On the role of ppGpp and DksA mediated control of σ54‐dependent 

transcription       

Lisandro Bernardo            

   

Department of Molecular Biology Umeå University Umeå , Sweden 

2006 

                               

Copyright © 2006 by Lisandro Bernardo ISBN 91‐7264‐217‐3 

Printed by Arkitektkopia AB, Umeå, Sweden 

2 

              

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Science is facts; just as houses are made of stone, so is science made  of  facts;  but  a  pile  of  stones  is  not  a house,  and  a  collection  of  facts  is  not  necessarily science. 

Jules Henri Poincaré (1854‐1912) French mathematician.   

3 

Table of Contents 

ABSTRACT …………………………………….....................................…….....................6 

PAPERS IN THIS THESIS ………………………………...…........................................7 

INTRODUCTION ………………………………………………......................................8 

1.1. Overview of specific and global regulatory signals of bacterial gene expression …..........8 1.2. The engine of the transcription cycle ………………………………………...……..................9   1.2.1. The promoter specificity subunit ……………………………………….…..…….........10   1.2.2. Families of σ‐factors …………………………………………………….……….............12   1.2.3. Structure to function relationships of σ‐factors ………………………...…….........…14   1.2.4. Transcription initiation step‐by‐step ……………………………………..……............16   1.2.5. σ54‐activators ‐ enhancer binding proteins (EBPs) ……………………………............18 1.3. Modulation of transcription initiation by nucleoid‐associated proteins …………............20 1.4. The alarmone ppGpp – the effector of the stringent response ………………...……..........21   1.4.1. ppGpp and transcription ………………………………..……………………................23   1.4.2. DksA ‐ an enhancer of ppGpp activity ……………………………………..…….........25 1.5. Global regulation of hydrocarbon catabolism ……………………………………...….........27 1.6. The experimental system derived from Pseudomonas sp. strain CF600 ……………...........28   1.6.1. Subservience of the DmpR/Po system to global regulatory input ………..…...........30 

AIMS ……………………………………………………………….............…..................32 

RESULTS AND DISCUSSION ……………………………………......…...................33 

1. Do global regulatory systems found to impact a closely related system also impact DmpR/Po? ……………………...………………………………………......................33   1.1. Is FtsH required for σ54‐Po transcription? ……………………….........…………............33   1.2. Is the DmpR/Po system under the control of PtsN‐mediated      glucose repression? ...............................................................................................................34   1.3. Influence of ppGpp on DmpR/Po and XylR/Pu circuits in E. coli      and P. putida ...........................................................................................................................35 

2. Do ppGpp and DksA have direct and/or indirect effects on any of  the processes of specific regulation? ……………………………………..…………..................36   2.1. Are both ppGpp and DksA required for efficient σ54‐dependent     transcription in vivo? .............................................................................................................38   2.2. What’s true of E. coli is (nearly true) of P. putida – an adaptive twist ……...................39   2.3. Do ppGpp and DksA have any direct effects on σ54‐dependent      transcription in vitro?.............................................................................................................41   2.4. Can the requirement for ppGpp and DksA be explained by their      effects on the levels of IHF?..................................................................................................43   2.5. Can the requirement for ppGpp and DksA be explained by their      effects on the levels of DmpR or σ54?...…………………………………………................44 

4 

3. Do ppGpp and DksA regulatory effects through σ70‐transcription  explain the impact of these regulatory molecules on σ54‐transcription? …………………....45   3.1. Supressor mutations reveal a link between ppGpp and     σ54‐dependent transcription .................................................................................................45   3.2. σ70 mutants are defective in competition with σ54 for core RNAP ……………............46   3.3. σ‐factor competition limits σ54‐dependent transcription in vivo ……………................48   3.4. Mutations within β and β´ reveal a dual bypass mechanism that      directly links σ54‐transcription to properties associated with      down‐regulation of stringent σ70‐promoters …………......................………...................50   3.5. ppGpp and DksA mediated regulation of      σ54‐transcription – the current model .................................................................................53 

CONCLUDING REMARKS ………………………...........................…………............55 

ACKNOWLEDGEMENTS ……………………………………………………….........56 

REFERENCES ……………………………………………………………………............58 

5 

ABSTRACT  The  σ54‐dependent  Po  promoter  drives  transcription  of  an  operon  that encodes a suite of enzymes  for  (methyl)phenols catabolism. Transcription from  Po  is  controlled  by  the  sensor‐activator  DmpR  that  binds (methyl)phenol effectors  to  take up  its active  form. The σ54‐factor  imposes kinetic constraints on transcriptional initiation by the σ54‐RNA polymerase holoenzyme  which  cannot  undergo  transition  from  the  closed  complex without  the aid of  the activator. DmpR acts  from a distance on promoter‐bound  σ54‐holoenzyme,  and  physical  contact  between  the  two  players  is facilitated by the DNA‐bending protein IHF. The bacterial alarmone ppGpp and  DksA  directly  bind  RNA  polymerase  to  have  far  reaching consequences  on  global  transcriptional  capacity  in  the  cell.  The  work presented  in  this  thesis  uses  the  DmpR‐regulated  Po  promoter  as  a framework  to  dissect  how  these  two  regulatory molecules  act  in  vivo  to control  the  functioning  of  σ54‐dependent  transcription.  The  strategies employed involved development of i) a series of hybrid σ54‐promoters that could  be  directly  compared  and  in which  key  DNA  elements  could  be manipulated ii) mutants incapable of synthesizing ppGpp and/or DksA, iii) reconstituted  in  vitro  transcription  systems,  and  iv)  genetic  selection  and purification of mutant RNA polymerases  that bypass  the need  for ppGpp and DksA  in vivo. The collective results presented show that the effects of ppGpp  and  DksA  on  σ54‐dependent  transcription  are  major,  with simultaneous  loss of  these regulatory molecules essentially abolishing σ54‐transcription in intact cells. However, neither of these regulatory molecules have  discernable  effects  on  in  vitro  reconstituted  σ54‐transcription, suggesting an  indirect mechanism of control. The major effects of ppGpp and DksA  in  vivo  cannot be  accounted  for by  consequent  changes  in  the levels of DmpR or other specific proteins needed for σ54‐transcription. The data presented here shows i) that the effects of loss of ppGpp and DksA are related  to  promoter  affinity  for  σ54‐holoenzyme,  ii)  that  σ54  is  under significant competition with other σ‐factors in the cell, and iii) that mutants of σ70, and  the β‐ and β’‐subunits of RNA polymerase  that can bypass  the need  for  ppGpp  and  DksA  in  vivo  have  defects  that would  favour  the formation of σ54‐RNA holoenzyme over  that with σ70, and  that mimic  the effects  of  ppGpp  and  DksA  for  negative  regulation  of  stringent  σ70‐promoters.  A  purely  passive model  for  ppGpp/DksA  regulation  of  σ54‐dependent transcription that functions through their potent negative effects on transcription from powerful σ70‐stringent promoters is presented. 

6 

PAPERS IN THIS THESIS  This  thesis  is  based  on  the  following  articles  and manuscripts  that  are referred to in the text by their roman numerals  I. Sze C.C., Bernardo L.M.D. and Shingler V.  (2002).  Integration of global regulation  of  two  aromatic‐responsive  σ54‐dependent  systems:  a  common phenotype by different mechanisms. J Bacteriol 184, (3) 760‐70.  II. Laurie A.D., Bernardo L.M., Sze C.C., Skärfstad E., Szalewska‐Palasz A., Nyström T., and Shingler V. (2003). The role of the alarmone (p)ppGpp in σN competition for core RNA polymerase. J Biol Chem 278, (3) 1494‐503.  III.  Bernardo  L.M.D.,  Johansson  L.U.M.,  Solera  D.,  Skärfstad  E.  and Shingler V. (2006). The guanosine tetraphosphate (ppGpp) alarmone, DksA and promoter affinity for RNA polymerase  in regulation of σ54‐dependent transcription. Mol. Microbiol. 60, (3) 749‐764.  IV. Szalewska‐Palasz A., Bernardo L.M.D., Johansson L.U.M., Skärfstad E., Stec  E.,  and  Shingler  V.  (2006).  Dual  by‐pass  mechanisms  of  RNA polymerase mutants: implications for ppGpp‐ and DksA‐mediated control of σ54‐dependent transcription. Submitted manuscript.  V.  *Bernardo  L.M.D.,  *Johansson  L.U.M.,  Solera  D.,  Skärfstad  E., Szalewska‐Palasz.,  A  and  Shingler  V.  (2006).  The  role  of  the  alarmone ppGpp  and  DksA  in  regulation  of  σ54‐dependent  transcription  in Pseudomonas putida. Manuscript.  * The first two authors contributed equally to this work. 

7 

INTRODUCTION  1.1. Overview of specific and global regulatory signals of bacterial gene expression. 

In  their  natural  habitats,  bacteria  are  exposed  to  a wide  range  of physical,  chemical,  and  nutritional  stresses.  In  order  to  adapt  and counteract  these  usually  adverse  conditions,  bacteria  alter  their  gene expression. The regulation of gene expression in response to environmental signals  involves  sensing  the  stimuli  that,  either  directly  or  via  signal transduction  pathways,  leads  to  up‐  or  down‐regulation  of  the  levels  of different  gene  products  to  make  appropriate  changes  in  cellular physiology. 

One group of environmental signals is involved in reporting on the availability of essential resources such as  the presence or absence of  trace minerals, carbon‐, nitrogen‐ and phosphate‐sources, electron acceptors, and other metabolites necessary  for growth. Other environmental stimuli such as  temperature,  osmolarity,  pH  and  other  factors  that  evoke  a  general protective  response  can  have  both  specific  and  global  regulatory consequences  (94). A  third  class  of  signals  constitute molecules  used  for detection of the same or other organisms, which is an important process for certain bacteria  in  sensing population densities  as  in bioluminescence, or sensing the presence of a suitable niche such as a eukaryotic host. 

Many  levels of  the control of gene expression can be  the  target of environmental  signals.  These  include  1)  regulation  at  the  level  of transcription  ‐  the process by which DNA  information  is  transcribed  into RNA, 2) at the post‐transcriptional level e.g. by RNase‐mediated regulation of  RNA  stability,  or  through  translational  control  brought  about  by  the action  of  small  regulatory  RNAs,  or  3)  at  the  post‐translational  level through  a  number  of  mechanisms  such  as  covalent  modifications  of proteins,  protein  co‐factor  requirements,  correct  folding,  processing,  or localization to an appropriate compartment of the cell. 

A distinct feature of the prokaryotic cell is the multicistronic operon, such as those for metabolic pathways, in which genes that encode proteins involved  in a related process are  transcribed  from a single promoter. This genetic  organisation provides  a  ready means  to  coordinate  expression  in response  to  a  signal  that  controls  the  activity of  a dedicated  regulator  to provide  specific  regulatory  circuits.  The  stimuli  that  the  regulator(s) sense(s) are often directly relevant to the function of the operon(s), e.g. for catabolic operons,  the signal  is often  the substrate or  intermediates of  the 

8 

catabolic  pathway.  Therefore,  these  genes  are  under  specific  regulation. Specific  regulation also occurs  in  regulons  in which cellular  functions  that involve  gene  products  of  multiple  operons  are  differentially  but coordinately controlled by one or more regulators. A stimulon, on the other hand,  refers  to  a  group  of  genes  or  operons  that  respond  to  a  defined stimulus, without regard to their regulatory organization. All specific gene regulatory circuits can be considered “guests”  that are subject  to a higher order  of  regulation  involving  global  regulatory  factors.  The  presence and/or net activity of  these global  factors  that act  through promoters  are ultimately dictated by metabolic signals that result from adaptation of the bacterium to its current environment (reviewed in 29, reviewed in 121). 

Once  adapted  to  the  physical  conditions  of  a  new  environment, bacteria  often  have  to  compete  with  other  organisms.  Competing effectively  might  mean  being  able  to  competitively  scavenge  scarce nutrients, e.g. iron, or taking advantage of plentiful ones to achieve higher growth rates. Within these choices, different compounds may be available for  use  as  carbon  and  energy  sources.  To  optimise  energy  usage,  a bacterium needs  to choose  the one(s)  it can use most cost‐effectively. This thesis  focuses on dissection of how global regulation dominates a specific regulatory  circuit  to  affect  this  choice.  Since  the mechanism  uncovered primarily  functions  at  the  level  of  transcriptional  initiation,  I  will  first introduce  the  transcriptional  machinery  and  the  processes  it  mediates, before  introducing  other  factors  involved  in  global  regulation  that  are pertinent to the experimental system used in this study. 

 1.2. The engine of the transcription cycle  

Bacteria  use  DNA‐dependent  RNA  polymerase  (RNAP)  to transcribe  the genetic  information  from DNA  into RNA. As  illustrated  in Fig.  1,  the  transcription  cycle  consists  of  distinct  steps:  promoter‐localization, initiation, elongation and termination. The core enzyme, which is  the  catalytic  machine  that  synthesizes  RNA,  is  a  thermodynamically stable  complex  of  five  subunits  (α2ββʹω, with  a molecular mass  of  ~400 kDa). The core complex exhibits a “crab‐claw”  like structure (made up by the β and βʹ subunits) that encompasses the active site of the enzyme that is located  at  the back‐end of  the  claw where  essential Mg2+  ions  are bound (91).  The  ω‐subunit  is  involved  in  assembly  of  the  core  enzyme, which starts with  the α2 dimer  that serves as  the scaffold on which β and βʹ are assembled with the aid of ω (50). 

 

9 

            

σσσcycle

1. Promoter localization

2. Initiation 3. Elongation 4. Termination

5. Release

6. Reconstitution

mRNAmRNA

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTDaaa

α ‐CTDβ/β’

α ‐NTD

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

σUP   ‐35           ‐10

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

σaaa

α ‐CTDβ/β’

α ‐NTD

σσUP   ‐35           ‐10UP   ‐35           ‐10

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

UP   ‐35           ‐10

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

UP   ‐35           ‐10 UP   ‐35           ‐10

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

UP   ‐35           ‐10UP   ‐35           ‐10

aaaα ‐CTD

β/β’α ‐NTD

aaaα ‐CTD β/β’

α ‐NTD

σaaa

α ‐CTD β/β’α ‐NTD

σσ

Fig.  1.  The  transcription  cycle  mediated  by  DNA‐bound  RNA  polymerase  consists  of distinct steps: 1. promoter localization, 2. initiation, 3. elongation and 4. termination. 

 Although core alone can initiate transcription from ends, nicks and 

open  regions of DNA,  it  is  incapable of selective  transcriptional  initiation due to its inability to specifically recognize promoter sequences. To initiate transcription  from  promoters,  the  core  RNAP  requires  binding  to  an additional  subunit,  the  sigma‐factor  (σ‐factor),  that  reversibly  associates with core  to  form  the σ‐RNAP holoenzyme. At  the end of  the elongation phase,  the  formation of a nascent RNA hairpin, or  the helicase activity of the  termination  factor Rho, mark  transcription  termination,  allowing  the released core to associate with a σ‐factor and then  initiate a new round of transcription from a promoter (114).  1.2.1. The promoter specificity subunit  

Transcriptional initiation is a multi‐step process that involves initial binding of holoenzyme to promoter sequences and melting (isomerisation) of the double stranded promoter DNA prior to initiation of RNA catalysis. Within  the  context  of  the  holoenzyme  ,  the  σ‐factor  facilitates  promoter recognition  by  binding  to  specific DNA  signatures  of  the  promoter,  and participates  in  transcriptional  initiation by  aiding opening of  the double‐stranded  DNA  (53,  152).  Different  σ‐factors  exhibit  various  sequence specificities  for DNA signatures of  the promoters  they control  (78). These different  classes  of  promoters  often  control  groups  of  genes  whose products  are  involved  in  related  and  specialized processes  (see Table  1). Most  bacteria  contain  multiple  σ‐factors,  and  genome  sequencing  has shown  that  the number of σs vary greatly between different bacteria. For 

10 

example,  dedicated  intracellular  pathogens  that  live  within  a  relatively constant environment frequently encode only one σ‐factor, e.g. Mycoplasma genetalium, while  free‐living  soil  bacteria  such  as Pseudomonas  putida  and Streptomyces coelicolor encode, respectively, 24 (83) and 63 σ‐factors (14). In general, organisms with more diverse  lifestyles  contain more σ‐factors  to rapidly adjust  their metabolism and developmental programs  in response to various environmental changes. 

 

Table 1. Sigma factors and their functions (adapted from 152).  

Group  Examples  Functions Primary σ‐factors  σ70 / σD (RpoD) 

(Gram‐negative bacteria) σA (Gram‐positive bacteria) MysA (Mycobacteria) HrdB (Streptomyces) 

Major σ‐factor in exponential phase, regulates house keeping genes 

Non‐essential stationary phase / stress σ‐factors 

σS / σ38 (RpoS) (Enterobacteria, Pseudomonas)   SigB‐E (Cyanobacteria) 

Major σ‐factor during entry into stationary phase and/or exposure to hyper‐osmotic or acid stress.  Controls gene expression during circadian responses, C and N limitation and post‐exponential phase. 

Flagella σ‐factors  σF  / σ28 (Enterobacteria) WhiG (Streptomyces) σD (Bacillus subtilis) 

Expression of late flagellar components, chemotaxis and/or early sporulation genes 

Extracytoplasmic function (ECF) σ‐factors 

σE  / σ24 (RpoE) (E. coli, Mycobacteria) CarQ (M. xanthus) AlgU (P. aeruginosa) SigV‐Z (B. subtilis) 

Expression of genes involved in alginate biosynthesis, iron uptake, antibiotic production, induction of virulence factors, OM proteins or survival of high temperature 

Heat shock and related σ‐factors 

σH / σ32 (RpoH) (Gram‐negative bacteria) SigB (M. xanthus) SigC (S. aurantiaca) σB (B. subtilis) 

Expression of genes during stress, fruiting body formation, myxospores maturation, or late sporulation 

Sporulation σ‐factors 

σH, σF, σE, σG, σK

(Bacillus, Clostridium) Transcription of genes involved in various stages of sporulation 

σ54‐factors  σ54 / σN (RpoN / NtrA) (Enterobacteria, Rhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Caulobacter, M. xanthus) 

Expression of genes involved in N fixation, nitrate utilization, glutamate synthesis, dicarboxylate transport, aromatic degradation, fimbriae and flagellar synthesis, and others 

11 

The  innate  affinities  of  the  promoter  sequences  for  their  cognate holoenzymes create hierarchies between promoters of the same class, while different  levels  of  holoenzymes  create  hierarchies  between  different promoter  classes.  σ‐factors  have  different  affinities  for  core  RNA polymerase (estimated to be in the range of 1 to 10 nM) (52 and references therein).  In  addition,  the  levels  of  many  of  them  are  controlled  by sophisticated  regulatory  systems  involving  transcription,  translation  and proteolysis. For example, in Escherichia coli, the nucleotide ppGpp acts as a positive  regulator  of  transcription  of  rpoS  that  encodes  σS, Hfq  and HU stimulate  translation  by  affecting  the  secondary  structure  of  the  rpoS mRNA, while phosphorylated RssB modulates σS availability by delivering it to the ClpXP protease (reviewed in 57). 

The levels of other σ‐factors are controlled by anti‐σ‐factors, which sequester the cognate σ‐factor so that it is unavailable to associate with core RNA polymerase until  condition  trigger degradation  of  the  anti‐σ‐factor, e.g. the anti‐σE protein RseA (3). In the case of σ28, the FlgM anti‐σ28 protein inhibits  transcription  of  σ28‐dependent  genes whose  products  are  needed late in assembly of flagella. Once the hook‐basal body of the flagellar motor structure  is  in place, FlgM  chaperoned by σ28  exits  through  this partially completed  flagella  structure,  thus  freeing  σ28  to  form  the  cognate holoenzyme to transcribe genes needed to complete the structure (4). In E. coli, the levels of the housekeeping σ70 are relatively constant (67); however, the  stationary‐phase Rsd  protein  (65,  66)  and  the  related  phage‐encoded regulator, AsiA (120), associate with σ70 to reduce σ70‐transcription in vitro. 

These limited examples illustrate some of the elegant strategies that allow bacteria  to modulate  the  composition of σ pools, and  consequently transcription,  to efficiently respond  to changing environmental conditions and sequentially control gene expression to give temporal order to complex events.  In  contrast  to  other  alternative  σ‐factors,  the  levels  of  σ54  remain constant  under different  growth  conditions  and  growth  phases  in E.  coli and P. putida (30, 67), hence alternative explanations are needed for growth‐phase  and  conditional  regulation  of  promoters  recognised  by  σ54‐RNAP. The mechanisms underlying these responses of σ54‐promoters are discussed in detail in the Results and Discussion section. 

 1.2.2. Families of σ‐factors 

Based  on  sequence  and  functional  similarity,  σ‐factors  can  be grouped  into  two  families,  which  have  little  if  any  sequence  identity between them (Fig. 2). The largest of these is the σ70‐family, named after the 

12 

70 kDa primary σ‐factor encoded by rpoD that is also sometimes referred to as  σD  (78).  The  second  family  is  the  σ54‐family,  named  after  the  54  kDa nitrogen regulation σ‐factor, which  is encoded by rpoN  (ntrA) and  is  thus sometimes referred to as σN (88). In addition to nitrogen metabolism, σ54 is involved  in  controlling  many  processes  that  are  responsive  to environmental signals, including the utilization and transport of alternative carbon sources, chemotaxis, and alginate biosynthesis (reviewed in 141). 

                      

Activation ofPromoter melting

Region IIAcidic

Region IIIconserved

Region ILeu-gln rich

Core binding DNACross-link

RpoNbox

HTHand -12

recognition

σ54σ54

NCR

σ1.1

σNCR

σ3 σ4σ2σ 3.2 loop

Inhibits DNA bindingCore binding

DNA melting

-10 recognition

Extended -10 recognition

HTH box and

-35 recognition

σ70σ70

1.1 1.2 2.1 2.2 2.3 3.0 3.12.4 3.2 4.1 4.21.1 1.2 2.1 2.2 2.3 3.0 3.12.4 3.2 4.1 4.2

Fig.  2. Schematic  illustration of  the σ70‐  and σ54‐subunits of RNA polymerase. NCR: non‐conserved region (adapted from 90, 147, respectively). 

 Both  σ54  and  σ70‐like  proteins  have  regions  involved  in  DNA‐

binding and interaction with core RNA polymerase (Fig. 2). Unlike σ70, σ54 is  able  to  bind  to  certain  promoters  in  the  absence  of  core  polymerase, although σ54‐holoenzyme binds tighter than σ54 alone (reviewed in 88). The σ54‐factor  programs  RNAP  to  recognise  the  unusual  ‐24,  ‐12  class  of promoters, consensus TGGCAC‐N5‐TTGCa/t with the almost invariant GG and GC residues underlined (12). This sequence is very different from those 

13 

of σ70‐promoters, consensus TTGACA‐N17‐TATAAT, which are located at ‐35 and ‐10 with respect to the transcription start site. 

The  σ70  family  has  been  broadly  divided  into  four  phylogenetic groups on the basis of gene structure and function (reviewed in 54). Group 1  consists of  the  essential primary σ70/D  (78)  that  controls  transcription of housekeeping genes. This group has two distinctive features: a) region 1.1 which  auto‐inhibits  promoter  recognition  by  free  σ‐factor  (90  and references  therein)  and  b)  a  non‐conserved  region  (NCR,  Fig.  2)  that  is present  only  in  some  housekeeping  σ‐factors  (reviewed  in  54). Group  2 proteins  are  closely  related  to  the primary σ‐factors  and direct  the RNA polymerase  to a  large number of genes upon conditions of growth arrest, starvation and stress  (e.g.  the stationary phase and stress  factor σ38/S), but are dispensable  for growth  (57). Members of group 3  lack  region 1.1 and NCR,  and  have  roles  in  sporulation  (e.g.  σ32/H,  σ28/F  and  σK),  in  flagella biosynthesis  (e.g. σ28/F) and  in  the heat‐shock response  (σ32/H)  (reviewed  in 54). Finally, group 4 accommodates the extracytoplasmic function (ECF) σ‐factors  that  lack  region  1.1, NCR  and  regions  3.0  to  3.1.  These  σ‐factors respond  to  signals  from  the  extracytoplasmic  environment,  such  as  the presence of misfolded proteins  in  the periplasmic space and cell envelope stress (e.g. σ24/E) (reviewed in 54). 

 1.2.3. Structure to function relationships of σ‐factors 

Based on the crystal structure of Thermus aquaticus σA (equivalent to σ70 of E. coli), the regions of homology of σ70‐like proteins encode functional domains  that  form extensive contacts with core RNAP  (21). As  illustrated in Fig. 3B,  these subunits are spread across  the upstream  face of  the core RNA polymerase crab‐claw, and consist of globular regions (σ2, σ3, and σ4) that  are  connected  by  flexible  linkers.  Region  1.1  functions  as  an  auto‐inhibitory domain that prevents free σ70 from binding promoter DNA, but upon  interaction with  the  core  enzyme,  this  inhibitory  effect  is  relieved (87). Regions of  the globular domains  that  are  involved  in DNA‐binding are all solvent‐exposed, while  the σ‐3.2  loop protrudes  into  the active site cleft (see Fig. 3B). The σ2 domain forms one of the primary interfaces with RNAP,  and  is  involved  in  both  recognition  of  the  –10  hexamer  DNA sequence  of  promoters  and  in DNA melting  (21  and  references  therein). The σ3 domain binds extended  ‐10 DNA sequences  that are  important  for the  functioning  of  promoters  lacking  –35  sequences  (54),  while  the  σ4  

domain  recognizes  ‐35 DNA  hexamers  of  σ70‐promoters.  The  σ4  domain contacts the β‐flap region that lies right over the RNA exit channel (Fig. 3B). 

14 

The  σ4  domain  is  also  the  target  for  interaction  with  transcriptional regulators  at  some  promoters,  and  in  some  cases  is  simultaneously contacted along with one of  the α‐carboxy‐terminal domains  (α‐CTDs) of RNAP (51). 

              

αI

αII

β β’

Mg2+

Active site

ω

σ1.1

β

β’

σ4

αII

RNA exit channel

template strand non-template strand

-5

-15

-25

-35

σ3σ3

σ2

downstreamDNA

900

A) B)

αI

 Fig. 3. A) Schematic  illustration of core RNA polymerase and B)  the σ70‐RNA polymerase holoenzyme at the first step of open complex formation (see text). Active Mg2+ ions (circles). The path of the RNA to be synthesized is indicated by a dashed line to emphasise the local conflict between the σ‐3.2 loop and the nascent RNA (adapted from 62). 

 Until  now,  (to  the  best  of  my  knowledge),  no  high‐resolution 

structure  of  σ54‐proteins  has  been  solved. Nevertheless,  alignment  of  the highly  conserved  amino  acid  sequence  of  σ54  from  different  bacteria  has identified  three distinct  regions  (Fig. 2). The amino‐terminal Region  I  is a regulatory  bifunctional  domain  that  inhibits  DNA  isomerisation  by  the holoenzyme  in  the absence of activation  (23, 73, 130, 144); but aids DNA isomerisation and stable open complex formation upon activation (27, 116, 130). Region II is an acidic‐residue‐trimer repeat linker connecting Region I and  Region  III. Deletion  studies  of  σ54  suggested  a  role  for  region  II  in DNA‐binding and  in stabilising the holoenzyme (22), as well as effects on open complex  formation  in  the presence of an activator protein  (126). The carboxy‐terminal  Region  III  contains  sequences  required  for  core  RNAP binding  (49,  135)  and  determinants  for DNA  interactions,  including  the helix‐turn‐helix motif and a patch that UV‐crosslinks to promoter DNA (33, 49, 88). 

15 

1.2.4. Transcription initiation step‐by‐step The  multiple  steps  of  transcription  initiation  involve  major 

sequential  structural  changes  within  both  the  DNA  and  the  RNA polymerase.  Extensive  genetic,  biochemical  and  structural  studies  have greatly helped understanding of  these multiple steps  in both σ70‐ and σ54‐dependent  transcription  initiation  events,  even  though  not  all  is  fully known. A schematic overview of some of the intermediates in this process is shown in Fig. 4. 

          

BinaryClosed

Complex

RNAPolymerase

+Promoter DNA

BinaryOpen

Complex

NTP

TernaryInitiationComplex

AbortiveInitiation

NTP TernaryElongationComplex

+Promoter

DNAσ

R+P RPC1/RPC2 RPinit RPERPO1/RPO2

BinaryClosed

Complex

RNAPolymerase

+Promoter DNA

BinaryOpen

Complex

NTP

TernaryInitiationComplex

AbortiveInitiation

NTP TernaryElongationComplex

+Promoter

DNAσ

R+P RPC1/RPC2 RPinit RPERPO1/RPO2

Fig. 4. Transcription initiation is a multi‐step process which involves promoter recognition, formation of a closed DNA complex, isomerization of the DNA to form the open complex, nascent  RNA  initiation  in  the  ternary  initiation  complex,  and  finally  promoter escape/clearance to form the ternary elongation complex. 

 Transcription  is  initiated  when  a  σ‐bound  RNA  polymerase  (R) 

recognizes and binds  to  the double‐stranded promoter DNA  sequence  to form  the  so‐called  binary  closed  complex  (RPC).  Within  the  RPC1  σ70‐holoenzyme‐promoter  complex, σ2  engages  the promoter  –10  element, σ4 the –35 elements, while  the σ‐3.2  loop and σ‐1.1  region protrude  into  the RNAP active site channel (21). The binding of downstream double‐stranded DNA  in  the active site displaces  the σ‐1.1 region, bringing both  the DNA upstream and downstream of the transcriptional start site into contact with the RNA polymerase, forming the binary closed complex RPC2 (40). 

Unwinding  and  separation  of  the  double‐stranded  DNA  from approximately position –10 to position +2 by the σ2 sub‐region‐2.3 form the transcription  bubble,  and  marks  the  start  of  open  complex  formation, resulting in the binary open complex RPO (see Fig. 3B), that has at least two intermediates  (RPO1 and RPO2)  (91). Once  the  transcription bubble extends past  the  +1  transcription  start,  the  single‐stranded  template  DNA  is directed to the active site, where NTP (nucleotide triphosphate) substrates 

16 

are provided  through  the secondary channel and  the synthesis of RNA  is initiated, resulting in the ternary initiation complex RPinit. 

As illustrated in Fig. 3B, the path of the σ‐3.2 loop in the active site is in conflict with the path that the synthesised RNA will take through the RNA  exit  channel  under  the  β‐flap.  Within  the  RPinit  complex,  the elongating RNA chain must either displace the σ‐3.2 loop out of its way or dissociate  from  the  complex  and  be  released  (probably  through  the secondary  channel),  a  process  that  is  called  abortive  initiation. Once  the RNA  chain  elongates  to  ~12 nucleotides,  it  is  of  sufficient  size  to  fill  the RNA‐DNA hybrid and upstream RNA exit channel under  the β  flap  (90). The displacement of the σ‐3.2 loop thus ends the potentially abortive stage of initiation. The displacement of the σ‐3.2 loop and exiting of the RNA is also believed to be  linked to the initial steps of promoter escape, resulting from destabilization of  the σ4‐β  flap  interaction as RNA exits  through  the underlying channel. As a consequence of the release of σ4 from the β flap, the  interactions  between  σ4  and  the  ‐35  element would  be  destabilized, allowing  the RNAP  to  be  released  from  the promoter  and  to  translocate downstream  as  it  elongates  the  RNA.  Eventually  the  σ70  is  completely released, through sequential breaking of its multiple interactions with core, regenerating  core  RNAP  in  its  processive  elongation  mode  as  ternary elongation complex; RPE (90). 

The  levels  of  formation  of  the  non  reversible  ternary  initiation complex  are  primarily  determined  by  the  ease  of  melting  of  the  DNA strands, the stabilities of the intermediates which are all reversible and the ability of the nascent RNA to out‐compete the σ‐3.2 loop (90 and references therein);  and  at  some  promoters  can  also  be  greatly  influenced  by  the concentration of the initiating NTPs (117). 

In contrast to σ70‐RNAP, σ54‐RNAP forms an unusually stable closed complex around positions  −24  (GG‐region) and  −12  (GC‐region)  from  the transcription  start  site,  and  is  incapable  of  self‐isomerization  to  an  open complex.  Thus,  transcription  by  this  holoenzyme  always  requires activation. The interactions between σ54‐regions I and III with the ‐12 DNA sequence are  responsible  for preventing spontaneous  isomerization of  the closed complex to the open promoter complex in the absence of activation (55,  147).  Initiation  of  open  complex  formation  by  σ54‐RNAP  requires interactions between σ54‐region I with a specialized AAA+‐family activator protein (ATPases associated with diverse cellular activities), which utilizes ATP  hydrolysis  to drive  conformational  changes  in  the  σ54‐RNAP  closed promoter  complex,  resulting  in  the  formation  of  the  open  promoter 

17 

complex  (20,  27,  48). The  initial  open  complex  (RPO1)  formed  is  heparin‐unstable and  the activator  interaction with σ54‐RNAP  further assists  in  its conversion to a heparin‐stable, NTP binding proficient state (RPO2) (143). A functional  interplay  between  σ54‐region  I  and  the  β  and  the  β’  subunits stabilizes  the  σ54‐RNAP open  complex  (148  and  references  therein). Once the  open‐promoter  complex  has  formed,  the  pathway  for  σ54‐RNAP  is much  as  described  for  σ70‐RNAP  except  that  abortive  initiation  appears more  efficient,  since  the  abortive  products  are  2  nucleotides  long  as compared to 3‐12 nucleotides for σ70‐RNAP (63, 136). 

 1.2.5. σ54‐activators ‐ enhancer binding proteins (EBPs) 

Classical  regulators  of  transcription  initiation  act  by  binding  to DNA regions  in or proximal  to a promoter  to affect RNAP recruitment  to the  promoter  and/or  to  enhance  rate‐limiting  steps  of  the  transcriptional initiation pathway (reviewed in 19). However, as outlined above, σ54‐RNAP forms  stable  closed  complexes,  and  the  cognate  regulators  of  this polymerase  are  thought  to  act  solely  by  acting  on  pre‐bound  σ54‐RNAP locked in the closed complex form. 

        

V4R

Major effectorspecificity sub-region

GAFTGA HTH

Sensory/ Regulatorydomain

DNA-binding domain

AAA+ σ54-activation domain

1 211 234 472 558 563

Linker

V4R

Major effectorspecificity sub-region

GAFTGA HTH

Sensory/ Regulatorydomain

DNA-binding domain

AAA+ σ54-activation domain

1 211 234 472 558 563

Linker

  Fig.  5.  Domain  structure  of  a  σ54‐activator,  e.g.  DmpR,  illustrating  the  locations  of  the hydrocarbon‐binding V4R  signature motif,  the  σ54‐RNAP  interacting GAFTGA motif, and the helix‐turn‐helix DNA binding motif (adapted from 128). 

 The  activity  of  σ54‐activators  is  controlled  in  response  to  a wide 

variety  of  physiological  and  environmental  signals,  affecting  cellular responses ranging from nitrogen assimilation and utilization (e.g. NifA and NtrC),  utilization  of  alternative  carbon  sources  (e.g.  DmpR  and  XylR), expression  of  specific  transport  systems  (e.g.  DctD),  to  production  of virulence determinants and extracellular structures (reviewed in 128). This family  of  proteins  usually  consists  of  three  domains  involved  in  signal reception, transcriptional activation, and DNA binding (Fig. 5). The amino‐

18 

terminal signal reception domain is a regulatory domain that represses the activity of these proteins until they receive an activating signal in the form of a small  ligand, phosphorylation, or by an  interacting protein (reviewed in  122).  The  central  catalytic  AAA+  domain  is  required,  and  is  often sufficient,  for  activating  transcription  from  σ54‐promoters  in  vivo  and  in vitro (15, 71, 108, 149). The carboxy‐terminal HTH domain mediates DNA‐binding  to  sites  located unusually  far upstream  from  the promoters  they control that are referred to as UASs (upstream activating sequences). Since σ54‐activators can frequently still mediate some level of transcription when their  binding  sites  are  moved  even  further  from  the  promoter,  these proteins  are  also  referred  to  as  enhancer‐binding  proteins  (EBPs)  by analogy to transcriptional regulators of eukaryotes (106, 154). 

 

UAS

(EBP)2

(EBP)6

-24 -12 +1

σ54

A

C

B

ATP

ADP+Pi

IHF+1

σ54

+1

σ54

Core

Core

Core

                    

Fig. 6. Illustration of activation of transcription from σ54‐dependent promoters by EBPs. (A) σ54, within the context of the holoenzyme, binds to specific promoter sequences at positions ‐24/‐12  relative  to  the  transcriptional  start,  forming  a  closed σ54‐RNAP‐promoter  complex. EBPs bind to UASs upstream of the promoter sequence. (B) The EBP hexamer contacts the σ54‐RNAP‐promoter complex via DNA  looping, often assisted by  IHF.  (C) ATP hydrolysis by the AAA+ domain of the EBP results in a σ54‐RNAP‐promoter open complex with melted DNA (adapted from 119). 

19 

EBPs are usually dimeric in their inactive state and the formation of active higher‐order oligomers  (usually hexamers)  is  required  to  stimulate ATPase  activity  and  to  allow  interaction with  σ54‐RNAP  (e.g.  112,  149). EBPs  bound  to  UASs  that  are  located  at  ‐80  to  ‐150  bp  from  the transcriptional  start  site  contact  the promoter  bound  σ54‐RNAP  via DNA looping  (see Fig. 6)  (129, 145).  In many cases,  this event  is assisted by  the DNA  bending  protein  IHF  (Integration Host  Factor)  (61). Upon  contact, conformational changes  induced by  the EBP as  it hydrolyses ATP  lead  to the  disruption  of  the  repressive  interaction  of  σ54‐region  I  on  the  core polymerase. This step  involves  the GAFTGA motif of  the central domain, which is the hallmark of this family of proteins. In particular, the conserved threonine of GAFTGA that resides on a mobile loop is suggested to play a crucial role in the energy transfer process derived from ATP hydrolysis to restructure  the σ54‐RNAP promoter DNA complex  into a  transcriptionally competent open complex (Fig. 6C) (17, 112). 

 1.3.  Modulation  of  transcription  initiation  by  nucleoid‐associated proteins 

Bacterial  chromosomes  far  exceed  the  length  of  the  cell  and  are compressed  thousands of  fold  in  the nucleoid structure  that serves as  the scaffold  within  which  transcription,  replication  and  recombination  take place.  The  highly  compacted  bacterial  chromosome  is  ordered  by supercoiling,  RNA,  and  nucleoid‐associated  proteins  that  represent  the prokaryotic  equivalent  to  histones.  Negative  supercoiling,  due  to  the negative  charges  on  the  phosphates  of  DNA,  can  facilitate  both  DNA folding and compaction and also the unwinding of DNA, which is required for  the  initiation  of  transcription  as  well  as  DNA  replication  and recombination.  In  E.  coli, major  nucleoid‐associated  proteins  involved  in DNA compaction include FIS (Factor for Inversion Stimulation), IHF, H‐NS (heat‐stable  [or  histone‐like]  nucleoid‐structuring  protein)  and  HU (histone‐like nucleoid‐structuring proteins) (reviewed in 139). 

The levels of nucleoid‐associated proteins vary according to growth phase  of  the  cell,  e.g.  IHF  increases  up  to  ~7‐fold  upon  transition  from exponential  to stationary phase  in E. coli and P. putida  (93, 140), while  the level  of  FIS  is  high  during  exponential  phase  but  drops  to  almost  nil  at stationary  phase  (10).  In  particular,  the  levels  of HU, H‐NS  and  IHF  all increase before cell size reduction, probably to better compact the nucleoid to fit the smaller‐sized cells of stationary phase (10). 

20 

In  addition  to  their  roles  in  compacting  chromosomal  DNA, nucleoid‐associated  proteins  can  also  function  as  transcription  factors through  their  influence on DNA  topology  in and  round  regulatory DNA sequences (118, 151). For example, upon binding, FIS bends DNA between 50° and 90° (102), whilst IHF induces a 160° bend (113). The consequences of changes in DNA topology caused by nucleoid proteins at promoters are varied  and  include  i)  enhanced  or  reduced  binding  of RNA  polymerase and/or regulator(s), ii) establishment or disruption of interactions between RNA polymerase and regulator(s),  iii) enhanced or reduced unwinding of DNA duplex (affecting formation of open complexes), and/or iv) nucleation and formation of higher order structure leading to activation or repression of transcription (reviewed in 38). 

IHF plays a role at promoters of different types, but  is particularly important  for σ54‐dependent promoters  in  facilitating contact between  the distally  bound  EBP  and  the  σ54‐RNAP  (see  Fig.  6).  IHF  also  has  some additional  roles  at  σ54‐dependent  promoters  such  as  i)  restricting  the transcriptional activation specificity to a single regulator bound to specific UASs (35, 45, 109), ii) helping to recruit σ54‐RNAP to the promoter (16), iii) helping  to  engage  regulators  to  UASs  (70),  and  iv)  promoting  and/or stabilizing the σ54‐RNAP open complex (131). 

One of the most extensively characterized regulatory roles of H‐NS and  FIS  is  their  involvement  in  transcriptional  repression  (H‐NS)  and activation (FIS) of the seven rRNA operons of Escherichia coli that are driven by promoters that are amongst the most powerful known in prokaryotes (2, 118).  Ribosomal  genes  are  highly  transcribed  during  the  exponential growth  phase  when  nutrients  are  abundant  and  large  numbers  of ribosomes  are  needed  for  protein  synthesis. When  cells  reach  stationary phase, and the demand for protein synthesis lessens, the decreased levels of the activator protein FIS and increased levels of the repressor protein H‐NS are  involved  in  the  down‐regulation  of  transcription  of  ribosomal  genes (reviewed  in  105).  However,  as  detailed  in  the  following  sections,  the nucleotide  ppGpp  and  its  co‐factor  DksA,  which  directly  bind  and modulate RNAP  function, are  the most potent  factors  involved  in down‐regulation of these powerful promoters. 

 1.4. The alarmone ppGpp – the effector of the stringent response 

The  stringent  response  occurs when  the  supply  of  charged  tRNA cannot  keep  up  with  the  demands  for  protein  synthesis  and  is  elicited under  conditions  of  amino  acid  starvation,  carbon‐,  nitrogen‐  and 

21 

phosphate‐limitation  and  common  physical‐chemical  stresses  that  cause decreased growth rates and/or growth arrest (32). The effector molecule of the stringent response is the nucleotide guanosine tetraphosphate, ppGpp. Since  ppGpp  production  heralds metabolic  stress,  it  serves  to  raise  the alarm for adaptation for difficult times that lie ahead. 

In E. coli, this simple‐structured signalling molecule has far reaching global  regulatory affects on gene expression  (Fig. 7)  through  its  influence on  the  levels of global  regulators such as  IHF, σS and σH  (77). Regulatory effects  of  ppGpp  on  cellular  functions  have  also  been  reported  in many other bacteria  for example  in sporulation of Bacillus subtilis  (46), antibiotic production  by  Streptomyces  spp.  (142)  and  alginate  and  polyphosphate production by Pseudomonas  aeruginosa  (74).  In addition,  the existence of a bacteria‐type  stringent  response  has  been  recently  identified  in  plants, where  increased  levels  of  ppGpp  occur  in  chloroplasts  in  response  to stresses  such  as wounding,  heat  shock,  high  salinity  and  jasmonic  acid (134). 

                   

GTP+ATP

Amino Acid Starvation

RelAStress and Starvation

SpoTAmino Acid Starvation

RelAAmino Acid Starvation

RelAStress and Starvation

SpoTStress and Starvation

SpoT

pppGpp

GDP+PPippGpp

pppGpp

GDP+PPippGpp

Glycolysisgenes

Stasis survivalgenes

Oxidative stresssurvival genes

Osmotic stress survival genes

StableRNA

Ribosomalproteins &Elongation

factor

DNA replication

rpoSFatty acids,Lipids &Cell wall

UniversalStress

proteins

Amino acidbiosynthesisProteolysis

StableRNA

Ribosomalproteins &Elongation

factor

DNA replication

rpoSFatty acids,Lipids &Cell wall

UniversalStress

proteins

Amino acidbiosynthesisProteolysis

σS

aaaα -CTD β/β’

α - NTD

σaaa

α -CTD β/β’α - NTD

σσ

 Fig. 7. ppGpp  is produced  from GTP and ATP by 2  routes  in  response  to  starvation and stress.  It  targets  RNAP  and  redirects  transcription  from  growth‐related  genes  to  genes involved in stress resistance and starvation survival. SpoT also hydrolyzes ppGpp (adapted from 80). ‐ indicates down‐regulation, + indicates up‐regulation. 

22 

In E. coli and P. putida, the accumulation of ppGpp  is mediated by the RelA‐ppGpp synthetase I and the SpoT‐ppGpp synthetase II dependent pathways. A  strain  lacking  both RelA  and  SpoT  is  completely  unable  to produce ppGpp and is referred to as a ppGpp0 strain, while the response to starvation of such a strain is called a relaxed response. The specific feature of  the  relaxed  response  is  a  continued  accumulation  of  rRNA  during starvation  (32). E. coli cells  lacking ppGpp are also characterized by being polyauxotrophs  (153).  The  production  of  ppGpp  in  response  to  nutrient limitation  and  other  stresses  leads  to  coordinated  changes  in  gene expression. In general, genes  involved  in cell proliferation and growth are negatively regulated by ppGpp, whereas genes implicated in maintenance and  stress  survival  are  positively  regulated  by  the  alarmone;  see  Fig.  7 (reviewed by 98). 

The RelA  protein  is  activated  to  catalyze  the  synthesis  of  ppGpp from  ATP  and  GTP  during  amino  acid  starvation  or  when  cells  enter stationary  phase.  Initially  pppGpp  is  produced,  which  is  then  rapidly converted  by  guanosine  pentaphosphate  hydrolase  to  ppGpp  (75).  RelA detects uncharged tRNA stalled on the ribosomes and as a result activates its ppGpp synthesis while hopping to other stalled ribosomes (146). Less is known  about  how  SpoT  senses  starvation  conditions.  SpoT  is  a  dual‐functional  protein  and  is  also  responsible  for  hydrolyzing  ppGpp  (32). Most bacteria only contain a single protein that, like SpoT, has two catalytic sites  in  its amino terminal region that are  involved  in  its dual activity (60, 89). Allosteric  changes  through  its  carboxy‐terminal  end  are proposed  to control  switching  between  its  two  opposing  activities.  SpoT  is  primarily responsible for the accumulation of ppGpp in response to most stresses and nutrient  limitations other  than amino acid starvation  (92). Very recently  it has  been  suggested  that  interaction with  a  central  co‐factor  in  fatty  acid synthesis may  be  the mediator  for  controlling  the  opposing  activities  of SpoT (13). 

 1.4.1. ppGpp and transcription 

In  contrast  to  classical  DNA‐binding  transcriptional  regulators, ppGpp binds directly to RNAP to modulate its activity. Mutations affecting ppGpp‐mediated  control  of  transcription  have  been  identified  in  the  β (encoded by rpoB), β’ (encoded by rpoC) and σ70 (encoded by rpoD) subunits (58), and crosslinking of ppGpp‐analogues to RNAP has shown that ppGpp interacts  with  β  and  β’  subunits  (34).  These  studies  have  been complemented  by  the  recent  co‐crystallisation  of RNAP  in  complex with 

23 

ppGpp,  in which ppGpp was  found  to bind  in either of  two orientations adjacent  to  the  active  site  (8).  The  authors  suggest  that  ppGpp  binding might affect interactions of NTPs with RNAP by altering the configuration of  the  active  site,  and  that  ppGpp might  interact with  the  non‐template DNA strand of the transcription bubble. However, supporting biochemical data  for  the  involvement of residues proposed  to bind ppGpp, and hence the significance of the structure found, is still awaited. 

  A)          

Fig.  8.  Thermodynamic  representation  of  promoter  activation  versus  inhibition  by ppGpp/DksA (adapted from 104). Free energy diagrams for an amino acid promoter (A) and an  rRNA  promoter  (B)  showing  the  progression  of  transcription  initiation.  The  diagram illustrates two steps, RP1 and RP2, on the pathway to open complex formation with a single transition state  ([RP]‡). A  two‐step mechanism  is depicted for simplicity, but RP1 and RP2 could  refer  to  any  two  intermediates  on  the  pathway  to  open  complex  formation,  and ppGpp/DksA conceivably could affect any  transition state between  the  two  intermediates. ΔG1 and ΔG2 represent the changes in free energy required to transition from RP1 to [RP]‡ and [RP]‡ to RP2, respectively. The dashed  line represents the free energy of the transition state in the presence of ppGpp/DksA. ΔG1D and ΔG2D represent the changes in free energy in the presence of ppGpp/DksA. ppGpp/DksA are proposed to decrease the free energy of [RP]‡,  allowing  for  a more  rapid  conversion  from RP1  to RP2  and  from RP2  to RP1. The ground  state  of  both  RP1  and  RP2  at  a  particular  promoter  would  dictate  whether ppGpp/DksA would facilitate activation as in the case of A) or inhibition of the promoter as in B). 

 Despite the availability of the co‐crystal structure and the proposed 

interaction of ppGpp with DksA, which is described in the next section, it is still  unclear  how  ppGpp  mechanistically  alters  the  function  of  RNA polymerase. Nevertheless, ppGpp has been  found  to directly act on many steps  of  transcriptional  initiation  from  different  σ70‐promoters  in  vitro, including:  1)  The  rate  of  ternary  initiation  complex  formation  through competition between ppGpp and NTPs at the active centre of RNAP (8, 69), 

ΔG

RP1

RP2

[RP]‡

ΔG1

ΔG2

ΔG1DΔG2D

RP1

RP2

[RP]‡

ΔG1

ΔG2

ΔG1DΔG2D

ΔG

RP1

RP2

[RP]‡

ΔG1ΔG2

ΔG1DΔG2D

Progression of Transcription Initiation

B)

RP1

RP2

[RP]‡

ΔG1ΔG1ΔG2

ΔG1DΔG2D

Progression of Transcription Initiation

24 

which would particularly  effect promoters  that  are  sensitive  to  initiating NTP  levels;  2)  destabilisation  and  reduced  life‐time  of  open  RNAP‐promoter  complexes.  This  is  of  particular  importance  for  negative regulation of promoters which have this as a rate limiting step, for example those of  rRNA promoters which are  intrinsically unstable and short‐lived (11,  103,  156);  3)  accelerated  transition  to  the  open  complex,  which  is proposed  to underlie ppGpp‐stimulation of  transcription  from promoters controlling  certain  amino  acid  biosynthetic  and  transport  pathways  (104 and  references  therein);  and  4)  negative  effects  on  promoter  clearance, which  has  been  proposed  to  underlie  down‐regulation  of  transcription from the λPR promoter by ppGpp (110). In addition, ppGpp has also been observed  to  increase  pausing  during  transcriptional  elongation  (69).  The outcome of  the effects of ppGpp and DksA at different promoters can be explained  by  changes  on  the  kinetics  of  the  pathway  to  open  complex formation,  depending  on  the  relative  stabilities  of  transition  state intermediate(s) (Fig. 8) (104 and references therein). 

In  addition  to  acting directly on  transcription  from σ70‐promoters, ppGpp  also  acts  as  a  positive  regulator  of  gene  expression  from  some promoters  recognised by alternative σ‐factors, e.g. σS  (68, 76), σH  (68), σ54 (26,  133),  and  σE  (37).  In  these  cases,  ppGpp  is  proposed  to  primarily mediate its effect through modulating the outcome of competition of the σ‐factors  for  core  RNAP  to  co‐ordinate  responses  to  nutritional  and  other stresses (68 and papers II‐IV). This model in relation to σ54‐transcription is the primary focus of this thesis and  is developed and discussed further  in the Results and Discussion section. 

 1.4.2. DksA ‐ an enhancer of ppGpp activity 

The  151‐amino‐acid  long  DksA  protein  was  initially  isolated  in Escherichia coli as a multicopy suppressor of  temperature‐sensitive growth and  filamentation  phenotypes  of  dnaKJ  mutants  (72).  Deletion  of  dksA results in pleiotropic effects in the cell such as defects of σS expression (59), cell division,  amino  acid biosynthesis, quorum  sensing, phage  sensitivity and virulence in a number of organisms (104 and references therein). Many, but not all, of  these effects are probably explained by  the  identification of DksA as a co‐factor  that binds RNAP and amplifies both  the positive and negative  effects  of  ppGpp  on  σ70‐transcription  (103,  104  and  references therein, 107). However, DksA also mediates ppGpp‐independent effects on transcription (103). The phenotypes of E. coli DksA null and ppGpp0 strains do  not  completely  overlap.  For  example,  both  strains  exhibit  somewhat 

25 

different  amino  acid  requirements  and  the  promoter  sequence requirements  for  the  two  regulatory  components  have  been  reported  to differ (59). Thus, it is possible that DksA and ppGpp in some instances act alone and in other cases act in concert. 

Structural  studies  have  shown  that DksA  is  a  structural,  but  not sequence, homologue of Gre factors that are involved in reactivating stalled RNAP  by  stimulating  the  intrinsic  endonucleolytic  transcript  cleavage activity of RNAP (107 and references therein). The acidic residues at the tip of the coiled‐coil of E. coli GreA and GreB are positioned close to the active site by protrusion of the coiled‐coil through the secondary channel, see Fig. 9, where they are proposed to help coordinate one of the two catalytic Mg2+ ions at  the active centre of RNA polymerase  (107 and  references  therein). Based  on  the  structural  similarity  of DksA  to Gre  factors  and  computer modelling, Perederina and co‐workers propose that the coiled‐coil of DksA also protrudes  through  the secondary channel of RNAP and  that  the  two aspartate residues at the tip of the DksA coiled‐coil interact with a Mg2+ ion coordinated  by  ppGpp  to  directly  facilitate  and/or  stabilize  the  ppGpp‐RNAP complex, thus providing a structural basis for the synergistic effects of ppGpp and DksA (107). 

             

Mg2+

DownstreamDNA

UpstreamDNA

DksA/GreA/GreB

SecondaryChannel

TemplateDNA

NTPs and ppGppβ

flap

RNA

  

Fig.  9.  Schematic  illustration  of  transcribing  RNA  polymerase.  The  secondary  channel (represented  in white)  is  the  site  of  entrance  for  the NTPs  and  ppGpp  and  also  has  to accommodate regulatory proteins such as DksA, GreA and GreB that access the active site to directly modulate  the  activity  of RNAP.  β  subunit:  dark  grey  and  β’  subunit:  light  grey (adapted from 97). 

26 

The existence of multiple secondary channel binding proteins such as GreA, GreB and DksA of E. coli, may suggest competition  for  this site. This  competition would most  likely be governed not only by  the  relative concentrations of the regulators, but also by their relative binding affinities for  the  secondary  channel. All  these  levels  of  regulation  add  complexity that  can  contribute  to  the  diversity  of  responses  to  nutritional  and environmental signals that have evolved for regulating different promoters. 

 1.5. Global regulation of hydrocarbon catabolism 

Soil micro‐organisms such as Pseudomonas, Alcaligenes, Burkholderia and Acinetobacter are capable of degrading aliphatic  (e.g. alkanes, styrene) and  aromatic  hydrocarbons  (e.g.  phenols  and  toluenes).  Pseudomonas genomes (> 6 million bp) contain the highest proportion of regulatory genes observed,  and  a  high  proportion  of  genes  dedicated  to  the  catabolism, transport  and  efflux  of  organic  compounds  (95).  The  process  of hydrocarbon  biodegradation  requires  sets  of  specialized  enzymes  that catalyze  sequential  biochemical  reactions  to  convert  these  compounds  to central  metabolites.  Operons  encoding  aromatic  catabolic  enzymes  are often  found  on  plasmids,  or,  if  located  on  chromosomes,  are  flanked  by transposons, thus ensuring a degree of horizontal transferability (150). The aerobic  catabolism  of  various  classes  of  hydrocarbons  by  pseudomonads has  been  extensively  studied  due  to  their  environmental  bioremediation potential. 

The ability  to  catabolise aromatics  is nonessential,  serving only  to confer  an  advantage  to  the  host  bacterium  under  conditions  where aromatic  compounds  are  readily  available.  However,  aromatic  catabolic pathways, like other catabolic processes, have to function efficiently within the context of the host and the signals presented by complex environments. Thus,  tight  regulation  is  required  in  order  to  avoid  detrimental  energy fluxes,  with  these  auxiliary  metabolic  pathways  only  becoming  truly favourable  if  their usefulness does not  compromise  the host’s  fitness and survival. Therefore, the functioning of aromatic catabolic pathways within the  network  of  host  cellular  processes  requires  both  specific  and  global regulation (reviewed in 121). 

27 

Table 2. Hydrocarbon catabolic systems subject to global regulation.  

Pathway/operon and phenotype  Reference 

Down‐regulation of pentachlorophenol metabolism by glutamate, glucose and cellobiose. 

(137) (138) 

Inhibition of benzene consumption of P. putida ML2 by succinate.   (84) Down‐regulation of activity of PnahG promoter involved in salicylate/naphthalene degradation of P. fluorescens H K44 by rich media, glucose and toluene. 

(56) 

Inhibition of ethyl benzene catabolism of P. fluorescens CA4 by glutamate but not glucose or citrate. 

(36) 

Down‐regulation of TOL pathway of pWW0 of P. putida mt2 by rich media, rapid growth, and some carbohydrates e.g. glucose. 

(82)(43)(44) (42)(30) 

Inhibition of degradation of styrene in P. putida CA3 by glutamate and citrate, but not glucose. 

(99) 

Down‐regulation of (methyl)phenol degradation dmp pathway of Pseudomonas sp. CF600 by media that support rapid growth. 

(132) 

Down‐regulation of chlorobenzoate degradation clc pathway of P. putida AC27 by fumarate. 

(85) (86) 

Inhibition of benzoate consumption of Ralstonia eutrophus by succinate.  (6)(5) Down‐regulation of n‐alkane degradation alk pathway of P. oleovorans by rich media and rapid growth. 

(155) (127) 

Down‐regulation of styrene catabolism in P. fluorescens ST by glucose, acetate and glutamate, and to a lesser extent by succinate and lactate. 

(115) 

 The phenomena of global regulation overriding specific regulation 

of hydrocarbon catabolism have been reported in many systems, and some examples are listed in Table 2. The mechanisms of how specific systems are integrated and made subservient to global regulatory  input are many and varied,  and  can  involve  competition  between  pathway  substrates  and central metabolites for binding sites of a regulator (e.g. ClcR), through the action of components of an alternative PTS system (e.g. at the Pu promoter for  toluene  catabolism  of pWW0),  to  switching  of  the use  of different σ‐factors  (e.g. Pm promoter of pWW0)  (reviewed  in 121). The experimental system  used  in  this  study,  that  of  the  dmp‐operon  of  pVI150  from Pseudomonas sp. CF600 is also subservient to global regulation (132). 

 1.6. The experimental system derived from Pseudomonas sp. strain CF600 

Interest  in  the  regulatory  and  metabolic  processes  of  the  soil bacterium Pseudomonas  sp.  strain CF600 mainly derives  from  its ability  to degrade phenols and substituted phenols. This organism was first isolated by  selection  in media  containing  3,  4‐dimethylphenol  as  the  sole  carbon 

28 

source, and subsequently found to similarly grow on phenol, 2‐, 3‐ and 4‐methylphenols.  These  compounds  are  more  usually  known  for  their toxicity than roles as growth substrates. The genetic setup that allows such unusual growth  is conferred by  the dmp‐system, which  includes  the dmp‐operon  and  the  divergently  transcribed  regulatory  gene  dmpR  that  are carried  on  pVI150,  an  Inc‐P2  megaplasmid  (124).  The  dmp‐operon  is composed of  fifteen genes  transcribed  from  the Po promoter. These genes encode  the  nine  enzymes  required  for  sequential  conversion  of (methyl)phenols to pyruvate and acetyl CoA (Fig. 10), which then feed into central metabolism (125).  

Transcription from the Po promoter of the dmp‐operon is dependent on σ54‐RNAP (123), and shows all the typical hallmarks of a σ54‐dependent promoter, including a functional IHF binding site located between the ‐24, ‐12 promoter and distally located UAS sequences that comprise the binding sites  for  DmpR  (131).  Likewise,  the  DmpR  regulator  that  controls  the output from Po is a mechano‐transcriptional regulator of the AAA+ family (101, 149). DmpR  is a sensory  transcriptional regulator  that directly binds phenolic pathway  substrates  (and  structurally  related  compounds) via  its amino‐terminal domain to unlock its transcriptional promoting activity and take  up  its  active  multimeric  form  (100,  149).  As  such,  the  specific regulatory  circuit  provided  by  DmpR  and  Po  serves  to  ensure  that  the metabolically expensive Dmp‐enzymes are only produced when pathway substrates are present. 

            

Fig. 10. Genetic organization of the dmp‐system and the (methyl)phenol catabolic pathway catalyzed by the enzymes  it encodes. Phenolic substrates are converted to catechols by the multi‐component  phenol  hydroxylase  Dmp(K)LMNOP.  Subsequently,  catechol  2,3‐dioxygenase,  (DmpB), mediates  ring‐cleavage  to  initiate  the  sequential  transformation  to acetyl CoA and pyruvate by downstream meta‐pathway enzymes (DmpC to I). 

29 

1.6.1. Subservience of the DmpR/Po system to global regulatory input  When the dmp‐system of pVI150 is transferred from Pseudomonas sp. 

strain CF600  to  the now genome  sequenced  strain  of P.  putida KT2440  it enables  the  new  host  to  degrade  phenolic  substrates  via  the DmpR/Po‐controlled dmp catabolic pathway (124). However, even  in  the presence of phenol, the enzymes of the pathway are not produced during rapid growth on  rich media  (high‐energy  conditions),  becoming  detectable  only  at  the exponential to stationary phase transition (Fig. 11). 

  

0 2 4 6 8 10 12

0,1

1

Gro

wth

(OD

650)

Time (hr)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C230 S

pecific activity

+ phenol - phenol

           

Fig. 11: The expression of the dmp‐operon can be monitored by an enzyme assay of one of the operon gene products, DmpB, which has  catechol‐2,3‐deoxygenase  (C23O) activity. P. putida KT2440 carrying a plasmid encoded dmp‐system does not express DmpB even in the presence of phenol in a rich media until the transition from exponential to stationary phase. 

 The finding that the genetic components of the dmpR gene and the 

Po regulatory region are sufficient to mimic the growth phase response  in both P. putida and E.  coli suggested  that host‐encoded  factors  involved  in this response are  functionally common  to both strains  (132). This allowed the use of E. coli mutants to help decipher the mechanisms underlying this phenomenon. Roles  for some potential global  regulators  in mediating  the growth  phase  response  were  excluded,  such  as  σS,  FIS,  and  quorum signalling molecules  (132), and  these early studies  identified DmpR  levels and  IHF  as  important  for  the  net  transcriptional  output  from  the  σ54‐Po promoter. Subsequently, the alarm signalling molecule ppGpp was shown to be both  required  for  transcriptional output  from  the σ54‐dependent Po promoter and to be a major link between the specific DmpR‐Po regulatory circuit  and  the  physiological  status  of  the  cell.  This  level  of  global regulation dominates  the DmpR‐mediated  regulatory circuit  so  that Po  is 

30 

essentially  silent  under  nutritionally  rich  growth  conditions  (low  ppGpp levels)  and  is  only  active when  levels  of ppGpp  increase,  for  example  i) under nutritionally poor conditions such as media lacking amino acids, ii) when nutrients are depleted as during the transition into stationary phase, or iii) when ppGpp levels are artificially manipulated (133). 

                 

transcription- + - + 2-mp- - + + ATP

ATP

NTPsDmpR

IHF

OH

σ54Core

-24 -12 +1UASs

terminator

transcription- + - + 2-mp- - + + ATP

transcription- + - + 2-mp- - + + ATP

ATP

NTPsDmpR

IHF

OHOH

σ54Core

σ54Core

-24 -12 +1UASs

terminator

 Fig.  12.  Aromatic  effector‐  and  ATP‐dependent  transcription  from  the  σ54‐Po  promoter reproduced  in  vitro. The  required  components  include  the σ54‐RNAP holoenzyme,  the Po regulatory  region, DmpR, an aromatic effector and ATP  required  for DmpR activity,  IHF required for maximal output, and NTPs. 

 Aromatic effector and ATP dependent transcription from the σ54‐Po 

promoter  can  be  fully  reproduced  in  vitro  with  just  a  few  purified components.  These  include  the  σ54‐RNAP  holoenzyme,  Po  regulatory region, DmpR, an aromatic effector and ATP required  for DmpR activity, IHF  required  for maximal  output  and NTPs  (Fig.  12)  (101,  149). Hence, these  components  represent  targets  for  integration  within  the  global regulatory network of the cell. 

In  the  next  section,  I  will  present  studies  conducted  on  global regulation to deduce the molecular mechanisms of how the ppGpp signal is integrated to superimpose its message at the level of transcription from σ54‐dependent promoters. 

31 

AIMS  The  general  aim  of my  research was  to  determine  the molecular 

mechanism(s) of how ppGpp, and  later on DksA, exert  their effects at  the level of  transcription from σ54‐dependent promoters. This general aim can be subdivided into different mechanistic questions as illustrated below: 

   

-24 -12 +1

σ54

Core

-24 -12 +1

σ54

Core

ATP

OH

DmpR

ATP

OHOH

DmpR

IHF

Core andσ-factors

ppGppDksA

ppGppDksA

?

?

?

FtsHPtsNFtsHPtsN

1.Do global regulators

found to impact a closely relatedspecific regulatory circuit

also impact DmpR/Po?2.

Do ppGpp and DksAhave direct and/or indirect effects

on any of the processesof specific regulation?

3.Do ppGpp and DksA regulatory effects

through σ70-transcription explain the impact of these regulatory molecules

on σ54-dependent transcription ?

 

32 

RESULTS AND DISCUSSION  In  this  section,  rather  then  going  through  the  papers 

chronologically,  I  present  the  key  data  under  the mechanistic  questions posed above. 

 1. Do global regulatory systems found to impact a closely related system also impact DmpR/Po? (Paper I) 

The major regulators of the dmp‐ and xyl‐systems, DmpR and XylR, are  two mechanistically  related σ54‐dependent  regulators  that  respond  to distinct sets of aromatic effector compounds representing cognate pathway substrates and structural analogues (reviewed  in 121). The Po promoter  is the  sole  target  for  DmpR,  while  XylR  controls  the  Pu  (upper  operon) promoter  and  the  Ps  promoter  of  second  regulatory  gene  involved  in controlling toluene catabolism. The Po and Pu promoters have three similar regions:  a)  the  ‐24,  ‐12  promoter  motif  recognized  by  σ54‐RNAP,  b)  an integration  host  factor  (IHF)  binding  site  required  for  optimal  promoter output, and  c)  related upstream activating  sequences  (UAS)  for  regulator binding  (1, 39, 125, 131). These common properties allow cross‐regulation of the Pu and Po promoters by DmpR and XylR in response to appropriate aromatic effectors (47). 

Both  systems  are  subject  to  dominant  global  regulation,  which results  in  repression  of  transcription  during  exponential  growth  in  rich media.  In  this  work  we  were  interested  to  determine  (i)  if  two  global regulatory  factors  (FtsH  and  PtsN)  that  impact  the XylR/Pu  system  also influence the DmpR/Po system and (ii) if the alarmone ppGpp, previously analyzed  predominantly  in  E.  coli,  affects  the  two  systems  to  the  same extent in the native P. putida host. 

 1.1. Is FtsH required for σ54‐Po transcription? 

The levels of E. coli ATP‐dependent FtsH protease are controlled in response  to  physiological  cues.  This  protease  is  an  essential  factor  for aerobic  survival  of  E.  coli,  with  ftsH  mutations  requiring  an  additional suppressor mutation in order for the bacteria to grow (111). In an FtsH null E.  coli  strain, XylR‐mediated  transcription  from Pu  is drastically  reduced (24). As shown by  the comparison  in Fig. 13  (Paper  I, Fig. 3A and B),  the DmpR/Po  system  is  fully  functional while  the XylR/Pu  system  is  clearly defective  in  the  absence  of  FtsH. Hence we  concluded  that  FtsH  is  not required  for DmpR/Po  transcription, and  is clearly not an essential  factor 

33 

for σ54‐dependent transcription per se. As shown in the lower panels of Fig. 13,  regulator  swapping  experiments  clearly  indicate  that  the  regulator, rather  than  the  promoter,  determines  sensitivity  to  the  absence  of  FtsH (Paper  I).  Although  the  mechanism  behind  FtsH  dependence  of  the XylR/Pu system  is unknown, one speculation, based on work  from others (96),  is  that  the  chaperone  activity  of  FtsH may  be  required  for  proper assembly and/or disassembly of active multimers of XylR but not DmpR. 

  

0,1

1

10

Gro

wth

OD

600

0

5

10

15

20

25A) XylR/Pu (pVI677)

B) DmpR/Po (pVI466)

E. coli: A8514 ( FtsH+ ) A8926 ( FtsH- )

0

1

2

3

4

5

RLU

/OD

600 x 10,000 (open symbols)

0 1 2 3 4 5 6

0,1

1

10

Gro

wth

OD

600

C) XylR/Po (pVI678)

Time (hr)0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6

D) DmpR/Pu (pVI679)

Time (hr)0

1

2

3

4

5

                 

Fig. 13. Luciferase transcriptional profiles of Po and Pu promoters activated by their native regulators  (panel  A  and  B)  or  non‐native  regulators  (panel  C  and  D)  in  E.  coli  FtsH+ (squares)  and  FtsH‐  (circles).  Culture  growth  is  shown  with  closed  symbols  and  the luciferase response with open symbols (adapted from Paper I). 

 1.2. Is the DmpR/Po system under the control of PtsN‐mediated glucose repression? 

The XylR/Pu  system has been  reported  to be under  the  control of glucose repression by the ptsN gene, which encodes the IIANtr enzyme of an alternative phosphoenolpyruvate‐sugar phospho‐transferase  system  (PTS) (28, 31). As seen in Fig. 14 (Paper I, Fig. 4), the presence of glucose has no effect on the DmpR/Po system  in P. putida while a previously observed 2‐fold  decrease  was  found  in  the  XylR/Pu  system.  Regulator‐swapping experiments  again  indicate  that  the  susceptibility  to  glucose  repression 

34 

depends on the  identity of the regulators (Fig. 14). Hence,  like FtsH, PtsN represents a regulatory factor that impacts the XylR/Pu system but not the DmpR/Po  system  and mediates  its  effect via  the  activity of  the  regulator rather than the properties of the promoter. 

 

0

100

200

300

400

P. putida KT2440 derivatives in M9+CAA M9+CAA+glucose

XylR/Pu XylR/PoDmpR/PuDmpR/Po

Peak

act

ivity

(RLU

/OD

600 x

100

0)

             

Fig.  14.  Peak  luciferase  activities  of  P.  putida  KT2440::dmpR‐Km  and  KT2440::xylR‐Km, carrying plasmids Po‐luxAB or Pu‐luxAB. Cells were grown  in M9 media with 0.2% casein amino acids  (CAA) and  the appropriate aromatic effector, and  further supplemented with 10 mM glucose where indicated (adapted from Paper I).  1.3. Influence of ppGpp on DmpR/Po and XylR/Pu circuits in E. coli and P. putida. 

Previous work  in E.  coli  identified ppGpp as  the major signal  that couples  the  DmpR/Po  system  to  cellular  physiology.  However,  while transcription  from  Po  in  ppGpp0  E.  coli  is  dramatically  reduced, transcription  from  Pu  is  minimally  affected  (26,  133).  To  assess  the dependence  of  the  two  systems  on  ppGpp  in  their  native  host,  a  full ppGpp0 strain of P. putida was generated, as confirmed by chromatographic analysis (Paper I, Fig. 5). The transcriptional profiles of both DmpR/Po and XylR/Pu in P. putida confirmed previous observations in E. coli, i.e. that the DmpR/Po system  is very dependent on ppGpp, although  to a some what lesser  extent  than  in  E.  coli  (Paper  I,  Fig.  6A  to D).  In  comparison,  the expression profiles of  the XylR/Pu system  in both ppGpp+ and ppGpp0 P. putida  still  exhibited  an  abrupt  shift  in  expression  at  the  transition  from exponential  to  stationary  phase.  Thus  while  the  basic  trends  and main conclusions drawn  from  the work  in E. coli were verified  in P. putida,  the magnitude of dependence of the two systems in the different hosts varies. 

35 

To see if the difference in the influence of ppGpp on the DmpR/Po and XylR/Pu systems could be ascribed to regulator or promoter properties, regulator‐swapping experiments were performed with both hosts. The data showed  that  in  the  E.  coli  ppGpp0  background  transcription  from  both DmpR‐driven Pu and XylR‐driven Po were  reduced  (Paper  I, Fig. 6E and F). Thus, having either component of the DmpR/Po pair renders the system more dependent on ppGpp, although not to the same extent (10‐fold) as for the original pair.  In P. putida,  the nature of  the  regulator appeared as  the predominant component that determines the transcriptional outcome, since profiles  with  the  cognate  and  non‐cognate  promoters  are  very  similar. Hence, both the nature of the regulator (most likely expression levels) and the promoter play a  role  in controlling  the  level of expression  seen along the growth curve. 

These  studies  led  to  the  conclusions  that:  i)  neither  of  the  two factors identified to impact the XylR/Pu system (FtsH and PtsN) influences the DmpR/Po  system,  and  ii)  ppGpp  impacts  the DmpR/Po  system  to  a much greater extent than the XylR/Pu system. Thus, even two very similar specific  regulatory  circuits  can  be  locked  into  the  global  regulatory networks  of  bacteria  by  very  different means.  The  predominant  role  of ppGpp  in  controlling  transcription mediated  from  the DmpR/Po  system lead to a focus on the role of this bacterial alarmone and how it dominates the  specific DmpR/Po  regulatory  circuit  in  particular,  and  σ54‐dependent transcription in general. In addition, the observation that responses differed when monitored  in E.  coli and P. putida, prompted  continual  comparison between these two organisms. 

 

2. Do ppGpp and DksA have direct and/or indirect effects on any of the processes of specific regulation? 

To address this question we needed to develop a series of tools that included  i) mutants  incapable  of  synthesizing  ppGpp  and/or DksA,  ii)  a series of σ54‐dependent promoters  that could be directly compared and  in which key DNA elements could be manipulated with minimal disruptions, and iii) reconstituted in vitro transcription systems from both E. coli and P. putida. E. coli mutants were already available and corresponding P. putida mutants were constructed (Paper I and V). Likewise, the necessary purified E. coli derived proteins were already available, and P. putida counterparts were either purified or obtained from generous colleagues (Papers III and V). 

36 

              

Promoter upstream regions

XhoI NdeI

-170 -127 -52

UAS1 UAS2

-24,-12

hybrid σ54-promoters-24 -12 +1

CATATCAGACCTTGGCACAGCCGTTGCTTGATGTCCTGCGC Po/PoCATATCAAGCAATGGCATGGCGGTTGCTAGCTATACGAGAC Po/PuCATATCCACGGCTGGTATGTTCCCTGCACTTCTCTGCTGGC Po/nifHCATATCCACGGCTGGTATGTTTTTTGCACTTCTCTGCTGGC Po/nifH049CATATCAAAAATTGGCACGCAAATTGTATTAACAGTTCAGC Po/pspACATATCAAAAGTTGGCACAGATTTCGCTTTATCTTTTTTAC Po/glnA

IHFluxABdmpRdmpRdmpR

-388BglII

Hin

dIII

Po/Px

×xh-Pu/Px hybrids

xh-Po(-IHF)/Px hybrids

UP

Fig.  15.  Hybrid  σ54‐promoter  regions  of  luxAB  transcriptional  reporters.  Schematic illustration (not to scale) of the Po promoter region is shown together with the locations of the coding regions of dmpR and  the  luciferase  luxAB reporter genes as open boxes. Arrow heads  indicate  the  direction  of  transcription.  The  location  of  the DNA  binding  sites  for DmpR  (inverted  shaded arrows; UAS1, UAS2) and  the  IHF  recognition  sequence  (shaded box)  are  also  indicated.  The  upstream  regions  that  vary  in  xh‐Px/Px  hybrid  promoters, which contain a non‐native XhoI site (xh), have a disrupted IHF binding site or the upstream region from the Pu promoter (adapted from Paper V). 

 To obtain a series of directly comparable σ54‐dependent promoters, 

we  used  the  frame‐work  of  the  Po  promoter  to  ensure  that  appropriate promoter  geometry was maintained  and  to  place  other well  studied  σ54‐promoters under  control  of DmpR. These  series  of hybrid promoters  are schematically  illustrated  in  Fig.  15  (Papers  III  and V).  In  the  first  series, designated  Po/Px,  the  ‐33  to  +2  region  spanning  the  conserved  −24,  −12 promoter  region  from  Po was  replaced  by  the  corresponding  regions  of other σ54‐promoters. These included the P. putida‐derived Pu promoter, the Klebsiella  pneumoniae‐derived  nifH  promoter  and  its  mutant  derivative nifH049, in which substitution of the −17 to −15 CCC by TTT increases both affinity and transcriptional output, and the strong E. coli‐derived pspA and glnA promoters. In a second series, designated xh‐Po(‐IHF)/Px hybrids, the different promoters were  combined with a disruption of  the  IHF‐binding site consensus that maintained the base composition of Po. Abolished IHF‐binding  capacity  as  a  result  of  these manipulations was  confirmed by  in vitro transcription assays (Paper III, Fig. 8B). In the final series, designated xh‐Pu/Px hybrids, the entire ‐116 to ‐40 region was replaced with that of the 

37 

Pu promoter. These hybrids still have  the UAS binding sites for DmpR  in the  same  location  relative  to  the  ‐24,  ‐12  sequence,  but  have  the appropriately  positioned  Pu  UP‐element  and  IHF  binding  site  that  is located  one  helical  turn  from  that  in  Po  (see  Fig.  15). At  Pu,  this  region provides enhanced affinity for σ54‐RNAP by means of IHF mediated DNA architecture  changes  that  allow  simultaneous  binding  of  both  the  α‐subunits of σ54‐RNAP to the distally located UP element (16, 25, 79).  2.1.  Are  both  ppGpp  and  DksA  required  for  efficient  σ54‐dependent transcription in vivo? 

The absence of ppGpp or DksA in both E. coli and P. putida results in a severe decrease in the transcriptional output from the σ54‐Po promoter as shown in Fig. 16 (Paper III and V). The simultaneous lack of both ppGpp and DksA essentially abolishes  transcription  from Po  in E.  coli  (Paper  III, Fig. 1A). The additive negative effect upon loss of both of these regulatory molecules  is  consistent with  the proposed  role of DksA  in  stabilizing  the binding  of  ppGpp  to  RNAP.  However,  as  DksA  can  also  modulate transcriptional properties  in  the absence of ppGpp  (103, 104),  the ppGpp‐independent effects of DksA may also contribute to the net in vivo effect on σ54‐Po and other σ54‐promoters. 

       1

   1  

0 2 4 6

0.

 Fig.  16.  Both  ppGpp  and  DksA  are  required  for  efficient  transcription  from  the  σ54‐Po promoter in P. putida and E. coli. Isogenic strains were used in both cases, and cultured in LB containing  2‐methylphenol. For P.  putida KT2440 derivatives  (left‐hand panel),  dmpR was expressed in monocopy from the host chromosome, and transcription monitored using a Po‐luxAB reporter plasmid. For E. coli MG1655 derivatives (right‐hand panel), transcription was monitored using a dmpR‐Po‐luxAB plasmid (adapted from Paper III and Paper V). 

Gro

wth

(OD

600)

(clo

sed

sym

bols

)

Time (hr)0 2 4 6

0.1

1

E. coli

Time (hr)

0.0

0.5

1.0

1.5P. putida

0.0

0.5

1.0

1.5

Wild-type DksA null

ppGpp0 ppGpp0 / DksA null

Transcription (open symbols)

(Wild-type set as 1)

38 

The  requirement  for  ppGpp  for  transcription  from  σ54‐Po  in  vivo appeared  to  be  associated  with  the  intrinsically  low  affinity  of  the  Po promoter  for  σ54‐RNAP  (131).  This  observation  encouraged  the  direct testing of  the  requirement of ppGpp and DksA  for  transcriptional output from  the Po/Px  series  of  hybrid promoters described  above. The  relative affinities  of  the  hybrid  Po  derivatives  in  the  presence  of  increasing concentrations of σ54‐RNAP  in electro mobility shift assays were shown to lie in the order Po/nifH < Po/Pu < Po/Po < Po/nifH049 < Po/glnA < Po/pspA (Paper III, Fig. 5B), with the first three hybrids (Po/nifH, Po/Pu, and Po/Po) constituting a group of relatively low‐affinity promoters and the second set (Po/nifH049,  Po/glnA,  Po/pspA)  constituting  a  group  of  relatively  high‐affinity promoters. Additionally,  in vitro  transcription data  (Paper  III, Fig. 6)  shows  that  promoter  occupancy  kinetics  differs  such  that  the  higher‐affinity  promoters  rapidly  approach  plateau  values,  while  the  lower‐affinity promoters show slower kinetics. These results defined the relative affinities and hierarchy of promoter occupancies of  the hybrid promoters under in vitro conditions, which would presumably result in higher affinity promoters being occupied more easily by the available pool of σ54‐RNAP in vivo than lower affinity counterparts. 

In E. coli, the temporal in vivo expression of all the hybrid promoters showed  growth‐phase  dependent  profiles  similar  to  Po,  with  absolute levels  that  differed  by  18‐fold  (Paper  III,  Fig.  7C).  These  differences  in promoter  output were  essentially  reiterated with  an E.  coli‐based  in  vitro transcription system (Paper III, Fig. 7D). The powerful high‐affinity hybrid promoters,  such as  the Po/pspA and Po/glnA, also allowed  some  level of transcription even  in  the exponential phase of growth. Most  importantly, all  the  Po/Px  hybrids were  found  to  require  ppGpp  and  DksA  for  full transcriptional output  to an extent that reflects  their affinity  for σ54‐RNAP in  vitro  (Paper  III,  Figs.  5B  and  7C),  i.e.  transcription  from  high‐affinity promoters was  reduced  ~2‐  to  3‐fold  in  the  absence  of  ppGpp  or DksA while transcription from low‐affinity promoters was reduced ~6‐ to 10‐fold. 

 2.2. What’s  true  for  E.  coli  is  (nearly  true)  for P.  putida  –  an  adaptive twist?  

The  nutritionally  and  environmentally  adaptable  Pseudomonads can  thrive  in and occupy a wide variety of niches  including soils, aquatic environments,  and  in  association  with  plants.  Transcription  from  σ54‐promoters, as with any type of promoter, has to function within the context of  the  evolutionary  selected  regulatory network of  the host bacteria. The 

39 

different  lifestyles of P. putida and enteric E. coli are  likely  to have  lead  to adaptations to integrate responses to very different external stimuli. These considerations  prompted  a  similar  series  of  experiments  in  P.  putida  as those described for E. coli (Paper V). 

Consistent with their nutritional adaptability, P. putida ppGpp0 and DksA  null  strains  are  prototrophic which  contrasts  the  polyauxotrophic amino  acid  requirements  of  E.  coli  counterparts  (Paper  V).  In  P.  putida, rather  than  the 18‐fold difference observed  in  transcriptional output  from the lowest‐ to the highest‐affinity hybrid promoter of the Po/Px series in E. coli, only an ~3‐fold difference in the transcriptional output was found, but again  dependency  on  ppGpp  and  DksA  was  found  to  correlate  with promoter  affinity  for σ54‐RNAP  (Paper V, Fig.  8A). This difference  found with  the  Po/Px  hybrid  promoters  as  assessed with  the  two  species was initially  puzzling. However, we  found  that while  P.  putida  derived  σ54‐RNAP recognised the Po/Px hybrid promoters with the same hierarchy as that of E. coli, in vitro transcription with fully P. putida‐derived components reproduced  the  same  ~3‐fold  difference  in  the  transcriptional  output  as seen  in vivo (Paper V, Fig 8B). This suggests that the P. putida derived σ54‐RNAP is less discriminative of promoter differences that influence affinity for E.  coli σ54‐RNAP. We  infer  from  this data  that  this  less‐discriminative property  of  P.  putida  σ54‐RNAP  probably  accounts  for  the  robust transcription  seen  from  even  comparative  low  affinity  promoters  in  P. putida. 

In  contrast  to  the  high  transcription  observed  in  the  post‐exponential phase of growth in P. putida, exponential phase transcription is very  tightly  controlled  (Paper V,  Fig.  4A  to D). A  combination  of  high‐affinity  ‐24,  ‐12 promoter  features with  the  IHF‐dependent UP element of Pu to increase σ54‐RNAP binding, and the use of the XylR regulator that is naturally  expressed  at  higher  levels  than  DmpR,  were  simultaneously required to see any transcription in this phase of growth (Paper V, Fig. 4 F to I). 

It had previously been established  that ppGpp  levels, as  in E. coli, are vastly elevated at the exponential‐to‐stationary phase in P. putida (133). We  used monocopy  reporter  gene  fusions  to  the  PdksA  promoters  in  the chromosomes  of  these  two  organisms,  and  immuno‐detection  of  DksA levels  to determine  that  transcriptional  regulation and changes of protein levels across the growth curve were similar  in each case, Fig. 17 (Paper V, Fig. 6). DksA  levels peak  in mid exponential phase but only vary ~2‐fold across  the  growth  curve  in  both  species.  Thus,  while  σ54‐transcription 

40 

responses to ppGpp and DksA are similar in P. putida and E. coli, P. putida appears  to have  evolved  and  integrated  these  responses  to provide  both tighter  control  of  σ54‐transcription  under  high  energy  conditions  of  the exponential  phase  of  growth, with  vigorous  transcription  upon  nutrient limitation at the exponential‐to‐stationary phase transition. 

 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0.1

1

Gro

wth

(OD

600)

(clo

sed

sym

bols

)

Time (hr)

0

5

10

15

20

P. putida E. coli

Transcription (open symbols)

(RLU

/OD

600 x 10,000)

DksA

t1 t2 t3 t4

E. coli

P. putida

PdksA-luxAB

              

Fig. 17. DksA expression is similar in E. coli and P. putida. Growth and luciferase activity of monocopy  transcriptional  reporter  gene  fusions  on  the  chromosomes  of  P.  putida (KT2440::PdksA‐luxAB) and E. coli (MG1655::PdksA‐luxAB). Both P. putida (squares) and E. coli (circles)  strains were  cultured  at  30oC  in LB  and  luciferase  activity monitored  over  time. Triangles  indicate  the  time  points  that  cells were  harvested  for  immuno‐blot  analysis  of DksA  levels, which are shown  in the  lower part of the Figure. Immuno‐detection of DksA used 2 and 4 μg of SDS‐PAGE separated soluble protein prepared from the indicated strains (adapted from Paper V).  2.3.  Do  ppGpp  and  DksA  have  any  direct  effects  on  σ54‐dependent transcription in vitro? 

In addition to the series of hybrid Po/Px σ54‐promoters, the potential direct  effects  of  ppGpp  and  DksA  on  σ54‐transcription  in  vitro  was compared with  that of  two σ70‐dependent promoters  that had previously been  shown  to be  either positively  stimulated by ppGpp  and DksA  (σ70‐PthrABC) or negatively  regulated by ppGpp and DksA  (the  stringent σ70‐rrnB P1) (103, 104). As illustrated in Fig. 18 (Paper III, Fig. 2B), the presence of ppGpp and DksA had no major stimulatory effect on transcription from σ54‐Po under conditions that recapitulated the known negative and positive effects  on  σ70‐dependent  transcription. As  is  the  case  for  Po,  addition  of 

41 

ppGpp  and  DksA  had  no  significant  stimulatory  effects  on  in  vitro transcription  from  the  hybrid  Po/Px  derivatives with  either  E.  coli  or  P. putida purified components (Paper III, Fig. 7D; Paper V, Fig. 8B). 

  

0 1 2 3 4 50.1

1

0 75 150 225 3000.1

1

PthrABC Po rrnB P1

PthrABC

Po

rrnB P1

2 μM DksA + ppGpp 200 μM ppGpp +DksA               

Fig. 18. Multiple‐round in vitro transcription in the absence or presence of ppGpp and DksA. Autoradiographs of titrations of ppGpp in the presence of constant concentrations of DksA (2 μM; left‐hand panel), and titrations of DksA in the presence of constant concentrations of ppGpp  (200  μM;  right‐hand  panel).  Templates:  σ54‐Po,  σ70‐PthrABC,  and  the  σ70‐rrnB  P1 promoters. Graphs  show  the normalized data  for each promoter with  the zero ppGpp or DksA value set as one (adapted from Paper III).  Despite having no direct  influence on σ54‐dependent  transcription  in vitro, both ppGpp and DksA do target σ54‐RNAP just as they do σ70‐RNAP. This was demonstrated by their negative effects on the  lifetimes of competitor‐resistant open complexes (Paper III, Fig. 3; Paper IV, Fig. 6A to C). Decrease in  competitor‐resistant  open  complex  lifetime will  only  have  impact  on promoters  that have  this as a  rate  limiting step, e.g. σ70‐rRNA promoters. However, this reduction in lifetime does not result in reduced transcription from  the  σ54‐Po promoter under  in  vitro  conditions,  suggesting  that open complex  stability  is  not  the  rate‐limiting  step  for  σ54‐dependent transcription  from  this  promoter.  The  possibility  that  σ54‐dependent transcription from this promoter was influenced by the nature and levels of the  initiating nucleotide was also  investigated, but was not  found  to play any role (Paper III, Fig. 2). 

Tran

scrip

ts

+ 2 μM DksA + 200 μM ppGpp

ppGpp [μM] DksA [μM]

42 

The  lack of any detectable direct effect of ppGpp and DksA on  in vitro  σ54‐transcription  implies  that  these  two  regulatory molecules  exert their effects in vivo by an indirect mechanism. The studies described in the following sections focus on the possible effects of ppGpp and DksA on the levels of key players  involved  in σ54‐Po  transcription  that could couple  to host physiology. 

 2.4. Can  the  requirement  for  ppGpp  and DksA  be  explained  by  their effects on the levels of IHF? 

Transcription  from  the  σ54‐Po  promoter  requires  IHF‐mediated DNA‐bending  for optimal DmpR and σ54‐RNAP  interaction. The  levels of IHF are partially under the control of ppGpp and increase at the transition from exponential to stationary phase of growth (9, 41, 140). Therefore, the influence  of  ppGpp  on  IHF  levels might  contribute  to  the  ppGpp/DksA dependency  of  σ54‐Po  transcription  in  vivo.  To  test  this  possibility,  the hybrid  Po/Px  series  and  cognate  derivatives  containing  disrupted  IHF binding site consensus were used. This approach, as opposed to the use of an IHF‐deficient strain, avoids pleiotropic effects of the loss of IHF, which has global regulatory consequences in vivo (7). 

In vitro transcription assays confirmed that all hybrid σ54‐promoters tested were strongly dependent on capacity to bind IHF (Paper III, Fig. 8B). Likewise,  all  hybrid  σ54‐promoters were  dependent  on  the  IHF  binding capacity for maximal in vivo transcriptional output in both wild‐type E. coli and P. putida (Paper III, Fig. 8C; Paper V, Fig. 3B). However, using the xh‐Po(‐IHF)/Px hybrids  that  lack  the capacity  to bind  IHF, ppGpp and DksA were still both required for maximal promoter output from all derivatives tested, Fig. 19  (Paper  III, Fig. 8D; Paper V, Fig. 5C). As with  IHF binding proficient  derivatives,  simultaneous  loss  of  both  molecules  essentially abolished  detectable  in  vivo  transcription  in  E.  coli.  Additionally,  over‐expression  of  IHF  had  no  significant  effect  on  the  transcriptional  profile from σ54‐Po across the growth curve in wild‐type E. coli (133) or on any of the hybrid σ54‐promoters in P. putida (Paper V, Fig. 3C). These studies led to the conclusion that while IHF levels are important for optimal output from these σ54‐promoters, the mechanism by which ppGpp and DksA  influence transcription  from  these σ54‐promoters  is not  through  their effects on  IHF levels. 

43 

0 2 4 6 8

0.1

1

G

row

th (O

D60

0) (c

lose

d sy

mbo

ls)

Time (hr)

0.0

0.5

1.0

xh-Po(-IHF)Po

Wild-type

ppGpp0

DksA null

ppGpp0 / DksA null

Transcription (open symbols)

(RLU

/OD

600 x 10,000)

 Fig. 19. Transcription of an IHF‐binding incompetent σ54‐Po derived promoter still requires ppGpp  and  DksA.  Growth  (closed  symbols)  and  luciferase  activity  (open  symbols)  of isogenic E. coli strains harbouring a transcriptional reporter plasmid (dmpR‐xh‐Po(‐IHF)/Po‐luxAB), cultured in LB containing 2‐methylphenol (adapted from Paper III). 

 2.5. Can  the  requirement  for  ppGpp  and DksA  be  explained  by  their effects on the levels of DmpR or σ54? 

Western blot analysis revealed that the temporal expression profiles of DmpR and σ54  in wild‐type and mutant E.  coli ppGpp0 and DksA null strains are similar (Paper III, Fig. 1B). In both E. coli and P. putida, σ54 levels remained constant across the growth curve, while DmpR levels vary (Paper III, Fig. 1B, and Paper V, Fig. 2B).  In E.  coli DmpR  levels  increase ~2‐fold over the growth while in P. putida the elevation in DmpR levels is greater. Only lack of ppGpp was found to influence the levels of either of these two key proteins: σ54  levels were unaffected while DmpR  levels were reduced ~2‐fold  in  both  organisms  (Paper  III,  Fig.  1B;  Paper  V,  Fig.  2B). Compensatory  experiments were  performed  in  E.  coli  to  provide DmpR levels  in  the ppGpp0  strain  that  slightly  exceeded  those  in  the wild‐type. However,  this  compensation  did  not  alter  the  degree  of  ppGpp‐dependency of  transcription  from σ54‐Po. This  lead  to  the  conclusion  that while DmpR  levels  are  obviously  critical  for  the  output  from  the  σ54‐Po promoter, ppGpp and DksA exert their action in vivo through a mechanism that is independent of changes of either DmpR or σ54 levels.  

44 

3.  Do  ppGpp  and  DksA  regulatory  effects  through  σ70‐transcription explain the impact of these regulatory molecules on σ54‐transcription? 

The work  outlined  in  the  proceeding  sections  established  i)  that ppGpp and DksA have  little  if any direct  influence on the performance of σ54‐RNAP  on  a  range  of  σ54‐  promoters  tested  in  in  vitro  transcription assays,  ii)  that  the  major  effects  on  transcription  in  vivo  can  not  be accounted  for  by  ppGpp‐associated  changes  in DmpR,  IHF  or  σ54‐levels, and  iii)  that  the  influence  of  ppGpp  and  DksA  on  σ54‐dependent transcription is related to the innate affinity of the promoters for σ54‐RNAP. However, these data do not provide any obvious link between ppGpp and σ54‐dependent  transcription.  So  how  is  ppGpp  linked  to  σ54‐dependent transcription? 

 3.1  Suppressor  mutations  reveal  a  link  between  ppGpp  and  σ54‐dependent transcription 

Some RNAP mutants isolated in the laboratory of M. Cashel on the basis of  restoration of prototrophy had previously been  shown  to  restore efficient  transcription  to  the  σ54‐Po  promoter  in  ppGpp‐deficient  E.  coli (133). This suggested that ppGpp and DksA are likely to have their effects through RNAP, but given  the data already described,  it was not obvious how  this could be so. This prompted a genetic approach  to  try  to  identify the  players  or mechanisms  that  could  provide  the  link  (Paper  III).  The strategy  employed  to  isolate  suppressor  mutants  was  designed  to specifically target DmpR‐regulated Po promoter activity. This involved the use of a selection plasmid carrying the minimal dmp‐system controlling the expression  of  a  promoter‐less  tetracycline  resistance  gene  in  an  E.  coli ppGpp0 strain. This approach resulted in the isolation of many spontaneous mutants.  The  vast  majority  mapped  to  the  components  of  the transcriptional machinery.  DNA  sequencing  identified  two  independent mutations within  the  rpoD  gene  that  encodes  σ70,  nineteen  independent mutations within  rpoB  that  encodes  the  β‐subunit  of  RNAP,  and  twelve independent mutations within  rpoC  that encodes  the β’‐subunit of RNAP (Paper II, III and IV).  

The  degree  of  restoration  of  transcription  from  σ54‐Po  by  these different  mutants  ranged  from  a  barely  detectable  difference  from  that observed in the ppGpp0 parent to >3‐fold higher levels than that observed in the ppGpp proficient wild‐type strain  in vivo (Papers II, Fig. 1B and IV, Fig. 1A), which translate to >30‐fold enhanced transcription in the absence of  ppGpp.  This data  clearly  suggested  that  ppGpp  operates  through  the 

45 

transcriptional  apparatus,  but  raised  the  obvious  question  of  how  do mutations  in  σ70  restore  transcription  to  the  σ54‐dependent  Po  promoter? Given the distinct classes of promoters recognized by the two σ‐factors, it is unlikely that the σ70 mutants directly affect Po output. The most plausible interpretation  of  this data was  that  the  σ70 mutants mediate  their  effects through defects in their association with the common substrate for the two σ‐factors, namely core RNAP. 

 3.2. σ70 mutants are defective in competition with σ54 for core RNAP 

This series of experiments used the two σ70 mutants identified in the genetic  screen  described  above  (designated  σ70‐40Y  and  σ70‐35D),  and  two previously  isolated  σ70 mutants  identified  on  the  basis  of  restoration  of prototrophy (designated σ70‐P504L and σ70‐S506P) (58). The σP

70 mutants all have substitutions that are likely to directly or indirectly alter the path of the σ70‐3.2 loop and/or interaction of σ  with the β‐flap (Paper II). 4

To  test  for  possible  defects  in  competition  for  core  RNAP,  we established  an  in  vitro  competition  assay  that  allowed  simultaneous monitoring  of  transcription  from  the  σ54‐Po  promoter  and  the  σ70‐dependent  promoter  PRNA1.  As  a  first  step  in  the  in  vitro  analysis,  we established the parameters of wild‐type proteins. Consistent with previous data  from others, we  found  that  the  apparent affinities of σ54  and σ70  for core RNAP are similarly high when assessed in isolation (Paper II, Fig. 2B and C). However, under a situation of competition provided by a constant level  of  core  and  σ70 with  increasing  amounts  of  σ54,  or  vice  versa,  clear differences became apparent: σ54 is significantly poorer at out‐competing a fixed concentration of σ70 than the converse (Paper II, Fig. 3A and 4B). 

In vitro competition between the σ70‐mutants and σ54 demonstrated that they indeed were defective in competitive association for core RNAP, with  their deficiencies  lying  in  the order σ70‐40Y > σ70‐P504L > σ70‐S506P > σP

70‐35D (Paper  II,  Fig.  3).  This  order  correlated  with  the  phenotypes  of  these mutants on transcription from σ54‐Po in ppGpp0 E. coli (Paper II, Fig. 1). The most  severely  defective  mutant  (σ70‐40Y)  restored  transcription  to approximately  1.5‐fold  the  levels  seen  in  the  ppGpp+  parent,  the intermediately affected mutants (σ70‐P504L and σ70‐S506P) restored transcription to approximately wild‐type  levels, while  the  least affected mutant  (σ70‐35D) had barely detectable effects in vivo. The σ70‐40Y and σ70‐35D mutants were also tested for their ability to restore transcription from σ54‐Po in the absence of DksA. Again  the magnitude of  their defects  in competitive association  for core  RNAP  correlated  with  their  in  vivo  phenotypes;  σ70‐40Y  resulting  in 

46 

restoration of transcription from Po in the DksA null mutant to ~1.5‐fold of the  levels  observed  in  wild‐type,  while  the  minimally  affected  σ70‐35D resulted in ~0.5‐fold the levels in wild‐type E. coli (Paper III, Fig. 1D) 

These data established that the requirements for ppGpp and DksA for σ54‐transcription  from Po  could be bypassed  in vivo by mutants of  σ70 that are defective  in competitive association  for  limiting core RNAP. This data  strongly  suggested  that  ppGpp  and  DksA  acted  together,  either directly or  indirectly,  to  control σ54‐transcription  through  competition  for core RNAP. However, no detectable effects of ppGpp and DksA could be detected  in  in vitro competition assays between σ70 and σ54, Fig. 20  (Paper III, Fig. 4). Hence, we favour a purely passive model for ppGpp and DksA effects on σ54‐transcription in vivo. 

   

σ54-Po transcripts

σ54 [nM]0 50 100 150 200

0

20

40

60

80

100

No additions + ppGpp/DksA

0

20

40

60

80

100

No additions + ppGpp/DksA

σ70-R

NA

1tra

nscr

ipts

σ70-R

NA

1tra

nscr

ipts

σ70-R

NA

1tra

nscr

ipts

PoRNA1

               

Fig.  20. Multiple‐round  in  vitro  competition  between  σ70  and  σ54  for  core  RNAP  in  the absence  or  presence  of  ppGpp  and DksA. Transcript  levels  are  given  as  a  percentage  of those achieved for σ70‐RNA1 in the presence of 20 nM σ70 and the absence of σ54 (‐‐‐‐‐‐‐), or for  σ54‐Po  in  the  presence  of  160  nM  σ54  and  in  the  absence  of  σ70  (_______),  under  each condition (adapted from Paper III). 

47 

The  concept  that  alternative  σ‐factors  compete  for  their  common substrate  –  core  RNA  polymerase  –  has  a  long  history  and  has  been proposed  to  account  for  a  number  of  observations  relating  to  the  poor performance  of  promoters  controlled  by  alternative  σ‐factors.  Up  until recently, the numbers of σ‐factors in the cell was thought to only be slightly in excess of the number of core RNAP available for association to form the RNAP holoenzyme. However, recent reassessments estimate that  in E. coli grown in rich defined media, ~13,000 molecules of core RNAP are available for  association  with  ~17,000  molecules  of  σ70  (52).  While  being approximately constant throughout growth, the levels of σ70 always exceed those of σ54, and σ54 levels are maintained at about 16‐20% of the level of σ70 (67). Upon entry  in stationary phase,  the  levels of σS also come  into play, and are dramatically increased to about 30% of the level of σ70 (64). Hence, conditions in the cell are such that competition for core RNAP is likely to be fierce. 

 3.3. σ‐factor competition limits σ54‐dependent transcription in vivo 

Manipulation of  the availability of different σ‐factors was used  to experimentally  establish  if  competition  between  σ‐factors  limited  σ54‐dependent transcription in vivo. The first clues that competition for limiting core  might be involved in controlling the output from the σ54‐Po promoter came  from  the  early  observation  that  transcription  from  this promoter  is higher in the absence of σS (132). This observation suggested that σS and σ54 

competed with each other and  led  to a direct comparison of  transcription from  the σ54‐Po promoter  in cells either devoid of σS or expressing excess σ54.  The  data  confirmed  that  lack  of  σS  results  in  ~2‐fold  higher transcriptional  output,  while  elevated  levels  of  σ54  resulted  in  ~2.5‐fold higher transcriptional output (Paper II, Figs. 5C and A).  

σ70  levels are slightly elevated  in ppGpp0 E. coli (58). Therefore, we employed a genetic system with the σ70 gene (rpoD) under the control of the Ptrp  promoter  to  i)  be  able  to  determine  the  effect  of  ppGpp  on  σ54‐Po transcription  independently  of  its  effects  through  σ70  levels  and  ii)  to  be able to artificially under‐produce the essential σ70 factor. As summarised in Fig. 21 (paper II, Fig. 6), using this approach, simple balancing of the levels of σ70 in ppGpp+ and ppGpp0 counterparts to those of wild‐type ppGpp+ E. coli  drastically  reduced  the  effect  of  the  absence  of  ppGpp  on  σ54‐Po transcription  (compare  open  and  shaded  bars  in  left  panel  in  Fig.  21). Furthermore, underproduction and  sequestering of σ70 by  the σ70‐binding protein Rsd  resulted  in >10‐fold  increase  in maximal σ54‐Po  transcription, 

48 

and  transcription during exponential growth where ppGpp  levels are  low and the Po promoter is normally silent (right panel in Fig. 21). Subsequent to  these  findings, work  from  the  laboratory of T. Nyström demonstrated that underproduction of σ70 mimics a stringent response as assessed on the proteomic level (81). 

               

Fig.  21. Effect of modulation  of  in  vivo σ70  levels  on  transcription  from  the Po promoter. Expression  of  rpoD  is  from  the  IAA‐dependent Ptrp promoter  (Ptrp‐rpoD). Left‐hand panel shows  the  transcriptional  output  from  the  Po  promoter  of  a  luciferase  reporter  plasmid (dmpR‐Po‐luxAB) in ppGpp0 CF1693Δlac Ptrp‐rpoD (open bars) or in ppGpp+ MG1655Δlac Ptrp‐rpoD  (shaded  bars)  that  harbour  either  the plasmid pBR‐Rsd  (indicated  as Rsd ↑)  or  the pBR322  vector  control  (indicated  as  Rsd  ‐).  Results  are  the  average  of  data  from  two independent experiments with cultures inoculated into LB supplemented with 0.2 mM IAA (indicated  as  σ70  –  )  or  0.002 mM  IAA  (indicated  as  σ70  ↓). Right‐hand  panel  shows  the immediate Po‐transcriptional response  (open symbols) upon down‐regulation of σ70  levels in CF1693Δlac Ptrp‐rpoD (circles) and its ppGpp proficient counterpart (squares) MG1655Δlac Ptrp‐rpoD. Growth  as measured  by OD600  is  indicated with  closed  symbols  (adapted  from Paper II).  The  results  from  the  in  vivo  assays  establish  that  σ54  is  under  significant competition by both σ70 and σS which results in restricted transcription from σ54‐Po, and supports the idea that ppGpp effects on this process are indirect (passive) since the same effects were observed in ppGpp+ and ppGpp0 cells alike. 

0

5

10

15

20

25

30

Tran

scrip

tion

(RLU

/OD

600 x

10,

000)

0 1 2 30

2

4

6

8

10

12

Tran

scrip

tion

(RLU

/OD

600 x

10,

000)

Time (hr)

0.1

1

Grow

th (OD

600 )

- ↑ - ↑- - ↓ ↓

Rsd σ70

- ↑ - ↑- - ↓ ↓

- ↑ - ↑- - ↓ ↓

Rsd σ70

- ↑ - ↑- - ↓ ↓

(p)ppGpp0 (p)ppGpp+

49 

3.4. Mutations  within  β  and  β´  reveal  a  dual  bypass mechanism  that directly  links  σ54‐transcription  to  properties  associated  with  down‐regulation of stringent σ70‐promoters. 

All  the mutations  in  the  β‐  and  β´‐subunits  of  RNAP  that were identified  in  the  genetic  screen  described  under  section  3.1, map  to  the active site cleft of RNAP (Paper V, Table 2). Five of these mutants (β‐R451C, β‐H551Y, β‐H1244L, β‐Q1264P and β’‐L432R) were  found  to give a hyper‐suppressor  phenotype  on  σ54‐Po  transcription,  resulting  in  20‐  to  60‐fold higher transcription levels than wild‐type RNAP in ppGpp0 E. coli, Fig. 22 (Paper IV, Fig. 2B to F). 

0 2 4 6 8 10

0.1

1

B) rpoC-L432RA) rpoBC-wt

Gro

owth

(OD

600)

0 2 4 6 8 10

0 2 4 6 8 10

C) rpoB-R451C

0 2 4 6 8 10

0.1

1

D) rpoB-H551Y

Gro

wth

(OD

600)

Time (hr)0 2 4 6 8 10

E) rpoB-H1244L

Time (hr)0 2 4 6 8 10

F) rpoB-Q1264P

Time (hr)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0

2

4

6

8

10 WT

ppGpp0

DksA null

0

2

4

6

8

10 Transcription (wt set as 1)

0

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10

Transcription (wt set as 1)

0

2

4

6

8

10

Fig. 22. rpoBC alleles bypass the requirement for ppGpp and DksA. Growth profiles (closed symbols) and transcriptional profiles (open symbols) of strains harbouring a dmpR‐Po‐luxAB plasmid.  Strains  possess  either  wild‐type  (wt)  alleles  or  the  indicated  rpoBC  alleles  in ppGpp+  DksA+  (squares),  or  its  otherwise  isogenic  ppGpp0  (circles)  and  DksA  null (triangles) counterparts. The data for rpoBC‐wt are shown for comparison. Note the change of  scale  for  the  rpoBC mutations  in  panels  B–F,  in which  the  dashed  line  indicates  the maximal wild‐type level (adapted from Paper IV). 

 These  hyper‐suppressors  were  also  able  to  restore  transcription 

from  the σ54‐Po promoter  in E. coli  lacking DksA  to 0.5‐  to 2‐fold  levels of those  found  in  the wild‐type strain  (Fig. 22). However,  transcription  from σ54‐Po  in  the absence of DksA was found  to be notably  lower  than  that  in the absence of ppGpp in all cases, suggesting a critical role for this protein 

50 

in the normal functioning of the cell that is not fully compensated for by the mutations in core RNAP. The essentially ppGpp‐independent behaviour of these  mutants  in  vivo  occurs  despite  the  fact  that  core  RNAP  mutants remain  co‐responsive  to ppGpp  and DksA  in  vitro when  assessed on  the σ70‐rrnB P1 promoter  (Paper  IV, Fig.  5B). This  suggests  that  transcription from the σ54‐Po promoter has reached a ceiling in each of these strains that is the maximal level that can be driven by each of the mutant polymerases.  

In  vitro  comparison  of  σ54‐dependent  and  σ70‐dependent transcription with the core RNAP mutants showed that they mediate 1.1 to 1.6  fold  higher  relative  σ54‐dependent  transcription  (Paper  IV,  Fig.  3E), suggesting  that  these  mutants  may  be  comparatively  defective  in  their association  with  σ70.  In  vitro  assessment  of  their  potential  defects  in competitive  association with σ70  and σ54  supported  this  suggestion,  since the  levels  of  the  defects  were  recapitulated  under  in  vitro  competition conditions  (Paper  IV, Fig. 4). However, while all  the core RNAP mutants exhibited defects,  they were not as extensive as  those  found  for  the σ70‐40Y mutant, and were  closer  to  those observed  for σ70‐P504L and σ70‐S506P. Hence these  differences,  although  significant,  appeared  insufficient  to  fully explain their hyper‐suppressor phenotypes.  

P

To  identify other potential defects of  the  core RNAP mutants  that might contribute to their in vivo hyper‐suppressor phenotypes, we assessed the lifetimes of competitor‐resistant RNAP‐promoter complexes in relation to  the  lifetimes  of  the wild‐type  RNAP  holoenzymes  in  the  presence  of ppGpp and DksA, Fig. 23A  to C  (Paper IV, Fig. 6). This analysis used  the σ54‐Po promoter, the σ70‐λPL promoter, and the rrnB P1 promoter at which ppGpp  and  DksA  effects  on  this  step  are  thought  to  be  critical  for transcriptional down‐regulation  in  response  to  these molecules. Although ppGpp  and  DksA  decrease  the  lifetimes  of  RNAP‐promoter  open complexes at both the σ54‐Po promoter and the σ70‐λPL promoter, this step is not rate limiting, and does not result in reduced transcription. 

As summarised in Fig. 23D to F, all the mutants reduced the lifetime of RNAP‐open complexes at all the promoters. However, for σ54‐Po and σ70‐λPL, the pattern observed with the mutant RNAP holoenzymes was similar, and  the  reduced  lifetimes  that  result  from  these mutations  is above  those evoked by ppGpp and DksA with  the wild‐type RNAP holoenzyme  (Fig. 23D and F). This contrasts the results with the σ70‐rrnB P1 promoter. At this promoter, with  the  exception of β‐Q1264P,  the mutant polymerases  form intrinsically unstable RNAP‐promoter complexes that are close to or below those  found with  the wild‐type  in  the presence of ppGpp and DksA  (Fig. 

51 

23E). These  findings prompted  re‐examination of  the σ70 mutants. The σ70 mutants were also found to mediate specific defects in the lifetimes of open RNAP‐promoter complexes at  the σ70‐rrnB P1 promoter  (Paper  IV, Fig 7), that  like  their defects  in σ‐factor  competition assays, also  correlated with their in vivo phenotypes. 

The vast majority of the suppressor mutants have two defects which could  combine  to  explain  their  in  vivo  phenotypes  on  σ54‐dependent transcription  from  Po:  i)  modulation  of  σ‐factor  to  core  association  to favour σ54 over σ70, and  ii) reduced  innate stability of competitor‐resistant RNAP‐promoter complexes, which mimics the effects of ppGpp and DksA for  negative  regulation  of  stringent  σ70‐promoters.  Both  these  properties support  the purely passive model described below  that  is put  forward  to explain regulation of σ54‐transcription by ppGpp and DksA. 

0 50 100 150 2000

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100

%

tran

scrip

ts re

mai

ning

time (min)

C) σ70-λPLB) σ70-rrnB P1A) σ54-Po

% tr

ansc

ripts

rem

aini

ng

% tr

ansc

ripts

rem

aini

ng

time (min)

time (min)

1 2 3 4 5 60

10

20

30

40

50

60

70 E) σ70-rrnB P1

% rr

nB P

1 tra

nscr

ipts

(10

min

)

1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100F) σ70-λP

L

% λ

PL t

rans

crip

ts (9

0 m

in)

1 2 3 4 5 60

10

20

30

40

50

60

β β'

-wt

β-Q

1264

P

β-H

1244

L

β-H

551Y

β-R

451C

β'-L

432R

D) σ54-Po

% P

o tra

nscr

ipts

(30

min

)

 Fig. 23. The effects of ppGpp and DksA on the lifetimes of open promoter complexes with wild‐type  or mutant  RNA  polymerases.  The  lifetimes  of  competitor‐resistant  complexes generated with 10 nM core RNA polymerase and 80 nM σ‐factor. A)–C) Time courses in the presence  of no  additions  (squares),  200 μM ppGpp  (triangles),  200 nM DksA  (circles),  or both  (open diamonds),  are  shown with  the values  found  at  20  sec  in  the  absence of  any additions set as 100%. Templates used: A. σ54‐Po (11 nM), B. σ70‐rrnB P1 (7 nM), C. σ70‐λPL, (11 nM). D)–F) Were performed as for panels A–C using wild‐type or mutant core enzymes in the absence of ppGpp and DksA, and monitored at the indicated times after competitor additions. Bars 1 to 6 in panels E and F are as indicated in panel D. Dashed lines indicate the corresponding  level  of  the wild‐type  holoenzyme  in  the  presence  of  ppGpp  and  DksA (adapted from Paper IV). 

52 

3.5.  ppGpp  and  DksA  mediated  regulation  of  σ54‐transcription  –  the current model 

The effects of ppGpp and DksA on σ54‐dependent transcription are major,  with  simultaneous  loss  of  these  regulatory  molecules  essentially abolishing  transcription  from  the σ54‐Po promoter. Based on  the collective results presented in this work, any model for ppGpp and DksA regulation of σ54‐transcription has to take into consideration the following: 1) That  the major  effects  of ppGpp  and DksA do not  function  indirectly through  the  levels  of DmpR  or  other  proteins  directly  required  for  σ54‐transcription. 2) That σ54 is under significant competition with other σ‐factors in the cell. 3) That ppGpp and DksA have no apparent direct effects on σ54‐dependent transcription in vitro, either alone or when placed in competition with σ70. 4) That the effects of ppGpp and DksA in vivo are related to the affinity of promoters for σ54‐RNAP. 5) That mutants of σ70, and the β‐ and β’‐subunits of RNAP that can bypass the need  for ppGpp and DksA  in vivo have defects  that would  favour  the formation  of  σ54‐RNAP,  and mimic  the  effects  of  ppGpp  and  DksA  for negative regulation of stringent σ70‐promoters. 

 

The  proposed  passive  model  for  control  of  σ54‐dependent transcription  functions  through predicted global  regulatory  consequences of the negative action of ppGpp and DksA at the seven powerful stringent σ70‐rRNA  operon  promoters.  While  the  levels  of  ppGpp  change dramatically, DksA levels only vary ~2–fold across the growth curve. Thus, this  passive model  primarily  operates  through  changes  in  ppGpp  levels. The powerful  stringent σ70‐rRNA operon promoters  sequester ~60‐70% of the transcriptional machinery during rapid‐to‐intermediate growth on rich media  (18). Thus, under  these conditions,  in which ppGpp  levels are  low (Fig. 24A), sequestering of the majority of the transcriptional machinery by the  rRNA  operons  would  leave  little  free  core  RNAP  available  for association with the constant  levels of σ54 and σ70,  leading to  low  levels of σ54‐RNAP  holoenzyme  and  consequent  low  promoter  occupancy  and output  from  cognate  σ54‐promoters.  However,  under  slow  growth  and stress  conditions  that  elicit high  levels of ppGpp  (Fig.  24B),  the dramatic down‐regulation  of  transcription  from  the  σ70‐rRNA  operon  promoters would lead to increased levels of core RNAP available for association with σ‐factors. As a result, σ54‐RNAP holoenzyme levels would increase, leading to enhanced σ54‐promoter occupancy and output. 

53 

          

Nutrition & other stressA) Low ppGpp B) High ppGpp

σ70-rRNA operons

σ54-operons

σ70-rRNA operons

σ54-operons

core RNAPσ70

σ54

  

Fig. 24. Passive model for ppGpp/DksA control of σ54‐dependent transcription. A) Growth  conditions  that  elicit  low  levels  of  ppGpp. Availability  of  key  transcriptional components  is  illustrated  schematically.  As  detailed  in  the  text,  ~60‐70%  of  the transcriptional machinery  is  sequestered  in  expressing  the  abundant  transcripts  from  the multiple powerful rRNA operon promoters under these conditions. Thus, only low levels of core RNAP would be available for association with different σ‐factors, leading to low levels of σ54‐holoenzyme. B) Conditions  that  elicit high  levels  of ppGpp. Reduced  transcription from  the  rRNA  operon  promoters would  increase  the  levels  of  core RNAP  available  for holoenzyme  formation,  leading  to  higher  levels  of  σ54‐RNAP  holoenzyme  (adapted  from Paper III). 

 Within  this model,  both  core  RNAP‐  and  σ70‐suppressor mutants 

would mimic the effects of ppGpp and  its co‐factor DksA  in two ways: 1) by  directly  reducing  transcription  from  the  powerful  stringent  σ70‐rRNA operon promoters  to elevate  the  levels of core RNAP  for association with other  σ‐factors,  and  2)  by  altering  RNAP  core  to  σ‐factor  association  to favor  the  formation  of  σ54‐RNAP  holoenzyme  over  that  of  σ70‐RNAP holoenzyme.  In  the  case  of  the  core RNAP mutants,  these  effects would further amplify the enhanced output from the σ54‐Po promoter that is found with these mutants RNAP holoenzymes. 

The  model  as  outlined  above  would  predict  that  low‐affinity promoters that have σ54‐RNAP holoenzyme binding as a rate‐limiting step would be more susceptible to loss of these regulatory molecules than their high‐affinity counterparts. This indeed appears to be the case since among six σ54‐promoters tested, those with lower affinity for σ54‐RNAP were found to exhibit greater sensitivity to loss of ppGpp and DksA in vivo than high‐affinity counterparts. 

54 

CONCLUDING REMARKS  The mechanism proposed above for ppGpp/DksA‐mediated passive 

regulation  of  σ54‐dependent  transcription  is  also  pertinent  to  the functioning of other alternative σ‐factors.  In addition  to σ54, DksA and/or ppGpp have been shown to be important for transcription from promoters dependent on σS, σH and σE that control processes critical for stress survival (37, 68). In the case of σS, mutant RNAPs that mimic the effects of ppGpp have also been  shown  to bypass  the  requirement  for ppGpp  in vivo by a mechanism  that  is  independent  of  ppGpp  effects  on  σS  levels  (68,  76). Although the direct effects of ppGpp in synergy with DksA have not been tested at  these σS‐, σH‐ and σE‐dependent promoters,  it appears  likely  that passive regulation of the levels of the cognate holoenzyme would at least in part  contribute  to  regulation  of  their  transcription  and  to  the pleiotropic roles  of  ppGpp  and  DksA  in  controlling  the  activity  of  promoters  in response to nutritional and other stresses. 

So  is  it all purely passive? The  findings  that ppGpp and DksA do not  affect  competition  between  σ54  and  σ70  in  vitro,  contrasts  with  the previously  observed  direct  effects  of  ppGpp  on  competition  between  σH and σ70  (68). Hence  it  is certainly possible  that  for some σ‐factors, ppGpp and DksA may directly  enhance  their  ability  to  compete with  σ70  and/or each other. In addition, the results presented do not exclude the possibility that  a  currently  unknown  regulator(s)  could  also  contribute  to  the requirement for ppGpp and DksA for efficient σ54‐dependent transcription in  vivo.  Akin  to  the  discovery  of  the  role  of  DksA  in  ppGpp‐mediated regulation of σ70‐transcription,  it  is possible that some yet unknown factor could also act in conjunction with ppGpp and DksA to directly control σ54‐dependent  transcription,  or  alternatively,  could  directly  affect  σ‐factor competition for limiting core RNAP. However, only in the latter case could the  existence  of  such  an  unknown  player  account  for  the  σ54‐promoter affinity‐dependent differences in the requirement for ppGpp and DksA. 

55 

ACKNOWLEDGEMENTS  

When I first landed in Umeå, my first thought was: “Where the hell am I? This is going to be a short term experience!! Take a deep breath and make the most of  it while you’re here!”. Seven years later, here I am happily thanking everybody that made  my  life  here  in  Umeå  unforgettable,  in  and  out  of  the  department  of Molecular Biology. I want to start to thank the person that had the courage to take me in her lab and teach me a lot of what I know today, my supervisor Victoria Shingler. Thank you very much  for  all  the  guidance,  the  pushing  forward,  the  enthusiasm  and  the problem solving and, last but not least, the help during the writing of this thesis. Many thanks to past and present members in the lab: Andrew, Chun Chau (pity I didn’t  have  a  chance  to work with  you  longer),  Inga,  “crazy‐red‐haired polish” Agnieszka,  “always  giggling”  Petra,  “adopted  spanish  proper  lady”  Teresa, “always giggling part  II” and  training addict Linda  (wish you  the best of  luck!) and  the mother  of  us  all, my  dear  Eleonore. Mustafa  Jason! Go Newcastle! Go Hull! Thanx  for  the music  in  the  lab,  thanx  for  the England  trip and many more. Hope  to see you soon, mate! Ciao, bella Dafne, you are a very good and special friend,  in  and  out  of  the  lab.  I wish  you  and  Bunny  Boy  the  best  of  luck,  you deserve it! A special obrigado to Fernando and Perpétua for helping me a lot during the very beginning,  for  always  advising me  and  for  keeping  the  portuguese  alive.  I  big smile up to Sugar Baby Mário! I will always remember those great dinners and the picture we took at Nydala with the rest of the foreign gang!! Swiss António, Jojo, Boióla  Vinicius  and  querida  Tania  (tenho  saudades  vossas;  boa  sorte  com  o junior!)  lets do  that Brasil  trip again and  finish killing our  liver!! Thanx  to “curly baixinha” Nadia,  “crazy  rhum‐drinking”  Joan,  Ingela,  “kanguru”  Kurt  for  the great dinners and parties. Wish you guys best of luck. Magnus, Maria, Hans and Gosinha,  thanx  for  the great  conversations,  airsoft  and dark parties  ;)  I want  to thank  Carlos  “Hombre”  and Anna  (soon  it’s  your  turn,  hehe!)  for  being  good personnel friends and ppGpp partners in crime. Big thanks to all the people that listened and/or slept during bacterial seminars, the Hans Wolf‐Watz clan: Sara (your going to be done  in 6 days!), Margareta, Janne (thanx for reparing my bike so many times!), Elin, Ann‐Cathrine, Rolle I, Rolle II; Matt  Francis  (thanx  for  always  being  around  for  a  good  chat  and  a  cold  beer, mate!) & Co: Katrin, Petra; Cathrine Persson,  Jenny and Miss 2M Maria; Debra Milton, Barbara, Medisa and  the Åke Forsberg and his FOI crew. For  those  that are not listed, I apologize! Thanx to “Almighty” Johnny (don’t forget your friend when  you  retire  early!)  that  has  always  delivered  the  goods  on  time;  to  the secretaries and the media personnel many thanx for making our lives easier at the department. 

56 

Tack  så  jätte mycket  för  allt möjligt  till mina  svenska  kompisar: Nasse, Jenny,  Åsa,  Andreas,  Kiwi, Dr.  Johanna.  Um muito  obrigado  especial  para  ti Lotta,  ajudaste‐me  imenso  e  estiveste  ao meu  lado  durante  estes  ultimos  anos. Tiraste‐me do  lab para viajarmos,  sem  ti nao  tinha  conhecido o que  conheco da Suécia, sem  ti nao  tinha conhecido muitos dos meus amigos suecos,  foste  tu que me  ajudaste  a  aprender  sueco,  a  esquiar  e muito mais.  Sem  tudo  isto nao  tinha conseguido fazer esta tese. Desejo‐te muita sorte para o teu doutoramento. Beijo e muito obrigado! Cumprimentos ao clã Sandberg. 

Prá malta do Porto: Joao Juani, Nuno Cigano, Duarte Zum, Daniel Demo, Raquel e Joana Desalojada, espero que possamos manter contacto e amizade para sempre. Boa sorte prá vocês!! Para o meu irmao Hugo (contigo para sempre até ao fim!), Xana e sobrinho Diogo e pró resto da familia Tavares um forte abraco e um muito obrigado! 

Por fim, um grande muito obrigado prós meus pais. Obrigado pela ajuda, por me terem sempre apoiado e aconselhado, e por nunca dizerem não (salvo raras excepcões,  hehe!!).  Sem  vocês  nao  tinha  chegado  onde  cheguei  nem  tinha conseguido o que consegui. Beijo e abraco! 

57 

REFERENCES  

1.  Abril, M. A., M. Buck, and J. L. Ramos. 1991. Activation of the Pseudomonas TOL plasmid upper pathway operon. Identification of binding sites for the positive regulator XylR and for integration host factor protein. J Biol Chem 266:15832‐15838. 

2.  Afflerbach, H., O. Schroder, and R. Wagner. 1998. Effects of the Escherichia coli DNA‐binding protein H‐NS on rRNA synthesis in vivo. Mol Microbiol 28:641‐53. 

3.  Alba, B. M., and C. A. Gross. 2004. Regulation of the Escherichia coli sigma‐dependent envelope stress response. Mol Microbiol 52:613‐9. 

4.  Aldridge, P. D., J. E. Karlinsey, C. Aldridge, C. Birchall, D. Thompson, J. Yagasaki, and K. T. Hughes. 2006. The flagellar‐specific transcription factor, sigma28, is the Type III secretion chaperone for the flagellar‐specific anti‐sigma28 factor FlgM. Genes Dev 20:2315‐26. 

5.  Ampe, F., D. Leonard, and N. D. Lindley. 1998. Repression of phenol catabolism by organic acids in Ralstonia eutropha. Appl Environ Microbiol 64:1‐6. 

6.  Ampe, F., J. L. Uribelarrea, G. M. Aragao, and N. D. Lindley. 1997. Benzoate degradation via the ortho pathway in Alcaligenes eutrophus is perturbed by succinate. Appl Environ Microbiol 63:2765‐2770. 

7.  Arfin, S. M., A. D. Long, E. T. Ito, L. Tolleri, M. M. Riehle, E. S. Paegle, and G. W. Hatfield. 2000. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12. The effects of integration host factor. J Biol Chem 275:29672‐29684. 

8.  Artsimovitch, I., V. Patlan, S. Sekine, M. N. Vassylyeva, T. Hosaka, K. Ochi, S. Yokoyama, and D. G. Vassylyev. 2004. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell 117:299‐310. 

9.  Aviv, M., H. Giladi, G. Schreiber, A. B. Oppenheim, and G. Glaser. 1994. Expression of the genes coding for the Escherichia coli integration host factor are controlled by growth phase, rpoS, ppGpp and by autoregulation. Mol Microbiol 14:1021‐31. 

10.  Azam, T. A., A. Iwata, A. Nishimura, S. Ueda, and A. Ishihama. 1999. Growth phase‐dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J Bacteriol 181:6361‐6370. 

11.  Barker, M. M., T. Gaal, C. A. Josaitis, and R. L. Gourse. 2001. Mechanism of regulation of transcription initiation by ppGpp. I. Effects of ppGpp on transcription initiation in vivo and in vitro. J Mol Biol 305:673‐688. 

12.  Barrios, H., B. Valderrama, and E. Morett. 1999. Compilation and analysis of σ54‐dependent promoter sequences. Nucleic Acids Res 27:4305‐4313. 

13.  Battesti, A., and E. Bouveret. 2006. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT‐dependent stress response to fatty acid metabolism. Mol Microbiol 62:1048‐63. 

58 

14.  Bentley, S. D., K. F. Chater, A. M. Cerdeno‐Tarraga, G. L. Challis, N. R. Thomson, K. D. James, D. E. Harris, M. A. Quail, H. Kieser, D. Harper, A. Bateman, S. Brown, G. Chandra, C. W. Chen, M. Collins, A. Cronin, A. Fraser, A. Goble, J. Hidalgo, T. Hornsby, S. Howarth, C. H. Huang, T. Kieser, L. Larke, L. Murphy, K. Oliver, S. OʹNeil, E. Rabbinowitsch, M. A. Rajandream, K. Rutherford, S. Rutter, K. Seeger, D. Saunders, S. Sharp, R. Squares, S. Squares, K. Taylor, T. Warren, A. Wietzorrek, J. Woodward, B. G. Barrell, J. Parkhill, and D. A. Hopwood. 2002. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417:141‐7. 

15.  Berger, D. K., F. Narberhaus, H. S. Lee, and S. Kustu. 1995. In vitro studies of the domains of the nitrogen fixation regulatory protein NIFA. J Bacteriol 177:191‐199. 

16.  Bertoni, G., N. Fujita, A. Ishihama, and V. de Lorenzo. 1998. Active recruitment of σ54‐RNA polymerase to the Pu promoter of Pseudomonas putida: role of IHF and alphaCTD. EMBO J 17:5120‐5128. 

17.  Bordes, P., S. R. Wigneshweraraj, J. Schumacher, X. Zhang, M. Chaney, and M. Buck. 2003. The ATP hydrolyzing transcription activator phage shock protein F of Escherichia coli: Identifying a surface that binds sigma 54. Proc Natl Acad Sci U S A 100:2278‐2283. 

18.  Bremer, H., and P. P. Dennis. 1996. Modulation of chemical composition and other parameters of the cell by growth rate, p. 1553‐1569. In F. C. Neidhardt, R. I. Curtis, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, vol. 2. American Society of Microbiology Press, Washington, D.C. 

19.  Browning, D. F., and S. J. Busby. 2004. The regulation of bacterial transcription initiation. Nat Rev Microbiol 2:57‐65. 

20.  Buck, M., M. T. Gallegos, D. J. Studholme, Y. Guo, and J. D. Gralla. 2000. The bacterial enhancer‐dependent σ54 (σN) transcription factor. J Bacteriol 182:4129‐4136. 

21.  Campbell, E. A., O. Muzzin, M. Chlenov, J. L. Sun, C. A. Olson, O. Weinman, M. L. Trester‐Zedlitz, and S. A. Darst. 2002. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell 9:527‐539. 

22.  Cannon, W., M. Chaney, and M. Buck. 1999. Characterisation of holoenzyme lacking σN regions I and II. Nucleic Acids Res 27:2478‐2486. 

23.  Cannon, W., M. T. Gallegos, P. Casaz, and M. Buck. 1999. Amino‐terminal sequences of σN (σ54) inhibit RNA polymerase isomerization. Genes Dev 13:357‐370. 

24.  Carmona, M., and V. de Lorenzo. 1999. Involvement of the FtsH (HflB) protease in the activity of σ54 promoters. Mol Microbiol 31:261‐270. 

59 

25.  Carmona, M., V. de Lorenzo, and G. Bertoni. 1999. Recruitment of RNA polymerase is a rate‐limiting step for the activation of the σ54 promoter Pu of Pseudomonas putida. J Biol Chem 274:33790‐33794. 

26.  Carmona, M., M. J. Rodriguez, O. Martinez‐Costa, and V. De Lorenzo. 2000. In vivo and in vitro effects of (p)ppGpp on the σ54 promoter Pu of the TOL plasmid of Pseudomonas putida. J Bacteriol 182:4711‐4718. 

27.  Casaz, P., and M. Buck. 1999. Region I modifies DNA‐binding domain conformation of  σ54 within the holoenzyme. J Mol Biol 285:507‐514. 

28.  Cases, I., and V. de Lorenzo. 2000. Genetic evidence of distinct physiological regulation mechanisms in the σ54 Pu promoter of Pseudomonas putida. J Bacteriol 182:956‐960. 

29.  Cases, I., and V. de Lorenzo. 2005. Promoters in the environment: transcriptional regulation in its natural context. Nat Rev Microbiol 3:105‐18. 

30.  Cases, I., V. de Lorenzo, and J. Perez‐Martin. 1996. Involvement of σ54 in exponential silencing of the Pseudomonas putida TOL plasmid Pu promoter. Mol Microbiol 19:7‐17. 

31.  Cases, I., J. Pérez‐Martín, and V. de Lorenzo. 1999. The IIANtr (PtsN) protein of Pseudomonas putida mediates the C source inhibition of the σ54‐dependent Pu promoter of the TOL plasmid. J Biol Chem 274:15562‐15568. 

32.  Cashel, M., D. Gentry, V. J. Hernandez, and D. Vinella. 1996. The stringent response, p. 1458‐1496. In F. C. Neidhardt, R. I. Curtis, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed, vol. I. American Society of Microbiology Press, Washington, D.C. 

33.  Chaney, M., and M. Buck. 1999. The σ54 DNA‐binding domain includes a determinant of enhancer responsiveness. Mol Microbiol 33:1200‐1209. 

34.  Chatterji, D., N. Fujita, and A. Ishihama. 1998. The mediator for stringent control, ppGpp, binds to the beta‐subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Genes Cells 3:279‐287. 

35.  Claverie‐Martin, F., and B. Magasanik. 1992. Positive and negative effects of DNA bending on activation of transcription from a distant site. J Mol Biol 227:996‐1008. 

36.  Corkery, D. M., K. E. OʹConnor, C. M. Buckley, and A. D. Dobson. 1994. Ethylbenzene degradation by Pseudomonas fluorescens strain CA‐4. FEMS Microbiol Lett 124:23‐27. 

37.  Costanzo, A., and S. E. Ades. 2006. Growth phase‐dependent regulation of the extracytoplasmic stress factor, sigmaE, by guanosine 3ʹ,5ʹ‐bispyrophosphate (ppGpp). J Bacteriol 188:4627‐34. 

38.  Dai, X., and L. B. Rothman‐Denes. 1999. DNA structure and transcription. Curr Opin Microbiol 2:126‐130. 

60 

39.  de Lorenzo, V., M. Herrero, M. Metzke, and K. N. Timmis. 1991. An upstream XylR‐ and IHF‐induced nucleoprotein complex regulates the σ 54‐dependent Pu promoter of TOL plasmid. Embo J 10:1159‐1167. 

40.  deHaseth, P. L., M. L. Zupancic, and M. T. Record, Jr. 1998. RNA polymerase‐promoter interactions: the comings and goings of RNA polymerase. J Bacteriol 180:3019‐25. 

41.  Ditto, M. D., D. Roberts, and R. A. Weisberg. 1994. Growth phase variation of integration host factor level in Escherichia coli. J Bacteriol 176:3738‐3748. 

42.  Du, Y., A. Holtel, J. Reizer, and M. H. Saier, Jr. 1996. σ54‐dependent transcription of the Pseudomonas putida xylS operon is influenced by the IIANtr protein of the phosphotransferase system in Escherichia coli. Res Microbiol 147:129‐132. 

43.  Duetz, W. A., S. Marqués, C. de Jong, J. L. Ramos, and J. G. van Andel. 1994. Inducibility of the TOL catabolic pathway in Pseudomonas putida (pWW0) growing on succinate in continuous culture: evidence of carbon catabolite repression control. J Bacteriol 176:2354‐2361. 

44.  Duetz, W. A., S. Marqués, B. Wind, J. L. Ramos, and J. G. van Andel. 1996. Catabolite repression of the toluene degradation pathway in Pseudomonas putida harboring pWW0 under various conditions of nutrient limitation in chemostat culture. Appl Environ Microbiol 62:601‐606. 

45.  Dworkin, J., G. Jovanovic, and P. Model. 1997. Role of upstream activation sequences and integration host factor in transcriptional activation by the constitutively active prokaryotic enhancer‐binding protein PspF. J Mol Biol 273:377‐388. 

46.  Eymann, C., G. Mittenhuber, and M. Hecker. 2001. The stringent response, sigmaH‐dependent gene expression and sporulation in Bacillus subtilis. Mol Gen Genet 264:913‐23. 

47.  Fernández, S., V. Shingler, and V. De Lorenzo. 1994. Cross‐regulation by XylR and DmpR activators of Pseudomonas putida suggests that transcriptional control of biodegradative operons evolves independently of catabolic genes. J Bacteriol 176:5052‐5058. 

48.  Gallegos, M. T., and M. Buck. 2000. Sequences in σ54 region I required for binding to early melted DNA and their involvement in sigma‐DNA isomerisation. J Mol Biol 297:849‐859. 

49.  Gallegos, M. T., and M. Buck. 1999. Sequences in σN determining holoenzyme formation and properties. J Mol Biol 288:539‐553. 

50.  Ghosh, P., A. Ishihama, and D. Chatterji. 2001. Escherichia coli RNA polymerase subunit omega and its N‐terminal domain bind full‐length betaʹ to facilitate incorporation into the alpha2beta subassembly. Eur J Biochem 268:4621‐4627. 

51.  Gourse, R. L., W. Ross, and T. Gaal. 2000. UPs and downs in bacterial transcription initiation: the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition. Mol Microbiol 37:687‐95. 

61 

52.  Grigorova, I. L., N. J. Phleger, V. K. Mutalik, and C. A. Gross. 2006. Insights into transcriptional regulation and sigma competition from an equilibrium model of RNA polymerase binding to DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 103:5332‐7. 

53.  Gross, C. A., C. Chan, A. Dombroski, T. Gruber, M. Sharp, J. Tupy, and B. Young. 1998. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63:141‐55. 

54.  Gruber, T. M., and C. A. Gross. 2003. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol 57:441‐66. 

55.  Guo, Y., L. Wang, and J. D. Gralla. 1999. A fork junction DNA‐protein switch that controls promoter melting by the bacterial enhancer‐dependent sigma factor. Embo J 18:3736‐3745. 

56.  Heitzer, A., K. Malachowsky, J. E. Thonnard, P. R. Bienkowski, D. C. White, and G. S. Sayler. 1994. Optical biosensor for environmental on‐line monitoring of naphthalene and salicylate bioavailability with an immobilized bioluminescent catabolic reporter bacterium. Appl Environ Microbiol 60:1487‐94. 

57.  Hengge‐Aronis, R. 2002. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the sigma(S) (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiol Mol Biol Rev 66:373‐95, table of contents. 

58.  Hernandez, V. J., and M. Cashel. 1995. Changes in conserved region 3 of Escherichia coli  σ70 mediate ppGpp‐dependent functions in vivo. J Mol Biol 252:536‐49. 

59.  Hirsch, M., and T. Elliott. 2002. Role of ppGpp in rpoS stationary‐phase regulation in Escherichia coli. J Bacteriol 184:5077‐87. 

60.  Hogg, T., U. Mechold, H. Malke, M. Cashel, and R. Hilgenfeld. 2004. Conformational antagonism between opposing active sites in a bifunctional RelA/SpoT homolog modulates (p)ppGpp metabolism during the stringent response [corrected]. Cell 117:57‐68. 

61.  Hoover, T. R., E. Santero, S. Porter, and S. Kustu. 1990. The integration host factor stimulates interaction of RNA polymerase with NIFA, the transcriptional activator for nitrogen fixation operons. Cell 63:11‐22. 

62.  Hsu, L. M. 2002. Open season on RNA polymerase. Nat Struct Biol 9:502‐4. 63.  Hsu, L. M. 2002. Promoter clearance and escape in prokaryotes. Biochim 

Biophys Acta 1577:191‐207. 64.  Jishage, M., and A. Ishihama. 1995. Regulation of RNA polymerase sigma 

subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of σ70 and σ38. J Bacteriol 177:6832‐5. 

65.  Jishage, M., and A. Ishihama. 1998. A stationary phase protein in Escherichia coli with binding activity to the major sigma subunit of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 95:4953‐8. 

62 

66.  Jishage, M., and A. Ishihama. 1999. Transcriptional organization and in vivo role of the Escherichia coli rsd gene, encoding the regulator of RNA polymerase sigma D. J Bacteriol 181:3768‐76. 

67.  Jishage, M., A. Iwata, S. Ueda, and A. Ishihama. 1996. Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of four species of sigma subunit under various growth conditions. J Bacteriol 178:5447‐51. 

68.  Jishage, M., K. Kvint, V. Shingler, and T. Nystrom. 2002. Regulation of sigma factor competition by the alarmone ppGpp. Genes Dev 16:1260‐70. 

69.  Jores, L., and R. Wagner. 2003. Essential steps in the ppGpp‐dependent regulation of bacterial ribosomal RNA promoters can be explained by substrate competition. J Biol Chem 278:16834‐43. 

70.  Jovanovic, G., and P. Model. 1997. PspF and IHF bind co‐operatively in the psp promoter‐regulatory region of Escherichia coli. Mol Microbiol 25:473‐81. 

71.  Jovanovic, G., J. Rakonjac, and P. Model. 1999. In vivo and in vitro activities of the Escherichia coli σ54 transcription activator, PspF, and its DNA‐binding mutant, PspFΔHTH. J Mol Biol 285:469‐83. 

72.  Kang, P. J., and E. A. Craig. 1990. Identification and characterization of a new Escherichia coli gene that is a dosage‐dependent suppressor of a dnaK deletion mutation. J Bacteriol 172:2055‐64. 

73.  Kelly, M. T., and T. R. Hoover. 2000. The amino terminus of Salmonella enterica serovar Typhimurium σ54 is required for interactions with an enhancer‐binding protein and binding to fork junction DNA. J Bacteriol 182:513‐7. 

74.  Kim, H. Y., D. Schlictman, S. Shankar, Z. Xie, A. M. Chakrabarty, and A. Kornberg. 1998. Alginate, inorganic polyphosphate, GTP and ppGpp synthesis co‐regulated in Pseudomonas aeruginosa: implications for stationary phase survival and synthesis of RNA/DNA precursors. Mol Microbiol 27:717‐25. 

75.  Kuroda, A., H. Murphy, M. Cashel, and A. Kornberg. 1997. Guanosine tetra‐ and pentaphosphate promote accumulation of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. J Biol Chem 272:21240‐3. 

76.  Kvint, K., A. Farewell, and T. Nyström. 2000. RpoS‐dependent promoters require guanosine tetraphosphate for induction even in the presence of high levels of σS. J Biol Chem 275:14795‐8. 

77.  Lange, R., D. Fischer, and R. Hengge‐Aronis. 1995. Identification of transcriptional start sites and the role of ppGpp in the expression of rpoS, the structural gene for the σS‐subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. J Bacteriol 177:4676‐80. 

78.  Lonetto, M., M. Gribskov, and C. A. Gross. 1992. The sigma 70 family: sequence conservation and evolutionary relationships. J Bacteriol 174:3843‐9. 

63 

79.  Macchi, R., L. Montesissa, K. Murakami, A. Ishihama, V. De Lorenzo, and G. Bertoni. 2003. Recruitment of  σ54‐RNA polymerase to the Pu promoter of Pseudomonas putida through integration host factor‐mediated positioning switch of alpha subunit carboxyl‐terminal domain on an UP‐like element. J Biol Chem 278:27695‐702. 

80.  Magnusson, L. U., A. Farewell, and T. Nystrom. 2005. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends Microbiol 13:236‐42. 

81.  Magnusson, L. U., T. Nystrom, and A. Farewell. 2003. Underproduction of sigma 70 mimics a stringent response. A proteome approach. J Biol Chem 278:968‐73. 

82.  Marqués, S., A. Holtel, K. N. Timmis, and J. L. Ramos. 1994. Transcriptional induction kinetics from the promoters of the catabolic pathways of TOL plasmid pWW0 of Pseudomonas putida for metabolism of aromatics. J Bacteriol 176:2517‐24. 

83.  Martinez‐Bueno, M. A., R. Tobes, M. Rey, and J. L. Ramos. 2002. Detection of multiple extracytoplasmic function (ECF) sigma factors in the genome of Pseudomonas putida KT2440 and their counterparts in Pseudomonas aeruginosa PA01. Environ Microbiol 4:842‐55. 

84.  Mason, J. R. 1994. The induction and repression of benzene and catechol oxidizing capacity of Pseudomonas putida ML2 studied in perturbed chemostat culture. Arch Microbiol 162:57‐62. 

85.  McFall, S. M., B. Abraham, C. G. Narsolis, and A. M. Chakrabarty. 1997. A tricarboxylic acid cycle intermediate regulating transcription of a chloroaromatic biodegradative pathway: fumarate‐mediated repression of the clcABD operon. J Bacteriol 179:6729‐35. 

86.  McFall, S. M., S. A. Chugani, and A. M. Chakrabarty. 1998. Transcriptional activation of the catechol and chlorocatechol operons: variations on a theme. Gene 223:257‐67. 

87.  Mekler, V., E. Kortkhonjia, J. Mukhopadhyay, J. Knight, A. Revyakin, A. N. Kapanidis, W. Niu, Y. W. Ebright, R. Levy, and R. H. Ebright. 2002. Structural organization of bacterial RNA polymerase holoenzyme and the RNA polymerase‐promoter open complex. Cell 108:599‐614. 

88.  Merrick, M. J. 1993. In a class of its own‐‐the RNA polymerase sigma factor σ54 (σN). Mol Microbiol 10:903‐9. 

89.  Mittenhuber, G. 2001. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p)ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA and SpoT proteins). J Mol Microbiol Biotechnol 3:585‐600. 

90.  Murakami, K. S., and S. A. Darst. 2003. Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol 13:31‐9. 

91.  Murakami, K. S., S. Masuda, and S. A. Darst. 2002. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science 296:1280‐4. 

64 

92.  Murray, K. D., and H. Bremer. 1996. Control of spoT‐dependent ppGpp synthesis and degradation in Escherichia coli. J Mol Biol 259:41‐57. 

93.  Murtin, C., M. Engelhorn, J. Geiselmann, and F. Boccard. 1998. A quantitative UV laser footprinting analysis of the interaction of IHF with specific binding sites: re‐evaluation of the effective concentration of IHF in the cell. J Mol Biol 284:949‐61. 

94.  Neidhardt, F. C., and M. A. Savageau. 1996. Regulation beyond the operon, p. 1310‐1324. In F. C. Neidhardt, R. I. Curtis, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed, vol. I. American Soceity of Microbiology Press, Washington, D.C. 

95.  Nelson, K. E., C. Weinel, I. T. Paulsen, R. J. Dodson, H. Hilbert, V. A. Martins dos Santos, D. E. Fouts, S. R. Gill, M. Pop, M. Holmes, L. Brinkac, M. Beanan, R. T. DeBoy, S. Daugherty, J. Kolonay, R. Madupu, W. Nelson, O. White, J. Peterson, H. Khouri, I. Hance, P. Chris Lee, E. Holtzapple, D. Scanlan, K. Tran, A. Moazzez, T. Utterback, M. Rizzo, K. Lee, D. Kosack, D. Moestl, H. Wedler, J. Lauber, D. Stjepandic, J. Hoheisel, M. Straetz, S. Heim, C. Kiewitz, J. Eisen, K. N. Timmis, A. Dusterhoft, B. Tummler, and C. M. Fraser. 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol 4:799‐808. 

96.  Neuwald, A. F., L. Aravind, J. L. Spouge, and E. V. Koonin. 1999. AAA+: A class of chaperone‐like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9:27‐43. 

97.  Nickels, B. E., and A. Hochschild. 2004. Regulation of RNA polymerase through the secondary channel. Cell 118:281‐4. 

98.  Nystrom, T. 2004. Growth versus maintenance: a trade‐off dictated by RNA polymerase availability and sigma factor competition? Mol Microbiol 54:855‐62. 

99.  OʹConnor, K., C. M. Buckley, S. Hartmans, and A. D. Dobson. 1995. Possible regulatory role for nonaromatic carbon sources in styrene degradation by Pseudomonas putida CA‐3. Appl Environ Microbiol 61:544‐8. 

100.  OʹNeill, E., L. C. Ng, C. C. Sze, and V. Shingler. 1998. Aromatic ligand binding and intramolecular signalling of the phenol‐ responsive σ54‐dependent regulator DmpR. Mol Microbiol 28:131‐41. 

101.  OʹNeill, E., P. Wikstrom, and V. Shingler. 2001. An active role for a structured B‐linker in effector control of the σ54‐dependent regulator DmpR. Embo J 20:819‐27. 

102.  Pan, C. Q., S. E. Finkel, S. E. Cramton, J. A. Feng, D. S. Sigman, and R. C. Johnson. 1996. Variable structures of Fis‐DNA complexes determined by flanking DNA‐protein contacts. J Mol Biol 264:675‐95. 

65 

103.  Paul, B. J., M. M. Barker, W. Ross, D. A. Schneider, C. Webb, J. W. Foster, and R. L. Gourse. 2004. DksA: a critical component of the transcription initiation machinery that potentiates the regulation of rRNA promoters by ppGpp and the initiating NTP. Cell 118:311‐22. 

104.  Paul, B. J., M. B. Berkmen, and R. L. Gourse. 2005. DksA potentiates direct activation of amino acid promoters by ppGpp. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7823‐8. 

105.  Paul, B. J., W. Ross, T. Gaal, and R. L. Gourse. 2004. rRNA transcription in Escherichia coli. Annu Rev Genet 38:749‐70. 

106.  Pelton, J. G., S. Kustu, and D. E. Wemmer. 1999. Solution structure of the DNA‐binding domain of NtrC with three alanine substitutions. J Mol Biol 292:1095‐110. 

107.  Perederina, A., V. Svetlov, M. N. Vassylyeva, T. H. Tahirov, S. Yokoyama, I. Artsimovitch, and D. G. Vassylyev. 2004. Regulation through the secondary channel‐‐structural framework for ppGpp‐DksA synergism during transcription. Cell 118:297‐309. 

108.  Pérez‐Martín, J., and V. De Lorenzo. 1995. The amino‐terminal domain of the prokaryotic enhancer‐binding protein XylR is a specific intramolecular repressor. Proc Natl Acad Sci U S A 92:9392‐6. 

109.  Pérez‐Martín, J., and V. De Lorenzo. 1995. Integration host factor suppresses promiscuous activation of the σ54‐dependent promoter Pu of Pseudomonas putida. Proc Natl Acad Sci U S A 92:7277‐81. 

110.  Potrykus, K., G. Wegrzyn, and V. J. Hernandez. 2002. Multiple mechanisms of transcription inhibition by ppGpp at the lambdap(R) promoter. J Biol Chem 277:43785‐91. 

111.  Qu, J. N., S. I. Makino, H. Adachi, Y. Koyama, Y. Akiyama, K. Ito, T. Tomoyasu, T. Ogura, and H. Matsuzawa. 1996. The tolZ gene of Escherichia coli is identified as the ftsH gene. J Bacteriol 178:3457‐61. 

112.  Rappas, M., J. Schumacher, F. Beuron, H. Niwa, P. Bordes, S. Wigneshweraraj, C. A. Keetch, C. V. Robinson, M. Buck, and X. Zhang. 2005. Structural insights into the activity of enhancer‐binding proteins. Science 307:1972‐5. 

113.  Rice, P. A., S. Yang, K. Mizuuchi, and H. A. Nash. 1996. Crystal structure of an IHF‐DNA complex: a protein‐induced DNA U‐turn. Cell 87:1295‐306. 

114.  Richardson, J. P., and J. Greenblatt. 1996. Control of RNA chain elongation and termination, p. 822‐848. In F. C. Neidhardt, R. I. Curtis, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed, vol. I. American Society of Microbiology Press, Washington, D.C. 

115.  Santos, P. M., J. M. Blatny, I. Di Bartolo, S. Valla, and E. Zennaro. 2000. Physiological analysis of the expression of the styrene degradation gene cluster in Pseudomonas fluorescens ST. Appl Environ Microbiol 66:1305‐10. 

66 

116.  Sasse‐Dwight, S., and J. D. Gralla. 1990. Role of eukaryotic‐type functional domains found in the prokaryotic enhancer receptor factor σ54. Cell 62:945‐54. 

117.  Schneider, D. A., and R. L. Gourse. 2003. Changes in Escherichia coli rRNA promoter activity correlate with changes in initiating nucleoside triphosphate and guanosine 5ʹ diphosphate 3ʹ‐diphosphate concentrations after induction of feedback control of ribosome synthesis. J Bacteriol 185:6185‐91. 

118.  Schneider, D. A., W. Ross, and R. L. Gourse. 2003. Control of rRNA expression in Escherichia coli. Curr Opin Microbiol 6:151‐6. 

119.  Schumacher, J., N. Joly, M. Rappas, X. Zhang, and M. Buck. 2006. Structures and organisation of AAA+ enhancer binding proteins in transcriptional activation. J Struct Biol 156:190‐9. 

120.  Severinova, E., K. Severinov, D. Fenyo, M. Marr, E. N. Brody, J. W. Roberts, B. T. Chait, and S. A. Darst. 1996. Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 subunit. J Mol Biol 263:637‐47. 

121.  Shingler, V. 2003. Integrated regulation in response to aromatic compounds: from signal sensing to attractive behaviour. Environ Microbiol 5:1226‐1241. 

122.  Shingler, V. 1996. Signal sensing by σ54‐dependent regulators: derepression as a control mechanism. Mol Microbiol 19:409‐16. 

123.  Shingler, V., M. Bartilson, and T. Moore. 1993. Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the positive regulator (DmpR) of the phenol catabolic pathway encoded by pVI150 and identification of DmpR as a member of the NtrC family of transcriptional activators. J Bacteriol 175:1596‐604. 

124.  Shingler, V., F. C. Franklin, M. Tsuda, D. Holroyd, and M. Bagdasarian. 1989. Molecular analysis of a plasmid‐encoded phenol hydroxylase from Pseudomonas CF600. J Gen Microbiol 135:1083‐92. 

125.  Shingler, V., J. Powlowski, and U. Marklund. 1992. Nucleotide sequence and functional analysis of the complete phenol/3,4‐ dimethylphenol catabolic pathway of Pseudomonas sp. strain CF600. J Bacteriol 174:711‐24. 

126.  Southern, E., and M. Merrick. 2000. The role of region II in the RNA polymerase sigma factor sigma(N) (sigma(54)). Nucleic Acids Res 28:2563‐70. 

127.  Staijen, I. E., R. Marcionelli, and B. Witholt. 1999. The PalkBFGHJKL promoter is under carbon catabolite repression control in Pseudomonas oleovorans but not in Escherichia coli alk+ recombinants. J Bacteriol 181:1610‐6. 

128.  Studholme, D. J., and R. Dixon. 2003. Domain Architectures of σ54‐Dependent Transcriptional Activators. J Bacteriol 185:1757‐67. 

129.  Su, W., S. Porter, S. Kustu, and H. Echols. 1990. DNA‐looping and enhancer activity: association between DNA‐bound NtrC activator and 

67 

RNA polymerase at the bacterial glnA promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 87:5504‐8. 

130.  Syed, A., and J. D. Gralla. 1998. Identification of an N‐terminal region of σ54 required for enhancer responsiveness. J Bacteriol 180:5619‐25. 

131.  Sze, C. C., A. D. Laurie, and V. Shingler. 2001. In vivo and in vitro effects of integration host factor at the DmpR‐ regulated σ54‐dependent Po promoter. J Bacteriol 183:2842‐51. 

132.  Sze, C. C., T. Moore, and V. Shingler. 1996. Growth phase‐dependent transcription of the σ54‐dependent Po promoter controlling the Pseudomonas‐derived (methyl)phenol dmp operon of pVI150. J Bacteriol 178:3727‐35. 

133.  Sze, C. C., and V. Shingler. 1999. The alarmone (p)ppGpp mediates physiological‐responsive control at the σ54‐dependent Po promoter. Mol Microbiol 31:1217‐28. 

134.  Takahashi, K., K. Kasai, and K. Ochi. 2004. Identification of the bacterial alarmone guanosine 5ʹ‐diphosphate 3ʹ‐diphosphate (ppGpp) in plants. Proc Natl Acad Sci U S A 101:4320‐4. 

135.  Tintut, Y., and J. D. Gralla. 1995. PCR mutagenesis identifies a polymerase‐binding sequence of σ54 that includes a σ70 homology region. J Bacteriol 177:5818‐25. 

136.  Tintut, Y., J. T. Wang, and J. D. Gralla. 1995. Abortive cycling and the release of polymerase for elongation at the σ 54‐dependent glnAp2 promoter. J Biol Chem 270:24392‐8. 

137.  Topp, E., R. L. Crawford, and R. S. Hanson. 1988. Influence of readily metabolizable carbon on pentachlorophenol metabolism by a pentachlorophenol‐degrading Flavobacterium sp. Appl Environ Microbiol 54:2452‐9. 

138.  Topp, E., and R. S. Hanson. 1990. Degradation of pentachlorophenol by a Flavobacterium species grown in continuous culture under various nutrient limitations. Appl Environ Microbiol 56:541‐4. 

139.  Travers, A., and G. Muskhelishvili. 2005. Bacterial chromatin. Curr Opin Genet Dev 15:507‐14. 

140.  Valls, M., M. Buckle, and V. de Lorenzo. 2002. In vivo UV laser footprinting of the Pseudomonas putida σ54 Pu promoter reveals that integration host factor couples transcriptional activity to growth phase. J Biol Chem 277:2169‐75. 

141.  Valls, M., I. Cases, and V. De Lorenzo. 2004. Transcription mediated by rpoN‐dependent promoters, p. 289‐317. In J.‐L. Ramos (ed.), Pseudomonas: Virulence and Gene Regulation, vol. II. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York. 

142.  van Wezel, G. P., E. Takano, E. Vijgenboom, L. Bosch, and M. J. Bibb. 1995. The tuf3 gene of Streptomyces coelicolor A3(2) encodes an inessential 

68 

elongation factor Tu that is apparently subject to positive stringent control. Microbiology 141:2519‐28. 

143.  Wang, J. T., A. Syed, and J. D. Gralla. 1997. Multiple pathways to bypass the enhancer requirement of σ54 RNA polymerase: roles for DNA and protein determinants. Proc Natl Acad Sci U S A 94:9538‐43. 

144.  Wang, J. T., A. Syed, M. Hsieh, and J. D. Gralla. 1995. Converting Escherichia coli RNA polymerase into an enhancer‐responsive enzyme: role of an NH2‐terminal leucine patch in σ 54. Science 270:992‐4. 

145.  Wedel, A., D. S. Weiss, D. Popham, P. Droge, and S. Kustu. 1990. A bacterial enhancer functions to tether a transcriptional activator near a promoter. Science 248:486‐90. 

146.  Wendrich, T. M., G. Blaha, D. N. Wilson, M. A. Marahiel, and K. H. Nierhaus. 2002. Dissection of the mechanism for the stringent factor RelA. Mol Cell 10:779‐88. 

147.  Wigneshweraraj, S. R., M. K. Chaney, A. Ishihama, and M. Buck. 2001. Regulatory sequences in sigma 54 localise near the start of DNA melting. J Mol Biol 306:681‐701. 

148.  Wigneshweraraj, S. R., D. Savalia, K. Severinov, and M. Buck. 2006. Interplay between the betaʹ clamp and the betaʹ jaw domains during DNA opening by the bacterial RNA polymerase at σ54‐dependent promoters. J Mol Biol 359:1182‐95. 

149.  Wikström, P., E. OʹNeill, L. C. Ng, and V. Shingler. 2001. The regulatory N‐terminal region of the aromatic‐responsive transcriptional activator DmpR constrains nucleotide‐triggered multimerisation. J Mol Biol 314:971‐84. 

150.  Williams, P. A., and J. R. Sayers. 1994. The evolution of pathways for aromatic hydrocarbon oxidation in Pseudomonas. Biodegradation 5:195‐217. 

151.  Williams, R. M., and S. Rimsky. 1997. Molecular aspects of the E. coli nucleoid protein, H‐NS: a central controller of gene regulatory networks. FEMS Microbiol Lett 156:175‐85. 

152.  Wösten, M. M. 1998. Eubacterial sigma‐factors. FEMS Microbiol Rev 22:127‐50. 

153.  Xiao, H., M. Kalman, K. Ikehara, S. Zemel, G. Glaser, and M. Cashel. 1991. Residual guanosine 3ʹ,5ʹ‐bispyrophosphate synthetic activity of relA null mutants can be eliminated by spoT null mutations. J Biol Chem 266:5980‐90. 

154.  Xu, H., and T. R. Hoover. 2001. Transcriptional regulation at a distance in bacteria. Curr Opin Microbiol 4:138‐44. 

155.  Yuste, L., I. Canosa, and F. Rojo. 1998. Carbon‐source‐dependent expression of the PalkB promoter from the Pseudomonas oleovorans alkane degradation pathway. J Bacteriol 180:5218‐26. 

156.  Zhou, Y. N., and D. J. Jin. 1998. The rpoB mutants destabilizing initiation complexes at stringently controlled promoters behave like ʺstringentʺ RNA polymerases in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 95:2908‐13. 

69