Micronização Supercrítica do β-Caroteno · “Morre lentamente quem não vira a mesa quando...

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Micronização Supercrítica do β-Caroteno Sofia Inês de Matos Antunes Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biológica Júri Presidente: Professor Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca Orientador: Professor Doutor António Manuel de Figueiredo Palavra Vogal: Professor Doutor Vítor Manuel Geraldes Fernandes Setembro de 2007

Transcript of Micronização Supercrítica do β-Caroteno · “Morre lentamente quem não vira a mesa quando...

Micronização Supercrítica do β-Caroteno

Sofia Inês de Matos Antunes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Biológica

Júri

Presidente: Professor Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca

Orientador: Professor Doutor António Manuel de Figueiredo Palavra

Vogal: Professor Doutor Vítor Manuel Geraldes Fernandes

Setembro de 2007

 

AGRADECIMENTOS 

Em  primeiro  lugar,  um  especial  agradecimento  ao  Professor  António  Palavra,  pelo  convite  para  a 

realização deste trabalho, pela orientação do mesmo, pela confiança demonstrada e pela experiência e 

conhecimentos transmitidos. 

 

Agradeço  igualmente ao Eng. Miguel Cardoso, por  todo o apoio, orientação e conhecimentos que me 

forneceu. Pela amizade, companheirismo e espírito de equipa que muito me ensinaram. O trabalho não 

teria sido possível de outra forma. 

 

A todo o pessoal da BioTrend por todo o apoio prestado na realização das análises laboratoriais. 

 

A todos aqueles que, directa ou indirectamente, contribuíram para a conclusão deste trabalho. 

 

Às minhas caríssimas amigas Ausenda Pires, pelo esclarecimento de dúvidas fulcrais sobre estatística, e 

Ida Griffith,  pela  ajuda  na  revisão  dos  textos  em  inglês. Um  grande Obrigada  pela  vossa  amizade  e 

disponibilidade, hoje e sempre. 

 

A  todos os meus amigos e  familiares, pelo apoio, pela amizade e pelos bons momentos que me  têm 

vindo a proporcionar ao longo do meu percurso académico e da minha vida. 

 

Aos meus pais, por sempre acreditarem e pelo seu apoio e confiança em cada instante. 

 

Ao meu namorado, por tudo. 

 

A todos, a minha mais sincera gratidão. 

Obrigada. 

 

 

 

 

 

 

 

“Morre lentamente quem não vira a mesa quando está infeliz com o seu trabalho, 

quem não arrisca o certo pelo incerto para ir atrás de um sonho, 

quem não se permite, pelo menos uma vez na vida, fugir dos conselhos sensatos. 

Morre lentamente quem passa os dias queixando‐se da má sorte ou da chuva que cai incessante.” 

(Pablo Neruda) 

ii 

 

RESUMO 

Neste  trabalho  foi  realizado  um  estudo  de  micronização  do  β‐caroteno,  um  carotenóide  de  suma 

importância para a indústria, graças às suas propriedades corantes, antioxidantes e como precursor na 

síntese da vitamina A. A micronização do β‐caroteno tem por principal objectivo o aumento da sua taxa 

de dissolução em água, permitindo, simultaneamente, a preparação de suspensões aquosas contendo 

este carotenóide. 

O processo foi desenvolvido num aparelho de micronização supercrítica do tipo “SAS”, utilizando como 

anti‐solvente  o  dióxido  de  carbono  supercrítico  e  como  solvente  o  tetrahidrofurano,  tendo  sido 

estudado  o  efeito  da  pressão  na  dimensão  e  na  forma  das  partículas  obtidas.  Os  ensaios  de 

micronização permitiram  ainda  a  realização de um  estudo da  solubilidade do  β‐caroteno na mistura 

supercrítica em várias condições de pressão, temperatura e caudal. Foi ainda efectuado um ensaio de 

micronização de um extracto de β‐caroteno natural, com o intuito de avaliar o processo em termos de 

purificação do produto. 

O  estudo  de  solubilidades  permitiu  estabelecer  algumas  relações  importantes  entre  as  variáveis 

estudadas  e  a  solubilidade  do  β‐caroteno  na  mistura  supercrítica.  Concluiu‐se  que  a  solubilidade 

depende fortemente da temperatura e da fracção de THF e é pouco dependente da pressão. 

Foi  possível  verificar  que  a morfologia  das  partículas  é  alterada  quando  se  varia  a  pressão,  sendo 

também  dependente  da  posição  do  ponto  operatório  relativamente  ao  ponto  crítico.  Verificou‐se, 

ainda, que o  tamanho de partícula aumenta  com o aumento da pressão, quando  se opera acima do 

ponto  crítico, e  estabeleceu‐se uma  relação  entre o  tamanho de partícula  e  a densidade da mistura 

binária. 

A micronização  com  anti‐solvente  supercrítico  foi  bem  sucedida  no  processamento  do  β‐caroteno, 

sendo  possível  o  controlo  da morfologia  e  da  dimensão  das  partículas  através  da manipulação  das 

condições experimentais. A micronização do β‐caroteno natural também foi possível, mas a purificação 

não foi bem sucedida. 

 

Palavras‐chave:  β‐caroteno;  fluidos  supercríticos;  dióxido  de  carbono; micronização;  solubilidade; 

tetrahidrofurano 

iii 

 

ABSTRACT 

The aim of the present work was the micronization of β‐carotene, an  important carotenoid, due to  its 

properties as colorant, antioxidant and as a precursor in the synthesis of vitamin A. The micronization of 

β‐carotene has as main goal the  increase of  its dissolution rate  in water, allowing, simultaneously, the 

preparation of aqueous suspensions containing this carotenoid.  

The process was developed in a supercritical micronization apparatus type SAS, using carbon dioxide as 

antisolvent  and  tetrahydrofuran  as  solvent.  The  effect  of  operating pressure  in  the  particle  size  and 

morphology of  the  final product has been  studied. The  runs of micronization have also permitted  to 

study  the  solubility  of  β‐carotene  in  the  supercritical mixture  under  several  conditions  of  pressure, 

temperature and flow rate. The micronization of an extract of natural β‐carotene has also been made, in 

order to evaluate the purification ability of the process. 

Some  relationships  between  experimental  variables  studied  and  solubility  of  β‐carotene  in  the 

supercritical  mixture  were  recognized.  It  has  been  concluded  that  solubility  strongly  depends  on 

temperature and on THF fraction and does not depend much on pressure. 

It has been shown that particle morphology is changed when the operating pressure changes and it also 

depends on the position of the operating point relatively to the mixture’s critical point. Additionally, it’s 

been shown that particle size increases with the operating pressure, when one operates over the critical 

point,  and  a  relationship  between  the  particle  size  and  the  density  of  the  binary mixture  has  been 

established. 

The  supercritical  antisolvent micronization  was  well  done  in  the  processing  of  β‐carotene  and  the 

control  of  particle  size  and  morphology  through  the  manipulation  of  the  operating  conditions  is 

possible. Moreover, this process allows the micronization of the natural extract of β‐carotene, although 

purification is not achievable. 

 

Keywords: β‐carotene; supercritical fluids; micronization; carbon dioxide; solubility; tetrahydrofuran 

iv 

 

ÍNDICE 

 

Agradecimentos .................................................................................................................................. i 

Resumo .............................................................................................................................................. ii 

Abstract ............................................................................................................................................. iii 

Índice ................................................................................................................................................. iv 

Índice de tabelas ............................................................................................................................... vii 

Índice de figuras ............................................................................................................................... viii 

Lista de abreviaturas .......................................................................................................................... xi 

1. Introdução ..................................................................................................................................... 1 

1.1. IMPORTÂNCIA DO TAMANHO DE PARTÍCULA ................................................................................................. 1 

1.2. MICRONIZAÇÃO – FORMAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS ..................................................................................... 4 

1.2.1. Métodos tradicionais de moagem .............................................................................................. 4 

1.2.2. Engenharia de partículas ............................................................................................................ 5 

1.3. OS FLUIDOS SUPERCRÍTICOS E AS SUAS APLICAÇÕES ........................................................................................ 6 

1.3.1. Estado supercrítico ..................................................................................................................... 6 

1.3.1.1. O dióxido de carbono como fluido supercrítico ................................................................................... 8 

1.3.2. Extracção supercrítica ................................................................................................................ 9 

1.3.3. Micronização supercrítica (“RESS” e “PGSS”) ............................................................................. 9 

1.3.3.1. Expansão rápida de uma solução supercrítica (“RESS”) ..................................................................... 10 

1.3.3.2. Precipitação de soluções saturadas em gás (“PGSS”) ........................................................................ 10 

1.3.4. Micronização com anti‐solvente supercrítico (“SAS”) ............................................................... 11 

1.3.4.1. Fundamentos teóricos ....................................................................................................................... 12 

1.3.4.2. O estado da arte da micronização “SAS” – trabalhos elaborados ...................................................... 14 

1.3.4.3. Variáveis que influenciam a micronização “SAS” ............................................................................... 16 

1.3.5. Atomização assistida por fluidos supercríticos (“SAA”) ............................................................ 17 

1.4. CAROTENÓIDES .................................................................................................................................... 18 

1.4.1. Características estruturais, químicas e físicas .......................................................................... 18 

1.4.2. Distribuição na Natureza .......................................................................................................... 20 

1.4.2.1. Plantas superiores .............................................................................................................................. 20 

1.4.2.2. Algas ................................................................................................................................................... 21 

1.4.2.3. Bactérias ............................................................................................................................................ 21 

1.4.2.4. Fungos ................................................................................................................................................ 21 

1.4.3. Biossíntese ................................................................................................................................ 21 

1.4.4. Fontes alimentares ................................................................................................................... 23 

 

1.4.5. Estabilidade .............................................................................................................................. 24 

1.4.6. Funções biológicas .................................................................................................................... 24 

1.4.6.1. Nas plantas ......................................................................................................................................... 24 

1.4.6.2. No ser humano................................................................................................................................... 25 

1.5. Β‐CAROTENO ....................................................................................................................................... 27 

1.5.1. Química ..................................................................................................................................... 27 

1.5.2. Biossíntese ................................................................................................................................ 28 

1.5.3. Funções biológicas .................................................................................................................... 29 

1.6. OBJECTIVOS DO TRABALHO ..................................................................................................................... 29 

2. Parte experimental: Materiais, aparelhos e técnicas ...................................................................... 31 

2.1. MATERIAIS .......................................................................................................................................... 31 

2.2. MICRONIZAÇÃO SUPERCRÍTICA ................................................................................................................ 31 

2.2.1. Descrição geral do aparelho ..................................................................................................... 31 

2.2.2. Técnica experimental ................................................................................................................ 34 

2.3. ANÁLISE DOS PRODUTOS ........................................................................................................................ 34 

2.3.1. Espectrofotometria ................................................................................................................... 34 

2.3.2. Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) ...................................................................... 34 

2.3.3. “Dynamic light scattering” ....................................................................................................... 35 

2.3.4. Microscopia electrónica de varrimento .................................................................................... 35 

3. Resultados experimentais e discussão ........................................................................................... 36 

3.1. ESTUDO DE SOLUBILIDADES ..................................................................................................................... 36 

3.1.1. Estimativa de densidades da mistura binária ........................................................................... 38 

3.1.2. Relação entre solubilidade, densidade e variáveis do processo ............................................... 40 

3.2. ESTUDO DA PRECIPITAÇÃO DO Β‐CAROTENO SINTÉTICO ................................................................................. 45 

3.2.1. Análise macroscópica dos cristais ............................................................................................. 45 

3.2.2. Análise da pureza do produto ................................................................................................... 47 

3.2.2.1. HPLC ................................................................................................................................................... 47 

3.2.2.2. Espectrofotometria ............................................................................................................................ 49 

3.2.3. Influência da pressão de trabalho no produto obtido .............................................................. 50 

3.2.3.1. Análise do produto não processado .................................................................................................. 51 

3.2.3.2. Análise do β‐caroteno processado a 75 bar ....................................................................................... 52 

3.2.3.3. Análise do β‐caroteno processado a 100 bar ..................................................................................... 55 

3.2.3.4. Análise do β‐caroteno processado a 130 bar ..................................................................................... 57 

3.2.3.5. Discussão do efeito da pressão .......................................................................................................... 59 

3.3. ESTUDO DA PRECIPITAÇÃO DE UM EXTRACTO NATURAL DE Β‐CAROTENO .......................................................... 62 

3.3.1. Análise macroscópica ............................................................................................................... 62 

3.3.2. Análise da pureza do produto ................................................................................................... 62 

3.3.2.1. HPLC ................................................................................................................................................... 63 

vi 

 

3.3.2.2. Espectrofotometria ............................................................................................................................ 65 

3.3.3. Conclusão acerca da precipitação do β‐caroteno natural ........................................................ 66 

3.4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................................................................................... 66 

Referências bibliográficas .................................................................................................................. 68 

Apêndice A .......................................................................................................................................... I 

Apêndice B ......................................................................................................................................... II 

Apêndice C ........................................................................................................................................ III 

Apêndice D ....................................................................................................................................... IV 

Apêndice E ......................................................................................................................................... V 

Apêndice F ........................................................................................................................................ VI 

 

vii 

 

ÍNDICE DE TABELAS 

Tabela 1.1 – Constantes críticas de alguns fluidos com interesse em extracção supercrítica [40]. ............. 7 

Tabela 1.2 – Ordens de grandeza de propriedades termofísicas dos fluidos supercríticos [5]. ................... 8 

Tabela 1.3 – Efeito das condições operatórias no tamanho de partícula de vários produtos micronizados 

através de técnicas de anti‐solvente supercrítico [70]. .............................................................................. 17 

Tabela 1.4 – Quantidades típicas de carotenóides em vegetais [19]. ........................................................ 24 

Tabela 3.1 – Dados de pesos moleculares dos compostos envolvidos no trabalho. .................................. 36 

Tabela 3.2 – Condições de ensaios, resultados experimentais e fracções molares calculadas. ................. 36 

Tabela 3.3 – Parâmetros dos compostos puros [33]. ................................................................................. 39 

Tabela 3.4 – Composições da mistura binária nas diferentes condições de trabalho. .............................. 39 

Tabela  3.5  –  Densidades  calculadas  pela  equação  de  Peng—Robinson  para  as  várias  condições  de 

trabalho. ..................................................................................................................................................... 40 

Tabela 3.6 – Registo de rendimento dos ensaios realizados. ..................................................................... 47 

Tabela  3.7  – Resumo dos  resultados obtidos para o  tamanho de partícula  em  função da pressão de 

processamento. .......................................................................................................................................... 60 

 

Tabela A. 1 – Pontos para o cálculo da recta de calibração do espectrofotómetro. ................................... IV 

 

viii 

 

ÍNDICE DE FIGURAS 

Figura 1.1 – Diagramas de fase do dióxido de carbono: pressão vs temperatura (a); densidade vs pressão 

(b). ................................................................................................................................................................ 7 

Figura 1.2 – Diagrama pressão–composição da mistura etanol–dióxido de carbono a 35°C [15]. ............ 13 

Figura 1.3  –  Estrutura molecular do  isopreno  (a)  e da  sua  forma biologicamente  activa, difosfato de 

isopentenilo (b). ......................................................................................................................................... 19 

Figura 1.4 – Estrutura molecular de alguns carotenóides. ......................................................................... 19 

Figura 1.5 – Formação do difosfato de isopentenilo [19]. ......................................................................... 22 

Figura 1.6 – Biossíntese do fitoeno a partir do IPP e do DMAPP [19]. ....................................................... 23 

Figura 1.7 – Estrutura molecular do β‐caroteno. ....................................................................................... 28 

Figura 1.8 – Ciclização do licopeno (formação do β‐caroteno) [19]. .......................................................... 29 

Figura 2.1 – Aparelho de micronização supercrítica: aspecto geral. .......................................................... 31 

Figura  2.2  –  Diagrama  esquemático  do  aparelho  de micronização  supercrítica.  B1  e  B2,  bombas  de 

recirculação;  BP1  e  BP2,  “backpressure”  ou  regulador  de  pressão;  BT,  banho  termostático;  C, 

condensador; CG, contador de gás; DR, disco de  ruptura; G, garrafa de CO2 com  tubo prolongador; P, 

indicador  de  pressão; Q, medidor  de  caudal;  S,  bureta  de  solução;  T,  indicador  de  temperatura;  V, 

válvula; VM, válvula micrométrica; VP, vaso de precipitação; VS, vaso de recolha de solvente. .............. 32 

Figura  2.3  –  Aparelho  de micronização  supercrítica:  banho  termostático  de  água  (a);  célula  de  alta 

pressão (b). ................................................................................................................................................. 32 

Figura 2.4 – Aparelho de micronização supercrítica (secção de bombagem): CO2 (a); solução (b); aspecto 

geral (c). ...................................................................................................................................................... 33 

Figura 2.5 – Aparelho de micronização supercrítica: recolha de solvente (a); aspecto geral (b). .............. 33 

Figura  3.1  –  Representação  gráfica  da  variação  da  solubilidade  do  β‐caroteno  em  CO2/THF  com  a 

temperatura. .............................................................................................................................................. 37 

Figura 3.2 – Representação gráfica da variação da solubilidade do β‐caroteno em CO2/THF com a fracção 

de THF (caudal de líquido). ......................................................................................................................... 37 

Figura  3.3  –  Representação  gráfica  da  variação  da  solubilidade  do  β‐caroteno  em  CO2/THF  com  a 

pressão. ...................................................................................................................................................... 38 

Figura  3.4  –  Variação  da  densidade  da  mistura  binária  e  da  solubilidade  do  β‐caroteno  com  a 

temperatura. .............................................................................................................................................. 40 

Figura 3.5 – Variação da densidade da mistura binária e da solubilidade do β‐caroteno com a pressão. 41 

Figura 3.6 – Variação da densidade da mistura binária e da solubilidade do β‐caroteno com a fracção de 

THF.............................................................................................................................................................. 41 

Figura 3.7 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia a 

temperatura. .............................................................................................................................................. 42 

Figura 3.8 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia o 

caudal (fracção) de THF. ............................................................................................................................. 42 

ix 

 

Figura 3.9 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia a 

pressão. ...................................................................................................................................................... 43 

Figura  3.10  –  Representação  gráfica  da  variação  da  solubilidade  do  β‐caroteno  em  CO2/THF  com  a 

fracção de THF (a 100 e a 130 bar). ............................................................................................................ 44 

Figura 3.11 – Recolha do β‐caroteno micronizado acima do ponto crítico: copo da célula de alta pressão 

(a); tampa da célula de alta pressão (b). .................................................................................................... 45 

Figura 3.12 – Recolha do β‐caroteno micronizado abaixo do ponto crítico (75 bar): copo da célula de alta 

pressão (a); pormenor do fundo da célula (filtro) (b). ............................................................................... 46 

Figura 3.13 – Recolha do β‐caroteno micronizado: aspecto dos cristais. .................................................. 46 

Figura 3.14 – Representação gráfica do rendimento da micronização em função da solubilidade (ensaios 

T1, P2, Q2 e Q3). ......................................................................................................................................... 47 

Figura 3.15 – Cromatograma do β‐caroteno original, micronizado e recolhido no efluente (líquido), em 

THF, com detecção a 454 nm. .................................................................................................................... 48 

Figura 3.16 – Cromatograma do β‐caroteno original, micronizado e recolhido no efluente (líquido), em 

THF, com detecção a 260 nm. .................................................................................................................... 48 

Figura 3.17 – Espectros de várias misturas de isómeros do β‐caroteno em ciclohexano [63]. .................. 49 

Figura 3.18 – Espectros de absorção do β‐caroteno não processado  (original), precipitado e solúvel do 

ensaio T1. ................................................................................................................................................... 50 

Figura 3.19 – Aspecto do β‐caroteno antes do processamento  (imagem de microscopia electrónica de 

varrimento com ampliação de 1000 vezes). ............................................................................................... 51 

Figura 3.20 – Aspecto do β‐caroteno antes do processamento  (imagem de microscopia electrónica de 

varrimento com ampliação de 3000 vezes). ............................................................................................... 51 

Figura  3.21  –  Representação  gráfica  da  distribuição  de  tamanhos  de  partícula  contabilizada  por 

contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno não processado). ..................................................... 52 

Figura  3.22  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  75  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 50 vezes). ................................................................................................... 53 

Figura  3.23  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  75  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 100 vezes). ................................................................................................. 53 

Figura  3.24  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  75  bar  (imagens  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de: 500 vezes (a); 3000 vezes (b)). ................................................................. 54 

Figura  3.25  –  Representação  gráfica  da  distribuição  de  tamanhos  de  partícula  contabilizada  por 

contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 75 bar). .............................................. 55 

Figura  3.26  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  100  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 100 vezes). ................................................................................................. 56 

Figura  3.27  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  100  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 500 vezes). ................................................................................................. 56 

Figura  3.28  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  100  bar  (imagens  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de: 3000 vezes (a); 5000 vezes (b)). ............................................................... 56 

 

Figura  3.29  –  Representação  gráfica  da  distribuição  de  tamanhos  de  partícula  contabilizada  por 

contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 100 bar). ............................................ 57 

Figura  3.30  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  130  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 100 vezes). ................................................................................................. 58 

Figura  3.31  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  130  bar  (imagem  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de 200 vezes). ................................................................................................. 58 

Figura  3.32  –  Aspecto  do  β‐caroteno  processado  a  130  bar  (imagens  de microscopia  electrónica  de 

varrimento com ampliação de: 200 vezes (a); 500 vezes (b)). ................................................................... 58 

Figura  3.33  –  Representação  gráfica  da  distribuição  de  tamanhos  de  partícula  contabilizada  por 

contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 130 bar). ............................................ 59 

Figura 3.34  – Distribuição de  tamanhos de partícula obtida para  cada um dos  ensaios do  estudo do 

efeito da pressão. ....................................................................................................................................... 60 

Figura  3.35  –  Relação  entre  o  tamanho  de  partícula  obtido  e  a  densidade  estimada  para  a mistura 

CO2/THF em cada uma das condições de pressão...................................................................................... 61 

Figura 3.36 – Aspecto do β‐caroteno natural processado. ........................................................................ 62 

Figura 3.37 – Cromatograma do β‐caroteno natural micronizado e  recolhido no efluente  (líquido), em 

THF, com detecção a 454 nm. .................................................................................................................... 63 

Figura 3.38 – Cromatograma do β‐caroteno natural micronizado e  recolhido no efluente  (líquido), em 

THF, com detecção a 260 nm. .................................................................................................................... 64 

Figura 3.39 – Cromatograma do  β‐caroteno natural micronizado e  sintético, em THF, com detecção a 

454 nm. ....................................................................................................................................................... 64 

Figura 3.40 – Espectros de absorção do β‐caroteno natural micronizado e recolhido no efluente líquido, 

após o processamento. .............................................................................................................................. 65 

Figura  3.41  –  Espectros de  absorção do  β‐caroteno  sintético  (não processado)  e no  extracto natural 

(após o processamento). ............................................................................................................................ 65 

 

Figura A. 1 – Espectro de absorção do β‐caroteno em THF. ....................................................................... III 

Figura A. 2 – Representação gráfica da recta de calibração do espectrofotómetro. .................................. IV 

Figura A. 3 – Diagrama de fases da mistura CO2/THF à temperatura de 40°C, determinado por Li et al. 

[33]. .............................................................................................................................................................. V 

Figura A. 4 – Cromatograma do tetrahidrofurano com detecção a 260 nm. .............................................. VI 

Figura A. 5 – Cromatograma do tetrahidrofurano com detecção a 454 nm. .............................................. VI 

 

xi 

 

LISTA DE ABREVIATURAS 

T – temperatura 

P – pressão 

ρ – densidade 

S – sobressaturação 

x – fracção molar 

C – concentração 

Q – caudal 

a, b, κ – parâmetros da equação de Peng–Robinson 

k, l – parâmetros das regras de mistura 

ω – factor acêntrico 

R – constante dos gases perfeitos 

v – volume molar 

i, j ‐ componentes 

c – crítico 

0 – inicial 

eq – equilíbrio 

R – variável reduzida 

L – líquido 

 

 

1. INTRODUÇÃO 

1.1. Importância do tamanho de partícula 

O projecto envolvendo a produção de partículas pequenas com distribuição de tamanho controlada tem 

atraído o  interesse das comunidades científica e  industrial com aplicações nas  indústrias farmacêutica, 

alimentar e química. 

O tamanho de partícula influencia fortemente vários processos, como sejam a combustão de explosivos 

sólidos [29] , onde é possível obter uma maior energia de detonação através do uso de partículas mais 

pequenas; a eficiência de coloração, que pode ser aumentada quando o material corante é aplicado sob 

a forma de partículas muito pequenas; ou a actividade dos catalisadores, que está também associada a 

elevadas áreas  superficiais, que podem  tipicamente  ser obtidas através do uso de nanopartículas. As 

micropartículas de polímeros podem também ser usadas como fase estacionária em cromatografia, com 

a  função  de  adsorventes  e  suportes de  catalisadores,  assim  como  em  sistemas  de  administração  de 

drogas  [51]. Através do uso de nanopartículas, os supercondutores, que  têm um grande potencial na 

indústria  electrotécnica,  podem  ver  ultrapassados  alguns  dos  problemas  relacionados  com  a 

manutenção  das  suas  propriedades  em  diferentes  condições  operatórias,  aquando  do  aumento  de 

escala  [58].  Em  aplicações  farmacêuticas,  são  especialmente  importantes  a  estreita  distribuição  de 

tamanhos de partícula, a uniformidade da morfologia das partículas e a pureza enantiomérica [2].  

As partículas de  ingredientes  farmacêuticos, activos ou não, existem, na maioria dos produtos,  sob a 

forma de pós secos e de dispersões líquidas e semi‐sólidas, que podem ir de nanocolóides a grânulos à 

escala milimétrica,  dependendo  da  dosagem  e  da  via  de  administração.  O  tamanho  e  a  forma  da 

partícula podem influenciar uma vasta gama de propriedades físicas, processos de fabrico e atributos de 

qualidade [64]: 

• Taxa de dissolução e biodisponibilidade dos princípios activos. 

• Velocidade (controlada) de libertação da droga. 

• Distribuição  e  deposição  das  partículas  in  vivo,  taxa  de  absorção  e  tempo  de  permanência, 

especialmente  para  aerossóis  e  sistemas  de  colóides  desenhados  para  atingir  um  alvo 

específico. 

• Uniformidade da composição, bem como outras propriedades relacionadas com a estabilidade 

físico‐química. 

• Comportamento de aerosolização e desempenho das formulações respiratórias. 

• Propriedades  de  fluxo  e  empacotamento,  mistura  e  segregação  de  pós,  características 

reológicas das formulações líquidas e semi‐sólidas. 

• Granulosidade das partículas  sólidas nas  formulações mastigáveis, em  cremes para aplicação 

tópica e em preparações oftálmicas. 

 

É, contudo, a biodisponibilidade que mais desafia a investigação farmacêutica. A lipofilicidade de muitas 

drogas  obriga  à  suspensão  de muitos  testes  farmacológicos,  devido  à  sua  baixa  biodisponibilidade. 

Também muitas das novas drogas altamente eficientes, desenvolvidas na base da medicina molecular 

moderna,  e  projectadas  para  atingir  locais  de  reconhecimento  da  superfície  das  células,  possuem 

solubilidade em água, e  consequente biodisponibilidade, muito baixas. Apesar de a generalidade das 

drogas  com  elevada  lipofilicidade  poder  permear  rapidamente  as  biomembranas,  a  solubilidade  nos 

fluidos gastrointestinais e a taxa de dissolução são factores limitantes, na maioria dos casos. É, assim, de 

extrema importância o desenvolvimento de estratégias que permitam o aumento da taxa de dissolução 

deste tipo de drogas. 

 

As diferentes  vias de  administração dos  ingredientes  farmacêuticos  exigem diferentes  formulações  e 

dosagens, o que  implica também diferentes tamanhos de partícula. Os avanços recentes na terapia da 

inalação  têm  despontado  um  interesse  considerável  no  desenvolvimento  de  novas  tecnologias  da 

formulação de drogas. A preparação de pós adequados para a inalação e carregados com biomoléculas é 

também de particular interesse para a terapia génica e para a vacinação [9]. 

A  investigação na área do  tamanho de partícula  tem mostrado que o diâmetro óptimo das partículas 

para formulações orais de aerossóis que penetram efectivamente nos pulmões se situa na gama de 1 a 5 

µm,  sendo  o  mecanismo  predominante  a  sedimentação  nas  regiões  brônquica  e  alveolar  [64].  As 

partículas de tamanho superior a 5 µm colidem com as paredes nas vias respiratórias superiores, sendo 

depois transportadas por fluxo ciliar até à boca e atingindo o sistema, primeiramente, por ingestão. As 

partículas de  tamanho  inferior a 1 µm podem permanecer suspensas no ar  inspirado e expirado, não 

chegando a atingir os pulmões [56]. 

A produção de micropartículas pode ser importante no envio de drogas directamente para os pulmões. 

A  deposição  selectiva  dessas  drogas  no  tracto  respiratório  humano  pode  ser  optimizada  através  do 

controlo  do  tamanho  das  partículas,  maximizando  a  sua  efectividade  contra  doenças  que  não  se 

manifestam uniformemente no pulmão  (por exemplo, a bronquite) e minimizando os efeitos  laterais 

adversos  [56].  Por  exemplo,  os  antibióticos,  quando  administrados  sob  forma  de  aerossóis,  têm  a 

vantagem de fornecer elevadas concentrações directamente ao local da infecção, no caso de infecções 

pulmonares. Por outro lado, os pulmões podem ainda ser considerados um local de recepção de drogas 

que  permite  ultrapassar  problemas  de  absorção  e  processos  metabólicos,  que  são  limitantes  da 

eficiência da droga por outras vias de administração [55]. 

As  nanopartículas  constituem  também  uma  promessa  na  deposição  pulmonar  de  drogas,  devido  à 

homogeneidade, e consequente eficiência acrescida, das nanosuspensões. As nanopartículas de drogas 

pouco  solúveis  em  água  têm  uma  taxa  global  de  dissolução mais  elevada  e  podem  ter  uma  via  de 

interacção específica com os epitélios traqueo‐brônquico e alveolar. As nanopartículas ultrafinas (<150 

nm)  têm  uma  libertação  mais  lenta  do  pulmão,  maior  interacção  com  certas  proteínas  e  maior 

translocação do epitélio para a circulação e, subsequentemente, para os órgãos alvo [64]. 

 

A dimensão de partícula adequada para comprimidos tende a situar‐se no  intervalo de 100 a 200 µm, 

devido ao comportamento de compactação exigido e às propriedades de  transporte do pó. Contudo, 

partículas mais  pequenas,  de  20  a  50  µm,  são  passíveis  de  ter  boas  características  para  o  tipo  de 

formulações mastigáveis ou de  rápida desintegração, onde a dissolução controlada e a  trituração são 

importantes. Por outro  lado, o tamanho de partícula tem grande  influência em praticamente todas as 

etapas da produção de comprimidos, incluindo a mistura, granulação, compressão e revestimento [64]. 

O  aumento  da  biodisponibilidade  das  drogas  insolúveis  em  água  e  administradas  por  via  oral  pode 

também ser atingido por nanopartículas, através da homogeneidade que estas podem conferir a uma 

suspensão  [64]. A camada de difusão à volta das partículas pequenas é mais  fina, especialmente para 

diâmetros  inferiores  a 5 µm, o que  resulta numa mais  rápida distribuição das moléculas dissolvidas, 

devido à diminuição da resistência à transferência de massa [49]. 

O  tamanho  de  partícula  de  formulações  oftálmicas  de  libertação  controlada  é muito  importante  no 

balanço entre a velocidade de  libertação da droga, o aumento da biodisponibilidade e a  facilidade de 

aplicação.  Quando  formuladas  apropriadamente  para  esta  via  de  administração,  as  partículas  são 

retidas no canto do olho, sendo a droga  libertada a uma velocidade que não é nem muito rápida nem 

muito  lenta  para  permitir  a  penetração  adequada  da  droga  no  tecido  ocular.  As  nanopartículas 

(tipicamente de cerca de 300 nm) sem bioadesão podem ser eliminadas quase tão rapidamente como as 

soluções aquosas, mas a presença de uma fracção de partículas grosseiras acima dos 25 µm pode tornar 

o medicamento  irritante  para  o  olho. Assim,  os maiores  desafios  do  desenvolvimento  deste  tipo  de 

sistemas  de  partículas  residem,  precisamente,  na  complexidade  do  seu  fabrico  e  no  controlo  do 

tamanho de partícula na produção em grande escala [64]. 

O  tamanho de partícula  também exerce uma  influência significativa nas vias de penetração cutâneas: 

partículas com tamanho superior a 10 µm permanecem à superfície da pele; partículas entre 3 a 10 µm 

concentram‐se  nos  folículos  capilares;  partículas  inferiores  a  3  µm  podem  penetrar  os  folículos  e  a 

epiderme. Assim, a escolha ponderada do tamanho de partícula para formulações tópicas pode não só 

maximizar a eficácia local, como também minimizar reacções adversas [64]. 

As formulações intravenosas são essencialmente produtos baseados em soluções, cujo controlo tem de 

ser apertado ao nível da  contaminação por parte de partículas, que, em  caso de precipitação ou má 

formulação,  podem  provocar  a  oclusão  vascular  ou  embolia  pulmonar  do  paciente.  Mesmo  as 

micropartículas  de  tamanho mais  elevado  podem  ainda  diminuir  a  injectabilidade  do  produto,  bem 

como o seu manuseamento em seringas [64]. 

Na  área  já  bastante  explorada  da  administração  direccionada  a  alvos  específicos,  os  fagócitos 

mononucleares, células dendríticas, endoteliais, e tumores (células e novos vasos sanguíneos) são alvos 

importantes  para  as  nanopartículas  com  tamanhos  médios  muitas  vezes  inferiores  a  100  nm.  As 

nanopartículas com diâmetro inferior a 150 nm têm um tempo de meia vida prolongado na circulação, 

devido à sua baixa taxa de aquisição por parte dos micrófagos [64]. 

Tendo  já  sido provado que micelas  em  forma de bastonete,  com  alguns mícrons de  comprimento  e 

secção transversal de 10 a 100 nm, são capazes de se manter em circulação durante vários dias, pode‐se 

 

afirmar que o  tamanho não é o único  factor preponderante. Diferentes estudos  in vivo mostram que 

estes bastonetes se comportam como verdadeiras nanopartículas, nas células e no corpo, o que indica 

que  todas  as  propriedades  das  partículas,  como  o  tamanho,  forma  e  características  de  superfície, 

necessitam de ser investigadas neste tipo de formulações [64]. 

 

1.2. Micronização – formação de micropartículas 

Micronização  é  o  termo  usado  para  designar,  duma  forma  generalizada,  o  processo  de  redução  de 

tamanho de partícula, resultando da ordem de grandeza do tamanho obtido através dos processos de 

moagem tradicionais. Actualmente, as exigências da indústria, essencialmente na área farmacêutica, já 

se centram num tamanho de partícula ainda mais diminuto, que atinge a escala dos nanómetros, mas o 

termo micronização mantém‐se em utilização. 

Foram  já  referidas  as  inúmeras  vantagens  da  redução  do  tamanho  de  partícula  de  ingredientes 

farmacêuticos. A engenharia das pequenas partículas  tem, a este nível, dois objectivos principais. Por 

um  lado, a modificação do  tamanho de partícula, porosidade e densidade de um princípio activo. Por 

outro,  permite  ainda  a  incorporação  de  um  princípio  activo  numa  formulação  para  administração 

dirigida a um alvo específico (mistura com excipientes, por exemplo) [60]. 

Dos  mais  tradicionais  aos  mais  recentes,  existem  vários  processos  de  micronização,  baseados  em 

diferentes fundamentos. A sensibilidade do produto às condições físico‐químicas operacionais, a pureza 

e tamanho de partícula pretendidos, podem ditar o tipo de processo a implementar. 

A técnica mais comum é a tradicional trituração de partículas maiores, através de processos de moagem 

mecânica, em moinhos de jacto, de bolas, ou homogeneizadores de alta pressão. A redução de tamanho 

das partículas dá‐se, portanto, através de forças físicas de fricção e atrito, impacto, corte, ou da pressão. 

No extremo oposto estão as técnicas de produção de partículas pequenas de tamanho controlado, das 

quais são exemplo o “spray drying” ou a precipitação com fluidos supercríticos. 

 

1.2.1. Métodos tradicionais de moagem 

A produção de partículas à escala  industrial é, normalmente, realizada num processo de várias etapas, 

que inclui uma cristalização descontínua, filtração e secagem, seguidas da micronização [9]. No entanto, 

apesar de comercializadas e bem estabelecidas, as técnicas tradicionais de moagem mecânica trazem as 

desvantagens associadas ao processamento físico de produtos biológicos sensíveis. 

Os moinhos de jacto são os aparelhos mais usados. Aplicam uma pressão na câmara de 3 a 10 bar, o que 

faz com que o ar injectado, ao sofrer uma expansão que o coloca a alta velocidade, provoque a colisão 

das partículas do produto a micronizar. As partículas mais finas são então descarregadas numa câmara 

de classificação. Apesar dos gastos energéticos, o stresse térmico a que o produto é sujeito é baixo. Os 

moinhos  de  bolas  consistem  num  tanque  rotativo  que  está  parcialmente  preenchido  com  bolas.  A 

 

rotação  deste  sistema  provoca  a  redução  de  tamanho  da  droga,  através  das  forças  de  atrito  e  de 

impacto provocadas. 

A homogeneização de alta pressão é também muito usada na indústria farmacêutica para a preparação 

de  nanosuspensões  de  drogas  pouco  solúveis  em  água.  Devido  às  forças  de  corte  e  cavitação 

provocadas  através  de  uma  expansão  rápida,  ocorre  a  divisão  das  partículas  e  criam‐se  estruturas 

amorfas na  sua  superfície, o que as  torna  termodinamicamente activadas. A  solubilidade da droga é 

então  aumentada  através  de  dois  mecanismos:  redução  do  tamanho  da  partícula  e  activação  da 

superfície.  Esta  técnica  aplica  pressões  da  ordem  dos  1000  bar  às  suspensões  a  processar,  durante 

vários ciclos, provocando uma elevada tensão de corte no produto [49]. 

A limitação de todas as técnicas tradicionais de moagem está principalmente na dificuldade de controlo 

de características importantes do produto, como o tamanho, a forma, a morfologia, as propriedades da 

superfície e a carga electrostática. A micronização mecânica resulta numa larga banda na distribuição de 

tamanho e na heterogeneidade de formas das partículas. As superfícies amorfas termodinamicamente 

activadas podem converter‐se de novo em material cristalino durante o armazenamento, o que  leva a 

uma  natureza  dinâmica  do  produto,  através  de modificações  das  propriedades  físico‐químicas,  e  a 

recristalização pode ainda  levar à aglomeração. Esta  instabilidade  torna o produto mais  susceptível à 

decomposição química e à absorção de água,  sendo o  conjunto de  todas estas alterações altamente 

indesejável, podendo prejudicar o desempenho  in vitro e  in vivo das  formulações. Por outro  lado, os 

custos  associados  ao  processo  de micronização mecânica,  ainda  bastante  elevados, devido  à  grande 

quantidade de energia em  jogo, e a natureza  lábil de muitos produtos  farmacêuticos podem  limitar a 

aplicação deste tipo de micronização. 

Devido  às  desvantagens  enumeradas  dos  processos  de moagem,  torna‐se  necessária  a  procura  de 

alternativas  mais  eficientes  e  económicas,  através  da  engenharia  de  partículas,  que  permitam  a 

manipulação e o controlo das propriedades desejadas na produção de drogas. 

 

1.2.2. Engenharia de partículas 

Dadas as  limitações dos processos de moagem para micronização de produtos biológicos, têm vindo a 

ser  estudadas  e  desenvolvidas  técnicas  alternativas,  baseadas  essencialmente  em  processos  de 

separação de drogas em solução. 

A produção controlada de partículas de um determinado produto  (que pode ser uma droga ou a sua 

mistura  com  moléculas  transportadoras,  para  administração  dirigida)  cujas  características  físicas 

(tamanho, morfologia  e  estrutura)  estão  optimizadas  é  designada  por  “engenharia  de  partículas”. O 

objectivo principal desta disciplina é a  incorporação de atributos desejáveis nas partículas,  tais  como 

uma  estreita  distribuição  de  tamanhos,  elevada  dispersibilidade,  estabilidade  físico‐química,  maior 

biodisponibilidade, distribuição controlada e administração dirigida [9]. 

As técnicas desenvolvidas mais recentemente no domínio da micronização envolvem o uso de  líquidos 

convencionais,  gases  comprimidos,  líquidos  em  condições  próximas  do  ponto  crítico,  ou  fluidos 

 

supercríticos,  que  funcionam  como  solvente  ou  antisolvente,  ou meios  criogénicos  que  permitem  a 

congelação ultra rápida. Estas técnicas envolvem a separação de fases entre o solvente e a droga, por 

evaporação, expansão rápida, mudança na composição do solvente, ou solidificação por congelação. A 

configuração do atomizador em muitos destes processos permite a produção de gotas com elevada área 

superficial, o que resulta na separação de fases e rápida nucleação, levando a partículas muito pequenas 

[60]. 

Para  além  do  controlo  das  propriedades  das  partículas,  estes  novos  processos  trazem  vantagens 

relativamente  aos  métodos  tradicionais,  pois  requerem  menor  manuseamento,  o  que  permite  um 

aumento do  rendimento e simplifica os procedimentos de  limpeza e esterilização, e estão mais aptos 

para o aumento de escala. Estes processos podem também operar em modo contínuo, ao contrário dos 

processos de moagem, que operam em descontínuo [60]. 

O  início  da  aplicação  do  “spray  drying”  remota  aos  anos  40  do  século  XX,  no  processamento  de 

alimentos  e  de  produtos  bioquímicos  e  farmacêuticos  na  indústria.  O  facto  de  ser  uma  técnica 

relativamente  simples,  de  fácil  operação,  com  disponibilidade  de  equipamento  em  grande  escala  e 

capacidade  de  produção  de  materiais  compostos,  levou  a  uma  popularidade  generalizada  deste 

processo [9].  

As  drogas  processadas  por  esta  técnica  atingem  tamanhos  de  partícula  reduzidos  e  distribuições 

homogéneas. O limite de tamanho de partícula obtido por “spray drying” situa‐se no intervalo de 1 a 5 

µm, o que ainda  restringe a  sua aplicabilidade em alguns produtos  farmacêuticos  com exigências de 

tamanho  de  partícula mais  reduzido.  Contudo,  embora  bem  desenvolvida  e  versátil,  esta  técnica  é 

bastante limitada no que diz respeito à aplicação a produtos biológicos. Apesar de reduzido pelo efeito 

do  termómetro  húmido,  o  stresse  provocado  pelas  elevadas  temperaturas  pode  causar  alterações 

conformacionais, ou mesmo a desnaturação das biomoléculas. Também a rápida solidificação resulta na 

formação de partículas amorfas que podem sofrer recristalização, instabilizando o produto [9]. O uso de 

solventes orgânicos também deve ser evitado, devido a problemas toxicológicos e ambientais, pelo que 

esta técnica só deve ser aplicada a drogas solúveis em água [49]. 

Mais recentemente, nomeadamente a partir da década de 1990, têm vindo a ser desenvolvidas várias 

técnicas  que  empregam  os  fluidos  supercríticos  nos  processos  de  micronização,  as  quais  serão 

averiguadas com maior detalhe no decorrer deste texto. 

 

1.3. Os fluidos supercríticos e as suas aplicações 

1.3.1. Estado supercrítico 

Os  fluidos  supercríticos  caracterizam‐se  por  a  sua  temperatura  e  pressão  serem  superiores  aos 

correspondentes valores críticos (Figura 1.1). Acima do ponto crítico, deixa de haver tensão superficial e 

separação entre as fases líquida e gasosa em equilíbrio, formando‐se uma única fase supercrítica, cujas 

 

propriedades  são  intermédias  daqueles  dois  estados.  A  Tabela  1.1  regista  a  pressão  e  temperatura 

críticas de alguns fluidos com interesse em processos de extracção supercrítica. 

 

Tabela 1.1 – Constantes críticas de alguns fluidos com interesse em extracção supercrítica [40]. 

Fluido  Tc (K) Pc (bar) Etileno  282,4 50,4 Dióxido de carbono  304,1 73,8 Etano  305,4 48,8 Óxido nitroso 309,6 72,4 Propano  369,8 42,5 Etanol  513,9 61,4 Benzeno  562,1 48,9 Tolueno  591,8 41,0 Água  674,3 221,2 

 

A Figura 1.1  ilustra dois tipos de diagrama de fases do dióxido de carbono, que é, pelas características 

que  se  apontarão mais  à  frente,  a  substância mais usada para  trabalhar  em  condições  supercríticas, 

especialmente com produtos de origem biológica. 

 

(a)  (b)

Figura 1.1 – Diagramas de fase do dióxido de carbono: pressão vs temperatura (a); densidade vs pressão (b).  

Observando a Figura 1.1 (b), pode verificar‐se que, para temperaturas próximas da temperatura crítica, 

uma pequena variação na pressão provoca uma grande alteração na densidade, ao contrário do que se 

passa para  temperaturas muito superiores. De  forma semelhante, para pressões próximas da pressão 

crítica,  uma  pequena  variação  da  temperatura  provoca  uma  alteração  bastante  significativa  na 

densidade, o que  já não  se passa para pressões muito elevadas. Conclui‐se, portanto, que, perto do 

ponto crítico, a densidade é particularmente sensível a pequenas alterações nos valores de pressão e 

temperatura. 

A solubilidade de um soluto num solvente é ditada pelas forças intermoleculares entre os dois tipos de 

moléculas envolvidas. Esta interacção soluto‐solvente é fortemente promovida pela proximidade entre 

 

as moléculas e, portanto, pela densidade da  fase  fluida. Consequentemente, deve‐se esperar que um 

fluido supercrítico tenha um poder de dissolução elevado em estados de elevada densidade, sendo esse 

poder menor  para  densidades mais  baixas  [5].  Tendo  em  conta  as  considerações  anteriores,  é  fácil 

aceitar que o controlo do poder solvente de um fluido supercrítico é possível, através da manipulação 

da sua pressão, a temperatura constante. 

Os  fluidos  supercríticos  possuem  também  propriedades  de  transporte  que  os  tornam  únicos. 

Parâmetros como a viscosidade, condutividade  térmica e difusibilidade contribuem significativamente 

para  o  comportamento  do  fluido  supercrítico,  pois  são  essas  propriedades  que  determinam  a  força 

motriz para a transferência de calor e de massa. 

Tal  como  evidencia  a  Tabela  1.2,  a  densidade  do  fluido  supercrítico  pode  aproximar‐se  à  do  estado 

líquido, tornando o poder solvente dos fluidos supercríticos semelhante ao dos líquidos. Por outro lado, 

as propriedades de transporte são intermédias entre as dos gases e dos líquidos, o que faz com que um 

fluido  supercrítico  se  comporte  como uma  fase extremamente móvel,  capaz de  se misturar  rápida e 

profundamente com outras substâncias,  reduzindo ainda os custos de  transporte através de bombas, 

devido à sua baixa viscosidade. 

 

Tabela 1.2 – Ordens de grandeza de propriedades termofísicas dos fluidos supercríticos [5]. 

Estado Densidade (kg m‐3) 

Viscosidade (N s m‐2) 

Coeficiente de difusão (m2 s‐1) 

Condutividade térmica 

(W m‐1 K‐1) Gasoso  1 – 100  10‐5 – 10‐4 10‐5 – 10‐4 2×10‐5 – 5×10‐4

Fluido Supercrítico  250 – 800  10‐4 – 10‐3 10‐8 – 10‐7 5×10‐2 – 10‐1

Líquido  800 – 1200 10‐3 – 10‐2 10‐9 – 10‐8 ≈ 10‐1  

1.3.1.1. O dióxido de carbono como fluido supercrítico 

No que diz  respeito a  técnicas que envolvem o uso de  fluidos  supercríticos, o dióxido de  carbono é, 

quase  impreterivelmente,  a  substância  escolhida.  A  sua  pressão  e  temperatura  críticas, 

respectivamente, 73,8 bar e 31°C, são facilmente atingíveis e permitem o processamento, em condições 

moderadas e inofensivas, de produtos sensíveis à temperatura, como é o caso da maioria dos produtos 

de origem e aplicação biológica. Adicionalmente, o dióxido de carbono tem ainda as vantagens da sua 

natureza inerte, não tóxica, e do seu baixo custo. 

Em  termos  de micronização  supercrítica,  o  dióxido  de  carbono  permite  a  extracção  e  a  separação 

eficiente de  solventes orgânicos, o que possibilita a produção de partículas  secas, ou  sob a  forma de 

suspensão aquosa,  livres de  contaminação por parte dos  solventes. Este  facto, aliado à  facilidade da 

realização de uma precipitação limpa e reciclável, constitui, claramente, uma vantagem, nomeadamente 

no que diz respeito ao processamento de produtos farmacêuticos e alimentares. 

É  importante referir, ainda, as vantagens do dióxido de carbono supercrítico na precipitação selectiva, 

na  separação  de  impurezas  e  no  controlo  das  formas  cristalinas.  Em  certas  aplicações,  tais  como  a 

engenharia de partículas de drogas de elevado valor e sensibilidade, o dióxido de carbono supercrítico 

 

pode  reduzir  a  complexidade  de  fabrico,  as  necessidades  de  energia  e  de  solventes,  e  geralmente 

constitui um processo mais benigno e amigo do ambiente do que as técnicas convencionais [9]. 

Devido ao seu comportamento não polar, o dióxido de carbono  tem pouca afinidade para compostos 

polares. No entanto, a sua mistura com uma pequena quantidade de uma outra substância, designada 

de co‐solvente ou “entrainer”, como a água, o etanol ou o metanol, pode aumentar consideravelmente 

o poder solvente do dióxido de carbono [40]. 

 

1.3.2. Extracção supercrítica 

A extracção  supercrítica é uma das mais  conhecidas e estudadas aplicações dos  fluidos  supercríticos, 

que se baseia no poder de dissolução deste tipo de fluidos. Devido às suas características, estes fluidos 

têm uma boa capacidade para dissolver  solutos e, portanto, um grande potencial para os  separar de 

outros compostos, sendo relativamente fácil a manipulação da selectividade do fluido supercrítico por 

alteração das condições experimentais de pressão e/ou temperatura. 

As grandes vantagens da extracção supercrítica em relação às técnicas convencionais são a possibilidade 

de processamento a condições moderadas de temperatura e o uso de fluidos não tóxicos e baratos, o 

que  torna  este  processo  bastante  atractivo  para  a  separação  de  produtos  biológicos. O  uso  de  co‐

solventes neste processo é também particularmente atractivo, na medida em que permite a extracção 

de compostos polares. 

A  extracção  supercrítica  tem  aplicações  nas  indústrias  farmacêutica  e  alimentar,  na  extracção  de 

compostos de produtos naturais  (como  a  cafeína,  a baunilha, óleos  vegetais ou  carotenóides) ou na 

remoção de extractos  indesejáveis  (pesticidas ou químicos perigosos). Ao nível da  indústria biológica, 

este  tipo  de  extracção  tem  também  algumas  aplicações  interessantes,  como  a  remoção  de  agentes 

biostáticos de caldos de fermentação, a extracção de solutos orgânicos de soluções aquosas, a ruptura 

celular,  a  destruição  de  desperdícios  industriais,  o  tratamento  de  materiais  linhocelulósicos,  a 

recuperação  e  purificação  de  produtos  biológicos,  o  fraccionamento  de  óleos  ou  a  preparação  de 

lipossomas  [5].  Um  exemplo  de  aplicação  da  extracção  supercrítica  de  produtos  biológicos  é  na 

extracção de compostos com importância farmacêutica a partir de microalgas [40].  

 

1.3.3. Micronização supercrítica (“RESS” e “PGSS”) 

O papel dos  fluidos supercríticos no processo de micronização pode ser de solvente ou anti‐solvente. 

Dentro destas duas possibilidades, existem quatro  técnicas principais de micronização que envolvem 

este tipo de fluidos, sendo as duas primeiras abordadas nesta secção e as outras nas secções seguintes: 

• Expansão  rápida de uma  solução  supercrítica  (“Rapid  expansion of  supercritical  solutions”) – 

“RESS”; 

• Precipitação  a  partir  de  soluções  saturadas  em  gás  (“Precipitation  from  gas‐saturated 

solutions”) – “PGSS”; 

10 

 

• Anti‐solvente supercrítico (“Supercritical antisolvent”) – “SAS”; 

• Atomização assistida por fluidos supercríticos (“Supercritical assisted atomization”) – “SAA”. 

 

1.3.3.1. Expansão rápida de uma solução supercrítica (“RESS”) 

A expansão rápida de uma solução supercrítica é uma técnica de recristalização, redução de tamanho de 

partícula, e mistura de componentes [18]. Esta técnica foi  já aplicada na produção de pós de produtos 

cerâmicos, polímeros e esteróides farmacêuticos [60][25]. 

O  processo  de  micronização  por  “RESS”  baseia‐se  na  precipitação  de  partículas  através  da  rápida 

expansão da  solução em  cujo  solvente  se encontram dissolvidas. Nesta  técnica, o  soluto é dissolvido 

directamente  no  dióxido  de  carbono  supercrítico,  sendo  a  solução  depois  atomizada  através  de  um 

restritor para uma câmara de recolha, que está, tipicamente, em condições atmosféricas. Esta expansão, 

que  faz  com  que  o  dióxido  de  carbono  evapore  rapidamente,  provoca  uma  redução  brusca  na 

densidade, e, logo, no seu poder solvente, incitando um elevado grau de sobressaturação na solução e 

promovendo a rápida nucleação das partículas de soluto, o que produz o pó micronizado. 

Quando  um  composto  é  solúvel  no  dióxido  de  carbono  supercrítico  em  fracções  molares  de 

aproximadamente  10‐4,  esta  técnica  é  a  escolhida,  dado  que  permite  a  produção  contínua,  simples, 

directa, e livre de solventes, de um pó seco. A “RESS” pode ser optimizada para atingir distribuições de 

tamanho  de  partícula  relativamente  estreitas,  podendo  ser  usada  para  o  revestimento  de 

micropartículas  com polímeros  solúveis no dióxido de  carbono na microencapsulação de drogas, por 

exemplo [9]. 

A grande desvantagem deste processo é que a substância a precipitar não pode ser pouco solúvel no 

dióxido  de  carbono,  o  que  limita  a  aplicabilidade  desta  técnica  no  processamento  de  produtos 

biológicos e farmacêuticos, na sua maioria polares e insolúveis neste solvente. A aplicação da “RESS” em 

grande escala também sofre de alguns problemas, nomeadamente, ao nível da expansão do solvente, 

que provoca um arrefecimento muito acentuado no sistema. Esta queda de temperatura, que ocorre na 

zona do restritor, pode provocar o entupimento do mesmo, ou ainda promover a  formação de gotas, 

com  a  consequente  redissolução  e  perda  das  partículas  formadas.  No  processamento  de  produtos 

termolábeis, o pré‐aquecimento do  sistema pode não  ser possível, o que exige a adopção de outros 

meios,  como  a  administração  de  calor  à  câmara  de  recolha  com  um  fluido  quente,  o  que  implica, 

também, gastos adicionais [18]. 

 

1.3.3.2. Precipitação de soluções saturadas em gás (“PGSS”) 

A precipitação de soluções saturadas em gás faz uso da elevada solubilidade do dióxido de carbono em 

certos materiais,  como  os  polímeros,  o  que  resulta  na  sua  plasticização,  redução  da  viscosidade,  e 

abaixamento dos pontos de fusão e vitrificação [9]. Estas propriedades têm sido exploradas na mistura, 

11 

 

revestimento e encapsulação, de alguns produtos, desde pós inorgânicos a formulações farmacêuticas, 

sem que seja necessário o uso de solventes orgânicos [25]. 

A técnica e o fundamento da “PGSS” são muito similares à “RESS”. No entanto, embora sejam poucos os 

compostos orgânicos solúveis em dióxido de carbono, existe um número considerável de polímeros que 

podem ser embebidos em dióxido de carbono supercrítico e, portanto, processados por “PGSS” [60]. 

Como as solubilidades dos gases comprimidos em líquidos e sólidos como os polímeros são usualmente 

elevadas,  e muito mais  elevadas  do  que  as  solubilidades  desses  sólidos  e  líquidos  na  fase  gasosa 

comprimida,  o  processo  consiste  na  dissolução  de  dióxido  de  carbono  em  substâncias  fundidas  ou 

suspensas  em  líquidos,  conduzindo  à  formação de uma  solução ou  suspensão  saturada em  gás  [25]. 

Assim, o dióxido de carbono supercrítico é disperso para dentro de um composto  fundido, para criar 

uma suspensão gás‐líquido, cujo ponto de fusão e viscosidade diminuem com a concentração do fluido 

supercrítico. Esta suspensão é então atomizada, através de um restritor, para dentro de uma câmara de 

recolha,  que  se  encontra  em  condições  atmosféricas. Ao  expandir,  o  dióxido  de  carbono  arrefece  e 

promove  também o arrefecimento e a solidificação do material  fundido,  formando‐se micropartículas 

porosas, através de um mecanismo de sobressaturação semelhante ao já descrito para a “RESS”. 

As  vantagens  da  técnica  de  “PGSS”  são  também  idênticas  às  da  “RESS”,  no  que  diz  respeito  à 

simplicidade do processo, aos seus custos, e à possibilidade de ter um produto final  livre de solventes 

orgânicos. Adicionalmente, a “PGSS” requer, geralmente, pressões mais reduzidas e menores consumos 

de gás do que a “RESS” [18]. 

Como  desvantagem  da  “PGSS”,  tem‐se  que  esta  só  permite  o  processamento  de  compostos  que  se 

encontram  fundidos  abaixo  das  condições  do  fluido  supercrítico,  limitando  grandemente  a  aplicação 

desta técnica com formulações biológicas. 

 

1.3.4. Micronização com anti‐solvente supercrítico (“SAS”) 

Os anti‐solventes líquidos são amplamente conhecidos e aplicados na indústria. São baseados no uso de 

dois  solventes,  completamente miscíveis  entre  si,  sendo  o  soluto  a  precipitar  apenas  solúvel  num 

daqueles (o primeiro). A mistura do solvente com o anti‐solvente provoca a sobressaturação da solução 

e  a  consequente  precipitação  do  soluto.  No  entanto,  o  uso  de  solventes  líquidos  tem  a  grande 

desvantagem do complexo pós‐processamento, necessário para a completa eliminação dos resíduos de 

solvente. 

Devido às características de transporte dos fluidos supercríticos e à possibilidade da sua recuperação (e 

do solvente orgânico) sem processamento posterior, este tipo de fluidos tem sido proposto, nas últimas 

décadas, como alternativa aos anti‐solventes  líquidos  [51]. A micronização baseada neste conceito  foi 

apresentada, pela primeira vez, numa proposta de patente, em 1988 [25]. 

Do ponto de vista  termodinâmico, o processo de micronização com anti‐solvente  supercrítico  (“SAS”) 

tem de obedecer às seguintes especificações [52]: 

12 

 

• O  soluto  tem de  ser  solúvel no  solvente orgânico  à  temperatura de  trabalho  e  insolúvel no 

fluido supercrítico; 

• O solvente e o fluido supercrítico têm de ser miscíveis. 

 

O dióxido de  carbono  supercrítico,  como  anti‐solvente,  traz  várias  vantagens  relativamente  aos  anti‐

solventes  líquidos. Por um  lado, a completa remoção do anti‐solvente é conseguida com uma simples 

redução  de  pressão,  que  provoca  a  sua  passagem  ao  estado  gasoso.  Por  outro,  o  anti‐solvente 

supercrítico é caracterizado pela sua elevada difusibilidade, que pode ser, como foi  já referido (secção 

1.3.1), até duas ordens de grandeza superior à dos  líquidos. Assim, a sua rápida difusão e mistura no 

solvente  líquido  produz  a  rápida  sobressaturação  da  solução  e  a  precipitação  do  soluto  em 

micropartículas. 

Apesar  de  ainda  pouco  difundidos  na  indústria,  os  processos  de  precipitação  que  envolvem  fluidos 

supercríticos  têm  vindo  a  ser  vistos  como  excelentes  alternativas  aos  processos  tradicionais,  pela 

possibilidade que oferecem de garantir a elevada qualidade de certos produtos farmacêuticos, facto que 

se  sobrepõe  aos  problemas  técnicos  associados  às  altas  pressões  praticadas  [65].  Devido  à  baixa 

solubilidade de muitos compostos  farmacêuticos em dióxido de carbono, o processo “SAS” torna‐se o 

mais  apelativo,  relativamente  aos  outros  processos  de  micronização  com  fluidos  supercríticos  já 

abordados (secção 1.3.3). 

 

1.3.4.1. Fundamentos teóricos 

Na  técnica  de micronização  “SAS”,  a  precipitação  ocorre  de  acordo  com  a  selecção  adequada  das 

substâncias e das condições operatórias, de forma a que o solvente e o anti‐solvente sejam parcial ou 

totalmente miscíveis e o soluto tenha baixa solubilidade no anti‐solvente [15]. 

A micronização  “SAS”  é  um  processo  complexo  que  envolve  a  interacção  de  vários mecanismos  de 

transferência  de massa,  hidrodinâmica,  equilíbrio  de  fases,  nucleação  e/ou  crescimento  dos  cristais. 

Uma descrição completa deste processo teria de ter em conta todos estes mecanismos, o que, até aos 

dias de hoje, ainda não  foi possível,  apesar dos esforços por parte de muitos  autores na modelação 

deste processo [36]. 

Quando as condições operatórias se encontram abaixo do ponto crítico da mistura,  tira‐se partido da 

capacidade do dióxido de carbono supercrítico para dissolver e expandir solventes orgânicos. Quando a 

expansão é suficientemente acentuada, o poder de solvatação do solvente  torna‐se tão pequeno que 

provoca a sobressaturação da solução, permitindo a precipitação do soluto em pequenas partículas [51]. 

Em  condições  supercríticas  da mistura,  o  solvente  orgânico  difunde‐se  rapidamente  no  dióxido  de 

carbono e o este no solvente, formando uma única fase. Ambas as taxas de difusão são bastante mais 

rápidas do que em anti‐solventes  líquidos convencionais. Assim, as elevadas taxas de transferência de 

massa  resultam  numa  nucleação  muito  mais  rápida  e  uniforme,  permitindo  atingir  tamanhos  de 

partícula muito mais pequenos e distribuições de tamanho mais estreitas [60]. 

13 

 

Termodinâmica de misturas binárias 

As  condições operatórias  do  processo  de micronização  “SAS”  devem  ser  seleccionadas  com  base  na 

análise do diagrama de fases do sistema em estudo. Na carência de diagramas ternários para o sistema 

soluto,  solvente  e  anti‐solvente,  o  comportamento  do  sistema  pode  ser  previsto,  embora  não  sem 

algumas  reservas,  com  base  no  diagrama  binário  da mistura  solvente/anti‐solvente.  Este  diagrama 

permite saber qual o ponto crítico desta mistura, bem como as fracções molares dos dois componentes 

em cada uma das fases em equilíbrio, quando em condições subcríticas. 

Um dos sistemas mais estudados é constituído pelo etanol (solvente) e pelo dióxido de carbono (anti‐

solvente) e está representado na Figura 1.2, onde se relacionam a pressão e a composição da mistura. O 

ramo da esquerda representa a fracção molar de dióxido de carbono dissolvido na fase líquida, xCO2, e o 

da direita a fracção do mesmo componente na fase gasosa, yCO2.  

 

 

Figura 1.2 – Diagrama pressão–composição da mistura etanol–dióxido de carbono a 35°C [15].  

Abaixo do ponto crítico da mistura (ponto de junção dos ramos da esquerda e da direita na Figura 1.2), 

há coexistência de uma fase rica em etanol e de uma fase rica em dióxido de carbono. Como se mostra 

na mesma figura, no regime das baixas pressões, as fracções de dióxido de carbono na fase líquida e de 

etanol na  fase gasosa em equilíbrio  são ambas baixas. Com o aumento da pressão, a  solubilidade do 

dióxido de carbono no etanol aumenta, enquanto a fracção de etanol no dióxido de carbono se mantém 

praticamente  inalterada.  Ao  atingir  o  ponto  crítico  da mistura,  onde  as  curvas  de  líquido  e  vapor 

saturados se interceptam, a interface entre as duas fases desaparece e, a partir deste ponto, não existe 

tensão interfacial de equilíbrio nem calor latente. 

 

Nucleação e sobressaturação 

Em traços gerais, a nucleação tem início quando agregados de moléculas presentes em solução atingem 

uma determinada dimensão crítica. Inicialmente, a formação destes agregados é termodinamicamente 

14 

 

desfavorável, mas ocorre, devido ao movimento Browniano, em solução homogénea, ou à presença de 

substratos que facilitam a nucleação1, em solução heterogénea. Contudo, quando os agregados atingem 

a dimensão crítica, a absorção de qualquer molécula suplementar já é termodinamicamente favorável, 

pelo que a partícula cresce regular e irreversivelmente. 

À  partícula  de  dimensão  crítica  dá‐se  o  nome  de  núcleo  e  a  etapa  de  formação  destes  núcleos,  a 

primeira do processo de precipitação, é, portanto, designada de nucleação. O número de núcleos que se 

formam  por  unidade  de  tempo  e  de  volume  é  a  velocidade  de  nucleação.  A  segunda  etapa  deste 

processo é o crescimento, durante o qual não se formam mais núcleos e o que ocorre é o crescimento 

dos que se formaram na etapa anterior [62]. 

A  força motriz para que se dê a precipitação do soluto é a sobressaturação, S, definida pela equação 

(1.1), onde  x0 é  a  concentração  inicial do  soluto na  solução  e  xeq  a  correspondente  concentração de 

equilíbrio. 

 

eqx

xS 0=   (1.1) 

 

A sobressaturação ocorre devido à difusão do anti‐solvente nas gotas atomizadas do solvente contendo 

o soluto. Assim que a sobressaturação se torna suficientemente elevada num determinado elemento de 

volume, a nucleação tem início e a sua velocidade aumenta grandemente com o aumento de S. Quando 

o processo de difusão é rápido, o equilíbrio entre o solvente e o anti‐solvente é estabelecido antes que o 

primeiro núcleo se  forme, o que  faz com que a sobressaturação seja uniforme em  todo o volume da 

mistura, bem como a respectiva velocidade de nucleação. Assim, para maior grau de sobressaturação, 

são mais e mais pequenas as partículas que se formam por unidade de tempo e de volume. 

Tomando  novamente  como  exemplo  o  sistema  etanol–dióxido  de  carbono  (Figura  1.2  da  secção  0), 

verifica‐se que, perto do ponto crítico da mistura, o valor de xCO2 aumenta até 0,95. Nestas condições, a 

correspondente  concentração  de  equilíbrio  do  soluto,  xeq, decresce  várias  vezes  relativamente  à  sua 

concentração inicial, x0, o que faz com que a sobressaturação seja máxima perto do ponto crítico. Acima 

deste ponto, há miscibilidade total do solvente com o anti‐solvente, qualquer que seja a composição da 

mistura, pelo que a maior a fracção de dióxido de carbono no sistema torna menor a concentração de 

equilíbrio, xeq, o que permite tornar a sobressaturação máxima. 

 

1.3.4.2. O estado da arte da micronização “SAS” – trabalhos elaborados 

Ao  longo, essencialmente, da última década,  têm  sido  realizados vários estudos que  incidem  sobre o 

processo de micronização com anti‐solvente supercrítico. A aplicação desta técnica estende‐se, hoje em 

dia, a  vários  tipos de produto, desde explosivos a  fármacos, e a  investigação que  sobre ela  recai diz                                                                  1 Na presença de uma superfície heterogénea na solução sobressaturada, a energia  interfacial aparente decresce, porque a criação de uma  interface cristal–partícula é energeticamente  favorável, relativamente à criação de uma interface cristal–solução. [59] 

15 

 

respeito, principalmente, à influência das variáveis operatórias sobre as características do produto final 

e aos solventes utilizados. 

No início dos anos noventa, um trabalho de Randolph et al. [8] mostrou que a precipitação de sólidos a 

partir de solventes  líquidos, com a sobressaturação  induzida pela dissolução de dióxido de carbono a 

alta  pressão,  pode  ser  um  processo  de  cristalização  atractivo.  Os  autores  utilizaram  como  sistema 

modelo o β‐caroteno, utilizando como solvente a ciclohexanona e uma mistura de tolueno/butanol, e 

verificaram ainda que é possível separar o β‐caroteno dos seus produtos de degradação (óxidos), bem 

como purificar o isómero geométrico trans do β‐caroteno. 

Recentemente, Kikic et al.  [1] estudaram a  influência das condições operatórias na precipitação e co‐

precipitação  do  β‐caroteno  com  um  polímero  biodegradável  (PVP  K30),  utilizando  como  solvente  o 

clorofórmio. 

Cocero &  Ferrero  [10]  estudaram  também  a micronização  de  carotenóides  pela  técnica  “SAS”. O  β‐

caroteno foi micronizado com sucesso em condições subcríticas, utilizando como solventes o acetato de 

etilo  e  o  dicloromentano. Neste  trabalho,  foi  também  estudada  a  solubilidade deste  carotenóide  na 

mistura dióxido de carbono/acetato de etilo.  

Martín et al. [38] estudaram a aplicação e a influência das variáveis operatórias da micronização “SAS” 

na co‐precipitação do β‐caroteno e da  luteína com polietileno glicol (PEG). Este é um polímero solúvel 

em água e amplamente utilizado na indústria, devido à sua compatibilidade fisiológica. As vantagens da 

sua mistura com carotenóides são o aumento da estabilidade e da taxa de dissolução destes em água. A 

micronização  dessa  mistura  permite  obter  um  produto  final  livre  de  solventes  e  com  degradação 

térmica e oxidação dos carotenóides reduzidas. 

Os mesmos autores analisaram a precipitação do ácido mandélico em etil acetato por “SAS” [37], com 

vista ao aumento de escala deste processo para aplicação nas indústrias farmacêutica e cosmética. Este 

produto  pode  ser  utilizado  como  anti‐séptico  urinário  e  na  síntese  orgânica  de  drogas,  corantes  e 

pesticidas. A influência das variáveis operatórias (pressão, temperatura, concentração inicial e caudais) 

nas características do produto final foi avaliada, assim como foi realizada a modelação do processo. 

Um outro trabalho de Miguel et al. [42] reporta a micronização do licopeno e a influência das variáveis 

operatórias nas características do produto final. 

Majerik et al. [34] investigaram a co‐precipitação (“SAS”) do oxeglizatar (uma droga recente, fracamente 

solúvel em água, utilizada no combate à diabetes tipo II) com diferentes excipientes e solventes. O seu 

estudo incidiu sobre o efeito dos solventes e dos excipientes nas propriedades das formulações sólidas 

(grau  de  cristalinidade, morfologia,  pureza  polimórfica,  conteúdo  em  solvente  residual,  cinética  de 

dissolução e rendimento da precipitação), sendo que se concluiu ser possível a preparação de partículas 

de transportadores de drogas através da técnica “SAS”. 

Costa  et  al.  [11]  estudaram  a  precipitação  de  micropartículas  de  PHBV  (co‐precipitados  de  poli(3‐

hidroxibutirato)  com  3‐hidroxivalerato),  um  co‐polímero  que  tem  vindo  a  ver  aumentadas  as  suas 

aplicações no campo da biomedicina, devido às  suas potencialidades na administração  controlada de 

drogas.  A  micronização  do  PHBV  foi  possível,  sendo  ainda  estudada  a  influência  dos  parâmetros 

16 

 

operacionais  (temperatura,  pressão  e  caudal)  sobre  a morfologia  das  partículas,  o  seu  tamanho,  e 

distribuição de tamanhos. 

O  grupo  de  trabalho  de  Reverchon  et  al.  tem  vindo  a  desenvolver  vários  estudos  nesta  área.  A 

micronização de precursores de supercondutores [58][52], antibióticos [55][54][53] e biopolímeros [57]. 

A  influência  dos  vários  parâmetros  do  processo  e  dos  solventes  tem  sido  avaliada  na morfologia  e 

tamanho de partícula dos produtos finais. 

Tenorio  et  al.  investigaram  a  influência  dos  solventes  e  da  pressão  na micronização  da  ampicilina 

[71][70]. O trabalho permitiu concluir que a variação do solvente líquido provoca uma grande variação 

no  tamanho  e  distribuição  de  tamanho  de  partícula,  bem  como  na  morfologia  do  pó  obtido. 

Adicionalmente,  verificou‐se  que  a  variação  da  pressão  operatória  permite  controlar  a  forma  das 

partículas e a sua coalescência. 

Hwang  et  al.  [47]  realizaram  recentemente  um  estudo  no  qual  avalia  a  influência  da  pressão, 

temperatura,  e  solvente  utilizado,  nas  características  morfológicas  do  fluconazol  (um  agente  anti‐

fúngico)  recristalizado  pelo  processo  “SAS”.  Este  grupo  de  trabalho  observou  diferenças  nas  formas 

polimórficas  do  produto  causadas  pelas  alterações  das  condições  experimentais  do  processo, 

concluindo que  as  características do estado  sólido do  fluconazol podem  ser  controladas pela  técnica 

“SAS”. 

 

1.3.4.3. Variáveis que influenciam a micronização “SAS” 

A  influência  das  variáveis  operatórias  sobre  o  tamanho  de  partícula  obtido  utilizando  técnicas  de 

micronização  “SAS”  tem  sido  estudada  por  vários  autores.  Entre  essas  variáveis,  a  pressão  (P)  e  a 

temperatura  (T)  de  trabalho,  a  concentração  da  solução  inicial  (C)  e  os  caudais  de  CO2  (QCO2)  e  de 

solução  (QL)  têm  um  papel  fundamental  nos  mecanismos  de  precipitação,  actuando  quer  na 

hidrodinâmica do sistema, quer na termodinâmica da mistura ternária e, portanto, na força motriz para 

a precipitação – a sobressaturação. 

Reverchon [51] e Tenorio et al. [70] registaram alguns resultados importantes a este nível, fazendo uma 

revisão sobre alguns trabalhos já elaborados e o efeito das variáveis estudadas sobre o produto final. A 

Tabela  1.3  resume  alguns  desses  resultados,  evidenciando  que  não  existe  uma  regra  geral  para  a 

influência de cada uma das variáveis no processo, o que permite concluir que a micronização com anti‐

solvente supercrítico está ainda longe de ser explicada à luz de uma só disciplina. 

 

17 

 

Tabela 1.3 – Efeito das condições operatórias no tamanho de partícula de vários produtos micronizados através de técnicas de anti‐solvente supercrítico2 [70]. 

Produto  C T P QL  QCO2 Tetraciclina  ↔ - ↓ ↔ ↔ Amoxicilina3  ↑↓ ↑ ↑ ↔ ↔ Acetaminofen  - ↑ ↑ - - Ácido nicotínico  ↑ ↓ ↑ - ↑ Salbutamol  ↓ - - - - Rifampicina  ↑ - - - - Insulina  ↔ - ↔ ↔ - Ácido para‐hidroxibenzóico  ↓ - ↓ ↑ - Sulfatiazol  - ↔ - - ↓ Cefonicida  ↓ - - - - Budesonida  - - - ↔ ↔ Sulfarnetizol  - ↑ - - ↓ β‐caroteno  ↓ ↑ ↑ ↓ ↓ Salicilamida  ↓ ↑ ↓ ↑ - Teofilina  ↓ - ↑ ↔ - BECD  ↓ ↑ - - ↓ Atenolol  - - - ↑ - Paracetamol  ↔ ↑ - - ↓ Fenitoína  - - - - ↓ Indometacina de cobre  ↓ ↔ - ↔ -

 

1.3.5. Atomização assistida por fluidos supercríticos (“SAA”) 

A atomização assistida por  fluidos  supercríticos é a  técnica de micronização com  fluidos  supercríticos 

mais  recente,  tendo  sido  desenvolvida  com  base  nos  conceitos  da  técnica  “SAS”  e  patenteada  por 

Reverchon  [56].  Esta  técnica  foi  já  aplicada  com  sucesso  à  micronização  de  supercondutores, 

precursores de catalisadores, cerâmicas e compostos farmacêuticos, produzindo partículas de tamanho 

controlado  e  estreita  distribuição  de  tamanhos  de  partícula.  Sabe‐se,  ainda,  que  a  concentração  da 

solução líquida é o factor que mais influencia o tamanho de partícula [18]. 

A “SAA” faz uso dos fluidos supercríticos para a aerosolização de soluções. A mistura da solução com um 

fluido supercrítico, e sua posterior atomização, conduz à formação de micro bolhas e pequenas gotas, 

que  secam mais  rapidamente do que  aquelas  formadas  através de métodos  convencionais. Assim,  a 

temperatura necessária para secar as soluções nebulizadas é bastante inferior àquela que é necessária 

na técnica do “spray drying” [18]. 

Num  sistema  de  “SAA”,  é  usada  uma  torre  de  enchimento  de  elevada  superfície  de  contacto,  que 

permite a mistura e solubilização do dióxido de carbono, até concentrações próximas da saturação, na 

solução  líquida  que  contém  o  soluto.  A mistura  é  depois  pulverizada,  através  de  um  restritor,  para 

dentro  de  uma  câmara  de  precipitação,  cuja  pressão  é  próxima  da  atmosférica  e  por  onde  passa 

também uma corrente de azoto aquecido. Este é adicionado para promover a evaporação do solvente 

                                                                 2  Símbolos: ↑, aumento do  tamanho médio de partícula  com o  aumento do parâmetro; ↓,  redução do  tamanho médio de partícula com o aumento do parâmetro; ↔, efeito negligível do parâmetro; –, efeito do parâmetro não avaliado. 3 Dados retirados de dois estudos diferentes. 

18 

 

líquido, que pode ser água ou um solvente orgânico, e a consequente formação de pequenas partículas 

de soluto. 

Neste processo, a solubilização do dióxido de carbono na solução  líquida é um dos parâmetros chave 

que controlam a eficiência da micronização. A quantidade máxima de dióxido de carbono que pode ser 

dissolvida depende do solvente líquido e da temperatura e pressão dentro do dispositivo onde ocorre a 

mistura.  

A  “SAA”  já provou  ser  uma  técnica  vantajosa  na produção  de  farmacêuticos micronizados,  sem que 

ocorra  degradação  química,  com  distribuições  de  tamanhos  de  partícula  mais  estreitas  do  que  as 

obtidas  através  de métodos  convencionais.  Contudo,  a  grande  vantagem  da  “SAA”  relativamente  às 

outras técnicas de micronização que envolvem fluidos supercríticos é a versatilidade do solvente líquido 

usado.  A  possibilidade  de  utilizar  soluções  aquosas  estende  a  aplicabilidade  das  técnicas  de 

micronização com fluidos supercríticos ao processamento de produtos biológicos como as proteínas. 

 

1.4. Carotenóides 

Os  carotenóides  pertencem  a  uma  família  de  compostos  químicos  lipofílicos,  os  pigmentos,  que 

absorvem luz na região visível do espectro. A cor produzida por estes compostos deve‐se à presença de 

uma estrutura específica de cada molécula, o cromóforo, que capta a energia. A luz que não é absorvida 

por esta estrutura é reflectida, o que lhe confere a sua cor. 

Os pigmentos estão amplamente distribuídos pelos mais variados domínios da vida, mas são as plantas 

os principais produtores, onde se encontram nas  folhas,  frutos, caules e  flores. Os pigmentos existem 

também  em  algumas  estruturas  animais,  como  os  olhos  e  a  pele,  em  bactérias  e  em  fungos.  A 

importância  deste  tipo  de  compostos  é  relevante,  na medida  em  que,  sem  eles,  seriam  impossíveis 

funções vitais como a fotossíntese, onde têm o seu papel as clorofilas e os carotenóides, ou o transporte 

de oxigénio e dióxido de carbono, pela hemoglobina e a mioglobina. 

As  aplicações  dos  pigmentos  naturais  e  sintéticos  na  indústria  são  vastas  e  conhecidas  em 

medicamentos, alimentos, vestuário, mobiliário, cosméticos, entre outros produtos. 

O metabolismo dos carotenóides e potenciais funções biológicas e relacionadas com a saúde têm sido 

alvo de um interesse generalizado, devido às fortes correlações encontradas entre a ingestão de frutos e 

vegetais e a diminuição do risco de doenças crónicas como o cancro e a aterosclerose. 

 

1.4.1. Características estruturais, químicas e físicas 

Graças às suas características estruturais, os carotenóides pertencem à classe dos pigmentos que deriva 

dos  isoprenóides  (também  designados  de  terpenóides). Os  derivados  dos  isoprenóides  contam  com 

mais de 23000 compostos e são constantemente identificadas mais moléculas. Dada a sua abundância e 

estrutura, têm sido considerados três subgrupos principais: as quinonas, os carotenóides e os iridóides. 

19 

 

Em geral, os carotenóides são constituídos por oito unidades isoprenóides (Figura 1.3 a), cuja orientação 

é invertida no centro da molécula. No entanto, apesar de derivarem da molécula de isopreno, este não é 

o  precursor  directo  dos  isoprenóides.  Na  biossíntese,  esse  papel  é  levado  a  cabo  pela  sua  forma 

biologicamente activa, o difosfato de  isopentenilo  (Figura 1.3 b), que é formado do ácido mevalónico, 

via acetato [30]. 

 

 

(a)  (b)Figura 1.3 – Estrutura molecular do isopreno (a) e da sua forma biologicamente activa, difosfato de isopentenilo 

(b).  

A  característica mais  óbvia das moléculas  de  carotenóides  é  a  sua  longa  cadeia poliénica, que  pode 

conter entre três a quinze ligações duplas conjugadas (cromóforo), e cujo comprimento determina o seu 

espectro de absorção e, portanto, a sua cor. Alguns exemplos estão representados na Figura 1.4. 

 

 

Figura 1.4 – Estrutura molecular de alguns carotenóides.  

Nos compostos com uma única  ligação dupla conjugada, os comprimentos de onda de absorção estão 

na gama do ultravioleta, o que faz com que não sejam corados. Contudo, se uma molécula tem várias 

ligações duplas conjugadas, o seu comprimento de onda de máxima absorção desloca‐se para a região 

visível do espectro  (≈400‐600 nm). Para o olho humano, os  carotenóides  com  sete a quinze  ligações 

20 

 

duplas conjugadas aparentam uma cor que vai de amarelo a vermelho. Este sistema de electrões π é 

ainda influenciado por ligações duplas adicionais, grupos funcionais e diferentes conformações [30]. 

Todos  os  carotenóides  podem  ser  considerados  derivados  do  licopeno  (C40H56),  adquirindo  a  sua 

estrutura própria através de reacções envolvendo hidrogenação, desidrogenação, ciclização, inserção de 

oxigénio, migração de  ligações duplas, migração de grupos metilo, alongamento ou encurtamento de 

cadeias. 

Os  carotenóides  são  classificados  segundo  a  sua  estrutura  química  em  carotenos  (constituídos  por 

carbono e hidrogénio) e oxicarotenóides ou xantofilas (constituídos por carbono, hidrogénio e oxigénio). 

Podem ainda ser classificados, segundo a sua função, como carotenóides primários ou secundários. Os 

primeiros  agrupam  aqueles  que  são  essenciais  para  a  fotossíntese  (β‐caroteno,  violaxantina  e 

neoxantina),  enquanto  os  secundários  são  aqueles  que  estão  localizados  nos  frutos  e  nas  flores  (α‐

caroteno, β‐criptoxantina, zeaxantina, anteraxantina, capsantina, capsorubina). 

 

1.4.2. Distribuição na Natureza 

Os  carotenóides  são  o  grupo  de  pigmentos  mais  amplamente  distribuído.  A  sua  presença  foi  já 

identificada em organismos fotossintéticos e não‐fotossintéticos: em plantas superiores, algas, fungos, 

bactérias e, pelo menos, em uma espécie de cada forma de vida animal. São responsáveis pela coloração 

vermelha, cor‐de‐laranja ou amarela dos  frutos, vegetais,  fungos,  flores e  também pássaros,  insectos, 

crustáceos  e  trutas.  Contudo,  apenas  os  microrganismos  e  as  plantas  são  capazes  de  sintetizar 

carotenóides  de  novo. Os  carotenóides que  existem  nos  animais  são provenientes de  uma  das  duas 

fontes  anteriores,  apesar  de  poderem  ser  modificados  ao  longo  do  seu  metabolismo,  de  forma  a 

acumularem‐se nos tecidos. 

 

1.4.2.1. Plantas superiores 

Os  carotenóides  acumulam‐se nos  cloroplastos de  todas  as plantas  verdes, numa mistura de  α‐ e  β‐

caroteno, β‐criptoxantina, luteína, zeaxantina, violaxantina e neoxantina. Estes pigmentos encontram‐se 

sob a forma de complexos formados por uma  ligação não covalente com proteínas. Nas folhas verdes, 

os  carotenóides  estão  livres,  não  esterificados,  e  a  sua  composição  depende  da  planta  e  das  suas 

condições de desenvolvimento. Algumas gimnospérmicas acumulam carotenóides pouco vulgares, como 

a rodoxantina ou a β‐carotenona, em pequenas gotas de óleo que se encontram fora dos plastos. Nos 

tecidos reprodutivos, foram  já encontrados carotenóides como a  liliaxantina e a crocetina. Também as 

flores  podem  sintetizar  carotenóides  altamente  oxigenados  (frequentemente  5,8‐epóxidos),  β‐

carotenos,  ou  carotenóides  que  são  específicos  da  espécie.  Os  frutos  são  considerados  ainda mais 

surpreendentes  do  que  as  flores  na  síntese  de  carotenóides,  tendo  sido  descritos mais  de  setenta 

carotenóides que lhes são característicos. 

 

21 

 

1.4.2.2. Algas 

Nas  algas,  os  carotenóides  encontram‐se nos  cloroplastos,  em misturas  complexas  características  de 

cada classe. A excepção vai para as algas verdes  (filo Chlorophyta), que  têm  tendência a acumular os 

pigmentos característicos das plantas superiores. 

As algas vermelhas  (filo Rhodophyta) possuem  α‐ e  β‐caroteno e os  seus derivados hidroxilados. Nos 

dinoflagelados  (filo  Pyrrophyta),  os  pigmentos  principais  são  a  peridininda,  a  dinoxantina  e  a 

fucoxantina. As  crisófitas  (filo  Chrysophyta)  acumulam  epoxi‐carotenóides,  e  carotenóides  alénicos  e 

acetilénicos, e ainda  fucoxantina e diadinoxantina. A eutreptielanona  foi  identificada em euglenófitas 

(filo Euglenophyta). O  filo Chloromonadophyta  tem  como principais  carotenóides  a diadinoxantina,  a 

heteroxantina  e  a  vaucheriaxantina.  As  Chryptophyta  são  caracterizadas  pelos  seus  carotenóides 

acetilénicos, como a aloxantina, a monadoxantina e a crocoxantina. As Phaeophyta são caracterizadas 

pelo seu pigmento principal, a fucoxantina. 

 

1.4.2.3. Bactérias 

São  cerca  de  oitenta  os  diferentes  carotenóides  sintetizados  por  bactérias  fotossintéticas.  Estes 

carotenóides  são  caracterizados  por  ser,  na  sua  maioria,  alifáticos,  embora  nas  Chlorobiaceae  e 

Chloroflexaceae alguns carotenóides tenham anéis aromáticos ou β. Cada espécie possui várias classes 

de carotenóides, que se encontram, na sua totalidade, ligados aos complexos de captação de luz ou aos 

centros de reacção nos sistemas membranares das células bacterianas. 

Nas  bactérias  não  fotossintéticas,  os  carotenóides  podem  aparecer  esporadicamente  e,  quando 

presentes, têm características únicas. Por exemplo, algumas Staphylococcus acumulam carotenóides C30, 

as flavobactérias C45 e C50, enquanto algumas micobactérias acumulam glicosídeos de carotenóides C40. 

 

1.4.2.4. Fungos 

A  distribuição  dos  carotenóides  pelos  fungos,  organismos  não  fotossintéticos,  é  aparentemente 

caprichosa. No  entanto,  estas  espécies  acumulam  geralmente  carotenos  e  carotenóides mono‐  e  bi‐

cíclicos. 

 

1.4.3. Biossíntese 

A  biossíntese  dos  carotenóides  inicia‐se  com  a  síntese  do  difosfato  de  isopentenilo  (IPP)  envolve  a 

condensação da hidroxietil  tiamina, derivada do piruvato,  com o  carbono C1 do grupo aldeído do D‐

gliceraldeído‐3‐fosfato (G3P), reacção que dá origem à 1‐desoxi‐D‐xilulose 5‐fosfato (DXP). Esta reacção 

é  catalisada  pela  1‐desoxi‐D‐xilulose  5‐fosfato  sintase  (DXPS). De  seguida,  um  rearranjo molecular  e 

subsequente  redução da DXP, catalisada pela DXP  redutoisomerase, que  requer NADPH e Mn2+ como 

cofactores,  dá  origem  ao  2‐C‐metil‐D‐eritriol  4‐fosfato  (MEP).  Este  é  convertido  a  IPP  e  dimetil‐alil 

22 

 

pirofosfato  (DMAPP)  via  4‐(citidina  5’‐difosfo)‐2‐C‐metil‐D‐eritritol  (CDP‐ME),  2‐fosfo‐4‐(citidina  5’‐

difosfo)‐2‐C‐metil‐D‐eritritol (CDP‐MEP), 2‐C‐metil‐D‐eritritol‐2,4‐ciclodifosfato e 1‐hidroxi‐2‐metil‐2‐(E)‐

butenil 4‐fosfato  (HMBPP). As enzimas envolvidas nestas reacções são a 2‐C‐metil‐D‐eritritol 4‐fosfato 

citidil  transferase  (MCT),  4‐(citidina  5’‐difosfo)‐2‐C‐metil‐D‐eritritol  cinase  (CMK),  2‐C‐metil‐D‐eritritol 

2,4‐ciclodifosfato (MCS) e 1‐hidroxi‐2‐metil‐2‐(E)‐butenil 4‐fosfato sintase (HDS). 

A enzima responsável pela conversão de HMBPP numa mistura de IPP e DMAPP é a IPP/DMAPP sintase. 

Um esquema da via metabólica que leva à formação do IPP está representado na Figura 1.5. 

 

 

Figura 1.5 – Formação do difosfato de isopentenilo [19].  

O IPP é a unidade básica para a construção dos terpenóides de cadeia mais longa. Contudo, o IPP não é 

suficientemente  reactivo para  iniciar as  reacções de condensação, pelo que o primeiro passo é a  sua 

isomerização a dimetil‐alil pirofosfato (DMAPP), reacção que é catalisada pela IPP isomerase, que utiliza 

como  cofactor  um  ião metálico  divalente.  O  passo  seguinte  é  a  condensação  do  IPP  e  do  DMAPP, 

formando  geranil  pirofosfato  (GPP).  De  seguida,  duas  moléculas  de  IPP  são  adicionadas  ao  GPP, 

obtendo‐se o geranilgeranil pirofosfato (GGPP), por catálise com a GGPP sintase, enzima que necessita 

de dois  iões, Mg2+ e Mn2+, por centro catalítico. O  intermediário destas reacções é o farnesil difosfato 

(FPP). 

O primeiro passo  específico para  a  síntese dos  carotenóides  é  a  condensação de duas moléculas de 

GGPP,  para  obter  o  cis‐fitoeno  (C40),  tendo  a  reacção  o  prefitoeno  pirofosfato  (PPPP)  como 

intermediário. No tomate e na pimenta, foi verificado que uma enzima (fitoeno sintase) catalisa ambos 

os passos. A biossíntese do fitoeno está representada na Figura 1.6. 

 

23 

 

 

Figura 1.6 – Biossíntese do fitoeno a partir do IPP e do DMAPP [19].  

O fitoeno sofre quatro reacções de dessaturação, para se obter fitoflueno, ζ‐caroteno, neurosporeno e, 

finalmente, licopeno, nas quais se sabe que o ferro tem um papel fundamental na cadeia de transporte 

electrónico. A biossíntese dos outros carotenóides dá‐se a partir deste ponto, através de reacções cuja 

molécula de partida é o  licopeno. A enzima responsável pela dessaturação do fitoeno a ζ‐caroteno é a 

fitoeno dessaturase  (PDS),  sendo a  ζ‐caroteno dessaturase  (ZDS)  responsável pela dessaturação do  ζ‐

caroteno a licopeno, via neurosporeno. 

 

1.4.4. Fontes alimentares 

Os  carotenóides  que  se  encontram  na  dieta  humana  derivam  essencialmente  de  plantas  cultivadas, 

onde os  carotenóides estão  localizados nas  raízes,  folhas, galhos,  sementes,  frutos e  flores. Cerca de 

sessenta carotenóides diferentes foram  já  identificados em frutos e vegetais consumidos pelo Homem 

[19]. Em menor proporção, os carotenóides podem também ser encontrados em ovos, aves domésticas 

ou  peixe,  animais  que  se  alimentam  tipicamente  de  plantas  ou  algas.  As  quantidades  típicas  de 

carotenóides em plantas cultivadas são mostradas na Tabela 1.4. 

No sangue humano em circulação, os sete carotenóides predominantes são o β‐caroteno, o licopeno, a 

luteína,  o  α‐caroteno,  a  α‐criptoxantina,  a  β‐criptoxantina  e  a  zeaxantina.  Cerca  de  25  a  75%  do  β‐

caroteno percorre o intestino e é expelido com as fezes, mas o restante é absorvido inalterado, circula 

através  do  corpo  e  é  armazenado  no  tecido  adiposo,  devido  à  sua  lipossolubilidade,  o  que  dá  às 

gorduras a sua cor amarela. A eliminação ocorre depois, lentamente, através da via fecal. Carotenóides 

diferentes são acumulados em diferentes órgãos: o licopeno e o β‐caroteno na próstata, e a luteína e a 

zeaxantina na mácula do olho, por exemplo [45]. 

24 

 

Tabela 1.4 – Quantidades típicas de carotenóides em vegetais [19]. 

Espécie  Carotenóides (µg/g peso fresco)Total  Zeaxantina Luteína α‐Caroteno β‐Caroteno  Licopeno

Couve‐de‐bruxelas  1163  ‐ 610 ‐ 553  ‐ Feijão verde  940  ‐ 494 70 376  ‐ Fava  767  ‐ 506 ‐ 261  ‐ Bróculo  2533  ‐ 1614 ‐ 919  ‐ Couve  139  ‐ 80 ‐ 59  ‐ Alface  201  ‐ 110 ‐ 91  ‐ Salsa  10335  ‐ 5812 ‐ 4523  ‐ Ervilha  2091  ‐ 1633 ‐ 458  ‐ Espinafre  9890  ‐ 5869 ‐ 4021  ‐ Agrião  16632  ‐ 10713 ‐ 5919  ‐ Damasco  2196  31 101 37 1766  ‐ Banana  126  4 33 50 39  ‐ Cenoura (Maio)  11427  ‐ 170 2660 8597  ‐ Cenoura (Setembro)  14693  ‐ 283 3610 10800  ‐ Laranja  211  50 64 Nd 14  ‐ Pimenta  2784  1608 503 167 416  ‐ Pêssego  309  42 78 Tr 103  ‐ Milho doce  1978  437 522 60 59  ‐ Tomate  3454  ‐ 78 ‐ 439  2937Nd = não detectado; Tr = traço. 

 

1.4.5. Estabilidade 

Regra geral, os carotenóides, na sua forma pura, revelam estabilidade baixa e são altamente sensíveis a 

vários  factores, como a  luz, o oxigénio, os ácidos, as bases e o calor. Sob condições deste género, os 

carotenóides são altamente susceptíveis a uma variedade de processos de degradação e de conversão 

oxidativa,  e  podem  ser  isomerizados.  É  importante,  então,  que  sejam  protegidos  por  formulações 

adequadas e aditivos. Contudo, os ésteres e os complexos de carotenóides‐proteínas são bastante mais 

estáveis [30]. 

 

1.4.6. Funções biológicas 

1.4.6.1. Nas plantas 

De entre as funções dos carotenóides nas plantas está a cor que estas moléculas conferem às flores, às 

sementes e aos frutos, a qual tem um papel  importante na reprodução: a coloração atrai animais que 

dispersam pólen, sementes ou esporos. 

Outro  dos  papéis  vitais  desempenhado  por  carotenóides  é  o  da  fotossíntese,  levada  a  cabo 

principalmente por clorofilas e carotenóides. Os carotenóides têm aqui duas funções bem conhecidas: 

são pigmentos  acessórios na  captação de  luz  e  actuam  também  como  fotoprotectores  contra danos 

oxidativos. A estrutura física dos cloroplastos, onde se alojam os carotenóides, facilita a transferência de 

energia  dos  carotenóides  para  as  clorofilas.  Nas  membranas  dos  tilacóides,  os  carotenóides  estão 

ligados a clorofilas e proteínas, formando complexos específicos, designados de fotossistema I e II (PSI e 

25 

 

PSII,  respectivamente),  que  desempenham  funções  primárias  na  fotossíntese.  O  carotenóide  mais 

abundante no PSI é o β‐caroteno, sendo a luteína mais abundante no PSII. 

O ciclo da xantofila desempenha também um papel importante no mecanismo de protecção das plantas 

contra os danos provocados pela luz. Quando as folhas estão expostas a uma iluminação muito forte, os 

grupos  epoxi‐xantofila  são  removidos  da  violaxantina,  para  inicialmente  formar  a  anteraxantina  e  a 

zeaxantina. O nível de  carotenóides do  ciclo da  xantofila  (violaxantina, anteraxantina e  zeaxantina) é 

aumentado nas  folhas expostas ao sol,  fenómeno que é particularmente  importante na dissipação de 

parte da energia absorvida, para protecção do aparelho fotossintético. 

 

1.4.6.2. No ser humano 

As primeiras correlações entre o elevado consumo de carotenóides e benefícios para a saúde surgiram 

na  literatura  na  década  de  1970.  Dietas  ricas  em  frutos  e  vegetais  eram  associadas  a  reduzidas 

incidências de cancro e doenças coronárias, verificando‐se também o inverso. 

Ao  longo  dos  anos,  têm  sido  realizados  inúmeros  estudos  que  evidenciam  os  benefícios  dos 

carotenóides  para  o  ser  humano.  Foi  já  observado,  entre  outras  propriedades,  que  os  carotenóides 

modulam o metabolismo do citocromo P450 (β‐caroteno, criptoxantina, luteína); inibem o metabolismo 

do  ácido  araquidónico  (β‐caroteno);  actuam  como  antioxidantes  e  aniquiladores  de  radicais  livres  e 

espécies reactivas (astaxantina, cantaxantina, α‐caroteno, β‐caroteno, crocetina, criptoxantina,  luteína, 

licopeno, zeaxantina); modulam funções imunitárias (astaxantina, cantaxantina, β‐caroteno); induzem a 

diferenciação e a comunicação  intercelular (astaxantina, cantaxantina, α‐caroteno, β‐caroteno,  luteína, 

licopeno);  inibem  a  instabilidade  cromossómica  (cantaxantina,  β‐caroteno);  e  inibem  alterações 

bioquímicas  associadas  à  proliferação  celular  (α‐caroteno,  β‐caroteno).  O  β‐caroteno  pode  ainda 

influenciar a apoptose, levando à morte celular, ao invés da sua proliferação [45]. 

 

Pro‐vitamina A 

A mais bem estabelecida função dos carotenóides é a de pro‐vitamina A. Esta está restringida a cerca de 

cinquenta e três carotenóides com anéis β nas suas extremidades, tais como o β‐caroteno, a zeaxantina 

e a β‐criptoxantina. Quando  ingeridos, estes carotenóides são convertidos em retinal por uma 15‐15’‐

desoxigenase intestinal. A vitamina A na dieta pode provir de fontes animais, sob a forma de ésteres de 

retinil,  retinol  e  retinal,  ou  de  fontes  vegetais,  sob  a  forma  de  carotenóides.  Os  carotenóides  pro‐

vitamina A nos vegetais e nos  frutos atingem a actividade de vitamina A quando  são convertidos, no 

corpo, em retinol. Este pode  inibir a proliferação e  induzir a diferenciação de células epiteliais, através 

de ligações a receptores nucleares e subsequente modificação da actividade dos genes [45]. 

Os  carotenóides  pro‐vitamina  A  na  dieta  podem  ainda  prevenir  doenças  como  a  xeroftalmia  [19], 

doença que se  refere em conjunto a  todas as manifestações oculares da deficiência de vitamina A. O 

primeiro sinal da carência neste nutriente é a cegueira nocturna, que pode progredir a danos estruturais 

26 

 

no  olho,  como  a  secura  das  membranas  e  da  córnea,  podendo  eventualmente  resultar  no 

enfraquecimento da visão ou na cegueira irreversível. 

A  vitamina  A  é  indispensável  para  o  normal  funcionamento  do  sistema  imunitário,  da  visão,  para  a 

manutenção  epitelial,  segregação  mucosa,  resistência  a  infecções  e  reprodução.  No  processo  da 

degeneração macular, o retinol está relacionado com a indução de uma cascata de genes que permite a 

fagocitose da célula danificada na retina, processo que é crítico para a sobrevivência do fotoreceptor. 

Adicionalmente,  está  estabelecido  que  os  retinóides  afectam  muitos  processos  biológicos,  como  a 

proliferação celular, a diferenciação e a morfogénese [14]. 

 

Antioxidante 

Os carotenóides são também bem conhecidos pela sua actividade antioxidante e está estabelecido que 

a sua estrutura tem aqui uma forte influência. Os carotenóides têm assim a capacidade de actuar como 

aniquiladores  do  oxigénio  molecular  singleto,  funcionando  como  protectores  das  células  e  dos 

organismos contra a foto‐oxidação, evitando a presença de radicais  livres e de espécies excitadas que 

podem causar danos  irreversíveis ao nível do DNA e dos  lípidos. Estas propriedades dos carotenóides 

fazem deles uma potencial arma contra o cancro e outras doenças que se acredita serem despontadas 

por radicais livres, como a aterosclerose, as cataratas, a degeneração macular relacionada com a idade e 

a esclerose múltipla  [19]. Estudos epidemiológicos que examinam o  risco de doença e a aquisição de 

carotenóides  específicos  têm  sugerido  uma  correlação  inversa  entre  os  níveis  de  α‐tocoferol  e  de 

carotenóides e a incidência de doenças coronárias [61]. 

O  stresse  oxidativo  tem  sido  implicado na  patofisiologia de  inflamações  crónicas  e  no  cancro,  assim 

como em doenças como a de Alzheimer, Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, ou arteriosclerose. Foi 

já demonstrado que o licopeno e o β‐caroteno intracelulares são capazes de proteger as células contra 

danos no DNA causados por peroxinitritos formados a partir da geração simultânea de óxido nítrico e do 

radical superóxido. Estes carotenóides são também inibidores potentes de quebras na cadeia simples de 

DNA plasmídico [44]. 

O  transporte  de  carotenóides  até  aos  tecidos  dá‐se  através  de  lipoproteínas,  essencialmente 

lipoproteínas de baixa densidade. Devido às suas características antioxidantes, é possível que a função 

dos  carotenóides  seja,  em  parte,  proteger  as  lipoproteínas  da  oxidação.  Esta  protecção  poderá  ser 

importante no desenvolvimento da  aterosclerose,  após  ter  sido posta  a hipótese de que o processo 

desta doença envolve a oxidação das lipoproteínas de baixa densidade [61]. 

Este tipo de descobertas permitem explicar a razão pela qual os frutos e os vegetais estão muitas vezes 

ligados  a  baixos  riscos  de  desenvolvimento  de  processos  patológicos  como  o  cancro,  a  inflamação 

crónica e as doenças cardiovasculares e neurológicas. Em combinação com vários outros mecanismos, 

as propriedades antioxidantes dos carotenóides podem proteger as células contra os efeitos adversos 

do stresse oxidativo [44]. 

Os  carotenóides  reagem  contra  os  radicais  livres  através  de  mais  do  que  um  mecanismo.  Podem 

fornecer electrões em falta aos radicais livres de outras moléculas ou formar aductos com esses radicais, 

27 

 

por  exemplo.  Em  ambos  os  casos,  é  a  riqueza  em  electrões  nativa  dos  carotenóides  que  os  torna 

atractivos para os radicais, permitindo a protecção de  lípidos, proteínas e DNA, dos danos provocados 

pelos  radicais.  Como  consequência,  há  um  interesse  crescente  no  uso  e  na medida  da  capacidade 

antioxidante  em  preparações  alimentares  e  farmacêuticas  e  em  estudos  clínicos.  O  interesse  é 

principalmente devido ao papel das espécies de oxigénio reactivas no processo de envelhecimento e na 

patogénese  de  muitas  doenças  nas  quais  aquelas  espécies  estão  envolvidas.  Muitos  estudos  têm 

mostrado que estas espécies de oxigénio  reactivas,  incluindo  radicais  livres de oxigénio,  são  factores 

importantes  na  etiologia  de  doenças  degenerativas,  incluindo  algumas  hepatopatias  e  danos 

importantes  noutros  orgãos.  Estes  radicais  livres  são  também  responsáveis  pelo  ataque  aos  ácidos 

gordos insaturados das membranas biológicas, o que resulta na peroxidação lipídica e na desnaturação 

de  proteínas  e  do  DNA,  causando  uma  série  de  alterações  deteriorativas  nos  sistemas  biológicos, 

levando à inactivação celular [43]. 

 

Anti‐cancerígeno 

Culturas de células in vitro mostram que os carotenóides inibem a proliferação celular, a transformação, 

a formação de micronúcleos, e a expressão de certos genes. Estas propriedades são consistentes com o 

efeito protector contra a carcinogénese. Vários estudos têm sido realizados, sugerindo relações entre o 

consumo elevado de carotenóides e o menor  risco de cancro do pulmão, da mama, da próstata e do 

recto [19]. Os carotenóides de maior relevância neste campo são o β‐caroteno e o licopeno, o primeiro 

associado ao pulmão e à mama e o segundo à próstata e ao recto. Contudo, nem todos os estudos nesta 

área são consistentes entre si, revelando um misto de mecanismos ainda desconhecido e uma dúvida 

permanente acerca da verdadeira actividade anticancerígena dos carotenóides [6]. 

 

1.5. β‐caroteno 

De todos os carotenóides, o β‐caroteno é o de actividade biológica mais relevante, sendo a sua função 

mais conhecida a de pro‐vitamina A. O β‐caroteno possui uma coloração que vai desde o amarelo até ao 

vermelho forte, dependendo do seu grau de pureza, fonte e localização, ocorre naturalmente em muitas 

plantas, nomeadamente vegetais e frutos. Contudo, as concentrações mais elevadas de β‐caroteno são, 

de  longe, as encontradas na microalga halotolerante Dunaliella salina, atingindo até 100 g/kg de peso 

seco  [31]. O β‐caroteno é também o carotenóide mais  importante em termos de biodisponibilidade e 

ocorrência  na  natureza.  Aparentemente,  todas  as  amostras  de  plantas  carotenogénicas  comestíveis 

analisadas até à data contêm o β‐caroteno como constituinte, principal ou não [17]. 

 

1.5.1. Química 

Se  o  aldeído  retinal  (C20,  H18, O)  for  representado  por  R=O,  então  o  retinol  será  H‐R‐OH,  o  ácido 

retinóico  será  H‐R‐OOH,  e  o  β‐caroteno  com  todas  as  ligações  trans  será  R=R.  Como  os  outros 

28 

 

carotenóides, o β‐caroteno é um isoprenóide biossintetisado através da ligação das extremidades finais 

(cadeia  linear)  de  duas moléculas  C20.  Assim,  o  β‐caroteno  é  baseado  num  esqueleto  de  quarenta 

átomos de carbono, com onze  ligações duplas conjugadas C=C. Este sistema de  ligações C‐C duplas e 

simples  alternadas  forma o  cromóforo,  com electrões  π deslocalizados  ao  longo da  cadeia poliénica, 

gerando a sua distinta forma molecular, reactividade química e propriedades de absorção de  luz. Esta 

ocorre na gama  visível de baixa energia do espectro, que  confere aos  frutos e plantas as  suas  cores 

amarela,  laranja, vermelha e verde brilhantes. As extremidades da molécula do  β‐caroteno  são anéis 

monoinsaturados de seis átomos de carbono (Figura 1.7). 

 

 

Figura 1.7 – Estrutura molecular do β‐caroteno.  

O β‐caroteno pode ocorrer sob a  forma de vários estereoisómeros, sendo o mais estável a  forma em 

que  todas  as  ligações  são  trans.  Contudo,  as  formas  cis  são  significantemente  mais  lipossolúveis, 

podendo ser absorvidas de forma melhor pelo corpo humano. Estima‐se que as formas cis apresentem 

uma  actividade  de  pro‐vitamina  A  de menos  de  50%  da  forma  completamente  trans.  No  entanto, 

estudos recentes levados a cabo com o isómero nomeado 9‐cis‐β‐caroteno revelaram que este pode ser 

isomerisado quase completamente ao β‐caroteno com todas as  ligações trans no  intestino delgado do 

homem.  Isto  implica que o 9‐cis‐β‐caroteno é  tão bom como o β‐caroteno de configuração  trans, em 

termos de fonte de vitamina A. 

 

1.5.2. Biossíntese 

A biossíntese do  β‐caroteno dá‐se por  ciclização do  licopeno,  cuja biossíntese  foi  já descrita  (secção 

1.4.3), por acção da β‐ciclase (LCY‐b). A ciclização é limitada à formação de um anel de seis membros nas 

duas extremidades do precursor acíclico (licopeno). A formação dos grupos cíclicos nas extremidades é 

iniciada  por  ataque  no  carbono  C2  da  ligação  dupla  do  terminal  C‐1,2,  que  está  isolada  da  cadeia 

poliénica. Podem ocorrer dois tipos de anéis, α e β, os quais diferem da posição da ligação dupla no anel 

ciclohexeno e dependem da natureza da enzima ciclase (Figura 1.8). Estudos sugerem que o substrato 

para a ciclização é o todo‐trans‐licopeno e o cofactor necessário pelas ciclases é o NADPH. 

 

29 

 

 

Figura 1.8 – Ciclização do licopeno (formação do β‐caroteno) [19].  

1.5.3. Funções biológicas 

Para  o  ser  humano,  a  função  mais  importante  do  β‐caroteno  é  a  de  precursor  da  vitamina  A. 

Teoricamente,  a  clivagem  enzimática  de  uma molécula  de  β‐caroteno  pode  render  duas  de  retinol, 

enquanto  a  clivagem  de  outros  dois  carotenóides  pro‐vitamina  A  importantes,  o  α‐caroteno  e  a  β‐

criptoxantina, rendem apenas uma molécula de retinol cada. Um dos benefícios da administração de β‐

caroteno é que a sua conversão a vitamina A só se dá quando esta é  requerida pelo corpo, o que se 

opõe à potencial toxicidade associada com uma overdose de vitamina A [17]. 

Para lá da sua função como precursor da síntese de vitamina A pelo corpo, a actividade antioxidante do 

β‐caroteno é também bem conhecida. O β‐caroteno é um tipo de antioxidante pouco usual, que actua 

por  aniquilação  dos  radicais,  sendo  a  sua  actividade  óptima  à  pressão  de  oxigénio  nos  tecidos. 

Evidências  epidemiológicas  têm mostrado que o  β‐caroteno  é  capaz  de prevenir o  cancro  em  vários 

órgãos, como o pulmão, o estômago, o colo do útero, o pâncreas, o cólon, o recto, a mama, a próstata e 

o ovário, através da sua actividade antioxidante. Outras funções deste carotenóide são a sua influência 

na comunicação intracelular, resposta imunitária, transformação neoplástica e controlo do crescimento 

[43]. Os resultados de um estudo  in vitro revelam ainda evidências para a morte de uma  linha celular 

leucémica de linfoblasto T provocada pelo β‐caroteno [6]. 

 

1.6. Objectivos do trabalho 

As  propriedades  do  β‐caroteno  tornam‐no  numa  substância  de  grande  potencial  de  aplicação  nas 

indústrias  farmacêutica  e  alimentar,  como  corante,  antioxidante  ou  precursor  da  vitamina  A,  entre 

outros potenciais  efeitos benéficos. Contudo,  a  elevada  lipofilicidade deste  carotenóide  faz  com que 

30 

 

seja altamente insolúvel em preparações aquosas, pelo que é importante a procura de uma solução que 

ultrapasse esta limitação. 

A  redução de  tamanho de partícula é,  como  foi  já  referido, uma das  formas de  aumentar  a  taxa de 

dissolução de  substâncias de baixa  solubilidade perante a preparação de  suspensões dessas mesmas 

substâncias. 

O presente  trabalho  tem por objectivo principal  a micronização do  β‐caroteno  sintético, utilizando  a 

técnica de micronização por anti‐solvente supercrítico. O solvente escolhido é o tetrahidrofurano (THF), 

devido à solubilidade relativamente elevada do β‐caroteno neste solvente (10 mg/mL). 

A recolha de resultados de solubilidade é  importante para vários processos da tecnologia supercrítica, 

como a cromatografia, a extracção e a precipitação. Assim, simultaneamente, medidas de solubilidade 

do β‐caroteno na mistura supercrítica CO2/THF serão possíveis e estudar‐se‐á a variação da solubilidade 

com as variáveis do processo – temperatura, pressão e composição da mistura. 

O estudo da morfologia e da dimensão das partículas obtidas aquando do processamento a diferentes 

pressões será  realizado, de  forma a  tentar estabelecer uma relação entre o  tamanho de partícula e a 

pressão  de  trabalho.  Serão  realizados  ensaios  acima  e  abaixo  da  pressão  crítica, para  determinar  as 

diferenças existentes entre uma e outra condição. 

Por  fim,  será  efectuado um  ensaio de precipitação de um  extracto de  β‐caroteno produzido por  via 

biológica. A pureza do produto final será analisada e a micronização “SAS” como processo de separação 

e purificação será avaliada. 

31 

 

2. PARTE EXPERIMENTAL: MATERIAIS, APARELHOS E TÉCNICAS 

2.1. Materiais 

Todos  estudos  de micronização  foram  realizados  com  β‐caroteno  sintético  (isómero  trans)  Tipo  I  da 

Sigma (grau de pureza ≈95% UV), à excepção de um ensaio, em que se utilizou um extracto natural β‐

caroteno produzido e fornecido pela BioTrend. 

O solvente utilizado nestes estudos, bem como em todas as análises necessárias, foi o tetrahidrofurano 

(THF)  pró‐análise  da  Merck,  com  grau  de  pureza  ≥99,8%  e  estabilizado  com  BHT  (hidroxitolueno 

butilado). 

O dióxido de carbono (pureza de 99,998%) foi fornecido pela Air Liquide. 

 

2.2. Micronização supercrítica 

2.2.1. Descrição geral do aparelho 

Os ensaios de micronização  supercrítica  foram  realizados num aparelho  construído para esse  fim, no 

âmbito do trabalho de doutoramento do Eng. Miguel Cardoso, sob a orientação do Professor António 

Palavra, no  Instituto Superior Técnico. O aparelho, representado na Figura 2.1, está esquematizado na 

Figura 2.2  e  está descrito na  literatura  [69]. Mostra‐se  também  em maior pormenor  algumas partes 

deste aparelho (Figura 2.3, Figura 2.4 e Figura 2.5). 

 

 

Figura 2.1 – Aparelho de micronização supercrítica: aspecto geral.  

32 

 

 

Figura 2.2 – Diagrama esquemático do aparelho de micronização supercrítica. B1 e B2, bombas de recirculação; BP1 e BP2, “backpressure” ou regulador de pressão; BT, banho termostático; C, condensador; CG, contador de gás; DR, disco de ruptura; G, garrafa de CO2 com tubo prolongador; P, indicador de pressão; Q, medidor de caudal; S, bureta de solução; T, indicador de temperatura; V, válvula; VM, válvula micrométrica; VP, vaso de 

precipitação; VS, vaso de recolha de solvente.  

O  aparelho  é  constituído  por  uma  célula  (vaso  de  precipitação)  de  alta  pressão  de  aço  inoxidável  e 

volume  igual a 300 mL  (VP),  imersa num banho  termostático de água  (BT), à qual é alimentada uma 

corrente de gás (CO2) e outra de solução líquida com a substância a micronizar. O fundo da célula está 

equipado com um filtro de aço inoxidável, que permite a recolha do pó micronizado, enquanto a mistura 

orgânica passa  através daquele. Ambas  as  correntes  são  também mantidas  à  temperatura da  célula, 

através da passagem pelo banho. A temperatura deste é mantida usando um termóstato (Tectron Bio, 

modelo  Selecta)  e  verificada  por  um  termómetro.  A  pressão  e  temperatura  na  célula  são medidas, 

respectivamente, por um manómetro e por um termopar, ambos digitais (Omega Engineering, Inc.). 

 

   

(a)  (b)Figura 2.3 – Aparelho de micronização supercrítica: banho termostático de água (a); célula de alta pressão (b). 

 

33 

 

A corrente de gás provém de uma garrafa de dióxido de carbono (G) e é refrigerada num banho de gelo 

(C), para que a alimentação à respectiva bomba (Gilson) (B1) se mantenha no estado líquido. A pressão 

a  jusante desta bomba, medida por um manómetro analógico  (Omega Engineering,  Inc.) é controlada 

por  um  sistema  de  regulação  de  pressão  (Tescom)  (BP1),  que  permite manter  a  pressão  constante, 

através da “recirculação” do fluido para a bomba, caso a pressão na célula seja superior à pretendida. 

A corrente de  líquido, por sua vez, provém de uma bureta  (S), onde é  injectada a solução. À saída da 

bureta, a bomba de líquido (Gilson) (B2) pressuriza a solução para a célula, sendo a pressão à saída da 

bomba medida por um manómetro analógico (Omega Engineering, Inc.). A solução é injectada também 

no topo da célula, mas num local distinto do CO2, através de um restritor de aço inoxidável (125 µm de 

diâmetro e 1 cm de comprimento). 

 

 

(a)  (b) (c)Figura 2.4 – Aparelho de micronização supercrítica (secção de bombagem): CO2 (a); solução (b); aspecto geral (c).  

A corrente de saída da célula passa por uma válvula micrométrica (Hoke) (VM) aquecida através de uma 

fita de aquecimento. Esta válvula permite controlar o caudal de saída da célula. A expansão da mistura 

supercrítica e separação do solvente e do CO2 dá‐se no vaso de recolha do solvente (VS), cuja pressão, 

medida por um manómetro analógico (Omega Engineering, Inc.), é regulada por um segundo sistema de 

controlo de pressão (Tescom) (BP2). 

 

   

(a)  (b)Figura 2.5 – Aparelho de micronização supercrítica: recolha de solvente (a); aspecto geral (b). 

 

34 

 

A  corrente  gasosa  que  abandona  o  vaso  de  recolha  de  solvente  passa  por  um medidor  de  caudal 

(Omega Engineering, Inc.) (Q) e por um contador de gás (AMC) (CG). No final de cada ensaio, o solvente 

é recolhido através da abertura da válvula do vaso (V1). 

 

2.2.2. Técnica experimental 

Todos os ensaios foram conduzidos obedecendo a um procedimento semelhante. 

O primeiro passo consiste no bombeamento de CO2  (caudal na bomba de 25 mL/min) até se atingir a 

pressão desejada, para a qual é regulada a válvula BP1. Simultaneamente, é estabelecida a pressão (30 

bar) no vaso de expansão da mistura solvente/CO2, por regulação da válvula BP2. 

A  injecção de uma quantidade previamente calculada de solvente orgânico  (exemplo deste cálculo no 

Apêndice  A)  é  efectuada  após  se  estabilizar  a  pressão,  de  forma  a  garantir  o  estado  estacionário. 

Quando o solvente orgânico dentro da célula atinge a concentração pretendida, estabelece‐se o caudal 

de saída (leitura no medidor de caudal igual a 354), por regulação da válvula micrométrica (VM). 

Após a  injecção da solução e do solvente, a passagem de CO2 pela célula durante cerca de 75 minutos 

(cálculo  no  Apêndice  B)  permite  que  praticamente  todo  o  solvente  abandone  a  célula,  por 

arrastamento, restando apenas o pó seco. 

No final da secagem, o sistema é despressurizado, a célula aberta para recolha do pó micronizado e o 

solvente obtido é retirado do vaso de expansão. 

 

2.3. Análise dos produtos 

2.3.1. Espectrofotometria 

Os espectros de varrimento e a medição da absorvância do solvente recolhido no final de cada ensaio 

foram realizados com recurso a um espectrofotómetro da marca Shimadzu, modelo UV PharmaSpec – 

1700, utilizando o programa UV Probe Versão 2.10, da Shimadzu. 

Foi previamente realizado um espectro de varrimento, para o qual foi seleccionado o comprimento de 

onda de máxima absorção, sendo feita de seguida uma recta de calibração (lei de Lambert‐Beer) a esse 

mesmo comprimento de onda (458 nm), de forma a relacionar a absorvância com a concentração das 

soluções medidas (espectro de varrimento e recta de calibração nos Apêndices C e D, respectivamente). 

 

2.3.2. Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) 

A pureza dos produtos obtidos  foi analisada com recurso a um cromatógrafo de  líquido da Shimadzu, 

modelo LC.2010CHT, com detector UV/visível e uma coluna de fase reversa Chromolith Performance RP‐

                                                                 4 correspondente a cerca de 11,704 g/min de CO2. 

35 

 

18  encapped  (diâmetro  3 mm  e  comprimento  100 mm).  Os  cromatogramas  foram  obtidos  com  o 

programa LC Real Time Analysis (Shimadzu). 

 

2.3.3. “Dynamic light scattering” 

O  tamanho de partícula  e distribuição de  tamanho de partícula  foram  analisados por  “dynamic  light 

scattering”  (“DLS”)  usando  um  equipamento  da  Brookhaven  Instruments  (goniómetro  BI‐200SM  e 

correlacionador BI‐9000AT), com  laser de He‐Ne  (632,8 nm, 35 mW) da Spectra Physics  (modelo 127) 

como fonte de luz. Os resultados foram analisados usando o software BI‐ZP da Brookhaven. 

 

2.3.4. Microscopia electrónica de varrimento 

As  amostras  de  pó  analisadas  foram  observadas  por  um microscópio  electrónico  de  varrimento  da 

Philips  (XL  30  FEG).  As  amostras  foram  cobertas  com  250  Å  de  ouro,  usando  um  equipamento  de 

revestimento por pulverização da Jeol (modelo JFC‐1100). 

36 

 

3. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO 

3.1. Estudo de solubilidades 

A  determinação  da massa  de  β‐caroteno  recolhida  no  solvente  em  cada  um  dos  ensaios  permite  o 

cálculo da solubilidade deste soluto na mistura supercrítica utilizada neste trabalho, em cada conjunto 

de condições de pressão, temperatura e caudal de solvente. 

O caudal de  β‐caroteno considerado consiste na massa de  β‐caroteno  recolhida no solvente, dividida 

pelo  tempo  de  adição  de  solução  e  de  solvente.  Sabendo  o  caudal mássico  do  solvente  e  do  anti‐

solvente, é possível determinar as fracções mássicas e molares (dados de pesos moleculares na Tabela 

3.1) do sistema ternário. 

 

Tabela 3.1 – Dados de pesos moleculares dos compostos envolvidos no trabalho. 

Composto Peso molecular

CO2  44,01

THF 72,11

β‐caroteno 536,87

 

A Tabela 3.2 resume as condições praticadas em cada ensaio de medida de solubilidades, bem como os 

resultados de cada um.  

 

Tabela 3.2 – Condições de ensaios, resultados experimentais e fracções molares calculadas. 

Ensaio  0  P1 P2 T1 T2 Q1 Q2  Q3

P (bar)  130  100 75 130 130 130  130  130

T (°C)  40  40 40 35 50 40 40  40

QL (mL/min)  1  1 1 1 1 0,3 2  3 

Qm,THF (g/min)  0,88  0,88 0,88 0,88 0,88 0,264  1,76  2,64

Qm,CO2 (g/min)  11,7  11,7 11,7 11,7 11,7 11,7  11,7  11,7

Vsolução (mL)  10  10 10 10 10 10 10  10

Vsolvente, fim (mL)  20  20 30 30 25 20 30  30

tadição (min)  30  30 40 40 35 100  20  13,3

Cefluente (mg/mL)  0,336  0,316 0,364 0,441 0,270 0,242  0,369  0,454

Vefluente (mL)  30,5  47,5 32 44 34 24 62  79

mβ‐caroteno, efluente (mg) 10,3  15,0 11,7 19,4 9,2 5,8 22,9  35,9

Qm, β‐caroteno (×104 g/min)  3,4  5,0 2,9 4,9 2,6 0,58  11  27

xCO2  0,956  0,956 0,956 0,956 0,956 0,986  0,916  0,879

xTHF  0,044  0,044 0,044 0,044 0,044 0,014  0,084  0,121

xβ‐caroteno ×106  2,29  3,35 1,95 3,25 1,76 0,40  7,34  16,57

 

A  variação  da  solubilidade  do  β‐caroteno  na mistura  supercrítica  com  as  variáveis  do  processo  está 

representada na Figura 3.1 (temperatura), Figura 3.2 (caudal) e Figura 3.3 (pressão). 

37 

 

 

 

Figura 3.1 – Representação gráfica da variação da solubilidade do β‐caroteno em CO2/THF com a temperatura.  

 

Figura 3.2 – Representação gráfica da variação da solubilidade do β‐caroteno em CO2/THF com a fracção de THF (caudal de líquido). 

 

A solubilidade do β‐caroteno como função da temperatura e da fracção de THF é dada pelas equações 

(3.1) e (3.2), respectivamente. 

 

)03,0(exp488,0 xy −=   (3.1) 

 

)6,33exp(104 7 xy −×=   (3.2) 

 

38 

 

 

Figura 3.3 – Representação gráfica da variação da solubilidade do β‐caroteno em CO2/THF com a pressão.  

Na variação da solubilidade com a pressão não foi estabelecida qualquer relação matemática, devido à 

alteração da composição da mistura que resulta da variação da pressão, facto que será discutido mais à 

frente no texto (secção 3.1.2). 

 

3.1.1. Estimativa de densidades da mistura binária 

De  forma  a  estabelecer uma  relação  da  densidade da mistura  supercrítica  com  a  solubilidade  do  β‐

caroteno,  foi estimada a densidade da mistura binária CO2  (1)/THF  (2). Na ausência de parâmetros de 

interacção ternária do β‐caroteno com o solvente e o anti‐solvente que permitissem uma determinação 

da  densidade  do  sistema  completo,  assume‐se  que  a  influência  do  soluto  na mistura  é  nula,  dada 

também  a  sua  baixa  fracção molar  (desprezável,  face  aos  outros  dois  componentes)  nos  sistemas 

estudados. 

A densidade da mistura foi determinada com base na equação de estado de Peng—Robinson (equação 

(3.3)) [33], sendo os parâmetros a e b da mesma dados pelas equações (3.4) e (3.5) e κi pela equação 

(3.6).  

 

( )22 2 bbvv

Tabv

RTP

−+−

−=   (3.3) 

 

( ) ( )[ ]25,0

,

2,

2

1145724,0

Ri

ic

ici T

P

TRTa −+⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛= κ   (3.4) 

 

ic

ic

i P

RTb

,

,07780,0=   (3.5) 

 

39 

 

226992,054226,137464,0 iii ωωκ −+=   (3.6) 

 

Para a mistura binária, foram adoptadas as regras de mistura clássicas de van der Waals (equações (3.7) 

e (3.8)). 

 

( ) ( )iji j

jiji kaaxxa −= ∑∑ 121

 (3.7) 

 

( )iji j

ji

ji lbb

xxb −⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ += ∑∑ 1

2  (3.8) 

 

Os  parâmetros  dos  compostos  puros  são  dados  pela  Tabela  3.3  e  os  parâmetros  de  interacção, 

provenientes da literatura [33], tomam o valor de k12 = 0,01678 e l12 = ‐0,02395. 

 

Tabela 3.3 – Parâmetros dos compostos puros [33]. 

Composto  Tc (K)  Pc (bar)  ω 

CO2 (1)  304,21  73,8  0,225 

THF (2)  540,1  51,9  0,226  

A  composição  da  mistura  binária  foi  determinada  com  base  na  pressão  e  na  quantidade  de  THF 

adicionada à célula antes da micronização, tendo em conta a densidade do dióxido de carbono em cada 

conjunto de condições de trabalho, o volume da célula (300 mL) e a densidade do THF (0,88 g/mL). 

Nos ensaios em que QL = 1 mL/min,  tomou‐se um volume médio  (20 mL) de THF a adicionar à célula 

para se atingir o estado estacionário antes de se dar início à injecção da solução. Nos ensaios em que se 

variou o caudal, o volume de THF adicionado foi recalculado. 

 

Tabela 3.4 – Composições da mistura binária nas diferentes condições de trabalho. 

T (K)  P (bar)  ρCO2 (g/mL) QL (mL/min) xTHF xCO2 

308  130  0,78570 1 0,044 0,956 

313  75  0,23153 1 0,134 0,866 

313  100  0,62861 1 0,054 0,946 

313  130  0,74304 0,3 0,014 0,986 

313  130  0,74304 1 0,044 0,956 

313  130  0,74304 2 0,084 0,916 

313  130  0,74304 3 0,121 0,879 

323  130  0,63612 1 0,053 0,947 

 

Com  os  valores  da  composição  da mistura  binária  registados  na  Tabela  3.4,  é  possível  calcular  os 

parâmetros  da  equação  de  Peng—Robinson,  cuja  única  incógnita  passa  a  ser  o  volume  molar,  v. 

Determinado este valor, e  tomando um peso molecular médio da mistura  (ponderado pelas  fracções 

molares dos seus dois constituintes), calcula‐se a respectiva densidade (Tabela 3.5). 

40 

 

 

Tabela 3.5 – Densidades calculadas pela equação de Peng—Robinson para as várias condições de trabalho. 

T (K)  P (bar) QL (mL/min) ρmistura (g/mL) 

308  130 1 0,8131 

313  75 1 0,7929 

313  100 1 0,7280 

313  130 0,3 0,7274 

313  130 1 0,7750 

313  130 2 0,8193 

313  130 3 0,8476 

323  130 1 0,7064 

 

3.1.2. Relação entre solubilidade, densidade e variáveis do processo 

Após determinadas as densidades da mistura CO2/THF para as várias  condições de  trabalho, pode‐se 

representar a variação da solubilidade e da densidade com cada uma das variáveis em estudo, de forma 

a inferir possíveis relações entre elas. 

No  estudo  da  temperatura  (Figura  3.4),  a  pressão  é mantida  constante  e  a  composição,  apesar  de 

ligeiramente  variada,  devido  ao  efeito  da  densidade  e  do  volume  adicionado  para  atingir  o  estado 

estacionário, pode ser também considerada constante. 

No estudo da pressão (Figura 3.5), devido às diferentes pressões estudadas, bastante afastadas entre si, 

a  densidade  do  CO2  variou  significativamente  e,  portanto,  também  a  composição  da mistura. Desta 

forma, o único parâmetro que foi mantido constante neste estudo foi a temperatura. 

No  estudo  do  caudal  de  THF  (Figura  3.6),  tanto  a  pressão  como  a  temperatura  foram  mantidas 

constantes de ensaio para ensaio, pelo que a única variável em  jogo  foi apenas a  fracção de THF na 

mistura. 

 

 

Figura 3.4 – Variação da densidade da mistura binária e da solubilidade do β‐caroteno com a temperatura.  

41 

 

 

Figura 3.5 – Variação da densidade da mistura binária e da solubilidade do β‐caroteno com a pressão.  

 

Figura 3.6 – Variação da densidade da mistura binária e da solubilidade do β‐caroteno com a fracção de THF.  

Das análises anteriores, pode‐se tentar estabelecer uma relação entre a solubilidade do β‐caroteno e a 

densidade  da  mistura  binária  de  CO2/THF.  Para  isso,  representa‐se  a  solubilidade  em  função  da 

densidade, quando esta varia por alteração da temperatura (Figura 3.7), da pressão (Figura 3.8) ou do 

caudal (Figura 3.9). 

 

42 

 

 

Figura 3.7 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia a temperatura. 

 

 

Figura 3.8 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia o caudal (fracção) de THF. 

 

À variação da solubilidade com a densidade por variação da temperatura, é possível ajustar uma função 

exponencial com um coeficiente de correlação razoável (R2 = 0,942), dentro do erro experimental. Esta 

curva é dada pela equação (3.9). 

 

( )xy 53,5exp1043,3 8−×=   (3.9) 

 

Do ajuste de uma função exponencial aos pontos da Figura 3.8, obtém‐se uma curva com coeficiente de 

correlação R2 = 0,994 e expressão dada pela equação (3.10). 

 

( )xy 6,30exp1035,9 17−×=   (3.10) 

 

43 

 

 

Figura 3.9 – Solubilidade do β‐caroteno em função da densidade da mistura CO2/THF, quando se varia a pressão.  

Na variação da densidade por variação da pressão, a solubilidade como  função da densidade tem um 

comportamento linear, do qual resulta o ajuste a uma recta (dada pela equação (3.11)) com coeficiente 

de correlação R2 = 0,999. 

 

55 1092,11017,2 −− ×+×−= xy   (3.11) 

 

Nos  estudos  da  temperatura  e  do  caudal,  verifica‐se  que  os  resultados  experimentais  seguem  a 

tendência  já  observada  noutros  trabalhos  [41][7]  –  o  aumento  exponencial  da  solubilidade  com  a 

densidade da mistura  supercrítica. Este  facto prende‐se  com a maior proximidade das moléculas em 

estados mais densos, o que força as interacções entre soluto e solvente. 

A fracção crescente de THF na mistura, avaliada no estudo do caudal, tem dois efeitos que actuam em 

conjunto para a  relação exponencial que se verificou. Por um  lado, a presença de THF  faz com que a 

densidade da mistura aumente, o que provoca, pela razão  já descrita, um  incremento na solubilidade. 

Por outro  lado, o  facto de  se estar a aumentar a  fracção de  solvente na mistura aumenta  também a 

afinidade  do  soluto  para  essa mistura.  Ambos  os  efeitos  promovem  as  interacções  entre  soluto  e 

solvente, o que se reflecte na solubilidade do β‐caroteno na mistura supercrítica. 

No estudo da pressão, verifica‐se que a tendência discutida para os efeitos anteriores não é respeitada. 

Uma eventual explicação para este  facto consiste em dois pontos distintos. O primeiro é que um dos 

ensaios (P = 75 bar) terá sido realizado abaixo do ponto crítico (o que foi constatado pela precipitação 

do soluto no fundo da célula) e, como tal, a precipitação deu‐se na fase líquida, existindo duas fases em 

equilíbrio dentro  célula, donde não  faz  sentido  analisar e  comparar  com  rigor  a  solubilidade medida 

nestas  condições  com  as  solubilidades  em  fase  supercrítica.  O  segundo  facto  foi  já  referenciado  e 

prende‐se com a variação da composição da mistura binária com a pressão. De 100 para 130 bar, apesar 

do aumento da densidade, verifica‐se que a fracção de THF na mistura supercrítica diminui ligeiramente 

(de 0,054 para 0,044), o que pode evidenciar a prevalência do efeito da composição da mistura (efeito 

44 

 

do co‐solvente) sobre o da pressão (densidade). Atentando na novamente na Figura 3.2 da secção 3.1, 

pode‐se verificar, através da tendência da curva, que uma variação da composição de THF de 0,044 para 

0,054 provoca, efectivamente, um aumento da solubilidade de cerca de 1×10‐6, à pressão de 130 bar. 

Desta  forma, pode‐se  concluir que  é o  efeito do  solvente,  e não  a pressão, que  está  em  jogo nesta 

análise. Senão, note‐se como o ponto destacado na Figura 3.10, apesar da diferente pressão de trabalho 

(100  bar),  assenta  no  gráfico  sem  prejuízo  maior  para  a  relação  exponencial  anteriormente 

determinada. Conclui‐se, assim, que a pressão não tem influência maior sobre a solubilidade, mas esta é 

bastante alterada pela composição da mistura, a temperatura constante. 

 

 

Figura 3.10 – Representação gráfica da variação da solubilidade do β‐caroteno em CO2/THF com a fracção de THF (a 100 e a 130 bar). 

 

Como conclusão do estudo de solubilidades, pode‐se afirmar que a presença do co‐solvente  (THF) na 

mistura supercrítica, numa composição de cerca de 5% de THF, provoca um aumento da solubilidade de 

cerca de duas ordens de grandeza, relativamente ao CO2 supercrítico puro, em condições semelhantes 

de pressão e temperatura [41]. No caso específico da micronização, este facto é uma desvantagem, pois 

implica o aumento das perdas do soluto durante o processo e, portanto, a diminuição do rendimento. 

No entanto, o uso do solvente é indispensável, dado que é este o veículo transportador do produto de 

interesse,  e  a única  forma de ultrapassar  esta  limitação  será  aumentar  a  razão CO2/THF na mistura, 

aumentando o caudal de CO2 (que  implica maiores gastos), diminuindo o caudal de  líquido, ou, ainda, 

aumentando a concentração da solução. 

Kopcak et al. [27] verificou que o efeito da presença de um co‐solvente na solubilidade da cafeína numa 

mistura supercrítica diminui com o aumento da pressão e, portanto, pode‐se assumir que existe de facto 

um efeito deste tipo em jogo. 

No entanto, seriam necessários mais pontos experimentais para se poder discutir, com alguma certeza, 

o efeito da pressão neste sistema. Desta forma, não se consideram os resultados obtidos significativos 

para discussões posteriores acerca da variação da pressão. 

 

45 

 

3.2. Estudo da precipitação do β‐caroteno sintético 

Os ensaios realizados para o estudo da micronização do β‐caroteno sintético foram conduzidos de forma 

a avaliar o tipo de precipitação obtida acima e abaixo do ponto crítico, bem como analisar o tamanho de 

partícula obtido quando se varia a pressão de trabalho. O comprimento do restritor através do qual é 

injectada  a  solução  também  foi  variado,  com  o  objectivo  de  averiguar  a  sua  influência  no  local  de 

precipitação do produto dentro da célula. 

As condições dos ensaios são as descritas na Tabela 3.2 da secção 3.1. Foi ainda realizado um ensaio a 

65 bar (P3) e um outro com as condições do ensaio 0 e com o restritor de 10 cm (N1). 

 

3.2.1. Análise macroscópica dos cristais 

Aquando  da  recolha  do  pó micronizado  da  célula  de  alta  pressão,  verificou‐se  que,  à  excepção  dos 

ensaios P2 e N1, o produto se encontrava espalhado por toda a célula. Nestes ensaios acima do ponto 

crítico da mistura, como sugere o diagrama de fases da mistura binária (Apêndice E), existe dentro da 

célula  uma  única  fase  (supercrítica),  em  que  a  sobressaturação  da  solução  ocorre  em  todos  os 

elementos de volume da célula, dado que a adição da solução e do CO2 se dão no topo da mesma. A 

cristalização deu‐se a partir das paredes da célula, que devem  ter  servido como centro de nucleação 

e/ou de crescimento dos cristais (Figura 3.11). 

No  ensaio N1,  a precipitação ocorreu  a meio da  célula,  formando um  anel  à  volta do  local onde  se 

situava a extremidade do restritor. 

 

  

(a)  (b)Figura 3.11 – Recolha do β‐caroteno micronizado acima do ponto crítico: copo da célula de alta pressão (a); 

tampa da célula de alta pressão (b).  

Segundo o diagrama de  fase da mistura binária CO2/THF, os ensaios P2  (75 bar) e P3  (65 bar)  foram 

realizados abaixo do ponto crítico da mistura. Este  facto pôde ainda ser constatado através da  forma 

como ocorreu a micronização do β‐caroteno no ensaio P2. Evidenciando a existência de duas fases em 

equilíbrio, e a sua afinidade para a mais densa das duas, o produto surge acumulado no fundo da célula 

(Figura  3.12).  A  sua  precipitação  ocorre  na  fase  líquida,  segundo  um  mecanismo  de  expansão 

46 

 

volumétrica  do  solvente  e  subsequente  sobressaturação  da  solução,  por  dissolução  de  uma  grande 

quantidade de CO2. 

No ensaio P3 não ocorreu a precipitação do β‐caroteno dentro da célula, mas foi observada uma massa 

muito reduzida de cristais no lado exterior do filtro, os quais deverão ter sido formados por flutuações 

de concentração  locais. Assume‐se, portanto, que a 65 bar não ocorreu a precipitação do β‐caroteno, 

sendo o limite mínimo de pressão para que se dê a micronização a praticada no ensaio P2 (75 bar). 

 

  

(a)  (b)Figura 3.12 – Recolha do β‐caroteno micronizado abaixo do ponto crítico (75 bar): copo da célula de alta pressão 

(a); pormenor do fundo da célula (filtro) (b).  

Macroscopicamente, o β‐caroteno processado apresenta‐se sob a forma de cristais planos de dimensão 

considerável, de cor vermelha escura e com reflexos prateados, ao contrário do produto original, que 

apresenta uma coloração completamente uniforme. O β‐caroteno original tem também uma tendência 

para aderir mais às superfícies do que o processado. A Figura 3.13 mostra o aspecto dos cristais após o 

processamento e a recolha. 

 

   

Figura 3.13 – Recolha do β‐caroteno micronizado: aspecto dos cristais.  

O  rendimento  de  β‐caroteno micronizado  em  cada  um  dos  ensaios  está  registado  na  Tabela  3.6.  É 

também mostrado o volume de solvente que foi adicionado no final de cada ensaio, de forma a arrastar 

o  β‐caroteno  acumulado  no  volume morto  do  aparelho,  dado  que  este  influencia  a  quantidade  de 

produto  obtido  no  final.  Em  média,  a  quantidade  de  β‐caroteno  perdido  em  cada  ensaio,  que 

47 

 

corresponde à massa que é retida nas tubagens e às perdas que ocorrem na recolha do pó, é de cerca 

de 20% da massa inicial. 

 

Tabela 3.6 – Registo de rendimento dos ensaios realizados. 

Ensaio  0  P1*  P2 P3** T1 T2 Q1 Q2  Q3  N1 

Solvente (mL)  20  20  30 30 30 25 20 30  30  30 

Rendimento  41%  ‐  79% ‐ 62% 61% 37% 48%  51%  57%

*, massa não contabilizada; **, micronização não teve lugar. 

 

O rendimento médio, que depende tanto das perdas no aparelho, como da solubilidade nas condições 

dos ensaios, é de aproximadamente 60%. A título ilustrativo, mostra‐se na Figura 3.14 a relação entre o 

rendimento e a solubilidade, para condições semelhantes de volume de solvente adicionado e perdas no 

sistema  (ensaios  T1,  P2, Q2  e Q3).  Esta  figura  prova  que  se  tem  todo  o  interesse  em  trabalhar  em 

condições de baixa solubilidade do β‐caroteno, de forma a maximizar o rendimento. 

 

 

Figura 3.14 – Representação gráfica do rendimento da micronização em função da solubilidade (ensaios T1, P2, Q2 e Q3). 

 

3.2.2. Análise da pureza do produto 

3.2.2.1. HPLC 

A pureza do β‐caroteno micronizado e da solução recolhida no efluente de um dos ensaios (Q2) foram 

analisadas e comparadas com o β‐caroteno de partida por HPLC. 

A análise do trans‐β‐caroteno e do cis‐β‐caroteno foi realizada com detecção a 454 nm. A presença do 

isómero cis em qualquer das soluções analisadas  implica o aparecimento de dois picos, em tempos de 

retenção  ligeiramente diferentes, no cromatograma. A presença de eventuais produtos de degradação 

(óxidos)  foi avaliada com detecção a 260 nm,  tal como sugere Randolph et al.  [8]. Os cromatogramas 

detectados a 454 e a 260 nm estão patentes na Figura 3.15 e na Figura 3.16, respectivamente. 

48 

 

 

 

Figura 3.15 – Cromatograma do β‐caroteno original, micronizado e recolhido no efluente (líquido), em THF, com detecção a 454 nm. 

 

 

Figura 3.16 – Cromatograma do β‐caroteno original, micronizado e recolhido no efluente (líquido), em THF, com detecção a 260 nm. 

 

Da análise da Figura 3.15 e da Figura 3.16, verifica‐se que o factor comum a ambas é a presença de dois 

picos de absorção, com tempo de retenção de 0,4 e 3,1 minutos, respectivamente. 

Sabe‐se que o  segundo pico  (tR  =  3,1 min)  corresponde  ao  β‐caroteno. Observando  a  Figura  3.15  e, 

sendo este pico único, pode afirmar‐se com alguma certeza que não ocorreu  isomerização durante o 

processo,  visto  que  o  pico  é  único  e  idêntico  nas  três  amostras  analisadas  (das  quais  a  original, 

correspondente ao β‐caroteno sintético, contém apenas o isómero trans). 

O pico existente em todas as amostras a cerca de 0,4 minutos corresponde ao solvente (THF), como foi 

verificado no cromatograma do solvente puro (Apêndice F). 

As observações  anteriores permitem  reforçar  a  tese de que  a degradação dos  β‐caroteno durante o 

processo de micronização “SAS” tem tendência a ser desprezável [42]. Por um lado, devido ao facto de 

49 

 

se trabalhar com o inerte CO2. Por outro, o oxigénio (presente em muito baixa concentração no CO2) e 

os  carotenóides  estão  em  contacto  por  um  curto  período  de  tempo,  apenas  antes  de  ter  lugar  a 

micronização. A partir do momento em que a micronização tem lugar, a oxidação teria de prosseguir em 

ambiente heterogéneo, o que torna a reacção bastante mais lenta. 

 

3.2.2.2. Espectrofotometria 

A  isomerização do  β‐caroteno  foi  também  avaliada  através do  espectro de  varrimento dos produtos 

(líquido e precipitado) de um dos ensaios (T1) e da comparação com o β‐caroteno de partida. 

Num  trabalho  desenvolvido  por  Schierle  et  al.  [63]  sobre  um  método  espectrofotométrico  para  a 

determinação do β‐caroteno, é apresentada também uma comparação dos espectros de várias misturas 

de isómeros cis e trans deste carotenóide (Figura 3.17). 

 

 

Figura 3.17 – Espectros de várias misturas de isómeros do β‐caroteno em ciclohexano [63].  

Como  se pode observar na  Figura 3.17, o  espectro  a  vermelho  corresponde  ao de uma mistura que 

contém praticamente  só  trans‐β‐caroteno. Prestando atenção na  zona do espectro entre os 470 e os 

500 nm, verificam‐se variações a ter em conta entre as várias misturas, sendo o pico que se situa nesta 

gama  bastante mais  acentuado  para  o  trans‐β‐caroteno.  Por  outro  lado,  à medida  que  aumenta  a 

fracção do isómero cis, surge um pico a cerca de 350 nm. Tendo em conta estas considerações, avaliar‐

se‐ão os espectros resultantes do ensaio T1. 

 

50 

 

 

Figura 3.18 – Espectros de absorção do β‐caroteno não processado (original), precipitado e solúvel do ensaio T1.  

Por  observação  da  Figura  3.18,  verifica‐se  que  o  pico  entre  os  470  e  os  500  nm  do  espectro  do  β‐

caroteno é  idêntico para todas as amostras e que não existe, em nenhuma das amostras processadas, 

um  pico  a  350  nm.  Desta  forma,  reforça‐se  a  conclusão  obtida  por  HPLC  de  que  não  ocorreu 

isomerização ao longo do processo. 

 

3.2.3. Influência da pressão de trabalho no produto obtido 

A determinação do tamanho de partícula e da correspondente distribuição foi realizada, primeiramente, 

por “DLS”. Contudo, a suspensão parcial das partículas foi apenas possível numa solução aquosa ácida 

(pH ≈ 1), verificando‐se que as partículas mais pequenas ficavam em suspensão, enquanto as maiores se 

acumulavam  à  superfície. Ao  colocar  as  amostras  na  célula  de  difracção  de  luz,  as  únicas  partículas 

medidas eram as mais pequenas e, ocasionalmente, algumas das maiores  interferiam  com a medida, 

originando  resultados  inconsistentes  entre  si  e  que  não  corroboravam  as  imagens  de  microscopia 

electrónica.  Sabe‐se,  ainda,  que  o  limite  de  dimensão  das  partículas  para  que  o  aparelho  de  “DLS” 

apresente  resultados  reprodutíveis  é  de  apenas  alguns micrómetros,  tendo  as  amostras  a  analisar 

tamanhos de partícula bastante  superiores, pelo que  foi possível apurar das  imagens de microscopia 

electrónica. Posto  isto, e para evitar conclusões erráticas, a análise das amostras de pó por “DLS”  foi 

colocada de parte e, como tal, sem efeito. 

Assim, a determinação da dimensão dos cristais de β‐caroteno obtidos por micronização  foi  realizada 

com  base  em  imagens  de microscopia  electrónica.  Efectuou‐se  então  a  contagem  e  a medição  das 

partículas e  realizaram‐se os  cálculos da média e do desvio padrão para as partículas  contabilizadas, 

assumindo  que  estas  constituem  uma  amostra  representativa  do  produto  final.  A  distribuição  de 

tamanhos  de  partícula  foi  então  estimada,  através  de  um  tratamento  estatístico,  assumindo  que  o 

processo de precipitação obedece a uma distribuição lognormal, de média e desvio padrão calculados. 

51 

 

A influência da pressão sobre o tamanho das partículas formadas foi estudada com base em dois ensaios 

acima do ponto crítico da mistura (100 e 130 bar) e um abaixo deste ponto (75 bar). Nestes ensaios, a 

temperatura foi de 40°C, o caudal de 1 mL/min e a concentração inicial de β‐caroteno em THF igual a 6 

mg/mL. 

 

3.2.3.1. Análise do produto não processado 

De  forma  a  possibilitar  a  comparação  do  produto  processado  com  o  produto  inicial,  foi  realizada  a 

análise  deste.  A  Figura  3.19  e  a  Figura  3.20  representam  duas  imagens  do  β‐caroteno  antes  do 

processamento  e  a  Figura  3.21  a  distribuição  de  tamanhos  de  partícula  obtida  na  contagem  e  a 

distribuição estimada pelo tratamento estatístico. 

 

 

Figura 3.19 – Aspecto do β‐caroteno antes do processamento (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 1000 vezes). 

 

 

Figura 3.20 – Aspecto do β‐caroteno antes do processamento (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 3000 vezes). 

 

52 

 

Observando a Figura 3.19 e a Figura 3.20, pode verificar‐se que a  forma das partículas de β‐caroteno 

antes  do  processamento  é  tridimensional,  arredondada  ou,  em  alguns  casos,  pontiaguda,  sendo  a 

distribuição  de  tamanhos  relativamente  uniforme.  Dada  a  ordem  de  grandeza  observada  para  o 

tamanho das partículas, pode considerar‐se que o produto de partida já se encontra micronizado. 

A  contagem  e medição  de  uma  quantidade  representativa  de  partículas  (448)  e  o  seu  tratamento 

estatístico  estimam  que  o  tamanho médio  é  de  1,9  µm  e  o  desvio  padrão  2,0  µm.  A  Figura  3.21 

representa graficamente a contagem efectuada e a função distribuição calculada para se ajustar a esses 

dados, existindo uma boa concordância entre os dois gráficos. Note‐se ainda que a diferença entre a 

dimensão das partículas maiores e mais pequenas não excede, em geral, uma ordem de grandeza, o que 

vem  reforçar, mais  uma  vez,  o  que  foi  observado  nas  imagens,  que  é  a  relativa  uniformidade  de 

tamanhos de partícula (entre 0,5 µm e 5 µm).  

 

 

Figura 3.21 – Representação gráfica da distribuição de tamanhos de partícula contabilizada por contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno não processado). 

 

3.2.3.2. Análise do β‐caroteno processado a 75 bar 

O primeiro ensaio de estudo do efeito da pressão no processamento do β‐caroteno foi realizado a 75 

bar  (P2).  Segundo  o  diagrama  de  fase  para  o  sistema  CO2/THF  (Apêndice  E),  para  a  composição  de 

entrada de yCO2 = 0,956 e pressão de trabalho de 75 bar, o sistema encontra‐se abaixo do ponto crítico, 

existindo  dentro  da  célula  duas  fases  em  equilíbrio.  Apesar  de  não  ser  rigorosa  a  aproximação  do 

sistema  real a um  sistema binário, pôde constatar‐se que, de  facto, a micronização  se deu abaixo do 

ponto crítico, tal como se evidencia na secção 3.2.1 (Figura 3.12). 

O aspecto microscópico das partículas processadas nestas condições é apresentado na Figura 3.22 e na 

Figura 3.23. As partículas tomam a forma de lâminas compridas (estrutura praticamente bidimensional), 

mas  de  tamanho  variável  e  em  geral  bastante  superior  às  partículas  de  β‐caroteno não  processado. 

Verifica‐se, pois, que a morfologia das partículas é alterada no decorrer do processo. Quanto à redução 

53 

 

do  tamanho  das  partículas,  esta  não  acontece,  quando  comparada  com  o  produto  de  partida  (já 

micronizado), mas pode considerar‐se que o objectivo da formação de micropartículas foi atingido. 

 

 

Figura 3.22 – Aspecto do β‐caroteno processado a 75 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 50 vezes). 

 

 

Figura 3.23 – Aspecto do β‐caroteno processado a 75 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 100 vezes). 

 

Na Figura 3.24 (a) mostra‐se em maior detalhe a forma dos cristais de β‐caroteno processados a 75 bar. 

Nesta  figura,  é  particularmente  evidente  a  sua  estrutura  praticamente  bidimensional,  bem  como  a 

forma irregular das arestas dos cristais, que podem evidenciar que as partículas maiores são produto da 

agregação de partículas mais pequenas em fases mais adiantadas do crescimento dos cristais, tal como 

foi proposto por Bristow et al. [4]. Segundo este autor, as partículas formadas abaixo da pressão crítica 

da mistura estão muito mais  agregadas do que  as que  são  formadas  a pressões mais elevadas. Este 

mecanismo de aglomeração pode ser explicado pela precipitação que ocorre dentro das gotas ricas em 

THF, onde as partículas submicrométricas começam a nuclear, coalescem e fundem durante a fase de 

crescimento que prossegue a nucleação. 

54 

 

Paralelamente  à  alteração  da morfologia  das  partículas,  verificou‐se  ainda,  numa  imagem  de maior 

ampliação, que os cristais procedentes deste ensaio apresentam uma superfície porosa, característica 

que  é  realçada  na  Figura  3.24  (b).  Este  facto  demonstra  que,  apesar  do  aumento  do  tamanho  das 

partículas resultante do processamento a 75 bar, é possível alterar completamente a sua morfologia, o 

que  pode  potenciar  igualmente  interessantes  aplicações,  dado  o  aumento  da  área  superficial  que  é 

possível obter. 

 

 

 

(a)  (b)Figura 3.24 – Aspecto do β‐caroteno processado a 75 bar (imagens de microscopia electrónica de varrimento com 

ampliação de: 500 vezes (a); 3000 vezes (b)).  

A distribuição de tamanhos de partícula obtida no processamento do β‐caroteno a 75 bar foi também 

estimada com base na contagem e medição das partículas, através de imagens obtidas por microscopia 

electrónica.  

A  medição  de  uma  quantidade  considerada  representativa  da  amostra  (290  partículas)  permitiu  o 

cálculo do  tamanho médio de partícula e do desvio padrão,  respectivamente 100,7 µm e 1,9 µm. As 

representações  gráficas  das  partículas  contadas  e  da  função  distribuição  (lognormal)  estimada 

encontram‐se na Figura 3.25, revelando uma razoável concordância entre as duas. 

Para  uma  análise  acerca  do  efeito  da  pressão  sobre  o  tipo  de  partículas  obtidas  em  condições  de 

pressão abaixo do ponto crítico, foi realizado um ensaio à pressão de 65 bar. Contudo, o que se verificou 

foi que a precipitação não ocorreu, o que  levou a concluir que o  limite mínimo de pressão (mantendo 

constantes as restantes condições) para que se dê a micronização do β‐caroteno é 75 bar. A realização 

de um ensaio  intermédio (70 bar, por exemplo) foi descartada, dado que a diferença de pressão seria 

provavelmente demasiado pequena para que se observassem diferenças significativas no produto,  tal 

como foi constatado por Cocero & Ferrero [10]. 

 

55 

 

 

Figura 3.25 – Representação gráfica da distribuição de tamanhos de partícula contabilizada por contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 75 bar). 

 

3.2.3.3. Análise do β‐caroteno processado a 100 bar 

As  restantes condições do ensaio para o estudo da micronização do  β‐caroteno a 100 bar  (P1)  foram 

semelhantes às praticadas no ensaio anterior (secção 3.2.3.2). 

Analisando o diagrama de  fases  (Apêndice E), pode verificar‐se que, nas  condições de  temperatura e 

pressão de  trabalho deste ensaio, a mistura binária se encontra acima do ponto crítico, qualquer que 

seja a sua composição. A forma como a precipitação ocorreu dentro da célula (ver secção 3.2.1) prova 

que o mesmo é verdade para o sistema  ternário  (CO2 + THF + β‐caroteno). Acima do ponto crítico, o 

mecanismo de precipitação deixa de ser a expansão volumétrica do solvente (já não existem duas fases), 

para ocorrer a chamada nucleação em fase gasosa. 

A distribuição de tamanhos das partículas obtidas a 100 bar é relativamente uniforme, tal como se pode 

constatar  pela  Figura  3.26  e  pela  Figura  3.27.  Estas  partículas  apresentam  uma morfologia  bastante 

diferente daquelas que foram obtidas a 75 bar, bem como dimensões mais reduzidas. A sua forma é em 

geral rectangular ou triangular, de arestas rectas e superfície  lisa, e a sua espessura é muito fina, mas 

verifica‐se facilmente que se trata de partículas tridimensionais (Figura 3.28).  

Cocero  &  Ferrero  [10],  no  seu  estudo  da  cristalização  do  β‐caroteno,  obtiveram  partículas  com 

morfologia semelhante à resultante deste ensaio. 

 

56 

 

 

Figura 3.26 – Aspecto do β‐caroteno processado a 100 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 100 vezes). 

 

 

Figura 3.27 – Aspecto do β‐caroteno processado a 100 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 500 vezes). 

 

  

(a)  (b)Figura 3.28 – Aspecto do β‐caroteno processado a 100 bar (imagens de microscopia electrónica de varrimento 

com ampliação de: 3000 vezes (a); 5000 vezes (b)).  

57 

 

A medição de uma quantidade de partículas  (283), que se admite ser uma amostra representativa do 

produto, com base em imagens de microscopia electrónica, permitiu uma estimativa do tamanho médio 

de partícula  (13,9 µm) e  respectivo desvio padrão  (2,4 µm). Estes dados permitiram ainda  calcular  a 

função distribuição que modela a distribuição real de tamanhos de partícula obtida. Ambos os gráficos 

se encontram representados na Figura 3.29. 

 

 

Figura 3.29 – Representação gráfica da distribuição de tamanhos de partícula contabilizada por contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 100 bar). 

 

3.2.3.4. Análise do β‐caroteno processado a 130 bar 

Para  concluir  sobre o  estudo da  influência da pressão na micronização do  β‐caroteno  em  condições 

supercríticas,  foi  realizado  um  outro  ensaio  (0),  cujas  condições  se mantiveram  semelhantes  às  dos 

ensaios anteriores (ver secção 3.2.3.2), com excepção da pressão, que se aumentou para 130 bar. 

De acordo com o  já exposto para a pressão de 100 bar (secção 3.2.3.3), o ensaio a 130 bar é também 

realizado acima do ponto crítico da mistura ternária. 

As partículas obtidas nestas condições mostraram ter uma morfologia semelhante às obtidas no ensaio 

a 75 bar: são lâminas longas, praticamente sem espessura e de extremidades recortadas, existindo uma 

gama relativamente larga de tamanhos de partícula observados (Figura 3.30 e Figura 3.31). Contudo, a 

superfície destas partículas é lisa, tal como foi verificado para as partículas oriundas do processamento a 

100 bar (Figura 3.32 (b)). Algumas das partículas revelam, ainda, indícios de agregação (Figura 3.32 (a)), 

mas muito menos pronunciados do que as processadas a 75 bar. 

 

58 

 

 

Figura 3.30 – Aspecto do β‐caroteno processado a 130 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 100 vezes). 

 

 

 

Figura 3.31 – Aspecto do β‐caroteno processado a 130 bar (imagem de microscopia electrónica de varrimento com ampliação de 200 vezes). 

 

 

 

(a)  (b)Figura 3.32 – Aspecto do β‐caroteno processado a 130 bar (imagens de microscopia electrónica de varrimento 

com ampliação de: 200 vezes (a); 500 vezes (b)).  

59 

 

A medição das partículas obtidas neste ensaio permitiu estimar a sua distribuição  real. No entanto, a 

análise destas partículas  foi  substancialmente mais difícil do que nos casos anteriores, dada a menor 

qualidade das imagens e a dificuldade na medição das partículas. Desta forma, o número de partículas 

contabilizadas  para  a  estatística  foi muito menor  (67),  podendo  estas  não  constituir  uma  amostra 

significativa. Ainda assim, obteve‐se um tamanho médio de partícula de 77,8 µm, com um desvio padrão 

de 1,9 µm. Os resultados obtidos estão representados na Figura 3.33. 

 

 

Figura 3.33 – Representação gráfica da distribuição de tamanhos de partícula contabilizada por contagem e por tratamento estatístico (β‐caroteno processado a 130 bar). 

 

3.2.3.5. Discussão do efeito da pressão 

O  estudo  do  efeito  da  pressão  de  trabalho  sobre  as  partículas  de  β‐caroteno  obtidas  no  processo 

permitiu  delinear  duas  conclusões  preliminares.  Por  um  lado,  esta  variável  tem  uma  importância 

considerável na dimensão das partículas obtidas. Por outro, ou talvez consequentemente, a morfologia 

das  partículas  é  também  alterada  no  decorrer  do  processamento,  verificando‐se  ainda  que  se  torna 

completamente diferente do produto de partida. Kikic et al. [1] verificaram  igualmente a alteração de 

morfologia das partículas de β‐caroteno quando processadas a 100 bar (semelhantes a agulhas) e a 120 

bar (surgiam como aglomerados sob a forma de folhas). 

A micronização abaixo da pressão crítica da mistura produz partículas de superfície porosa e dimensão 

considerável, a qual se suspeita ser resultado da agregação que é permitida ocorrer na fase líquida em 

que  se  dá  a  precipitação. Acima  da  pressão  crítica,  verifica‐se  que  as  partículas  têm  uma  superfície 

essencialmente  lisa e conseguem‐se dimensões consideravelmente mais reduzidas do que no primeiro 

caso.  Contudo,  para  o  ensaio  de  pressão  mais  elevada  e  para  o  ensaio  abaixo  do  ponto  crítico, 

identificam‐se algumas semelhanças na morfologia dos respectivos produtos. 

A Tabela 3.7 resume os resultados obtidos para o tamanho médio de partícula em função da pressão e a 

Figura 3.34 as respectivas distribuições de tamanho. 

 

60 

 

Tabela 3.7 – Resumo dos resultados obtidos para o tamanho de partícula em função da pressão de processamento. 

Pressão (bar) 

Dimensão média(µm) 

Desvio padrão(µm) 

75  100,7 1,9

100  13,9 2,4

130  77,8 1,9

 

 

Figura 3.34 – Distribuição de tamanhos de partícula obtida para cada um dos ensaios do estudo do efeito da pressão. 

 

Apesar de representar a pressão à qual  foi possível obter os  tamanhos de partícula mais reduzidos, o 

ensaio realizado a 100 bar apresenta uma menor uniformidade na respectiva distribuição de tamanhos 

(a dimensão das partículas varia de cerca de uma ordem de grandeza). Mais uma vez, os ensaios a 75 e 

130  bar  surgem  com uma  função  distribuição muito  semelhante,  relativamente  uniforme,  e diferem 

apenas na média, em cerca de 20 µm. 

 

Para  os  ensaios  acima  do  ponto  crítico,  verifica‐se  que  há  uma  clara  tendência  para  o  aumento  do 

tamanho de partícula com o aumento da pressão (de cerca 14 para 78 µm quando a pressão varia de 

100  para  130  bar,  respectivamente).  Martín  &  Cocero  [36]  verificaram  tendência  semelhante  no 

processamento de  β‐caroteno,  tendo como solvente o diclorometano, até pressões da ordem de 150 

bar. 

Outros  autores  observaram  já  tendências  semelhantes  com  outras  substâncias.  Miguel  et  al.  [42] 

verificaram que o tamanho das partículas do licopeno quando processado por “SAS” aumenta quando a 

pressão aumenta de 90 para 150 bar. Bristow et al. [4] constataram igualmente o aumento do tamanho 

das  partículas  de  paracetamol  de  3  para  20  µm,  quando  a  pressão  de  trabalho  é  de  80  e  300  bar, 

respectivamente.  Subra  et  al.  [68],  no  seu  estudo  de micronização  da  teofilina  a  várias  pressões  e 

temperaturas, verificaram também esta tendência. Panayiotou et al. [26] estabeleceram que o mesmo 

61 

 

acontece  no  processamento  da  amoxicilina  a  pressões  entre  130  e  250  bar.  Rehman  et  al.  [50] 

verificaram também esta tendência para o ácido nicotínico a várias temperaturas. 

A  razão  pela  qual  se  verifica  o  facto  apresentado  reside  no  aumento  da  densidade  associado  ao 

aumento  da  pressão.  Com  o  aumento  da  densidade,  a  solubilidade  do  β‐caroteno  na  mistura 

supercrítica  deverá  aumentar,  pelo  que  o  grau  de  sobressaturação  diminui.  Como  o  tamanho  de 

partícula é inversamente proporcional ao grau de sobressaturação, pode‐se concluir que a dimensão de 

partícula aumenta com o aumento da densidade e, portanto, da pressão, a temperatura constante. 

De forma a avaliar a validade desta conclusão, tome‐se em consideração a secção 3.1.1 (Tabela 3.5) e 

retenha‐se os valores da densidade para cada uma das condições de pressão (acima e abaixo do ponto 

crítico). Tome‐se, ainda, os valores dos tamanhos de partícula para esses mesmos ensaios (Tabela 3.7). A 

Figura 3.35 mostra o gráfico resultante, que relaciona estes dois parâmetros. 

 

 

Figura 3.35 – Relação entre o tamanho de partícula obtido e a densidade estimada para a mistura CO2/THF em cada uma das condições de pressão. 

 

Da análise da Figura 3.35, verifica‐se que existe uma relação bastante forte entre o tamanho médio das 

partículas obtidas e a densidade da mistura onde a precipitação ocorre. Adicionalmente, esta relação é 

estabelecida para todos os pontos experimentais, estejam estes acima ou abaixo do ponto crítico. 

As afirmações anteriores acerca da semelhança entre as partículas produzidas a 75 e a 130 bar, bem 

como  as  respectivas distribuições de  tamanho, podem  agora  ser  corroboradas pela proximidade dos 

respectivos  valores  de  densidade  da mistura,  independentemente  da  posição  do  ponto  operatório 

relativamente  ao  ponto  crítico  e,  portanto,  da  miscibilidade  e  do  mecanismo  de  precipitação.  A 

densidade mais  elevada nestes dois  ensaios provocou não  só um menor  grau de  sobressaturação,  e 

consequente  maior  dimensão  dos  cristais,  como  também  permitiu  a  aglomeração  dos  mesmos, 

igualmente verificada nas imagens de microscopia electrónica. 

 

Como  foi  já  referido  (secção 3.2.3.2),  a  influência da  variação da pressão na micronização  abaixo do 

ponto crítico não foi estudada neste trabalho. No entanto, pode afirmar‐se com alguma consistência, de 

62 

 

acordo com o que foi colocado até aqui, que o aumento da pressão até ao ponto crítico provoca uma 

diminuição  do  tamanho de partícula  obtido.  Senão,  note‐se  que, havendo duas  fases  e  ocorrendo  a 

precipitação na  fase  líquida  (mais densa e rica em solvente orgânico), o aumento da pressão provoca 

uma  maior  expansão  volumétrica  no  solvente  e,  portanto,  a  diminuição  mais  acentuada  da  sua 

densidade. Por sua vez, a solubilidade diminui, o que  torna a solução mais sobressaturada, reduzindo 

assim  o  tamanho  das  partículas  obtidas.  Trabalhos  como  o  de  Reverchon  &  Della  Porta  [55],  o  de 

Tenorio et al. [70], ou o de Costa et al. [11], obtiveram este resultado. 

 

3.3. Estudo da precipitação de um extracto natural de β‐caroteno 

Com o objectivo de avaliar a micronização com anti‐solvente supercrítico como processo de purificação, 

foi realizado um ensaio em que se utilizou como produto de partida um extracto produzido a partir de 

microrganismos. Este extracto foi totalmente dissolvido em THF e processado nas condições de pressão 

de 130 bar,  temperatura de 40°C e caudal de solução de 1 mL/min. O produto  final  foi analisado por 

HPLC e espectrofotometria. 

 

3.3.1. Análise macroscópica 

Após processamento, o produto apresenta uma morfologia macroscópica em tudo semelhante à do β‐

caroteno sintético processado nas mesmas condições. Contudo, a coloração dos cristais obtidos é mais 

clara, tendo passado do vermelho forte dos cristais sintéticos para o cor‐de‐laranja do produto natural 

(Figura 3.36). Este facto demonstra que os cristais contêm, para além do β‐caroteno, outras substâncias 

não coradas, tal como seria de prever, visto que o produto de partida não é β‐caroteno puro. 

 

   

Figura 3.36 – Aspecto do β‐caroteno natural processado.  

3.3.2. Análise da pureza do produto 

O  extracto  de  β‐caroteno  micronizado  obtido  foi  analisado  por  espectrofotometria  e  por  HPLC  e 

comparado  com  o  β‐caroteno  obtido  no  efluente  líquido,  de  forma  a  concluir  acerca  da  purificação 

63 

 

obtida. Como não se está a trabalhar com β‐caroteno puro, a recta de calibração para a determinação 

do β‐caroteno sintético não é aqui aplicável, dado que podem existir no extracto outros compostos que 

absorvam  ao mesmo  comprimento  de  onda  do  β‐caroteno,  não  sendo  possível  a  sua  quantificação. 

Devido  à natureza do  extracto  avaliado, produzido  a partir de microrganismos, pode‐se  afirmar  com 

alguma certeza que as impurezas presentes no produto inicial eram sobretudo compostos de baixo peso 

molecular,  tipicamente  produtos  do  metabolismo  microbiano,  ou  mesmo  outros  carotenóides  de 

estrutura semelhante à do β‐caroteno. 

 

3.3.2.1. HPLC 

A análise dos produtos foi realizada por HPLC, a dois comprimentos de onda diferentes (260 e 454 nm), 

tal como foi exposto na secção 3.2.2.1. 

O  objectivo  da  análise  a  454  nm  é  a  detecção  de  isómeros  cis  e  trans  do  β‐caroteno  e  de, 

eventualmente, outras contaminações que absorvam nesta gama do espectro. A Figura 3.37 mostra este 

cromatograma para o pó micronizado e para o efluente líquido recolhido. Novamente, o pico presente a 

0,4 min corresponde ao THF (vide Apêndice F) e o pico a 3,1 min ao β‐caroteno, sendo este idêntico para 

ambas  as  amostras.  Devido  à  sua  forma,  este  pico  parece  ser  a  fusão  de  dois  picos  distintos, 

eventualmente  dos  dois  isómeros,  que  surgem  aqui  juntos,  devido  à  sua  semelhança molecular  e  à 

incapacidade  da  coluna  cromatográfica  para  os  resolver.  Com  respeito  ao  restante  cromatograma, 

verifica‐se  a presença de  impurezas,  as quais  foram mais  acumuladas no efluente  líquido. Não é, no 

entanto, possível afirmar que ocorreu purificação, pois tanto o líquido como o pó continham impurezas. 

A análise a 260 nm tem por objectivo a detecção de óxidos de degradação do β‐caroteno. Não tendo 

sido detectado nenhum pico adicional, assume‐se que não houve qualquer degradação do produto no 

decorrer do processo. 

 

 

Figura 3.37 – Cromatograma do β‐caroteno natural micronizado e recolhido no efluente (líquido), em THF, com detecção a 454 nm. 

 

64 

 

 

Figura 3.38 – Cromatograma do β‐caroteno natural micronizado e recolhido no efluente (líquido), em THF, com detecção a 260 nm. 

 

De forma a avaliar a pureza isomérica do produto obtido, o seu cromatograma foi comparado ao do β‐

caroteno sintético que, como se sabe, contém 95% de trans‐β‐caroteno. Observando a Figura 3.39, pode 

confirmar‐se  a  presença  de  dois  picos  fundidos  no  cromatograma  do  β‐caroteno  natural,  em  que  o 

primeiro  (em  forma  de  “ombro”)  coincide  com  o  pico  do  isómero  trans,  presente  no  β‐caroteno 

sintético. Assim, conclui‐se que o extracto de β‐caroteno contém uma mistura dos isómeros cis e trans e 

o  segundo  pico  corresponde  ao  cis‐β‐caroteno,  ou mesmo  a  outros  carotenóides  ou  impurezas  de 

estrutura semelhante à do β‐caroteno. Sendo o pó e o efluente líquido idênticos no seu cromatograma, 

e  tendo‐se  verificado  no  estudo  da micronização  do  β‐caroteno  sintético  que  não  há  isomerização 

durante o processo  (secção 3.2.2.1), pode‐se  concluir que os dois  isómeros  já estavam presentes no 

produto de partida, não tendo sido convertidos entre si durante o processo. A resolução da coluna não 

permite, contudo, a quantificação dos dois isómeros. 

 

 

Figura 3.39 – Cromatograma do β‐caroteno natural micronizado e sintético, em THF, com detecção a 454 nm.  

65 

 

3.3.2.2. Espectrofotometria 

Os  espectros  de  varrimento  do  β‐caroteno micronizado  e  recolhido  no  líquido  foram  realizados,  de 

forma a serem comparados, e estão representados na Figura 3.40, onde se pode verificar que o espectro 

do  β‐caroteno precipitado é  semelhante ao que  foi  recolhido no efluente  líquido. No entanto, não é 

possível, através desta análise, verificar a existência de  impurezas, como  foi  feito por HPLC na secção 

anterior. 

 

 

Figura 3.40 – Espectros de absorção do β‐caroteno natural micronizado e recolhido no efluente líquido, após o processamento. 

 

Comparando ainda o espectro do β‐caroteno sintético não processado com o do extracto micronizado 

(Figura 3.41), verifica‐se que as diferenças entre os dois não são significativas, o que leva a crer que não 

é possível a distinção entre os isómeros cis e trans do β‐caroteno através da análise dos espectros. 

 

 

Figura 3.41 – Espectros de absorção do β‐caroteno sintético (não processado) e no extracto natural (após o processamento). 

 

66 

 

3.3.3. Conclusão acerca da precipitação do β‐caroteno natural 

Este estudo permitiu verificar que é possível a micronização de um extracto de β‐caroteno produzido 

biologicamente e contendo impurezas. O aspecto macroscópico destes cristais é em tudo semelhante ao 

obtido com o β‐caroteno puro, à excepção da cor que, devido à presença de outros compostos que não 

absorvem na mesma gama do espectro, se apresenta mais clara. 

A avaliação do grau de pureza do produto de partida e do produto final não foi possível, devido à falta 

de informação acerca da verdadeira composição deste extracto. A recta de calibração determinada para 

o  β‐caroteno puro não pode  ser aqui aplicada, dado que não  se pode quantificar as  substâncias que 

absorvem  na  mesma  gama  do  espectro  que  o  β‐caroteno.  A  análise  dos  cromatogramas  permite 

verificar que existem de facto substâncias no extracto que absorvem a cerca de 450 nm. Algumas destas 

surgem acumuladas no líquido recolhido, embora este facto não seja suficientemente evidente para se 

poder concluir que existiu purificação. 

 

3.4. Conclusões e perspectivas futuras 

Após  a  realização  deste  trabalho,  é  possível  tecer  algumas  conclusões  acerca  do  processo  de 

micronização utilizado e da sua aplicação ao composto estudado. 

A micronização com anti‐solvente supercrítico foi aplicada com sucesso na formação de micropartículas 

de β‐caroteno, utilizando como solvente o tetrahidrofurano e como anti‐solvente o dióxido de carbono 

supercrítico. Mostrou‐se que é possível micronizar este carotenóide em condições experimentais abaixo 

ou acima do ponto crítico, sendo a pressão mínima para que a precipitação ocorra, a 40°C,  igual a 75 

bar. 

Dependendo da pressão imposta no sistema, foram conseguidas micropartículas com dimensões médias 

entre  14  e  100  μm.  A morfologia  dos  cristais  obtidos  e  a  sua  agregação  é  também  dependente  da 

pressão  de  trabalho.  Estabeleceu‐se,  ainda,  uma  relação  linear  entre  a  densidade  da mistura  onde 

ocorre a precipitação e o tamanho médio das partículas obtidas. O controlo do tamanho das partículas 

é, portanto, possível, através da manipulação das condições experimentais. 

O estudo de solubilidades realizado neste trabalho demonstrou  igualmente alguns pontos  importantes 

na  termodinâmica  do  sistema  estudado,  com  interesse  em  aplicações  futuras  deste  sistema  na 

micronização  ou  noutros  processos  envolvendo  fluidos  supercríticos.  Os  dois  resultados  de  maior 

relevância mostram  a  diminuição  exponencial  da  solubilidade  do  β‐caroteno  na mistura  supercrítica 

CO2/THF com o aumento da temperatura, como consequência da diminuição da densidade do sistema, e 

o aumento exponencial da solubilidade do mesmo composto com a fracção de THF na mistura, devido à 

afinidade do soluto para este solvente orgânico. Provou‐se, igualmente, que a presença do co‐solvente 

numa  composição de aproximadamente 5% aumenta a  solubilidade do  β‐caroteno em  cerca de duas 

ordens de grandeza, relativamente ao CO2 puro em condições semelhantes de pressão e temperatura. 

Verificou‐se,  ainda,  que  o  efeito  da  fracção  molar  de  THF  se  sobrepõe  ao  efeito  da  pressão:  ao 

67 

 

representar os resultados obtidos a 100 e a 130 bar, observou‐se que a solubilidade dependia apenas da 

composição da mistura. 

Um extracto de β‐caroteno produzido biologicamente foi também micronizado com sucesso. Este facto 

demonstra que o processo pode ser aplicado na precipitação de produtos biológicos com aplicações nas 

indústrias  alimentar  e  farmacêutica, dado que o processamento  é  realizado  com um  gás  inerte, não 

tóxico  e  de  baixo  custo,  e  o  produto  final  está  isento  de  solventes  orgânicos.  No  entanto,  não  se 

constatou que houvesse purificação, dado que os cromatogramas do produto precipitado e recolhido no 

líquido eram praticamente  idênticos. Por outro  lado, não existe  forma de determinar a concentração 

dos produtos inicial e final, de forma a compará‐los. 

 

As  perspectivas  futuras  da  micronização  com  anti‐solvente  supercrítico  são  várias,  embora  seja 

necessário conhecer melhor o processo. No processamento do β‐caroteno,  impõe‐se um estudo mais 

abrangente  da  influência  das  condições  experimentais  sobre  a  dimensão  das  partículas  obtidas.  A 

temperatura,  a  concentração  e o  caudal de  solução  e de CO2  são  variáveis que, noutros  estudos,  já 

provaram  poder  influenciar  fortemente  a  forma  e  a  dimensão  das  partículas  resultantes.  É 

particularmente interessante que encontrem as condições óptimas de processamento para obtenção de 

partículas  ainda mais  pequenas. Deve‐se  também  avaliar  o  desempenho  de  outros  solventes menos 

tóxicos e voláteis do que o  tetrahidrofurano, dado que a sua utilização a nível  industrial deverá estar 

comprometida devido às desvantagens apontadas, que limitam o seu manuseamento. 

Em termos de purificação de produtos biológicos, as condições de trabalho deverão igualmente ser alvo 

de estudo, para que seja optimizado também o grau de pureza obtido. Dependendo das aplicações do 

produto,  pode‐se  ainda  ponderar  as  condições  de  processamento  segundo  os  dois  objectivos  que  o 

processo pode ter: a purificação e a formação de micropartículas. 

Este  trabalho  foi  realizado  num  aparelho  de  micronização  à  escala  piloto.  Estudos  sobre  a 

hidrodinâmica, os fenómenos de transferência de calor e massa e a termodinâmica do sistema em causa 

deverão  ser  efectuados, para que  a modelação deste  tipo de  sistema  seja  realizada,  só  assim  sendo 

possível um aumento de escala eficaz. Ao nível industrial, seria indispensável a recirculação do dióxido 

de carbono, de  forma a aumentar o rendimento, rentabilizar economicamente o processo e reduzir a 

quantidade de efluente gasoso a  tratar, e ainda a automatização dos sistemas de recolha do produto 

precipitado e do solvente. 

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tomato by‐products. Journal of Supercritical Fluids, 40, 218‐226. 

 

APÊNDICE A 

Cálculo  da  quantidade  de  solvente  a  injectar  para  atingir  o  estado 

estacionário 

 

Exemplo de cálculo para o ensaio nas seguintes condições: P = 130 bar 

T = 40°C 

QL = 1 mL/min 

[β‐caroteno/THF] = 6 mg/mL 

Caudal de saída de CO2 = 6,56 L/min (PTN) 

 

Dados: 

ρCO2 (130 bar, 40°C) = 0,74304 g/mL 

ρCO2 (1 bar, 25°C) = 0,0017842 g/mL 

ρTHF = 0,88 g/mL 

Vcélula = 300 mL 

 

Base de cálculo = 1 min 

 

Balanço mássico ao CO2: 

(CO2)entra = (CO2)sai = 6,56 L/min × 1,7842 g/L = 11,704 g/min 

 

Cálculo da massa de CO2 na célula: 

(CO2)célula = 0,74304 g/mL × 300 mL = 222,912 g 

 

Balanço mássico ao THF: 

(THF)entra = (THF)sai = 1 mL/min × 0,88 g/mL = 0,88 g/min 

 

Cálculo da composição dentro da célula: 

[THF/CO2] = 0,88 g THF / 11,704 g CO2 = 0,075188 g THF/g CO2  

 

Cálculo da massa e do volume de THF na célula: 

(THF)célula = 0,75188 g THF/g CO2 × 222,912 g CO2 = 16,76 g THF 

VTHF = 16,76 g / 0,88 g/mL = 19 mL 

II 

 

APÊNDICE B 

Cálculo do tempo de secagem 

 

O  tempo de  lavagem do produto para  remoção do solvente da célula é calculado segundo o método 

proposto por Reverchon [58]. 

Este cálculo considera a célula como um tanque perfeitamente agitado (CSTR) com 300 mL de volume e 

caudal  de  CO2  de  6,56  L/min  PTN  (estabelecido  no  decorrer  do  ensaio)  e  cujo  balanço mássico  se 

representa na equação (A.1). 

 

dtdC

VCQCQ sssee +=   (A.1) 

 

Depois de parada a adição de solvente, a concentração de entrada, Ce, é nula. Resolvendo a equação 

(A.1), obtém‐se a equação (A.2). 

 

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

f

i

s CC

QV

t ln   (A.2) 

 

Para as condições de 100 bar e 40°C (ρCO2 = 0,62861 g/mL), Qs = 18,62 mL/min. 

O tempo necessário para que a concentração final de THF na célula passe para 1% do seu valor inicial é, 

então, cerca de 75 minutos. 

III 

 

APÊNDICE C 

Espectro de varrimento do β‐caroteno em THF 

 

De forma a determinar o comprimento de onda de absorção máxima do β‐caroteno no solvente THF, foi 

realizado um espectro de varrimento de absorção na gama visível do espectro electromagnético (400‐

700 nm). 

O espectro obtido está representado na Figura A. 1 e a máxima absorção foi registada ao comprimento 

de onda de 458 nm. 

 

 

Figura A. 1 – Espectro de absorção do β‐caroteno em THF. 

IV 

 

APÊNDICE D 

Recta de calibração do espectrofotómetro 

 

A  recta de  calibração do espectrofotómetro  foi efectuada a 458 nm, por medição da absorvância de 

soluções de concentração conhecida de β‐caroteno em THF. Os pontos utilizados para o cálculo da recta 

estão patentes na Tabela A. 1 e são representados graficamente na Figura A. 2. 

 

Tabela A. 1 – Pontos para o cálculo da recta de calibração do espectrofotómetro. 

Solução Concentração 

(µg/mL) Absorvância (458 nm) 

0  0 01  1,07 0,0532  1,98 0,1043  2,97 0,1564  3,86 0,2125  7,36 0,402

 

 Figura A. 2 – Representação gráfica da recta de calibração do espectrofotómetro. 

 

A recta de calibração obtida, de coeficiente de correlação R2 = 0,99, é caracterizada pela equação (A.3). 

 

003,0055,0 −= CAbs   (A.3)  

 

APÊNDICE E 

Diagrama de fases da mistura CO2/THF 

 

A partir dos dados de pontos de bolha e pontos de gota para a  temperatura de 40°C determinados e 

publicados  por  Li  et  al.  [33],  foi  possível  representar  o  diagrama  de  fases  da mistura  CO2/THF.  Este 

diagrama permite que se  tenha uma  ideia acerca do ponto crítico da mistura e está  representado na 

Figura A. 3. 

 

 

Figura A. 3 – Diagrama de fases da mistura CO2/THF à temperatura de 40°C, determinado por Li et al. [33]. 

VI 

 

APÊNDICE F 

Cromatogramas do tetrahidrofurano 

 

 

Figura A. 4 – Cromatograma do tetrahidrofurano com detecção a 260 nm.  

 

Figura A. 5 – Cromatograma do tetrahidrofurano com detecção a 454 nm5. 

                                                                 5  A  variação  de  intensidade  existente  a  cerca  de  3 min  deve‐se  ao  facto  de  o  eluente  ser  recirculado  e  estar contaminado com β‐caroteno.