La protéine S100B vaut-elle le "coup" ?
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Année académique 2014 – 2015 Site de Fleurus La protéine S100β vaut-elle le « coup » ? Comparaison de deux méthodes de dosages pour des patients atteints de traumatismes cérébraux Présenté par Masquillier Guillaume Sous la direction de Monsieur Q.Delefortire En vue de l’obtention du grade de Bachelier – Technologue de laboratoire médical Section Biologie Médicale Madame S.Moerman Monsieur P.vankerkhoven
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Année académique 2014 – 2015 Site de Fleurus
La protéine S100β vaut-elle le « coup » ?
Comparaison de deux méthodes de
dosages pour des patients atteints de
traumatismes cérébraux
Présenté par
Masquillier Guillaume
Sous la direction de
Monsieur Q.Delefortire En vue de l’obtention du grade de
Bachelier – Technologue de
laboratoire médical
Section Biologie Médicale
Madame S.Moerman
Monsieur P.vankerkhoven
Année académique 2014 – 2015 Site de Fleurus
Année académique 2014 – 2015 Site de Fleurus
La protéine S100β vaut-elle le « coup » ?
Comparaison de deux méthodes de
dosages pour des patients atteints de
traumatismes cérébraux
Présenté par
Masquillier Guillaume
Sous la direction de
Monsieur Q.Delefortire En vue de l’obtention du grade de
Bachelier – Technologue de
laboratoire médical
Section Biologie Médicale
Madame S.Moerman
Monsieur P.vankerkhoven
Je tiens à remercier toutes les personnes
ayant contribué à l’élaboration de ce travail
de fin d’études et en particulier :
Monsieur P.Vankerkhoven, Pharmacien
Biologiste, directeur du laboratoire de la
clinique Notre-Dame de Grâce à Gosselies
pour son accueil.
Mon maitre de stage Monsieur Quentin
Delefortrie, assistant-pharmacien biologiste,
ainsi que Madame Patricia Schatt et
Monsieur Alexandre Grimmelprez pour leur
aide, leurs conseils et leur suivit tout au long
de mon travail.
Je remercie également ma promotrice,
Mademoiselle Soizic Moerman, maitre de
formation pratique à la HELHa de Fleurus
pour tous ses précieux conseils et ses
corrections.
Je tiens à remercier tous les membres du
laboratoire,et en particulier le département
de chimie pour leur accueil, leur
enseignement et le temps qu’ils m’ont
consacré.
Je voudrais enfin remercier tous mes
proches, Véronique Decamp et Pascal
Decamp pour leur aide lors de la réaction de
ce travail, Cédric et Soline Demonte pour
leurs encouragements, sans oublier ma
marraine, mes parents et ma soeur qui ont
toujours cru en moi.
Table des matières
Partie théorique : .............................................................................................................................................. 7
1) Caractéristiques de la protéine S100β ................................................................................................. 7
1.1) Structure et rôle physiologique ; ........................................................................................................... 7
1.2) Synthèse ; .......................................................................................................................................... 10
1.3) Voie d’élimination ; ............................................................................................................................. 10
1.4) Variation de la concentration en S100β ; ............................................................................................ 10
2) Intérêt du dosage de la protéine S100β ............................................................................................. 12
2.1) Relation entre le scanner cérébrale et la concentration en S100β ; ................................................... 12
2.2) Progression de la protéine S100béta à partir des cellules gliales; .................................................... 12
2.3) Intérêt du dosage de la protéine ; ....................................................................................................... 13
2.4) Dosage de la protéine S100β ............................................................................................................. 17
2.4.1) Dosage de la S100β chez les enfants ; ................................................................................................ 17
2.4.2) Dosage de la S100β chez les adultes ; ................................................................................................ 18
3) Technique de dosage ; Roche – Diasorin .......................................................................................... 19
3.1) Réaction antigène-anticorps rappel ; ....................................................................................................... 20
3.1.1) Les anticorps polyclonaux ; ................................................................................................................. 20
3.1.2) Les anticorps monoclonaux ;............................................................................................................... 20
3.1.3) Cinétique ; ........................................................................................................................................... 21
3.2) Conditions pré-analytiques ; .................................................................................................................. 21
3.3) Principe du kit Roche S100 ®; ............................................................................................................... 22
3.3.1) l’électrochimie luminescence ;............................................................................................................. 22
3.3.2) principe du dosage utilisé par le kit ; .................................................................................................... 23
3.4) principe du kit Diasorin S100 ® ; ............................................................................................................ 25
3.4.1) chimiluminescence ; ............................................................................................................................. 25
3.4.2) Principe du dosage utilisé par le kit ; ................................................................................................... 25
3.5) différence entre Roche® et Diasorin ® ;................................................................................................ 27
3.6) Autres techniques de dosage ; ............................................................................................................... 28
4) Autres marqueurs influencés lors d’un traumatisme crânien .............................................................. 32
5) Matériels et méthode ......................................................................................................................... 33
5.1) Matériel : ............................................................................................................................................ 33
5.2) Réactifs : ............................................................................................................................................ 33
5.3) Composition des kits : ........................................................................................................................ 34
5.3.1) Liaison ® ............................................................................................................................................ 34
5.3.2) Roche ® ............................................................................................................................................. 35
5.4) Conservation : .................................................................................................................................... 35
5.4.1) Liaison ® ............................................................................................................................................ 35
5.4.2) Roche ® ............................................................................................................................................. 36
5.5) Méthode ............................................................................................................................................. 36
5.5.1) Liaison vert – Diasorin ® .................................................................................................................... 36
5.5.2) Cobas – Roche ® ............................................................................................................................... 38
5.6) Préparation des échantillons .............................................................................................................. 39
5.7) Choix des échantillons ; ..................................................................................................................... 39
5.8) But de cette étude : ............................................................................................................................ 40
5.9) Avant-propos : .................................................................................................................................... 40
6) Analyse statistique ............................................................................................................................. 41
6.1) Comparaison du dosage de la S100B avant et après la congélation avec le kit Roche®. ................. 41
6.1.1) Statistique descriptive : ...................................................................................................................... 41
6.1.2) Statistiques inférentielles .................................................................................................................... 44
6.1.3) En conclusion ..................................................................................................................................... 46
6.2) Comparaison entre le kit Roche ® et Diasorin ® après congélation des échantillons ........................ 47
6.2.1) Statistique descriptive : ...................................................................................................................... 47
6.2.2) Statistique iférentielle ; ....................................................................................................................... 50
6.2.3) Conclusion : ....................................................................................................................................... 51
6.3) Population étudiée :............................................................................................................................ 52
En conclusion les kits ont tout deux une VPN de 100% et une sensibilité de 100% ils détectent donc tous les
patients n’ayant aucun traumatisme crânien, ceux-ci évitent dès lors l’exposition aux radiations. ................. 53
7) Conclusion générale........................................................................................................................... 53
5
Présentation du lieu de stage
Mon stage s’est effectué au sein du laboratoire de la Clinique Notre-Dame de Grâce à Gosselies,
durant une période de 15 semaines. Durant mon stage, j’ai pu travailler dans différents services
parmi lesquels se trouvent :
Le service de chimie
Le service d'hématologie
Le service de bactériologie
Le dispatching
La sérologie manuelle
les prises de sang
À l’origine, en 1921, la clinique était un dispensaire appelé « La charité » fondé par des sœurs. En
1934, le dispensaire fut changé en clinique Notre Dame de Grâce qui par la suite, devint une ASBL
indépendante. C’est à partir de 2002 qu’une extension importante fut réalisée, engendrant la
création de salles d’opérations, et la reconstruction de salles de réanimation, de l’hôpital de jour,
du service d’urgence et du laboratoire de biologie clinique. Depuis ce jour, l’hôpital n’a cessé de se
développer pour aujourd’hui être en partenariat avec les cliniques universitaires Saint-Luc de
Bruxelles et continuer à progresser d’un point de vue technologique afin d’assurer les meilleures
soins aux patients pris en charge.
6
Introduction
À l’heure actuelle, la protéine S100B est utilisée comme marqueur de traumatisme crânien. En
effet, lors d‘un choc tel qu’un traumatisme cérébral, la concentration en cette protéine augmente
dans le sang des patients. La concentration en protéine S100B peut donc nous aider à déterminer
l’état clinique du patient et orienter notre démarche vers des tests plus approfondis. Le dosage de
la protéine S100B permet donc d’exclure des tests inutiles pour le patient.
Ce travail réalisé dans le cadre de mon stage de fin d’études portera sur le dosage de la protéine
S100β chez des patients admis aux urgences pour une suspicion de traumatisme crânien.
L’objectif de cette étude est de rechercher une influence de la congélation sur les échantillons de
patients, de comparer deux kits de dosage utilisant des techniques différentes et de réaliser une
comparaison entre les résultats obtenus et les états cliniques des patients.
Ce travail sera divisé en deux parties, une partie théorique et une partie pratique.
Dans la partie théorique, nous présenterons la protéine S100β, ses caractères physico-chimiques,
les méthodes de dosage fréquemment utilisées dans les laboratoires, les voies d’élimination de la
protéine ainsi que la structure et le mode d’interaction de la protéine.
Dans la partie pratique, nous détaillerons les techniques de dosage et les automates utilisés au
sein de la clinique Notre Dame de Grâce pour doser la protéine S100 dans les sérums des patients.
Nous réaliserons ensuite des tests statistiques pour déterminer l’influence de la congélation sur le
dosage de la protéine avant de réaliser une comparaison statistique des kits Roche® et Diasorin®.
7
Partie théorique :
1) Caractéristiques de la protéine S100β
1.1) Structure et rôle physiologique ;
La protéine S100béta est une holoprotéine de 186 acides aminés ayant une masse de 21 kDa.
Elle possède la caractéristique d’être uniquement présente chez les vertébrés. La protéine est
formée par l’assemblage de deux dimères, un dimère α-β composé d’une sous-unité α et β et d’un
dimère β-β composé de deux sous-unités β comme représentées sur le schéma ci-dessous.
[1][4]
Monomères α β
Protéine S-100a protéine S100b
Dimères α-β β-β
Protéine S-100ab Protéine S-100B
(92 acides aminés) (94 acides aminés)
PROTÉINE S-100Béta
(186 acides aminés)
Figure 1.1 ; schéma représentant la composition de la protéine S100Béta [1]
Cette calciprotéine est formée de quatre motifs « main EF », eux-mêmes composés de deux
hélices alpha séparées d’une boucle entourant un ion calcium. L’affinité pour cet ion est influencée
par la composition du milieu extracellulaire. Par exemple, en présence de zinc, la protéine a une
affinité accrue pour le calcium, à contrario en présence de magnésium l’affinité pour le calcium
diminue.
8
La structure tridimensionnelle de la protéine S100β est représentée sur la figure 1.2.
Calcium
Monomère
Dimère en
conformation
« main EF »
Protéine S100B
Figure 1.2 ; structure tridimensionnelle de la S100β [10]
Grâce à cette représentation, il est possible de montrer que la protéine d’intérêt est capable de
fixer quatre atomes de calcium au niveau des 4 boucles des motifs « main EF ». Sur la figure 1.3,
une autre représentation permet de mieux apprécier la localisation de l’interaction entre l’ion
calcium et la protéine S100β.
Hélice alpha site de liaison du Ca++
Motif EF Motif EF
Dimère
Figure 1.3 ; structure secondaire d’une portion de la protéine S100β [11]
9
La protéine S100β fait partie de la famille des protéines liant le calcium. La liaison de celui-ci induit
un changement de conformation de la protéine et l’exposition de résidus hydrophobes. Grâce à ce
changement, la S100B peut interagir avec d’autres protéines et les activer, c’est le cas notamment
de l’annexine A2 (qui lie les phospholipides membranaires au cytosquelette), de la protéine TAU
(qui intervient dans la formation des filaments hélicoïdaux du cytosquelette) … La S100B peut
également inhiber les protéines telles que la phospholipase C (diminuant dès lors la concentration
en inositol triphosphate dans le milieu extracellulaire), l’inositol triphosphate (qui intervient dans la
transduction de la signalisation lipidique au niveau cytoplasmique), la tubuline (inhibant
l’assemblage des microtubules) ou la P53 (qui est une protéine suppressive de tumeur)…. [16][4]
La figure1.4 montre l’action de la protéine S100β sur la P53.
Figure 1.4 : activation de la S100β et inhibition de la P53 [25]
Cette représentation permet de mettre en évidence le changement de conformation de la protéine
S100β lorsque celle-ci se lie au calcium. Suite à l’exposition de ses groupements hydrophobes, la
protéine se lie, et inhibe, la protéine P53. L’inhibition de la protéine P53 permet de réguler le
nombre de mitoses et la mort cellulaire. [16][4]
S100β lié
au calcium
S100β non lié
au calcium
Protéine p53
10
1.2) Synthèse ;
La protéine S100béta est codée au niveau du bras long du chromosome 21 sur le locus 22.3. Ce
gène est exprimé dans de nombreux tissus et cellules, tels que les cellules gliales, les testicules,
le tissu adipeux, la vessie, le côlon, les intestins, les mélanocytes…Parmi ces cellules et tissus, les
astrocytes expriment 30 fois plus la protéine que les autres cellules ou tissus. Malgré cette
surexpression, la S100β reste une protéine non spécifique du tissu cérébral [7][8]. Sa localisation
intracellulaire peut être diverse. En effet, il est possible de la retrouver en intranucléaire ou en intra
cytoplasmique, cette protéine remplit de nombreuses fonctions telles que précisées dans le point
précédent. [2][3]
1.3) Voie d’élimination ;
Quand la protéine S100β se retrouve dans le sang, elle est rapidement éliminée par voie rénale
(unique voie d’élimination de la protéine). En effet comme sa taille est de 21KDa, elle sait
facilement traverser la barrière de filtration glomérulaire, ce qui lui confère une demi-vie
relativement courte de 30 à 90 minutes. [11][7][9][12]
1.4) Variation de la concentration en S100β ;
Le tableau 1.1 reprend différents facteurs pour lesquels la concentration en protéine S100β peut
varier.
Tableau 1.1 ; paramètre influençant la concentration en S100β [7][26][10]
facteurs influençant la concentration en S100β
Influence sur la concentration en S100β
Explications
La trisomie 21 Augmentation
Le chromosome 21 code la protéine S100β une
augmentation du nombre de chromosomes 21 induit une
sur expression de la protéine. [59][60]
La maladie d’Alzheimer Augmentation
La formation de plaques amyloïdes induit une
surexpression de la S100β. [61][62]
Les mélanomes Augmentation La synthèse de la S100β est proportionnelle à l’activité des
mélanocytes. [63][64] La pigmentation de la peau
Augmente proportionnellement au teint
Le traumatisme cérébral Augmentation
Lors d’un tel traumatisme, les astrocytes sont lysés ce qui
induit la libération de la protéine S100β dans le LCR et ensuite la diffusion dans le
sang. [65]
11
Il est donc important de prendre ces différents paramètres en compte lors de l’interprétation des
résultats. Cependant, il a été démontré que la concentration plasmatique en protéine ne varie pas
après l’âge de 20 ans ni selon le sexe, l’hémolyse, le poids ou la consommation d’aliments,…
[7][26][10]
La consommation de certains médicaments peut influencer la concentration sanguine en S100β.
En effet, des médicaments administrés en vue de traiter des infections au VIH tels que l’Abacavir,
lamivudine, l’abatacept,… peuvent contenir la protéine S100β. Certains antidépresseurs et
antipsychotiques tels que le serlain, le sulpiride, le Seroquel,… augmentent également la
concentration en S100β suite à une stimulation de l’activité neuronale. [33]
L’alcool, quant à lui, n’influence pas le dosage de la S100β sauf s’il est consommé après la
libération de la protéine dans le sang. En effet, plusieurs études réalisées notamment par
Enochsson.L et al. et par Brin T et al. ont mis en évidence une influence de l’alcool sur le dosage
de la protéine S100β lorsque celui-ci est consommé après le traumatisme. Pour réaliser leurs
études, ils ont pris tous deux un groupe de patients témoins sobres atteints d’un traumatisme
cérébral léger et un groupe de patients atteints d’un traumatisme cérébral léger à qui ils ont fait
boire de l’alcool après le choc. Ils ont ensuite dosé la concentration en S100β à des intervalles
réguliers et ont observé les tendances suivantes.[66][67]
Consommation D’alcool
Nulle Modérée
(inférieur à 100mg/dl) Supérieure à
100mg/dl
Concentration en S100β
au temps 0 sans X X X
consommations d’alcool
(X en µg/L)
Concentration en S100β
quelques minutes après
la consommation d’alcool
Figure 1.5 ; schéma représentant l’évolution de la S100β après consommation d’alcool [66][67]
Ces études prouvent que la consommation d’alcool en forte concentration après un traumatisme
crânien engendre une augmentation de la concentration en S100β dans le sérum. Celle-ci est
due à une lyse excessive des cellules gliales par l’alcool. Il est donc important de bien faire
12
l’anamnèse du patient avant d’interpréter les résultats obtenus. En effet, un patient ayant
consommé de l’alcool après un traumatisme crânien léger pourrait avoir une concentration en
S100β anormalement élevée. [34]
2) Intérêt du dosage de la protéine S100β
2.1) Relation entre le scanner cérébral et la concentration en S100β ;
Des études réalisées, entre autres par Shuolon et al. Calcagnile et al. et Shakery et al., ont
démontré le lien entre l’augmentation de la concentration en S100β sanguine et la présence ou
pas d’un traumatisme crânien. Durant leurs études, ils ont observé en parallèle, la concentration
en S100β et les résultats obtenus lors des scanners cérébraux pour des patients atteints de
différents traumatismes crâniens. Ces trois études ont permis de démontrer le lien entre la
majoration excessive de la concentration en S100β et la présence d’un traumatisme cérébral. Ces
différentes études ont également démontré l’absence de traumatisme cérébral lorsque la
concentration en S100β est inférieure au cut-off proposé par les différents kits de dosage de la
protéine. [29][30][31]
2.2) Progression de la protéine S100béta à partir des cellules gliales;
Avant de se retrouver dans le sang et de pouvoir être dosée, la protéine S100β est produite dans
les cellules du système nerveux, plus précisément dans les cellules gliales. Lors d’un choc tel qu’un
traumatisme crânien, les cellules sont endommagées et se lysent. Le nombre de cellules lysées,
et donc la quantité de protéine S100β, est proportionnelle à l’intensité du traumatisme. Lors de la
lyse cellulaire, la protéine S100β diffuse dans le LCR. La protéine passe ensuite la barrière
hématoencéphalique pour se retrouver dans le sang avant d’être filtrée au niveau des reins et
éliminée dans les urines. Cette courte demi-vie signifie qu’un dosage rapide, post traumatique,
doit être réalisé pour éviter des valeurs faussement basses. [10]
13
Le schéma suivant représente le trajet parcouru par la protéine S100B à partir des cellules gliales
vers les voies urinaires.
Passage de la barrière
hémato encéphalique
Filtration rénale
Élimination dans les urines
Figure 1.6 ; évolution de la protéine S100β dans le corps humain après un traumatisme crânien
2.3) Intérêt du dosage de la protéine ;
À l’heure actuelle, la protéine S100β est dosée pour détecter un traumatisme crânien et déterminer
l’utilité d’un scanner cérébral. Comme vu précédemment, un traumatisme crânien léger engendrera
une lyse modérée des cellules gliales au niveau cérébral et, par conséquent, une augmentation de
la concentration en protéine S100 dans le sang. Une faible augmentation au niveau sanguin permet
d’exclure un traumatisme crânien important (confer point 2.1) et d’éviter un scanner cérébral.
Lyse de l’astrocyte et libération
de la S100β dans le LCR
14
Aucune
1 point
4 points
Orienté et claire
4 points
4 points Confuse
3 points
4 points Incompréhensible
2 points
4 points
Le dosage de la protéine S100β étant caractérisé par une VPN élevée (proche de 100% selon les
études), l’intérêt de la S100β réside donc là.
Par contre, le dosage de la protéine S100β possède une VPP basse, ce qui signifie qu’une
augmentation de la concentration en cette protéine peut avoir une origine autre que le système
nerveux.
La protéine fonctionne donc à l’image des D-dimères, une valeur basse excluant toute probabilité
d’avoir un traumatisme, alors qu’une valeur positive nécessitera des tests complémentaires afin de
déterminer l’étiologie.
Avant l’apparition du dosage de protéine S100β, la gravité d’un traumatisme crânien pouvait être
déterminée grâce à plusieurs techniques, dont, le score de Glasgow pouvant être calculé comme
suit.[17]
Score de Glasgow
Ouverture des yeux réponse motrice réponse verbale
Figure 1.7 ; score de Glasgow organigramme [17]
Spontanée
4 points
À la demande ou au
bruit
3 points
4 points
Aucune
1 point
4 points
Suite à une demande
verbale
6 points
4 points
Suite à une douleur
5 points
4 points Mouvement d’évitement
non adapté à la douleur
4 points
4 points
Réponse stéréotypée
en flexion à la douleur
3 points
4 points
Réponse stéréotypée en extension à la
douleur 2 points
4 points
Aucune
1 point
4 points
15
Les valeurs obtenues s’interprètent de la manière suivante
Traumatisme crânien (TC) sévère
TC moyen
TC léger
Figure 1.8 ; interprétation du score de Glasgow [17]
La figure 1.9 représente les résultats obtenus lors d’une étude réalisée, notamment, par Shuolun
et al. [30]
Figure 1.9 ; relations entre le scanner cérébral et la concentration en S100β [30]
Ce schéma montre que si la concentration en S100β est inférieure à 0.10µg/L le scanner est
inutile. [29][30][31]
3 8
9 12
13 14
traumatisme cranien sans facteur de risque et S100β dosé dans les 3h00
512 patients
S100𝛽 < 0.10 µ𝑔/𝐿
138 patients
scanner positif
0 patient
S100𝛽 ≥ 0.10 µ𝑔/𝐿
374 patients
Scanner positif
21 patients
16
Cependant, comme dit précédemment, le dosage de la S100β permet d’obtenir une valeur
prédictive négative élevée, mais une valeur prédictive positive basse, ce qui signifie que, rappelons
le, de nombreux patients sont faussement positifs et subissent donc un scanner inutile. Le
graphique ci-dessous permet de mieux comprendre le lien entre la VPP et la VPN.
Nombre de patients
X Y concentration en S100β
Figure 1.10 ; lien entre VPP et VPN
« X » représente la valeur moyenne des personnes saines
« Y » représente la valeur moyenne des patients atteints de la pathologie
Il existe une zone commune aux individus sains et atteints de la pathologie (zone entourée en
rouge). Or, lors de l’établissement des valeurs de références, il faut définir une valeur à partir de
laquelle les patients sont qualifiés de sains ou de malades .Si le seuil est placé en « A », certaines
personnes seront dites « malades » alors qu’elles sont saines, la VPN sera donc élevée et la VPP
plus basse et inversement si le seuil est placé en « B ». Dans le cas de la protéine S100B le seuil
donné permet d’obtenir une VPN élevée, ce qui signifie que tous les patients qualifiés de « sains »
par la méthode de dosage ne sont pas atteints d’un traumatisme cérébral ; ces individus pourront
dès lors éviter un scanner et, par la même occasion, une exposition inutile aux radiations. L’intérêt
d’avoir une VPN élevée est donc de pouvoir exclure les vrais négatifs.
A B
nBB B
17
2.4) Dosage de la protéine S100β
2.4.1) Dosage de la S100β chez les enfants ;
Chez les enfants, le traumatisme crânien représentent une cause importante de mortalité, il est
donc relativement important de savoir détecter celui-ci le plus rapidement possible. À l’heure
actuelle, de nombreux hôpitaux dosent la protéine S100β pour déterminer la présence ou non d’un
traumatisme cérébral. Cependant, et d’après des études de Diego Gazzolo et al. et de Potela et
al., la concentration de cette protéine varie, chez les enfants, en fonction de l’âge et du sexe. Le
tableau suivant représente les variations de concentration en S100β (en fonction de l’âge et du
sexe) obtenus lors de l’étude réalisée par Diego Gazzolo et al. (Ces valeurs peuvent différer en
fonction des conditions analytiques). [18][31][58]
Tableau1.2 ; valeurs pédiatriques en S100β selon l’étude de Diego Gazzolo et al. [18]
Âge des enfants (en années)
Concentration en S100β (en µg/L) chez les garçons
Concentration en S100β (en µg/L) chez les filles
0-1 0,81 0.95
1-2 0,72 0.77
2-3 0 ,62 0.76
3-4 0,70 0.66
4-5 0,61 0.74
5-6 0,68 0.56
6-7 0.60 0.86
7-8 0.90 0.90
8-9 1.37 1.41
9-10 1.44 1.67
10-11 1.45 1.74
11-12 0.42 0.45
12-13 1.23 1.25
13-14 1.13 1.35
14-15 0.66 0.91
Moyenne entre 1an et 15 ans 0.80 0.95
18
La variation en S100β est mieux visible sur le graphique suivant
Figure 1.11 ; Graphique représentant la variation de concentration en S100β en fonction de l’âge, avant 18 ans [18]
Une valeur de référence moyenne a été instaurée pour interpréter les résultats obtenus lors du
dosage de la protéine S100β chez les enfants, cette valeur se situe aux alentours de 0.10 et
0.20µg/L en fonction des kits et s’applique à tout patient ayant moins de 18 ans. Cette valeur de
référence permet d’obtenir une VPN de 100% mais induit une VPP relativement basse (inférieure
à 40%), ces données varient en fonction de la population étudiée. [18][19][20][24][58]
2.4.2) Dosage de la S100β chez les adultes ;
Il y a en moyenne 100-250 cas de traumatismes crânien/100 000 habitants par an en Europe,
parmi ceux-ci 90-95% sont des traumatismes crâniens légers. Chaque patient souffrant d’un
traumatisme cérébral subit un scanner et dans certains cas une hospitalisation. Contrairement aux
enfants, les valeurs de références en S100β chez les adultes ne varient pas avec l’âge ou le sexe.
Des études réalisées par Portela et al. et par Wiesmann et al. ont démontré que les valeurs de
références sériques en S100β se situent aux alentours de 0.10 – 0.20 µg/L en fonction des kits
utilisé. [21][22][32]
Pour déterminer la gravité d’un traumatisme cérébral il existe 2 méthodes préférentiellement
utilisées, la classification de MASTERS (reposant sur la classification de Glasgow et la
concentration en S100β) et la classification de Glasgow, celle-ci fonctionne comme expliqué ci-
après. [1][23][31][32]
0
0,5
1
1,5
2
con
cen
trat
ion
en
S1
00
β(e
n
µg/L
)
âge en années
variation de S100β plasmatique en
fonction de l'age et du sexe
Gracons
Filles
19
Dosage de la S100β si
TC date de moins de 3h
Pas de scanner cérébral Scanner cérébral
Figure 1.12 ; Classification de Masters [22] [23]
Grâce à cette classification et au dosage de la protéine S100β il est possible d’exclure ou non un
traumatisme crânien.
3) Technique de dosage ; Roche – Diasorin
La protéine S100β peut être dosée grâce à différentes techniques telles que l’ÉLISA, l’IRMA, le
western blot et la RT-RT PCR. Ses différentes techniques sont expliquées ci-après.
[6][13][14][15][7]
Groupe 1
TC léger
(établi grâce au
score de Glasgow)
Groupe 2
TC moyen
(établi grâce au
score de Glasgow)
Groupe 3
TC sévère
(établi grâce au
score de Glasgow)
S100β< 0,10µg/L S100β >0,10 µg/L
Ou TC de plus de 3h
20
3.1) Réaction antigène-anticorps rappel ;
Beaucoup de techniques de dosage utilisent la réaction entre un anticorps et un antigène pour
quantifier la concentration en S100β, cette réaction permet d’obtenir une haute spécificité. Les
firmes Roche® et Diasorin® utilisent notamment cette réaction. La formation du complexe
antigène-anticorps peut être représentée comme sur la figure 1.13.
Paratope
Épitope
Figure 1.13 ; réaction Ag-Ac [35]
L’anticorps est une glycoprotéine ayant un rôle important dans la défense immunitaire. Il est
composé de deux chaines lourdes (H) liées par des ponts disulfure et de deux chaines légères (L),
ces différentes chaines possèdent une zone constante (CL et CH) et une zone variable (VL et VH)
sur laquelle vient se fixer l’épitope antigénique, c’est-à-dire la partie reconnue par l’anticorps. Un
anticorps étant spécifique à une molécule donnée, cette spécificité est notamment exploitée dans
les techniques d’immunodosage. La formation du complexe anticorps-antigène résultera de la
liaison entre l’epitope de l’antigène et le paratope de l’anticorps. Les anticorps utilisés dans les
immunoanalyses peuvent être de deux types, monoclonaux ou polyclonaux. [35]
3.1.1) Les anticorps polyclonaux ;
Un antisérum polyclonal est un mélange de différents anticorps possédant des affinités et une
spécificité différente pour l’antigène. De plus les anticorps polyclonaux reconnaissent différents
épitopes d’un même antigène. [35]
3.1.2) Les anticorps monoclonaux ;
Un antisérum monoclonal est un mélange homogène d’anticorps ayant une affinité et une
spécificité identique pour l’antigène. [35]
S100β
21
3.1.3) Cinétique ;
Comme de nombreuses réactions chimiques, la réaction antigène-anticorps est caractérisée par
une constante d’équilibre et une équation telle que celle-ci [35]
Ag+Ac Ag-Ab
Kequilibre = [Ag-Ac] / [Ag]*[Ac]
Ag = antigène
Ac = anticorps
3.2) Conditions pré-analytiques ;
Avant de réaliser le dosage de la S100β, il faut réaliser l’anamnèse du patient, savoir quel est son
âge, les symptômes ressentis par celui-ci, sa couleur de peau, ses antécédents, les éventuelles
pathologies (tel que mélanome, Alzheimer…) dont pourrait souffrir celui-ci… Les différentes
informations récoltées auprès du patient seront extrêmement importantes lors de l’analyse des
résultats et lors du diagnostic. En effet, comme vu précédemment, certains paramètres peuvent
influencer de manière non négligeable la concentration sérique en S100β et dès lors engendrée
de faux négatifs ou des faux positifs.
Au laboratoire, afin d’avoir une bonne stabilité de la protéine S100β, il faut centrifuger le plasma
ou le sérum le plus rapidement possible après le prélèvement. La protéine est stable 24h à 20°C,
7jours à 4°C et pendant plusieurs mois entre -20°C et -80°C ; passé ce délai, les valeurs obtenues
lors du dosage de la protéine S100β ne pourront plus être garanties. Une étude réalisée par Raabe
et al. a démontré que la protéine S100β est stable durant 24h00 à température ambiante ;
cependant cette étude a également démontré que la protéine S100β est stable durant 48h00 à
4°C. Les données obtenues par l’étude de Raabe et al. sont donc différentes de celles données
par les firmes telles que Roche® et Diasorin®, cependant ces différentes données démontrent
que la protéine S100β est thermolabile. [28]
22
3.3) Principe du kit Roche S100 ®;
Ce kit permet de quantifier la S100 (S100AB et S100BB) en utilisant une technique de dosage
appelée électrochimie luminescence par méthode sandwich :
3.3.1) l’électrochimie luminescence ;
a) principe de la chimiluminescence :
La chimiluminescence est une réaction chimique procurant de la lumière. Pour ce faire une
molécule est portée à un état excité grâce à une réaction chimique ; lorsque celle-ci retourne à un
état stable, elle émet de la lumière. Cette réaction peut se caractériser comme suit :
Niveau d’énergie haut
Photons
Niveau d’énergie normal
Figure 1.14 ; états d’énergie de la molécule
En électrochimiluminescence, il y a une amplification du signal grâce à une réaction
électrochimique ; le schéma suivant montre la réaction de chimiluminescence obtenue grâce au
ruthénium.
Figure 1.15 : réaction d’électrochimiluminescence du ruthénium [55]
Le principe de chimiluminescence procure une grande sensibilité suite à une amplification du signal.[55]
Suite à une différence de
potentiel, le ruthénium est
oxydé et le TPA devient un
radical libre. Le radical du TPA
réagit avec le ruthénium oxydé
pour émettre un photon
(mesuré à 620nm)
23
3.3.2) principe du dosage utilisé par le kit ;
La protéine S100 (présente dans l’échantillon) vient se fixer sur un anticorps biotynilé, un deuxième
anticorps marqué au ruthénium vient ensuite se lier à un autre épitope de la protéine (formation du
sandwich).
Figure 1.16 : formation du sandwich lors du dosage de la S100β par Roche ®
Les microparticules tapissées de streptavidine, ajoutées par après, viennent se lier à la biotine.
Figure 1.17 : représentation de la liaison entre les microparticules et le sandwich
Les particules sont maintenues grâce à un aimant avant de subir un lavage. Une différence de
potentiel permet ensuite de mesurer une émission de lumière proportionnelle à la quantité de
S100β. Pour finir, les résultats sont obtenus grâce à la droite de calibration. [37]
Le kit possède une limite de détection de 0.005 µg/L et une limite de linéarité égale à 39.0 µg .La
firme Roche® a établi le seuil pathologique de 0.10 µg/L chez l’adulte et de 0.16 µg/L chez l’enfant
(entre 3 et 18 ans). Le dosage peut se faire sur le LCR ou sur le sérum (le test n’est pas influencé
par l’hémolyse). Le kit est caractérisé par une haute sensibilité et une basse spécificité. Pour
démontrer l’efficacité de leur kit, la firme a réalisé le tableau suivant. [37]
24
Tableau 1.3 ; sensibilité, spécificité, VPP et VPN du kit [37]
S100β CT + CT -
>0,10 µg/L 92 855 VPP 10 %
<0,10 µg/L 1 361 VPN 99,68%
Total 93 1216 1309
sensibilité 99 % spécificité 30 %
Un CT scan positif correspond à un scanner cérébral positif, caractérisé par la présence d’une
anomalie sur le scanner, par exemple la présence d’une hémorragie.
Figure 1.18 ; CT scan positif
Au contraire, un CT scan négatif correspond à un scanner cérébral normal sans présence
d’anomalie sur le scanner.
Figure1.19 ; CT scan négatif
Certains paramètres tels que la bilirubine, la lipémie, la biotine, peuvent influencer le dosage de la
protéine S100β.
25
3.4) principe du kit Diasorin S100 ® ;
Ce kit permet de quantifier la S100β dans le sang et dans le LCR en utilisant une technique
d’immunologie par chimiluminescence en méthode sandwich
3.4.1) chimiluminescence ;
Le kit Diasorin S100® utilise la molécule d’isoluminol pour réaliser la réaction de
chimiluminescence. L’isoluminol va réagir avec de l’eau oxygénée pour subir une décomposition
oxydative. Cette réaction produira un produit instable qui, pour retourner à son état de stabilité,
émettra de la lumière.
Figure 1.20 ; réaction de chimiluminescence de l’isoluminol
3.4.2) Principe du dosage utilisé par le kit ;
Des particules magnétiques recouvertes de deux anticorps monoclonaux sont placées dans la
cuvette réactionnelle.
Figure 1.21 : schéma des particules paramagnétiques du kit Diasorin ®
isoluminol
26
Suite à l’ajout de l’échantillon, la protéine S100β vient se fixer à l’anticorps.
Figure 1.22 : liaison de la protéine S100β à la particule paramagnétique
Après un lavage, l’anticorps conjugué (anticorps associé à de l’isoluminol) vient se fixer à la
protéine S100β.
Figure 1.23 : liaison de l’anticorps secondaire à la protéine S100β
Le réactif starter est ensuite injecté ; celui-ci vient activer l’isoluminol induisant un signal lumineux
qui sera ensuite mesuré.
Le kit possède une limite de linéarité égale à 30.0 µg/L. La firme Diasorin® a établi le seuil
pathologique de 0.15 µg/L chez l’adulte. Ce kit est caractérisé par une haute sensibilité et une
basse spécificité. Le dosage peut se faire sur le LCR ou sur le sérum. Cependant ce test est
influencé par la présence d’hémolyse. [38]
Certains paramètres tels que la bilirubine, l’hémoglobine, les triglycérides, peuvent également
influencer le dosage de la protéine S100β.
27
3.5) différence entre Roche® et Diasorin ® ;
Le tableau suivant permet de mettre en évidence une potentielle différence entre le kit Roche ®
et le kit Diasorin ® .Celle-ci sera analysée dans la partie pratique.
Tableau 1.4 ; tableau comparatif de Roche® à et Diasorin® [22]
Roche Elecsys ® S100 Diasorin liaison® S100
Technique de dosage Électrochimie luminescence
par méthode sandwich Electro chimiluminescence
par méthode sandwich
Molécule utilisée Le Ruthénium L’isoluminol
Activation de la réaction de dosage
Différence de potentiel Le réactif starter
Limite de linéarité 39.0µg/L 30.0 µg/L
Seuil pathologique chez l’adulte
0.10µg/L 0.15µg/L
Influence de l’hémolyse sur le dosage
NON OUI
Sensibilité Haute Haute
Spécificité Basse Basse
Stabilité du kit fermé et conservé entre 2-8°C
Jusqu’à la date de péremption
Jusqu’à la date de péremption
Stabilité du kit ouvert et conservé entre 2-8°C
12 semaines 2 semaines
Kit ouvert et à température ambiante
8 semaines Jusqu’à ce que le contrôle
soit rejeté
Une étude réalisée par Laribi et al. a permis de démontrer la différence entre le dosage de la S100β
avec le kit Roche ® et le kit Diasorin ®. Pour réaliser leur étude, les scientifiques ont mesuré la
concentration en S100β de 431 personnes (27 avec un CT+ et 404 avec un CT -) après la prise de
sang et après un temps de latence de 3 heures. Les résultats obtenus sont les suivants. [22]
Tableau 1.5 ; comparaison des kits Roche® et Diasorin ® au temps 0
Concentration en S100β au temps 0
Diasorin S100β ® CT + CT-
>0,15 µg/L 26 219 VPP 10,6 %
<0,15 µg/L 1 174 VPN 99,9 %
sensibilité 96,3% spécificité 44,3%
Roche S100β ® CT+ CT-
>0,15 µg/L 26 231 VPP 10,1 %
<0,15 µg/L 0 153 VPN 100%
sensibilité 100% spécificité 38,2%
Le Tableau 1.5 montre une différence non significative de VPN entre Diasorin® et Roche®. Le kit
Roche® possède une VPN de 100% alors que Diasorin® possède une VPN de 99.9%. Dès lors,
lorsque le kit Roche® donne une concentration en S100β inférieure à la valeur de 0.15µg/L, le
28
médecin peut affirmer avec une certitude de 100% que le patient ne souffre pas d’un traumatisme
cérébral, alors que, pour la même concentration, le kit Diasorin® assure à 99.9% que le patient ne
souffre pas de ce même type de traumatisme.
Tableau 1.6 ; comparaison des kits roche ® et Diasorin ® après 3h00
Concentration en S100β après 3H
Diasorin S100β ® CT + CT-
>0,15 µg/L 22 143 VPP 13,2 %
<0,15 µg/L 4 243 VPN 98,4 %
sensibilité 84,6% spécificité 63,0%
Roche S100β ® CT+ CT-
>0,15 µg/L 17 177 VPP 8,7 %
<0,15 µg/L 8 189 VPN 94,4%
sensibilité 68% spécificité 51,2%
Lorsque le dosage est réalisé après 3h00, le kit Roche ® possède une moins bonne VPN que le
kit Diasorin ®. En effet après 3h00 la VPN du kit Roche ® diminue de 5.6 % alors que la VPN du
kit Diasorin ® diminue de 1.5 %.
3.6) Autres techniques de dosage ;
Méthode Principe
ÉLI
SA
Indi
rect
e
Figure 1.24 ; méthode Élisa indirecte
29
Dire
cte
IRM
A
Figure 1.25 ; méthode Élisa directe
Figure 1.26 ; méthode IRMA
30
Wes
tern
Blo
t
Figure 1.27 ; représentation d’un western blot [69]
31
RT
-RT
PC
R
Figure 1.28 ; action de la transcriptase inverse [27]
Figure 1.29 ; action de la RNAse [27]
Figure 1.30 ; PCR
32
4) Autres marqueurs influencés lors d’un traumatisme crânien
En plus de la protéine S100β, il existe d’autres protéines qui augmentent lors d’un traumatisme
crânien ; c’est le cas notamment de la neuron specific enolase, la protéine Tau, la myelin basic
protein, la protéine amyloide, la protéine fibrillaire acide gliale,… ces différentes protéines sont
détaillées ci-après.
La neuron specific enolase (NSE) ; est une enzyme glycolytique présente dans les neurones (il
existe des iso enzymes présentes dans d’autres cellules) une augmentation de la (NSE) dans le
sang est signe de mauvais pronostique lors d’un accident cérébral, tel qu’un traumatisme, un
accident vasculaire cérébrale… mais une augmentation de la NSE peut également être due à un
cancer du poumon, à une schizophrénie, ou à des affections pulmonaires… [39][40]
La protéine Tau ; cette protéine est principalement présente dans les neurones ou elle interagit
avec la tubuline pour stabiliser les microtubules des axones. Une augmentation de la protéine tau
peut donc être due à des dommages cérébraux. Cependant, la protéine Tau augmente dans les
maladies d’Alzheimer, Parkinson … [42] [43]
La myelin basic protéin (MBP) ; joue un rôle de maintien structural au niveau de la gaine de
myéline. Une augmentation de la MBP peut être causée par des scléroses, ou une lyse de
cellules nerveuses [44] [45] [46] [47] [48]
La protéine amyloïde ; cette protéine permet de couper la communication entre les synapses.
Une augmentation de cette protéine est notamment observée dans la maladie d’Alzheimer ; il y a
alorsformation de plaques amyloïdes. [49][50]
La protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) ; cette protéine est un filament intermédiaire présent
dans certaines cellules gliales .Sa concentration augmente lors de la lyse d’astrocyte, avec la
couleur de peau, avec la croissance … [51] [52]
Ces marqueurs sont, pour la plupart, peu sensibles. En effet il faut un choc relativement
important avant que ceux-ci ne soient relâchés dans le sang. La protéine S100β reste donc un
marqueur de choix quant au sa sensibilité importante. Cependant, comme dit précédemment, la
protéine S100β n’est pas spécifique au système nerveux.
33
Partie pratique :
5) Matériels et méthode
5.1) Matériel :
Centrifugeuse Hettich ®
Aliquoteuse RSA pro ®
Liaison Vert ®
Cobas 6000 ®
calibrateur S100 Diasorin® Lot 227444X . Exp : 2016-09-30 . Ref 319117
Control S100 Diasorin ® Lot S10D4341X . Exp: 2016-08-30 . Ref 319112
kit LIAISON®S100 Diasorin ® Lot 22744X . Exp : 2016-09-30 . Ref 314701
kit Roche S100® Lot 180647-01 EXP : 2016-02 Ref 03175243190
calibrateur S100 Roche® Lot 175948-01 EXP : 2016-02 Ref 03289834
Control S100 Roche ® Lot 175948-02 EXP 2016-02 Ref 03289835
Logiciel Corlabs ®
Échantillons patients
5.2) Réactifs :
Préparer le Wash du liaison vert ®
Mélanger 9 litres d’eau distillée avec 1 Litre de solution Wash/System Liquid Liaison ®
(lot 419120 exp 2016-05-04) et laisser le tout reposer au minimum 6h00 (à l’abri des UV)
avant l’utilisation.
Reconstituer les contrôles
Liaison® : ajouter 1ml d’eau distillée dans le flacon du contrôle, agiter
doucement la préparation pour éviter la formation de bulles, laisser reposer 15
minutes à température ambiante avant d’introduire dans la machine.
Roche® : ajouter 1ml d’eau distillé dans le flacon du contrôle, agiter doucement
la préparation, laissé reposer 10 minutes à température ambiante avant
d’introduire dans la machine.
34
Reconstituer les calibrateurs
Le kit Laison ® : le kit liasion S100® est composé de deux calibrateurs (un haut
et un bas) chacun d’entre eux est lyophilisé. Pour reconstituer les calibrateurs,
ajouter 1ml d’eau distillée dans chaque tube. Agiter lentement les tubes et les
laisser reposer 15 minutes à température ambiante avant de les introduire dans
l’automate.
Le kit Roche ® : est composé de deux calibrateurs (un haut et un bas) chacun
d’entre eux est lyophilisé. Pour reconstituer les calibrateurs, ajouter 1ml d’eau
distillée dans chaque tube. Agiter lentement les tubes et les laisser reposer 10
minutes à température ambiante avant de les introduire dans l’automate.
5.3) Composition des kits :
5.3.1) Liaison ®
Figure 2.1 kit liaison S100 ®
Le kit Liaison ® est composé de trois compartiments
Le compartiment 1, appelé « SORB », contient les particules magnétiques revêtues
d’anticorps monoclonaux (de souris) spécifiques à la protéine S100B.
1
2 3
35
Le compartiment 2, appelé « DIL/SPE », contient un diluant pour liquide
céphalorachidien (LCR) composé d’azide de sodium (ce compartiment ne sera pas
utilisé lors de nos analyses).
Le compartiment 3, appelé « CONJ », contient un anticorps monoclonal anti S100β
marqué à l’isoluminol.
5.3.2) Roche ®
Le kit Roche ® est composé de trois compartiments
Le compartiment 1 est appelé « M ». Il contient des microparticules tapissées de
strepatavidine
Le compartiment 2 est appelé « R1 ». Il contient des anticorps (de souris) anti S100
biotinylé
Le compartiment 3 est appelé « R2 ». Il contient des anticorps monoclonaux (de souris)
anti S100 marqué au ruthénium.
5.4) Conservation :
5.4.1) Liaison ®
Une fois introduits dans l’automate, les kits sont conservés à température ambiante jusqu’à la
date de péremption
Les contrôles sont conservés entre 2 et 8°C durant 2 semaines
Les calibrateurs sont conservés au frigo entre 2 et 8°C durant 2 semaines
1
2 3
Figure 2.2. kit roche s100®
36
5.4.2) Roche ®
Les kits, une fois introduits dans l’automate, sont conservés à température ambiante durant 8
semaines
Les contrôles sont conservés entre 2 et 8°C durant 12 semaines
Les calibrateurs sont conservés au frigo entre 2 et 8°C durant 12 semaines
5.5) Méthode
5.5.1) Liaison vert – Diasorin ®
Introduire un aliquot du sérum (approximativement 250µL), sur un rack « I »
Figure 2.3. Rack liaison vert
Introduire ensuite le rack dans l’automate et encoder les dosages à réaliser par celui-ci (dans ce
cas-ci le dosage encodé serra celui de la protéine S100β).
Figure 2.4. Introduction du rack dans le liaison vert.
37
Une fois les échantillons encodés, le dosage peut débuter. L’automate vient prélever 100µL du
sérum et l’introduit dans une cuvette de lecture.
Figure 2.5. Cuvette réactionnelle liaison vert
L’automate vient ensuite prélever 20µl de phase solide, contenant les particules magnétiques
recouvertes de deux anticorps monoclonaux, et les ajoute dans la cuvette réactionnelle.
Il s’en suit un temps d’incubation de 10 minutes suivies d’un lavage grâce à la solution de Wash.
L’automate ajoute 200µl d’anticorps conjugué (anticorps lié a de l’isoluminol) dans la cuvette.
Après un temps d’incubation de 10 minutes et un nouveau lavage, le réactif starter est injecté et
le signal lumineux est mesuré. Le signal lumineux obtenu est rapporté sur la courbe d’étalonnage
suivante afin d’obtenir la concentration en protéine S100β dans le sérum du patient.
Figure 2.6. Droite d’étalonnage du kit S100 liaison ®
38
5.5.2) Cobas – Roche ®
Introduire le sérum à doser sur un portoir à 5 positions (appeler « rack standard gris »)
Figure 2.7. rack Cobas 6000
Introduire ensuite le rack dans l’automate
Figure 2.8. Introduction du rack dans le cobas 6000
Encoder les analyses nécessaires dans l’ordinateur et lancer le dosage.
L’automate va prélever 20µl de l’échantillon à doser et va introduire celui-ci dans une cuvette
réactionnelle
L’automate va ensuite venir ajouter 80µL d’un anticorps monoclonal anti-S100 biotinylé et 80µL
d’un anticorps anti S100 marqué au ruthénium.
Figure 2.9. Intérieur du cobas 6000
39
Après un temps d’incubation de 5 minutes, il y a formation du sandwich.
Les microparticules tapissées de streptavidine sont ensuite ajoutées dans la cuvette
réactionnelle, le complexe immun se fixe aux particules grâce à une liaison strepatavidine-
biotine.
Le tout est ensuite transféré dans la cuvette de lecture et la fraction libre est évacuée grâce à un
lavage.
Le résultat est mesuré et amplifié par un photomultiplicateur. La valeur obtenue est pour finir
rapporté sur une droite de calibration afin d’obtenir la concentration sérique ne S100β.
5.6) Préparation des échantillons
Le prélèvement sanguin est effectué sur un patient à jeun ou pas, dans le pli du coude, sur un
tube sec comme représenté ci-après.
Figure 2.10. Tube sec
Après le prélèvement, le tube est centrifugé le plus rapidement possible à 2100g durant 10
minutes à 22°C afin d’obtenir du sérum ; celui-ci sera aliquoté par la RSA pro et transvidé dans
un tube en plastique. Le tube dans lequel se trouve l’aliquot sera ensuite introduit dans
l’automate pour réaliser le dosage de la protéine S100β.
5.7) Choix des échantillons ;
Les patients sélectionnés pour réaliser cette étude, ont subi un traumatisme crânien et possèdent
un score de Glasgow compris entre 14 et 15, les patients doivent également souffrir d’un des
critères suivants
Perte de conscience dans les 5 minutes après le choc
Amnésie
Céphalée
Plus de deux vomissements
Tous les patients répondant à ces critères et ayant subi le traumatisme entre 0 et 6 heures avant
l’admission subissent un dosage de la protéine S100β (et dans le cadre de notre étude un
scanner cérébral).
40
5.8) But de cette étude :
Dans un premier temps, nous allons essayer d’observer l’influence de la congélation sur les
échantillons de patients admis aux urgences pour une suspicion de traumatisme crânien ; pour ce
faire, nous réaliserons un premier dosage sur sérum après le prélèvement et un second dosage
après quelques mois de congélation à -28 °C sur ce même sérum. Nous allons ensuite réaliser
des comparaisons cliniques en mettant en parallèle les observations des CT scan et les
conclusions fournies par le dosage de la protéine S100β .Pour finir, nous comparerons les valeurs
obtenues lors du dosage de la protéine S100β sérique avec le kit Roche ® et Diasorin ®, dans
les mêmes conditions et avec le même opérateur, afin d’observer une différence significative ou
non entre ses deux kits.
5.9) Avant-propos :
Le dosage de la protéine S100β au temps 0 a seulement été réalisé sur le kit Roche ® pour
diverses raisons.
Tous d’abord, la majorité des dosages de la protéine S100β ont lieu de la nuit or durant cette
période l’effectif du laboratoire est à son minimum et certains automates (tel que le liaison vert)
sont mis en veille.
Ensuite la personne faisant la nuit doit gérer de nombreux services différents il n’est donc pas
possible pour elle de réaliser des analyses en « double ».
Pour finir, le dosage de la protéine S100β est une urgence nous ne pouvons dès lors pas nous
permettre de réaliser deux dosages pour un même paramètre et attendre la sortie des résultats.
Suite à ces différentes contraintes le dosage de la protéine à lieu sur le Cobas® avec le kit
Roche ® car cet automates est maintenus allumé durant la nuit et permet de doser de nombreux
autres paramètres au contraire du liaison vert.
41
6) Analyse statistique
6.1) Comparaison du dosage de la S100β avant et après la congélation avec
le kit Roche®.
Pour pouvoir observer une influence significative de la congélation sur le dosage de la protéine
S100β, nous avons réalisé une mesure au temps 0 (quelques minutes après avoir prélevé
l’échantillon sanguin) et une mesure quelques mois après la congélation de ces mêmes
échantillons. Nous allons donc réaliser une analyse statistique descriptive et iférentielle, sur les
différents résultats obtenus, afin de démontrer ou pas l’influence de la congélation sur le dosage
de la protéine S100β.
6.1.1) Statistique descriptive :
Figure 2.11. Bland Altman avant et après congélation
Ce Bland Altman permet de démontrer une différence de concentration en S100β avant et après
la congélation des échantillons. La moyenne de la différence entre le dosage au temps 0 et le
dosage après congélation nous donne une valeur négative (de -0.0668 avec un intervalle de + ou
– 1.96 SD allant de -0.7788 à 0.6452). La différence entre les deux dosages est proche de « 0 »,
ceci semble donc démontrer qu’il n’y a pas vraiment de différence entre le dosage avant et après
congélation. Des études réalisées notamment par Benabdesselam et al. ont démontré que la
concentration en S100B restait stable plusieurs mois dans nos conditions expérimentales, entre -
0.6452 Moyenne +1.96SD
Moyenne de la différence
Moyenne -1.96SD
-0.0668
-0.7788
42
20 et -80°C. Nous allons donc réaliser, ci-après, des statistiques iférentielles afin de savoir si la
congélation a une influence significative sur le dosage de la protéine S100β.[9]
Le graphique suivant permet de mieux visualiser la variation de concentration engendrée par la
congélation.
Figure 2.12. Bâtons de variation réalisés à partir des résultats obtenus avant et après congélation
Ce graphique permet de mieux visualiser l’augmentation de la concentration en protéine S100β
après la congélation des échantillons, celui-ci est en accord avec le Bland Altman précédent. Ce
graphique est caractérisé par la moyenne mesurée, avant et après congélation, entourée d’un
intervalle de confiance de 95%.
43
La droite de corrélation suivante permet d’observer une potentielle relation entre le dosage avant
et après congélation. Pour réaliser cette droite, nous avons mis les résultats obtenus avant la
congélation en abscisse et les résultats obtenus après congélation en ordonnées ; nous obtenons
dès lors la droite suivante.
Figure 2.13. Droite de corrélation entre les résultats obtenus avant et après congélation
Cette droite de corrélation semble démontrer une association linéaire entre les résultats obtenus
avant et après la congélation sur Roche ®. Ce graphique est caractérisé par le coefficient de
corrélation, égal à 0.88, qui semble indiquer un manque d’influence de la congélation sur ce
dosage de la protéine S100β. Nous confirmerons cette observation dans la partie « statistique
iférentielle ».
Cependant, pour pouvoir observer la relation entre les dosages avant et après congélation, nous
pouvons calculer le coefficient de Pearson. Celui-ci permet de déterminer la relation entre deux
données.
44
Tableau 2.1. Corrélation avant et après congélation
**la corrélation est significative au niveau 0.01 (bilatéral)
Le coefficient de Pearson est de 0.943, celui-ci est donc significativement différent de 0. Cette
valeur semble indiquer une relation linéaire entre le dosage avant et le dosage après la
congélation. Ce coefficient semble confirmer les observations obtenues grâce à la droite de
corrélation précédente.
6.1.2) Statistiques inférentielles
En vue de confirmer les observations réalisées précédemment, nous allons établir un test de T
student pour échantillons appariés. Il faut dans un premier temps vérifier les conditions
suivantes, à savoir la normalité des distributions et l’homogénéité des variances.
Nous allons donc poser les hypothèses suivantes
H0 : population normale
H1 : population non normale
Roche après congélation Roche avant congélation R
oche
apr
ès
cong
élat
ion
Corrélation de Pearson 1 0.943
Sig. (bilatérale) 0.00
Somme des carrés et produits croisés 99.107 80.281
Covariance 1.114 0.902
N 90 90
Roc
he a
vant
cong
élat
ion
Corrélation de Pearson 0.943** 1
Sig. (bilatérale) 0.000
Somme des carrés et produits croisés
80.281 73.202
Covariance 0.902 0.822
N 90 90
45
Tableau 2.2. Tests de normalité
Ce test nous permet d’observer une signification proche de 0, aussi bien pour les valeurs entières que
pour les logarithmes. Nous devons donc rejeter l’hypothèse nulle et, par la même occasion, accepter
l’hypothèse alternative que notre population est non normale. Nous allons donc devoir utiliser un test non
paramétrique pour échantillons appariés.
Pour réaliser ce test non paramétrique, nous posons les hypothèses suivantes
H0 : il n’y a pas de différence significative entre les deux dosages
H1 : il y a une différence significative entre les deux dosages
Ce test nous permet de retenir H0 et donc d’accepter le fait qu’il n’y ait pas de différence
significative entre le dosage de la protéine S100B avant et après congélation. Ces résultats
permettent de démontrer que la différence de concentration observée sur le Bland Altman peut
être négligée.
Pour confirmer l’accord entre le dosage avant et après la congélation, nous allons calculer le
coefficient kappa ; celui-ci nous permettra de confirmer la concordance entre les dosages. Pour
ce faire, nous donnerons la note de « 1.00 » à chaque test positif et la note de « 0.00 » à chaque
test négatif (en utilisant le cut off de 0.10µg/L pour Roche ® ). Nous obtenons dès lors le tableau
suivant.
Kolmogorov-Smirnov
Shapiro-Wilk
Statistique ddl Signification Statistique ddl Signification
Roche avant congélation
0.309 90 0.000 0.499 90 0.000
Roche après congélation
0.322 90 0.000 0.498 90 0.000
LogRoche avant congélation
0.103 90 0.020 0.940 90 0.000
LogRoche après congélation
0.088 90 0.081 0.951 90 0.002
46
Tableau 2.3. Calcul du coefficient Kappa
Nous pouvons en conclure que les dosages sont en accord 83 fois et sont en désaccord 7 fois
sur un total de 90 dosages, il y a donc 7.78 % de désaccord entre le dosage au temps 0 et le
dosage après congélation.
Le tableau suivant nous permet de démontrer l’accord entre les deux dosages.
Tableau 2.4. Mesures symétriques
La mesure d’accord Kappa est de 0.714 ; celle-ci est rapportée sur une table afin de déterminer
le niveau d’accord entre les deux dosages et nous annonce un bon accord (bon accord entre
0.64-0.8).
6.1.3) En conclusion
Grâce à la statistique descriptive, nous pouvons constater une légère augmentation de la
concentration en protéine S100β après une phase de congélation (propre à nos conditions
d’analyses).
Cependant les statistiques iférentielles nous permettent de démontrer que cette différence de
concentration entre les deux dosages est non significative. La concentration en protéine S100B
mesurée avant et après la phase de congélation n’est donc pas modifiée. Cette conclusion est
confirmée par des études réalisées notamment par Ouardia Benabdesselam et al.
Grâce à ces résultats, nous savons que nous pourrons utiliser des sérums congelés, dans nos
conditions expérimentales, pour réaliser des analyses postérieures telles que la comparaison des
kits Roche ® et Diasorin ® ou des comparaisons cliniques tout en gardant des valeurs proches
de celle au temps 0.[9]
Kappa avant congélation
Total 0.00 1.00
Kappa après congélation
0.00 11 6 17
1.00 1 72 73
Total 12 78 90
Valeur Erreur standard asymptotique
T approximé
Signification approximée
Mesure d’accord kappa 0.714 0.101 6.919 0.00
Nombre d’observations valides
90
47
6.2) Comparaison entre le kit Roche ® et Diasorin ® après congélation des
échantillons
Comme nous venons de le voir, la congélation n’a pas d’influence significative sur le dosage de
la protéine S100B.Nous pouvons dès lors mesurer en parallèle la concentration en S100β
obtenue avec le kit Roche ® et le kit Diasorin ® afin de démontrer ou pas une différence
significative entre ces deux kits. Pour ce faire nous allons réaliser des statistiques descriptives et
iférentielles.
6.2.1) Statistique descriptive :
Figure 2.14. bland altman de la différence entre roche ® et diasorin ®
Ce bland altman semble démontrer une différence entre le kit Roche ® et Diasorin ®. La moyenne
de la différence entre le dosage réalisé par Roche ® et Diasorin ® nous donne une valeur négative
(-0.1841 avec un intervalle de 1.96SD allant de – 1.546 à 1.178). Ce graphique semble dès lors
démontrer que le kit Roche ® donne des valeurs en protéine S100B inférieures à celles obtenues
avec le kit de Diasorin ®. Des études réalisées notamment par Laribi et al. et par Muller et al. ont
également démontré cette différence de dosage entre les kits. Cependant, cette différence est
corrigée par les firmes grâce au cut off (en effet le cut off donnée par Roche ® (<0.10 µg/L) est
inférieur à celui donné par Diasorin® (<0.15µg/L)). Le graphique suivant permet de mieux
visualiser la différence de dosage entre les deux kits.
Moyenne de la différence
Moyenne +1.96 SD
Moyenne -1.96 SD
1.178
-0.1841
-1.546
48
Figure 2.15. Bâtons de variation réalisés à partir des résultats mesurés avec Roche ® et Diasorin ®
Ce graphique permet de mieux visualiser la différence de dosage entre les deux kits utilisés. Ces bâtons
de variations sont caractérisés par la moyenne mesurée entourée d’un intervalle de confiance de 95%.
Ceci semble confirmer les résultats obtenus sur le bland altman précédent. Afin de confirmer ces
observations nous allons réaliser des statistiques descriptives ci-après.
La droite de corrélation suivante, permet d’observer la relation entre le dosage de la protéine S100β
réalisée avec le kit Roche ® et le kit Diasorin ® pour réaliser cette droite nous avons mis les valeurs
obtenues par Diasorin ® en abscisse et les valeurs obtenues par Roche ® en ordonnée. Nous
obtenons dès lors le graphique suivant.
49
Figure 2.16. Droite de corrélation entre le dosage de Roche ® et Diasorin ®
Cette droite de corrélation semble démontrer une association entre les résultats obtenus par Roche
® et ceux obtenus par Diasorin ®. Ce graphique est caractérisé par le coefficient de linéarité, égal
à 0.727, qui semble indiquer une concordance entre les valeurs mesurées. Cette hypothèse sera
confirmée ci-après par des statistiques iférentielles.
Afin d’observer la relation entre le dosage de Roche ® et celui de Diasorin ®, nous pouvons calculer
le coefficient de Pearson. Celui-ci nous permet de déterminer la relation entre deux données.
Tableau 2.5. Corrélation entre Roche ® et Diasorin ®
Roche après congélation Roche avant congélation
Roc
he a
près
cong
élat
ion
Corrélation de Pearson 1 0.853
Sig. (bilatérale) 0.000
Somme des carrés et produits croisés 99.107 101.156
Covariance 1.114 1.137
N 90 90
Dia
ssor
in
(apr
ès c
ongé
latio
n) Corrélation de Pearson 0.853 1
Sig. (bilatérale) 0.000
Somme des carrés et produits croisés
101.156 141.956
Covariance 1.137 1.595
N 90 90
50
Le coefficient de Pearson est égal à 0.853 ; il est donc significativement différent de 0. Cette valeur
semble indiquer une relation linéaire entre le dosage réalisé avec le kit Roche ® et le kit Diasorin®.
Ce qui semble confirmer les observations obtenues grâce à la droite de corrélation.
6.2.2) Statistique iférentielle ;
Afin de confirmer les observations réalisées précédemment, nous allons réaliser un test t de
student pour échantillons appariés, pour ce faire, il faut vérifier les conditions suivantes, à savoir la
normalité des distributions et l’homogénéité des variances.
Dans un premier temps nous posons les hypothèses suivantes ;
H0 : population normale
H1 : population non normale
Et nous réalisons ensuite le test de Kolmogorov-Smirnov
Les résultats obtenus lors de ce test nous indiquant que notre population est non normale, nous
allons donc réaliser un test non paramétrique pour échantillons liés avec les hypothèses suivantes
H0 il n’y a pas de différence significative entre les deux kits
H1 il y a une différence significative entre les deux kits
Ce test nous permet de rejeter l’hypothèse nulle et donc d’accepter le fait qu’il y ait une différence
significative entre le kit de Roche ® et de Diasorin ®. Cette différence est notamment visible sur le
Bland Altman et sur la droite de corrélation réalisée précédemment.
Pour observer l’accord entre le kit Roche® et Diasorin® nous allons utiliser le coefficient
Kappa. Pour ce faire, nous allons donner la note de « 1.00 » à chaque valeur supérieure au cut
off du kit et la note de 0 pour chaque valeur inférieure au cut off (rappelons que les cut off
varient en fonction du kit utilisé , le cut off de Roche ® étant de 0.10µg/L et celui de Diasorin ®
de 0.15µg/L.)
51
Tableau 2.6. Tableau croisé coefficient kappa
Nous pouvons en conclure que les kits annoncent tous les deux une valeur négative dans 10 cas
sur 17, et une valeur positive dans 67 cas sur 73. Cependant les kits ne donnant pas les mêmes
résultats 13 fois sur un total de 90 mesures, nous pouvons donc dire que ceux-ci se contredisent
dans 14.4% des cas et sont en accord dans 85.6 % des cas.
Le tableau suivant nous permet de démontrer l’accord entre les mesures réalisées par Roche ® et
celles réalisées par Diasorin ®
Tableau 2.7.accord entre les deux méthodes
La mesure d’accord Kappa est de 0.518 ; cette valeur calculée est rapportée sur une table afin de
déterminer le niveau d’accord entre les deux kits. Celle-ci nous annonce un accord modéré (entre
0.41 et 0.60).
6.2.3) Conclusion :
Les statistiques descriptives nous montrent une différence entre le dosage réalisé par le kit Roche
® et le kit Diasorin ®, dans les mêmes conditions, sur les mêmes sérums et avec le même
opérateur.
Cette différence êtant confirmée par les statistiques iférentielles, celles-ci démontrent une
différence significative entre les deux dosages. Cette différence est confirmée par des études
réalisées notamment par Muller et al. et par Laribi et al.. Cependant nous pouvons constater que
les conclusions obtenues avec chacun des kits restent relativement proches (il y a un accord
modéré), cet accord entre les dosages s’explique par un cut off différent.[15][22]
Kappa Diasorin
Total 0.00 1.00
Kappa Roche 0.00
10 7 17
1.00 6 67 73
Total 16 74 90
Valeur Erreur standard asymptotique
T approximé
Signification approximée
Mesure d’accord kappa 0.518 0.117 4.915 0.000
Nombre d’observations valides
90
52
ChuteAgression
Accident de
voiture
Autres
HommesFemmes
Tableau 2.8. Espace interquartiles des âges de patients
Tableau 2.9. Pourcentage d’hommes et de femmes dans l’étude
Tableau 2.10. Causes d’accidents
Tableau 2.11. Récapitulatif des résultats fournit par Roche®
Figure 2.17. Pourcentage d’hommes et de femmes
Figure 2.18. Répartitions des causes d’accidents
Grâce à ces résultats, nous savons qu’il y a bien une différence significative entre le kit Roche ®
et Diasorin ®. Cependant les conclusions finales sont relativement proches l’une de l’autre, car la
différence de concentration est modifiée par un cut off différent.
6.3) Population étudiée :
La population étudiée était composée d’individus de sexe et d’âges différents, répartis de la
manière suivante :
La population étudiée s’est présentée au service des urgences suite à des accidents, pouvant
être source d’un traumatisme crânien. Les différentes causes d’accidents les plus fréquents sont
les suivants.
La protéine S100B a été dosée chez ces patients grâces aux kits Roche ® (dans un premier
temps) et Diasorin ® (dans un second temps).Suite aux résultats obtenus, un scanner a été
réalisé, les résultats obtenus se répartissent de la manière suivante.
Pour le kit Roche®
Cut off CT+ CT- Pourcent
>0.10 µg/L 4 82 4.65 VPP
<0.10 µg/L 0* 12 100 VPN
100 12.77
Sensibilité Spécificité
Q1 Q2
Médiane Q3
Âge des patients 18 43 64
Sexe en pourcent
CT+ CT-
Hommes 57.14 1 55
Femmes 42.86 3 39
Histoire Nombres de personnes Pourcentage
Chute 59 60,20
Agression 18 18,37
Accident de voiture 9 9,18
Autres 12 12 ,24
Graphique représentant le
pourcentage d’hommes et de femmes
*Remarque : les patients
ayant un une concentration
en S100B inférieur au Cut off
n’ont pas subi de CT scan
mais un contrôle après 48h00
suivi d’un rendez-vous chez le
neurologue un mois plus tard
afin de confirmer l’absence de
traumatisme
53
Tableau 2.12. récapitulatif des résultats fournit par Diasorin®
Tableau 2.13. Répartitions des valeurs obtenues par les deux kits
Pour le Kit Diasorin ®
Cut off CT+ CT- Pourcent
>0.15 µg/L 4 73 5.19 VPP
<0.15 µg/L 0* 16 100 VPN
100 17.98
Sensibilité Spécificité
Comme nous pouvons le constater, les deux kits ont bien détecté les personnes atteintes de
traumatisme cérébral.
Ces différentes mesures se répartissent de la manière suivante
Mesure de la S100B Q1 Q2
(médiane) Q3
Diasorin ® 0.175 0.300 0.855
Roche ® 0.125 0.240 0.535
En conclusion les kits ont tous deux une VPN de 100% et une sensibilité de 100% ils détectent
donc tous les patients n’ayant aucun traumatisme crânien, ceux-ci évitent dès lors l’exposition
aux radiations.
7) Conclusion générale
Les résultats obtenus sur notre population et dans nos conditions expérimentales nous permettent
de démontrer que les conditions de congélation utilisées au sein du laboratoire de la CNDG n’ont
aucune influence significative sur le dosage de la protéine S100β.
Grâce a cette conclusion nous avons pu réaliser une comparaison des kits Roche® et Diasorin ®
sur des sérums de patients congelés. Ces analyses nous ont permis de conclure une différence
significative entre ces deux dosages, celle-ci étant corrigée par des cut off différents. Cependant
nous avons constaté que la sensibilité des deux kits est de 100%, ceux-ci détectent donc toutes
les personnes souffrant d’un traumatisme crânien. Nous ne pouvons donc exclure ou mettre en
avant un de ces deux kits.
Nous pouvons également constater que la VPN de ces deux kits est de 100%, ceci signifie qu’ils
savent tous deux mettre en évidence l’absence d’un traumatisme crânien. Ces kits permettent donc
de certifier a 100% l’absence d’un tel traumatisme, ce qui permet au patient d’éviter un scanner
cérébral et donc d’être exposé à des radiations inutiles.
Le dosage de la protéine S100β peut dès lors être utilisée dans le but de diminuer le nombre de
scanner cérébraux lors d’une suspicion de traumatismes crânien.
Liste des figures
Figure 1.1 ; schéma représentant la composition de la protéine S100Béta [1] 7
Figure 1.2 ; structure tridimensionnelle de la S100β [10] 8
Figure 1.3 ; structure secondaire d’une portion de la protéine S100β [11] 8
Figure 1.4 : activation de la S100β et inhibition de la P53 [25] 9
Figure 1.5 ; schéma représentant l’évolution de la S100β après consommation d’alcool [66][67]
11
Figure 1.6 ; évolution de la protéine S100β dans le corps humain après un traumatisme crânien
13
Figure 1.7 ; score de Glasgow organigramme [17] 14
Figure 1.8 ; interprétation du score de Glasgow [17] 15
Figure 1.9 ; relations entre le scanner cérébral et la concentration en S100β [30] 15
Figure 1.10 ; lien entre VPP et VPN 16
Figure 1.11 ; Graphique représentant la variation de concentration en S100β en fonction de l’âge, avant 18 ans [18]
18
Figure 1.12 ; Classification de Masters [22] [23] 19
Figure 1.13 ; réaction Ag-Ac [35] 20
Figure 1.14 ; états d’énergie de la molécule 22
Figure 1.15 : réaction d’électrochimiluminescence du ruthénium [55] 22
Figure 1.16 : formation du sandwich lors du dosage de la S100β par Roche 23
Figure 1.17 : représentation de la liaison entre les microparticules et le sandwich 23
Figure 1.18 ; CT scan positif 24
Figure1.19 ; CT scan négatif 24
Figure 1.20 ; réaction de chimiluminescence de l’isoluminol 25
Figure 1.21 : schéma des particules paramagnétiques du kit Diasorin ® 25
Figure 1.22 : liaison de la protéine S100β à la particule paramagnétique 26
Figure 1.23 : liaison de l’anticorps secondaire à la protéine S100β 26
Figure 1.24 ; méthode Élisa indirecte 28
Figure 1.25 ; méthode Élisa directe 29
Figure 1.26 ; méthode IRMA 29
Figure 1.27 ; représentation d’un western blot [69] 30
Figure 1.28 ; action de la transcriptase inverse [27] 31
Figure 1.29 ; action de la RNAse [27] 31
Figure 1.30 ; PCR 31
Figure 2.1 kit liaison S100 ® 34
Figure 2.2. kit roche s100® 35
Figure 2.3. rack liaison vert 36
Figure 2.4. introduction du rack dans le liaison vert . 36
Figure 2.5. Cuvette réactionnelle liaison vert 37
Figure 2.6. Droite d’étalonnage du kit S100 liaison ® 37
Figure 2.7. rack Cobas 6000 38
Figure 2.8. Introduction du rack dans le cobas 6000 38
Figure 2.9. Intérieur du cobas 6000 38
Figure 2.10. Tube sec 40
Figure 2.11. Bland Altman avant et après congélation 41
Figure 2.12. Bâtons de variation réalisés à partir des résultats obtenus avant et après congélation
42
Figure 2.13. Droite de corrélation entre les résultats obtenus avant et après congélation
43
Figure 2.14. bland altman de la différence entre roche ® et diasorin ® 47
Figure 2.15. Bâtons de variation réalisés à partir des résultats mesurés avec Roche ®
48
et Diasorin ®
Figure 2.16. Droite de corrélation entre le dosage de Roche ® et Diasorin ® 49
Figure 2.17. pourcentage d’hommes et de femmes 52
Figure 2.18. répartitions des causes d’accidents 52
Liste des tableaux
Tableau 1.1 ; paramètre influençant la concentration en S100β [7][26][10] 10 Tableau1.2 ; valeurs pédiatriques en S100β selon l’étude de Diego Gazzolo et al. [18] 17 Tableau 1.3 ; sensibilité, spécificité, VPP et VPN du kit [37] 24 Tableau 1.4 ; tableau comparatif de Roche et Diasorin [22] 27 Tableau 1.5 ; comparaison des kits Roche® et Diasorin ® au temps 0 27 Tableau 1.6 ; comparaison des kits roche ® et Diasorin ® après 3h00 28 Tableau 2.1. Corrélation avant et après congélation 44 Tableau 2.2. Tests de normalité 45 Tableau 2.3. Calcul du coefficient Kappa 46 Tableau 2.4. Mesures symétriques 46 Tableau 2.5. Corrélation entre Roche ® et Diasorin ® 49 Tableau 2.6. tableau croisé coefficient kappa 52 Tableau 2.7.accord entre les deux méthodes 52 Tableau 2.8. Espace interquartiles des âges de patients 53 Tableau 2.9. pourcentage d’hommes et de femmes dans l’étude 53 Tableau 2.10. causes d’accidents 53 Tableau 2.11. récapitulatif des résultats fournit par Roche® 53 Tableau 2.12. récapitulatif des résultats fournit par Diasorin® 54 Tableau 2.13. répartitions des valeurs obtenues par les deux kits 54
Lexique
Elisa: la méthode ELISA est une méthode de dosage « d'immunoadsorption par enzyme liée »
(enzyme-linked immunosorbent assay en anglais). Ce test permet de détecter ou de quantifier une
protéine présente dans un échantillon. Un anticorps lié a une enzyme va venir se lier sur un site
spécifique de la protéine, le substrat de l’enzyme sera ensuite ajouté dans l’échantillon pour révéler
ou non la liaison de l’anticorps avec l’antigène. [55][56]
Irma: la méthode IRMA est une méthode de dosage radioimmunométrique, ce test permet de
mettre en évidence ou de quantifier une protéine grâce à un anticorps lié à une substance
radioactive. [57]
RT RT PCR : la RT RT PCR signifie Retro transcription – Real Time – Polymérase chain réaction,
ce qui signifie que la réaction subit une rétro transcriptase (passage d’un ARN vers un ADN) avant
de subir une réaction de polymérisation en chaîne pouvant être quantifiée en temps réel (grâce a
différente technique tel que le Syber green ou le Taqman).
Sandwich: la méthode sandwich peut s’appliqué à l’ELISA, à l’IRMA et à d’autres méthode de
dosage utilisant une réaction anticorps-antigène. La méthode est dite « sandwich » lorsque la
protéine d’intérêt est liée à deux anticorps différents (chaque anticorps ayant un site antigénique
différent de l’autre) le sandwich permettant d’obtenir une plus grande spécificité du dosage.
Western blot: le western blot est une technique immunologique permettant de détecter la
présence éventuelle d’une protéine grâce à un anticorps spécifique
Chimiluminescsence: il s’agit d’une réaction émettant de la lumière grâce à une réaction
chimique.
Bibliographie
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Table des annexes
Annexe 1 : étude proposé à la clinique notre dame de Grace sur la protéine S100B
Annexe 2 : fiche technique du kit Roche®
Annexe 3 : fiche technique du kit Liaison®
Annexe 1 : étude proposé à la clinique notre dame de Grace sur la protéine S100B
Annexe 2 : fiche technique du kit Roche®
Annexe 3 : fiche technique du kit Liaison®
Résumé :
En Belgique il y a en moyenne, par an, 100 à 250 cas de traumatismes crânien par 100 000
habitants, parmi ceux-ci, seulement 90 à 95 % sont des traumatismes crâniens légers.
Cependant, chaque patient admis pour une suspicion de traumatisme crânien subit un scanner
cérébral. Celui-ci soumet le patient à des radiations et induit un coup non négligeable pour la
sécurité sociale.
La protéine S100β est fréquemment dosée dans les hôpitaux afin de déterminer la nécessité d’un
scanner cérébral pour des patients chez qui on suspecte un tel traumatisme. En effet grâce au
cut off établi pour le dosage de cette protéine, nous pouvons exclure un scanner cérébral.
La protéine S100B permet donc aux patients d’éviter un scanner mais surtout d’être exposé à
des radiations néfastes pour l’organisme.
Cette étude a pour but de démontrer le rôle joué par le dosage de la protéine S100B et l’influence
des conditions de conservation des échantillons.
Pour ce faire nous avons congelé les échantillons à moins -28°C durant un laps de temps
déterminé et nous avons mesuré la différence entre le dosage au temps initial et le dosage après
congélation.
Nous avons ensuite comparé les différences de dosage entre le kit Roche ® et Diasorin ® en
mesurant, en parallèle, les mêmes échantillons de patients, au même moment et par une même
personne afin d’obtenir la meilleure reproductibilité possible.
Pour finir nous avons réalisé une comparaison entre les résultats cliniques des patients et les
résultats fournis par les différents kits. Ceux-ci nous on permit de démontrer l’utilité du dosage de
la protéine S100B lors de traumatisme crânien.
Ce travail de fin d’étude met donc en évidence l’influence ou non de la congélation dans nos
conditions, une potentielle différence entre Roche ® et Diasorin ® et permet de démontrer le rôle
du dosage de la protéine S100B lors de suspicion de traumatisme crânien.
