Luz polarizada

Luz linear

polarizada

Luz circular

polarizada

φ λ= −180l n nL R( ) / graus

θ π= −2 303 180 4, ( ) /A AL R graus

Atividade óptica

• Mudança na velocidade de propagação das duas componentes: dispersãorotatória óptica (ORD) e birrefringência• Diferença na absorção das mesmas: dicroísmo circular e elipticidade.

A rotação óptica como função do comprimento de onda é chamada de dispersão rotatória óptica (ORD)

Dicroísmo circular e birrefringência

Interações: • pelas mudanças nas velocidades de propagação dos raios através da amostra que tem relação com o índice de refração do meio = Dispersão Óptica Rotatória (ORD);

•pela diferença da intensidade de absorção dos raios através da amostra = Dicroísmo Circular (CD).

Lembrando: A = ε C lCD seria ∆A = Al - Ar = εl C I - εr C I =∆ ε C I ⇒⇒⇒⇒ CD= ∆ε =εl - εr

clA ε=

( ) Acl ∆=∆ /1ε

Onde ∆ε é definido como εl - εr

( ) ( ) ( ) ( )rlrl EEEEtgrad +−=≈ θθ

−

+

−

−

−

−

= expexpexpexp // rr AAAA

Desta forma, temos:

−

+

−

−

−

−

= 2exp2exp2exp2exp // rr AAAA

Expandindo as exponenciais e convertendo em graus, temos:

( ) πθ 4.10ln.180 Agraus ∆=

A∆= 98,32θ

Esta elipticidade é proporcional ao CD de forma que :

Por razões históricas, a concentração era medida em g/100 cm3, a elipticidade molarera medida em grau.cm2.g-1.

Para corrigir estas unidades temos que multiplicar a equação anterior por 100.

e

[ ] clθθ .100=

[ ] ( )clA∆= .98,32.100θ

[ ] εθ ∆= .3298 units: deg cm2 dmole -1

Cristal pizoelétrico

Esquema básico de um espectropolarímetro

ASSIMETRIAS QUE PODEM LEVAR À ATIVIDADE ÓPTICANA ESTRUTURA DE PROTEÍNAS

•os aminoácidos (com exceção da Glicina) são compostos assimétricos

•estrutura primária é inerentemente assimétrica devido as ligações peptídicas que são opticamente ativas:

•transições eletrônicas no grupo amida:•transições eletrônicas no grupo amida:

•n-π* (210 - 230 nm)•π-π* (180 - 200 nm)

Secondary Structure & CDα-helix β-sheet turn

12

3 4

ββββ-sheet

αααα-helix

other/PII

turns

PolyProII (PII)

CD Spectrum →→→→ Structure Linear relation Cλ = Σ fk Bkλ

Cλ: protein CD spectrum; Bkλ: component secondary structure spectra; fk is the fraction of the secondary structure k.

Determination of Bkλ model polypeptides or set of proteins.

Curve Assumptions

1. CD contributions from individual secondary structures are additive

2. The ensemble-averaged solution structure and the time-averaged solid-state structure are equivalent

3. CD contributions from non-peptide chromophores do not influence the analysis

4. The effect of the tertiary structure on CD is negligible

5. Effects of the geometric variability of the secondary structures are not explicitly considered

Curve Fitting

Secondary Structure - Structural Decomposition

α-helixA

β-sheetB

TurnsT

C147

N1

X-ray Structure

fα 0.32

fβ 0.22

fT 0.26

Methods for Protein CD Analysis

AlgorithmsVariable Selection

Locally Linearized Model

Self-consistent Method

Minimal Basis

CDProSoftware Package

MethodsLeast Squares Minimization

Ridge Regression

Singular Value Decomposition

Principal Component/Factor Analysis

Neural Networks

Convex Constraint Analysis

ProgramsSelcon3 CDsstr Contin

varselc, CDNN, K2D, CCA

Protein Structure & CD Spectrum

αβαβαβαβ

αααααααα ββββββββα/βα/βα/βα/β α+βα+βα+βα+β

Summary

Characteristic CD Spectra of Protein Secondary Structures

Different spectral regions give different structural information

The information content depends on the chromophore

Structure ���� Spectrum Spectrum ���� Structure

Chromophores Database of Structure/Spectra

Theoretical Methods Mathematical AnalysisTheoretical Methods Mathematical Analysis

Protein CD analysis

Secondary Structure Fractions

Number of α and β segments

Tertiary Structure Class

APPLICATIONS OF CD TO PROTEINS

• Protein structure and function– Secondary structure analysis– Monitoring conformational change– Ligand binding

• Protein folding• Protein folding– Equilibrium intermediates– Kinetics– Stability of short helices, β-strands

• Comparison of mutant and wild-type– Secondary structure – Stability

Fluorescência

Tipicamente

Herschel (1792- 1871)

Tipicamente moléculas aromáticas

Fluorescência

Diagramas de Jablonski