protein therapeutics

Intracellular delivery

Παπαδοπούλου Χ. Λευκοθέα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φαρμακολογίας

Ο «όρος» protéine πρωτάθηκε το 1838 από τον

Jöns Jakob Berzelius (Σουηδός χημικός, 1779-1848)

από την ελληνική λέξη “π ρ ώτ ο ς”

( first, foremost, in time, place, order, importance)

« η οργανική ύλη που αποτελεί τη γενική βάση -πρωτεύουσα-

όλων των τμημάτων που απαρτίζουν το σώμα των οργανισμών»

Methods Mol Biol. 2012; 899:1-26. Therapeutic proteins Dimitrov DS Ετυμολογικό Λεξικό Νέας Ελληνικής Γλώσσας Γ. Μπαμπινιώτη

DNA

A T G C

A A T C

G

T

mRNA

Ριβόσωμα

Messenger RNA Codon

Modified from Harald H Sitte, MD Medical University of Vienna, Austria and Bioinformatics and Functional Genomics by J Pevsner

Γενετικός κώδικας

πρωτεϊνη Φαινότυπος

http://www.virtualsciencefair.org/2005/anna5m0/public_html/images/chromosome.gif

Βασικό δόγμα της Μοριακής Βιολογίας

αρχικά, είχαμε

απομόνωση των πρωτεϊνών του

ενδιαφέροντος για θεραπευτικούς σκοπούς

από ζωικούς ιστούς

Iνσουλίνη από πάγκρεας ζώων

http://www.nytimes.com/2010/10/05/health/05insulin.html?pagewanted=2&_r=1&th&emc=th

11/1/1922 χορήγηση ινσουλίνης από βόειο πάγκρεας σε διαβητικό άτομο, ετών 14 στο Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδά

Το παιδί απέφυγε το θάνατο από ΔΙΑΒΗΤΙΚΟ ΚΩΜΑ Νobel 1923 Frederick Banting and Charles Best

1. Οι διαρκώς αυξανόμενες ανάγκες σε πρωτεϊνη 2. Οι παρενέργειες, λόγω απομόνωσης από ιστούς ζώων (μολυσματικότητα – αλλεργικές αντιδράσεις) 3. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA

Παραγωγή των θεραπευτικών πρωτεϊνών

βιοτεχνολογικά

Stanford University Medical School 1972-73

http://ocw.mit.edu/courses/biology/7-01sc-fundamentals-of-biology-fall-2011/recombinant-dna/

«Πέψη» με το ΙΔΙΟ ένζυμο περιορισμού (πχ. EcoRI)

«Μίξη» των DNAs «Σύνδεση» με το ένζυμο λιγάση

Μεταμόρφωση των βακτηριακών κυττάρων

Επιλογή των βακτηριακών κλώνων που μεταμορφώθηκαν με το ανασυνδυασμενο DNA

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙA ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Απομόνωση

α) DNA του ενδιαφέροντος β) πλασμιδιακού DNA από βακτήρια

PCR

DNA encoding γονίδιο

ενδιαφέροντος

Κλωνοποίηση

Πλασμίδιο έκφρασης

Barney Graham, M.D., Ph.D. http://www.vrc.nih.gov/clintrials/clinslides.htm

Ενίσχυση - Απομόνωση του γονιδιακού υλικού

Dingermann T.

Απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος

κλωνοποίηση Τεχνολογίες Ανασυνδυασμένου DNA

Κύκλος παραγωγής

Έκφραση στα κατάλληλα κύτταρα

Μεταμόρφωση των κατάλληλων επιδεκτικών κυττάρων ξενιστή

επιτρέπει την επαγωγή έκφρασης της αντίστοιχα κωδικοποιούμενης

ανασυνδυασμένηςπρωτεϊνης

Γλυκοσυλίωση: προσθήκη υδατανθράκων στη βασική

πρωτεϊνική δομή (μετα-μεταφραστική τροποποίηση)

• Πάνω από το 70% των πρωτεϊνών των ανώτερων οργανισμών είναι γλυκοσυλιωμένες

Folded protein structure (schematic) Satya S. Sahoo, Amit P. Sheth, William S. York, John A. Miller

Figure 3. Manufacture of a biopharmaceutical: opportunities for variation between manufacturers

Dingermann T.

Έλεγχος βιολογικής δραστικότητας In vitro In vivo

Κύκλος παραγωγής βιοτεχνολογικών θεραπευτικών πρωτεϊνών

Tυποποίηση

Ταυτοποίηση της πρωτεϊνης Ηλεκτροφόρηση

Ανοσοαποτύπωση HPLC

Φασματοσκοπία Μάζας (MALDI-TOF) Προσδιορισμός δομής

με NMR και με X-ray κρυσταλλογραφία

Απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος

Κλωνοποίηση Έκφραση Απομόνωση Καθαρισμός

Modified from

Dingermann T. Biotechnology J, 2008, 3: 90-97

Exome sequencing

The human Genome Project

http://news.sciencemag.org/biology/2015/11/3230-genes-you-can-t-do-without

modified from Claire T. Driscoll Director, Technology Transfer Office National Human Genome Research Institute National Institutes of Health

Βιοτεχνολογικά Προϊόντα κυτταρικές θεραπείες

Αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος

Γενετική ποικιλομορφία Μεταλλάξεις Παθολογικός φαινότυπος

Επιστήμη της Βιοπληροφορικής

Αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος

Συγκριτική Γενωμική

Νέα εποχή στην

Ιατρική Εξατομικευμένη

θεραπεία

Βιοτεχνολογικά Βιοφαρμακευτικά

Προϊόντα

Ανασυνδυασμένες Πρωτεϊνες

Εμβόλια υπομονάδας

Μονοκλωνικά Αντισώματα

Προϊόντα βασισμένα σε νουκλεϊνικά οξέα

πρωτεϊνική θεραπεία

γονιδιακή θεραπεία /

RNA interference

διακρίνονται βάσει: (1) της Φαρμακολογικής δράσης τους Αντικατάσταση μιας πρωτεϊνης; PRT Ενίσχυση κάποιου βιοχημικού μονοπατιου Παρεμβολή σε κάποιο μόριο ή οργανισμό, Για τη χορήγηση άλλων ενώσεων (ραδιονουκλίδια, κυταροτοξικά φάρμακα, κλπ)

(2) της Κατηγορίας των μορίων αντισώματα, πρωτεϊνες σύντηξης, Αντιπηκτικά, παράγοντες αίματος, ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες, ορμόνες, κυτταροκίνες, θρομβολυτικά φάρμακα

(3) του Μοριακού Μηχανισμού Δράσης ένζυμα, μονοκλωνικά αντισώματα (mabs), Methods Mol Biol. 2012;899:1-26. Therapeutic proteins. Dimitrov DS1

Papadopoulou and Tsiftsoglou, Pharmaceutical Research, 2011

Πρωτεϊνική θεραπεία (> 130 προϊόντα)

Πρωτεϊνική / Ενζυμική Θεραπεία

Αντικατάστασης

Μονοκλωνικά Αντισώματα (mabs)

εμβόλια

διαγνωστικά

sales of US$108 bln

Δράση πρωτεϊνών:

1. στο πλάσμα (π.χ. παράγοντες πήξης)

2. μετά από σύνδεση με υποδοχείς

στην επιφάνεια του κυττάρου (π.χ. ινσουλίνη)

3. ενδοκυτταρικά

απαραίτητη: η είσοδος εντός του κυττάρου

Insulin

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Insulin_glucose_metabolism_ZP.svg

Δράση της Ινσουλίνης στους υποδοχείς της στην κυτταρική μεμβράνη

Harald H Sitte, MD Medical University of Vienna, Austria

•1982 άδεια κυκλοφορίας (από το FDA) της ανασυνδυασμένης ινσουλίνης

Οι πιο συνηθισμένες διαταραχές των παραγόντων πήξης αφορούν έλλειψη :

• α) του παράγοντα FVIII (αιμοφιλία Α) • β) του παράγοντα FΙΧ (αιμοφιλία Β)

• γ) του παράγοντα von Willebrand

Hoffbrand and Pettit. Clinical Hematology Illustrated. An intergrated text and Color atlas. (W.B. Saunders Company) (1987)

in vitro

II

TF δράση

στο πλάσμα

παράγοντες πήξης

ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ- ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ

Ανασυνδυασμένα προϊόντα

(recombinant DNA technology),

ελεύθερα μολυσματικών ιών

Biogen Idec Releases Promising Hemophilia Data

Blood. 2015 Oct 22;126(17):1975-6. doi: 10.1182/blood-2015-08-664052.

rVWF: treatment finally reaches the modern age. Metjian AD.

2005

T1/2 = 20 min

T1/2 = 4 min

2 bolus injections

30 min apart

Θρομβολυτικά φάρμακα

Chinese Ηamster Οvary cellls

Etanercept : Πρωτεϊνη σύντηξης http://en.wikipedia.org/wiki/Etanercept

Διαλυτό τμήμα του υποδοχέα 2 του TNF

Το τμήμα Fc ενός ανθρώπινου αντισώματος IgG1

Σύνδεση με περίσσεια του TNF στο πλάσμα

π.χ. ψωρίαση

προσέλκυση των κυττάρων του ανοσοποιητικού

Εξουδετέρωση της διεγερτικής του ανοσοποιητικού συστήματος δράσης του TNF

Interferon beta Molecular weight: 19.000 Da Aspirin

Molecular weight : 180

μεγάλα - πολύπλοκα μόρια

(protein therapeutics as biological medicines)

μόνο ζωντανοί οργανισμοί (βακτήρια, μύκητες, έντομα, καλλιέργειες ανθρώπινων

κυττάρων) μπορούν να τις παράγουν

Oι πρωτεΐνες είναι πολύ ευαίσθητες στις

συνθήκες παρασκευής Μικρές αλλαγές μπορεί να επηρεάσουν σημαντικά

τη βιολογική δραστικότητα

Η πολυπλοκότητα αυτή οδηγεί σε ένα βαθμό ετερογένειας

της παραγόμενης πρωτεΐνης

[Adapted with permission from European Journal of Hospital Pharmacy, 2004, vol3, published by Pharma Publishing and Media Europe bvba, Belgium (Schellekens (2004b)].

Μοριακή ετερογένεια της ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (epoetin alfa)

μεταξύ των προϊόντων από διάφορες περιοχές του κόσμου

Korea Argentina

Indi

a

Chi

na

Eur

ope

διαφορετικό «προφίλ» γλυκοσυλίωσης (μετα-μεταφραστικής τροποποίησης) μπορεί να επηρεάσει τη βιολογική δραστικότητα

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Medicine_QA/2009/12/WC500020062.pdf

για τα βιο-ομοειδή

(biosimilars, biosimilar medicines) που «αναπτύσσονται»

μετά τη λήξη της πατέντας των πρωτότυπων (reference biological medicines),

απαιτείται

συγκριτική αξιολόγησή τους, παράλληλα με το αντίστοιχο πρωτότυπο,

σε κλινικό επίπεδο πριν την τελική έγκρισή τους

για θεραπευτική χρήση

Regenerative Medicine Vol. 10, No. 1, Pages 65-78, 2015

σε αρκετές περιπτώσεις,

μπορεί να ακολουθήσει

PEG-υλίωση των παραγόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Δηλαδή,

σύζευξη με το πολυμερές

πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) -(CH2-CH2-O)n-

Vol 10, Issue 21, 1 November 2005, Pages 1451-1458

η PEG-υλίωση των πρωτεϊνών οδηγεί σε:

Aύξηση μεγέθους, μείωση νεφρικής κάθαρσης ΑΥΞΗΣΗ του χρόνου ημιζωής

Aύξηση διαλυτότητας, λόγω της υδροφιλικότητας της PEG

Μειωμένη «προσβασιμότητα» σε πρωτεολυτικά ένζυμα και αντισώματα

επιμηκύνει

το χρόνο ημιζωής της ιντερφερόνης

(σταθερότερη στο πλάσμα)

και αυξάνει

την αντιϊκή του δράση

http://www.roche-australia.com/content/dam/internet/corporate/roche/en_AU/files/anti_virals/pegasys-pi.pdf

Θα ήταν δυνατόν βιοτεχνολογικές πρωτεϊνες να χρησιμοποιηθούν για τη

θεραπεία γενετικών – μεταβολικών νόσων λόγω

της απουσίας ή δυσλειτουργίας κάποιας

ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης ή ενζύμου

Mattias Belting, Staffan Sandgren, and Anders Wittrup Advanced Drug Delivery Reviews 57(4): 505-527 2004

Κυτταρική μεμβράνη

μηχανισμοί εσωτερίκευσης μακρομορίων

η δυνατότητα εισόδου μέσα στα κύτταρα

viruses

The nature of cell membranes

prevents peptide entry (unless there is an active transport mechanism)

except for short peptides

(<6aa; <600Da).

Delivery across BBB restricted to even smaller peptides

Ανάπτυξη τεχνολογιών

ενδοκυτταρικής εισαγωγής μακρομορίων

Ηλεκτροδιάτρηση (Electroporation)

Μικροέγχυση (Microinjection)

χρήση Λιποσωματίων – Νανοσωματίων

κυτταροτοξικότητα

hydrophobic drug - protein

hydrophilic polyoxyethylene

lipids

aqueous soluble drug - protein encapsulated in

aqueous compartment

http://www.pharmj.com/editorial/19990828/education/parenteral.html

http://the-scientist.com/2011/10/01/a-small-revolution/

http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/slides/3794s2_01_verma/sld004.htm

Modified from Ogawa et al, Acta Med. Okayama, 2009, Vol. 63, No. 1, pp. 1-7

, active

Γονιδιακή θεραπεία

Πρωτεϊνική θεραπεία

Φυσική ικανότητα των ιών να εισέρχονται στα κύτταρα με δυνατότητα έκφρασης των

ένθετων γονιδίων στα κύτταρα στόχο

ενδοκυττάρια μεταφορά εξωγενώς χορηγούμενων

ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Τεχνολογία ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ

Protein Transduction Domains (PTDs)

or

Cell Penetrating Peptides (CPPs)

Μικρού μεγέθους πεπτίδια (10 - 20 aa )

που έχουν τη δυνατότητα να διαπερνούν

σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες,

δίνoντας τη δυνατότητα εισαγωγής και

των συζευγμένων μακρομορίων, ως “cargo”, μέσα στα κύτταρα

Domains of the HIV-1 TAT protein

TAT peptide

Adv Drug Deliv Rev. 2005 Feb 28;57(4):597-608

Representation of the occurrence for the study and the use of various cell penetrating peptides (CPP) described in the review of Dietz and Bahr and entitled “Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach”. “Tat” stands for the Tat-derived peptide, “Ant” for the Antennapedia derived peptide or Penetratin, “VP22” for the VP22 protein from herpes virus, “Tpt” for Transportan and “poly+” for cationic peptides such as poly-lysine or poly-arginine. J Control Release. 2005 Dec 5;109(1-3):77-85

www.neuronlab.org/images/1228729118.jpg

I.Green et al . Trends in Pharmacological Sciences,24(5):213-215, 20

(help of chaperones?)

Tat ?

Pharm Res. 2007 Apr 19; [Epub ahead of i t]

J Pharmacol Exp Ther. 2015 Apr 28. Viral and other cell penetrating peptides as vectors of therapeutic agents in medicine. Durzyńska JŁ1, Przysiecka Ł2, Nawrot R3, Barylski J3, Nowicki G3, Warowicka A2, Musidlak O3, Goździcka-Jozefiak A3.

CPPs are either protein derived peptides (like the 11aa TAT peptide from the HIV-1 TAT full length protein) or synthetic peptides (like the R9) or even chimeric peptides (like the transportan)

5 < R < 15

TAT

R9 transportan

In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery

Jarver et al, 31(11), 528–535, 2010

PTD-cargo molecules and modifications to increase specificity of cargo delivery. Fusion proteins and peptides having a Protein Transduction Domain (PTD) on the N-terminal or C-terminal deliver cargo to virtually any cell.

To facilitate cargo release, a reducible disulfide linker can be introduced between the

cargo and the PTD. Homing peptides such as AHNP (anti-HER-2/neu peptide mimetic) or DV3 (d-amino acid peptid derived from vMIP-II CXCR4 ligand) direct the PTD-cargo molecule to specific cell types.

The stability of the PTD-cargo molecule can be attenuated by the introduction of an oxygen-dependent degradation (ODD) motif to selectively stabilize it in the hypoxic tumor environment. Cationic PTDs can be inactivated by an anionic peptide linked via a protease cleavable linker, activating the PTD in a protease rich environment.

Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules Arjen van den Berga - Steven F Dowdy Current Opinion in Biotechnology 2011, 22:888–893

το TAT “ανοίγει” την πόρτα των κυττάρων

Piyush M Vyas - Ronald M Payne Molecular Therapy vol. 16 no. 4 april 2008

Δυνατότητα στόχευσης

συγκεκριμένων οργανιδίων

Μιτοχόνδρια

Κύρια πηγή ενέργειας του κυττάρου Ημιαυτόνομα οργανίδια με το δικό τους DNA (mtDNA) ~ 100 - 1000 μιτοχόνδρια / κύτταρο ~ 2 - 10 αντίγραφα mtDNA / μιτοχόνδριο ~1000- 1500 πρωτεϊνες

( ~1% του ανθρώπινου πρωτεώματος )

Μιτοχόνδρια

http://neuromuscular.wustl.edu/mitosyn.html

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S15677249100010

“Primary” Mitochondrial Disorders

DiMauro S, Schon EA. N Engl J Med. 2003 Jun 26;348(26):2656-68

Οξειδωτική Φωσφορυλίωση

37

• Συμπτωματική θεραπεία – σπασμοί, – διαβήτης, – απώλεια ακοής, – πτώση βλεφάρων, – καρδιομυοπάθεια – …

• Αερόβια άσκηση επάγει

– οξειδωτική φωσφορυλίωση – μιτοχονδριακές λειτουργίες

• Διατροφή πλούσια σε λίπη β-οξείδωση έναντι της γλυκόλυσης

Di Mauro Acta Myol. 2010 29(2): 333–338

• Φαρμακολογική προσέγγιση – Απομάκρυνση τοξικών μεταβολιτών (πχ. Νευροτοξικό γαλακτικό οξύ με διττανθρακικό νάτριο )

– Απομάκρυνση ελευθέρων ριζών (αντιοξειδωτικά)

– Χορήγηση • βιταμινών (C, Β1, Β2, Ε) • CoQ10 • L-καρνιτίνης • κρεατίνης

• Ενίσχυση της βιογένεσης των μιτοχονδρίων

• Γονιδιακή θεραπεία

• Κυτταρικές θεραπείες • Πρωτεϊνική θεραπεία

Προγεννητικός έλεγχος

http://www.bbc.com/news/health-31069173

http://www.thelilyfoundation.org.uk/animation/

Shokolenko et al Environmental and Molecular Mutagenesis 51:451-461 (2010)

Δυνατότητα στόχευσης

οργανιδίων, όπως

Τα ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ

Gene therapy

Protein therapy

ΤΑΤ-L-Sco2-HA

Παραγωγή της ανθρώπινης TAT-L-Sco2-HA πρωτεϊνης σύντηξης σε βακτηριακό σύστημα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

L-SCO2

TAT-L-Sco2-HA

Μεταγωγή των ανθρώπινων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια

ΤΑΤ-L-Sco2-HA

ΤΑΤ-L

Sco2-HA ΤΑΤ-L

ΤΑΤ-L-Sco2-HA

2011; 28(11):2639-56

Mol Ther. 2008 Apr;16(4):691-7.

TAT-mediated delivery of LAD restores pyruvate dehydrogenase complex activity in the mitochondria of patients with LAD deficiency

Successful TAT-mediated enzyme replacement therapy in a mouse model of mitochondrial E3 deficiency

Werner et al, N ENGL J MED 366, 1132-1141, 2012

Χ Χ

Cel

l-pen

etra

ting

pept

ides

: stra

tegi

es fo

r ant

ican

cer t

reat

men

t. R

auch

er D

, Ryu

JS

.

Tr

ends

Mol

Med

. 201

5 S

ep;2

1(9)

:560

-70

http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/