ibn.idsi.md ale Naturii 7_2007.pdfSeria “{tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735...

$: ibn.idsi.md ale Naturii 7_2007.pdfSeria “{tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735 CARACTERISTICA MORFOFUNCŢIONALĂ A GLANDEI TIROIDE LA ACŢIUNEA PIROGENALULUI PE FONDALUL$
Seria “tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735

CARACTERISTICA MORFOFUNCŢIONALĂ A GLANDEI TIROIDE LA ACŢIUNEA

PIROGENALULUI PE FONDALUL MELANOTROPINEI

Boris MELNIC, Ecaterina PALADI, Liuba BUDEANU, Eugen DUDNIC, Natalia GAIDEI

Catedra Biologie Umană şi Animală This paper deals with the activity of pyrogenal (50 μg/kg) upon the functional state of the thyroid gland. Determining the level of the tiroxin (T4) and 3-iodtironin (T3) at white rats that were administered pyrogenal, we ascertain

a rapid growth of these hormones. Essential changes were of 50 established in the thyroid gland structure. The administered MSH on the pyrogenal background has a protective role for thyroid gland normalizing the modifi-

cations that had taken place. Pe parcursul ultimilor ani într-un şir de lucrări [1,2] au fost constatate fapte indiscutabile de raport între

starea funcţională a unor glande endocrine, în special a glandei tiroide, şi conţunutul de hormoni ai lobului intermediar al hipofizei – hormonul melanocit stimulator ( HMS).

Cu toate că au fost obţinute unele date asupra interacţiunii glandei tiroide cu melanotropina, problema în cauză rămâne a fi totuşi deschisă. Dinamica mecanismelor implicate în aceste procese suscită deopotrivă interesul de studiu în această direcţie.

Modificările în producţia şi metabolismul hormonilor tiroidieni la acţiunea diferiţilor factori interni şi externi pot afecta întreg echilibrul neuroendocrin şi metabolic al organismului.

Cercetările efectuate de G.Cehovic [3] demonstrează că melanotropina are un efect stimulator asupra glandei tiroide la animale. Se presupune că hormonul hipofizar melamotropina reduce acţiunea de blocare a hormonilor tiroidieni asupra funcţiei tireotrope a hipofizei, stimulând astfel secreţia tireotropinei în sânge care, la rândul său, intensifică activitatea glandei tiroide. A fost determinat la fel şi gradul identic de activităţi lipolitice ale tireotropinei şi MSH la şobolanii de laborator.

Date afirmative au fost obţinute în cadrul investigaţiilor efectuate de V.Andronic [4] referitor la acţiunea hormonului porţiunii intermediare a hipofizei asupra ultrastructurii celulelor secretoare ale glandei tiroide. Despre aceasta mărturiseşte creşterea activităţii funcţionale a glandei: epiteliul înalt, dimensiunile foliculelor micşorate, conţinutul coloidului redus, ergastoplasma, ribozomii şi granulele de secreţie bine dezvoltate. Apariţia acestor schimbări sunt explicate prin intensificarea sintezei hormonilor iodaţi.

În [5] s-a evidenţiat că melanotropina intensifică înglobarea I-radioactiv de către glanda tiroidă, sporeşte nivelul lui în sânge.

E cunoscut că la avansarea stării funcţionale a glandei tiroide capacitatea de transport a globulinei legate cu tiroxina se reduce aproape complet şi suplimentar se leagă o cantitate mai mică a tiroxinei exogene. Deoa-rece aproape toate legăturile libere ale proteinei sunt saturate cu hormon endogen, aceasta indică la faptul că HMS duce la creşterea cantităţii tiroxinei endogene şi a moleculelor sale libere.

Cercetările privind conţinutul formei libere – tiroxina în plasmă obţinută prin metoda gelfiltraţiei denotă că cantitatea de tiroxină la animalele cărora li s-a administrat peritoneal HMS s-a dovedit a fi mai înaltă în comparaţie cu martorii.

Deci, melanotropina provoacă mărirea nivelului moleculelor libere de tiroxină în sânge. Melanotropina măreşte acumularea I125 radioactiv de către glanda tiroidă intensificând funcţia ei hormonală

şi ridică concentraţia tiroxinei-T4 libere în sânge, fapt ce demonstrează activitatea funcţiilor glandei tiroide. Rezultatele obţinute de unii cercetători [6] atestă că administrarea melanotropinei diferitelor mamifere

provoacă schimbări în caracterul funcţiei glandei tiroide, ceea ce se manifestă prin hiperactivitate. P.J. Coates şi alţii fac, în baza cercetărilor [7], concluzia că HMS influenţează asupra mecanismului con-

versiei, care depinde de cantitatea de T4 în sânge. În afară de aceasta, se micşorează acţiunea de inhibiţie a hormonilor tiroidieni asupra funcţiei tireotrope a hipofizei, stimulând astfel secreţia hormonilor săi.

În [8] autorii demonstrează că la administrarea HMS are loc acumulărea sporită de I131 şi accelerarea con-comitentă a ieşirii lui în sânge din glandă.

Desigur, cercetarea influenţei HMS asupra activităţii glandei tiroide prezintă un mare interes, deoarece anume lui îi revine rolul principal în menţinerea stărilor de echilibru ale organismului.

Relevarea aspectelor noi ale activităţii adaptive a HMS şi elucidarea mecanismelor fiziologice de acţiune

5

STUD I A UN IVERS I TAT I S

Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 asupra organismului este foarte actuală pentru diversificarea arsenalului de remedii sau preparate medicamen-toase necesare corecţiei dereglărilor ce apar la acţiunea factorilor nefavorabili.

Reieşind din aceasta, putem presupune că HMS va avea un rol protector în cazul administrării pirogenalului în doză de 50 μg/kg, o lipopolizaharidă care provoacă starea febrilă a organismului.

Experienţele au fost efectuate pe şobolani de laborator linia Wistar la care s-a determinat nivelul de hormoni tiroidieni prin metoda imunofermentativă. Informaţie suplimentară pentru a judeca mai bine despre cauza sporirii sau micşorării concentraţiei de hormoni tiroidieni am primit-o prin studierea structurii glandei. Efectuând analiza histologică şi morfometrică a glandei, am evidenţiat un şir de modificări structurale atât la acţiunea separată a fiecărui factor-pirogenal, MSH, cât şi la administrarea lor combinată.

Foto 1. Ultrastructura glandei tiroide la şobolanii martor.

La administrarea dozei de 50 μg/kg pirogenal concentraţia hormonilor tiroidieni creşte: T3 – de la 0,600± 0,05 nmol/l până la 0,930±0,03 nmol/l; T4 de la 92±6,7 nmol/l până la 128±6,1 nmol/l, P<0,05. Cauzele pot fi diferite: sporirea activităţii de sintetizare şi secreţie a hormonilor, scăderea metabolismului hormonilor sau scăderea intensităţii eliminării pirogenalului din organism.

Foto 2. Ultrastructura glandei tiroide la şobolanii cărora li s-a administrat pirogenal.

6


Cercetările microscopice au demonstrat că în cazul administrării pirogenalului în doză de 50 μg/kg în glandă predomină folicule cu diametru mic – 0,002-0,025 mm, ce conţin coloid de densitate mică resorbtiv, celulele epiteliului folicular capătă formă cilindrică, citoplasma granulată, nucleele ovale fiind situate la baza celulei. Toate aceste schimbări indică sporirea activităţii de sinteză şi secreţie a hormonilor.

După cum observăm, la acţiunea HMS, în doză de 5 μg/kg, conţinutul hormonului tiroidian T3 creşte cu 0,804±0,01 faţă de control. Conţinutul de T4 atinge 114±7,4 nmol/l. Judecând după rezultatele obţinute, putem menţiona că are loc creşterea vădită a conţinutului hormonilor în sângele circulant. Analiza morfometrică şi histologică confirmă că mărirea concentraţiei este, ca şi în cazul administrării pirogenalului, rezultatul stimu-lării activităţii glandei tiroide. În celule predomină folicule cu diametru mic – 0,03-0,035 mm, epiteliul înalt în comparaţie cu norma, sunt prezente vacuole resorbtive. Se poate menţiona că acţiunea stimulatoare a HMS e puţin mai slabă decât a pirogenalului.

Foto 3. Ultrastructura glandei tiroide la şobolanii cărora li s-a administrat melanotropină.

Conţinutul T3 şi T4 la administrarea concomitentă a pirogenalului şi HMS a rămas mai scăzut decât în cazul folosirii doar a substanţei febrile – pirogenal, T3 – 0,719±0,05 nmol/l, T4 – 109±8,5 nmol/l, P<0,05.

Deci, putem menţiona că melanotropina poate fi considerată un hormon care atenuează modificările provocate în organism de substanţa febrilă şi stabileşte un echilibru dinamic neuroendocrin şi hormonal. Probabil, hormonul melanocit stimulator inhibă funcţia glandei tiroide prin mecanismul frânării funcţiei tireotrope a hipofizei.

Foto 4. Ultrastructura glandei tiroide la şobolani la acţiunea combinată a pirogenalului şi melanotropinei.

7


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7

Fig.1. Histogramele distribuirii dimensiunilor foliculelor glandei tiroide.

Martori Pirogenal MSH Pir.+ MSH

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 mm diametru

Fig.1 Histogramele distribuirii dimensiunilor foliculelor glandei tiroide. Referinţe:

1. Сивер П.А., Довгий В.П. Влияние АКТГ тиреотропного и МСГ на окислительно- восстановительные процессы в некоторых органах и тканях крыс // Проблемы эндокринологии. - 1990. - T.16. 5. - C.64-67.

2. Андроник В.И. Морфометрическое изучение реактивности ядерного аппарата тиреоцитов в условиях длительного введения меланотропина. - В кн.: Нейроэндокринные корреляты стресса и адаптации. - Кишинев: Штиинца, 1985, с.41- 45.

3. Cehovic G. Effect de MSH sur l′ axe hypotalamus-hypophyse thyroide // Rev. europ. Endocr. - 1967. - Vol.4. - No2. - P.125-137.

4. Андроник В.И. Op. cit. 5. Мелник Б.Е., Робу А.И., Паладий Е.С., Нгуен Нгок Хой. Функциональное состояние гипоталамуса при

гипертермии на фоне введения меланоцитстимулирующего гормона. Материалы Всесоюзной конференции „Важнейшие теоретические и практические вопросы терморегуляции”. - Новосибирск, 1982, с.172.

6. Дороган Р.В., Робу А.И., Бушман И.Л., Железный Ю.А. Исследование топографического распределения 125I-тироксина в различных отделах мозга интактных и стрессированных крыс. - В кн.: Нейроэндокринные корреляты стресса и адаптации. - Кишинев: Штиинца, 1985, с.94-99.

7. Coates P.J., McNicol A.M., Doniach I., Rees L.H. Increased production of L- melanocyte – stimulating hormone in the pituitary gland of pasients With untreted Addison’s disease clin. // Endocrinol. - 1988. - No4. - P.421-426.

8. Мелник В.Е., Робу А.И., Паладий Е.С., Нгуен Нгок Хой. Op. cit.

Prezentat la 18.04.2004

8

Seria “tiin\e ale naturii”

Biologie ISSN 1857-1735

STUDIU PRACTIC AL PLANTELOR MEDICINALE

ÎN EVOLUŢIA DIABETULUI ALLOXANIC

Tatiana CHITIC

Catedra Biologie Umană şi Animală This work is dedicated to the study of plant extracts influence on the functional state of several endocrine glands

during alloxanic diabethis the use of the normalization of hormonal and hematological indices and metabolic processes and to the acceleration of eliminating the toxic metabolits from the human organism.

On the basis of the receved results, we may conclude that herbs have inulin protective qualities capable to augment insulin secretion and to decrease blood glucose level.

Este general cunoscut că până la începutul secolului XXI diversele organe de plante medicinale, precum

şi preparatele obţinute din ele, extracte, siropuri şi tincturi au constituit cea mai mare şi mai importantă parte din arsenalul terapeutic folosit în medicina ştiinţifică. Cercetările realizate de oamenii de ştiinţă au stabilit structura lor chimică şi au demonstrat cât de diferită este şi cum variază în funcţie de activitatea terapeutică. De asemenea, au fost precizate proprietăţile fizice şi chimice ale acestor componenţi chimici, proprietăţi de care industria ţine cont când prepară medicamente [1,2].

De menţionat că statisticile conţin cifre alarmante ce vizează intoxicaţiile medicamentoase. Astfel, numai în anul 1961 în SUA au fost semnalate nu mai puţin de 882 decese survenite ca urmare a unor intoxicaţii medicamentoase, dintre care 182 revin aspirinei, precum şi derivaţilor salicilici în general.

În afară de aceste 882 decese accidentale ce au revenit în 1961 intoxicaţiilor medicamentoase, anual mai sunt de tratat între 820.000-850.000 intoxicaţii cauzate de alte medicamente. De menţionat că cifra intoxicaţiilor medicamentoase a depăşit în 1991 (la 30 ani diferenţă) pragul fatidic de 1.500.000. Statisticile din Franţa înregistrează anual un număr de 50.000-100.000 bolnavi intoxicaţi cu diverse medicamente care necesită spitalizare [3,4].

Practic, este imposibil ca în condiţiile unui consum medicamentos crescut, în cele ale polipragmaziei şi ale automedicamentaţiei – trăsături cât se poate de definitorii ale lumii moderne – să nu se ajungă şi la aspecte negative: intoxicaţii medicamentoase, care se prezintă a fi o nouă boală a civilizaţiei ce completează lista cauzelor de internare în ţările civilizate [5].

Empirismul, practicat de milenii pe toată suprafaţa globului în folosirea plantelor medicinale, este înlocuit în mare măsură cu argumentarea ştiinţifică, lăsând loc unei temeinice demonstraţii de eficienţă terapeutică în domenii multiple. Utilizate încă din timpurile străvechi, plantele, cu toată extensiunea, manifestă rezerve de tezaur de sănătate cu potenţial utilizat la maximum [6,7].

Plantele medicinale prezintă depozit necesar de preparate de origine vegetală. Amestecurile multicompo-nente de plante s-au selectat empiric şi s-au cizelat în decursul multor ani în practică. Aceasta a permis a stabili eficienţa utilizării plantelor, spectrul acţiunii lor şi efectele adverse [8,9], ceea ce nu a fost depistat la preparatul de origine naturală, care se consideră miracolul tratamentului în diverse patologii [10].

Adaptabilitatea fiinţei umane a impus menţinerea unei stări eficiente de sănătate care permite o integrare perfectă în mediul ambiant. Apariţia unor deficienţe nutriţionale antrenează scăderea potenţialului biologic şi chiar apariţia diverselor maladii [11]. În acest caz, drept suport incontestabil servesc plantele medicinale care se utilizează pe scară largă în afecţiuni imunitare, renale, cardiace, digestive, endocrine.

Actualmente, o problemă globală cu care se confruntă toate statele lumii este diabetul zaharat, boală care a afectat mii de locuitori ai planetei. Raportată la numărul populaţiei, această patologie atinge cifra de 2-5%, iar în ultimele decenii acest indice a crescut enorm [12].

Diabetul zaharat este o patologie endocrină, ereditar transmisibilă. În debutul manifestărilor clinice ale sindromului, pe lângă predispoziţia genetică cu transmitere autosomală cu caracter dominant neregulat, un rol decesiv i se atribuie influenţei factorilor mediului ambiant şi modului de viaţă – alimentaţia cu conţinut sporit de grăsimi animaliere, sedentarismul [13,14]. Datorită dietei alimentare adecvate, diabeticii încetinesc riscul preponderent faţă de această patologie. Utilizarea eficientă a plantelor medicinale favorizează profi-laxia şi tratamentul diabetului zaharat.

9



Deoarece diabetul zaharat este un sindrom heterogen din punct de vedere clinic şi etiopatogenetic, acesta se caracterizează prin hiperglicemie, însoţită sau nu de semne clinice, produs datorită alterării secreţiei de insulină sau perpetuării acţiunii sale. Semnele majore ale diabetului zaharat sunt: poliuria, polifagia şi poli-dipsia, precum scăderea ponderală, cetonuria, proteinuria, glicozuria, ceea ce demonstrează dereglările meta-bolice produse în organism.

Organismul afectat de diabet se află permanent într-o stare de ,,înfometare”, consumând hrană cvadruplă [15]. Astfel, organismul fără secreţie insulinică apelează în scop energetic la depozitele adipoase din care mobili-zează în mod exagerat grăsimi (lipoliză). Dezechilibrul metabolic acut, sever şi prelungit conduce la o negativizare a bilanţului energetic cu pierderea greutăţii corporale [16].

Tabelul 1 Influenţa extraselor din plante medicinale asupra greutăţii corporale (g)

în evoluţia diabetului alloxanic

Indicii Martor Alloxan Plante medicinale

Plante medicinale + Alloxan

Numărul (n) 10 10 10 10 În prima zi 233,8±0,33 198,0±0,57 190,4 ±0,29 259,1±0,60

În a 3-a zi 234,0 ±0,82 194,2±0,46 193,8±0,40 149,6±0,57

În a 6-a zi 234,3±0,73 191,0±0,52 195,2 ±0,38 240,4±0,56

În a 9-a zi 236,0±0,27 186,6±0,6 197,4±0,48 228,8±0,51

În a 13-a zi 238,1±0,75 174,5±0,53** 198,6±0,49* 218,5±0,50*

* P> 0,05; ** P< 0,05

Poliuria reprezintă unul dintre semnele majore ale diabetului, a cărei echilibrare imediat revine la normal. În cadrul investigaţiilor desfăşurate s-a urmărit acţiunea extraselor din plante medicinale asupra volumului de apă consumată (ml/24 ore) pe fondul diabetului alloxanic. Astfel, în primele zile ale cercetărilor nu se observă diferenţe mari în ce priveşte volumul apei consumate, însă spre finele experienţei se evidenţiază consumul mai intensiv de apă.

Tabelul 2

Influenţa extraselor din plante medicinale asupra volumului de apă utilizată (ml/24 ore)

Indicii Martor Alloxan Plante medicinale

Plante medicinale + Alloxan

Numărul (n) 10 10 10 10 În prima zi 45,0 ± 0,57 150,0 ±0,48 35,0 ± 0,41 135,0 ±0,13

În a 3-a zi 50,0 ± 0,11 156,0 ±0,41 33,5 ± 0,70 125,0 ±0,35

În a 6-a zi 40,4 ± 0,48 185,0 ±0,27 50,0 ± 0,54 150,0 ±0,33

În a 9-a zi 50,0 ± 0,70 190,0 ±0,35 45,0 ± 0,42 180,0 ±0,24

În a 13-a zi 58,0 ± 0,94 200,0 ±0,83** 55,0 ± 0,34* 195,0 ±0,17*

* P> 0,05; ** P< 0,05 Importanţi în cercetările realizate sunt indicii hematologici, care demonstrează eficacitatea preparatului

propriu-zis. Analizând indicii hematologici, observăm că eritrocitele la lotul alloxanic evidenţiază o scădere faţă de

lotul martor, iar o maximalizare se observă la lotul plantelor medicinale faţă de lotul plantelor medicinale cu aloxan. Este cunoscut că variate procese patologice, în a căror esenţă se încadrează dereglările metabolice celulare, se imprimă asupra stării morfofuncţionale eritrocitare.

10



(* 1012 e/l)

Fig.1. Nivelul eritrocitelor în diabetul alloxanic.

5,44

5,08

5,47

5,1

4,8

4,9

5

5,1

5,2

5,3

5,4

5,5

1 2 3 4

Conţinutul eritrocitar pe fondul diabetului alloxanic se micşorează la lotul alloxanic ce constituie 5,08 ± 0,17*,

faţă de lotul martor 5,44 ± 0,20, iar lotul plantelor medicinale atinge valoarea de 5,47 ± 0,16* şi în lotul mixt constituie 5,10 ± 0,15*.

Condiţiile variabile ale organismului determină eritropoieza propriu-zisă. Intensitatea mărită a eritro-poiezei în cazul diabetului zaharat decurge cu micşorarea eritrocitelor.

Un puternic reglator al eritropoiezei este oxigenul, care este condus de eritrocite spre ţesuturile organis-mului. Odată ce survin modificări ale formei şi învelişului membranar al eritrocitelor, se produce dereglarea funcţională a acestora, iar nivelul de hemoglobină scade.

Cercetările relatează că conţinutul de hemoglobină la lotul martor constituie 142,0 ± 4,06 faţă de lotul alloxanic care evidenţiază cifra de 139,0 ± 3,31*, iar lotul plantelor medicinale atinge valoarea de 145,0 ± 3,87* şi în lotul mixt constituie 139,3 ± 4,74*

(g/l)

142

139

145

139,3

136137138139140141142143144145

1 2 3 4

Fig.2. Nivelul hemoglobinei în diabetul alloxanic.

Cercetările efectuate asupra leucocitelor demonstrează că valoarea lotului martor constituie 8,89 ± 0,32, iar în cazul lotului alloxanic aceasta atinge cifra de 15,0 ± 0,56**. În lotul plantelor medicinale se înregistrează valoarea de 9,15 ± 0,48*, iar în lotul mixt – de 14,05 ± 0,29**. Cifra ridicată în cazul diabetului alloxanic se datorează creşterii imunităţii celulare în patogeneza diabetului.

11



(* 109 l/l)

8,89

15

9,15

14,05

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1 2 3 4

Fig.3. Nivelul leucocitelor în diabetul alloxanic.

Diabetul zaharat se datorează lipsei cantitative şi calitative de insulină, ceea ce face să apară hipergli-cemia, caracterizându-se ca manifestare tardivă a patologiei [17].

Conţinutul glucozei în sânge pe fondul diabetului alloxanic se măreşte în lotul alloxanic şi constituie 7,48 ± 0,31** faţă de lotul martor 5,10 ± 0,25, iar în lotul plantelor medicinale acesta atinge valoarea de 5,01 ± 0,21* şi în lotul mixt constituie 6,98 ± 0,28**.

(mmol/l)

5,1

7,48

5,01

6,98

012345678

1 2 3 4

Fig.4. Nivelul glucozei în diabetul alloxanic. Persoanele sănătoase ingerează alimente bogate în carbohidraţi care sunt descompuse de aparatul digestiv

în glucoză, eliminată în circulaţia sangvină. Când hiperglicemia se măreşte, glanda endocrină – pancreasul elimină insulina necesară pentru prelucrarea acesteia. În consecinţă, nivelul de glucoză scade în sânge, iar eliberarea insulinei este întreruptă până la o nouă reluare. Acest proces este echilibrat, el permite păstrarea nivelului de glucoză în sânge [18].

În cazul pacientului diabetic acest sistem este dereglat, datorită conţinutului ridicat de glucoză. Din cauza insuficienţei insulinice, glucoza nu poate fi prelucrată la nivel adecvat, de aceea glucoza este eliminată din organism prin urină.

Întrucât mecanismele normale de reacţie nu funcţionează normal, apare un vector coordonat de tratament cu ajutorul plantelor medicinale ce contribuie, la stadiul incipient al diabetului zaharat, la reducerea glucozei sangvine.

12



Eliminarea insulinei de celulele-β

Scăderea nivelului de glucoză în sânge

Alimente bogate în

carbohidraţi

. Pe baza constatărilor menţionate putem deduce că extrasele din plantele medicinale prezintă un potenţial

material cu mari posibilităţi de valorificare, ce indică la un conţinut ridicat de principii active de nivel supe-rior, exercitând acţiune poliglandulară; acestea pot fi indicate în profilaxia şi tratamentul diabetului zaharat.

Referinţe:

1. Constantinescu D., Haţieganu Gr. Plantele medicinale. - Bucureşti: Editura Medicală, 1979, p.25. 2. Dumitrescu C., Perciun R. Diabetul zaharat: Ghid practic. - Bucureşti: Editura Medicală, 2002, p.25. 3. Popescu A.-Bălceşti. Boli metabolice. - Bucureşti: Triumf, 2002, p.21. 4. Percik A. Lumea medicamentelor. - Bucureşti: Teora, 1996, p.14, 117. 5. Stătescu C. Botanica medicală veterinară. - Bucureşti: Ceres, 1989, p.5. 6. Micuţ I. C. Plantele în medicină. Vol.II. - Bucureşti: Editura Medicală,1987, p.2. 7. Pieptea R. Diabetul zaharat – în clinica medicală. - Bucureşti: Editura Academiei, 1989, p.46. 8. Gonciar V., Scutari C. Farmaco- şi Fitoterapia în cardiologie. - Chişinău: Medicina, 2005, p.11. 9. Leon S. Plante medicinale şi aromatice cultivate în Romania. - Cluj: Dacia, 1990, p.11. 10. Vasilachi A., Vasilachi G. Fitodietica. - Chişinău: Medicina, 2000, p.38. 11. Mogoş V. Dietoterapia deficienţelor vitaminice. - Bucureşti: R.A.I., 2001, p.28. 12. Шабалов А. Детские болезни. - Москва: Питер, 2002, p.357. 13. Allison A., Frank B. Dietary modulation of endothelial function, implication for cardiovascular disease // American

journal of clinical nutrition. - 2001. - Vol.73. - No3. - P.673-686. 14. Pieptea R. Op. cit. 15. Ibidem. 16. Dumitrescu D., Haţieganu Gr. Op. cit. 17. Шабалов А. Op. cit. 18. Buckman R., McLaughlin Ch. Diabet. - Bucureşti: Prut Internaţional, 2004, p.10-11.


13



IMPACTUL APEI POTABILE ASUPRA SĂNĂTĂŢII POPULAŢIEI

Maria LUPEI-PRODAN

Catedra Biologie Umană şi Animală Dans cet article on parle des analyses effectuées sur de l'eau potable des puits. En analysant les données obtenues,

on a relevé certains paramètres modifiés, qui dépassent la limite moyenne admissible. Ce sont: la dureté totale, les nitrates, le résidu fixe. La qualité et la composition de l'eau influence la santé. Les maladies intransmissibles considérées comme étant déterminées par la composition chimique de l'eau sont: la goutte endémique, la carie dentaire, les affections cardio-vasculaires, les intoxications avec le plomb, le cadmium.

Existenţa vieţii este strâns legată de apă care, datorită însuşirilor sale fizice şi chimice, reprezintă un factor

de prim ordin în desfăşurarea multor procese biochimice, fiziologice şi ecologice esenţiale [1,2]. Asigurarea populaţiei cu apă potabilă constituie unul dintre factorii primordiali ai securităţii naţionale a ţării. Apa pota-bilă este un element necesar pentru activitatea vitală a populaţiei şi calitatea ei influenţează sănătatea omului şi a animalelor, provocând adeseori diferite maladii. Frecvent, apele potabile sunt investigate sub aspect sanitar-epidemiologic. Actualmente, în Republica Moldova nu există un monitoring unificat al calităţii apelor [3].

Nici unul dintre organismele vii de pe planeta noastră nu poate exista fără apă. Conţinutul apei în organis-mul uman e de circa 70%, în peşti – 75%, în meduze – 99%, în tomate – 90%, în mere – 85%. Conţinutul de apă în diferite părţi ale corpului omenesc constituie: oase – 22%, creier – 75%, muşchi – 75%, sânge – 83%. Viaţa omului este de neconceput fără apă. Pentru om apa este cea mai preţioasă bogăţie naturală.

Creşterea rapidă a numărului populaţiei pe Terra, necesităţile mari de apă pentru industrie, agricultură, pentru serviciile comunale contribuie la apariţia crizei acvatice totale. Rezervele de apă potabilă nu se măresc, dar consumul ei creşte în permanenţă. Consumul apelor dulci în anii 1990-1995 s-a majorat de 6 ori; actual-mente, deficitul de apă potabilă este unul dintre factorii principali ce reţin dezvoltarea social-economică a multor ţări. Circa 20% din populaţia Terrei nu are acces la apă potabilă calitativă, iar în jur de 50% este lipsită de condiţii sanitare de trai [4].

Apa nu este numai cea mai răspândită şi cea mai utilă substanţă de pe Pământ, ea este şi cel mai minunat şi mai neobişnuit corp fizic şi compus chimic. Aproape toate proprietăţile fizico-chimice ale apei joacă un rol important în originea proceselor planetare de apariţie şi întreţinere a vieţii pe Pământ [5, 6].

Apele de suprafaţă sunt poluate frecvent cu apele reziduale urbane, preponderent habituale, fecaloid-menajere, deversate uneori fără vreo epurare prealabilă. În cazul unor anumiţi poluanţi autopurificarea nu mai poate avea loc, deoarece apele nu mai au puterea necesară de regenerare naturală [7].

Sursele de poluare sunt prezentate în cele mai dese cazuri de sectorul gospodăriei comunale (staţiile de epurare a apelor uzate, deversările din sistemul comunal al apelor neepurate, managementul neadecvat al deşeurilor menajere solide în toate localităţile), sectorul agricol (dejecţiile animaliere acumulate în acumula-toare, în care sunt păstrate circa 3,9 mln m3, sectorul individual din gospodăria sătească, depozitele de pesti-cide inutilizabile şi interzise) şi de sectorul energetic (bazele de produse petroliere, staţiile de alimentare cu petrol, alte locuri poluate, care reprezintă deja focare de poluare continuă).

Peste 60% din populaţia Republicii Moldova consumă apă poluată din cauza lipsei reţelelor de alimentare cu apă potabilă sau degradării acestora; 92% din cele 1689 de localităţi nu dispun de sisteme centralizate de alimentare cu apă, populaţia fiind pusă în situaţia să consume apă din fântâni care nu corespund rigorilor igienice; 80% din cele 130 mii de fântâni existente sunt poluate intens cu nitraţi. În consecinţă, bolile sunt cauzate în proporţie de 80% de apa poluată sau de deficitul de apă. Aceste date au fost prezentate de către Mihai Vieru, viceministrul Ecologiei, Construcţiilor şi Dezvoltării Teritoriului [8].

Factorul de mediu cu cel mai mare impact asupra sănătăţii populaţiei este apa, avându-se în vedere necesitatea vitală permanentă a prezenţei apei potabile pentru procesele fiziologice, biochimice în organismul uman, precum şi pentru necesităţile igienice, menajere. Apa folosită în scopuri potabile în Moldova este un factor care determina până la 15-20% din cazurile de boli diareice acute şi hepatită virală A, preponderent în zonele rurale, 20-25% din bolile somatice, în cazul fluorozei dentare – 100%.

14



Apa influenţează sănătatea populaţiei în mod direct (prin calităţile sale biologice, chimice şi fizice), sau indirect. Astfel, cantitatea insuficientă de apă duce la menţinerea unei stări insalubre, a deficienţelor de igienă corporală, a locuinţei şi a localităţilor, ceea ce duce la răspândirea unor afecţiuni digestive (dezinteria şi he-patita endemică), a unor boli de piele.

Bolile umane, produse ca urmare directă a calităţii apei, pot fi clasificate în: - boli cauzate de infecţii răspândite prin consum de apă infectată (diareea, febra tifoidă, hepatita A, salmo-

neloza); - boli cauzate de infecţii transmise prin animale acvatice (bilharioza); - boli cauzate de infecţii răspândite prin insecte cu stagii acvatice (malarie, oncocercoză); - boli cauzate de infecţii transmise prin animale acvatice nevertebrate. O altă influenţă directă a apei asupra sănătăţii populaţiei se produce prin calităţile sale, respectiv prin

compoziţia sa. O serie întreagă de boli netransmisibile sunt considerate astăzi ca fiind determinate sau favo-rizate de compoziţia chimică a apei:

- guşa endemică; - caria dentară; - afecţiunile cardiovasculare; - methemoglobinemia; - intoxicaţiile cu plumb; - intoxicaţiile cu cadmiu. În Republica Moldova, maladiile cardiovasculare se situează pe primul loc în structura mortalităţii generale

a populaţiei, constituind 56,3% din numărul total de decese. Aceste date au fost făcute publice de către Ministerul Sănătăţii şi Protecţiei Sociale. Potrivit datelor MSPS, în anul 2005 în Republica Moldova au fost înregistraţi 331197 bolnavi cu maladii ale aparatului circulator (919,4 la 10000 locuitori). Rata incidenţei (cazuri noi) de boli ale aparatului circulator în anul 2005 a constituit 242,9 la 10000 locuitori (faţă de 184,3 cazuri la 10000 locuitori în 2004).

Diversele substanţe chimice dizolvate în apă pot avea importante efecte asupra sănătăţii organismelor vii, în general, şi asupra omului, în particular. Sunt substanţe care pot fi dăunătoare peste o anumită concentraţie. Altele creează probleme la concentraţii prea mici. În fine, sunt substanţe care pot dăuna la orice concentraţie. Pe această bază putem grupa efectele biologice ale substanţelor din apă în trei categorii:

- substanţe toxice cu efect de prag – sunt toxice numai peste o anumită concentraţie. Astfel de substanţe sunt nitraţii, diverse metale care sunt toxice peste concentraţia-prag, aceasta poate fi atinsă şi treptat prin fenomenul de bioacumulare;

- substanţe genotoxice – sunt substanţe toxice ce produc efecte nocive: cancerigene (produc cancer), muta-gene (produc mutaţii genetice) sau teratogene (produc malformaţii), posibil la orice concentraţie, deci pentru care nu s-a putut stabili existenţa unui prag sub care să nu fie nocive. În categoria substanţelor genotoxice pentru om intră arsenul, unele substanţe organice sintetice, mulţi compuşi organici halogenaţi, unele pesticide;

- elemente esenţiale – sunt substanţe care trebuie să facă parte obligatoriu din dieta organismului. La om, astfel de substanţe esenţiale sunt seleniul, fluorul, iodul.

La baza patologiei hidrice neinfecţioase stau trei mecanisme: - modificarea conţinutului de micro- şi macroelemente chimice în apă; - contaminarea apei cu substanţe chimice toxice; - contaminarea apei cu elemente radioactive. Astfel, investigând impactul apei potabile asupra sănătăţii populaţiei am efectuat analize chimice din

10 fântâni din satul Cojuşna în „Laboratorul de epurare a apei potabile” al Societăţii pe Acţiuni „Glodeni Zahăr” (a se vedea Tabelul).

În baza datelor obţinute putem relata că ingredienţii ce depăşesc LMA sunt: duritatea totală, în puţine cazuri nitraţii, reziduul fix. Nu se depăşeşte limita sau nu s-au depistat metalele: Mo6+, Zn2+, Pb2+, Mn2+, Cu2+, Fe3+.

Duritatea totală redă cantitatea de săruri, hidrogenocarbonaţi, sulfaţi, cloruri ale calciului şi magneziului în apă. În cazul depăşirii concentraţiei medii admisibile la indicii ce determină mineralizarea (calciu, natriu, magneziu, hidrogenocarbonaţi), în sânge creşte nivelul glucozei, al acidului uric.

Duritatea apei cu concentraţii mai mari de 15 mg/dm3 înlesneşte, de asemenea, apariţia osteoartrozelor, osteopatiilor, renolitiazelor, colelitiazelor.

15



Tabel

Calitatea apei din fântânile satului Cojuşna, raionul Străşeni

Ingr

edie

nţi

Col

oraţ

ia,

grad

e

pH

Alc

alin

itate

, m

g ec

hiv

/ dm

3

Dur

itate

tota

lă,

mg

echi

/ dm

3

Săru

rile

de

amon

iu N

H4+

, m

g / d

m3

Nitr

iţi N

O2- ,

mg

/ dm

3

Nitr

aţi N

O3- ,

mg

/ dm

3

Clo

ruri

Cl- ,

mg

/ dm

3

Sulfaţi

SO42-

, m

g / d

m3

Rez

iduu

fix,

m

g / d

m3

Fluo

r F- ,

mg

/ dm

3

Mag

nezi

u M

g2+,

mg

/ dm

3

Fântâna 1 10 7,4 9,0 6,5 0,16 0,006 3,3 17,5 48,9 563 1,6 49,6 Fântâna 2 15 7,6 11,5 18,4 0,2 - 50,6 107,3 120 1727 0,1 97 Fântâna 3 5 7,4 7,6 10,6 0,06 0,006 22,5 54,1 68,1 985 0,8 50 Fântâna 4 5 8,0 7,6 9,6 0,16 - 45,0 52,6 59,3 799 0,5 48 Fântâna 5 70 7,8 8,6 11,2 0,1 - 39,3 43,1 48,4 998 0,8 103 Fântâna 6 50 7,0 11,6 10,6 0,17 - 8,4 36,5 87,2 1091 0,76 Fântâna 7 0 8,0 10,2 10,6 0,23 - 28,1 193 209 1127 0,54 Fântâna 8 15 8,2 15,2 10,5 0,23 0,017 45 106,5 240 1175 0,56 Fântâna 9 5 8,1 10,0 10,2 0 - 22,5 102 188 1115 0,5

Fântâna 10 10 7,2 10,7 35,6 1,7 0,05 78,8 375 425 3863 0,2 LMA 20 6,0-9,0 - 7,0 0,1 0,02 45 350 500 1000 0,7-1,5 50

STA

S

3351

-74

4151

-72

4192

-82

4192

-82

1882

6-73

4245

-72

4389

-72

1816

4-72

9386

-89

2644

91-8

5

În ultimul timp, maladiile cardiovasculare sunt generate parţial de mineralizarea apei. Investigaţiile sta-

tistice din diferite ţări au semnalat existenţa unei relaţii inverse între duritatea apei şi decesele provocate de bolile cardiovasculare. S-a constatat că numărul deceselor cauzate de aceste afecţiuni este mai mare în loca-lităţile în care apa este moale şi că acest număr scade proporţional cu creşterea durităţii apei. Rolul calciului este bine cunoscut, iar carenţa de calciu duce la apariţia aritmiilor. Duritatea apei favorizează dizolvarea în apă a unui şir de metale: cadmiu, cobalt, nichel, crom, mangan care, la rândul lor, au o acţiune toxică asupra sistemului cardiovascular [9]. Duritatea apei afectează procesul de spălare (inclusiv a corpului uman), dar influenţează pozitiv patologia cardiovasculară, apa dură fiind considerată factor protector. Studii mai recente denotă că nu duritatea în sine este benefică, ci Ca, Mg ai căror compuşi sunt factorul major determinant al durităţii. Studii clinice indică un efect favorabil al Ca, Mg, Cr, Mn şi Zn; în schimb, Na, Cu şi Co sunt suspectate pentru efecte defavorabile.

Concentraţia nitraţilor (NO3-) în apa potabilă peste limitele admisibile constituie o problemă majoră. Azo-

taţii sunt propriu-zis nocivi numai la concentraţii foarte mari, care rareori sunt atinse în apă. Nitriţii (NO2-)

rezultă din nitraţi fie înaintea consumului (reducere în fântâni), fie în lumenul tubului digestiv, în cazul migrării, în diverse împrejurări, spre stomac şi intestinul subţire a elementelor reducătoare din biocenoza intestinală.

Limita maximal admisibilă (LMA) de nitraţi în apă nu trebuie să depăşească 50 mg/l. Consumul unor cantităţi mari cu nitraţi poate provoca methemoglobinemia. Declanşarea maladiei are la bază transformarea nitraţilor în nitriţi, aceştia din urmă fiind implicaţi în producerea bolii. Nitriţii se combină cu hemoglobina, transformând-o în methemoglobină ce blochează transportul oxigenului în ţesuturi. Astfel, hemoglobina îşi pierde funcţia de a lega şi transporta oxigenul producând hipoxie. S-a constatat că consumul apei cu nitraţi afectează dezvoltarea biologică generală a copiilor, provocând intoxicaţii cronice, care nu au manifestări clinice evidente.

Carenţa de iod poate produce distrofia endemică tireopată (guşa endemică). Apa este o sursă relativ minoră de iod (majoritatea provenind din alimente), dar carenţa este indusă nu doar de cantitatea insuficientă ingerată, ci şi de interferarea absorbţiei iodului de către cantităţile prea ridicate de Ca, F sau Mn.

Raionul Străşeni e considerat cu carenţă de iod şi cu cazuri frecvente de afecţiuni ioddeficitare. Deşi nu oferă organismului uman decât o mică parte din cantitatea necesară de iod, apa are o importanţă destul de mare în cazul guşei endemice. Maladia respectivă este mai frecventă la femei. Insuficienţa de iod în organism provoacă reducerea biosintezei hormonilor tiroidieni.

16



Carenţa de fluor favorizează caria dentară, fluorul poate contracara şi efectele methemoglobinizante ale nitraţilor. Această leziune a dinţilor apare de la o concentraţie a fluorului din apă sub 0,5 mg/dm3, devenind mai gravă sub nivelul de 0,3 mg/dm3. Astfel, în fântânile nr.2 şi nr.10 concentraţia fluorului este sub 0,3 mg/dm3. Exces de fluor provoacă fluoroza, iar la doze mari – osteoscleroza şi osteofluoroza anchilozantă. Afecţiunea fluoroza dentară este determinată de intervenţia fluorului în procesul calcificării smalţului dentar şi apare la o concentraţie peste 1,5 mg/dm3. S-a stabilit că apa este elementul care asigură de la 2/3 până la 4/5 din necesarul zilnic de fluor al organismului uman.

Arsenul (As) a fost semnalat în apă în concentraţii uneori semnificativ peste normele admise. În formă metalică e puţin toxic. Are şi un rol biologic în organism, de aceea nici absenţa totală nu e dezirabilă. El poate da intoxicaţii acute sau hipercheratoză, hiperpigmentaţie şi cancer al pielii.

Seleniul (Se) este prezent uneori în concentraţii crescute în anumite surse de apă. Este element esenţial pentru om, necesarul fiind de 0,05-0,2 mg/zi. Deficitul afectează sănătatea (de exemplu, boala Keshan). În doze excesive produce afecţiuni dermatologice, gastroduodenale, respiratorii. Seleniul poate fi foarte toxic pentru plante. El reduce toxicitatea pentru animale a mercurului şi arsenului, însă e mai puţin toxic în prezenţa zincului.

Cadmiul (Cd) a generat boala Itai-Itai, care a făcut în Toyama (Japonia) peste 200 de victime. Limitele admise se depăşesc frecvent. Bioacumularea este puternică. Organul afectat în principal la om este rinichiul. O sursă de contaminare a apei sunt ţevile de zinc în care se găseşte ca impuritate cadmiul. Este şi el suspectat pentru posibilele efecte cancerigene.

Plumbul (Pb) este frecvent întâlnit printre poluanţi şi poate genera intoxicaţii, mai ales cronice, din cauza fenomenului de bioacumulare. Organizaţia Mondială a Sănătăţii recomandă neadmiterea vreunei cantităţi pentru copii sau gravide. Multe conducte de apă mai sunt încă din plumb. Apa, dacă stagnează sau are anumite caractere fizico-chimice, poate dizolva plumbul şi duce la intoxicaţii. De asemenea, este suspectat pentru efecte cancerigene.

Cromul (Cr) este un element esenţial pentru viaţă, în cantităţi de 0,05-0,2 mg/zi pentru om. În concentraţii mari are efecte toxice. Forma metalică nu este toxică, dar sărurile sunt toxice. Cromul se acumulează în organismele vii (de 10000 ori în peşte), rezultând riscuri sporite.

Cuprul (Cu) în concentraţii prea ridicate în apă e toxic. El nu se bioacumulează în organismul uman. Poate proveni din ţevile de cupru, care sunt atacate de apele moi sau acide.

Cianurile (CN-) sunt săruri ale acidului cianhidric. Şi acidul, şi sărurile sale (cianurile, mai ales cele de sodiu, potasiu...) sunt deosebit de toxice pentru om şi animale. Acţiunea este acută, prin blocarea respiraţiei la nivel biochimic, celular. Doza letală pentru om este de 0,57-1 mg/ kilogram corp. Pentru peşti, concentraţia letală în apă se estimează la 0,05 mg/litru ion cian. În cazul cianurilor nu există bioacumulare şi nu sunt dovezi clare despre o eventuală toxicitate cronică.

Aluminiul (Al) în cantitate crescută este toxic pentru sistemul nervos central. În organismul uman există circa 300 mg aluminiu. Rolul şi metabolismul lui nu este complet cunoscut. În mod normal e puţin solubil, dar la pH foarte acid sau alcalin solubilitatea creşte puternic.

Nichelul (Ni) se pare că are şi el rol biologic, dar în cantităţi mai mari este toxic. Sărurile de nichel pot provoca alergii şi chiar cancer.

Azbestul este un grup de minerale de silicaţi cu structură filamentară, care se folosesc la fabricarea mate-rialelor rezistente la foc şi căldură, a foilor şi conductelor de azbociment, multe folosite pentru apă. În foarte multe ţări utilizarea azbestului este interzisă, deoarece fibrele de azbest sunt cancerigene. Ajunge în apă din mineralele de pe sol şi subsol, din poluări diverse şi din conductele de azbociment dacă apa are duritate redusă, fapt ce a determinat renunţarea la utilizarea de conducte de azbociment pentru apa potabilă.

Poluanţii organici din apă sunt de o enormă diversitate, în concordanţă cu spectaculoasa amplificare a spectrului de substanţe sintetizate de industria actuală. Există peste 10 000 000 de substanţe chimice, dintre care peste 100 000 se comercializează şi au o răspândire tot mai largă. Din punctul de vedere al toxicităţii, doar circa 3500 sunt studiate relativ complet; dintre acestea, 600 au fost declarate ca prezentând risc pentru sănătatea omului. Există şi compuşi toxici organici naturali, cum sunt toxinele cianobacteriilor, care pot fi hepatotoxice, neurotoxice sau iritante cutanate şi care au fost găsite chiar şi în conducte de alimentare cu apă potabilă. Acţiunea unor poluanţi organici este mai puţin cunoscută, majoritatea producând modificări orga-noleptice evidente, ceea ce duce la limitarea utilizării apei, mai ales ca apă de băut. Dintre aceşti poluanţi

17


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 sunt consideraţi ca principali: pesticidele, dintre care cele organoclorurate ocupă primul loc datorită degradării lor biologice încete şi persistenţei în apă. Acţiunea lor este complexă şi se manifestă: asupra ficatului, siste-mului nervos, a unor glande endocrine (sexuale), unor enzime. Se presupune că ar avea acţiune cancerigenă şi asupra descendenţilor. Şi în Europa compuşii chimici de sinteză apar adesea în concentraţii neadmisibile în apele de suprafaţă în cadrul proceselor de potabilizare, ajungând în reţelele de alimentare a populaţiei [10,11].

În urma analizei raportului statistic privind numărul maladiilor înregistrate la bolnavii domiciliaţi în satul Cojuşna s-a constatat: populaţia – 7123 locuitori: adulţi – 5532, adolescenţi – 390, copii 0-17 ani – 1201. În anul 2006 născuţi – 68, decedaţi – 80. Analizând cauzele deceselor, constatăm că au decedat de maladii ale aparatului respirator 6,3%, de maladii ale aparatului cardiovascular – 55,7%, de maladii ale aparatului digestiv – 11,4%, iar 26,6 % din diferite cauze.

Din numărul locuitorilor se află la evidenţă la finele anului sau sunt înregistraţi cu maladii cardiovasculare 306 locuitori, cu maladii ale aparatului respirator – 44, cu maladii ale aparatului digestiv – 196, cu carii dentare tratate – 1903 locuitori, dintre care copii având vârsta 0-14 ani – 386, cu fluoroză – 7 bolnavi. Cariile dentare pot fi complicate şi necomplicate, fiind înregistrate în raport de1:2. Însă, ţinând cont de faptul că nu toţi locuitorii satului au grijă de propria sănătate şi nu merg regulat să consulte medicul, putem presupune că bolnavi sunt mai mulţi.

Recomandări practice: • Este necesar să se purceadă la examinarea sănătăţii populaţiei şi, în primul rând, a femeilor gravide şi a

copiilor, recomandându-se măsurile de profilaxie. Este contraindicată consumarea apelor potabile puternic mineralizate şi poluate cu nitraţi.

• Locurile de acumulare a dejecţiilor, gunoiului de grajd trebuie să aibă un strat impermeabil de protecţie şi acoperiş pentru a exclude poluarea apelor freatice cu nitraţi şi alte impurităţi. Fântânile urmează să fie proiectate şi construite în strictă conformitate cu regulile sanitare.

• Analizele să se efectueze periodic şi în dinamică, deoarece calitatea apei se modifică sub influenţa factorilor de mediu şi a activităţii antropice.

Referinţe:

1. Botnariuc N., Vaideanu A. Ecologia. - Bucureşti, 1982. 2. Garaba V. Apa potabilă pentru locuitorii de la sate. - Chişinău, 2004. 3. Grigheli Gh., Stasiev Gr. Aspectele ecologice ale calităţii apelor potabile din Republica Moldova. Materialele

simpozionului „Ecologia, etica, morală”. - Chişinău, 2001. 4. Tufescu V., Tufescu M. Ecologia şi activitatea umană. - Bucureşti: Albatros, 1981. 5. Duca Gh., Scurlatov Iu. Ecological chemistry. - Chişinău, 2002. 6. Duca Gh., Mihaileev G. Chimia apelor naturale. - Chişinău: CE USM, 1995, p.12. 7. Friptuleac G. Problemele ecologo-igienice ale calităţii mediului ambiant urban. - Chişinău, 2006. 8. Internet: Ministerul Ecologiei procedează la realizarea programului de aprovizionare cu apă a populaţiei din locali-

tăţile rurale şi centrele raionale. http://www.azi.md/news. 9. Gonţa M., Şalaru I., Sireţanu D. Impactul mediului ambiant asupra sănătăţii. - Chişinău, 1998, p.22. 10. Internet: Să cunoaştem apa www.ccn.ro/utile/publicatii. 11. Internet: Apa potabilă http://www.ccn.ro/utile/publicatii_ccn/ECOAQUAXXI_12_

BROSURI_TEXT_CENTRALZAT_1.pdf


18

http://www.azi.md/news

http://www.ccn.ro/utile/publicatii

http://www.ccn.ro/utile/publicatii_ccn/ECOAQUAXXI_12_BROSURI_TEXT_CENTRALZAT_1.pdf

http://www.ccn.ro/utile/publicatii_ccn/ECOAQUAXXI_12_BROSURI_TEXT_CENTRALZAT_1.pdf



19

THE FORMATION AND MAINTANANCE OF GASTRODUODENAL DYSRHYTHMIA

ON THE BACKGROUND OF EXAGGERATED CELLULAR PROTEIC BIOSYNTHETIC

ACTIVITY OF PARAVENTRICULAR, NORADRENERGIC, AND VAGAL CENTERS

Anatolie BACIU, Lyudmila LISTOPADOVA

Taras Shevchencko Transdniesterian State University În prezentul studiu, citofotometria, citomorfometria şi metoda electrofiziologică au fost combinate pentru a examina

starea funcţională a aparatului de sinteză proteică în celulele nervoase şi neurosecretorii centrilor reglatori în asociere cu activitatea mioelectrică în regiunile gastrice şi duodenale în caz de stresare acută şi cronică. Rezultatele obţinute au demonstrat că începutul perioadei de dezvoltare a stării de stres se caracterizează prin activizarea biosintezei în celulele neurosecretorii localizate în nucleul paraventricular al hipotalamusului. Această sporire a neurosecreţiei se asociază cu implicarea puţin mai tardivă a neuronilor din centrul noradrenergic trunchiular (locus coeruleus) în reacţia asupra stresării. Stresarea cronică duce la stabilirea activităţii biosintetice intensive în celulele nucleului dorsal al nervului vag şi în neuronii preganglionari din aria sacrală a măduvei spinării. Această distribuţie a activităţii centrilor de reglare neuronală condiţionează formarea şi stabilirea disritmiei motorice gastroduodenale. Activitatea exagerată a structurilor celulare hipotalamice şi noradrenergice poate asigura reducerea activităţii mioelectrice gastrice, dar cea a nucleului dorsal al nervului vag duce la stimularea activităţii mioelectrice duodenale.

Depression scores as a result of chronic psycho-emotional stress have a negative linear correlation with

the electrogastrogram (EGG) resting frequencies. Anxiety scores have a positive linear correlation with the EGG area power ratio of the resting to stress responses. Cold or emotional stress affects gastric myoelectrical activity. Audio stimulation, with both music and noise, alters the rhythmicity and regularity of gastric slow waves [1]. During arithmetic task, the gastric power significantly increases [4]. Hyperactivity of gastric motility and the decrease in gastric mucosal blood flow play an important role in inducing gastric mucosal lesions under stress conditions. Regular gastric motility in antrum abolishes, for instance, after traumatic stress [2]. Obvious enhancement in gastric motility is induced in another stress model (the restraint plus water-immersion stress) [6]. Inflammation process developed as a result of stress could be associated with decreased colonic normal mixing motor patterns but increased propulsive motility including high amplitude propagated contractions. Stress-induced colonic motility is increased during diarrhoea associated with irritable bowel syndrome on the background of hyperresponsiveness to corticotrophin releasing factor (CRF) [5]. The role of CRF in gastrointestinal motility regulation represents a great importance. The brain CRF1 receptors mediate the stimulation of colonic transit. CRF2 receptors mediate the inhibitory actions of these peptides on gastric transit. Centrally administered CRF inhibits gastric emptying and contractility while simultaneously increasing colonic motility, transit and defecation, mimicking the gastrointestinal motor alterations observed in response to various stressors [3].

Thus, the aim of this study is to investigate myoelectrical gastroduodenal activity formed on the background of regulatory centers functional state under stress conditions.

This investigation was carried out by the utilization of cytophotometrical, cytomorphometrical, electro-physiological approaches in the rat. The restraint stress model was realized in wire mesh restrainers over 1-, 3-hour, 15-, and 30-day periods. Gallocyanin-chrome alum staining was applied for nucleic acids (NA) revealing. Nucleic acids optical density (DNA) was measured cytophotometrically but NA quantity (QNA) was calculated for each cellular compartment in dependence on volume determined morphometrically. Electrogastrogram (EGG) was recorded by means of 12-channel electroencephalograph equipped by digital recorder “Spike” and special software for spectral EGG analysis. Electrophysiological investigation was realized at The Utrish Marine Biological Station (A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution, Russia). Statistical analysis includes ANOVA test.

The obtained results of the morphometric and cytophotometric examines manifested that in the neurosecretory cells of the hypothalamic nuclei tested (paraventricular hypothalamic nucleus, PVHN, and supraoptic hypo-thalamic nucleus, SOHN) cytoplasmic RNA content is significantly enhanced (by 27.3%, P<0.01 and 19.6%,



20

P<0.05, respectively) at the 1-hour point after stress action beginning. The nuclear nucleic acid level in PVHN`s neurons is decreased by 21.5% (P<0.05). After 3-hr period of stressor action in the cytoplasm of neurosec-retory cells in PVHN the nucleic acid quantity is decreased by 22.4% (P<0.05). The nucleic acid content remains increased by 17.5% (P<0.05) in the neuronal nucleolus on the background of nucleolus volume reduction. The cytoplasmic RNA content is restored up to baseline after 3 hr-period of stressor action in SOHN`s neurons.

The chronic action of restraint stressor (Fig.1) leads to significant changes of the protein synthetic activity and morphometric indices of hypothalamic neurosecretory cells. The cellular biosynthetic apparatus is attenuated after 15-day periodic stressor action. The cytoplasmic RNA level in PVHN`neurons is lower by 36.7% than baseline. The cytoplasm and nucleolus volumes are also reduced (by 18.3 and 16.3%, respectively). In the brain stem noradrenergic centre (locus coeruleus, LC) the neuronal biosynthetic apparatus activation is realized later than that in PVHN. Nevertheless, the protein biosynthesis is intensified after 1-hr stressor action in accordance with the nuclear nucleic acid level elevation (by 24.2%, P<0.05). After 3-hr stressor action the biosynthesis intensification is extended up to cytoplasm and is manifested by the cytoplasmic RNA level elevation (by 39.1%, P<0.01) and cytoplasm volume enhancement (by 23.3%, P<0.05). The chronic restraint stressor action (Fig.1) promotes the maintenance of enhanced protein biosynthetic activity in the noradre-nergic neurons from LC. However, this intensified activity is manifested by the nucleic acid content increase in the neuronal nucleolus (by 25.1%). Finally, the nucleic acid quantity reduction is realized in the neuronal cytoplasm as a result of chronic stressor action (by 17.6%, P<0.05). In the case of chronic stressor action evident response of neurons from dorsal motor nucleus of vagus (DMNV) is revealed. In these neurons cytoplasmic RNA level is shifted (by 17.3%) after 15-day period of stressor action. Moreover, long-lasting preganglionic neuron biosynthetic

Fig.1. Biosynthetic activity in neuronal regulatory formations (nucleic acid content)

and myoelecrical activity patterns after 15-day restraint stressor action (%).

1 – paraventricular hypothalamic nucleus (PVHN); 2 – supraoptic hypothalamic nucleus (SOHN); 3 – locus coeruleus (LC); 4 – dorsal motor nucleus of vagus (DMNV); 5 – sacral section of spinal cord (SSSC).



21

apparatus activation in the sacral section of spinal cord is also for interest. This activation is manifested by the earlier elevation of nucleic acid level in the neuronal nucleus and the later shifting in the cytoplasm (by 17.3%, P<0.05) after 30-day of chronic stressor action.

Recently, it was shown that the “wear and tear” resulting from chronic overactivity or underactivity of physiological stress response systems. Stressors which have been associated with such maladaptive consequen-ces, both acute and chronic, are referred to pathological stressors [3]. The neurosecretory cellular elements of hypothalamic nuclei and noradrenergic neurons from LC shown to be included in the systems responded to different stressors. Therefore, evident morpho-functional modifications are manifested in these structural formations in association with stress-reaction development. Moreover, these modifications represent adequate criteria for estimation of stress restructurings dynamics. These restructurings in turn involve not only nervous and endocrine regulatory systems but also immune system. It is for interest that nucleic acid content changes dynamics evidenced by present study in subcellular compartments of PVHN and MDNV neurons close correlated (r=0.659-0.757, P<0.05). These findings confirm the close interaction between neuroendocrine and autonomic regulatory centers providing stress-reaction development. It is known, that in addition to sympathetic pathways activation the characteristic biphasic pattern of parasympathetic activity is forming during stress-reaction development. This biphasic pattern of parasympathetic activity consists of gastro-vagal inhibition and activation of the parasympathetic sacral efferent output [5].

In the present study phasic changes of gastro-duodenal myoelectrical activity are revealed on the background of enhanced biosynthetic activity in neurosecretory hypothalamic cells, and phasic activity in the noradrenergic centre, dorsal vagus nucleus and sacral spinal cord section. At the earlier stage of restraint stress-reaction development (1-3 minutes after stressor action beginning) the inhibition of EGG slow-wave activity is evidenced. This inhibition is manifested by the percentage reduction of the normal slow-wave activity (2.5-4 cpm, cycles per minute) presence in EGG recorded in stomach (up to 60% versus 73%, baseline, P<0.05). The spike activity predominance is evidenced in duodenal region after 1-hr stressor action (by 130% in comparison with baseline). This predominance is manifested by enhancement of oscillations amplitude and dominant frequency (5.3-7.4 versus 4.1-5.3 cpm baseline). After 5-hour stressor action myoelectrical activity dyscoordination is exaggerated in stomach sections, on the one hand, and in duodenal region, on the other hand. Following EGG recordings revealed that the myoelectrical activity dyscoordination between duodenal and pylorus regions is elevating during restraint stress development (after 15-day and 30-day stressor action). The dominant frequency averages 3.15-4.36 cpm in the duodenum region, and 2.81-2.9 cpm in the pylorus. This myoelectrical dysrhythmia suggests possible duodeno-gastric reflux development.

Therefore, acute restraint stressor action leads to biosynthetic apparatus activation in paraventricular neuro-secretory cells, and neurons of noradrenergic brain stem centre on the background of myoelectrical gastric activity inhibition. Chronic stressor action result in cellular biosynthetic attenuation in paraventricular area and intensification in noradrenergic and vagus nuclei in association with profound myoelectrical dysrhythmia in gastroduodenal regions. Moreover, preganglionic sacral neurons are active over period of stressor chronic action.

References:

1. Chen D.D., Xu X., Wang Z., Chen J.D. Alteration of gastric myoelectrical and autonomic activities with audio stimulation in healthy humans // Scand. J. Gastroenterol. - 2005. - No40(7). - P.814-21.

2. Liu J., Li Z.S., Xu G.M. Effect of neuropeptides VIP and CCK-8 on gastric motility after traumatic stress // Dier Junyi Daxue Xuebao. - 2000. - No21. - P.13-15.

3. Martinez V. & Taché Y. Role of CRF receptor 1 in central CRF-induced stimulation of colonic propulsion in rats // Brain Res. - 2001. - No893. - P.29-35.

4. Riezzo G., Porcelli P., Guerra V., Giorgio I. Effects of different psychophysiological stressors on the cutaneous electrogastrogram in healthy subjects // Arch. Physiol. Biochem.- 1996. - No104(3). - P.282-6.

5. Spiller R. Role of motility in chronic diarrhoea // Neurogastroenterol. Motil. - 2006. -No18(12). - P.1045-1055. 6. Tuncel N., Erkasap N., Sahinturk V., Ak D.D., Tuncel M. The protective effect of vasoactive intestinal peptide

(VIP) on stress-induced gastric ulceration in rats // Ann. NY Acad. Sci. - 1998. - No865. - P.309-322.




UNELE ASPECTE ALE PROCESELOR COGNITIVE ÎN DIABETUL ZAHARAT

Lidia COJOCARI

Universitatea de Stat din Tiraspol After an investigation, the result is that the cognitive disturbances in diabetes type I and II are determined by the

metabolic and morphofunctional vascular cerebral of a nuxed origin disturbances, when it is in type DZ I and the grade of the brain’s autoimmunization.

Omul contemporan este supus unui pericol de perturbări în funcţionarea statutului imun; procesele auto-

imune au sporit semnificativ viciile congenitale, maladiile metabolice, oncologice, alergice; au apărut un şir de boli genetic determinate care, în cele din urmă, determină şi diminuarea proceselor cognitive [1]. Astăzi putem afirma că echilibrul psihofiziologic este determinat de funcţionarea armonioasă a sistemului nervos central, a celui endocrin şi a celui imun, a căror afectare determină dezvoltarea unui şir de maladii [2], şi, nu în ultimul rând, diminuarea proceselor cognitive.

Actualmente, endocrinologii, imunologii şi psihofiziologii sunt preocupaţi de stabilirea metodelor şi pro-cedeelor de terapie a dereglărilor metabolice, care determină dereglarea proceselor cognitive.

Dereglarea metabolismului glucidic în organism nu se limitează doar la procesele distructive ale unui sau altui organ, dar afectează integru sistemele nervos central, imun, endocrin etc. şi, în general, întreg organismul. Aşadar, diabetul zaharat (DZ) a devenit astăzi o problemă medico-socială acută.

Este bine cunoscut că diabetul zaharat e una dintre maladiile cele mai larg răspândite în toate ţările lumii, indiferent de nivelul lor de dezvoltare socioeconomică, a cărei creştere înregistrează în fiecare an cote îngri-jorătoare, punând în alertă atât medicina contemporană, cât şi instituţiile abilitate de stat şi cele internaţionale. Cercetările recente pe plan mondial au realizat progrese importante în privinţa diagnosticului, fiziopatologiei şi tratamentului acestei maladii, sporind considerabil calitatea şi prelungirea vieţii bolnavilor diabetici [3].

Astăzi în lume sunt peste 150 milioane bolnavi de diabet zaharat, în cadrul ţărilor CSI – peste 5 milioane, în Moldova – peste 45 mii. Circa 5% din populaţie suferă de forma clinică a acestei maladii şi circa 10% – de forma subclinică [4-6]. În fiecare an numărul de cazuri diagnosticate constituie 6-10% în raport cu numărul total de bolnavi; deci, numărul bolnavilor de diabet zaharat se dublează în fiecare 10-15 ani [7].

Incidenţa mult crescută din ultimii ani a diabetului zaharat tip II reprezintă o adevărată „epidemie” la nivel global. Factorii determinanţi ai sporirii numărului bolnavilor de DZ sunt: schimbările demografice care duc la creşterea prevalenţei vârstnice (mai mult de 10% dintre persoanele peste 70 ani au diabet zaharat), modul de viaţă nesănătos (dieta bogată în calorii, hipodinamie), obezitatea, susceptiblitatea genetică crescută etc.

Diabetul zaharat, drept cauză a mortalităţii, este pe locul trei după bolile cardiovasculare. Mai mult, unii savanţi consideră că DZ constituie un teren favorabil pentru apariţia şi evoluţia diferitelor boli ale sistemelor cardiovascular, respirator etc. Pe de altă parte, succesele medicinii în tratarea acestei boli, mai ales folosirea insulinei, fac ca pacienţii cu diabet insulinodependent să supravieţuiască şi să se reproducă transmiţând însă predispoziţia către această boală generaţiilor următoare [8-11].

Toate acestea încă odată denotă că la etapa actuală diabetul zaharat este una dintre cele mai răspândite maladii de origine neinfecţioasă şi poartă caracter epidemic, ocupând locul 4-5 printre cauzele principale ce determină moartea bolnavilor în multe ţări dezvoltate şi în curs de dezvoltare.

Evaluarea medico-socială a diabetului zaharat se efectuează în baza sechelelor tardive în această maladie. O mare îngrijorare trezesc complicaţiile diabetice în sistemul cardiovascular şi cel nervos. Conform datelor din literatură, în diabetul zaharat mai frecvent se afectează vasele creierului, de trei ori sporeşte riscul dezvol-tării insultelor cerebrale [12-15].

Pe lângă polineuroangopatii, în diabetul zaharat foarte frecvent se înregistrează şi o aşa complicaţie numită encefalopatie, care stă la baza apariţiei dereglărilor proceselor cognitive. Afectarea encefalului este determinată de dereglarea metabolismului la nivelul ţesutului nervos, datorită diminuării conţinutului de glucoză şi defi-citului energetic la nivelul celulelor afectate. Encefalopatiile pot apărea drept consecinţă a afectării diabetice a vaselor sangvine sau în urma aterosclerozei de altă geneză, precum şi a acţiunii „moleculelor deosebite” – a radicalilor liberi, care prezintă unul dintre factorii principali în declanşarea spasmului îndelungat al vaselor cerebrale şi a edemului ţesutului cerebral [16-17]. Astfel, afectarea encefalului în DZ este consecinţa asocierii patologiilor dereglărilor vasculare şi metabolice.

22


Actualmente, există o gamă diversă de cercetări în domeniul complicaţiilor diabetice la bolnavii cu DZ [18]. În opinia noastră, rămâne în umbră studierea particularităţilor psihofiziologice la pacienţii cu diabet zaharat, şi anume: a proceselor cognitive.

Este cunoscut că hiperglicemiile îndelungate, frecvente şi grave, determină dereglări ireversibile de intelect. De asemenea, nivelul înalt de hemoglobină glicolizată acţionează nefavorabil asupra funcţiilor cognitive ale encefalului. Hiperglicemia cronică afectează atât vasele sangvine, cât şi sistemul nervos central şi periferic, ceea ce, în cele din urmă, determină diminuarea memoriei şi a capacităţilor de a învăţa [19].

În diabetologia contemporană, perturbările proceselor cognitive şi emoţionale sunt determinate de dereglări de hemodinamică şi neurofiziologice ale encefalului, care în DZ sunt atribuite encefalopatiilor diabetice [20].

Surplusul de zahăr determină tulburări metabolice şi la nivelul membranei celulelor nervoase, care deter-mină şi dereglări psihomotorii, diminuarea proceselor memorative şi a capacităţilor gândirii abstracte [21]. Rolul dereglărilor metabolismului glucidic şi diminuarea indicilor sănătăţii psihice, a proceselor cognitive este stabilit veridic. Însă, la etapa actuală lipsesc date ce ar reflecta particularităţile activităţii intelectuale în DZ tip I autoimun şi genetic determinat, ceea ce a şi condiţionat actualitatea studiului nostru.

Reieşind din cele relatate supra, ne-am propus ca obiectiv: evaluarea unor indici ai activităţii intelectuale la bolnavii cu diabet zaharat tip I şi tip II.

Unele particularităţi ale proceselor cognitive au fost apreciate în baza probei de corectură. Evaluarea probei s-a efectuat după modelul stabilit anterior. Testul includea mai multe rânduri de semne ale alfabetului latin alese arbitrar. Persoanele supuse investigaţiei trebuiau să sublinieze timp de 10 minute, peste fiecare 60 secunde, semnele propuse. Pentru o analiză calitativă a particularităţilor atenţiei s-a calculat coeficientul concentraţiei atenţiei (K); coeficientul stabilităţii atenţiei (V) şi viteza de prelucrare a informaţiei (C). S-a luat în consideraţie numărul de greşeli şi tempoul de îndeplinire a probei. O deosebită atenţie s-a acordat distribuirii greşelilor în timpul testării (dacă ele se distribuie uniform pe tabelul propus sau se înregistrează îndeosebi la sfârşitul testării în legătură cu epuizarea bolnavului). S-a luat în consideraţie, de asemenea, caracterul greşelilor: omiterea unor litere aparte sau rânduri, sublinierea altor semne, aflate alături sau la exterior, asemănătoare. Pentru unii bolnavi testarea s-a repetat, deoarece schimbarea rezultatelor poate viza nu numai modificarea stării bolnavului, dar şi atitudinea faţă de investigaţie.

În scopul estimării obiective a particularităţilor psihofiziologice, am convenit de a diviza subiecţii supuşi examinării în trei loturi: experimental I – bolnavi de diabet zaharat tip I, experimental II – bolnavi de diabet zaharat tip II şi martor – persoane practic sănătoase.

În investigaţii au fost incluşi 45 bolnavi de diabet zaharat, dintre care 35,19% de forma DZ tip I şi 64,42% – de forma DZ tip II; lotul martor l-au constituit 27 persoane sănătoase cu vârsta medie de 48,7±15,6 ani. Vârsta bolnavilor de diabet zaharat tip I în grup a fost în medie de 33,6±12,9 ani; durata maladiei – de 10,1±8,0 ani. Vârsta bolnavilor de diabet zaharat tip II în grup a fost în medie de 57,7±9,7 ani; durata maladiei – de 11,1±6,5 ani.

Rezultatele investigaţiilor au estimat la persoanele lotului experimental I cu diabet insulinodependent coeficientul mediu al concentraţiei atenţiei (K) diminuat 0,67±0,02 comparativ cu indicele insulinodependent la reprezentaţii lotului martor 0,91±0,03 (p<0,05). La persoanele din lotul experimental I s-a observat creş-terea numărului de greşeli către minutul 5-6 (0,64±0,04), ceea ce atestă la ei oboseală rapidă şi o diminuare vădită a concentraţiei atenţiei (Fig.1). La persoanele din lotul martor s-a observat comiterea minimă de greşeli, tempoul de îndeplinire a probei păstrându-se relativ stabil pe parcursul îndeplinirii probei; o diminuare neesenţială a activităţii s-a observat spre minutul 10 la 36,79% din reprezentanţii lotului martor de vârstă înaintată (61-74 ani).

Coeficientul stabilităţii atenţiei şi viteza de prelucrare a informaţiei denotă o tendinţă spre diminuare la reprezentanţii lotului experimental I. Coeficientul stabilităţii atenţiei (V) s-a estimat diminuat până la 164,79±12,19 comparativ cu indicele înregistrat la lotul martor – practic sănătoşi (219,48±14,58; p<0,01). Dacă stabilitatea atenţiei la lotul martor rămâne aproape neschimbată, fiind către minutul 10 al testării de 214,09±13,90, atunci la bolnavii lotului experimental s-a constatat asimetria atenţiei şi o diminuare bruscă în minutul 5-6 – până la 171,89±12,34, ceea ce atestă instaurarea unei oboseli şi diminuarea potenţialului de lucru. De asemenea, ţinem să menţionăm că viteza de prelucrare a informaţiei la persoanele incluse în lotul experimental I comparativ cu cei din lotul martor manifestă o tendinţă continuă spre diminuare, în minutul 10 fiind de 41,93±1,61 (media 46,89±2,14; p<0,02), ceea ce caracterizează creşterea oboselii. La persoanele din lotul martor acest indice s-a înregistrat sporit, în minutul 10 atingând valorile 64,50±2,02 (media 64,38±2,69), adică persoanele sănătoase

23



se includ în activitate mai rapid, astfel îmbunătăţindu-şi calitatea efectuării probei propuse. De obicei, persoanele sănătoase îndeplinesc însărcinările propuse timp de 6-8 minute, comiţând nu mai mult de 15 greşeli.

0

10

20

30

40

50

60

2 4 6 8 10 m

unitatiunităţi

in

C

K 0,77 0,75 0,64 0,63 0,58

48,951,95

47,88

43,72 41,93

Fig.1. Manifestarea unor indici cognitivi la reprezentanţii lotului experimental I.

Aşadar, la persoanele din lotul martor capacitatea intelectuală şi creativă rămâne intactă. La persoanele cu diabet zaharat tip I se constată o diminuare de 26,15% a proceselor cognitive faţă de parametrii înregistraţi la indivizii din lotul martor. De asemenea, s-a observat o oboseală sporită, atenţie instabilă, diminuarea capacită-ţilor de concentrare, precum şi diminuarea vitezei de prelucrare a informaţiei, ceea ce atestă o activitate intelectuală satisfăcătoare care este legată, considerăm, de durata evaluării DZ şi de compensaţia ineficientă a diabetului zaharat tip I, fapt pe care îl explicăm prin caracterul autoimun al maladiei şi prin afectarea nemijlocită a sis-temului nervos central.

Aceiaşi indici au fost evaluaţi şi la reprezentanţii lotului experimental II (Fig.2). La bolnavii cu diabet zaharat tip II coeficientul K în primele minute ale testării a înregistrat valorile 0,85±0,04, în minutul 6 o diminuare de 0,78±0,03, care s-a menţinut până la sfârşitul testării, în minutul 10 fiind de 0,71±0,06, ceea ce este cu 18,39% mai redus decât la reprezentanţii lotului martor în minutul 10. Indicele studiat la reprezentanţii lotului experi-mental I în minutul 10 s-a dovedit a fi diminuat cu 33,33%, ceea ce atestă o oboseală mai vădită la ei decât la bolnavii de diabet zaharat tip II; faptul îl argumentăm prin etiologia maladiei – ca dobândită fără afectarea autoimună.

0

10

20

30

40

50

60

70

K

C

min2 4 6 8 10

55,01 56,71 57,61 57,33 56,63

0,85 0,81 0,78 0,77 0,71

Unitatiunităţi

Fig.2. Manifestarea unor indici cognitivi la reprezentanţii lotului experimental II.

24


Coeficientul stabilităţii atenţiei pe parcursul testării în minutul 2 s-a încadrat în valorile 172,51±12,9, apoi s-a observat o îmbunătăţire a parametrilor studiaţi, în minutul 4 fiind de 195,04±14,48, în minutul 6 – de 207,49±11,33, iar spre sfârşitul testării, în minutul 10 – de 191,76±12,20, ceea ce este specific pentru activi-tatea intelectuală – creşterea oboselii şi diminuarea potenţialului de lucru.

De rând cu modificările cantitative, în probele testate intervin şi o serie de modificări calitative, privind scăderea capacităţii creatoare, oscilaţii ale atenţiei, confundarea unor semne etc. Simptomele subiective sunt dominate de apariţia unor senzaţii de slăbiciune, încordare, scăderea interesului şi dorinţei de a întrerupe acti-vitatea, cefalee, dureri în globii oculari etc.

Exprimarea modificărilor psihoemoţionale variază de la simptome neînsemnate: dispoziţie labilă, oboseală rapidă, diminuare a memoriei, tristeţe până la reacţii psihice grave şi îşi găsesc confirmare în studiul mai multor autori [15,16,20]. Astfel, dereglarea sferei psihoemoţionale variază foarte mult – de la 7,4 până la 70,2% din numărul bolnavilor diabetici.

Prin urmare, atât la reprezentanţii lotului experimental I, cât şi II s-a înregistrat creşterea oboselii şi dimi-nuarea potenţialului de lucru începând cu minutul 5-6. Tendinţa s-a evidenţiat până la finele testării. Însă, la bolnavii de diabet insulinodependenţi procesele cognitive sunt mai diminuate – 26,15% comparativ cu rezul-tatele grupului martor. La reprezentanţii lotului experimental II procesele cognitive la fel s-au dovedit a fi diminuate cu 12,3% faţă de indicii înregistraţi la persoanele sănătoase. Această diferenţă dintre loturile de bolnavi cu diabet zaharat tip I şi tip II o explicăm prin efectul toxic al glucozei în diabetul tip II la nivelul celulelor nervoase, concomitent cu efectul toxic al glucozei şi acţiunea autoimună asupra sistemului nervos central în diabetul tip I.

Prin urmare, la bolnavii de diabet s-a constatat epuizarea proceselor psihice de diferit grad de dificultate cu dereglări ale memoriei active predispuşi spre „slăbirea memoriei” cu sustragerea atenţiei; unii chiar devin iritaţi. Potenţialul rezervelor psihofiziologice la persoanele în vârstă şi de vârstă înaintată este epuizat.

Evaluând rezultatele individuale ale probei de corectură în cadrul lotului experimental I, s-a constatat: pentru pacienţii cu o formă avansată şi o durată de timp mai mare în evoluţia bolii sunt caracteristice activitatea psi-hică inertă, instaurarea rapidă a oboselii, diminuarea concentraţiei atenţiei şi a activităţii intelectuale care direct depinde de concentraţia de glucoză în sânge şi de caracterul atacant autoimun.

Particularităţile activităţii cognitive în diabetul zaharat nu pot servi drept criteriu de diagnostic subclinic, deoarece o diminuare mai vădită a proceselor cognitive poate fi constatată doar la persoanele cu o durată a hiperglicemiei mai îndelungată.

Conform datelor din literatură [6], printre primele simptome ale afectării creierului se înregistrează dimi-nuarea capacităţilor de muncă, slăbiciune generală, oboseală sporită, diminuarea memoriei, cefalee, ameţeală, instabilitate în timpul mersului, tulburarea somnului.

Atât în diabetul zaharat tip I, cât şi tip II, dereglările cognitive sunt determinate, presupunem, de afecţiunile morfofuncţionale vasculare cerebrale de origine mixtă, concomitent cu hiperglicemia şi gradul de autoimuni-zare a encefalului.

Prin urmare, am stabilit un grad divers al dereglărilor funcţiilor cognitive în DZ. La majoritatea bolnavilor incluşi în investigaţii s-au stabilit dereglări cognitive diminuate, ceea caracterizează diminuarea neînsemnată a memoriei, atenţiei, recepţionării, încetinirea gândirii care nu acţionează asupra adaptării sociale a pacienţilor.

Pe parcursul avansării maladiei, creşte timpul necesar pentru îndeplinirea sarcinilor intelectuale, diminuează concentrarea atenţiei, se dereglează memoria, apar dereglări emoţionale, cum ar fi apatia, neliniştea, iritabili-tatea. În stadiile de decompensare a DZ cu o durată îndelungată, dereglările memoriei se manifestă prin difi-cultăţi cognitive mai vădite, de cultivare a unor noi deprinderi şi aptitudini. Menţionăm, că diminuarea pro-ceselor cognitive nu atestă o patologie chiar şi pentru persoanele de vârstă înaintată. Modificările etative ale proceselor cognitive au loc la vârsta între 50 şi 65 ani, nu progresează în continuare, nu determină dificultăţi în activitatea cotidiană. Modificările etative ale memoriei sunt legate, în primul rând, de diminuarea con-centraţiei atenţiei. Pentru procesul fiziologic de îmbătrânire este specific mai mult afectarea memoriei auditiv-verbale şi mai puţin a celei vizuale. În afară de acestea, se mai constată diminuarea proceselor de gândire, creşterea duratei de răspuns la acţiunea diferiţilor excitanţi, diminuarea plasticităţii intelectuale, însă mai puţin faţă de cele constatate în diabetul zaharat.

În baza rezultatelor obţinute putem conchide că diminuarea proceselor cognitive în diabetul zaharat este determinată de afecţiunile morfofuncţionale vasculare şi celulare cerebrale, iniţiate de hiperglicemie concomitent cu gradul de autoimunizare a encefalului.

25



Referinţe:

1. Duda R. Sănătate, mediul ambiant şi responsabilitate ecologică // Medicina modernă. - 1996. - Vol.III. - Nr.11. 2. Mihaila I. Bazele ştiinţifice şi aplicaţiile ergonomiei. - Bucureşti: Editura Medicală, 2004, p.74-82. 3. Anestiade Z., Anestiade V., Fedaş V. Oportunităţi în diabetologia modernă // Materialele Congresului VI al fiziologilor

din Moldova cu participare internaţională. - Chişinău 2005, p.22-23. 4. Dumitrescu C., Perciun R. Diabetul zaharat – ghid practic. - Bucureşti: SAECULUM I.O., 2002, p.16-28. 5. Князев Ю.А., Никберг И.И. Сахарный диабет. - Москва: Медицина, 1989, с.8-25. 6. Чапова О.И., Болотова Н.В. и др. Особенности поражения ЦНС у детей при СД 1-ого типа // Проблемы эндо-

кринологии. (Россия). - 2006. - Т.52. - 1. - C.11-14. 7. Маловиченко А. Сахарный диабет. - Москва, 2001, с.176. 8. Aaslid R. Cerebral hemodynamics // Transcranial Doppler / Eds. D.W. Newell, R. Aaslid. - New-York: Raven, 1992. - 500 p. 9. Asini M.H., Walsh M.J. A practical guide to echocardiography. - London: Chapman & Hall Medical, 1995. - 260 p. 10. Caprio S., Wong S., Alberti K., King G. Cardiovascular complications of diabetes // Diabetologia. - 1997. No40. - P.

B78-B82. 11. Щербак А.В. Патология органов и систем при сахарном диабете. - Киев: Здоровье, 1989, с.140-146. 12. Caprio S., Wong S., Alberti K., King. G. Op. cit. 13. Ekbom T., Dahlof B., Hansson L. et al. Antihypertensive efficacy and side effects of three beta-blockers and a diuretic in

elderly hypertensives: a report from the STOP-Hypertension study // J. Hypertension. - 1992. - Vol.10. - P.1525-1530. 14. Joslin,s Diabetes Mellitus. Ed. by C.Ronald Kahn and Gordon C.Weir. 13 th ed. - Lea & Febiger, a Waverly Company, 1992. 15. Mincu I., Ionescu-Tîrgovişte C. şi al. Aspecte psihologice ale pacienţilor diabetici de tip I care prezintă episoade

hipoglicemice frecvente // Acta Diabetal. Rom. - 1990. - No.16. - P.34. 16. UKPDS Group: U.K // Ann. Intern. Med. - 1996. No124. - P.136-145. 17. Щербак А.В. Op. cit. 18. Чапова О.И., Болотова Н.В. и др. Op. cit. 19. Dunger D.B // Asta Paediatr., 1998, Suppl. 425, p.25-29. 20. Менделевичь В.Д. Клиническая медицинская психология. - Москва, 2002. 21. Mincu I., Ionescu-Tîrgovişte C. şi al. Op. cit.


26


ОСОБЕННОСТИ ЭКСКРЕЦИИ ПРОДУКТОВ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА

У СПОРТСМЕНОВ-ПЛОВЦОВ

О. ГАРАЕВА, Г.РЕДКОЗУБОВА

Институт физиологии и санокреатологии АН Молдовы Центр метрологии и аналитических методов исследования АН Молдовы Analiza comparativă a indicilor metabolismului azotat în urină a fost efectuată la 17 înotători tineri cu vârsta de

15-19 ani. Cercetările au fost executate prin metoda de cromatografie cu schimbi de ioni. Pentru analiză a fost colectată prima

urină de dimineaţă, care a fost prelucrată cu metoda ordinară. La înotătorii tineri s-a depistat hiperaminoacidurie fiziologică. S-au constatat modificări veridice ale conţinutului de

aminoacizi – atât individual cât şi în grupele lor funcţionale. Fapt ce dovedeşte modificările specifice ale spectrului amino-acizilor în urină la înotători. În articol este argumentată necesitatea controlului spectrului de aminoacizi în urină cu scopul efectuării la momentul oportun a măsurilor profilactice şi de reabilitare.

The authors carried out a comparative analysis of indexes in urine of 17 swimmers of 15-19 age old high qualification

on young donors of the same age. The research was realized by the ion exchange chromatography method. The first morning urine was selected for

analysis and was worked up by the method in general use. It was revealed the physiological hyperaminoaciduria of young swimmers. The ere reliable modifications of individual

and functional groups amino acids, with testify about specific amino acid specter peculiarities at them. There is based the authors arguments on fact of necessity of individual amino acid specter control of swimmers urine for timely realization of prophylactic and rehabilitating measures.

В основе процесса адаптации высокоорганизованного организма лежит формирование специфической

функциональной системы, компоненты которой обеспечиваются всеми видами обменных процессов [8]. Так, интенсивная длительная мышечная деятельность, в частности – спортивная, влияя на уровень азотистого обмена и содержание свободных аминокислот в плазме крови спортсменов [7], неизбежно отражается на уровне экскреции продуктов азотистого обмена.

В последние годы получила подтверждение необходимость индивидуального подхода к исследованию особенностей процессов адаптации [2; 10], что важно для прогностической оценки предела интенсив-ности тренировок и их влияния на гомеостаз [14]. Однако данные о конкретных изменениях содержания различных азотистых компонентов в моче спортсменов по сравнению с нормой, за исключением моче-вины [13], в доступной литературе практически отсутствуют.

Нами изучены показатели азотистого обмена (ПАО), в частности – содержание свободных аминокислот (САК) и конечных продуктов (мочевины и аммиака) в утренней моче 17 спортсменов-пловцов, юношей в возрасте 15-19 лет, имеющих квалификацию от 1 разряда до мастера спорта, через 3-е суток после по-следней тренировки, а также нетренированных юношей-доноров того же возраста. Калорийность питания соответствовала энергозатратам спортсменов, определялась их полом, возрастом и была постоянной.

Анализ образцов был проведен в лаборатории жидкостной хроматографии ЦМАМИ АН Молдовы на аминокислотном анализаторе ААА 339М. Полученные результаты сравнивали с соответствующими возрастными региональными нормами содержания ПАО в моче нетренированных юношей того же возраста, разработанными в данной лаборатории [4]. Для анализа брали среднюю порцию утренней мочи и исследовали еë согласно общепринятым методикам [5]. Аминокислоты определяли методом жидкостной ионообменной хроматографии [5].

Достоверность полученных результатов оценивали по t-критерию Стьюдента. Нами выявлено, что сумма ∑ПАО в моче обследованных спортсменов-пловцов по сравнению с нетре-

нированными юношами снижена в 1,4 раза, в то время как экскреция ∑САК повышена в 2,2 раза (рис.1).

27



Нетренированные юноши

4%

95,7%

Σ аминокислотмочевина + аммиак

Спортсмены-пловцы

87,2%

12,8%

Σ аминокислотмочевина + аммиак

Рис.1

При анализе уровня ∑САК отдельных функциональных групп выявлено, что у спортсменов этот показатель во всех случаях достоверно увеличен (рис.2).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

нетренированные

Рис.2

Наиболее значительно повышена экскреция серосодержащих аминокислот (в 2,9 раза). Выведение

протеиногенных аминокислот увеличено на 52,5%, в том числе: незаменимых – на 44,9%, заменимых – на 57,3%, а также иммуноактивных – на 20,3%, гликогенных и кетогенных – на 37,6% и 39,6% соответ-ственно.

Более подробный анализ аминокислотного спектра мочи спортсменов-пловцов выявил значительное повышение экскреции таурина (в 6,8 раза), аспарагиновой кислоты (в 4,1 раза), аспарагина (в 2,4 раза), цистеиновой кислоты (в 2,2 раза), метионина (в 2 раза), фенилаланина и лизина (в1,9 раза), γ-аминомас-ляной кислоты и гистидина (в 1,8 раза), а также глицина и этаноламина – на 38% (табл.1)

Обращает внимание факт усиленной экскреции из организма спортсменов аминокислот – маркеров обменных процессов соединительной ткани: оксипролина (в 6 раз) и пролина (в 2,7 раза). Коэффициент взаимосвязи между экскрецией пролина и оксипролина используется как индекс катаболизма колла-гена [21]; у спортсменов он составляет 0,15 и снижен в 2,5 раза по сравнению с таковым у нетрениро-ванных юношей (0,33). Высокий уровень оксипролина в моче и плазме крови у пловцов, отмеченный в нашем исследовании, коррелирует с повышенной секрецией остеокальцина [18].

юноши спортсмен ловы-п цы

Σ

заменимы

х АК

Σ

незаменимы

х АК

Σ

им

муноактивных АК

Σ

гликогенны

х АК

Σ

кетогенных АК

Σ

протеиногенных АК

Σ

серосодерж

ащих

АК

нетренированные юноши спортсмены-пловцы

28


Таблица 1 Сравнительное содержание свободных аминокислот и конечных продуктов

азотистого обмена в моче юношей-доноров и спортсменов-пловцов (15 - 19 лет), мкмоль/100мл

Аминокислоты Юноши-доноры Спортсмены-пловцы цистеиновая кислота 1,38 ± 0,15 2,97 ± 0,56* таурин 2,00 ± 0,25 13,53 ± 2,71* аспарагиновая кислота 0,45 ± 0,07 1,83 ± 0,33* гидроксипролин 2,55 ± 0,35 15,21 ± 3,80* треонин 2,30 ± 0,35 2,01 ± 0,42* серин 3,00 ± 0,55 4,36 ± 0,87* аспарагин 0,60 ± 0,11 1,44 ± 0,26* глутаминовая кислота 0,55 ± 0,09 0,59 ± 0,12 глутамин 6,50 ± 0,75 12,42 ± 2,11* α-аминоадипиновая кислота 0,35 ± 0,06 0,40 ± 0,06* пролин 0,85 ± 0,15 2,31 ± 0,37* глицин 9,50 ± 1,25 13,11 ± 1,84* аланин 3,00 ± 0,41 3,96 ± 0,71* цитруллин 0,30 ± 0,05 0,54 ± 0,11* α-аминомасляная кислота 0,28 ± 0,04 0,15 ± 0,03* валин 0,45 ± 0,07 0,46 ± 0,08 цистеин 3,00 ± 0,27 2,18 ± 0,35* метионин 0,40 ± 0,05 0,79 ± 0,11* цистатионин 0,30 ± 0,04 0,71 ± 0,16* изолейцин 0,60 ± 0,08 0,31 ± 0,05* лейцин 0,90 ± 0,15 0,52 ± 0,07* тирозин 1,13 ± 0,16 2,73 ± 0,52* фенилаланин 0,63 ± 0,09 1,20 ± 0,22* β-аланин 0,40 ± 0,06 0,44 ± 0,09 β-аминомасляная кислота 0,60 ± 0,08 0,38 ± 0,06* γ-аминомасляная кислота 0,20 ± 0,03 0,37 ± 0,09* этаноламин 1,00 ± 0,03 1,39 ± 0,29* орнитин 0,50 ± 0,06 0,21 ± 0,03* лизин 1,65 ± 0,21 3,12 ± 0,75* гистидин 9,50 ± 1,25 16,98 ± 3,40* 1-метилгистидин 2,00 ± 0,28 12,84 ± 3,47* 3-метилгистидин 1,50 ± 0,18 5,26 ± 1,52* аргинин 1,00 ± 0,12 0,95 ± 0,19 мочевина 1250,00 ± 125,51 850,93 ± 144,66* аммиак 32,50 ± 5,25 7,24 ± 1,16* Σ свободных аминокислот 57,85 ± 7,53 125,67 ± 27,65* Σ показатели азотистого обмена 1340,35 ± 136,55 983,85 ± 196,77* Σ заменимых аминокислот 28,58 ± 3,15 44,94 ± 7,26* Σ незаменимых аминокислот 18,18 ± 2,16 26,33 ± 5,84* Σ иммуноактивных аминокислот 14,30 ± 1,65 17,20 ± 3,30* Σ гликогенных аминокислот 18,70 ± 2,15 25,73 ± 4,14* Σ кетогенных аминокислот 5,65 ± 0,63 7,89 ± 1,68* Σ протеиногенных аминокислот 46,75 ± 5,33 71,27 ± 11,93* Σ серосодержащих аминокислот 7,08 ± 0,85 20,18 ± 3,83*

* Достоверные изменения (р ≤ 0,05).

29



В группе серосодержащих аминокислот, наряду с уже отмеченным выше увеличением экскреции таурина, цистеиновой кислоты, метионина и цистатионина, выявлено понижение выделения из орга-низма цистеина (на 27,3%). При определении цистеина в плазме крови этой же группы спортсменов-пловцов было установленное 5-кратное повышение цистеина по сравнению с группой юношей-доноров, что свидетельствует о накоплении этой аминокислоты в организме [4].

Достоверно повышено в моче пловцов содержание гистидина (1,8 раза) и промежуточных продуктов его обмена. Так, концентрация 1-метилгистидина увеличена в 6,4 раза, а 3-метилгистидина – в 3,5 раза. К 1-метилгистидинурии, отмеченной практически у всех пловцов, приводит, согласно данным литера-туры [19], недостаток витамина Е, что усиливает окислительные процессы в тканях скелетной мышцы. Кроме того, количество 3-метилгистидина в моче, образующегося при расщеплении актина и миозина, служит мерой деградации мышечных белков [1], а также может являться индикатором недостатка азота в организме [16].

Вместе с тем, содержание некоторых аминокислот в моче спортсменов снижено по сравнению с аналогичными показателями в моче нетренированных юношей. Так, снижена концентрация изолейцина и лейцина, соответственно, на 47,7% и 42,4%. При этом в плазме крови спортсменов их содержание также меньше нормы на 15,7% и 26,6% [4]. Известно, что эти САК играют важную роль в формиро-вании мышечной ткани, и дефицит изолейцина выражается в потере мышечной массы, поскольку он участвует в получении энергии за счет расщепления гликогена мышц.

Снижение экскреции изолейцина и лейцина, содержание которых снижено у спортсменов и в плазме крови [4], носит, вероятно, вторичный характер. Поскольку показано [17], что концентрация глутамина и аминокислот с разветвленной цепью (лейцин, изолейцин, валин) тесно коррелирует с физической работоспособностью, их недостаток не только в моче, но и в плазме крови можно считать прогности-ческим признаком утомляемости спортсмена или недостаточного восстановления его физической формы при интенсивных тренировочных нагрузках. Выявленный нами недостаток этих аминокислот в организме спортсменов-пловцов позволяет рекомендовать включение в их рацион бóльшего количества продуктов, содержащих изолейцин и лейцин, а также соответствующие композиции АК.

Пониженная концентрация в моче спортсменов орнитина (на 58,7%) и мочевины (на 31,9%) на фоне повышенной экскреции цитруллина (на 79,4%) соответствует пониженному содержанию их в плазме крови (на 40,9%, 80,5% и 10,0% соответственно), что свидетельствует об угнетении процесса образования мочевины и сопровождается повышением содержания аммиака в плазме в 2 раза [4] и снижением его в моче (в 4,5 раза). Кроме того, если в норме в моче коэффициент мочевина/NH3 составляет 38,5, то у пловцов этот коэффициент повышен в 3 раза и равен 115,5. Все эти факты свидетельствуют о значи-тельном накоплении аммиака в организме пловцов.

Отмеченная нами сниженная концентрация аминокислот с разветвленной цепью (за исключением валина) как в крови, так и в моче, также может быть одной из причин накопления аммиака в организме спортсменов [20].

Сниженное содержание мочевины в моче пловцов (в 1,5 раза) может быть связано с активным накоп-лением ее в почках с последующим возвращением в кровь для поддержания ее стабильного уровня в крови и других органах [13]. В литературе отмечена зависимость между направленностью белкового обмена и интенсивностью синтеза мочевины, содержанием ее в тканях и экскрецией: мочевина действует по принципу обратной связи, ингибируя катаболизм белков [6], что имеет место при постоянных физических нагрузках спортсменов. Повышенный её уровень в клетке подавляет свобод-норадикальные реакции и интенсивность перекисного окисления липидов, что дало основание отнести мочевину к категории эндогенных метаболических протекторов, осуществляющих адаптацию живых организмов к переносимости экстремальных воздействий и патогенетических факторов [6].

Адаптация организма к физическим нагрузкам характеризуется изменением содержания продуктов азотистого обмена не только в крови [7; 4], но и их экскрецией с мочой, что выявлено в нашем экспери-менте. Отмеченная нами гипераминоацидурия, вероятно, имеет почечное происхождение и связана с изменением реабсорбции САК в почках [1]. Повышенная проницаемость клубочковых мембран может быть вызвана снижением клубочкового кровотока, блокадой оттока мочи у спортсменов в условиях регулярных интенсивных тренировочных нагрузок [13; 14; 1]. У высокотренированных спортсменов отмечается нарушение функций желудочно-кишечного тракта, печени и почек, что является следствием ограниченного кровоснабжения этих органов в период длительной мышечной нагрузки [11; 12].

30


Кроме того, интенсивная мышечная деятельность ведет к некоторому угнетению протеолиза, физио-логическому нарушению соотношения между анаболическими и катаболическими процессами и усиле-нию катаболизма белков и других азотосодержащих соединений [13; 22]. Это, вероятно, и отражается в наблюдаемом нами у обследованных пловцов увеличении экскреции ∑САК. Действительно, по данным литературы даже через 48 часов после прекращения физической нагрузки скорость синтеза белка восстанавливается, а скорость его распада продолжает оставаться увеличенной [22].

На основании проведенного исследования и полученных результатов можно сделать следующие выводы. У спортсменов-пловцов по сравнению с нетренированными юношами выявлена физиологическая

гипераминоацидурия. Наиболее значительная экскреция протеиногенных и серосодержащих амино-кислот может дать представление о базовом уровне метаболизма у спортсменов высокой квалификации.

Значительное повышение выведения из организма глутамина и аминокислот с разветвленной цепью может служить прогностическим показателем перетренированности спортсменов и снижения их рабо-тоспособности.

Увеличение содержания в моче спортсменов пролина, оксипролина, гистидина и продуктов его обмена, а также повышенное выведение из организма протеиногенных и иммуноактивных аминокислот может свидетельствовать о вероятности развития у них патологических процессов. Так, у спортсменов установлена высокая заболеваемость аллергическими болезнями, индикаторами которых является изменение обмена гистидина и появление его метаболитов в крови и моче [15].

Для выявления степени изменения азотистого обмена у спортсменов необходим индивидуальный контроль аминокислотного профиля плазмы крови и мочи, что даст возможность своевременного про-ведения профилактических и реабилитационных мероприятий и определения оптимального уровня физических нагрузок.

Литература:

1. Березов И.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - Москва, 1998. 2. Волков Н.И. Закономерности биохимической адаптации в процессе спортивной тренировки. - Москва, 1986. 3. Гараева С.Н., Постолатий Г.В., Редкозубова Г.В. Особенности фонда свободных аминокислот в плазме крови

жителей Молдовы// Materialele Congresului al Fiziologilor din Moldova cu participare internaţională. - Chişinău, 2005, с.130-131.

4. Гараева О., Редкозубова Г. Особенности азотистого обмена у спортсменов-пловцов (в печати). 5. Козаренко Т.Д., Зуев С.Н., Муляр Н.Ф. Ионообменная хроматография аминокислот (теоретические основы и

практика). - Новосибирск, 1981. 6. Кричевская А.А., Лукаш А.И., Шугалей В.С., Бондаренко Т.И. Аминокислоты, их производные и регуляция

метаболизма. - Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1983. 7. Макарова Г.А., Алексанянц Г.Д., Локтев С.А. Морфологический состав крови и функциональное состояние

организма спортсменов. - Краснодар, 1992. 8. Павлов С.Е. Стресс. Адаптация. Спортивная тренировка// Спортивно-медицинская наука и практика на пороге

ХХI века. - Москва, 2000. 9. Павлов С.Е. Адаптация. - Москва, 2000. 10. Селуянов В.Н., Мякинченко Е.Б., Тураев В.Т. Биологические закономерности в планировании физической

подготовки спортсменов// Теория и практика физкультуры. - 1993. - 7. - С.29-33. 11. Солодков А.С., Сологуб Е.Б. Физиология спорта. - СПб, 1999. 12. Солодков А.С. Адаптация в спорте: состояние, проблемы, перспективы // Физиология человека. - 2000. - 26. -

С.87-93. 13. Усик С.В. Содержание мочевины в крови и органах при мышечной деятельности// Физиологический журнал

СССР. - 1976. - 1. - С.115-120. 14. Хмелева С.Н., Буреева А.А., Давыдов В.Ю., Васильев Н.Д. Адаптация к физическим нагрузкам и ее медико-

биологические характеристики у спортсменов циклических видов спорта// Теория и практика физкультуры. - 1997. - 4. - С.82-84.

15. Шартанова Н.В. Особенности клинико-иммунологических и аллергологических показателей в норме и при аллергопатологии у спортсменов высших достижений// Автореф. дисс… канд. мед. наук. - Москва, 2004.

16. Elia M. Clinical usefulness of urinary 3-methylhistidine excretion in indicating muscle protein breakdown // Br.Med.J. (Clin.Res. Ed.), 1981, 282, 6261, 351-354.

17. Feng Wei-quan. Характеристики обмена ряда аминокислот и спортивное питание. Развитие биохимии физи-ческой нагрузки // J.Beijing Univ. Phzs. Educ., 2000, 23, 3, 353-356.

31



18. Kaddam I.M. Comparison of serum osteocalcin with total and bone specific alkaline phosphatase and urinary hydroxyproline: creatinine ratio in patients with Paget, disease of bone // Ann.Clin. Biochem., 1994, 31, Pt 4, 327-330.

19. Long S.L. Urinary excretion of 3-methylhistidine: an assessment of muscle protein catabolism in adult normal subjects and during malnutrition, sepsis and skeletal trauma // Metabolism, 1981, 30, 8, 765-776.

20. MacLean D., Graham T., Saltin B. Branched-chain amino acids augment ammonia metabolism while attenuating protein breakdown during exercise // Amer.J. Physiol., 1994, 267, 6, Pt 1, 1010-1022.

21. Nusgens B., Lapiere C/M/ The relationship between proline and hydroxyproline urinary excretion in human as an index of collagen catabolism // Clin. Chim. Acta, 1973, 48, 2, 203-211.

22. Rennie M.J., Tipton K.D. Protein and amino acid metabolism during and after exercise and the effects of nutrition // Annu Rev. Nutr., vol.20, Palo Alto, 2000, 475-483.


32



SPECIFICUL BIOELECTRIC AL PROIECŢIEI MESAJELOR VISCERORECEPTIVE

ÎN CA1 HIPOCAMP ŞI ÎN SCOARŢA CEREBRALĂ LA IEPURI

Nina GUSCA, Vladimir ŞEPTIŢCHI, Galina MEDVEDEVA, Valentina NOVIŢCHI

Institutul de Fiziologie şi Sanocreatologie al AŞM The experiments implemented with the wakeful hares by use of electrophysiological techniques registered the

evoked potentials and EEG in CA1 hippocampus and the cerebral cortex produced as the result of gastric and intestinal interoceptive excitation. The results demonstrate that CA1 hippocampus represents a source – the generator of the interceptive projection but the stimulatory effect on the front, parietal and occipital areas of the cerebral cortex can generate electric discharges out of the hippocampus area. The potentials evoked initiated as the result of the interceptive messages effect contain a diffusion modality, can be mono- or bi-phases, differ by phase frequency and amplitude modifications in the function of the stimulus intensity and duration, threshold of sensitivity of the receptors and initially registered bioelectrical activity in the hippocampus and on the cerebral cortex. Agronomy as well as the encephalic mechanical damage of the reticular formation and administration of the pharmaceuticals agent (atropine, chlorpromazine) partially blocks but do nor impede the completers generation of the potentials evoked and the modification of EEG in hippocampus and the cerebral cortex, produced by the interceptors excitation, the fact that presumes that the intercept-tive excitations can be transported via the additional channels that also demands a specific examinations.

Conform clasificaţiei din [12], hipocampul (girul hipocampului) aparţine paleocortexului şi ocupă un loc

central în structurile acestuia. Unii autori [10,11,13,30] susţin opinia despre rolul de bază care îi aparţine hipocampului în procesele de motivare, organizare şi reglare a compartimentului – furie, anxietate, satisfacţie, reacţie de apărare. Totodată, existenţa conexiunilor cu sistemul limbic (scoarţa limbică, complexul amigda-lian, corpul mamilar) şi hipotalamusul dovedeşte că hipocampul receptează aferentaţia viscerală de origine interoceptivă, inclusiv mecanoceptivă, iniţiată în organele interne, şi participă în reglarea funcţiei lor [7,22,23]. Pe când, numeroasele traiectorii aferente de la paleocortex, îndreptate spre formaţiunea reticulară mezence-falică, demonstrează că activitatea hipocampului este strâns legată cu sistemul activator ascendent care, po-sibil, participă în plasarea impulsurilor viscerale spre hipocamp şi alte structuri ale sistemului limbic [4,11]. Astfel, activitatea funcţională a hipocampului este determinată nu numai de interacţiunile cu structurile sub-corticale ale creierului, dar şi de fluxul impulsurilor nervoase viscerale, inclusiv ale organelor digestive. În opinia unor autori [13,29], hipocampul, de rând cu alte structuri ale creierului visceral, contribuie la fondarea bazei fiziologice congenitale alimentare. Despre aceasta dovedesc datele conform cărora afectarea hipocam-pului provoacă diminuarea excitabilităţii centrului alimentar şi a celui de saturaţie localizat în hipotalamus, în urma cărui fapt animalele se istovesc şi pier. Cu toate că unele particularităţi funcţionale ale hipocampului deja s-au stabilit, specificul proiecţiei mesajelor interoceptive în hipocamp şi în scoarţa cerebrală, în special al celor condiţionate de stimulul receptorilor gastrici şi intestinali, până în prezent rămâne neclarificat.

În cele ce urmează expunem efectele stimulării receptorilor gastrointestinali şi ale influenţei impulsurilor aferente interoceptive asupra generării potenţialului evocat şi a activităţii bioelectrice în aria SA1 hipocamp şi pe cortexul cerebral. Faptul că hipocampul la iepuri, în comparaţie cu alte specii de mamifere, este mai spaţios ne-a determinat să efectuăm recentele cercetări.

Experienţele au fost efectuate pe 16 iepuri adulţi de rasă „Şinşila”, fiind în stare de veghe cu electrozi inseraţi în regiunea dorsală a hipocampului şi pe suprafaţa ariilor frontale, parietale şi occipitale ale cortexu-lui cerebral. Înregistrarea potenţialului evocat şi EEG asupra variaţiilor excitatorii ale potenţialului de mem-brană neuronală se execută în timpul stimulării mecanoceptorilor gastrointestinali şi în perioada manifestării în postacţiune a stimulului. După înlăturarea ţesutului muscular şi trepanarea osoasă a craniului se aspiră cortexul supracampal şi se descoperă suprafaţa albuie lucioasă a hipocampului dorsal. Electrozii activi din fir de argint sau platină cu diametrul de 0,2 mm, izolaţi pe tot traiectul, cu excepţia vârfului, au fost inseraţi pe suprafaţa hipocampului dorsal, apoi gaura craniului se acoperă cu vaselină încălzită. Pe suprafaţa cortexului electrozii au fost implantaţi stereotaxic şi fixaţi la craniu cu ciment dentar. Capătul liber se sudează la o piesă de legătură fixată de asemenea la craniu şi înglobată în acrilat. În timpul înregistrărilor se face contactul cu piesa de legătură fără a traumatiza animalul. Electrodul de referinţă a fost fixat pe linia mediană la nivelul

33


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 sinusului frontal, la aproximativ 10 mm în faţa suturii coronare. Potenţialele evocate primare se derivă din diverse puncte ale suprafeţei hipocampului dorsal. Controlul morfologic a confirmat poziţia electrozilor în regiunile vizate stereotaxic. Înregistrarea EEG şi a potenţialelor evocate primare a fost efectuată pe un electro-encefalograf cu 16 canale de tipul EEG-6-0,1M cu analizator, în derivaţii mono- şi bipolare, precum şi pe un oscilograf catodic H-105 cu amplificator de curent constant, având banda de trecere până la 2000 Hz. Analiza modificării potenţialelor evocate analoage ţinea în evidenţă existenţa lor, configuraţia, aspectul duratei şi ampli-tudinii şi, de asemenea, corelaţia cu reacţia stimulării receptorilor. Iniţial se înregistra tabloul de control, apoi se aplica stimulul receptorilor, a căror sensibilitate este asigurată de terminaţiile nervoase libere din parenchimul sau vasele sangvine ale organului receptiv. Intensitatea excitaţiei mecanoceptorilor prin gastrectazie era prestată prin introducerea aerului în balonul de cauciuc intercalat prin fistulă în stomac şi menţinerea tensiunii până la 10, 20, 30 mm col. Hg, iar în ansa izolată a intestinului subţire, respectiv, 40-65 mm col. Hg, indiferent de cantitatea aerului în balon. Intervalul dintre stimulanţi varia între 30-50 sec., în funcţie de aspectul răspunsului.

În condiţii fiziologice obişnuite potenţialul bioelectric înregistrat se caracterizează prin prezenţa undelor cu o frecvenţă de 8-13 c/s, amplitudine 20-70 μV, ritm de activitate diferit ce formează fondul de bază al electroencefalogramei. Stimularea efemeră cât mai îndelungată a mecanoceptorilor gastrici prin destinderea balonului introdus prin fistulă în stomac (20-30 mm col. Hg) sau în segmentul izolat al intestinului subţire (30-40 mm col. Hg) induce modificarea electroencefalogramei prin apariţia undelor teta şi oscilaţii ritmice alfa, răspândite difuz pe ariile cortexului şi structurile subcorticale, inclusiv hipocamp, şi formaţiunea reti-culară mezencefalică a trunchiului cerebral al creierului (Fig.1). Iniţierea activităţii bioelectrice în hipocamp prin manifestarea undelor cu frecvenţa de până la 7 c/s şi pe scoarţa cerebrală a undelor ritmice cu frecvenţa de 8-13 c/s amplitudine de 30-100 microvolt este observată şi de alţi autori prin excitaţiile visceroceptorilor de diversă origine (gustativi, olfactivi), precum şi în perioada activă de orientare a animalelor. În perspectivă, undele oscilatoare teta, observate în hipocamp, vor putea fi apreciate ca un filtru activ în selectarea informa-ţiei înregistrate [9]. Activitatea bioelectrică lentă apărută în hipocamp cu o perioadă latentă prelungită poate fi înregistrată în cursul gastrectaziei şi reprodusă sub formă de unde diminuate în postacţiunea excitaţiei me-canoceptorilor. Efectul favorizării activităţii bioelectrice lente întotdeauna se află în funcţie de intensitatea şi durata stimulării mecanoceptorilor gastrointestinali. Modificări tranzitorii deosebite ale activităţii bioelec-trice similare pot fi obţinute în ariile ţesutului cerebral şi în structurile subcorticale prin stimularea diverselor sisteme senzoriale (vizual, auditiv), obţinându-se potenţiale evocate caracteristice acestora [15,19]. Stimu-larea receptorilor gastrointestinali facilitează generarea descărcării electrice a neuronilor în hipocamp şi cortex la iepuri, pe când reluarea acesteia reduce intensitatea efectului, fapt ce presupune adaptarea lor faţă de stimul. Fenomenul de adaptare faţă de intensitatea diverselor excitaţii, atât viscero-, cât şi exteroceptivă, este observată şi de alţi autori [17,18].

Pe fondul activităţii exprimate prin descărcări electrice rapide, cu amplitudine semnificativă, indicatori ai stării de veghe, în hipocamp se înregistrează potenţiale evocate primare care reprezintă un complex de unde bifazice (pozitiv-negativ). Potenţialele evocate pot fi înregistrate atât în perioada acţiunii, cât şi postacţiunii stimulării mecanoceptorilor gastrici. Perioada latentă se află în funcţie de intensitatea şi durata gastrectaziei şi oscilează de la 2 până la 8 m/sec. Frecvenţa undelor înregistrate la începutul şi finele stimulării mecano-ceptorilor, precum şi reproducea lor în postacţiune se modifică de la 1 până la 35-50 c/s (Fig.2). Amplitudinea fazei pozitive oscila între 40-80 μV, durata de 40 m/sec., iar a celei negative deseori este mai semnificativă, atingând 340 μV, durata de 26,4 m/sec. În unele cazuri, amplitudinea componentului pozitiv varia între 40 şi 200 μV, iar a celui negativ – între 50 şi 250 μV. Amplitudinea potenţialelor evocate în diferite experienţe de asemenea este nestabilă. În urma apariţiei potenţialelor evocate se observă sporirea activităţii bioelectrice cu frecvenţa în hipocamp de 1-7, îndeosebi cu frecvenţa de 4-7 c/s. În unele experienţe, efectul excitaţiei mecanoceptorilor gastrici produce potenţial evocat de fază pozitivă, cu amplitudinea de până la 160 μV, durata de 6 m/sec.; ulterior, se iniţiază creşterea activităţii lente a electroencefalogramei. La iepurii înstăriţi reacţiile bioelectrice se modifică din cauza diminuării memoriei şi dereglării a-proteinchinazei localizate în neuronii hipocampului [30]. Cercetările realizate în [21] denotă că activarea receptorilor neuronali este con-diţionată de modificarea concentraţiei de calciu prin activarea proteinelor calciu-dependente şi calimodulinei intraneuronale a regiunii CA1 hipocamp. Datele din [2,5,6,27,28] demonstrează că ritm-teta, implicându-se activ în majorarea plasticităţii neuronilor hipocampului, totodată poate modifica efectul acţiunii impulsurilor aferente provocate de excitarea diferitelor câmpuri receptive.

34



Fig.1. Reacţia electroencefalografică a diverselor structuri corticale şi subcorticale în cursul şi postacţiunea stimulării mecanoceptorilor (A) şi ansei izolate a intestinului subţire (B).

Se remarcă alterarea de la starea activă la cea lentă iniţiată în cursul stimulării receptorilor şi reproducerea repetată a efectului în postacţiune.

35



Fig.2. A – Evoluţia potenţialelor evocate în hipocamp şi pe cortexul frontal, parietal şi occipital în perioada

stimulării mecanoceptorilor gastrici (30 mm col. Hg) şi a efectului în postacţiune. B – Modificarea frecvenţei EEG în timpul şi după stimularea mecanoceptorilor gastrici, exprimate în %. – perioada gastrectaziei, – efectul în postacţiune.

36



Potenţialele evocate produse de excitarea mecanoceptorilor gastrici şi înregistrate pe ariile scoarţei cere-brale posedă diversă formă, amplitudine şi durată. Valoarea perioadei de latenţă oscilează de la o modalitate la alta în funcţie de poziţia electrodului de înregistrare faţă de generatorul potenţialului evocat. Forma poten-ţialului evocat la nivelul cortexului este, în majoritatea cazurilor, bifazic (pozitiv-negativ), iar amplitudinea maximă nu depăşeşte câţiva milivolţi. În regiunea frontală a cortexului se înregistrează mai frecvent compo-nentul pozitiv al potenţialului evocat topic cu amplitudinea de 200 μV, durata de 50 m/sec.; ulterior, se modi-fică şi activitatea electroencefalogramei, creşte frecvenţa undelor lente. Devieri în iniţierea amplificării acti-vităţii neuronilor ariei frontale şi regiunii CA1 hipocamp sunt observate de asemenea în perioada excitaţiilor senzitive [3,9,20,31]. În regiunea parietală a cortexului se produc potenţiale evocate bifazice cu amplitudinea pozitivă de 160 μV, durata de 50 m/sec., iar cele negative, corespunzător, 80 μV, durata 60 m/sec. În regiunea occipitală a cortexului producerea componentului pozitiv al potenţialului evocat topic avea amplitudinea de 140 μV, durata de 60 m/sec. Modificarea biopotenţialului şi iniţierea undelor cu frecvenţă înaltă se înregis-trează pe scoarţa cerebrală, mai stabil în momentul stimulării mecanoceptorilor gastrici. Unii autori [28] denotă că frecvenţa teta-ritm poate fi iniţiată pe cortex independent de activitatea hipocampului. În cursul stimulării mecanoceptorilor gastrici şi alterării activităţii periodice înalte pe cortex se observă desincroni-zarea electroencefalogramei. În postacţiune efectul stimulării mecanoceptorilor, producerea potenţialului evocat, precum şi activitatea lentă a spectrului electroencefalogramei se reproduce clar, dar nestabil.

Datele experimentale au evaluat de asemenea şi existenţa unor particularităţi individuale ale modificării potenţialului bioelectric în hipocamp şi pe cortex la diferite animale. Una şi aceeaşi intensitate a excitaţiei receptorilor gastrici (30 mm col. Hg) produce diverse descărcări neuronale în hipocamp şi pe suprafaţa cor-texului cerebral la diferiţi iepuri (Fig.3A). În postacţiunea stimulării mecanoceptorilor se produc potenţiale evocate bifazice cu amplitudinea componentului pozitiv de aproximativ 160 μV, durata de 32 m/sec., şi a celui negativ – de120 μV, durata de 128 m/sec. În aria frontală şi parietală a cortexului adesea se observă potenţiale evocate cu amplitudinea de 80 μV, durata de 16 m/sec., iar în cea occipitală mai frecvent se înregistrează po-tenţiale evocate negative cu amplitudinea de 220 μV, durata de 16 m/sec. Diversitatea acestor descărcări bio-electrice poate fi condiţionată de particularităţile individuale ale animalelor, specificul şi reactivitatea celule-lor nervoase ale hipocampului şi cortexului, starea funcţională a câmpurilor receptive gastrice, precum şi de modularea informativă la nivelul diferitelor conexiuni neurale ale fluxului de impulsuri aferente interocep-tive. Neuronii hipocampului posedă însuşiri de a cizela similar impulsurile aferente şi la alte mamifere [3]. În postacţiunea stimulării receptorilor înregistrarea potenţialelor evocate în hipocamp şi în cortexul cerebral treptat dispare, rămânând să se observe desincronizarea electroencefalogramei şi a potenţialelor evocate diminuate cu durata de 80-900 m/sec. Astfel, excitarea interoceptorilor gastrici produce potenţiale evocate în hipocamp nestabile cu diverşi parametri, dependenţi de intensitatea excitării. Pe neocortex potenţialele evocate produse de stimularea receptorilor gastrici adesea sunt mascate, nestabile, cu diverşi parametri şi nu apar la orice stimulare a mecanoceptorilor. Noi am reuşit să înregistrăm potenţiale evocate pe suprafaţa ariilor corticale în 87% de experienţe, în celelalte cazuri producerea potenţialelor este mascată, iar stimularea mecanoceptorilor manifestă modificarea frecvenţei şi amplitudinii electroencefalogramei.

Un interes deosebit prezintă cercetarea specificului proiecţiei receptorilor gastrici şi a intestinului subţire prin stimularea de diversă intensitate a acestora. Rezultatele obţinute demonstrează că producerea potenţiale-lor evocate în hipocamp se înregistrează în limite largi de excitare a mecanoceptorilor gastrici şi ansei izolate a intestinului subţire (50-90 mm col. Hg), fiind condiţionate de intensitatea şi durata excitaţiei (Fig.3B). Din multiplele înregistrări, iniţierea potenţialelor evocate în hipocamp au fost observate în 83% din numărul lor, desincronizarea, apoi inhibiţia activităţii biopotenţialului electric. Diversitatea amplitudinii potenţialelor evocate înregistrate în hipocamp variază între 120-160 μV, durata de 40-90 m/sec. La un alt iepure, efectul sti-mulării mecanoceptorilor intestinului cu aceeaşi intensitate (70 mm col. Hg) condiţionează iniţierea potenţiale-lor evocate fotice în hipocamp cu amplitudinea de 380 μV, durata de 120 m/sec. Pe ariile cortexului, efectul stimulării mecanoceptorilor intestinului se caracterizează prin producerea potenţialului evocat cu amplitudi-nea de 20-60 μV durata de 10-12 m/sec., precum şi modificarea electroencefalogramei. În multe cazuri, pe suprafaţa cortexului potenţialele evocate practic sunt mascate. Intensificarea stimulării receptorilor poate cauza producerea în hipocamp a potenţialelor evocate lente, precum şi frecvenţe mono- sau bifazice. Stimula-rea supraliminală a receptorilor intestinali (80 mm col. Hg) iniţiază producerea potenţialului evocat şi desin-cronizarea electroencefalogramei cu trecerea la activitate lentă de 20-50 μV şi frecvenţă de 4-12 c/s a undelor

37


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 înregistrate. Studierea caracterului modificărilor reacţiilor bioelectrice a evaluat o dependenţă clară atât de starea funcţională iniţială a structurilor nervoase studiate, cât şi a câmpurilor de recepţie ale organelor digestive. Efecte mai stabile se înregistrează pe fonul relativ activ al acestora, modificându-se odată cu modificarea inten-sităţii stimulării receptorilor şi pe fonul iniţial al activităţii electrice a hipocampului şi al structurilor corticale.

Fig.3. A – Caracterul modificării reacţiei bioelectrice în hipocamp şi scoarţa cerebrală la iepurele nr.9. B – Potenţialele evocate în hipocamp în dependenţă de intensitatea stimulării mecanoceptorilor intestinului subţire.

Săgeţile indică momentul stimulării mecanoceptorilor gastrici (1,2) şi ansei izolate a intestinului subţire (2-5).

38



În continuarea acestor cercetări, noi am întreprins unele probe de a evalua importanţa căilor nervoase pa-rasimpatice în plasarea impulsurilor aferente interoceptive spre hipocamp şi cortexul cerebral. Analiza date-lor experimentale proprii demonstrează că vagotomia sau administrarea atropinei (150-600 mcg/kg), similar altor blocanţi ai receptorilor muscarinici, reduce activitatea sistemului nervos parasimpatic, produce unde bioelectrice lente asemănătoare cu cele din timpul somnului uşor şi face să crească în amplitudine potenţia-lele evocate în hipocamp. Sporirea dozei până la 0,5-3 mg/kg continuă progresiv să amplifice potenţialele evocate topice în hipocamp (Fig.4). În alte înregistrări efectuate, atropina în doze şi mai mari la fel face ca efectul să crească progresiv cu doza, bineînţeles, amplitudinea potenţialelor evocate în hipocamp se modifică, şi iniţiază potenţiale ample în ritm de 8-10 c/s (prin acţiunea inhibantă, sincronizată, bine cunoscută a acţiu-nii atropinei). În orice caz, atropina parţial a blocat, dar nu a împiedicat completamente potenţialele electrice produse prin excitarea mecanoceptorilor gastrici. Conform datelor din [16], blocada colinoceptorilor neuroni-lor CA1 hipocamp (galatamin), similar atropinei, reduce parţial sau semnificativ provoacă depolarizarea şi nivelul de acomodare la iepurii tineri şi la cei înstăriţi. Atropina de asemenea face să crească în amplitudine potenţialele evocate de pe ariile corticale, fapt explicat prin scoaterea din funcţiune, cu preselecţie, a sinapse-

lor colinergice inhibitorii, cu recep-tori postsinaptici muscarinici [2]. După doze mari, activitatea şi răspunsurile evocate nu sunt pro-fund alterate. Preparatul produce unde lente şi ample, dar fără să modifice comportamentul anima-lului. Pe de altă parte, atropina, administrată în prealabil, împiedi-că apariţia undelor lente şi a efec-telor de trezire pe EEG produse de acetilcolină. Conform datelor obţinute de F.Rinaldi (1955) şi V.Longo (1956), efectul atropinei nu este împiedicat prin secţionarea trunchiului cerebral la limita ros-trală a formaţiei reticulare, ceea ce demonstrează că tranziţia impulsu-rilor aferente interoceptive ocoleş-te aceste căi. La iepuri, acţiunea atropinei, în comparaţie cu alte preparate colinergice, este mai semnificativă [8,32]. De menţionat că atropina împiedică nu numai

apariţia undelor rapide ale substanţelor colinergice, dar şi ale celor adrenergice (adrenalină) la iepuri normali, precum şi cu secţiuni ale trunchiului cerebral [29]. Studierea relaţiilor dintre neo- şi paleocortex, inclusiv hipocamp, atestă că atropina induce unde lente în ambele formaţii corticale, dar suprimă balansul electric funcţional dintre aceste structuri, care în normă sunt opuse. Totodată, blocarea receptorilor muscarinici, când sunt administraţi în doze mari de atropină, ridică pragul de recepţie a gastrectaziei cu efecte de desincroni-zare a ariilor corticale, fapt confirmat la iepuri şi de alţi autori [8,14]. Efectul modificării reacţiei bioelectrice produs prin administrarea atropinei este semnificativ şi asamblat de modificarea latenţei excitării receptori-lor. Cu sporirea intensităţii de stimulare a receptorilor perioada latentă se reduce, efectul se pronunţă mai curând, iar în postreacţie devine mai prelungită. Aşadar, stimularea mecanoceptorilor gastrici în condiţiile blocadei traseelor preganglionare ale nervului vag face să apară în hipocamp şi pe cortexul cerebral potenţiale evocate cu amplitudinea destinsă şi multiple unde lente regulate similare ritmului teta şi delta. Conform datelor numeroşilor autori, neuronii colinergici care ar contribui la blocarea căilor aferente interoceptive există nu numai în structurile specifice, dar şi în motoneuronii ce secretă acetilcolină localizaţi în măduva trunchiului cerebral, în structurile subcorticale şi chiar în neuronii corticali (2-10%). Receptorii muscarinici,

20 m/sec.

20 m/sec.

20 m/sec.

20 min. După 1,5 mg atropină

(suprapuneri) 20 min. (suprapuneri) 20 min.

Fig.4. Potenţialele evocate fotic în hipocamp, înainte şi după atropină, doze totale (A), după 1,5 mg/kg (B), 2 mg/kg (C) şi 3,5 mg/kg (D). A distinge

amplificarea progresivă în paralel cu doza de atropină administrată a amplitudinii potenţialelor evocate.

39


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 ai acestor neuroni pot influenţa asupra generării proiecţiei specifice activităţii bioelectrice în hipocamp, prin sistemele inhibitorii ascendente ale cortexului şi căile aferente stabilite ca modulatori în transmiterea impul-surilor aferente interoceptive. Potrivit opiniei expuse de П.Богач (1961), Н.Беллер (1969), precum şi datelor din [8,24], doza-efect a administrării atropinei, observată la intensificarea stimulării mecanoceptorilor gastrici, demonstrează că influenţa aferentă iniţial pornită din organele digestive spre hipocamp şi structurile corticale poate fi transmisă nu numai pe nervii vegetativi, dar şi pe traiectorii lăturalnice-ocolite, cum ar fi fibrele nervoase aflate de-a lungul vaselor sangvine ale lanţului simpatic paravertebral, ganglionii extramurali ai cavităţii abdominale şi nervii simpatici, dar şi pe nervul hipogastric, glosofaringian şi al. Această viziune necesită confirmare experimentală.

Impulsurile aferente interoceptive, străbătând calea nervilor vegetativi până la ganglionul nervos, traver-sează celulele polineurale ale acestuia, străbat reţeaua polisinaptică ascendentă a formaţiei reticulare a trun-chiului cerebral pentru a ajunge la nucleele reticulare talamice şi a proiecta difuz mesajele interoceptive pe structurile subcorticale şi întreaga suprafaţă a scoarţei cerebrale [1,26]. E.Adrian constată că sistemul aferent nespecific din formaţiunea reticulară are o importanţă deosebită în plasarea excitaţiei, care pleacă de la re-ceptorii viscerali. Magoun (1950) dovedeşte că formaţia reticulară nu numai transmite, dar şi transformă im-pulsurile aferente viscerale specifice în nespecifice. Unii autori demonstrează că administrarea clorpromazi-nei ( 1,5-5 mg/kg), cu acţiuni predominante de liniştire şi deprimare a activităţii motorii, produce şi deprima-rea în mod selectiv a formaţiunii reticulare a trunchiului cerebral [1,7,27]. Datele noastre experimentale au demonstrat că afectarea mecanică a formaţiunii reticulare mezencefalice sau blocarea activităţii ei sub influ-enţa clorpromazinei modifică efectul stimulării mecanoceptorilor gastrici asupra reacţiilor bioelectrice în hipocamp şi cortexul cerebral. Datele cercetărilor mai directe vizând precizarea modificărilor pragului exci-taţiei receptorilor pentru a obţine devieri ale potenţialului evocat primar sunt tot atât de puţin concludente. Efectul stimulării acestora şi producerea potenţialului evocat în hipocamp sub influenţa clorpromazinei (1,5-2 mg/kg şi 3-6 mg/kg) semnificativ creşte. Durata efectului scade, fapt datorat acţiunii clorpromazinei care suprimă astfel componenţa umorală a reacţiei excitării interoceptive. Date dovedite şi prin împiedicarea completă a efectului stimulării interoceptorilor ce apare în mod normal. Majoritatea autorilor semnalizează că în timp ce creşterea pragului este adesea semnificativă; faptul care atrage atenţia este scăderea duratei perioadei de apariţie pe electroencefalogramă a reacţiei efective şi asupra pragului interoceptiv. Datele pri-vitor la modificările electroencefalografiei la iepuri, prin administrarea a 2-5 mg/kg de clorpromazină, se deosebesc prin producerea undelor lente, sub formă de cute separate de fază de alertă, mai ales când doza este mai mică (1-1,5 mg/kg). Favorizarea efectului stimulării interoceptorilor prin excitarea electrică a trun-chiului anterior al nervului vag (3-5 im/sec.) reduce durata iniţierii reacţiilor bioelectrice în hipocamp şi pe ariile scoarţei cerebrale, fapt ce dovedeşte că doza-efect a clorpromazinei (0,3 mg/kg şi 3,5 mg/kg) scade pragul formaţiunii şi la alţi iepuri experimentali. Cât priveşte acţiunea preparatului asupra amplitudinii po-tenţialelor evocate în hipocamp, acestea par a fi modificate în amplitudine, mai ales când sunt evocate prin stimuli suprapragali. Din cercetările noastre rezultă că potenţialele evocate fotic pe hipocamp, potenţiale a căror cale de propagare trece prin formaţia reticulară, sunt amplificate de clorpromazină. Dozele mici pot şi favoriza potenţialele evocate în hipocamp. Fenegranul amplifică apariţia undelor 8-10 c/s pe ariile cortexului consecutiv stimulării mecanoceptorilor, ceea ce demonstrează că acesta sprijină în mod activ unele mecanis-me ce acţionează asupra cortexului şi potenţialelor evocate primare în hipocamp, viziune susţinută şi în [25]. Necesită să mai amintim că multe din rezultatele discordante sunt condiţionate nu numai de dozele diverse, ci şi de sensibilitatea deosebită a animalelor faţă de clorpromazină. Conform datelor contemporane, rozătoarele, inclusiv iepurii, deţin formaţiunea reticulară mai sensibilă faţă de clorpromazină, fapt ce dovedeşte că ea îşi exercită acţiunea, probabil, predominant prin mecanisme periferice şi mult mai puţin prin mecanisme directe. După P.Bradley şi H.Magoun (1957), acest preparat ar deţine numai o acţiune asupra sinapselor între colate-ralele traseelor specifice de transmitere a impulsurilor interoceptive şi celulele formaţiunii trunchiului cere-bral. În baza experienţelor efectuate, în premieră concludem:

1. Aria SA1 hipocamp prezintă o sursă generatoare a proiecţiei aferente interoceptive declanşate din apa-ratul gastrointestinal. Prin conexiunile vaste cu sistemul limbic, inclusiv hipotalamusul, precum şi cu for-maţia reticulară, cortexul cerebral, hipocampul se implică în activitatea creierului şi, de rând cu alte funcţii specifice, generează potenţiale evocate produse de stimulii mecanoceptivi gastrici şi intestinali, contribuind la formarea mecanismelor neurale de reglare a activităţii fiziologice a organelor digestive.

40



2. Organizarea proiecţiei signalelor interoceptive gastrointestinale în hipocamp şi caracterul lor pe cor-texul cerebral deţin o modalitate de răspândire difuză, formă mono- sau bifazică (pozitiv-negativ) cu para-metri nestabili ai componentelor fazice, având durata şi perioada latentă în funcţie de intensitatea stimulului şi starea fiziologică a receptorilor, precum şi de activitatea bioelectrică iniţială în hipocamp şi pe cortexul cerebral. Potenţialele evocate se înregistrează, de regulă, în decursul gastrectaziei, pot fi modificate şi reluate în postacţiune şi diminua la întreruperea stimulului.

3. Vagotomia, lezarea formaţiunii reticulare mezencefalice a trunchiului cerebral, precum şi administrarea agenţilor farmacologici (atropina, clorpromazina), parţial blochează, dar nu împiedică completamente poten-ţialele evocate în hipocamp şi pe ariile cortexului cerebral, produse prin stimularea receptorilor gastrointesti-nali; totodată, presupune plasarea acestora şi pe traiectoriile dosnice, cum ar fi ganglionii extramurali, nervul hipogastric, glosofaringian şi al., fapt ce merită un studiu special.

Referinţe:

1. Анохин П.К. Биология и нейрофизиология условного рефлекса. - Москва, 1968. 2. Asaka, Mauldin K.N., Griffin A.L., Seager M.A. et al. Nonpharmacological ameliration of age-related learning

deficits: the impact of hippocampal theta-triggered trening // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - No102(37). - P.13284-13288.

3. Astikainen P., Ruusuvirta T., Korhonen T. Exp. Brain. Res. - 2005. - No160(2). - P.189-193. 4. Green J., Arduini A. 1954. Hippocampal electrical activity in arounsal // Neurophysiol. - 1957. - No17. - P.533-577. 5. Griffin A.L., AsakaY., Darling R.D., Berry S.D. Behav Neurosci. - 2004. - No118(2). - P.403-411. 6. Grifin A.L., Berry S.D. Inactivation of the anterior cingulate cortex impairs extinction of rabbit jaw movement

conditioning and prevents extinction-related inhibition of hippocampal activity // Learn Mem. - 2004. - No11(5). - P.604-610.

7. Гуска Н., Чебан Г. Влияние адекватного раздражения рецепторов желудка на электрические реакции гиппокампа. - В кн.: Физиология ядер головного мозга. - Кишинёв, 1970, c.69.

8. Гуска Н., Чебан Г. Влияние перерезки блуждающих и чревных нервов на электрические реакции гиппокампа, вызванные раздражением рецепторов органов пищеварения. Третья Всесоюзная конференция по физиологии вегетативной нервной системы. - Ереван, 1971, c.89.

9. Kichigina V.F. Mechanisms of the regulation and functional significance of the theta rhythm Zh Vyssh. Nerv. Deiat. Im. I.P. Pavlova. - 2004. - No54(1). - P.101-119.

10. Kopytova F.V. Spontaneous activity and rhythm assimilation reactions in baby rabbit hippocampal neurons during learning: ag-related characteristics // Neurosci. Behav. Physiol. - 2006. - No36 (3). - P.227-233.

11. Lissak K., Grastyan E. et al. Stady of hippocampal function in the waking end sliping whith chronically implanted electrodes // Acta psihiol. - 1957. - No6. - P.451-459.

12. Mac Lean P. The limbic system („Visceral brain”) end emotional behavior // Arch. Neuro. Psychiat. - 1955. - No73. - P.130.

13. Mac Lean P. Some psychiatric implications of physiological studies on frontotemporal portion of limbic system (visceral brain) // EEG and Clin. Neurophysiol. - 1952. - Vol.4. - P.407.

14. Moruzzi G. In brain mecanism and consciousness. A. Symposium. Blackwell, Oxford, 1954, p.21. 15. Pavlova I.V., Vanestian G.L. Activity of rabbit’s neocortical and hippocampal neurons in oriennting-exploratory

behavior and freezing // Ross. Fiziol. Zh. Im. I.M. Sechenova. - 2006. - No92(11). - P.1273-1284. 16. Oh M.M., Wu W.W., Pover J.M., Disterhoft J.F. // Neuroscience. - 2006. - No137(1). - P.113-123. 17. Пейпец Дж. Висцеральный мозг, его строение и связи. - В cб.: Ретикулярная формация мозга. - Москва, 1962. 18. Pietrzak B., Czarnecka E. Effect of combined administration of ethanol and tiagabine on rabbit EEG // Pharmacol.

Rep. - 2006. - No58(6). - P.890-899. 19. Polyanskii V.P., Evtikhin D.V., Socolov E.N. Reflection of an orienting reflex in the phases of evoked potentials in

the rabbit visual cortex and hippocampus during substitution of stimuls intensity // Neurosci. Behav. Physiol. - 2004. - No34(1). - P.19-28.

20. Polyanskii V.B., Evtikhin D.V., Socolov E.N. et al. Limited plasticity of difference neurons in the visual cortex and hippocampus in rabbits during the oddball test // Neurosci. Behav. Physiol. - 2006. - No36(5). - P.441-448.

21. Rycroft B.K., Gibb A.J. Regulation of single NMDA receptor channel activity by alpha-actin and calmodulin in rat hippocampal granule cells // J. Physiol. - 2004. - No15;557(Pt 3). - P.795-808.

22. Серков Ф.Н. Электрофизиология гиппокампа // Физиологический Журнал СССР. - 1966. Х11. - Вып.6. - C.56. 23. Серков Ф.Н. Вызванные потенциалы гиппокампа // Физиологический Журнал СССР. - 1966. - Т.111. - 6. 24. Серков Ф.Н., Братусь Н. В. Электрические реакции гиппокампа при рздражении блуждающего нерва. -

Москва: Наука, 1967.

41


Revist= [tiin\ific= a Universit=\ii de Stat din Moldova, 2007, nr.7 25. Сидоров Б., Франческоне В., Бертон Ф. Изменение нейронной возбудимости в срезах гиппокампа крысы,

изолированных после разрушения медиальной септальной области // Журнал ВНД. - 1991. - Т.4. - Вып.1. - С.131-138.

26. Судаков К.В. Афферентно и эфферентная активность в состоянии голода и после приёма пищи // Физио-логический Журнал СССР. - 1962. - Т.48. - 4. - С.72 - 734.

27. Sager O., Mareş A., Neştianu V. Formаţia reticulară. - Bucureşti, 1965. 28. Talk A., Kang E., Gabriel M. // Brain Res. - 2004 - No1015(1-2). - P.15-24. 29. Тартыгин Н.А. Влияние разрушения дорзального отдела гиппокампа на пищевые условные рефлексы //

Журнал Высшей Нервной Деятельности. - 1966. - 16. - С.203. 30. Van der Zee E.A., Palm I.F., O’Сonnor M. et al. Aging-related alterations in the distribution of Ca(2+)-dependent

PKC izoforms in rabbit hippocampus // Hippocampus. - 2004. - 14(7). - С.849-860. 31. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. - Москва, 1975. 32. Wanaverbeck N., Semyanov A., Pavlov I. Cholinergic axons modulate GABAergic signaling among hippocampal

interneurons via postsynaptic alpha 7 nicotinic receptors // J. Neurosci. - 2007. - No27(21). - P.2683-693.


42


РОЛЬ АУТОИММУННЫХ СВОЙСТВ МОЗГА В НАРУШЕНИИ

КОГНИТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

Лидия КОЖОКАРЬ

Тираспольский государственный университет În patogeneza autoimunizării creierului un rol aparte revine proteinelor encefalului, oligodendritelor, precum şi

dereglării proceselor metabolice ale proteinelor, lipidelor, stării barei hematoencefalice etc. Studiul proteinelor specifice ale creierului, antigenilor sistemului histocompatibilităţii HLA şi implicarea lor în reacţiile imunologice în studierea patologiilor creierului se află în legătură cu procesele autoimune şi presupunem că autoimunizarea encefalului prezintă un risc în diminuarea proceselor cognitive.

The brain’s autoimmune attack makes the process of the autoimmunization with an essential lesion especially of the

albumen, first of all having the intermediary role of the mutual reciprocal action of the oligodentrites between it and the neuroes. The appearance of the autoantigenes of the brain to the albumen causes disturbances of the brain’s physiological functions. In this way it lightens the process of learning and memorizing, which creates a limited risk of facilitation of the cognitive process.

Аутоиммунная патология характеризуется как атака иммунной системы против органов и тканей

собственного организма, в результате которой происходят их структурно-функциональные повреж-дения. Аутоиммунизация организма тесно связана с нарушением иммунной толерантности, состояния ареактивности иммунной системы по отношению к антигенам своих органов и тканей. Сущность аутоиммунных процессов заключается в том, что возникшие аутоантигены стимулируют синтез в иммунной системе аутоантител и формирование сенсибилизированных Т-лимфоцитов-киллеров, способных к агрессии против измененных и нормальных органов, вызывая повреждения печени, головного мозга, суставов, почек, сердца и других органов.

Не все клетки организма доступны иммунным клеткам, циркулирующим в крови. Некоторые отделены специальными барьерами: например, нейроны головного мозга – гематоэнцефалическим; клетки сперматогенеза, обеспечивающие образование сперматозоидов в яичках, – гематотестикулярным. Это связано с тем, что в процессе развития у некоторых клеток появляются белковые структуры (антигены), отсутствовавшие на момент рождения и в первые дни жизни, ранее не контактировавшие с иммунными клетками, поэтому на них может развиться иммунный ответ, то есть начнут вырабатываться антитела.

По этиопатогенезу аутоиммунную патологию подразделяют на первичную и вторичную. Ауто-иммунные болезни мозга являются первичными. Единой теории патогенеза аутоиммунных заболеваний в настоящее время не существует, однако аутоиммунный процесс довольно часто сочетается с другой аутоиммунной патологией, поэтому общность механизмов развития различной аутоиммунной патоло-гии подтверждает именно сочетанное течение многих аутоиммунных заболеваний. В регистрационном центре Всемирной организации здравоохранения нами изучена взаимосвязь антигенов HLA системы с большой группой заболеваний, в результате чего установлены положительные ассоциации антигенов HLA системы многих болезней, при некоторых настолько высокие, что это наталкиваeт на мысль о генотипическом факторе, ответственном за подверженность индивидуума аутоиммунному процессу.

Патогенез аутоиммунизации мозга сложный; предполагают, что под влиянием, например, вируса или группы вирусов развивается иммунопатологический процесс, приводящий к аутоиммунной реакции на антигены мозга, особенно на основной белок миелин [1]. Большое значение имеет и состояние миелинпродуцирующих клеток, прежде всего олигодендроцитов. Существенную роль в развитии иммунного процесса мозга играют также и нарушения в обмене белков, липидов, состояние гематоэн-цефалического барьера, свертывающей системы крови.

В результате аутоиммунного процесса появляется инфильтрация ткани мозга лимфоидными эле-ментами, разрушающими миелин. Реактивная пролиферация глиальных элементов (преимущественно астроглии) приводит к формированию характерных для рассеянного склероза бляшек, или глиозово-локнистых рубцов, в белом веществе различных отделов мозга. Выявлены положительные корреляции между рассеянным склерозом с локусами А3, В7DW2 главной системы гистосовместимости (HLA) на 6-й хромосоме [2].

43



Демиелинизированные аксоны очень чувствительны к любым изменениям гомеостаза. В диагностике аутоиммунной патологии мозга существенное значение имеет выявление антител к основному белку миелину и к мембранам клеток миелиновой оболочки, а также появление типичных очагов пониженной плотности при исследовании головного мозга ядерно-магнитным резонансом.

Миелин - ассоциированный гликопротеин, принадлежащий молекулам клеточной адгезии Этот белок экспрессируется на олигодендроглиоцитах и шванновских клетках (лимоцитах), образующих оболочки нервных волокон. Миелин является медиатором взаимодействий олигодендроглиоцитов между собой и с нейронами. При миелинизации аксонов он также обнаруживается на их внешних поверхностях и прилежащих поверхностях клеток, формирующих миелин.

Наиболее плодотворным при изучении белков мозга оказался направленный поиск белков, специ-фичных для нервной ткани. В подобных исследованиях велика роль методов современной иммунохимии, позволяющих с высокой избирательностью идентифицировать белки, локализовать их в различных отделах нервной системы, клетках и субклеточных структурах [3].

Заслуживает внимания то, что при использовании мозгоспецифичных антигенов обнаруживаются различия между некоторыми нервными и психическими заболеваниями. Так, при шизофрении анти-мозговые антитела обнаруживаются наиболее часто к белкам той фракции, к которой при рассеянном склерозе и боковом амиотрофическом склерозе антитела не выявляются или выявляются очень редко. При обследовании неврологических больных наиболее активная в иммунологических реакциях фракция оказывается неактивной у страдающих психозами, в частности – шизофренией. Такая избирательная активность сывороток крови больных нервными и психическими заболеваниями позволяет подойти к идентификации антигенов, участвующих в индукции аутоиммунных реакций при этих заболеваниях.

В последние годы внимание исследователей привлечено к системе антигенов гистосовместимости (HLA), играющих роль «барьера тканевой несовместимости» и определяющих предрасположенность к некоторым аутоиммунным заболеваниям. Структура комплекса HLA детерминируется генами, рас-положенными на 6-й паре хромосом человека. Следует считать доказанным, что локальная продукция интерферона – главного индуктора антигенов НLA-системы II класса – является решающим фактором развития органоспецифической аутоиммунной патологии, в частности – аутоиммунного поражения мозга, по поводу чего в настоящее время дискутируется связь с экспрессией только определенных антигенов системы HLA. Интерферон-гамма, действуя на клетку, стимулирует экспрессию антигенов гистосовместимости с последующей активацией Т-лимфоцитов, продуцирующих интерлейкин-1, который, в свою очередь, активирует резидентные макрофаги, секретирующие цитокинины, участвую-щие в атрезии клеток, трансформирует фактор роста, фактор некроза опухоли, фактор роста фибробластов, интерлейкин-1, интерферон и др. Постоянное, а не циклическое, как в физиологических условиях, освобождение цитокининов вовлекает в процесс все большее число клеток, способствуя формированию аутоиммунного процесса мозга.

Таким образом, одним из активно разрабатываемых в настоящее время аспектов иммуноневрологии является выделение мозговых, в том числе мозгоспецифических белков, изучение антигенов главной системы гистосовместимости НLA и возможностей их использования в иммунологических реакциях при изучении патологии мозга, связанной с аутоиммунными процессами. Интерес к белкам мозга особенно усилился в связи с тем, что они предположительно участвуют в основных функциях нервной ткани – генерации и проведении нервного импульса, синаптической передаче, установлении контакта между нервными клетками, в процессах обучения и памяти, а аутоиммунизация мозга, полагаем, соз-дает относительный риск нарушения когнитивных процессов, что является предметом наших даль-нейших исследований.


1. Аутеншлюс А.В., Иванова О.В. и др. Реакция лимфоцитов и гуморального иммунитета в ответ на мозгоспе-цифический белок у детей с патологией центральной нервной системой// Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. - 2002. - 102. - 12. - С.25-28.

2. Хондкарион О.А., Завалишин И.А. и др. Рассеянный склероз. - Москва, 1987, с. 132-133. 3. Мамытов М.М. Клиническое значение состояния иммунореактивности организма больных при хирургическом

лечении опухолей головного мозга: Автореф. дисс. … д-ра наук. - Киев, 1987.


44


ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ САДОВ НА СООБЩЕСТВА

РАСТЕНИЕОБИТАЮЩИХ КЛЕЩЕЙ В МОЛДОВЕ

Людмила КУЛИКОВА

Институт зоологии АН Молдовы Cercetările numeroase ale faunei acarienilor în cenozele de livadă din diferite zone naturale ale Moldovei au permis

de a evidenţia diversitatea specifică a acarienilor habitanţi pe plante. Lucrarea se bazează pe date obţinute după o metodă de colectare a materialului unificată. Diversitatea acarifaunei în biocenozele cercetate este reprezentată de 8 familii.

The acarian fauna researches in the garden cenosis of different natural regions of Moldova allow to emphasize the

species diversity of the acarians inhabiting the plants. The paper is based on data obtained after a unified method of material and samples collecting. The diversity of acarian fauna is reprezented by 8 families.

Клещи по количеству видов занимают второе место после насекомых, а по местообитаниям сопер-

ничают с ними. Акарологическая проблема возникла в Молдове, когда для борьбы с насекомыми в садах начали применять ДДТ, благоприятствующий дестабилизации фитосанитарной ситуации и нара-стающему размножению доминантных клещей-фитофагов [2;15]. Это объясняется снижением общей культуры земледелия, чрезмерной специализацией, возделыванием генетически однородных сортов. Изучение фитосанитарной и экологической обстановки в плодовых садах, расположенных в особых экологических зонах (близость источников водоснабжения, пансионатов, заповедных зон), позволило прийти к следующему выводу: несмотря на многолетнее применение различных пестицидов, видовой состав и плотность растениеобитающих клещей достаточно велики. Наибольшее число видов клещей-фитофагов установлено в промышленных садах. В садах не подвергаемых химической обработке или обрабатываемых минимальным количеством инсектицидов, выявлено наименьшее разнообразие клещей-фитофагов и наиболее представлены хищные клещи, относящиеся главным образом к семейству Phytoseiidae. Использование хищных клещей в интегрированной защите садов основывается на биоло-гических показателях динамики конкретных акарокомплексов и специфике доминирования популяций клещей-фитофагов. По формированию видового состава и динамике современного сообщества расте-ниеобитающих клещей в садах выявляется распространение отдельных таксонов и устанавливаются экологические процессы в Молдове.

Материал и методика Материал собран в плодовых промышленных и местного потребительского значения садах Молдовы.

Распределение и плотность клещей по площади сада и на деревьях устанавливались посредством отбора проб в 100 листьев. Оценка поражения паутинными клещами плодовых сортов проводилась тремя мето-дами: расчет процента поражения листьев, подсчет количества клещей на одном листе и из пятидесяти, на которых находилось пять и более клещей. В соответствии с одним из методов, под кроной 10 деревьев отбирали растительные образцы на площади 30 см [14]. Популяции растениеобитающих клещей учи-тывали подсчетом особей под микроскопом МБС-10. Математическая обработка данных проводилась с использованием индекса Shennon.

Результаты Основную часть мезофауны кроны плодовых деревьев составляют растениеобитающие клещи.

Наблюдения в течении 2000-2006 гг. позволили установить функционирование и формирование акаро-комплексов клещей в садах различия в плотности их популяций в зависимости от схем обработок и вида плодовых деревьев. Игнорирование процессов ухода за садом приводит к значительной деградации его агроценоза ввиду распространения растительноядных клещей и, как следствие, к значительным потерям сельскохозяйственной продукции.

45



В промышленных и местного потребительского значения садах зарегистрированы растениеобита-ющие клещи, относящиеся к 2 отрядам: Acariformes Zachvatkin, 1941 и Parasitiformes Reuter, 1909. Отметим, что именно промышленные сады имеют более контрастное распределение представителей внутри группы и со сдвигом в пользу более обычных, широко распространенных видов, в чем можно усматривать отрицательное влияние химической нагрузки на разнообразие видового состава акаро-комплексов сада.

В садах различных типов была установлена зависимость продолжительности существования от средней скорости роста численности популяций клещей. Каждому значению численности популяций клещей поставлено в соответствие значение логической функции – показатели корреляции от 0,0001 (широкораспространенные) до 9,3 (узкораспространенные). Посредством многофакторного анализа показано, что вариабельность хищных клещей в промышленных садах может быть обусловлена эколо-гическими факторами.

В промышленных садах большую роль играют клещи, свойственные конкретному саду в целом. Хищники представлены фитосеидными клещами, имеющими большое значение в качестве естественных врагов паутинных клещей. Семейство Phytoseiidae: Amblyseius andersoni – 1,31, A. finlandicus – 3,58, A. reductus – 2,33, Typhloctonus formosus – 6,41, Typhlodromus cotoneastri – 5,81, T. phialatus – 0,0003, T. pyri – 9,3, Anthoseius rhenanus – 1,45, Kampimodromus aberrans – 7,69, Phytoseius juvenis – 3,63 , P. echinus – 9,3. Вид семейства Stigmaeidae Zetzellia mali – 8,17. В составе доминантов клещей-фитофагов обнаружены представители семейств, занимающих зональное местообитание только в пределах сада. Tetranychidae: Panonychus citri – 0,002, P. ulmi – 0,035, Schizotetranychus pomeranzevi – 7,12, S. prunicola – 1,33, S. fraxini – 0,0004, Amphitetranychus viennensis – 0,123, Tetranychus urticae – 0,028; Tenuipalpidae: Cenopalpus pulcher – 0,002; Eriophyidaе: Eriophyes angro – 5,81, E. cochi – 1,76, Aculus schlechtendali – 0,004. Клещи-микофаги принадлежат к семействам Tarsonemidaе: Tarsonemus hermes – 0,002, T. lobus – 5,23, T. naegelie – 1,49, T. pallidus – 0,025, T. talpae – 2,85; Tydeidaе: Tydeus caudatus – 0,0001, T. californicus – 0,0001, T. devexus – 0,001, T. dignus – 0,001, T. kochi – 9,3, T. wainsteini – 6,41, Paralorryia ferula – 3,27, P. lena – 0,0003, Triophtydeus immanis – 3,63, T. flatus –- 5,23, Pronematus anconai – 5,25, P. sextoni – 2,85.

Виды хищных клещей в садах местного потребительского значения относятся к семействам Phytoseiidaе: Amblyseius finlandicus – 0,014, A. herbarius – 3,54, A. meridionalis – 3,54, A. meghriensis – 0,0003, A. reductus – 1,05, A. umbraticus – 0,0001, A. zwoelferi – 3,54, Typhloctonus formosus – 4,68, Typhlodromus cotoneastri – 4,68, T. pyri – 5,15, T. rodovae – 1,17, Anthoseius caudiglans – 0,0006, A. rhenanus – 1,17, Kampimodromus aberrans – 0,001, K. langei – 0,005, Phytoseius juvenis – 1,17, P. echinus – 0,148, P. salicis – 0,0001, Paraseiulus soleiger – 0,004, Metaseiulus longipilus – 0,0002 и Stigmaeidae: Zetzellia mali – 0,0004. Клещи-фитофаги принадлежат к семейству Tetranychidae: Panonychus ulmi – 0,059, Schizotetranychus prunicola – 4,68, S. fraxini – 4,21, S. uchidai – 3,54, Amphitetranychus viennensis – 1,98, Tetranychus lonicerae – 0,0003, Polynychus przhevalskii – 0,0009, Bryobia lonicerae – 0,0001, B. borealis – 3,54, B. ulmophila – 0,0001, B. redicorzevi – 0,012. Обнаружены семейства клещей-микофагов Tarsonemidae: Tarsonemus ellipticus – 3,54, T. floricolus – 3,54, T. naegelie – 1,87, T. pallidus – 0,016, T. piliger – 0,0002, T. talpae – 4,68, T. trapezoides – 0,0002; Pygmephoridae: – Siteroptes crossi – 3,54, S. hassi – 3,54; Tydeidae: Tydeus caudatus – 1,17, T. californicus – 0,003, T. devexus – 3,54, T. kochi – 1,17, T. placitus – 0,0003, T. praefatus – 0,0009, T. wainsteini – 2,92, Paralorryia mali – 1,17, Triophtydeus immanis – 1,87, T. flatus – 2,29, Lorryia reticulate – 3,54, L. pinnigera – 3,54, Pronematus rapidus – 0,002; Tenuipalpidae: Cenopalpus mespili – 1,68, C. piger – 3,54, C. pennatisetis – 0,0003, C. pulcher – 0,012, C. ruber – 0,01, C. populi – 3,54 [9, 12].

Конкретные типы садов характеризуются определенными особенностями видового состава расте-ниеобитающих клещей и их стабильностью. Неблагоприятные климатические условия в садах угрожают гомеостазу цитоплазмы, нарушают нормальное функционирование ферментов и целостность мембран. В научной литературе обсуждается частота возмущений и интенсивность неблагоприятных факторов [10, 11]. Многолетними исследованиями садов установлено, что сезонная динамика популяций расте-ниеобитающих клещей объясняется изменениями концентрации танинов (как защитных веществ), воды и белка (как питательного вещества) в листьях [1]. Повреждения клещами листьев вызывают изменения обмена веществ в них: снижается количество сахаров, сахарозы и крахмала, метаболическое превращение азота в листьях. Некоторые клещи устойчивы при температуре воздуха +30 градусов и

46

Seria “tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735 относительной влажности 80%. Ежедневная пищевая потребность хищных клещей составляет 5 взрослых паутинных клещей или приблизительно 20 нимф или яиц [10, 13, 16]. Способность хищных клещей к равномерному распределению и использование в качестве пищи также сока растений делает их одним из наиболее эффективных хищников клещей-фитофагов. Хищных клещей (Amblyseius andersoni, A. finlandicus, Typhloctonus formosus, Typhlodromus cotoneastri, T. pyri, Anthoseius rhenanus, Kampimodromus aberrans, Phytoseius juvenis, P. echinus) применяют для профилактики массового размножения паутинных клещей или после обнаружения первых признаков повреждения растений, что позволяет выбрать тактику биологической борьбы с клещами-фитофагами в садах. Для популяций клещей с развитым территориальным поведением при ограниченности ресурса характерна межвидовая конкуренция, в результате которой происходит вымирание наименее приспособленной части популяции [3, 4, 5, 7]. Конкуренция благоприятствует первоначальной плотности клещей, приводящей к популяционной стабильности, а не финальной плотности неполовозрелых особей с тенденцией к краху. Группу фоновых видов клещей-фитофагов составляют общие для всех выборок представители, за некоторым исключе-нием, которые обычно встречаются в материалах по всем зонам Молдовы. Сравнивая выборки по показателю встречаемости, можно определить основной состав практически значимых видов клещей. Общими фоновыми видами являются: Panonychus citri, P. ulmi, Schizotetranychus pomeranzevi, S. prunicola, S. fraxini, Tetranychus urticae, Amphitetranychus viennensis, Cenopalpus pulcher, Eriophyes angro, E. cochi, Aculus schlechtendali, Tydeus californicus, T. caudatus. Особенностью является выдви-жение нескольких ранее менее заметных видов на ведущие роли, в связи с их менее негативной реак-цией на химический пресс агроценозов - Schizotetranychus pomeranzevi, S. prunicola, S. fraxini. Два по-следних вида – микофаги, характерны для стаций с хорошо выраженной влажностью (поливные сады).

Анализ материала выявил существенные различия в видовом составе растениеобитающих клещей в садах потребительского значения и промышленных. Фаунистический комплекс растениеобитающих клещей в садах местного потребительского значения представлен видами с широким спектром жизненных форм, различающимися питанием и циклами развития. Одной из постоянных черт акарокомп-лексов является довольно установившийся состав растениеобитающих видов клещей. Формируются они с некоторым акцентом на эвритопные, лесные биоценозы. Наиболее многочисленно в садах местного потребительского значения представлены хищные клещи (Phytoseiidae – 20 видов, Stigmaeidae – 1 вид) и микофаги (Tarsonemidae – 7 видов, Pygmephoridae – 2 вида, Tydeidae – 13 видов, Tenuipalpidae – 6 видов). Отмечено также присутствие в акарокомплексе сада представителей семейств Pygmephoridae, Tydeidae, Tarsonemidae, свойственных лесным биоценозам, что отражается на характере трофической структуры комплекса акарофауны садов местного потребительского значения.

Изменения в составе представителей акарокомплекса индуцированы постоянными сдвигами в тех-нологии агрокультуры сада, основными из которых является использование широкого спектра ядови-тых веществ, специализированных против членистоногих вредителей.

На основании изучения акарокомплексов в плодовых садах можно сделать следующий вывод: уве-личению численности видов хищных клещей и снижению численности клещей-фитофагов способствуют видовой состав и ассортимент сортов (английские спуры и молдавские) плодовых растений [6, 8]. Основным промышленным видом в садах Молдовы является яблоня, представленная ранне-, средне- и позднесозревающими сортами.

Отмечены значительные расхождения в видовом составе, изменении плодовитости и численности популяций растениеобитающих клещей при их питании на разных сортах. Это обусловлено особен-ностями анатомического строения листьев, толщиной кутикулы и мезофилла, прежде всего палисадного, наличием опушения и железистых волосков и тому подобное. Несмотря на большое разнообразие изу-ченных сортов яблони, абсолютно устойчивых к растениеобитающим клещам не обнаружено. Изучение степени устойчивости сортов яблони (наиболее распространенных) к клещам при естественном зара-жении позволило условно разделить их на 4 группы:

1. Сильноповреждаемые сорта: Бельфлер желтый, Банан зимний, Джонатан, Кальвиль белый, Кальвиль снежный, Красный синап, Макинтош, Пармен зимний золотой, Пепин лондонский, Ренет шампанский, Ренет Симиренко, Рихард делишес, Шафран летний, Штетинское красное.

2. Среднеповреждаемые сорта: Антоновка обыкновенная, Астраханское белое, Бельфлер китайский, Вагнер призовое, Домнешты, Красная тиролька, Папировка, Ренет серый французский, Цыганка молдавская.

47



3. Слабоповреждаемые сорта: Апорт, Виргинское розовое, Мантуанское, Ренет анисовый, Синап Мичурина, Шафран московский.

4. Очень слабоповреждаемые сорта, или относительно устойчивые сорта: Вильямс, Кандиль - синап, Мелба, Пепинка литовская, Слава победителям.

Формирование сообществ клещей начинается на ранне- и среднесозревающих сортах, в отличие от позднесозревающих, что уберегает последних от сильного повреждения клещами-фитофагами.

У тетраниховых клещей (Amphitetranychus viennensis, Tetranychus urticae, Panonychus ulmi, Bryobia redikorzevi) в большей или меньшей степени выражена тенденция к заселению ранних сортов с опушен-ными листьями. Численность их на ранних сортах яблони постепенно нарастает до конца июня. В августе, когда прекращаются обработки пестицидами ввиду сбора урожая, количество клещей вновь увеличивается. В октябре-ноябре клещи уходят на зимовку. Определенный период диапаузы отмечается зимой. С началом весенней вегетации отмечается увеличение численности клещей, что продолжается до конца первой декады июня, затем наступает спад.

Плодовые сады, междурядья которых засеяны покровными культурами (клевер, вика и др.), харак-теризуются меньшей степенью поврежденности листьев и плодов растительноядными клещами, много-численностью хищных видов, усиливающих биологический контроль клещей-фитофагов. Клещи-энтомофаги позволяют предотвратить выход численности клещей-фитофагов за порог экономической вредоносности (плотность популяции 1:7).

Классификация сортов яблони, на наш взгляд, дает возможность в дальнейшем дифференцированно проводить борьбу с клещами-фитофагами в зависимости от степени заражения сортов в садах. Необхо-димо наладить постоянное обеспечение аграриев всех форм хозяйствования научно обоснованными прогнозами и конкретными рекомендациями по преодолению негативных последствий, связанных с клещами-фитофагами. Это позволит хозяйствам намного снизить затраты на обработку сада, значи-тельно сократить сроки проведения опрыскиваний.

Выводы 1. Выявлена структура растениеобитающих клещей в ценозах плодовых садов. В промышленных

садах обнаружены представители семейств: Phytoseiidae – 11 видов, Tydeidae – 12 видов, Tetranychidae – 7 видов, Stigmaeidae – 1 вид, Tarsonemidae – 5 видов, Tenuipalpidae – 1 вид, Eriophyidae – 3 вида. В садах местного потребительского значения обнаружены: Phytoseiidae – 20 видов, Stigmaeidae – 1 вид, Tetranychidae – 11 видов, Tarsonemidae – 7 видов, Pygmephoridae – 2 вида, Tydeidae – 13 видов, Tenuipalpidae – 6 видов.

2. Общими фоновыми видами являются: Panonychus citri, P. ulmi, Schizotetranychus pomeranzevi, S. prunicola, S. fraxini, Tetranychus urticae, Amphitetranychus viennensis, Cenopalpus pulcher, Eriophyes angro, E. cochi, Aculus schlechtendali, Tydeus californicus, T. caudatus. Регулирование численности клещей-фитофагов служит основой для дальнейшей разработки приемов практической оптимизации садовых биоценозов при создании управляемых экосистем. Данная оптимизация способствует разра-ботке практических методов эффективного использования энтомофагов и критериев прогноза чис-ленности клещей-фитофагов.

3. Увеличению числа видов хищных клещей и снижению клещей-фитофагов способствуют видовой состав клещей и ассортимент сортов фруктовых насаждений. Формирование сообществ клещей начина-ется на ранне- и среднесозревающих сортах, в отличие от позднесозревающих, что уберегает последних от сильного повреждения клещами-фитофагами.

Литература

1. Арутюнян Э., Давтяк В., Михаелян Т. Физиологическая сущность повреждения яблони клещом Metsteranychus ulmi Koch, 1836 (Acarina: Tetranychidae Donn., 1878) // Биологический журнал Армении. - 1988. - Т.41. - 8. - С.687-691.

2. Заянчкаускас П. Некоторые принципы биологического регулирования насекомых в биоценозах садовых насаж-дений // Материалы Пленума научного совещания по проблеме «Биологические основы освоения, реконструк-ции и охраны животного мира». - Вильнюс, 1987, с.61-75.

3. Куликова Л. Акарокомплекс плодовых садов Молдавии // Физические, химические и математические методы в современной биологии: Материалы конф. молодых ученых. - Кишинев, 1987, c.82-83.

48

Seria “tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735 4. Куликова Л. Стациальное распределение растениеобитающих клещей// Фауна антропогенного ландшафта

Молдавии. - Кишинев, 1989, c. 44-45. 5. Куликова Л. Акароценоз плодовых садов Молдавии// Успехи энтомологии в СССР. Экология и фаунистика.

Отряды членистоногих. Материалы Х съезда Всесоюзного энтомологического общества. 11 - 15 сент. 1989. -СПб., 1994, т.3, c.51-52.

6. Culicova L. Acarienii-fitofagi dăunătorii livezilor fructifere în Moldova. - Chişinău, 1997, р.1-20. 7. Culicova L. Particularităţiile structurii complexului acarian în livada de mere// Protecţia integrată a plantelor: Realizări

şi probleme. Simpozionul Internaţional. Chişinău, 2 - 4 octombrie, 2000. - Chişinău, 2000, p.140-141. 8. Куликова Л. Значение стаций для акарофауны Молдовы// Diversitatea, valorificarea raţională şi protecţia lumii

animale. IV conf. Zoologilor din Republica Moldova. - Chişinău, 2001, p.166-167. 9. Куликова Л. Обзор фауны растениеобитающих клещей Молдовы // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat

din Moldova. Seria „Ştiinţe chimico-biologice”. - Chişinău, 2005, c.174-177. 10. Altieri M., Linda S. Манипуляция покровными культурами в яблоневых садах и на виноградниках на севере

Калифорнии: влияние на сообщества членистоногих. Cover crop manipulation in Northern California orchards and vineyards: affects on arthropod communities // Biological Agriculture and Horticultura. - 1985. - Vol.3. - No1. -P.1-24.

11. Dicke M., Sabelis M. Как растения привлекают хищных клещей в качестве телохранителей. How plants obtain predatory mites as body guards // Proc. 18th Int. Congr. Entomol. - Vancouver, 1988, p.183.

12. Chant D. Систематика и таксономия [клещей семейства Phytoseiidae]. Systematics and taxonomy// Spider mites Biol. Natur. Enemies and Contr. - Amsterdam. - 1985. - Vol.1b. - P.17-29.

13. Karg W. Значение и возможность применения хищных клещей-олигофагов в садоводстве. Bedeutung und Einsatzmoglichkeiten oligophager Raubmilben im Gartenbau Taspo-Mag. 1991. - Vol. 18. - No3. - P.14-16.

14. Nachman G. Mетоды учета [хищных клещей]. Sampling technigues // Spider mites Biol. Natur. Enemies and Contr. - Amsterdam. - 1985. - Vol.1b. P.175-182.

15. Southwood T. R. Среда обитания и биология насекомых. Habitat and insect biology // Bull. Entomology Soc. Amer. - 1987. - Vol.33. - Nr.4. - C.211-214.

16. Suski Z. Клещи семейства Tarsonemidae на яблонях в Польше. Лабораторные исследования биологии не-cкольких видов клещей семейства Tarsonemidae. Tarsonemid mites on apple frees in Poland. X. Laboratory studies on the biology of certain mite species of the family Tarsonemidae (Acarina, Heterostigmata) // Zesz. Probl. Postepow. Nauk rol. - 1972. - No129. - P.111-137.


49



ELABORAREA PROCEDEULUI DE EXTRAGERE A HELIANTININEI

DIN SEMINŢELE DE FLOAREA-SOARELUI

Maria DUCA, Natalia LAPTEVA*, Alexei LEVIŢCHI

LCŞ „Securitate Biologică” *LCŞ “Biochimia Proteinelor” The necessity of elaboration of a rapid method of helianthinin extract obtaining from a single seed is determined by

the aim of individual analysis of homogeneity / polymorphism in sunflower populations. Thus, all the stages of the procedure should assure good quality of extracted protein and a sufficient protein quantity for several electrophoretic analyses and, besides, should to be easy in handling for a huge amount of samplings at hundred order.

Examinând problema privind proteinele de rezervă ale florii-soarelui, cercetătorii au ajuns al concluzia că

acestea pot servi drept parametri calitativi utili în descrieri individuale, populaţionale, speciale etc [1,2]. Aplicarea pe larg a acestor proteine în cercetări în calitate de parametri biochimici este determinată de simplitatea relativă de a lucra cu ele şi de preţul relativ scăzut al implementării metodei [3].

Procedeul se bazează pe tehnici de biochimie vegetală şi poate fi utilizat în agricultură pentru determinarea purităţii genetice a liniilor cosangvinizate de floarea-soarelui, calculată în baza spectrelor electroforetice ale heliantininei. La baza elaborării au stat lucrările efectuate de către Anisimova et al. [4,5], care utilizează metoda de extragere a heliantininei elaborate de ei pentru determinarea purităţii genetice a liniilor şi identificarea genotipurilor, precum şi lucrările lui Vaintraub şi Lapteva [6], Artâcov [7], care au elaborat o metodă de extragere şi purificare a extractului de heliantinină. Pentru realizarea design-ului extragerii şi purificării helian-tininei au fost combinate diferite etape ale ambelor metode.

Heliantinina, proteina de rezervă majoră a florii-soarelui, este reprezentată de o globulină oligomeră. Masa moleculară determinată de cercetători prin metode diferite constituie 300-305 kDa [8,9]. După carac-teristicile hidrodinamice, forma moleculei nu este sferică. La electroforeză, în condiţii denaturante, aceasta se caracterizează prin apariţia unei serii de polipeptide cu masa moleculară între 20-40 kDa, la al căror nivel poate fi pus în evidenţă polimorfismul sau uniformitatea seminţelor genotipului analizat [5].

Material şi metode Analiza individuală a fost efectuată asupra seminţelor decojate prealabil care fac parte din diferite geno-

tipuri de floarea-soarelui, oferite de către AŞP „Magroselect” SRL (or.Soroca), în persoana dr.hab. T. Rotaru. Seminţele se află în perioada de repaos fiziologic, fiind păstrate şi uscate. Seminţele se decojau în prealabil.

Analiza electroforetică a fost efectuată în baza metodei elaborate de Laemmli [10]. Concentraţia gelului de poliacrilamidă (GPAA) a fost de 12 şi 14%. După electroforeză, gelul a fost plasat în soluţia de fixare şi apoi colorat în soluţia Coumassie 250G [11]. Decolorarea gelului s-a făcut în soluţia de acid acetic 7%.

Rezultate şi discuţii Conform clasificării lui Osborn [12], extragerea fracţionată a globulinelor, precum heliantinina, se efec-

tuează în soluţii slab saline de NaCl sau KCl. În cazul florii-soarelui au fost propuse mai multe posibilităţi de extragere a fracţiei globulinice. Aceasta poate fi sedimentată selectiv prin acidularea mediului până la pH 4,6 şi ulterior supusă dializei contra soluţiei CH3COONa 20 mM la pH 4,6 şi separată prin centrifugare [13]. O altă posibilitate este extragerea prin precipitare cu sulfat de amoniu. Joubert [14] a extras fracţia proteinelor (11-12)S prin sedimentare cu soluţia (NH4)2SO4 cu saturaţie de 22-30%. Utilizarea metodei cromatografice la fel permite purificarea fracţiei globulinice de cea albuminică. Cercetând proteinele florii-soarelui, Sabir et al. [15] au separat albuminele de globuline prin cromatografie pe Sefadex G200, iar Schwenke et al. [16] au utilizat cromatografia dublă pe DEAE Sefadex A50. Rahma şi Narasinga [17] au propus utilizarea croma-tografiei pe Sepharose 6B pentru purificarea globulinei 12 S după precipitarea selectivă cu sulfat de amoniu.

Varietatea de metode elaborate de extragere şi purificare a extractului de heliantinină este limitată de unele probleme, printre care denaturarea proteinei şi insolubilitatea ei. Acestea sunt determinate de prezenţa unor

50


Biologie ISSN 1857-1735 substanţe, cum sunt fitatul şi acidul clorogenic (AC). Multe proteine formează cu acidul fitic şi fitina (sărurile de Ca, Mg şi K ale acidului fitic) complexe insolubile [18]. Formarea complexelor proteină-fitat are loc în mediul acid (pH 2-3) şi coincide cu protonarea grupărilor carboxilice ale proteinei. Titrarea turbidimetrică a complexului heliantinină-fitat a demonstrat insolubilitatea lui practic completă la pH 2,0 [19].

Utilizarea etapei cromatografice de purificare ar permite eliminarea polifenolilor liberi din extractele obţi-nute. Aceasta au relatat Sabir [15], Baudet şi Mosse [20] care eliminau acidul clorogenic liber din extractele proteice din seminţele de floarea-soarelui. Ultimii autori au reuşit totodată să separe parţial globulinele de albumine. Raymond et al. [21] au descris metoda de fracţionare a proteinelor florii-soarelui pe octilsepharose CL-4B, care permite şi eliminarea acidului clorogenic din extract.

Însă, utilizarea cromatografiei în scopul nostru este imposibilă, deoarece necesită cheltuieli considerabile de timp şi materiale, ceea ce nu este admisibil şi laborios. Astfel, a fost necesar de a efectua extragerea în astfel de condiţii, care să permită să fie eliminat AC şi fitatul. În mediul acid nu are loc oxidarea acidului clorogenic, iar cantitatea maximă de fitat se extrage într-un interval relativ mic de pH – 4,0-5,0. Totodată, solubilitatea proteinei este minimă la pH 4,0. Conform datelor izoelectrofocalizării, punctul izoelectric al Hel se află la pH 4,7 [8,9]. Coincidenţa valorilor de pH, care corespunde maximului de solubilitate a fitatului şi minimului de solubilitate pentru proteină, permite eliminarea prealabilă a fitatului la tratarea materialului vegetal cu apă acidulată la acest pH [7].

Pentru eliminarea fitatului şi acidului clorogenic [22,23], materialul vegetal este spălat cu apă la pH 5,0 (maximul de solubilitate a fitatului şi punctul izoelectric al heliantininei) [19]. Pentru reprimarea activităţii polifenoloxidazelor, în soluţie se adaugă 1mM EDTA, 0,1% Na2SO3 [24] şi acid ascorbic [25,26].

Seminţele de floarea-soarelui conţin o cantitate considerabilă de lipide, care determină anumite incomo-dităţi pe parcursul extragerii şi purificării proteinei. În special, formarea unei faze lipidice după centrifugările extractului împiedică colectarea unui volum mai mare de extract, respectiv duce la pierderea cantitativă a heliantininei. Pentru înlăturarea sau micşorarea acestei fracţii s-a propus degresarea prealabilă a seminţelor în acetonă. Astfel, iniţial se efectuează macerarea seminţei în acetonă, iar apoi eprubetele se lasă pentru 2 ore în frigider. După care eprubetele se centrifughează, iar supernatantul se decantează. Datorită proprietăţii de a se dizolva în solvenţi organici, o mare parte din lipide se înlătură împreună cu acetona decantată.

La extragerea cu soluţie de sulfat de amoniu cu saturaţia de 32% din precipitat sunt eliminate impurităţile proteice, iar cristaloizii care conţin heliantinina rămân în sediment. A fost realizată extragerea comparativă cu soluţiile de sulfat de amoniu cu saturaţia de 32, 34, 36, 38 şi 40%. În rezultat, concentraţia de 32% a fost considerată cea mai optimă, datorită faptului că electroforeza a prezentat o imagine maximal asemănătoare cu spectrele heliantininei denaturate obţinute de alţi cercetători [4,7,27] (Fig.1).

32 34 36 38 40 Hel

Fig.1. Spectrele electroforetice obţinute la extragerea în soluţii cu salinitate diferită de sulfat de amoniu în GPAA 12%:

32, 34, 36, 38, 40 – procentul de salinitate a sulfatului de amoniu; Hel – extractul heliantininei (obţinut prin metoda descrisă de Artâcov).

51



Ulterior, are loc extragerea heliantininei din sediment prin solubilizare cu 1 ml soluţie de NaCl 10%. Astfel, heliantinina, fiind globulină, trece în soluţie şi, după centrifugare, din supernatantul obţinut se colec-tează câte cca 0,9 ml în eprubete curate. După spălarea cu sulfat de amoniu şi extragerea cu NaCl, conţinutul acidului clorogenic în preparat constituie cca 0,5% din proteină [7].

Din extractul obţinut proteina se precipită cu ajutorul soluţiei de acid tricloracetic (ATA) de 50%. Acesta se adaugă în volum, astfel ca concentraţia lui finală să fie de cca 5-7%. Sedimentarea se efectuează la rece timp de cca 2 ore (sau peste noapte). Proteina se sedimentează pe fundul eprubetei şi pereţii ei. Aceasta permite spălarea sedimentului, după centrifugare, cu soluţie de acetonă răcită prin vortexare. După decantarea acetonei, se adaugă eter pentru o spălare adăugătoare şi uscarea proteinei la temperatura camerei.

O etapă intermediară imporatntă a fost stabilirea corespunderii polipeptidelor în condiţii denaturante (Fig.1) şi native (Fig.2) ale heliantininei obţinute. Astfel, heliantinina în condiţii native a disociat în două subunităţi α şi β, cu masele moleculare relative 56-57 şi, respectiv, 54-55 kDa. Astfel, masa moleculară relativă a Hel, calculată empiric, este de cca 330-340 kDa.

Analizele electroforetice efectuate au demonstrat că extractul de heliantinină obţinut a fost calitativ şi suficient pentru scopul propus, iar utilizarea gelului de poliacrilamidă de 14% permite separarea şi analiza mai reuşită a spectrelor polipeptidice ale heliantininei (a se vedea Tabelul, date nepublicate). Aceasta prezintă şi un şir de avantaje faţă de metoda descrisă de Anisimov [4], care este cea mai apropoiată după esenţa sa.

20,1

14,4

30

47

67

94

M Hel+ME -ME

Fig.2. Verificarea purităţii heliantininei extrase în condiţii denaturante (+ME) şi native (-ME):

M – marker proteic, kDa; Hel – heliantinina extrasă prin metoda Artâkov; ME – β-mercaptoetanol.

lanţul α

lanţul β

lanţul α

lanţul β

Tabel Diferenţele dintre metoda Anisimov şi metoda elaborată

Criteriul Metoda Anisimova Metoda elaborată

Durata extragerii 3-4 diurne 1-2 diurne

Etapele extragerii lipsesc metodele de purificare a extractului de heliantinină; doar

metoda de degresare

sunt prezente mai multe etape de eliminare a impurităţilor de alte

fracţii proteice, lipide şi compuşi fenolici

Cantitatea de material extras 0,15-0,25 ml soluţie de proteine

dizolvate cu concentraţia 1,5-4,0 mg/ml

cca 1 mg de heliantinină cu concentraţia 10 mg/ml

Concentraţia GPAA 12,5% 14% Deci, prezenta elaborare reprezintă un procedeu rapid şi relativ uşor de extragere a heliantininei în baza

căreia se va determina puritatea genetică a liniilor consangvinizate şi care ar asigura o precizie înaltă de deter-

52


Biologie ISSN 1857-1735 minare a uniformităţii din cadrul liniilor de floarea-soarelui. Testările ulterioare ale diferitelor genotipuri de floarea-soarelui, pe lângă aspectul lor aplicativ pentru programele de selecţie a florii-soarelui, vor avea şi o imporatnţă ştiinţifică, deoarece vor elucida polimorfismul populaţional în baza heliantininei şi, totodată, vor permite cercetarea geneticii heliantininei, dat fiind faptul că până în prezent sunt foarte puţine informaţii la acest subiect.

Referinţe:

1. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. - Москва: Колос, 1983. - 320 с. 2. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. - Москва: Наука, 1985. 3. Chenuil A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to

practical aspects // Genetica. - 2006. - Vol.127. - P.101-120. 4. Анисимова И.Н. Идентификация сортов, линий и гибридов подсолнечника по составу полипептидов

гелиантинина // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1987. - Т.114. - С.114-126. 5. Анисимова И.Н., Гаврилюк И.П. Гетерогенность и полиморфизм 11 S-глобулина семян подсолнечника //

Генетика. - 1989. - Т.XXV. - 7. - С.1248-1255. 6. Vaintraub I.A., Lapteva N.A. Protein isolates from sunflower cake: problems and solutions. - Proc. of the Intern.

Compositae Conference, Kiew. - 1994. - Vol.2. - P.617-626. 7. Artâcov G. Ameliorarea proprietăţilor funcţionale ale proteinelor din seminţele de floarea-soarelui prin modificarea

proteolitică Autoreferat al tezei de doctor în ştiinţe biologice. - Chişinău, 2003. - 18 p. 8. Schwenke K.D., Pahtz W., Linov K.J., Raab B., Schultz M. Purification, chemical composition and some physico-

chemical properties of the 11S globulin (Helianthinin) in sunflower seed // Narhung. – 1979. - Vol.23. - P.241-254. 9. Dalgararrondo M., Raymond J., Azanza J.L. Sunflower seed proteins: characterization and subunit composition of

the globulin fraction // J. Exptl. Bot. - 1984. - Vol.35. - No160. - P.1618-1628. 10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970.

- Vol.227. - No5259. - P.680-685. 11. Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetală. - Chişinău, 2001. - 174 p. 12. Osborn T.B. The vegetable proteins. - London, 1924. - 154 p. 13. Гегэн Ж., Азанза Ж.Л. Биохимические и физико-химические свойства растительных белков. - В кн.:

Растительный белок. - Москва: ВО Агропромиздат, 1991, c.149-175. 14. Joubert F.J. Sunflower seed proteins // Biochem. Biophys. Acta. - Vol.16. - 1955. - P.520-523. 15. Sabir M.A., Sosulski F.W., McKenzie S.L. Gel chromatography of sunflower proteins // J. Agric. Food Chem. -

1973. - Vol.21. - P.988-993. 16. Schwenke K.D., Pahtz W., Linov K.J., Raab B., Schultz M. Purification, chemical composition and some physico-

chemical properties of the 11S globulin (Helianthinin) in sunflower seed // Narhung. - 1979. - No23. - P.241-254. 17. Rahma E.H., Narasinga M.S. Isolation and characterization of the major protein fraction of sunflower seeds //

J. Agric. Food Chem. - 1981. - Vol.29. - P.518-521. 18. Taha F.S., El-Nockrashy A.S. Low phytate, low chlorogenic acid sunflower seed protein concentrate // Nahrung. -

1981. - Vol.25. - No8. - P.759-764. 19. Bulmaga V.P., Lapteva N.A., Vaintraub I.A. The effect phztate on the solubility of sunflower seed proteins //

Nahrung. - 1989. - Vol.33. - P.161-165. 20. Baudet J., Mosse J. Fractionation of sunflower seed proteins // J. Am. Oil. Chem. Soc. - 1977. - Vol.54. - P.82A-86A. 21. Raymond J., Azanza J.L., Fotso M. Hydrophobic interaction chromatogtaphy: a new method for sunflower protein

fractionation // J. of Chromatography. - 1981. - Vol.212. - P.199-209. 22. Gheyasuddin S., Cater C.M., Mattil R.F. Effect of several variables on the extractability of sunflower seed proteins

// J. Food Sci. - 1970. - Vol.35. - P.453-456. 23. Cater C.M., Gheyasuddin S., Mattil K.F. Effect of chlorogenic, quinic and caffeic acids on the solubility and color

of protein isolates, especially from sunflower seeds // Cereal Chem. - 1972. - Vol.42. - P.508-514. 24. Stores D.M., Anderson J.W., Rowan K.S. Oxidation of chlorogenic acid in the presence of reducing agents //

Phytochemistry. - 1968. - Vol.7. - P.1509-1511. 25. Milic B., Stojanovic S., Vucurevic N., Turcic M. Chlorogenic and quinic acids in sunflower meal // J. Sci. Food

Agric. - 1968. - Vol.19. - No2. - P.108-111. 26. Бузун Г.А. Выделение ферментов из растений в присутствии эндогенных фенолов // Успехи Биол. Химии. -

1972. - С.102-105. 27. Конарев В.Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К. и др. Молекулярно-биологические аспекты прикладной

ботаники, генетики и селекции. Том 1. - Москва: Колос, 1993, c.287-289.


53



54

POSIBILITĂŢI DE ESTIMARE A PURITĂŢII GENETICE LA FLOAREA-SOARELUI

Maria DUCA, Alexei LEVIŢCHI, Tudor ROTARU*

LCŞ „Securitate Biologică” *AŞP „Magroselect” SRL (or. Soroca)

The efficiency of application of different techniques to monitor the biologic purity of initial material designed for the

amelioration ensures the success of breeding programs. This means allow to estimate both, the homogeneity of inbred lines and the polymorphism of in frame of populations. Field tests are much easier and exact, but are time consuming, whereas laboratory tests provide fast results obtaining and reduce the expences for plant breeding programs. The utilization of different existant methods are determined by the budget, developed by the breeders, for the analyses and by the level of technical equipping of the laboratories. The most used method is based on the utilisation of storage protein electrophoretic spectra, being relative cheap and sufficiently exact.

Obţinerea soiurilor şi hibrizilor de perspectivă la plantele de cultură este bazată pe ameliorarea lor prin metode tradiţionale [1,2] sau prin aplicarea ingineriei genetice [3]. Însă, ambele direcţii presupun în egală măsură aplicarea unor tehnici eficiente care asigură monitoringul materialului iniţial, utilizat în programele de selecţie, inclusiv omogenitatea liniilor consangvinizate, gradul de hibridare în F1, precum şi estimarea polimorfismului populaţiilor studiate.

Floarea-soarelui este una dintre culturile agricole de bază în Republica Moldova. Conform datelor statistice FAO (2004), Republica Moldova este a 15-a ţară exportatoare de seminţe de floarea-soarelui pe plan interna-ţional. În economia republicii această cultură de asemenea ocupă un loc de bază, întrucât, după costul producţiei, exportul uleiului de floarea-soarelui, se află pe locul doi, iar după exportul de seminţe – pe locul 9.

Anual pe câmpurile agricole ale republicii se cultivă în jur de 250-270 mii ha de floarea-soarelui (anii 2003-2004), însămânţate cu seminţe F1. Pentru aceasta sunt necesare cca 800 tone de seminţe hibride pentru producere. Acest volum este asigurat la cca 50% de producătorii autohtoni, iar cealaltă parte provine din import. Totodată, Republica Moldova exportă anual între 500-1000 t de seminţe de floarea-soarelui hibridă în Rusia, Belarus şi Ucraina (Fig.1). Astfel, în circuit pe piaţă se află cca 1500-1800 tone de seminţe de elită, fiecare 25 tone dintre care necesită a fi apreciate pentru calitatea seminţelor şi certificate (Fig.2).

Fig.1. Necesitatea certificării seminţelor hibride. F1 indică momentele aplicării certificării.

260 000 ha

PRODUCEREA SEMINŢELOR HIBRIDE F1

500-1000 t

UCRAINA

RUSIA

BIELORUSIA

400 t

400 t


55

Fig.2. Cheltuielile necesare certificării seminţelor hibride din piaţa RM

400 t

16 teste

Fiecare 25 t de seminţe trebuie să fie certificate

500-1000 t

400 t

Fig.2. Cheltuielile necesare certificării seminţelor hibride pe piaţa Republicii Moldova.

Companii private

AMG Magroselect

ICC Selectia

Aprecierea calităţii seminţelor şi identificarea posibilelor impurificări biologice sau mecanice se efectuează prin diferite metode (Fig.3), printre care aprobarea în câmp a materialului semincier. Metodele de seră sau de câmp ţin de verificarea polimorfismului/omogenităţii prin studierea creşterii şi dezvoltării plantelor, fiind un proces îndelungat care necesită cheltuieli considerabile de resurse umane şi materiale. În acest caz identi-ficarea şi estimarea omogenităţii/polimorfismului se face în baza caracterelor morfologice care, din punct de vedere genetic, sunt caractere cantitative, fiind determinate de mai multe gene, astfel încât sunt mai puţin stabile şi manifestă o variabilitate fenotipică mult mai largă sub influenţa factorilor de mediu [4]. Numărul acestor indici este limitat, iar determinarea modului lor de moştenire este mult mai dificilă.

Metodele biologiei moleculare

Proteinele ADN

RFLP

Minisateliţi

RAPD Totale

Fracţionate Albumine Globuline Gluteline Prolamine

Specifice

Enzimele

Proteinele de rezervă

Metode de determinare a purităţii genetice la plantele de cultură

Morfologice Fiziologice Biochimice Genetice

Fig.3. Varietatea metodelor de estimare a purităţii genetice la plantele de cultură (Strategia utilizată în cercetare este indicată prin fond sur).

AFLP

SSR

Testare în laborator Testare în câmp



56

Determinarea calităţii materialului ameliorativ, realizat prin metodele de analiză de laborator, nemijlocit înaintea semănatului, este mai sigură şi efectiv mai economă în timp. Testele din laborator asigură rapiditatea în obţinerea rezultatului privitor la analiza indicilor menţionaţi. Analizele se pot efectua la diferite etape onto-genetice ale plantelor, dar mult mai eficientă şi mai relevantă este utilizarea seminţelor care reprezintă o fază ontogenetică fixă [5-7].

Diverse metode de laborator, la baza cărora stă evidenţierea markerilor pentru estimarea polimorfismului/ omogenităţii, care iniţial au servit doar pentru genotiparea speciilor şi varietăţilor în scopul cercetărilor ştiin-ţifice, sunt aplicate în prezent în activităţi comerciale la importul sau exportul seminţelor de elită, destinate cultivării plantelor pe terenurile agricole [8,9]. Totodată, aceste metode se utilizează pentru a rezolva prob-leme ce ţin de:

• Veridicitatea calităţii produsului; • Încălcarea drepturilor de autor; • Susţinerea drepturilor şi a patentelor amelioratorilor de plante; • Controlul programului de selecţie a plantelor; • Investigaţii legale (judiciare). Astăzi, pentru aprecierea polimorfismului genetic şi a variabilităţii, cu succes se implementează metode

bazate pe explorarea markerilor moleculari genetici (MMG): RAPD – Rrandom Amplified Polymorphic DNA (ADN Polimorfic Amplificat Randomizat), AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (Polimorfismul Lungimilor de Fragmente Amplificate), SSR – Simple Sequence Repeat (Repetiţii de Secvenţe Simple), RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismul Lungimilor Fragmentelor Restricţionate), SNP – Single Nucleotide Polymorphism (Polimorfismul după o Singură Nucleotidă) etc. Un factor important, care determină aplicarea unei sau altei metode, este nivelul la care se cercetează populaţiile şi gradul de polimorfism asigurat de markerul utilizat (Tab.1).

Tabelul 1 Criteriile de selectare a MMG pentru cercetarea problemelor biologice clasice [8]

Nivelul biodiversităţii Nivelul de variabilitate Natura informaţiei necesare Exemple de cei

mai utilizaţi markeri Intrapopulaţional

Structura fină a populaţiei, sistemul de reproducere, rata de înmulţire Medie - înaltă (N) loci codominanţi =

genotip (multilocular)1 Microsateliţi, proteine

specifice Amprentarea, analiza parentală Foarte înaltă Loci codominanţi sau loci

dominanţi numeroşi2 Microsateliţi

(RAPD, AFLP)2

Demografia Medie - înaltă Frecvenţa alelelor la diferite perioade de timp3

Proteine specifice, microsateliţi

Istoria demografică Medie - înaltă Frecvenţa alelelor + relaţiile evolutive3 Secvenţe ADNmt

Interpopulaţional Filogeografia, definirea unităţilor evolutiv semnificative (structura populaţiei)

Medie - înaltă Frecvenţa alelelor în fiecare populaţie3

Proteine specifice, microsateliţi (riscul

homoplaziei de marime)

Bioconservarea Medie Este preferabilă cunoaşterea relaţiilor evolutive ale alelelor

ADNmt (dacă este destul de

variabil) Interspecific

Specii înrudite cca 1%/ma4 Secvenţe de ADNmt, SIT4 al Rdna,

Diferite genuri, familii cca 0,1%/ma4

Unele SMa4 ale domenelor rDNA

(D1<D2, D8), dar şi ADNmt sau SMi4

rDNA

Diferite clase,...,filumuri cca 0,01%/ma4

Multe caractere. Lipsa variabilităţii în cadrul

speciei, dacă e posibilă

D1 al SMa4 rDNA, SMi4

rDNA


57

1 Pentru a compara proporţiile observate de heterozigoţi cu cele teoretice în baza legii echilibrului Hardy–Weinberg, se detectează abaterile de la legea echilibrului datorită amestecurilor în populaţie, lipsa panmixiei sau selecţia (procesul mutaţional este neglijat). Compararea locilor independenţi permite diferenţierea efectului cauzat de acţiunea migraţiei de cel determinat de selecţie.

2 Un marker dominant cu un număr mare de fragmente polimorfe (fiecare corespunzând locusului dominant) poate asigura o rezoluţie mai fină decât câţiva loci codominanţi [10], când este cunoscut unul din părinţi.

3 Metodele ce studiază genotipurile după mai mulţi loci sunt încă puţin aplicate, faţă de cele după un singur locus, deşi sunt mai puternice pentru cercetarea amestecurilor în populaţii, a numărului de migranţi şi a variaţiilor demografice [2,11,12].

4 ma – milioane de ani; SIT – spacer intern transcris; SMa – subunitate mare SMi – subunitate mică. Capacitatea de diferenţiere a genotipurilor este un parametru important şi depinde de tipul markerilor utilizaţi.

Izoenzimele, în general, sunt codificate de câteva alele şi posedă o capacitate limitată de diferenţiere geno-tipică. Cea mai mică capacitate de identificare a genotipurilor o posedă metoda RAPD, comparativ cu toţi ceilalţi markeri. Însă, această problemă ar putea fi rezolvată prin utilizarea unui număr mare de primeri arbitrari RAPD. Alte tipuri de markeri, ca SSR sau AFLP, au capacitate de diferenţiere net superioară, însă metodele de analiză cu aceşti markeri sunt mai complexe şi costisitoare pentru a putea fi implementate şi dezvoltate în laboratoare de certificare a producţiei agricole. Spre exemplu, markerii SSR sunt înalt polimorfi, abundenţi, se moştenesc dominant/codominant şi sunt relativ uşor de procesat în laborator, dar pot fi utili doar în cazul când sunt cunoscuţi şi bine studiaţi, cel puţin câţiva dintre aceştia pentru specia dată sau o altă specie înrudită. Situaţia este mult mai complicată când este necesar a caracteriza markerii SSR de novo.

Fiecare metodă oferă atât anumite avantaje, cât şi unele dezavantaje. Alegerea metodei depinde de posi-bilităţile şi experienţa laboratorului, de necesităţile clientului, modul de utilizare a informaţiei, bugetul, exis-tenţa sau lipsa markerilor moleculari predeterminaţi pentru specia dată, de distanţa genetică dintre genotipuri etc. (Tab.2).

Tabelul 2 Avantajele şi dezavantajele diferitor metode de amprentare [9]

Metoda utilizată Avantajele metodei Dezavantajele metodei

Proteinele de rezervă

- Relativ ieftină - Codominant - Genele expresate

- Rezoluţia mică a benzilor electroforetice - Markerii sunt greu de diferenţiat, datorită bandării complexe

a proteinelor oligomere şi comigrării la electroforeză

Izoenzimele - Relativ ieftin - Codominant - Genele expresate

- Numărul mic de sisteme izoenzimatice poate duce la imposi-bilitatea discriminării probelor

- Rezoluţia mică a benzilor electroforetice - Markerii sunt greu de diferenţiat, datorită bandării complexe

a izozimelor oligomere şi comigrării la electroforeză

RAPD - Relativ ieftin - Simplu

- ADN necaracteristic datorită amplificării nespecifice nu asigură informaţie suplimentară

- Stricteţea joasă a PCR utilizat în RAPD poate genera probleme de reproductibilitate a profilului

- Funcţia necunoscută a genei

AFLP - Discriminare înaltă - Mulţi markeri

- Costisitoare - Procedură complexă - Funcţia necunoscută a genei

SSR

- Discriminare înaltă - Înalt reproductibilă - Codominant - ADN caracteristic

- Procedură complexă - Costisitoare - Are succes înre genuri înrudite - Funcţia necunoscută a genei

RFLP - Înalt reproductibilă - Codominantă - ADN caracteristic

- Procedură complexă - Laborioasă

SNP - Înalt reproductibilă - Codominantă

- Procedură complexă - Nu este în uz general



58

Imperativul aplicării comerciale a diferitelor metode de identificare şi tipizare a genotipurilor este maxi-malizarea eficienţei şi simplităţii acestora, precum şi nivelul de reproductibilitate a rezultatelor. Cei mai utili markeri, care pot fi implementaţi în genotiparea exactă a materialului ameliorativ, sunt markerii codominanţi, ca izoenzimele, SSR sau RFLP, iar în cazul înregistrărilor pentru drepturile de autor asupra soiurilor şi hibri-zilor de plante de cultură sunt preferabil utilizaţi markerii care derivă de la procesul de expresie genetică, cum sunt izoenzimele sau markerii RFLP. Însă, utilizarea markerilor RFLP şi, mai ales, a AFLP este extrem de complexă, considerent din care ei sunt mai puţini atractivi pentru aplicarea practică. Mai mult ca atât, deseori se înregistreazâ o reproductibilitate joasă a markerilor RAPD [13], determinată de stricteţea condiţiilor de realizare a PCR-ului [14,15]. Motiv din care tehnica RAPD este puţin explorată [16]. Rezultate reproductibile ale cercetării polimorfismului şi identificării markerilor moleculari oferă doar 14% din primerii folosiţi [17]. Polimorfismul identificat prin astfel de tehnică se estimează prin prezenţă-absenţă şi efectul de segregare după alelele dominante, ceea ce la fel reprezintă un dezavantaj pentru RAPD-PCR [17-20]. Aceasta nu permite diferenţierea formelor homozigote dominante şi heterozigote în populaţiile hibride.

Însă, metoda RAPD asigură detectarea polimorfismului pentru diferite plante de cultură. Astfel, s-a arătat că polimorfismul la cartofii dulci este de 77,6% [21], la sorgo – 55,3% [22] şi la cereale – 9,3% [23]. Compa-rativ cu acestea, pentru floarea-soarelui s-a evidenţiat o variabilitate mult mai înaltă – 83% [24]. Rezultatele date demonstrează că RAPD poate fi utilizat pentru cercetările genetice ale liniilor la floarea-soarelui.

În contextul bazei tehnico-materiale existente în Republica Moldova, în controlul programelor de selecţie şi semenologia amelioratorii pot fi utilizate cu succes proteinele de rezervă pentru confirmarea gradului de hibridare şi a identităţii hibridului, precum şi a purităţii biologice a liniilor sau pentru verificarea paternităţii, pentru a exclude erorile la încrucişare. Marcarea plantelor, care fac parte din diferite taxoane – de la biotip şi soi la specie, gen şi mai superioare, cu ajutorul proteinelor a fost iniţiată anterior prin identificarea proteinelor şi caracterelor proteice, care cel mai bine ar caracteriza sistemele date [6], fiind evidenţiate trei tipuri de varia-bilitate: genomică, genică şi alelică (Fig.4) [25].

Fig.4. Cele trei categorii ale vartiabilităţii genetice evidenţiate în baza markerilor proteici la plante. Linia punctată indică domeniul de interes al selecţionerilor şi amelioratorilor.

FAMILIA

TRIBUL

GENUL

SPECIA

diploidă, allopoliploidă

POPULAŢIA naturală, soi, hibrid

LINIA BIOTIPUL

Gen

omic

ă

Gen

ică

Ale

lică

Categoria variabilităţii

Caractere proteice

Specificitatea antigenică

Electroforetice monomorfe

Electroforetice polimorfe

Proteine

Histone şi alte proteine evolutiv

conservative

Proteinele de rezervă şi enzimele variate şi genetic

polimorfe


59

Pentru identificarea soiurilor şi rezolvarea problemelor legate de variabilitatea intraspecifică şi intrapopu-laţională, sunt necesare sisteme proteice genetic polimorfe. Polimorfismul unor astfel de sisteme este deter-minat de variabilitatea alelică şi cel mai bine este evidenţiat prin analiza electroforetică, care permite diferen-ţierea genotipurilor şi evidenţierea soiurilor, biotipurilor şi a liniilor în baza spectrului electroforetic.

Totalitatea spectrelor proteinelor multiple (poligenice) şi genetic polimorfe (datorită polialelismului) per-mite evidenţierea poligeniei pentru proteina dată, a structurii alelice a genelor, a structurii populaţiei, a compo-nenţei biotipice a soiului şi a relaţiilor genetice dintre soiuri. Variabilitatea proteinelor poate fi condiţionată şi de procesele posttranslaţionale de glicozilare, metilare, fosforilare, proteoliză etc. [26].

În baza spectrelor electroforetice ale proteinelor polimorfe este posibilă şi analiza populaţiilor morfologic identice. Polipeptidele specifice, identificate ca markeri proteici, permit excluderea plantelor heterozigote la primele etape ale proceselor semenologice şi păstrarea caracteristicilor necesare ale genotipului, ale cărui plante sunt morfologic nediferenţiabile. Această metodă deschide posibilităţi largi de obţinere accelerată a liniilor homozigote şi a seminţelor de elită şi introducerea lor rapidă în producere pentru obţinerea hibrizilor cu calităţi superioare.

Analiza în baza proteinelor totale sau fracţionate este ineficientă, întrucât se caracterizează printr-o neuni-formitate a spectrelor obţinute şi un număr mare de benzi ce prezintă greutăţi în diferenţierea probelor [27-29].

În acest aspect sunt mai efective enzimele polimorfe (izoenzimele) şi proteinele de rezervă (Fig.3). Ultimele sunt polimorfe şi sunt localizate în ţesuturi morfogenetic omogene – endospermul şi cotiledoanele seminţei mature, fiind utilizate pe larg în identificarea soiurilor. Cantitatea lor în seminţe este suficientă pentru efectu-area analizei electroforetice individuale.

Mult mai eficiente sunt proteinele de rezervă, care se sintetizează similar cu proteinele secretorii în reticulum endoplasmatic al celulelor de rezervă şi care se depun sub forma corpilor proteici [30-32]. Aceste proteine se formează în cotiledoane şi sunt determinate de sistemele genetice ale nucleului diploid, fapt ce determină şi modul de moştenire a componentelor proteice de la formele parentale la hibrizi [29]. Proteinele de rezervă rămân constante pe parcursul mai multor ani. Reproductibilitatea rezultatelor separării electroforetice a acestui grup de proteine este considerată bună [5-7].

Globulinele sunt cele mai răspândite proteine de rezervă. Există două tipuri de bază ale globulinelor la floarea-soarelui – 11S şi 7S [31,32]. Structura biochimică a moleculei 11S, care este proteina de rezervă majoră, este reprezentată de o globulină cu structură quaternară complexă. Aceasta reprezintă un heterohexamer din subunităţile cu Mr ~ 60 kDa legate necovalent. În prezenţa reducătorilor aceasta se descompune în două polipeptide diferite: una cu caracter acid cu masa ~ 40 kDa şi alta – bazică de cca 20 kDa [32,33]. Controlul polimorfismului/omogenităţii prin intermediul electroforezei proteinelor este foarte efectiv pentru rezolvarea unor probleme practice şi poate mări eficienţa proceselor semenologice, în acelaşi rând poate reduce termenele de creare a liniilor şi hibrizilor de la 7 la 5 ani.

Pentru identificarea soiurilor, liniilor şi a hibrizilor sau pentru evidenţierea variabilităţii intraspecifice este important polimorfismul genetic, determinat de diversitatea alelică. Acestă variabilitate este cu succes studiată

cu ajutorul analizei electroforetice a proteinelor de rezervă din seminţele individuale în prezenţa detergenţilor sau a altor agenţi reducători [34]. Un aspect metodologic important în aplicarea practică a acestor metode este problema rezoluţiei benzilor electroforetice, care în unele sisteme electro-foretice prezintă dificultăţi la interpretarea rezultatelor. Indiscutabil, electroforeza în gel de poliacrilamidă sau în capilare poate rezolva aceste probleme, dar îmbunătăţirea şi optimizarea condiţiilor de electroforeză (Fig.5), precum şi utilizarea sistemelor electroforetice mai precise rămân a fi în continuare aspecte dintre cele actuale pentru cercetările în domeniu. Astfel de dificultăţi se întâlnesc şi în lucrul cu izoenzimele, care în gelul de amidon reprezintă benzi difuze [35], iar SSR în gel de agaroză deseori produc separarea slabă a benzilor [36].

Procesarea datelor obţinute la separarea electroforetică a proteinelor cu ajutorul calculatorului este mai rapidă şi uşoară şi permite obţinerea imediată a rezultatelor, precum puritatea genetică, gradul de hibridare sau de sterilitate etc. [37,38], ceea ce asigură facilitarea analizei prin

1 2

Fig.5. Electroforeza heliantininei în GPAA:

1 – gel 12,5%; 2 – 14%; săgeţile indică benzile polipeptidice noi apărute.



60

aplicarea realizărilor tehnologiilor informaţionale. Rezultatele obţinute vor sta la baza diferitelor baze de date, de exemplu, a celor de markeri moleculari care au fost validaţi. Aceştia pot fi utilizaţi cu succes pentru eficientizarea procesului de selecţie şi ameliorare a plantelor de cultură [39].

Deşi selecţia şi ameliorărea plantelor de cultură are tradiţii şi o istorie foarte îndelungată, aceasta cu succes îmbină realizările ştiinţei moderne şi devine un domeniu aplicativ al biologiei moleculare, al ingineriei gene-tice şi al tehnologiilor informaţionale.

Referinţe:

1. Siminel V.D. Ameliorarea generală a plantelor de câmp.- Chişinău: Tipografia Centrală, 1998. 2. Vitalis R. & Couvet D.. Estimation of effective population size and migration rate from one-and two-locus identity

measures // Genetics. - 2001. - Vol.157. - P.911-925. 3. William F. Tracy. What Is Plant Breeding? - In: Proceedings of Summit on Seeds and Breeds for 21st Century

Agriculture. - Washington, DC, September 6-8, 2003, p.51-60 4. Vrânceanu A.V. Floarea-soarelui hibridă. - Bucureşti: Ceres, 2000. - 1147 p. 5. Конарев А.В., Конарев В.Г., Губарева Н.К., Пенева Т.И. Белки семян как маркеры в решении проблем генети-

ческих ресурсов растений, селекции и семеноводства // Цитология и генетика. - 2000. - Т.34. - 2. - С.91-104. 6. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. - Москва: Колос, 1983. - 320 с. 7. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. - Москва: Наука, 1985. 8. Chenuil A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical

aspects. - Genetica. - 2006. - Vol.127. - P.101-120. 9. Henry R.J. Plant Genotyping: the DNA fingerprinting of plants // CAB International. - 2001. - P.265-273. 10. Gerber S., Mariette S., Streiff R., Bodenes C., Kremer A. Comparison of microsatellites and amplified fragment length

polymorphism markers for parentage analysis // Molecular Ecology. - 2000. - Vol.9. - P.1037-1048 11. Davies, N., Villablanca F.X., Roderick G.K. Determining the source of individuals: multilocus genotyping in

nonequilibrium population genetics // Trends in Ecological Evolution. - 1999. - Vol.14, - P.17-21. 12. Waser P.M. & Strobeck C. Genetic signatures of interpopulation dispersal // Trends in Ecological Evolution. - 1998. -

Vol.13. - P.43-44. 13. Jones C.J., Edwards K.J., Castiglione S., Winfiels M.O., Sala F., Van der Wiel C., Vosman B.L., Matthes M., Daly A.,

Brettschneider R., Bettini P., Buiatti M., Maestri E., Marmiroli N., Aert R.L., Volckaert G., Rueda J., Vazques A. & Karp A. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories // Molecular Breeding. - 1997. - Vol.3. - P.381-390.

14. Duca M., Capatana A., Barbacar N. The inheredity of DNA amplicons in different sunflower genotypes // Bulletin of Moldovan Academy of Science. - 2006. - Vol.9. - P.15-23.

15. Duca M., Capatana A., Port A., Barbacar N. The estimation of heterosis effect based on molecular analysis (RAPD) in sunflower/Genetic polymorphism in homo- and heterozygote genotypes of sunflower // Romanian Journal of Genetics. - 2005. - Vol.1. - No.2. - P.22-31.

16. Ellsworth D.L., Rittenhouse K.D., Honeycutt R.L. Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns // BioTechniques. - 1993. - Vol.14. - P.214-217.

17. Teulat B., Zhang Y.X., Nicolas P. Characteristics of random amplified polymorphic DNA markers discriminating Helianthus annuus inbred lines // Agronomie. - 1994. - Vol.14. - No8. - P.497-502.

18. Deragon J.M., Landry B.S. RAPD and other PCR-based analyses of plant genomes using DNA extracted from small leaf disks // PCR Methods Applications. - 1992. - Vol.1. - P.175-180.

19. Hu J., Quiros C.E. Identification of broccoli and cauhflower cultivars with RAPD markers // Plant Cell Reports. - 1991. - Vol.10. - P.505-511.

20. Michelmore R.W., Paran I., Kesseli R.V. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked-segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations // Proceedings of National Academy of Science. - 1991. - Vol.88. - P.9828-9832.

21. Connolly A.G., Godwin I.D., Cooper Μ., DeLacey Ι.Η. Interpretation of RAPD marker data for finger printing sweet potato (Ipomoea batatas L.) genotypes // Theoretical Applied Genetics. - 1994. - Vol.88. - P.332-336.

22. Tao Y., Manners J.M., Ludlow M.M., Henzell R.G. DNA polymorphisms in grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) // Theoretical Applied Genetics. - 1993. - Vol.86. - P.679-688.

23. Yang X, Quiros C. Identification and classification of celery cultivars with RAPD markers // Theoretical Applied Genetics. - 1993. - Vol.86, - P.205212.

24. Lawson W.R., Henry R.J., Kochman J.K., Kong G.A. Genetic diversity in sunflower (Helianthus annuus L) as revealed by RAPD analysis // Australian Journal of Agricultural Research. - 1994. - Vol.45. - P.1319-1327.

25. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции / Под ред. В.Г. Конарева. – Москва: Колос, 1993. - 447 с.


61

26. Lodish H., Scott M.P., Matsudaira P., Darnell J., Zipursky L., Kaiser C.A., Berk A., Krieger M. Molecular Cell Biology. W.H. Freeman Publisher, 5th Edition, 2003. - 973 p.

27. Leviţchi A., Palade E., Ţurcan E., Culicov A., Popistaş E. Determinarea purităţii genetice a liniilor de floarea-soarelui // Rezumatele comunicărilor la Conferinţa ştiinţifică internaţională „Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate pe cunoaştere”, 28 septembrie 2006, Chişinau, p.265-266.

28. Duca M., Capatana A., Port A., Glijin A., Articov G. Albumines electrophoretic analisys at different sunflower genotypes // Actual problems of Genetics, Biotechn. and Breeding. (Chisinau). - 2005. - P.115-119.

29. Duca M., Capaţâna A., Port A., Glijin A., Articov G., Ermolaev E. Analiza comparativă a globulinelor în cadrul sistemlui ASC-Rf la floarea-soarelui. - În: Genetica şi ameliorarea plantelor, animalelor şi microorganismelor. - Chişinau, 2005, p.114-118.

30. Eliot M. Herman, Brian A. Larkins. Protein storage bodies and vacuoles // The Plant Cell. - 1999. - Vol.11. - P.601-613. 31. Peter R. Shewry, Johnathan A. Napier, Arthur S. Tatham. Seed Storage Proteins: Structures and biosynthesis // The

Plant Cell. - 1995. - Vol.7. - P.945-956. 32. Гегэн Ж., Азанза Ж.Л. Состав и физико-химические свойства белков бобовых и масличных культур. - В кн.:

Растительный белок. - Москва: Агропромиздат, 1991, c.149-175. 33. Анисимова И.Н., Гаврилюк И.П. Гетерогенность и полиморфизм 11 S-глобулина семян подсолнечника //

Генетика. - 1989. - Т.XXV. - 7. - С.1248-1255. 34. Анисимова И.Н. Идентификация сортов, линий и гибридов подсолнечника по составу полипептидов

гелиантинина // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1987. -Т.114. - С.114-126. 35. Suurs L., Jongedijk E., Tan M. Polyacrylamide gradient-gel electrophoresis: a routine method for high resolution

isozyme electrophoresis of Solanum and Lycopersicon species // Euphytica. - 1989. - Vol.40. - No3. - P.181-186. 36. Nurdan Doúrar, Mahinur S. Akkaya. Optimization of PCR Amplification of Wheat Simple Sequence Repeat DNA

Markers // Turk Journal of Biology. - 2001. - Vol.25. - P.153-158. 37. Căpăţână Gh., Duca M., Leviţchi A., Podduchin Vl., Rogojin Iu. Sistem informaţional în biologie // Culegere de

lucrări ştiinţifice în memoria prof. univ. V.A. Zolotarevschi „Ecuaţii Integrale şi Modelarea Problemelor Aplicative” (EIMPA-2005). Chişinău (Moldova). - 2006. - Vol.II. - P.260-263.

38. Duca M., Căpăţână Gh., Leviţchi Al., Podduchin Vl. Sistem inteligent de asistenţă a unei clase de experimente bio-logice // Rezumatele comunicărilor la Conferinţa ştiinţifică internaţională „Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate pe cunoaştere”, 28 septembrie 2006. - Chişinau, p.23-24.

39. Frisch M., Lamkey K., Melchinger A. Storage of molecular marker data in databases for efficient use in plant breeding programs // Zeitschrift fur Agrarinformatik. - 2002. - Vol.10. - P.23-27.




62

ASPECTE PRIVIND ESTIMAREA GRADULUI DE STERILITATE A

LINIILOR DE FLOAREA-SOARELUI

Maria DUCA, Angela PORT, Alexei LEVIŢCHI, Tudor ROTARU*

LCŞ „Securitate Biologică” *AŞP „Magroselect” SRL (or. Soroca) Monitoring of the seed quality at different stages of plant breeding at sunflower represents a very important element

in obtaining high yield hybrids based on CMS-Rf genetic system. Sunflower represents a protandric plant with a single terminal inflorescence which contains 700-3000 individual hermaphrodite flowers, exposed on the calathidium, making manual emasculation almost impossible. That’s why the utilization of the male sterility was indispensable and necessary for the obtaining of the high level of hybridization at all the stages of sunflower breeding. Wide utilization of maternal lines, with cytoplasmic male sterility, and of paternal lines, with fertility restoring genes Rf, lead to the necessity to observe the stability and homogeneity of parental genotypes. Thus, for the paternal genotypes it is important to verify the presence and the stare of Rf genes, but maintaining male sterility is verified by the level of sterility control. Utilization of PCR-based methods with specific primers allows controlling genotype quality.

Androsterilitatea reprezintă o caracteristică larg răspândită în regnul vegetal, fiind observată la peste 150

plante [1] şi constituie incapacitatea plantelor de a produce polen funcţional, drept rezultat al blocării procesului de microsporogeneză la diverse etape – premeiotică [2] sau postmeiotică [3] – ale acestuia. Sterilitatea mas-culină la floarea-soarelui a fost descoperită în 1929 de către A.I. Kupţov [4].

Se cunosc mai multe tipuri de androsterilitate (AS), precum: AS nucleară, determinată de genele recesive ms, care se moştenesc mendelian, şi este înlănţuită cu genele

antocianice [5]; AS indusă sau modificaţională, prin aplicarea exogenă a diferitelor gametocide, în special a gibereli-

nelor [7], care s-a folosit la prima etapă de ameliorare a florii-soarelui la heterozis; AS citoplasmatică (ASC), care la floarea-soarelui este de natură aloplasmică, fiind obţinută experimental

pentru prima dată în Franţa în rezultatul hibridizării interspecifice între speciile sălbatice filogenetic distanţate H.petiolaris şi H.annuus [8].

Acest tip de androsterilitate, numit PET1, este utilizat pe larg în practica de ameliorare a florii-soarelui. Datorită folosirii aproape exclusive a acestei surse de androsterilitate citoplasmatică (ASC) pentru obţinerea de seminţe hibride, toţi hibrizii din cultură sunt puternic înrudiţi, cel puţin în ceea ce priveşte citoplasma lor. Însă, exploatarea unui singur tip de ASC pentru producerea hibrizilor duce la unificarea germoplasmei şi la reducerea bazei genetice a materialului ameliorativ, ceea ce determină pierderea unor caractere agronomice valoroase, creşterea vulnerabilităţii faţă de condiţiile variate ale mediului [9] şi generalizează dificultăţi legate de restaurarea ineficientă a androfertilităţii [10].

Astfel, a fost stabilită influenţa fotoperioadei asupra stabilităţii ASC şi restaurării androfertilităţii la porumb [11]. Influenţa factorilor de mediu s-a atestat, de asemenea, asupra dezvoltării polenului la hibrizii F1, creaţi în baza diferitelor tipuri de ASC [12-15]. Creşterea gradului de sterilitate la liniile A (ASC) şi liniile B (men-ţinătoare) odată cu mărirea temperaturii (33-36°C) şi a duratei zilei s-a constatat la bumbac [16].

La floarea-soarelui s-a demonstrat că, în dependenţă de sursa de ASC, plantele se caracterizează printr-o normă de reacţie şi o stabilitate diferită a gradului de sterilitate faţă de condiţiile mediului extern [17,18]. A fost stabilită creşterea numărului de plante sterile şi un nivel al variabilităţii caracterului cercetat mai mare la floarea-soarelui la testarea hibrizilor în semănatul de vară, comparativ cu cultura obişnuită de primăvară [19], androsterilitatea de tip lenticularis fiind mai puţin stabilă. Christov (1993) [20] a evaluat performanţele agronomice pentru 9 genotipuri hibride, provenite din 13 surse de ASC, printre care şi PET1, şi a stabilit importanţa efectelor nucleare şi citoplasmatice pentru caracteristicile biologice studiate: înălţimea plantelor, diametrul capului şi conţinutul în ulei (Tab.1). Principalele concluzii confirmă prevalenţa efectelor nucleare asupra celor citoplasmatice şi puternicele interacţii nucleu-citoplasmă.



63

Tabelul 1

Efectele cauzate asupra anumitor caractere, determinate de citoplasma PET1

Caracterul afectat Efectul observat Exemple de alte tipuri de ASC cu efect similar

Cantitatea de sămânţă Efecte negative ANN2, ANN4, PET2, MAX1 Inălţimea plantelor Creşterea plantelor în înălţime ANN1, ANN2, PET2 Conţinutul în ulei Efecte negative ANL2, PET2

Perioada de inflorire Creşterea duratei înfloririi ANL2, ANN1, ANN4, ANO1, BOL1, MAX1

Efectele liniilor androsterile asupra unor caractere de importanţă agronomică sunt în general reduse, uneori

determinând efecte negative. A fost stabilită susceptibilitatea unor tipuri de ASC la diferite specii faţă de patogeni. La Pennisetum

glaucum a fost demonstrată susceptibilitatea înaltă a majorităţii liniilor cu ASC la atacul Claviceps fusiformis [21], iar epifitotiile largi, provocate de Helminthosporium maydis şi Phyllosticta maydis, care au adus pierderi globale de producţie agricolă, reduc practic totalmente utilizarea androsterilităţii citoplasmatice de tipul Texas (T) în crearea hibrizilor de porumb [22-24].

De aceea, una dintre problemele de bază ale amelioratorilor este diversificarea surselor de androsterilitate citoplasmatică în crearea hibrizilor şi cultivarea hibrizilor creaţi pe bază de diverse tipuri şi surse de ASC [25,26].

Astăzi la floarea-soarelui sunt cunoscute peste 60 surse de sterilitate citoplasmatică masculină [3,27], create în baza a cca 20 specii din flora spontană [28], care se deosebesc atât după mecanismul molecular de geneză [29], cât şi după mecanismul hibridologic de restaurare a fertilităţii polenului în F1 [19]. Aceste surse de androsterilitate citoplasmatică pot şi trebuie utilizate la crearea hibrizilor înalt productivi. Însă, valorificarea acestora necesită cercetări ample atât în ce priveşte selectarea şi identificarea liniilor restauratoare şi a me-canismelor de restaurare a fertilităţii pentru aceste noi surse de ASC, cât şi stabilitatea manifestării sterilităţii în dependenţă de diferiţi factori biotici şi abiotici, identificarea genelor mitocondriale asociate cu androsteri-litatea citoplasmatică, a nivelului de expresie şi a gradului de sterilitate – cercetări necesare nu doar pentru tipizarea surselor existente, ci şi pentru utilizarea lor eficientă pe sectoarele de hibridare.

Material şi metode

Schema de analiză a inclus câte 50 seminţe ale formelor materne a trei hibrizi de perspectivă: Drofa, Valentino, Xenia. Materialul semincier a fost oferit de AŞP „Magroselect” SRL (or. Soroca).

ADN-ul a fost extras din plantule etiolate germinate timp de 4 zile (în termostat, 25ºC) cu reactivul-kit DNA-zol (Gibco BRL) conform protocolului propus de producător. Calitatea şi cantitatea de ADN utilizat ca matriţă în reacţia PCR a fost apreciată empiric prin electroforeză în gel de agaroză de 1%.

Amplificarea PCR a avut loc cu ajutorul primerilor specifici elaboraţi anterior prin programul de selecţie Primer3 pentru orfH522 (5`-3`) [30]:

sens GGCGCACTCTCTTTTTCTGT antisens CTTGAATGGCAGTGGTGATG

Mediul de reacţie PCR a inclus: 25-50 ng ADN; 50 pmol primeri; dNTP 200 µM; MgCl2 2,5 mM; 1X PCR tampon, Tag-DNA polimeraza (Rusia) 1,5 U/reacţie, volumul toatal – 25 µl. A fost utilizat amplificatorul Corrbett Thermal Cycler cu următorul program: 2 min. la 95ºC urmat de 40 cicluri: 30 sec. la 95ºC, 1 min. la 59ºC, 2 min. şi 30 sec. la 72ºC. Ampliconii au fost analizaţi în gel de agaroză de 1,5% cu etidium bromid (0,4 µg/µl) în prezenţa markerilor ADN (100–1000 pb) conform protocolului standard [31].

În calitate de control negativ s-au utilizat seminţele formelor paterne fertile, cu gena Rf, iar controlul pozitiv l-au asigurat seminţele hibride.

Testarea s-a realizat pe ADN-ul izolat dintr-o singură plantulă, incluzând în total 50 plantule pentru fiecare formă maternă, o plantulă de forma paternă în calitate de control negativ şi o plantulă a genotipului hibrid de primă generaţie, pentru controlul pozitiv.



64

Rezultate şi discuţii

Ameliorarea plantelor de cultură, asistată de markeri moleculari, asigură eficienţa şi rapiditatea în reali-zarea programelor de selecţie. Rezultatele prezentate în acest articol vizează estimarea gradului de sterilitate împreună cu evaluarea calităţii biologice a seminţelor la formele materne de floarea-soarelui, utilizând tehnicile de biologie moleculară, combinate cu experimentul în câmp.

Fiind asociată cu prezenţa secvenţei orfH522 în genomul mitocondrial, androsterilitatea citoplasmatică poate fi evaluată cu succes cu ajutorul tehnicii PCR în baza primerilor specifici. Acest fapt a determinat realizarea cercetării şi implementarea determinării ASC în baza primerilor orfH522, în acelaşi rând estimarea gradului de sterilitate pentru genotipurile de floarea-soarelui.

La prima etapă a cercetărilor, dat fiind faptul că, pentru a fi utilizată în programele de selecţie, modalitatea de estimare a gradului de sterilitate trebuie să fie relativ uşoară, rapidă şi exactă, a fost necesar de a adapta extragerea ADN şi condiţiile realizării tehnicii PCR. Pentru o estimare corectă a parametrilor se presupune analiza individuală a unui număr de cel puţin 50 de plantule. De aceea, a fost utilizat kit-ul DNA-zol, care permite extragerea rapidă a ADN. Ulterior, a fost important de a verifica calitatea ADN extras, ceea ce a fost realizat prin electroforeza în agaroză 1% (Fig.1).

În rezultatul evaluării calităţii ADN-ului, pentru analizele ulterioare au fost selectate 42 probe ale geno-tipului matern Xenia, 33 probe pentru Drofa şi 27 pentru Valentino. Calitatea ADN este importantă, deoarece influenţează realizarea PCR. Probabilitatea ruperii ADN în zonele de interes nu va duce la amplificarea fragmentului orfH522. Primerii utilizaţi sunt lungi; fiind specifici, aceştia necesită fixare complementară cu fragmentul întreg al ADN-ului ce prezintă interes. Aceşti primeri produc un amplicon de 321 pb, care ser-veşte în calitate de marker al prezenţei genei orfH522 în genomul mitocondrial.

Dat fiind faptul că rezultatul obţinut indică doar asupra prezenţei restructurării în genomul mitocondrial,

acesta nu permite diferenţierea genotipurilor. Astfel, genotipurile hibride trebuie la fel să se caracterizeze prin prezenţa ampliconului de 321 pb, deoarece materialul genetic citoplasmatic se transmite de la linia maternă. Observaţiile au demonstrat că toţi hibrizii se caracterizează prin amplificarea regiunii orfH522. Genotipurile paterne, caracterizate prin gena nucleară Rf şi lipsa orfH522, s-au manifestat (aşa cum s-a aşteptat) prin lipsa ampliconului.

Rezultatele amplificării au fost estimate prin gradul de sterilitate (GS) a liniilor materne, determinat prin următorul calcul:

100⋅=N

NGS A ,

unde: NA – numărul de probe care au dat rezultat pozitiv; N – numărul total de probe analizate, exprimat în % (Tab.2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 F1

A

B

C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 F1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F1

Fig.1. Electroforeza în gel de agaroză 1% a ADN total (4 µl) din trei familii de Helianthus annuus L.: Xenia (A); Drofa (B); Valentino (C). Cu cifre sunt indicate genotipurile .



65

Tabelul 2 Gradul de sterilitate (GS) estimat la diferite genotipuri materne

în baza primerilor pentru orfH522

Genotipul Xenia Drofa Valentino Numărul total de probe

Numărul de probe

amplificate

42

42

33

30

27

21

GS 100% 91% 78%

În cazul în care considerăm probele în calitate de un eşantion comun, se va obţine un nivel de sterilitate medie a genotipurilor materne – de 89,7%.

Testările în câmp efectuate de selecţionerii AŞP „Magroselect” SRL au demonstrat un grad de sterilitate între 71 şi 96% pentru liniile cercetate (Tab.4). Toate liniile au manifestat un grad de sterilitate mai înalt, fiind determinat de condiţiile de laborator. Aceasta poate fi explicat prin faptul că printre seminţele acestor linii au existat impurităţi, precum plante netipice, care nu sunt caracteristice genotipului dat. Această pre-supunere este susţinută şi de valoarea purităţii genetice a liniilor studiate. În câmp liniile respective s-au caracterizat prin 80–94% de puritate genetică. Cercetările anterioare asupra estimării purităţii genetice a liniilor în baza heliantininei au demonstrat valori net mai înalte – între 96 şi 100% (date nepublicate).

Tabelul 3 Puritatea genetică (GS) şi de sterilitate (GS) estimată la diferite genotipuri materne

în urma testării în câmp Genotipul Plante sterile tipice Plante fertile tipice Plante netipice PG, % GS, %

41 2 2 95,6 95,4 58 3 5 92,4 95,1 - - - - - Xenia

94,0 95,5 66 8 5 93,7 83,5 64 3 7 90,6 86,5 60 2 8 88,6 85,7 Drofa

91,0 85,2 66 3 24 74,2 71 65 7 21 77,4 69,9 75 15 12 88,2 73,5 Valentino

79,9 71,5

Fig.2. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor la trei familii de Helianthus annuus L.: Xenia (A) – 1-14; F1–15; –16; Drofa (B) – 1-11; F1–12; –13;

Valentino (C) – 1-9; F1–10; –11.

321pb

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0,5_

0,3_

B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0,5_

0,3_

C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0,5_

0,3_

321pb

321pb



66

Deşi analiza în baza parametrilor morfologici sau biochimici, precum spectrul heliantininei, nu determină direct gradul de sterilitate, aceasta este o caracteristică importantă a liniilor studiate. Totodată, trebuie de luat în consideraţie faptul că în urma testărilor din câmp se analizează toate plantele semănate în baza parametrilor lor morfologici. Aceasta poate determina atribuirea anumitor plante la nespecifice, fiind excluse din analiză. Testele de laborator se efectuează asupra seminţelor, care se află la păstrare, astfel nefiind supuse acţiunii mediului înconjurător.

Dependenţa manifestării androsterilităţii citoplasmatice de influenţa factorilor mediului înconjurător a denaturat corespunderea datelor obţinute în câmp şi în laborator. Astfel, estimarea corectă a gradului de steri-litate şi utilizarea lui în programele de selecţie este strict legată de cunoaşterea acţiunii condiţiilor mediului extern şi, în special, a mecanismului de manifestare ASC.

Lipsa amplificărilor specifice ale anumitor probe este determinată, probabil, de problema tehnică, deoarece unele probe prezintă şi amplificări nespecifice (Fig.2, A 3-5-6-8-14; C 5-6). Totodată, este necesară cercetarea mai largă a genotipurilor hibride pentru a verifica prezenţa genei pentru ASC în plasmonul lor.

Totuşi, utilizarea tehnicii PCR în baza primerilor specifici prezintă mai multe avantaje faţă de aplicarea celor nespecifici. Tehnica RAPD implementată pentru testarea genotipurilor parentale, în general [32], şi a celor feminine ASC, în special, este bazată pe un set de primeri [33], iar rezultatele posedă reproductibilitate joasă [34]. Astfel, primerii specifici pot fi utilizaţi cu succes la stabilirea prezenţei androsterilităţii citoplas-matice la liniile de floarea-soarelui. Reuşita implementării unor astfel de mecanisme de control în progra-mele de selecţie asigură utilizarea cu succes a plantelor cu ASC, fiind un mijloc relativ ieftin de obţinere a hibrizilor înalt productivi cu puritate înaltă.

Referinţe:

1. Horn R., Friedt W. (1998). CMS mechanisms in sunflower - How many are there? - In: Plant Mitochondria: From Gene to Function, eds. I.M. Moller, P.Gardestrom, K.Glimelius, E.Glaser. - Backhuys Publishers, Leiden, p.79-82.

2. Smart C., Monéger F., Leaver C.J. Cell-specific regulation of gene expression in mitochondria during anther development in sunflower // Plant Cell. - 1994. - Vol.6. - P.811-825.

3. Ispas I. Aspecte moleculare privind citoplasma androsterilă PET1 de la floarea-soarelui (Helianthus annuus L.) // Progrese în Biotehnologie. - 2002. - Vol.2. - P.51-72.

4. Mureşan T., Crăciun T. Ameliorarea specială a plantelor. - Bucureşti: CERES, 1971. - 461 p. 5. Анащенко А.В. Мужская стерильность у подсолнечника (Helianthus annuus L.): Автореферат кандидатской

диссертации. - Ленинград, 1968. 6. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. Пол растений и его гормональная регуляция. - Москва, 1982. - 176 с. 7. Анащенко А.В. Особенности выращивания подсолнечника при химической кастрации // Селекция и

семеноводство. - 1971. - 2. - С.36-38. 8. Leclerq P. Une sterilite male utilisable pour la production d’hibrides simple de tournesol // Ann. Amelior. Plantes. -

1966. - Vol.16. - No2. - P.135-144. 9. Dhillon M.K., Sharma H.C., Naresh J.S., Singh R., Pampapathy G. Influence of cytoplasmic male sterility on

expression of different mechanisms of resistance in sorghum to Atherigona soccata (Diptera: Muscidae) // Journal of Economic Entomology. - 2006. - Vol.99. - No4. - P.1452-1461.

10. Muhammad Sarwar Khan. Engineered male sterility // Nature. - 2005. - Vol.436. - No 7052, - P.783. 11. Mural Koji, Tsunewaki Koichiro. Photoperiod-sensitive cytoplasmic male sterility in wheat with Aegilops crassa

cytoplasm // Euphytica. - 1993. Vol.67. - No1-2. - P.41-48. 12. Дувик Д.Н. Влияние генотипа и условий внешней среды на цитоплазматическую стерильность пыльцы у

кукурузы. - В сб.: Гибридная кукуруза. - Москва, 1969, с.42-62. 13. Чалык Т.С., Белоус М.Т. Проявление жизнеспособности пыльцы кукурузы под влиянием стерильной цитоплазмы

молдавского типа и генов восстановителей фертильности // С/х биология. - 1973. - T.8. - 4. - C.523-531. 14. Гонтаровский В.А. Изменчивость признака мужской фертильности у цитостерильной кукурузы в различных

условиях окружающей среды // Генетика. - 1977. - T.13. - 11. - C.1900-1909. 15. Палилова А.Н. Цитоплазматическая мужская стерильность у растений. - Минск, 1969. - 208 с. 16. Marshall D.R., Thompson N.J., Nicholls G.H., Patrick C.M. Effects of temperature and day length on cytoplasmic

male sterility in cotton (Gossypium) // Australian Journal of Agricultural Research. - 1974. - Vol.25. - P.443-447. 17. Анащенко А.В. Генетика признака мужской стерильности у подсолнечника // Генетика. 1969. - T.45. - C.43-48. 18. Анащенко А.В. Достижения и перспективы селекции подсолнечника в мире. - Москва, 1977. - 53 с. 19. Duca M. Aspecte genetice şi fiziologice ale sistemului ASC-Rf la Helianthus annuus L.: Autoreferatul tezei

de doctor habilitat în biologie. - Chişinău, 1998. - 40 p.



67

20. Christov M. Sources of cytoplasmic male sterility produced at IWS “Dobroudja” // Biotechnol. & Biotechnol. - 1993, - Vol.7. - No4. - P.132-135.

21. Thakur R.P., Rao V.P., King S.B. Ergot susceptibility in. relation to cytoplasmic male sterility in pearl millet // Phytopathology. - 1989. - Vol.79. - P.1323-1326.

22. Hooker A.L., Smith D.R., Lim S.M., Musson M.D. Physiological races of Helminthosporium maydis and disease resistance // Plant Dis. Reptr. - 1970. - Vol.54. - No12. - P.1109-1110.

23. Smith D.R., Hooker A.L., Lim S.M. Physiologic races of Helminthosporium maydis // Plant Dis. Reptr. - 1970. - Vol.5410. - P.19-822.

24. Duvick D.N. Potential usefulness of new cytoplasmic male sterile and sterility system. - In: Proceedings of the 27th annual corn and sorghum research conference, 1972, p.197-201.

25. Serieys H. Identification, study and utilization in breeding programs of new cms sources // Helia. - 1999. - No22. - P.71-84.

26. Tavoljanskiy N.P., Chepurnaya A.L., Scherstyuk S.V., Tikhomirov V.T. Development of sunflower sterile CMS analogues on the base of different cytoplasmic backgrounds // Helia. - 2004. - No40. - P.251-256.

27. Serieys H. Identification, study and utilization of breeding programs of new CMS sources. - In: FAO Progress report of the working group. VII Consultation of European Cooperative Research Network on Sunflower, Pisa (Italy), 1991, p.11-13.

28. Serieys H. Report on the past activities of the FAO working group: „Identification, study and utilization of breeding programs of new CMS sources” for the period 1991-1993 // Helia. - 1994. - Vol.17. - No21. - P.93-102.

29. R. Horn, R.H. Köhler, K. Zetsche. A mitochonrial 16-kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower // Plant Molecular Biology. - 1991. - Vol.7. – P.26-33.

30. Duca M., Port A., Orozco-Cardenas M.L., Lovatt C. Mecanisme moleculare ale androsterilităţii ereditare şi induse la floarea-soarelui // Buletinul Academiei de Ştiinţe a Moldovei. - 2006. - Nr.1. - P.86-93.

31. Sambroke J et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Vol.1. - Cold Spring Harbour Laboratory, 1989. 32. Chenuil A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to

practical aspects // Genetica. - 2006. - No127. - P.101-120. 33. Indian Council for Agricultural Research, www.icar.delhi.nic.in 34. Henry R.J. Plant Genotyping: the DNA fingerprinting of plants. CAB International, 2001.




68

ASPECTE ALE STATUTULUI OXIDOREDUCĂTOR LA DIFERITE GENOTIPURI DE

FLOAREA-SOARELUI ATACATE DE LUPOAIE

Maria DUCA, Victoria POPESCU, Victor LUPAŞCU

Catedra Biologie Vegetală Accumulation of H2O2 and the activity of catalase in different genotypes of sunflower attacked by broomrape have

been analyzed in this work. The accumulation of H2O2 in normal conditions is specified by genotype, being more active in the Xenia variety.

The attack by broomrape leads to the intensification of the H2O2 synthesis in the analyzed genotypes, in particular in the Valentino variety.

The activity of catalase decreases in attacked plants of the Xenia and Valentino varieties at the level of leaves as a result of the accumulation of SRO. The quantity of H2O2 correlates with the quantity of enzyme, both in normal conditions and in the plants attacked by broomrape.

Creşterea şi dezvoltarea plantelor de cultură este permanent afectată de stresul biotic şi abiotic, care

influenţează morfologia, fiziologia şi, în final, productivitatea acestora. Anual, factorii de stres provoacă pierderi considerabile ale recoltei culturilor agricole [3].

Prin reacţiile de răspuns, care se declanşează în momentul percepţiei efectului extern [9], se activează multiple componente ale căilor de transmitere a semnalelor în sistemele fiziologice, contribuind la menţinerea homeostaziei celulare. În procesul de transmitere a semnalelor se include o reţea de interacţiuni atât în inte-riorul celulelor, cât şi dintre celule şi plantă în întregime, care au la bază diverse căi metabolice.

Au fost identificate mai multe reacţii de răspuns la infectarea plantelor de către organismele parazite, care includ majorarea activităţii peroxidazei şi a fenolilor [11], lignificarea [22], inducerea fitoalexinelor [25], ex-presia proteinelor specifice [14] etc. Expunerea plantelor la condiţii stresorice induce, de asemenea, produ-cerea de specii reactive ale oxigenului (SRO), aşa ca H2O2, radicali O2¯ şi OH¯ [13,18,28], care modifică statutul redox celular [8]. SRO sunt sintetizate în plante ca componenţi ai metabolismului aerob, care decurge în diferite organite celulare (mitocondrii, plastide şi peroxozomi), în urma transportului de electroni, a reac-ţiilor mediate de enzime în procesul de fotorespiraţie, β-oxidării etc. [1]

Pe de o parte, SRO sunt molecule înalt reactive faţă de lipidele membranare, proteine şi ADN, reprezentând principalii factori care contribuie la apariţia leziunilor ce deteriorează activitatea funcţională a celulelor [7] şi, respectiv, moartea acestora [20]. Pe de altă parte, speciile reactive ale oxigenului, la fel ca şi acidul salicilic, etilena şi alţi compuşi [16], sunt implicate în transducerea semnalelor [12] şi în activarea genelor de protecţie [13,18,28] şi, respectiv, în mecanismul de protecţie contra agenţilor patogeni [2].

Nivelul înalt de SRO stimulează producerea acidului ascorbic, glutationului, α-tocoferolului şi a carote-noizilor [10], care contribuie la activarea enzimelor antioxidante – superoxiddismutazei, catalazei şi peroxi-dazei [15]. Drept reacţie de răspuns la sporirea concentraţiei de specii reactive ale oxigenului s-a constatat şi activarea proteinelor de şoc, care protejează sistemul enzimatic celular împotriva proceselor oxidative [4], în special proteazelor cu rol de degradare a proteinelor deteriorate [26].

Reieşind din cele sus-menţionate, scopul lucrării rezidă în analiza parametrilor statutului oxidoreducător al plantelor prin prisma acumulării peroxidului de hidrogen (H2O2) şi activităţii catalazei (CAT) în sistemul-model de interacţiune gazdă-parazit pe exemplul florii-soarelui atacate de lupoaie.

Material şi metode Ca material de studiu au servit două familii de floarea-soarelui (Valentino şi Xenia), reprezentate de hibrizii

şi liniile lor parentale, oferite de către AŞP „Magroselect” SRL (or.Soroca). Genotipurile respective au fost testate faţă de atacul lupoaiei (Orobanche cumana Wallr.), colectate de la plantele de floarea-soarelui infectate în vara anului 2006 din zona de centru a Republicii Moldova. Seminţele de lupoaie au fost separate de inflo-rescenţe uscate şi păstrate la întuneric la temperatura camerei.



69

Condiţiile de cultivare in vivo. Inocularea artificială a plantelor a fost efectuată în vase de vegetaţie, în care s-a introdus mixtura de sol (nisip: turbă, 1:1, v/v) uniform infectată cu seminţe de lupoaie (la 200 g amestec s-a adăugat 30 mg seminţe) [21]. Amestecul de sol a fost udat cu 100 ml apă şi vasele au fost lăsate 7 zile pentru precondiţionarea lupoaiei, după care au fost plantate seminţele de floarea-soarelui germinate timp de 2 zile. Vasele au fost expuse în camera de cultivare, la temperatura de 14-16°C cu fotoperioada de 12-14 ore şi umiditatea de 60%.

Floarea-soarelui a fost prelevată după 11 săptămâni de la plantare, fiind analizată activitatea catalazei şi detectată prezenţa H2O2.

Determinarea prezenţei peroxidului de hidrogen. Ca substrat pentru identificarea vizuală a H2O2 în frunze a servit 3,3-diaminobenzidina (DAB). Limbul foliar împreună cu peţiolul s-a detaşat de la plantă cu bisturiul şi a fost incubat în soluţie de 1mg/ml DAB, pH 3,8, timp de 8 ore la lumină, la 25ºC. Apoi, frunzele au fost fierte 2-3 min. în etanol 96%. Acest tratament a decolorat frunzele, cu excepţia zonelor brune, unde a avut loc polimerizarea peroxidului cu DAB [18]. Pentru analiză au fost luate frunzele etajului superior al plantei.

Determinarea activităţii catalazei prin metoda gazometrică [30]. În cadrul analizei au fost luate 0,3 g material vegetal, majorat cu CaCO3 pentru crearea mediului bazic (pH 7,7), la care, în scopul obţinerii unei mase omogene, s-a adăugat apă. Amestecul s-a transferat în braţul mare al vasului de reacţie, iar în braţul mic s-au adăugat 5 ml H2O2 de 3%. Vasul s-a unit la gazometru, soluţiile din vas amestecându-se timp de 3 min. S-a determinat volumul O2 degajat (ml O2/1g/min ).

Prelucrarea statistică a datelor s-a efectuat prin analiza dispersională, datele fiind comparate în baza criteriului Fisher şi prin estimarea limitei semnificative a diferenţei (LSD) pentru P = 0,95 şi P = 0,99 [29]. Calculele s-au realizat cu utilizarea aplicaţiei Microsoft Excel.

Rezultate şi discuţii Lupoaia reprezintă un parazit angiosperm lipsit de clorofilă, care utilizează în procesul de creştere şi dez-

voltare asimilatele din planta-gazdă, provocând scăderea producţiei atât sub aspect cantitativ, cât şi calitativ. Infectarea plantelor de floarea-soarelui cu lupoaie, prin penetrarea de către parazit a celulelor din sistemul radicular, provoacă un efect de stres. Celulele răspund la semnalele mecanice sau chimice din peretele celular prin modificarea diferiţilor indici ai metabolismului celular [11,14,22,25] şi difuzează aceste semnale, pre-ponderent la nivel de plasmodesme, în tot corpul plantei.

Una dintre reacţiile primare ale plantelor la acţiunea factorilor externi este stresul oxidativ, sau „explozia” oxidativă, determinată de modificarea potenţialului electrochimic membranar şi de acţiune [8], care poate fi moni-torizat prin cuantificarea potenţialului redox, a metaboliţilor asociaţi cu stresul oxidativ (peroxidul de hidrogen, glutationul etc.), a enzimelor metabolismului oxidativ (catalaza, peroxidaza etc.) şi a proteinelor de şoc [5].

Rezultatele obţinute de noi în cadrul analizei semicantitative a H2O2 prin colorare cu ajutorul DAB a atestat prezenţa acestuia în frunze atât în condiţii normale, cât şi în urma atacului, însă în concentraţii diferite. Astfel, la familia Xenia, acumularea excesivă a H2O2 s-a depistat la toate genotipurile atât în normă, cât şi pe fon de infecţie. Prezenţa peroxidului s-a manifestat cel mai pronunţat la forma paternă şi hibrid, indicând astfel o specificitate de genotip (Fig.1).

F1 control

F1 infectat

Fig.1. Acumularea peroxidului de hidrogen la familia Xenia (săgeţile arată zonele întunecate unde a avut loc acumularea peroxidului).



70

O vădită reacţie de răspuns la atacul patogenului a fost atestată la familia Valentino, unde la control H2O2 practic nu este prezent, pe când la plantele afectate de lupoaie s-a atestat o acumulare excesivă a acestuia la toate genotipurile familiei, dovadă a reacţiei de răspuns la atacul lupoaiei (Fig.2).

Întrucât orice reacţie de stres provoacă acumularea excesivă a peroxidului de hidrogen (ca una dintre

reacţiile primare de răspuns [1,19]) şi, reieşind din faptul că planta parazit lupoaia produce cantităţi mari de antioxidanţi [27], considerăm demonstrat rolul sistemului redox în interacţiunea parazit-gazdă [6,17]. Deoarece familia Xenia pune în evidenţă un nivel sporit de toleranţă faţă de lupoaie, comparativ cu celelalte genotipuri cercetate, putem considera că concentraţiile sporite ale peroxidului, constatate la genotipurile care alcătuiesc această familie, se asociază cu majorarea rezistenţei faţă de patogeni. Infectarea florii-soarelui cu acest parazit intensifică puternic acumularea H2O2 la locul infecţiei, fiind determinată de un complex de mecanisme de reglare a conţinutului acestora [13], dar nu este clar dacă acumularea H2O2 este declanşată de planta-gazdă, de parazit sau de ambele organisme [23].

Reglarea şi autoreglarea conţinutului SRO în plante se realizează la nivel de mecanisme enzimatice (acţiunea superoxiddismutazei, catalazei, peroxidazei etc.) şi neenzimatice (antioxidanţii, glutationul), care contribuie la menţinerea echilibrului oxidoreducător şi a homeostaziei celulare [13].

Rezultatele cercetărilor asupra activităţii catalazei (CAT, EC 1.11.1.6.), una dintre cele mai răspândite enzime din clasa Oxidoreductazelor, cu funcţie de protecţie a celulelor contra SRO, a demonstrat că activi-tatea CAT în frunzele genotipurilor de floarea-soarelui infectate scade faţă de control.

În frunze se expresează gena cat1, care codifică una dintre formele izoenzimatice ale catalazei (CAT-1), activă în primele etape ontogenetice ale plantei [24]. Deoarece la genotipurile de floarea-soarelui analizate a fost atestată acumularea SRO, s-a presupus că activitatea CAT este redusă din cauza supresiei genei cat1 [6], întrucât se cunoaşte că în urma majorării SRO în celulele supuse stresului scade activitatea enzimei [28], ceea ce s-a observat la plantele studiate în condiţii normale şi infectate.

Astfel, activitatea CAT variază între 17,89-83,67 ml O2/1g m.v. Cele mai mari valori ale activităţii enzimei în frunze la familia Xenia s-au constatat la linia maternă, valorile obţinute la linia paterna şi hibrid fiind la nivelul genotipului matern. Pe fundal de infecţie, activitatea CAT scade la toate genotipurile familiei Xenia: cu 76,43% la linia maternă, cu 34,65% la linia paternă şi cu 20,86% la hibrid.

Activitatea CAT la genotipurile, care alcătuiesc familia Valentino, atestă valori mai mici faţă de familia Xenia în condiţii normale, rezultatele fiind confirmate şi de prezenţa redusă a H2O2 (Fig.3), excepţie făcând hibridul care are valori de 83,67 ml O2/1g m.v. La genotipurile parentale activitatea enzimei variază ne-semnificativ – între 50,0 şi 45,89 ml O2/1g m.v. Pe fon de infecţie, se atestă o scădere a activităţii catalazei, cu excepţia genotipului matern, unde s-a observat o creştere nesemnificativă, pe când la hibrid se atestă o diminuare a CAT – cu 49,11%.

F1

control

F1

infectat

Fig.2. Acumularea peroxidului de hidrogen la familia Valentino (săgeţile arată zonele întunecate unde a avut loc acumularea peroxidului).



71

Fig.3. Activitatea catalazei în frunzele plantelor de floarea-soarelui. ( ** P<0,01)

Întrucât lupoaia este un rizoparazit, percepţia (la nivelul receptorilor) şi transmiterea semnalelor (prepon-

derent prin xilem şi floem), ca rezultat al infectării, se iniţiază la nivelul sistemului radicular. Din aceste considerente, a fost studiată activitatea catalazei în rădăcinile plantelor de floarea-soarelui în condiţii normale de creştere şi pe fundal de infecţie cu lupoaie. S-a constatat că activitatea enzimei este mai redusă comparativ cu datele obţinute la nivelul frunzelor şi variază în limitele de 3,56-15,78 ml O2/1g m.v. Cele mai mari valori s-au obţinut la genotipul patern al familiei Xenia. Pe fon de infecţie se observă o diminuare nesemnificativă a activităţii CAT la linia maternă şi hibrid şi o diminuare semnificativă (cu 19,01%) la linia paternă (Fig.4).

Fig.4. Activitatea catalazei în rădăcina plantelor de floarea-soarelui. ( ** P<0,01, *P<0,05)

Diminuarea activităţii catalazei în frunze în condiţii de infectare corelează cu cea din rădăcină doar în

cazul genotipurilor familiei Xenia, pe când la genotipurile din familia Valentino s-a atestat un fenomen invers, observându-se o majorare semnificativă a activităţii enzimei în sistemul radicular la genotipurile infectate (21,95-93,60%). Sporirea activităţii CAT poate fi explicată prin acumularea excesiva a SRO în plantă, în special la locul infecţiei, acumularea dată fiind declanşată atât de planta-gazdă, cât şi de parazit [23]. Totodată, a fost stabilit că valorile parametrului studiat la genotipurile infectate nu se deosebesc semnificativ (Valentino – 8,0 ml O2/1g m.v., Valentino – 8,17 ml O2/1g m.v., Valentino F1 - 8,11 ml O2/1g m.v.,).

Astfel, rezultatele obţinute demonstrează că familia Valentino este susceptibilă la atacul lupoaiei.

XENIA VALENTIO

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

** F1

ml O

2 la

1g/

min control infectat

01

23

456

78

910

** ** F1*

mi O

2 la

1 g

/min control infectat

XENIA VALENTINO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

** F1

Act

ivita

tea

CA

T m

l O2

la 1

g/m

in control infectat

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

F1**

Act

ivita

tea

CA

T m

l O2

la 1

/min

g control infectat

Act

ivita

tea

CA

T m

l O2 l

a 1

g/m

in

Act

ivita

tea

CA

T m

l O2 l

a 1

g/m

in

ml O

2 la

1 g/

min

ml O

2 la

1 g/

min



72

Concluzii

1. Acumularea peroxidului în condiţii normale manifestă specificitate de genotip, fiind mai pronunţată la familia Xenia şi practic lipseşte la familia Valentino. Atacul cu lupoaie induce intensificarea sintezei H2O2 la genotipurile analizate, în special la reprezentanţii familiei Valentino, constituind una dintre reacţiile primare de răspuns ale plantelor la stres.

2. Activitatea catalazei scade pe fon de infecţie la familiile Xenia şi Valentino la nivelul frunzelor ca rezultat al acumulării SRO. Cantitatea H2O2 corelează cu activitatea enzimei, atât în condiţii normale, cât şi în urma atacului lupoaiei, fiind relevată prin diminuarea acestui indice.

3. Diminuarea activităţii catalazei în frunze în condiţii de infectare corelează cu cea din rădăcină doar în cazul genotipurilor familiei Xenia, pe când la genotipurile din familia Valentino s-a atestat un fenomen invers, ceea ce denotă o mai mare susceptibilitate a familiei date faţă de parazit.

Referinţe:

1. Apel K. and Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annu. Rev. Plant Biol. - 2004. - No.55. - P.373-399.

2. Bolwell G.P., Butt V.S.,Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants. // Free Radic. Res. - 1995. - Vol.23. - P.517-523.

3. Boyer J.S. Plant productivity and environment // Science. - 1982. - Vol.218. - P.443-448. 4. Burdon R.H. Stress protein in plants // Bot. L. Scotl. - 1993. - Vol.46. - P.463-475. 5. Cassells A.C and Curry R.F. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue

culture: implications for micro propagators and genetic engineers // Plant Cell, Tissue and Organic Culture. - 2001. - No.64. - P.145-157.

6. Chamnongpol S., Willekens H., Moeder W. et al. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H2O2 in transgenic tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Plant Biology. - 1998. - No.95. - p.5818-5823.

7. Desikan R., Hancock J.T., Neill S.J. Oxidative stress signaling. – In: Hirt and K.Shinozaki (eds.). Plant responses to abiotic stress: topic in current genetics. - Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York, 2003, p.121-148.

8. Duca M., Port A., Romanciuk L., Duca Gh. The redox state of aquatic medium and plants germination process regulation // Self-purification processes in natural waters. - Chisinau, 1995, p.245-256.

9. Duncan R.R. Plant tolerance to acid soil constraints: genetic resources, breeding methodology and plant improvement // Plant-Environment Interactions, 2nd ed. - New York, 2000, p.1-38.

10. Gille G., Siegler K. Oxidative stress and living cells // Folia Microbiol. - 1995. - Vol.40. - P.131-152. 11. Goldwasser Y., Hershenhorn J., Plakhine D., Kleifeld Y., Rubin B. Biochemical factors involved in vetch resistance

to Orobanche aegyptica // Physiological and Molecular plant Pathology. - 1999. - Vol.54. - P.87-96. 12. Hammond-Kosack K.E., Jones D.C. Resistance genre-dependent plant defense responses // Plant Cell. - 1996. -

Vol.8. - P.1773-1791. 13. Hung S.H., Yu C.W., Lin C.H. Hydrogen peroxide functions as a stress signal in plants // Bot. Bull. Acad. Sin. -

2005. - Vol.46. - P.1-10. 14. Joel D.M., Partnoy V.H. The angiospermous root parasite Orobanche L. (Oronancheaceae) induces expression of

pathogenesis related (PR) gene in susceptible tobacco roots // Annals of Botany. - 1998. - Vol.81. - P.779-781. 15. Larson R.A. Plant defenses against oxidative stress // Arch. Insect Biochem. Physiol. - 1995. - Vol.29. - P.175-186. 16. Leon, J., Lawton M.A., Raskin I., Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco // Plant

Physiolo. - 1995. - Vol.108. - P.619-629. 17. Mittler R., Herr E.H., Orvar B.L. et al. Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive

oxygen intermediates are hyper responsive to pathogen infection // PNAS. - 1999. - No.96(24). - P.14165-14170. 18. Orozco-Cardenas M., Ryan C.A. Hydrogen peroxide is generated systematically in plant leaves by wounding and

system via the octadecanoid pathway // Plant Biology. Proc. (Natl. Acad. Sci. USA) - 1999. - No.96. - P.6553-6557. 19. Orozco-Cardenas M., Narvaez-Vasquez J., Ryan Clarence A. Hydrogen peroxide acts as a second messenger for the

induction of defense genes in tomato plants in response to wounding, system, and methyl jasmonate // The Plant Cell. - 2001. - No.13. - P.179-191.

20. Orozco M.L. and Glijin A. The role of reactive oxygen species in plant defense responses // Conferinţa ştiinţifică internaţională „Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate pe cunoaştere”. Ştiinţe reale, 28 septembrie. - Chişinău, 2006, p.281.

21. Panchenko A.Y. Early diagnosis of broomrape resistance in breeding and improving seed production of sunflower (in Russia) // Viestnik, Sielkskkojosia Stevennog Nauki. - 1975. - Vol.2. - P.107-115.



73

22. Perez-de-Luque A., Rubiales D., Cubero J.I., Press M.C., Scholes J., Yonezama K., Takeuchi Y., Plakhine D., Joel D.M. Interaction between Orobanche crenata and its host legumes: unsuccessful haustorial penetration and necrosis of the developing parasite // Annals of Botany. - 2005. - Vol.45. - P.379-385.

23. Sauerbon J., Buschmann H., Ghiasvand Ghisasi K., Kogel K.-H. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower (Helianthus annuus) to the root-parasite weed Orobanche cumana // Genetics and resistance. - 2002. - Vol.92. - No.1. - P.59-64

24. Schultes N. P., Zelitch I., McGonigle B. et al. The primary leaf catalase gene from Nicotiana tabacum and Nicotiana sylvestris // Plant Physiology. - 1994. - Vol.106. - P.399-400.

25. Serghini K., Perez-de-Luque A., Castejon-Munoz M., Garcia-Torres L., Jorrin J.V. Sunflower (Helianthus annuus L.) response to broomrape (Orobanche cernua Loefl.) parasitism: induced synthesis and excretion of 7-hydroxylated simple coumarins // Jornal of Experimental Botany. - 2001. - Vol.52. - P.2227-2234.

26. Stadtman E.R. Protein oxidation and ageing // Science. - 1992. - Vol.258. - P.1220-1224. 27. Viron C., Lhermite S., Andre P., Lafosse M. Isolation of phenylpropanoid glycosides from Orobanche rapum by

high speed countrecurrent chromatography // Phytochem. Anal. - 1998. - Vol.9. - P.39-43. 28. Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у растений // Успехи биологической химии. - 2001. - Т.41. - С.3-38. 29. Доспехов А. Методы полевого опыта. - Москва: Агропромиздат, 1985. 30. Третьякова Н.Н. Практикум по физиологии растений. - Москва: Kолос, 1982, c.134.

Notă: Lucrarea a fost realizată în cadrul Proiectului instituţional 06.407.026F finanţat de CSŞDT al AŞM.




74

СОМАТИЧЕСКИЙ ГЕТЕРОЗИС У ОГУРЦА Cucumis sativus L.

Мария ДУКА, Татьяна ХОМЕНКО, Анжела ПОРТ, Людмила Гусева*, Доган ОЗДЕМИР

Кафедра биологии растений *НИИОЗиО, г.Тирасполь

Lucrarea reprezintă studiul fenomenului de heterozis la diverse genotipuri hibride de castraveţi (Cucumis sativus L.).

Rezultatele obţinute atestă modificarea caracterelor morfofiziologice. Evidenţierea legităţilor dintre ele va permite estimarea graduluii de heterozis, în dependenţă de suprafaţa foliară, volumul sistemului radicular şi intensitatea fotosintezei, care determină productivitatea plantei. S-a constatat că la castraveţi preponderent se manifestă heterozisul somatic.

The present paper is concerned with the study of heterosis at various hybrid genotypes of cucumber (Cucumis sativus L.).

There were analysed several morphological and physiological characters. Revealing the interdependence between them will allow to estimate the level of heterosis based on the correlations between leave area, root system volume and photo-synthesis intensity, which determines plant productivity. Mostly somatic heterosis was observed for the investigated genotypes.

Гетерозис – одна из актуальных проблем современной генетики и селекции. К настоящему времени

достигнуты значительные успехи по практическому использованию этого сложного биологического явления, однако природа его еще далеко не ясна.

Все больше становится данных о том, что первопричины гетерозиса заложены в генетическом аппа-рате, в каких-то деталях структуры и регуляции геномов гибридного организма. Биохимики и физиологи чаще всего имеют дело лишь с проявлениями или реализацией гетерозиса на разных уровнях органи-зации метаболизма и формообразовательных процессов. В расшифровке природы гетерозиса и поиске эффективных путей его использования в растениеводстве должны помочь принципы и методы современной биологии – молекулярной биологии и молекулярной генетики.

В гетерозисной селекции особенно актуальны проблемы идентификации и маркирования инбредных линий, контроль их генетической чистоты и оценка уровня гибридности семян межлинейных гибридов первого поколения.

Различают лабильный и стабильный, или фиксированный гетерозис [4]. Лабильный гетерозис проявляется лишь в первом поколении (F1) и затухает в последующих поколениях, тогда как фиксиро-ванный, включаясь в гомозиготную конституцию организма, закрепляется в его генетических системах и становится достоянием эволюции. В поле зрения селекционера обычно находится положительный лабильный гетерозис. В 1951 г. Густавсон предложил выделять 3 типа проявления гетерозиса: сомати-ческий, репродуктивный и адаптивный. При соматическом гетерозисе наблюдается сильный рост вегетативных частей гибридного растения, при репродуктивном – наиболее сильно развиваются репро-дуктивные органы, имеет место повышенная фертильность, высокий урожай семян, плодов, а при адаптивном – повышенная жизненность гибридов, их приспосабливаемость и выживаемость [11].

Сущность гетерозиса может быть до конца понята лишь на основе фундаментальных знаний не только генетических, но и морфогенетических процессов, связанных с этим явлением. В этом отношении особое значение приобретает анализ генетической структуры и морфогенетической сущности сложных биоло-гических свойств и хозяйственных признаков, поскольку гетерозис реализуется прежде всего в их раз-витии. Значимость этой проблемы состоит также в том, что эти свойства и признаки являются важ-нейшими аспектами изучения генофонда вида [1, 10].

Перспективы раскрытия природы гетерозиса связаны с надеждами на разработку быстрых и точных методов оценки комбинационных способностей линий и прогнозирование гетерозиса на ранних этапах онтогенеза.

Материал и методы исследования Материалом для исследований служили различные родительские линии (материнские и отцовские)

огурца Cucumis sativus L. и их гетерозисные гибриды первого поколения, предоставленные лабораторией селекции НИИ орошаемого земледелия и овощеводства г.Тирасполя.


75

Были использованы пять исходных материнских форм огурца, три отцовских линии (из них райони-рованные сорта – Береговой и Фаворит) и семь гибридов первого поколения (F1), из которых первых три (Н 273, Н 274, Н 275) обладали высокой продуктивностью, а гибриды Н 6 и Н 7 – низкой продук-тивностью. Контролем служили районированные гибриды первого поколения F1Взгляд и F1Эпилог (табл. 1).

Таблица 1

Генотипическая структура исследуемых гибридов Cucumis sativus

Высокопродуктивные гибриды Контроль Низкопродуктивные

гибриды Родительская форма

H 274 H 275 H 273 Взгляд Эпилог H 6 H 7

Л 203 Л 226 Л 222 Л 371 Л 371 Л 222 Л 222

Л 216 Л 203 Л 203 Береговой Фаворит Береговой Фаворит

Анализировались растения огурца в фазе 3-х настоящих листьев. Для определения энергии прорас-

тания, всхожести семян, зеленой и сухой биомассы, объема корневой системы, общей площади лис-товой поверхности, содержания хлорофиллов и каротиноидов, интенсивности фотосинтеза были использованы известные методы, апробированные на кафедре биологии растений [2, 6].

Математическая обработка экспериментальных данных проводилась стандартными методами [8]. Повторность – трехкратная.

Результаты и обсуждение Функциональные аспекты гетерозиса у растений особенно детально изучались биохимиками и физио-

логами по поводу фотосинтеза, дыхания, активности ферментов, биологически активных соединений, энергетического обмена, накопления питательных веществ и структуры урожая [14], однако многие вопросы остаются не до конца раскрытыми.

Нами собран и обработан экспериментальный материал, характеризующий некоторые гибридные комбинации Cucumis sativus L. различной продуктивности и их родительские формы на эффект гете-розиса по различным морфофизиологическим показателям.

Накопление сухой и зеленой биомассы растениями является одним из важных морфологических признаков, по которому судят о их продуктивности.

Результаты наших исследований показывают, что по накоплению зеленой биомассы (табл. 2) у гиб-ридов первого поколения показатели варьируют в пределах от 14,98 г (Н 7) до 26,66 г (Н 274).

Все высокопродуктивные гибриды характеризовались и наиболее обильной зеленой биомассой. Эта же закономерность сохранялась и при анализе сухой биомассы. Однако эти показатели не всегда пре-вышали контрольный вариант.

Отметим, что самый низкий процент гетерозиса, в сравнении с наилучшим родителем, по накоплению зеленой биомассы отмечен у низкопродуктивных гибридов Н 6 (0,53%), Н 7 (4,94%) а также у Н 273 (3,48%), являющегося партенокарпическим высокопродуктивным гибридом. Все перечисленные гибриды содержат в качестве материнской линии Л 222. Однако отмеченная закономерность не наблюдается в случае анализа эффекта гетерозиса по сухой биомассе.

Линия Л 203 показала высокий герозис в комбинации с Л 226 и Л 216 в гибридах Н 275 и Н 274 и существенно более низкий эффект гетерозиса с линией Л 222 в гибридной комбинации Н 273. Анало-гичную закономерность можно проследить, сравнивая между собой гибриды F1Взгляд и Н 6, и F1Эпилог и Н 7, имеющие одинаковые отцовские формы (Береговой и Фаворит).

Накопление зеленой и сухой биомассы отражает интенсивность роста вегетативных органов, ввиду чего можно прогнозировать долю соматического гетерозиса. Результаты проведенных исследований показали, что характер проявления гетерозиса изменяется от одной комбинации к другой (табл. 2).



76

Таблица 2 Накопление зеленой и сухой биомассы у Cucumis sativus L.

Высокопродуктивные гибриды Н 275, Н 274 и Н 273 проявили высокий процент гетерозиса как по

сравнению со средним показателем исходных родительских форм, так и по сравнению с максимальным показателем одной из родительских форм. Районированные гибриды, используемые в качестве стандарта, также показали высокий гетерозис (по зеленой биомассе – 12,95% у F1Взгляд и 26,5% у F1Эпилог, а по сухой биомассе – соответственно 60,8% и 44,73%). У гибридов Н 6 и Н 7, как по сухой, так и по зеленой биомассе, показатели были ниже контрольных.

Корневая система активно участвует в создании аминокислот, необходимых для построения белков во всех других органах растительного организма [12]. В корнях происходят превращения минеральных соединений фосфора, который используется для синтеза нуклеопротеидов и липидов и с восходящим током поступает в различные органы растений. Корневая система способна синтезировать алкалоиды и другие соединения. Определенные этапы в цепи процессов синтеза хлорофиллов и других пигментов тесно связаны с реакциями, протекающими в корневых системах [3].

Таким образом, корневая система оказывает влияние на различные процессы обмена веществ в наземных частях растения. Функции корневой системы обусловлены ее размерами, формированием различных видов корней, т.е. ёе объемом (табл. 3).

Название комбинации

Зеленая биомасса

(г)

% гетерозиса

по сравнению со средним родителем


по сравнению с лучшим родителем

Сухая биомасса (г)





H 275 22,52 21,14 19,53 3,57 37,82 29,41 L 226 17,40 1,92 L 203 18,12 2,52

H 274 26,66 31,70 31,36 4,35 42,30 42,07 L 203 18,12 2,52 L 216 18,30 2,5

H 273 18,96 27,48 3,48 4,24 53,77 40,57 L 222 9,38 1,40 L 203 18,12 2,52

Взгляд 19,30 12,95 3,32 2,75 44,73 33,82 L 371 18,66 1,82 Береговой 14,94 1,22

Эпилог 22,38 26,50 16,62 4,26 60,80 57,28 L 371 18,66 1,82 Фаворит 14,24 1,52

H 6 15,02 19,04 0,53 1,60 8,75 5,00 L 222 9,38 1,40 Береговой 14,94 1,52

H 7 14,98 21,16 4,94 1,40 27,14 12,85 L 222 9,38 0,82 Фаворит 14,24 1,22


77

Таблица 3

Длина растений и объем корневой системы


Длина (см)





Объем корневой системы

(см3)

% гетерозиса по сравнению со средним родителем



H 275 18,83 16,01 9,03 2,5 30,00 20,00 L 226 14,5 1,5 L 203 17,13 2,0

H 274 17,35 2,51 1,27 3,5 34,29 25,71 L 203 17,13 2,0 L 216 16,7 2,6

H 273 14,73 3,05 -16,29 3,0 41,67 33,33 L 222 11,43 1,5 L 203 17,13 2,0

Взгляд 18,35 11,42 8,56 2,5 10,00 0,00 L 371 15,73 2,0 Береговой 16,78 2,5

Эпилог 16,97 -3,71 -14,73 2,3 23,91 13,04 L 371 15,73 2,0 Фаворит 19,47 1,5

H 6 19,2 26,54 12,60 2,0 0,00 -25,00 L 222 11,43 1,5 Береговой 16,78 2,5

H 7 16,79 7,98 -15,96 2,0 25,00 25,00 L 222 11,43 1,5 Фаворит 19,47 1,5

По данному показателю гибридные комбинации не сильно варьируют, от 1,5 до 3,5 см3, что объяс-

няется начальными фазами онтогенеза растений. В большинстве случаев объем корневой системы значительно выше у гибридов F1 по сравнению с родительскими формами. Самый низкий эффект гетерозиса по этому показателю наблюдается у стандартного гибрида F1Взгляд, который, возможно, зависит от генотипа отцовского родителя. Это подтверждает и гибрид Н 6, у которого присутствует аналогичная отцовская форма (Береговой), показывающая нулевой или отрицательный эффект в первом поколении по сравнению с родительскими формами.

Длина растений на момент снятия опыта варьировала в пределах от 11,43 см у Л 222 до 19,42 см у Фаворита. В данном случае не наблюдается четкой закономерности превосходства гибридов F1 ни по сравнению с лучшей родительской формой, ни по среднему показателю родительских компонентов. Как у высокопродуктивных, так и у низкопродуктивных гибридов наблюдается отрицательный эффект гете-розиса по сравнению с лучшими родительскими формами. Однако даже такая изменчивость может помочь в определении степени гетерозиса и зависимости между площадью листовой поверхности, объемом корневой системы и интенсивностью фотосинтеза, так как все данные параметры закономерно влияют на интенсивность фотосинтеза.

Изменение площади листовой поверхности и интенсивности фотосинтеза Высокая продуктивность гибридов обусловлена и большой листовой поверхностью. Обычно гиб-

ридные растения формируют листовую поверхность, в 1,5 раза бόльшую, чем исходные формы [7, 9], а наибольший хозяйственный и биологический урожай достигается при определенной площади листо-



78

вой поверхности, чаще всего примерно равной 30000 м2/га. При большей или меньшей площади про-исходит снижение интенсивности фотосинтеза или ввиду затенения листьями друг друга (при их боль-шом количестве), или из-за малой площади фотосинтетической деятелъности. Наиболее благоприятные условия для формирования урожая овощных культур создаются тогда, когда общая площадь листьев примерно в 3-4 раза превышает площадь, занимаемую растениями [9].

Данные, полученные при изучении площади листовой поверхности у различных гибридных комби-наций Cucumis sativus L. (табл. 4), свидетельствуют о том, что гибридные комбинации по этому признаку варьируют в широких пределах. У гибридов F1 H 275, H 274, H 273 наблюдается гетерозисный эффект по площади листовой поверхности на уровне стандартных районированных гибридов (22,47%, 20,69% и 25% по сравнению со стандартом – 23,96% у F1 Эпилога). Стандартный гибрид F1Взгляд показал отрицательный гетерозисный эффект. Гибриды с низкой продуктивностью оказались на уровне стан-дартных гибридов по данному показателю.

Процессы фотосинтеза, будучи главным фактором продуктивности растений, особенно часто иссле-довались для обнаружения критериев гетерозиса. Было показано, что длительный инбридинг вызывает депрессию, особенно у линий с низкой комбинационной способностью. У ряда культур наблюдалось превосходство гибридов над самоопыленными линиями по интенсивности фотосинтеза, однако стро-гой закономерности не обнаружено [5].

Высокий гетерозисный эффект по интенсивности фотосинтеза наблюдается у гибридов Н 275 и Н 273 (35,61% и 33,25%). У этих же гибридов эти данные согласуются с высоким гетерозисным эффектом по площади листовой поверхности (табл. 4).

Таблица 4 Площадъ листовой поверхности и интенсивностъ фотосинтеза

у разных генотипов Cucumis sativus L.


Площадь листовой

поверхности (см2) Х ± mх

% гетерозиса по

сравнению со средним родителем



Интенсивность фотосинтеза

(мг СО2/дм2 час)




сравнению с лучшим родителем

H 275 8,9±1,1 22,47 21,35 1,39 35,61 13,67 L 226 7,0±1,3 0,59 L 203 6,8±1,2 1,20

H 274 8,7±0,2 20,69 19,54 1,38 13,77 13,04 L 203 6,8±1,2 1,20 L 216 7,0±02 1,18

H 273 8,8±0,9 25,00 22,73 1,28 33,20 6,25 L 222 6,4±0,5 0,51 L 203 6,8±1,2 1,20

Взгляд 7,2±0,8 -5,11 -11,82 1,36 81,25 73,53 L 371 8,1±0,7 0,36 Береговой 7,1±0,1 0,15

Эпилог 9,6±0,8 23,96 15,63 0,66 47,73 45,45 L 371 8,1 ± 0,7 0,36 Фаворит 6,5±0,7 0,33

H 6 7,5±1,3 14,00 13,33 0,59 44,07 13,56 L 222 6,4±0,5 0,51 Береговой 6,5±0,7 0,15

H 7 8,3±0,5 18,67 14,46 0,67 37,31 23,88 L 222 6,4±0,5 0,51 Фаворит 7,1 ±0,1 0,33


79

Контрольные гибриды показали также высокий гетерозисный эффект по интенсивности фотосинтеза (81,25% и 47,73% по сравнению со средним показателем исходных родительских форм и 73,53% и 45,45% по сравнению с максимальным показателем одной из родительских форм).

Низкоурожайные гибриды Н 6 и Н 7 проявили различную степень гетерозиса. Итак, высокий эффект гетерозиса в большинстве случаев отмечается в тех комбинациях, родительские формы которых четко отличаются друг от друга по данному показателю.

Изменение содержания фотосинтетических пигментов у Cucumis sativus L. Изучение содержания зеленых и желтых пигментов является очень важным физиологическим при-

знаком, влияющим на фотосинтез и важнейшие процессы роста и развития растений. Установлено, что фотосинтетический потенциал и высокий урожай в F1 сочетаются с высоким содержанием хлорофилла в листьях и умеренным балансом СО2 при высоких температурах [7]. Первый признак доминантный, второй – рецессивный. Эти показатели сопряжены с хорошей комбинационной способностью и реко-мендованы в качестве критериев при подборе родительских форм [10, 13].

Исходя из данных таблиц 5 и 6, отметим, что гетерозисный эффект по содержанию хлорофилла «а» и «б» у высокопродуктивных гибридов находится на уровне контрольного гибрида F1 Эпилог, однако процент гетерозиса по сравнению с одной из максимальных форм сильно варьирует. Гибриды с низкой урожайностью показали отрицательный гетерозисный эффект (табл. 5).

Таблица 5 Содержание хлорофилла «а» и «б» у разных генотипов Cucumis sativus L.


Хлорофилл«а», х ± mх



% гетерозиса по сравнению с лучшим родителем

Хлорофилл «б»

х ± mх

% гетерозиса по сравнению с со средним родителем

% гетерозиса по сравнению с

лучшим родителем

H 275 10,73±0,5 18,03 14,45 8,36±0,1 12,92 3,47 L 226 8,41±0,3 8,07±0,8 L 203 9,18±0,5 6,49±0,3

H 274 10,16±1,1 6,55 3,44 5,38±0,6 -20,82 -21,00 L 203 9,18±0,7 6,49±0,4 L 216 9,81±0,5 6,51±0,3

H 273 9,59±0,5 10,58 4,28 6,39±0,3 8,45 -1,56 L 222 7,97±0,9 5,21±0,4 L 203 9,18±0,5 6,49±0,3

Взгляд 7,13±0,5 -14,52 -22,16 7,68±0,3 23,31 16,54 L 371 8,71±0,7 6,41±0,4 Береговой 7,62±0,3 5,37±0,2

Эпилог 8,95±0,3 12,12 2,68 6,55±0,2 13,89 2,14 L 371 8,71±0,7 6,41±0,4 Фаворит 7,02±0,9 4,87±0,5

H 6 7,53±0,6 -3,52 -5,84 5,22±0,2 -1,34 -2,87 L 222 7,97±0,9 5,21±0,4 Береговой 7,62±0,3 5,37±0,2

H 7 6,81±0,3 -10,06 -17,03 4,48±0,2 -12,50 -16,29 L 222 7,97±0,7 5,21±0,4 Фаворит 7,02±0,9 4,87±0,5



80

Таблица 6 Содержание фотосинтетических пигментов у разных

генотипов Cucumis sativus L.


Зеленые пигменты Х ± mх



лучшим родителем

Каротиноиды Х ± mх



сравнению с лучшим родителем

H 275 19,09 15,79 13,67 10,09±0,24 1,88 -12,69 L 226 16,48 8,43±0,22 L 203 15,67 11,37±0,34

H 274 15,54 -2,93 -4,15 10,77±0,17 -1,35 -5,57 L 203 15,67 11,37±0,34 L 216 16,32 10,46±0,22

H 273 15,98 9,73 1,94 13,07±0,18 14,49 13,01 L 222 13,18 10,98±0,17 L 203 15,67 11,37±0,34

Взгляд 14,81 5,10 -2,09 12,94±0,45 19,40 14,30 L 371 15,12 11,09±0,32 Береговой 12,99 9,77±0,15

Эпилог 15,50 12,87 2,45 12,17±0,28 13,60 8,87 L 371 15,12 11,09±0,32 Фаворит 11,89 9,94±0,25

H 6 12,75 -2,63 -3,37 9,12±0,14 -13,76 -20,39 L 222 13,18 10,98±0,17 Береговой 12,99 9,77±0,15

H 7 11,29 -11,03 -16,74 9,91±0,14 -5,45 -10,60 L 222 13,18 10,96±0,17 Фаворит 11,89 9,94±0,15

Данные таблицы 6 свидетельствуют о незначительном гетерозисном эффекте у некоторых гибридных

комбинаций. Так, у гибрида Н 275 этот показатель составляет 14,14%, у гибридов Н 6 и Н 7 гетеро-зисный эффект не наблюдается.

Анализируя содержание желтых пигментов (каротиноидов), следует отметить высокий гетерозисный эффект у большинства гибридов с высокой продуктивностью. Так, гибриды Н 273, Взгляд и Эпилог показывают высокий процент гетерозиса по сравнению с гибридами Н 6 и Н 7, показывающими отри-цательный гетерозис. Изученный в плане содержания хлорофилла «а», «б» и каротиноидов раститель-ный материал наводит на мысль о том, что высокий гетерозисный эффект у гибридных комбинаций может наблюдаться и на иных, не изученных нами фазах онтогенеза растений.

Выводы Обобщая полученные результаты по изменчивости различных морфофизиологических признаков,

следует отметить, что выявленные закономерности могут содействовать в дальнейшем установлении степени гетерозиса и зависимости между площадью листовой поверхности, объемом корневой системы и интенсивностью фотосинтеза, ввиду того что все данные параметры закономерно влияют на продук-тивность растений.


81


1. Christopher S.C. and Todd C.W. Little heterosis for yield and yield components in hybrids of six cucumber inbreds // Euphytica. - 1999. - Nо110. - P. 99-108.

2. Duca M., Savca E. Fiziologia şi biochimia plantelor // Practicum pentru studenţi facultăţii de biologie şi pedologie. - Chişinău, 1997, р.87.

3. Kupper R.S. and Staub J.E. Combining ability between lines of Cucumis sativus L. and Cucumis sativus var. hardwickii (R.). // Euphytica. - 1988. - Vol.38. - Nо3. - P.197-210.

4. Mac Key J. Seed dormancy in nature and agriculture // Cereal Res. Commun. - 1976. - Vol. 4. - No 2. - P. 83-91. 5. Mehmed Ali Avci E., Ebadi A.G., Zareand S. and Babaee M. Combining ability and heterosis for grain yield and some

components in Pea (Pisum sativum L.). // Asian Journal of Plant Science. - 2006. - Vol. 5. - No1. - P.1-4. 6. Reva V., Ciobanu V. Muller-Uri F. Strategia şi tactica izolării şi purificării proteinelor. - Chişinău, 2001, p. 184. 7. Борисова Т.А. Особенности энергетического обмена при дыхании растущих клеток // Автореф. дисc….. канд.

биол. наук. - Москва, 1979. 8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - Москва: Агропромиздат, 1985, c. 350. 9. Кефели В.И. Природные и синтетические регуляторы онтогенеза растений // Итоги науки и техники. Cерия

„Физиология растений”. - Москва, ВИНИТИ, 1990, т.7, с.160. 10. Конарев В.Г., Камалетдинова М.А., Гилязетдинов Ш.Я. Молекулярно-генетические подходы к анализу исходного

материала на комбинационную способность // Физиология и биохимия селекции. - Москва: Наука, 1974, с.124. 11. Конарев В. Г. Вид как биологическая система в эволюции и селекции. - Санкт-Петербург, 1995, с.177. 12. Курсанов А.Л. Взаимосвязь физиологических процессов у растений // Тимирязевские чтения. - Москва, 1959. 13. Физиологические и биохимические аспекты гетерозиса и гомеостаза растений. - Уфа, 1976, с.239. 14. Полевой В.В. Физиология растений. - Москва: Высшая школа, 1989, с.464.




82

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ ЯВЛЕНИЯ ГЕТЕРОЗИСА У ОГУРЦА Cucumis sativus L.

Татьяна ХОМЕНКО, Мария ДУКА, Анжела ПОРТ, Людмила Гусева*, Доган ОЗДЕМИР

Кафедра биологии растений *НИИОЗиО, г. Тирасполь

În lucrare sunt generalizate datele privind studiul fenomenului de heterozis la diverse genotipuri de castraveţi

(Cucumis sativus L.): formele parentale şi hibrizii primei generaţii. Rezultatele relevă legătura dintre unii parametri fiziologo-biochimici, cum sunt conţinutul proteinelor sumare, activitatea catalazei şi conţinutul acizilor nucleici (AND şi ARN) cu heterozisul. Aceşti parametri biochimici şi moleculari pot prognoza heterozisul la etapele timpurii în dezvoltarea ontogenetică a plantelor.

The present paper is concerned with the study of heterosis at various hybrid genotypes of cucumber (Cucumis sativus L.).

The results revealed the relation between some physiologo-biochemical parameters like content of total proteins, catalase activity and content of nucleic acids (DNA and RNA) with heterosis. These biochemical and molecular parameters can forecast the heterosis at early stages of plants ontogenetic development.

Проблема гетерозиса вызывает интерес у исследователей своей уникальностью. Установлено, что гете-розисный эффект многих сельскохозяйственных культур наблюдается у гибридов первого поколения по продуктивности; такие гибриды отличаются сильным ростом, мощным развитием, интенсивностью метаболических процессов и т.д.

Наиболее перспективным является физиолого-биохимический подход к решению этой проблемы на основе достижений молекулярной биологии. Маркирование биологических свойств и хозяйственных признаков растения – одна из главных практических задач, к решению которых должна стремиться биохимическая и молекулярная генетика как теоретическая основа современной селекции. При этом особенно ценными должны быть сведения о структуре и функциональной активности генома и плаз-мона гетерозисных гибридов и их родительских форм. Сложилось несколько подходов к оценке струк-турного и функционального состояния генома и его элементарных систем. Известно, что гетерозис проявляется на всех уровнях метаболизма и морфогенеза. Биохимия и молекулярная биология позво-ляют продемонстрировать это достаточно конкретно и убедительно [10].

Впервые об этой фундаментальной проблеме заявил Н.И.Вавилов (1920, 1932). Он считал (цит. по Конареву В., [14]), что селекция должна основываться не на отдельных фрагментах вида, а на виде в целом как на сложной системе, на всем его генофонде.

Для объяснения механизмов гетерозиса и инбредной депрессии выдвинут ряд гипотез, которые обсуждаются на протяжении уже нескольких десятилетий (Дубинин,1967 [6]; Кирпичников, [9]; Мас Кеу, [3]). Наиболее популярны из них гипотезы о сочетании благоприятных доминантных факторов, сверхдоминировании и генетическом балансе.

Надежными критериями генома и диплоидного вида оказались белковые признаки. Это легло в основу разработок принципа и методов маркирования белками генома как системы видовой категории. Особое значение здесь приобретают методы быстрой и точной идентификации генома и геномного анализа исходного селекционного материала. Решающая роль в этом будет принадлежать белковым и другим маркерам [11,13], маркирующим короткие фрагменты генома в месте их расположения, что и позволяет исследовать такие сложные интегральные признаки, как адаптивность и продуктивность [16].

К настоящему времени по белкам-маркерам Конаревым В.Г. и др. [14, 15] осуществлен геномный анализ основных видов культурных растений и их диких сородичей и выявлены природа и происхождение геномов, определены геномные составы в полиплоидных комплексах пшеницы, картофеля, злаковых трав, овощных крестоцветных, плодовых косточковых и др. [14].

Новым этапом в дальнейшем совершенствовании технологии гетерозисной селекции станет внедрение методов, основанных на применении ДНК-маркеров [12].

В соответствии с вышесказанным, целью исследования явилось изучение качественного состава общих белков, белков-ферментов (каталазы) и нуклеиновых кислот у гибридных комбинаций и родительских форм огуречного растения в связи с селекцией на гетерозис для выявления маркеров гетерозиса.


83

Методика Материалом для исследований служили различные родительские линии (материнские и отцовские)

огурца Cucumis sativus L. и их гетерозисные гибриды первого поколения, предоставленные лаборато-рией селекции НИИ орошаемого земледелия и овощеводства (г. Тирасполь).

Изучались пять исходных материнских форм огурца, три отцовских линии (из них районированные сорта – Береговой и Фаворит) и семь гибридов первого поколения (F1), из которых первые три (Н 273, Н 274 и Н 275) обладали высокой продуктивностью, а гибриды Н 6 и Н 7 – низкой. Контролем служили районированные гибриды первого поколения F1 Взгляд и F1 Эпилог (табл.1).

Таблица 1 Генотипическая структура исследуемых гибридов Cucumis sativus

Гибриды с высокой продуктивностью Контроль Гибриды с низкой

продуктивностью Родительская форма

H 275 H 274 H 273 Взгляд Эпилог H 6 H 7 Материнские формы Л 226 Л 203 Л 222 Л 371 Л 371 Л 222 Л 222

Отцовские формы Л 203 Л 216 Л 203 Береговой Фаворит Береговой Фаворит

Анализировались растения огурца в фазе 3-х настоящих листьев. Для определения суммарного белка, активности каталазы и нуклеиновых кислот применялись

известные методы, апробированные на кафедре биологии растений [1, 2]. Математическая обработка экспериментальных данных проводилась стандартными методами [7]. Повторность трехкратная.

Результаты и обсуждение Собран и обработан экспериментальный материал, характеризующий некоторые гибридные комби-

нации Cucumis sativus L. различной продуктивности и их родительские формы на эффект гетерозиса по некоторым физиолого-биохимическим показателям.

Для установления закономерностей между содержанием белка и эффектом гетерозиса, определяли содержание суммарного белка в растениях огурца Cucumis sativus L. на стадии 3-х настоящих листьев. Для удобства выявления закономерностей наследования изучаемых признаков данные по линиям и гибридам группировались по 3-м комбинациям: материнская линия, отцовская линия, гибрид.

Как видно из таблицы 2, родительские формы и гибриды огурца по содержанию суммарного белка варьируют в пределах от 119,17 до 210,83 мг/г (табл. 2).

Первые пять гибридов, линии которых обладают высокой комбинационной способностью, сущест-венно превосходят по содержанию суммарного белка родительские формы и показывают высокий процент гетерозиса как по сравнению со средним показателем исходных родительских форм (от 13% до 42%), так и по сравнению с максимальным показателем одной из родительских форм (от 7% до 36%). Максимальный показатель гетерозисного эффекта – у гибрида F1 Эпилог: он составляет 42% по сравнению со средним показателем исходных родительских форм.

Таблица 2 Содержание суммарного белка у Cucumis sativus L.

Название комбинации Х ± mх (мг/г) % гетерозиса по


%гетерозиса по сравнению с лучшим

родителем H 275 210,83±1,02 13,04 8,69

L 226 174,17±2,84 L 203 192,5±2,92



84

H 274 256,67±3,21 28,57 25,0 L 203 192,5±2,92 L 216 174,17±2,84

H 273 207,17±2,84 24,78 7,08 L 222 119,17±1,8 L 203 192,5±2,92

Взгляд 177,89 ± 2,01 23,00 12,40 L 371 119,33±1,97 Береговой 155,83±2,59

Эпилог 229,17±1,54 42,00 36,00 L 371 119,33±1,97 Фаворит 146,67±2,01

H 6 155,83±2,59 12,00 0 L 222 119,17±1,8 Береговой 165,12 ± 2,71

H 7 137,5±2,01 3,30 -6,67 L 222 119,17±1,8 Фаворит 146,67±2,56

Гибриды, линии которых обладают низкой комбинационной способностью (Н 6 и Н 7), показали

небольшой положительный гетерозисный эффект по сравнению со средним показателем исходных родительских форм и отрицательный гетерозис по сравнению с максимальным показателем одной из родительских форм.

Данные о содержании суммарного белка в растениях изученных линий и гибридов представлены на гистограмме 1.

Закономерности наследования содержания суммарного белка в растениях огурца показывают, что

некоторые материнские линии при скрещивании с различными отцовскими линиями дают положи-тельный гетерозисный эффект, величина которого зависит, по-видимому, лишь от материнской линии. Так, Линия 203, включенная в гибрид Н 275 и гибрид Н 273 в качестве отцовской линии, оказывает

0

50

100

150

200

250

300


материнские формы отцовские формы гибрид F1

Гистограмма 1. Содержание суммарного белка у Cucumis sativus L., (мг/г)


85

меньшее влияние на процент гетерозиса, нежели эта же линия, выступающая в качестве материнской формы у гибрида Н 274 (дает до 30% гетерозисного эффекта).

Линия 371, включенная в качестве материнской в контрольные гибриды F1Взгляд и F1Эпилог, дает высокий процент гетерозиса – от 13% до 42%.

Отцовская родительская форма Фаворит в гибриде F1 Эпилог определяет высокий процент гетеро-зиса, на который, по-видимому, оказала значительное влияние материнская форма Л.371, т.к. в гибриде Н 7 – низкий и даже отрицательный процент гетерозиса (от 3% и до -6,7%).

Анализ литературных данных [4] позволяет предположить, что активация синтеза белка у гибридов по сравнению с исходными родительскими формами – один из механизмов, обеспечивающих на моле-кулярном уровне проявление гетерозисного эффекта.

Гилязетдинов Ш.Я. и Вахитов В.А. [5] предположили, что наблюдаемое ими превосходство высо-когетерозисных гибридов по активности трансляционного аппарата может показаться следствием сверхдоминирования. Однако в действительности, как рассуждают авторы, – это комплементарное взаимодействие неаллельных генов. Способность гибридов и их родительских форм синтезировать белок с той или иной скоростью следует рассматривать, безусловно, как сложный процесс, так как трансляционный аппарат является многокомпонентным, а синтез белка – многоступенчатым [8].

Направленность и интенсивность процессов обмена веществ обусловливается активностью фер-ментных систем. Биохимии гетерозиса в этом плане посвящено множество исследований. При изучении активности оксидоредуктаз и трансфераз у растений гетерозисных гибридов было установлено, что активность ферментов у них занимает или промежуточное положение между парами, или уступает им [4].

Ферменты как биологические катализаторы участвуют во всех процессах жизнедеятельности рас-тительной клетки, поэтому можно предположить, что гетерозисный эффект у гибридов связан прежде всего с направленностью в деятельности ферментов и их активностью. Однако существующие лите-ратурные данные относительно активности ферментов у гетерозисных гибридов и самоопыляемых линий противоречивы. Не обнаружено корреляции между проявлением гетерозиса и активностью каталазы, но в исследованиях Д.И.Семеновой установлено, что линии с высокой комбинационной способностью отличаются более высокой восстанавливающейся активностью тканей [4].

Нами исследовалась активность каталазы в связи с гетерозисным эффектом на стадии 3-х настоящих листьев у Cucumis sativus L. Гетерозисный эффект гибридов, линии которых обладают высокой комби-национной способностью, по активности каталазы в растениях огурца изменяется незначительно, практически все гибриды (кроме Н 273) показывают положительный гетерозис (табл. 3).

Таблица 3 Определение активности каталазы у Cucumis sativus L.

Название комбинации Х ± mх (млО2 /1г/1мин)



лучшим родителем H 275 19,7±0,97 6,09 5,58

L 226 18,6±0,76 L 203 18,4±0,86

H 274 22,1±0,24 14,50 11,00 L 203 18,4±0,86 L 216 19,4±0,86

H 273 18,7±0,27 0 -1,02 L 222 19,0±0,75 L 203 18,4±0,86

Взгляд 20,6±0,18 16,70 6,00 L 371 20,1±0,24 Береговой 19,4±0,86

Эпилог 21,3±0,09 10,56 8,92 L 371 20,1±0,24 Фаворит 18,7±0,71



86

H 6 18,1±0,71 -5,00 -5,00 L 222 19,0±0,75 Береговой 19,4±0,86

H 7 18,3±0,09 3,01 -3,83 L 222 19,0±0,75 Фаворит 18,7±0,71

Незначительно выделяется высокопродуктивный партенокарпный гибрид Н 274, родительские линии которого показывают 14,5% гетерозисного эффекта по сравнению со средним родителем и 11% по сравнению с лучшим показателем одной из родительских форм. Гибриды Н 6 и Н 7 с низкой продуктивностью не показали гетерозисного эффекта (табл.3).

Гистограмма 2 демонстрирует изменение активности каталазы у гибридов первого поколения и их родительских форм в растениях у Cucumis sativus L.

Проблему связи нуклеиновых кислот с гетерозисом изучают многие исследователи [4]. Некоторые

авторы показали прямую зависимость между относительным содержанием нуклеиновых кислот и проявлением гетерозиса. В опытах А.Ф.Серединской установлено заметное превосходство гибридных растений по содержанию нуклеиновых кислот, в особенности РНК, в листьях томатов. В семенах гибридов огурцов и их родительских форм изучалось относительное содержание нуклеиновых кислот (Белин, Корнер, 1968). Оказалось, что гибриды, семена которых имели повышенное содержание нукле-иновых кислот, проявляли гетерозис и по урожайности [4].

Многими авторами [5] обнаружено, что родительские формы гетерозисных гибридов различаются по интенсивности синтеза рибосомальных и нерибосомальных РНК.

Шахбазовым В.Г. [17] и Шестопаловой Н.Г. [18] обнаружена повышенная активность ядрышкового аппарата в клетках гетерозисных гибридов растений.

Результаты наших исследований также свидетельствуют, что у большинства гибридов, линии которых обладают высокой комбинационной способностью, наблюдается гетерозисный эффект. Так, данные таблицы 4 показывают, что по содержанию ДНК в огуречном растении на стадии 3-х настоящих листьев у изучаемых гибридов обнаружен высокий процент гетерозиса (от 16,67% до 66,67%) по сравнению со средним показателем исходных родительских форм (табл. 4).

0

5

10

15

20

25



Гистограмма 2. Активность каталазы у Cucumis sativus L (млО2 /1г/1мин.)


87

Таблица 4 Содержание ДНК и РНК у Cucumis sativus L.


ДНК Х ± mх

(мг/г) %

гетерозиса

по

сравнению

со средним

родителем

%


по

сравнению

с лучшим

родителем

РНК Х ± mх

(мг/г)

%


по

сравнению

с средним

родителем

%


по

сравнению

с лучшим

родителем

H 275 0,12 ± 0,008 66,67 58,33 0,87 ± 0,02 10,92 5,70 L 226 0,03±0,007 0,83±0,01 L 203 0,05±0,001 0,72±0,08

H 274 0,08 ± 0,001 25,00 12,50 1,00 ± 0,02 22,00 16,00 L 203 0,05±0,001 0,72±0,08 L 216 0,07±0,002 0,84±0,12

H 273 0,06 ± 0,002 16,67 16,67 1,01 ± 0,03 25,25 21,78 L 222 0,05±0,001 0,79±0,02 L 203 0,05±0,001 0,72±0,08

Взгляд 0,07 ± 0,002 50,00 28,57 0,86 ± 0,02 5,81 4,65 L 371 0,05 ± 0,001 0,80 ± 0,06 Береговой 0,02±0,001 0,82±0,07

Эпилог 0,06± 0,001 25,00 16,67 0,92± 0,03 24,46 13,04 L 371 0,05 ± 0,001 0,80 ± 0,06 Фаворит 0,04 ± 0,001 0,59 ± 0,01

H 6 0,06 ± 0,002 41,67 16,67 0,86 ± 0,01 6,40 4,65 L 222 0,05 ± 0,001 0,79 ± 0,02 Береговой 0,02 ± 0,001 0,82 ± 0,07

H 7 0,05±0,001 10,00 0 0,81±0,02 14,81 2,47 L 222 0,05±0,001 0,79±0,02 Фаворит 0,04±0,001 0,59±0,01

Обнаружен также высокий гетерозисный эффект и по сравнению с максимальным показателем

одной из родительских форм (от 12,5% и до 58,3%). Максимальный эффект гетерозиса наблюдается для гибрида Н 275 и составляет 66,7% и 58,3% соответственно.

По содержанию РНК в огуречном растении на стадии 3-х настоящих листьев у изучаемых гибридов наблюдается положительный гетерозисный эффект у всех гибридный комбинаций, однако более высокий эффект отмечен у гибридов Н 274, Н 273 и F1 Эпилог.

Заметно, что высокий процент гетерозиса наблюдается в тех комбинациях гибридов, родительские формы которых значительно отличаются друг от друга по содержанию нуклеиновых кислот.

Суммарная величина ДНК и РНК показала аналогичную закономерность, которую можно просле-дить на гистограмме 3.



88

Наглядно представлен максимальный гетерозисный эффект у гибридов Н 273 и F1Эпилог. Существенных различий между гибридом и материнской формой по содержанию РНК не обнару-

живается. Однако суммарное содержание ДНК и РНК у большинства гибридных комбинаций выше, чем у материнской формы (табл. 5). Это согласуется с литературными данными [5]: гибриды превос-ходят родительские формы по темпам накопления РНК в вегетативных органах.

Таблица 5 Содержание нуклеиновых кислот у Cucumis sativus L.


Х ± mх (мг/г)



лучшим родителем H 275 0,99±0,08 17,17 13,13

L 226 0,858±0,07 L 203 0,78±0,07

H 274 1,082±0,09 22,00 14,81 L 203 0,78±0,07 L 216 0,91±0,07

H 273 1,07±0,09 24,00 20,56 L 222 0,85±0,08 L 203 0,78±0,07

Взгляд 0,925±0,09 8,11 8,60 L 371 0,85±0,08 Береговой 0,845±0,07

Эпилог 0,98±0,09 24,49 13,27 L 371 0,8±0,08 Фаворит 0,63±0,07

H 6 0,92±0,08 8,70 8,70 L 222 0,84±0,08 Береговой 0,845±0,07

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2



Гистограмма 3. Содержание нуклеиновых кислот у Cucumis sativus L. (мг/г)


89

H 7 0,86±0,06 14,53 2,33 L 222 0,84±0,08 Фаворит 0,63±0,07

Из вышеизложенного можно предположить, что превосходство гетерозисных гибридов, линии

которых обладают высокой комбинационной способностью, по содержанию ДНК и РНК на стадии 3-х настоящих листьев объясняется высокой интенсивностью процессов роста и развития на начальных этапах онтогенеза растений.

Следует отметить, что, возможно, явления гетерозиса у растений огурца обусловлены разными звеньями механизмов экспрессии генов, и поэтому особенности, связанные с определенным содержанием нуклеиновых кислот в гибридных комбинациях, можно рассматривать лишь как одну из важных, но не единственных причин этих явлений.

Выводы Обобщая полученные результаты по изменчивости некоторых физиолого-биохимических показателей

у различных генотипов огурца Cucumis sativus L., можно выделить определенные закономерности между изученными признаками и явлением гетерозиса, которые помогут в дальнейшем быстрому прогнозированию гетерозиса у растений на ранних этапах онтогенеза.


1. Duca M., Savca E. Fiziologia şi biochimia plantelor. Practicum pentru studenţii facultăţii de biologie şi pedologie. - Chişinău, 1997, р.87.

2. Reva V., Ciobanu V., Muller-Uri F. Strategia şi tactica izolării şi purificării proteinelor. - Chişinău, 2001, р.184. 3. Mac Key J. Seed dormancy in nature and agriculture // Cereal Res. Commun. - 1976. - Vol.4. - No2. - P.83-91. 4. Али-Зади, Мисур А.М., Алиев Р.Т. Гетерозис и нуклеиновые кислоты. - Баку: Элм, 1982, с.129. 5. Гилязетдинов Ш.Я., Вахитов В.А. и др. Изучение числа цистронов р-РНК у родительских форм гетерозисных

гибридов растений. - БФАН СССР, 1976, с.156-167. 6. Гуляев В. Г. Генетика. - Москва, 1977, с.359. 7. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - Москва: Агропромиздат, 1985, с.350. 8. Иванова О. А., Кравченко Н. А. Генетика. - Москва: Колос, 1987, с.414. 9. Кирпичников В.С. Генетические механизмы и эволюция гетерозиса. Генетика. - 1974. - Т.10. - 4. - С.165-179. 10. Конарев В.Г. Биохимическая и молекулярная генетика гетерозиса. // Гетерозис. Вестник сельскохозяйственных

наук, 1974, с.1-10. 11. Конарев В.Г. Белки как маркеры. - Москва: Колос, 1983. - 319 с. 12. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. - Москва: Колос, 1983. - 320 с. 13. Конарев В.Г. Природа гетерозиса и возможности его прогнозирования // C-х биол. - 1991. - 3. - С.3-10. 14. Конарев В.Г. Вид как биологическая система в эволюции и селекции. - Санкт-Петербург, 1995. -176 с. 15. Конарев В.Г, Ахметов Р.Р., Гилязетдинов Ш. Я. О природе гетерозиса и его проявлениях по данным биохимии

и молекулярной генетики. - БФАН СССР, 1976, с.5-17. 16. Конарев В.Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких сородичей //

Доклады ВАСХНИЛ. - 1970. - 7. - С.16-18. 17. Шахбазов В.Г. Гетерозис – явление общебиологическое. - Москва, 1972, с.32. 18. Шестопалова Н.Г. Репродукция клеток при гетерозисе. - Харьков, 1981, с.83.




90

ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ И ВЛАЖНОСТИ ПОЧВЫ

НА ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ РАЗМЕРОМ ФРАКЦИИ ЗЕРЕН ПШЕНИЦЫ

И СОДЕРЖАНИЕМ В ИХ ЗАПАСНОМ БЕЛКЕ ОСНОВНЫХ АМИНОКИСЛОТ

Андрей БАБИЦКИЙ, Занфира ТОМА

Институт генетики и физиологии растений АН Молдовы

Metoda DBC (dye binding capacity) a fost folosită pentru a demonstra interacţiunea dintre conţinutul aminoacizilor bazici din proteinele bobului de grâu durum de vară, dimensiunea bobului şi condiţiile de reproducţie a acestuia la 13 regimuri de nutriţie minerală şi 3 niveluri de umiditate. S-a constatat că între nivelul de umiditate a solului şi conţinutul cantitativ al aminoacizilor bazici din proteine există o corelaţie pozitivă, care este mai evidenţiată în fracţia medie după dimensiunea grăunţelor. Factorul principal ce determină diminuarea conţinutului aminoacizilor bazici în proteinele de rezervă ale bobului de grâu este deficitul considerabil de umiditate din sol în perioada de creştere şi maturizare a grâului.

Dye binding capacity (DBC) method has been used to demonstrate the considerable dependence of the content of

basic amino acids of the spring durum wheat kernel protein in relation to kernel size and the plant growing condition of varying mineral fertilizers and levels of soil humidity in steppe ecological zone growing. The experimental design consisted of 13 variables mineral nutrition under three levels of soil humidity: one rain-fed and two different rates of irrigated conditions. To increase precision, the design was randomized. From our study it follows that there is positive relationship between content of basic amino acids of wheat protein and the level of soil moisture regime during kernel reproduction which is more manifested for middle fraction of wheat kernel size. These data indicate that the soil water deficit was responsible for the lower content of basic amino acids in wheat protein.

С бурным развитием научно-технического прогресса и ростом народонаселения все более актуаль-

ной становится проблема перехода населения от питания животным белком к питанию растительным белком. Она имеет не только продовольственное, но и громадное социальное значение в качестве гарантии дальнейшего существования цивилизации на земле. Всевозрастающее производство живот-ного белка создает громадный резервуар нематодной, бактериальной, микоплазменной, прионной, вирионной и вирусной инфекций. Первые предвестники этой катастрофы уже на горизонте. Это смертельные для людей инфекции птичьего гриппа в Азии и Европе, губчатого энцефалита крупного рогатого скота в Англии и Германии, смертельного вирусного заболевания нервной системы, переда-ваемого слюной свиней, в Малайзии. Эти случаи создают прецедент уничтожения в кратчайшие сроки миллионного поголовья животных, что само по себе является катастрофой. Массовое уничтожение птиц на птицефабриках, поголовья крупного рогатого скота на животноводческих комплексах – все это кошмарные по сути события. Так, в Малайзии миллионное поголовье живых свиней сваливали в огромные котлованы и расстреливали из пулемётов. Это уже сейчас страшная по жестокости картина, а в перспективе может возникнуть необходимость в еще более масштабных предохранительных мерах и в глобальном уничтожении всего поголовья животных. До тех пор, пока не ликвидированы живот-новодческие комплексы и мясокомбинаты, человек будет находиться на низком уровне развития чело-веческой цивилизации, определяемом не уровнем развития техники, но уровнем развития нравствен-ности. Чем больше людей занято на животноводческих комплексах и мясокомбинатах, тем больше в обществе распространяются звериные и антигуманные инстинкты жестокости и садизма; в сознаниe людей насаждается право и жажда убийства живых существ, в том числе и людей, что сейчас особенно видно на примере Америки, население которой вышло на самый высокий в мире уровень как преступ-ности, так и производства и потребления мяса и мясных продуктов. В Индии, например, уже в течение многих тысячелетий, со времени возникновения ведической культуры, людей, употребляющих в пищу мясо, считают умственно низкоразвитыми и нравственно низменными.

Еще одну опасность представляет технология кормления животных путем интенсивного применения гормональных стимуляторов роста и антибиотиков. Так, производство бройлерных кур и употребле-ние в пищу их мяса привело к рыхлости соединительной ткани и костной системы и массовому ожирению населения Америки. Ожирение населения становится национальной проблемой Америки.



91

Ясно, что снабжение населения белком не должно основываться на животном белке. Решением этой проблемы может быть только увеличение производства растительного белка с питательной цен-ностью, равноценной животному белку. Поэтому перед учеными мира стоит первостепенная задача создания растений, запасной белок которых был бы сбалансирован как по аминокислотному составу, так и по питательной ценности, и был бы равноценен белку животных.

Наиболее приемлемый белок – это белок злаковых культур, в частности – пшеницы, поскольку бобовые культуры насыщены алкалоидами и эстрогенами. Однако белок пшеницы не сбалансирован по целому ряду аминокислот, в том числе и по лизину. Поэтому для селекционеров весьма актуальна задача выяснения взаимосвязи между содержанием белка и содержанием в нем лизина и факторов, влияющих на эту взаимосвязь, особенно в связи с разнокачественностью семян.

До настоящего времени все еще остается невыясненным и крайне запутанным вопрос о тех внутрен-них и внешних факторах формирования белка в зерне злаковых культур, которые определяют его обогащенность незаменимыми аминокислотами, в частности – основными аминокислотами. Уже созданы многочисленные каталоги мировой коллекции пшениц с указанием содержания в их зерне белка и лизина, исходя из того, что эти показатели полностью определяются их генотипом и не зави-сят от условий выращивания растений и способа подготовки образцов к биохимическим анализам. Эти анализы были проведены на образцах, выращенных при широком разнообразии климатических и агрономических условий и на неконтролируемой выборке полученных семян. Однако исходная точка, что все определяет генотип, а внешние условия выращивания можно не учитывать, крайне ошибочна и способна только вводить исследователей в заблуждение.

Прежде чем исследовать разные генотипы мировой коллекции пшениц, крайне необходимо разо-браться вначале в этом вопросе на одном генотипе, получить сведения о том, насколько изменчив показатель содержания основных аминокислот в белке пшеницы и выявить существенные факторы, влияющие на него [2,8,10]. Успешная работа по отбору нужных генотипов неизбежно связана с не-обходимостью анализа больших массивов данных биохимических анализов различных образцов зерна пшеницы по аминокислотному анализу зерна на лизин. Однако для этих целей пропускная способность аминоанализаторов недостаточна, необходимо использовать метод связывания краси-теля и анализировать большие массивы данных. Лучше всего для этих целей подходит графическое представление данных, при котором сразу виден весь массив данных и тенденция его изменения, что позволяет лучше понять ответную реакцию изучаемого генотипа на условия внешней среды. Насколько нам известно, таких сведений никто до сих пор не представил, поэтому восполнение этого пробела и является целью данной публикации.

Материалы и методы Опыты по влиянию различных доз внесения минеральных удобрений и их сочетаний и режимов

влажности почвы на содержание основных аминокислот в запасном белке пшеницы были проведены на яровой твердой пшенице Харьковская 46, выращенной в полевых условиях Одесской области. Норма высева – 5 млн. семян/га, глубина заделки – 4 см, ширина междурядьев – 15 см. Опыт состоял из 13 вариантов различных сочетаний минеральных удобрений, которые обозначались номерами от 1 до 13 в следующем порядке: 1 – без удобрения; 2 – N30P30K30; 3 – N60P60K60; 4 – N90P90K90; 5 – N0P60K60; 6 – N30P60K60; 7 – N90P60K60; 8 – N60P60K0; 9 – N60P60K30; 10 – N60P60K90; 11 – N60P0K60; 12 – N60P30K60; 13 – N60P90K60, вносились поздней осенью под зяблевую вспашку после парового предшественника. Растения выращивали при трех режимах влажности почвы: 1 – без полива (дефицит влаги); 2 – 80% от полной почвенной влагоемкости (ППВ), (оптимум почвенной влаги); 3 – 90% ППВ (избыток влаги). Итого было 39 вариантов сочетаний уровней минерального питания и режимов влажности почвы. Каждый вариант засевался в 6-кратной повторности при рандо-мизированном размещении вариантов в пределах однородного уровня влажности почвы. Итого было засеяно 234 делянки по 18 квадратных метров каждая. Необходимый режим влажности почвы обес-печивался поливом водопроводной водой посредством передвижной дождевальной установки, на-вешенной на трактор ДТ – 54. Сбор урожая проводили комбайном Сидмайстер. Очищенное зерно, для учета урожая, взвешивали по вариантам. Зерно с каждого варианта фракционировали на зерновых решетах и обозначали серединой интервала между размерами ячеек проходного и задерживающего решет. Так, фракция 2,6 мм получалась при проходе зерна через ячейки решета 2,75 мм и задержке



92

на сите с шириной ячеек 2,5 мм. В полученных фракциях зерна каждого варианта белок определяли биуретовым методом [7,9], а содержание основных аминокислот – методом связывания красителя (Dye Binding Capacity: - DBC) [2,8,10].

Результаты и их обсуждение При представлении полученных данных как взаимосвязи между содержанием основных амино-

кислот в белке пшеницы и фракционным размером зерен пшеницы, выращенной при 3-х режимах влажности почвы и 13-ти вариантах минеральных удобрений (рис.1), было выявлено, что наибольшее влияние на этот показатель оказывает уровень влажности почвы, затем минеральное удобрение и размер семян. Так, в условиях водного дефицита, при выращивании растений без полива, в зерне пшеницы формируется самый низкокачественный белок, и какая-либо закономерность зависимости от размера семян не просматривается. На этом фоне влажности почвы внесение повышенных доз как азотного, так и фосфорного удобрения ведёт к формированию более сбалансированного по основным аминокислотам белку.

Рис.1. Влияние минерального питания и режимов влажности почвы на содержание основных аминокислот в белке (DBC) различных по крупности фракций зерна твердой пшеницы. Уровни влажности почвы указаны вверху в каждой из трех колонок. Сбоку указаны варианты уровней и сочетаний минерального питания. В чет-вертой колонке приведены графики зависимости DBC от размера фракции зерен при трех режимах влажности почвы, усредненные по всему набору уровней минерального питания. По оси абсцисс – размер фракции зерна, в мм; по оси ординат (DBC) – микромоли связанного красителя на грамм белка.



93

При увеличении влажности почвы до 80% ППВ качество белка повышается и в наибольшей степе-ни – на фоне дефицита азота и повышенного содержания калия. Повышенные дозы азота действуют в направлении, противоположном влиянию влажности почвы, и по содержанию основных аминокислот качество белка снижается. Аналогично действуют высокие дозы азота и на содержание белка при повышенном уровне влажности почвы [7], и на этом уровне влажности уже возможно обнаружить зависимость содержания основных аминокислот от размера зерен. Мелкие и крупные зерна содер-жат белок худшего качества, чем средние по размеру зерна. При этом более высоком уровне влаж-ности почвы просматривается и зависимость этого показателя от размера зерен. Средние по размеру зерна также содержат более качественный белок. Однако высокие дозы азота и фосфора нивели-руют влияние влажности почвы, и при таких уровнях минерального питания в зерне пшеницы фор-мируется белка больше, но он низкого качества. Усредненные графики по всем 13 вариантам мине-ральных удобрений показывают зависимость от размера зерен, наиболее четко просматриваемую при 80% ППВ влажности почвы.

Таким образом, из экспериментальных данных, отраженных на графиках, можно видеть, что со-держание основных аминокислот в белке зерна пшеницы зависит как от размера зерен, наиболее выраженного при повышенном уровне влажности почвы, так и минерального удобрения, высокие дозы которого по фосфору и азоту действуют в противоположном влажности направлении и при-водят к накоплению в зерне менее качественного белка, чем при других вариантах минерального удобрения.

Чтобы выяснить степень влияния влажности почвы на каждую фракцию по размеру зерен пше-ницы, полученный массив данных был представлен как функция влажности для каждой фракции (рис.2), из чего явствует, что между уровнем влажности почвы и содержанием основных аминокислот в белке эндосперма зерен пшеницы разного размера имеется положительная взаимосвязь, которая лишь в некоторых случаях отклоняется от линейной. Эти отклонения наиболее заметны в вариантах 4 и 7 минерального питания – при максимальной дозе азота 90 кг\га, и в варианте 5, когда азот вообще не вносился.

Если увеличение влажности почвы ведет к увеличению содержания основных аминокислот в белке, то на фоне высокого содержания азота влияние влажности элиминируется. Наиболее сильно влажность почвы повышает содержание основных аминокислот в белке в варианте 5, где на фоне среднего содержания калия и фосфора отсутствовало азотное удобрение. Из последней колонки гра-фика, представляющего усредненный ответ изучаемого показателя на влажность, видно, что наиболее крутая ответная реакция наблюдается у средних по размеру фракций 2,4 и 2,6 мм, в то время как фракции зерен минимального и максимального размеров реагируют значительно слабее.

Обнаруженное нами возрастание содержания основных аминокислот в запасном белке пшеницы при увеличении влажности почвы, сопровождаемое падением содержания белка в зерне [7], свиде-тельствует об ингибировании, в данных условиях формирования зерна, синтеза одной из основных фракций белка эндосперма, а именно – глиадина. Это вызывает вопрос о связи синтеза глиадина с водным режимом в момент роста и развития пшеницы: обусловлено ли это активацией новых генных комплексов или активацией кислой протеазы в момент налива зерна? Ответы на эти вопросы смогут прояснить механизм действия влажности почвы на качество белка пшеницы.



94

Рис.2. Влияние уровня влажности почвы на содержание основных аминокислот в белке зерен пшеницы,

различающихся по размеру. По оси абсцисс – уровень влажности почвы; по оси ординат – микромоли связан-ного красителя на 1 грамм белка. В верхней части каждой колонки указан размер фракции зерна, в мм. Сбоку приведены варианты минерального питания. В последней колонке приведен график с усредненными по 13 вариантам удобрений данными.

Учитывая недавно открытый механизм формирования семян с высокими урожайными качествами

в условиях высокой влажности почвы, передаваемый следующему поколению в виде онтогенетиче-ской наследственности [1, 3, 4, 5, 6] и неизбежно связанный с активацией генных комплексов, можно считать, что уровень влажности почвы способен активировать гены в процессе онтогенеза и влиять на наследственный аппарат семян пшеницы.



95

Рис.3. Взаимосвязь между содержанием белка в зерне пшеницы различных фракции и его обогащенностью основными аминокислотами под влиянием уровней минерального питания и режимов влажности почвы. По оси абсцисс – содержание белка, в %; по оси ординат – способность связывать краситель [ DBC – dye binding capacity], в микромолях связанного красителя на грамм белка.

Из рисунка четко видно, что различные по размеру фракции зерна отличаются по содержанию

белка и его обогащенности основными аминокислотами, судя по данным DBC, включая и лизин. Однако для каждой фракции зерна эта зависимость имеет разный наклон прямой и различную степень рассеяния образцов вокруг линии регрессии. Чем более крутая зависимость, тем точнее можно обна-ружить изменения в содержании основных аминокислот в белке. Степень рассеяния данных от линии регрессии характеризует погрешность метода. Для оценки этих параметров рассчитаны линии регрес-сии для каждой фракции. Рассчитанные коэффициенты линий регрессии и достоверности аппрокси-мации приведены в таблице.



96

Размер фракции, мм Уравнение регрессии Достоверность аппроксимации, R2 2,1 y = -163x + 4132 0,77 2,4 y = - 192x + 4458 0,84 2,6 y = - 176x + 4241 0,80 2,9 Y = -169x + 4216 0,90

Линии регрессии имеют различный наклон, а точки имеют различную степень рассеяния вокруг

линии регрессии. Наиболее тесное приближение к линии регрессии – у образцов крупных семян (2,9 мм), не особо подверженных влиянию условий выращивания растений и более четко отражающих генотип сорта. Зерна средней фракции (2,6 мм) более реагируют на удобрения, и точки на графике имеют больший разброс. Из этих графиков четко видно, что режим влажности почвы оказывает более сильное влияние на содержание белка и на его обогащенность лизином, нежели минеральное питание. Зерна растений, выращенных в условиях дефицита влаги, характеризуются наибольшим содержанием белка и наименьшей обогащенностью белка лизином. На всех графиках видна четкая отрицательная корреляция между содержанием белка и его обогащенностью лизином.

Полученные данные показывают, что при селекции на белковитость зерна и его обогащенность лизином следует тщательно готовить образцы для биохимического анализа и проводить его не на цельном зерне, а на расфракционированном на зерновых решетах. Особенно тщательно при репро-дукции зерна следует контролировать уровень влажности почвы – главный фактор, влияющий на содержание и качество белка. Анализы образцов зерен, гетерогенных по размерам, отраженные на графике в виде объединенных по всем фракциям усредненных величин (последняя колонка рисунка 3), указывают на значительно больший разброс данных относительно линии регрессии, что вносит зна-чительные погрешности при отборе генотипов пшеницы, различающихся по высокому содержанию основных аминокислот в белке эндосперма зерна пшеницы. Из представленных нами данных видно, насколько важным для формирования хозяйственно полезных признаков является уровень влажности почвы. Это позволяет считать, что окультуренные виды растений – омезофиченные ксерофиты.

Выводы 1. Представлены массивы данных о взаимосвязи минерального питания, влажности почвы и раз-

меров зерен на содержание основных аминокислот в белке зерна твердой яровой пшеницы. 2. Содержание основных аминокислот в белке зерна пшеницы зависит от размера фракции зерна.

Средняя, преобладающая фракция зерна, характеризуется самым высоким значением этого показателя. Более крупная и более мелкая фракции содержат меньше основных аминокислот в белке.

3. Между содержанием основных аминокислот в белке зерна пшеницы и влажностью почвы имеет-ся положительная коррелятивная зависимость при возделывании пшеницы в условиях степной зоны.

4. Увеличение влажности почвы ведет к снижению содержания в зерне белка и к повышению в нём содержания основных аминокислот. Однако эта зависимость нивелируется и переходит в проти-воположную при высоких дозах азотного и фосфорного минерального питания.


1. Бабицкий А., Брединский А. Урожайные качества семян пшеницы степной зоны // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. Seria "Ştiinţe chimico-biologice". - Chişinău, 2005, р.418-421.

2. Бабицкий А.Ф., Тома З. Г. Факторы, влияющие на содержание суммы основных аминокислот в белке зерна пшеницы // Материалы Международной научно-практической конференции 13-15 июля, г. Жодино: Проб-лемы дефицита растительного белка и пути его преодоления. - Минск: Белорусская наука, 2006, с.295-300.

3. Бабицкий А.Ф. Вторая зеленая революция в повышении продуктивности растений // Материалы Междуна-родной научно-практической конференции 13-15 июля, г. Жодино: Проблемы дефицита растительного белка и пути его преодоления. - Минск: Белорусская наука, 2006, с.48-53.

4. Бабицкий А., Брединский А. Экология семян пшеницы степной зоны // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. Seria "Ştiinţe chimico-biologice". - Chişinău, 2006, p.324-330.

5. Бабицкий А.Ф., Брединский А.А. Повышение урожайных качеств семян пшеницы // Аграрная наука. - Москва. - 2006. - 9. - С.5-7.



97

6. Бабицкий А.Ф, Брединский А.А. Урожайные качества семян пшеницы модифицирует влажность почвы // Acta et commentationes. Univ.de Stat din Tiraspol, vol.2: Ştiinţe biologice, geografice, geologice, chimice şi didac-tica geografiei, biologiei şi chimiei. - Chişinău, 2006, p.271-276.

7. Бабицкий А., Тома З. Влияние минерального питания и влажности почвы на взаимосвязь между урожаем зерна пшеницы и содержанием в нем белка //Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. Seria "Ştiinţe chimico-biologice". - Chişinău, 2007, p.176-180.

8. Гаркавый П.Ф., Тома З. Г., Кюйтс Х. Д., Оя И. Косвенный метод определения лизина в зерне при помощи связывания красителя ацилан оранж Ж // Научно-техн. Бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. Вып. 24. - Одесса, 1975, c.30-35.

9. Сечняк Л.К., Бабицкий А.Ф., Гармашова К. Н., Брединский А.А. Биохимические аспекты изучения урожай-ных качеств семян яровой пшеницы под влиянием условий минерального питания материнских растений // Пути создания исходного материала для селекции зерновых злаковых культур: Труды Всес. селекц.-генет. института. - Одесса, 1976, т.14, c.12-21.

10. Тома З.Г., Бабицкий А.Ф. Метод массового отбора высоколизиновых зерновых культур при помощи кра-сителя тропеолин 000-2 // Создание идентифицированных генофондов сельскохозяйственных растений. - Кишинев, 1979, c.99-100.




98

INFLUENŢA VALORII pH ASUPRA PRODUCTIVITĂŢII ŞI COMPONENŢEI

BIOCHIMICE A MICROALGEI DUNALIELLA SALINA LA CULTIVARE PE

LICHIDUL CULTURAL AL SPIRULINEI

Cezara BIVOL

Catedra Biologie Vegetală Green microalgae Dunaliella salina is largely used in modern biotechnology due to its high content of some bioactive

substances, in special glycerol and β-carotene. One of the key factors in the cultivation process of dunaliella is the pH level. Productivity and biochemical composition of Dunaliella salina cultivated on new nutritive medium – cultural liquid obtained at producing blue-green algae Spirulina platensis – have been studied. The value of pH – 8.5 during the cultivation has shown better results for these parameters, than the cultivation on spirulina cultural liquid with pH 10.

Introducere

Microalgele atrag tot mai mult interesul cercetătorilor atât în aspect ştiinţific, cât şi economic. Datorită dimensiunilor mici care permit producerea lor în spaţii limitate ale cultivatoarelor, componenţei lor biochimice bogate în substanţe biologic active accesibile, ele prezintă un avantaj al biotehnologiilor moderne [1,2].

Alga verde Dunaliella salina este un microorganism preţios graţie conţinutului bogat în β-caroten şi gli-cerol. În prezent, capătă amploare utilizarea dunalielei în cosmetologie şi farmaceutică, care propun metode efective de îngrijire şi protejare a ţesuturilor epiteliale. Iar utilizarea microalgei în iundustria alimentară permite excluderea coloranţilor artificiali [3].

Dunaliella salina este cultivată pe mediile minerale Ben-Amotz, Avron care includ parametrii nutritivi optimali ai acesteia [4,5]. Microalga dunaliela are, însă, un avantaj evident. Ea poate fi cultivată pe medii înalt mineralizate cu un grad divers de poluare. În acest context, prezintă interes reutilizarea lichidului cultural obţinut la producerea altor microorganisme (de exemplu, a spirulinei) în vederea cultivării pe el a dunalielei.

Astfel, scopul prezentei lucrări este studierea influenţei valorii pH asupra productivităţii şi componenţei biochimice a microalgei verzi Dunaliella salina la cultivare pe lichidul cultural rezultat la producerea spirulinei.

Material şi metode

Obiect de studiu a servit microalga Dunaliella salina TEOD. Calu-834 (Volvocales, Chlorophyta) inoculată pe lichid cultural rezultat la cultivarea spirulinei completat cu NaCl. La jumătate din probe pH-ul lichidului cultural a fost modificat până la valoarea 8,5.

pH-ul mediului de cultură a fost determinat la pH-metru (Ionomer universal ЭВ-74). Modificarea valorii pH s-a efectuat prin barbotarea CO2 în mediul nutritiv până la stabilirea indicelui dorit. Barbotarea se efectua zilnic pe parcursul cultivării, în 3 rate. Durata cultivării, atât pentru probele cu pH-ul mediului modificat, cât şi pentru cele cu pH-ul nemodificat, a fost de 10 zile, la temperatura 27-30ºC şi intensitatea luminii 4000 lucşi [6,7].

Productivitatea şi componenţa biochimică a dunalielei a fost calculată conform metodelor elaborate de V.Rudic (1993) [8].

Rezultate şi discuţii pH-ul mediului reprezintă unul dintre factorii determinanţi la cultivarea microalgelor [9,10]. Valorile pH-ului

determină excesul sau deficitul elementelor minerale în mediu, caracterizează vârsta populaţiei de microalge. De obicei, pH-ul mediului în primele zile de cultivare este diferit de cel din ultimele zile. Modificările pH-ului mediului depind de durata cultivării, pâna la atingerea unei limite anumite după care pH-ul nu mai variază. Pentru mediul Zarrouk utilizat la însămânţarea spirulinei pH-ul este 9,0 şi pentru lichidul cultural rezultat în urma cultivării ei pH-ul devine 10,0. Mediul mineral Ben-Amotz utilizat la creşterea dunalielei are pH-ul 8,5 [11,12]. Deoarece valoarea pH-ului lichidului cultural al spirulinei este egală cu 10, ceea ce nu coincide cu pH-ul mediului standard (Ben-Amotz), s-a efectuat barbotarea cu CO2 pe tot parcursul cultivării, fapt ce a asigurat menţinerea pH-ului lichidului cultural la valoarea 8,5.



99

Analiza productivităţii dunalielei a demonstrat că microalga creşte atăt pe lichid cultural nesupus barbotării cu CO2 – la pH 10, cât şi pe lichid cultural supus barbotării – la pH 8,5. Întreţinerea unui pH slab alcalin (8,5) influenţează favorabil cultivarea dunalielei, productivitatea sporeşte cu 6,15% faţă de probele crescute pe lichid cultural ce au un pH evidenţiat bazic (10). Rezultatele experienţei sunt prezentate în Figura 1.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1 zi 3 zi 5 zi 7 zi 10 zi

Durata cultivării, zile

Do , 7

50 n

m

pH 8,5 pH 10

Fig.1. Influenţa pH-ului asupra productivităţii algei Dunaliella salina cultivate

pe lichidul cultural rezultat la producerea spirulinei.

De asemenea, s-a observat că introducerea bioxidului de carbon direct în mediul de cultură prin barbotare asigură repartizarea uniformă a celulelor algale în suspensie, ceea ce nu este caracteristic în lipsa barbotării, unde algele au tendinţa să se repartizeze în stratul superior al mediului, mai aproape de lumină, O2 şi CO2.

Studiul componenţei biochimice a biomasei de Dunaliella salina a înregistrat o cantitate mai sporită de substanţe organice în cazul menţinerii pH-ului 8,5 în procesul cultivării. Conţinutul de proteine totale înregistrat este cu 9,12% mai înalt în cazul modificării valorii pH decât la cultivarea pe lichid cultural pH 10. Peptidele sporesc considerabil, cu 21,37% la cultivarea pe mediul cu valoarea pH-ului 8,5 (Fig.2).

010203040506070

pH 8,5 pH 10

pH-ul mediului cultural

Can

titat

ea d

e su

bsta

nţă,

%

proteine peptide

Fig.2. Cantitatea de substanţe proteice din biomasa de Dunaliella salina cultivată

pe lichidul cultural al spirulinei.

Cantitatea de glicerol se majorează cu 11,83% în probele crescute pe lichid cultural cu pH modificat (Fig.3).

05

101520253035

pH 8,5 pH 10


Can

titat

ea d

e g

licer

ol, %

Fig.3. Cantitatea de glicerol din biomasa de Dunaliella salina cultivată

pe lichidul cultural al spirulinei



100

Schimbarea pH-ului nu influenţează, însă, considerabil acumularea pigmenţilor fotosintetici. Cantitatea de carotenoizi şi de clorofilă ,,a” rămâne practic nemodificată [13]. Se micşorează doar cantitatea clorofilei ,,b” – cu 11,59% în prezenţa pH-ului mediului 8,5 faţă de pH-ul 10, caracteristic pentru lichidul cultural al spirulinei (Fig.4).

01234567

pH 8,5 pH 10


Can

titat

ea d

e pi

gmenţi,

mg/

lclorofila ,,a,, clorofila ,,b,, carotenoizi

Fig.4. Cantitatea de pigmenţi din biomasa de Dunaliella salina cultivată pe lichidul cultural al spirulinei.

Micşorarea cantităţii de clorofilă ,,b” presupune modificări la nivelul fotosistemului II şi remodelarea

aparatului fotosintetic în întregime posibile sub acţiunea CO2 atestate şi în [14]. Astfel, în baza rezultatelor obţinute putem concluziona că lichidul cultural al spirulinei poate fi reutilizat

la cultivarea microalgei verzi Dunaliella salina, prin asigurarea unui pH optim de cultivare. Concluzii

1. Microalga Dunaliella salina creşte pe lichidul cultural al spirulinei atât la valorile pH-ului 8,5, cât şi la valori mai ridicate ale pH-ului (10). Productivitatea dunalielei are valori neesenţial mai înalte (cu 6,15%) în cazul pH-ului 8,5.

2. Valoarea pH-ului influenţează considerabil cantitatea de substanţă organică în biomasa de Dunaliella salina. Un conţinut mai sporit de proteine cu 9,12%, peptide cu 21,37%, glicerol cu 11,83% s-a înregistrat la pH-ul mediului 8,5, în comparaţie cu pH-ul 10. Cantitatea de carotenoizi şi de clorofilă ,,a” rămâne constantă, iar a clorofilei ,,b” este mai diminuată cu 11,59%, datorită modificărilor intervenite la nivelul aparatului foto-sintetic, cauzate de barbotarea lichidului cultural cu CO2.

Referinţe:

1. Ficobiotehnologie – cercetări fundamentale şi realizări practice. - Chişinău: Elena-V.I., 2007, p.284-296. 2. Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne.-Chişinău: Ştiinţa, 1993, p.12-76. 3. Aharon O. A hundred years of Dunaliella research: 1905-2005 // Saline Systems. -2005 -1:2.-doi: 10.1186/1746-1448-1-2. 4. Ibidem. 5. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, география, распространение рода Dunaliella TEOD. - Киев:

Наукова думка, 1973. - 227 c. 6. Ficobiotehnologie – cercetări fundamentale şi realizări practice, p.284-296. 7. Масюк Н.П. Op.cit. 8. Rudic V., Gudumac V., Bulimaga V., Dencicov L., Ghelget V., Chiriac T. Metode de investigaţie în ficobiotehnologie.

- Chişinău:CE USM, 2002, p.19-36. 9. Масюк Н.П. Op.cit. 10. Саут Р. Уиттик. Основы альгологии. - Москва: Наука, 1990. - 392 с. 11. Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne, p.12-76. 12. Масюк Н.П. Op.cit. 13. Giordano M., Bowes G. Gas Exchange and C Allocation in Dunaliella salina Cells in Response to the N source and

CO2 Concentration Used for Growth // Plant Physiology.-1997. -Vol.115. - Issue 3. - P.1049-1056. 14. Muradyan E.A., Klyachko-Gurvich G. L., Tsoglin L. N., Sergeyenko T. V., Pronina N.A. Lipid Metabolism during

Adaptation of the High CO2 Concentration // Russian Journal of Plant Physiology. - 2004. - Vol.51. - No1. - P.53-62.




101

CERCETĂRI PRIVIND UNELE ASPECTE ALE RELAŢIILOR DINTRE

METABOLISMUL COMPUŞILOR FOSFORICI ÎN FRUNZE

ŞI RODIRE LA POMII DE MĂR

Anatol CECAN

Institutul de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM The effectuated researches have established that the buds formation and differentiation processes are possible in the

case of an abundant regimens conditions of precipitations and as consequence vigorous and listing vegetative growth and high flowering and respectively formed fruits.

The floral buds formation is possible in the case of phosphoric compounds accumulation in fructbearing formation leaves that is earlier of importance of these compounds in floral induction processes.

In the xx years with high yield and insufficient agro technical measures the metabolic substances accumulation are lemitated thanks to their utilization to the fruit growth and development, and those remained do not satisfied completely in the floral buds formation and differentiation, which is the reason that the apple trees are predisposed to fruiting alternance.

Pomicultura se consideră a fi şi pe viitor una dintre principalele ramuri ale economiei naţionale. Cu toate

că în ultimele decenii ale secolului trecut s-au realizat anumite succese în ce priveşte intensificarea şi specia-lizarea acestei ramuri, încă se simte nevoia unor investigaţii care să determine productivitatea şi eficacitatea pomiculturii. Un element eficient în stabilitatea recoltei este formarea şi diferenţierea mugurilor florali. Cerce-tările efectuate în această direcţie au constatat rolul substanţelor proteice, al glucidelor, al altor metabolice [1]. Insuficienţa fosforului provoacă o serie de modificări metabolice şi, ca urmare, diminuarea creşterii vegetative, formarea butonilor florali etc. Prezenţa unor cantităţi sporite de P–mineral în organele plantei indică insuficienţa substanţelor energogene pentru mobilizarea acestui element [2,3]. Pe parcursul perioadei de vegetaţie compuşii fosforului sunt supuşi unor schimbări esenţiale, se utilizează în cantităţi sporite de către organele reproductive [4,5].

Scopul cercetărilor pe parcursul mai multor ani a fost de a stabili unele modificări cantitative şi calitative în conţinutul compuşilor fosforici în frunze la pomii de măr cu rod optimal şi sporit şi cu rod anual şi periodic.

Material şi metode Cercetările au fost efectuate în livada gospodăriei „Vierul” cu soiurile Golden Delicious şi Wagener premiat,

ultimul considerat cu rod periodic, portaltoi M–IY, anul plantării – 1987, suprafaţa de nutriţie 4x3 m. Pentru realizarea scopului stabilit au fost selectaţi pomi cu rod şi fără rod, cu înflorire optimală (3 bal.) şi sporită (5 bal.) şi cu rod anual şi periodic. Pentru determinarea compuşilor fosforici [6] au fost colectate probe de frunze de pe lăstarii anuali şi ale pintenilor cu fructe şi fără fructe. Datele obţinute au fost prelucrate statistic [7].

Rezultate şi discuţii a) Pomii cu rod optimal şi sporit. Rezultatele analizei biochimice la soiul Golden Delicious cu rod optimal

au demonstrat că în fenofaza creşterii intensive a lăstarilor conţinutul P–acidosolubil total în frunzele cercetate cuprinde valori nesemnificative (Fig.1). Ulterior, în faza fenologică – încetinirea creşterii lăstarilor, creşterea intensivă a fructelor – acest component al fosforului creşte în frunzele pintenilor fără fructe. La pomii cu rod sporit, dimpotrivă, nivelul cantitativ al P–acidosolubil total în frunzele pintenilor fără fructe este mai scăzut decât în cele cu fructe, excepţie fiind fenofaza încetinirii creşterii lăstarilor. Conţinutul P–mineral în frunzele cercetate la ambele grupe de pomi nu afirmă schimbări esenţiale. Cu toate acestea, este de remarcat şi faptul că pe parcursul perioadei de cercetare nivelul cantitativ în frunzele pintenilor fără fructe oscilează în limite mai mici (82,4–107,8), iar în cele cu fructe – mai mari (74,2–117,0 mg P/100 g sub. uscată), fapt determinat de atracţia de către fructe a substanţelor energogene.

Deosebiri semnificative s-au constatat în nivelul de acumulare a P–organic. La pomii cu rod optimal con-ţinutul acestui component al fosforului, începând cu fenofaza încetinirii creşterii lăstarilor, creşterea intensivă



102

a fructelor, este mai ridicat în frunzele pintenilor fără fructe, decât în frunzele celor cu fructe. La pomii cu rod sporit nivelul cantitativ de P–organic cuprinde valori mai mici în frunzele pintenilor fără fructe. Mai evident aceasta se manifestă în perioada intrării fructelor în pârgă, maturării lor, formării şi diferenţierii mugurilor florali.

Analizând datele obţinute, se poate remarca că valoarea raportului P–organic/P–mineral constată intensifi-carea proceselor de sinteză a fosforului organic în frunzele pintenilor fără fructe la pomii cu rod optimal în partea a doua a perioadei de vegetaţie şi diminuarea acestui proces la pomii cu rod sporit.

050

100150200250300350400450

cu rod optimal cu rod sporit

0

20

40

60

80

100

120

140cu rod optimal cu rod sporit

0

50

100

150

200

250

300

350P–organic

P–acidosolubil total

P–mineral



103

Fig.1. Conţinutul compuşilor fosforici în frunze la pomii cu rod optimal şi sporit,

mg P/100 g sub. uscată, soiul Golden Delicious („Vierul”, 1995).

b) Pomii cu rod anual şi periodic. Datele prezentate în Figura 2 relevă diferenţe marcante sub aspectul nivelului de acumulare a compuşilor fosforici. În comparaţie cu frunzele lăstarilor vegetativi anuali ai soiului cu rod anual Golden Delicious, conţinutul P–acidosolubil total şi organic pe parcursul perioadei de cercetare este mai sporit în frunzele pintenilor cu fructe şi, mai semnificativ, în cele fără fructe, iar al P–mineral este mai ridicat în cele cu fructe. La pomii soiului Wagener premiat, considerat cu rod periodic (în anul cercetări-lor pomii au fost cu rod), nivelul de acumulare a compuşilor cu fosfor în majoritatea cazurilor este mai scăzut în frunzele pintenilor cu fructe. Comparând datele obţinute în dependenţă de particularităţile biologice ale soiurilor, se constată că frunzele formaţiunilor fructifere ale soiului Golden Delicious în cele mai dese cazuri se caracterizează printr-un conţinut mai ridicat al P–acidosolubil total şi organic, iar la soiul Wagener premiat – printr-un nivel mai scăzut de P–acidosolubil total şi mineral.

Intensitatea şi direcţia metabolismului compuşilor fosforici sunt confirmate şi prin valorile raportului dintre fracţii. Deşi P–mineral în frunze pe parcursul perioadei de cercetare nu suferă schimbări esenţiale, oscilează în limite restrânse, la pomii cu rod anual se intensifică procesele de sinteză a P–organic în frunzele pintenilor fără fructe, iar la pomii cu rod periodic (în cazul dat, pomii nu vor forma muguri florali pentru recolta anului următor) are loc diminuarea acestui proces în partea a doua a perioadei de vegetaţie. De menţionat şi faptul că acumularea compuşilor fosforici în frunzele formaţiunilor fructifere la pomii Golden Delicious are loc mai devreme, fapt determinat de importanţa acestora în procesele fructificării.

0

0,51

1,52

2,53

3,54

Frunzele pintenilor cufructeFrunzele pintenilor fărăfructe

P–organic/P-mineral

02.06 13.07 19.08 02.06 13.07 19.08

0

100

200

300

400

500

P–acidosolubil

Soiul Golden Delicious Soiul Wagner premiat



104

Fig.2. Conţinutul compuşilor fosforici în frunze la pomii de măr cu rod anual şi periodic, mg P/100 g sub.uscată („Vierul”, 1994).

Formarea mugurilor florali prezintă un indiciu după care se poate aprecia dacă metabolismul substanţelor

a evaluat în favoarea acestui proces. Din datele prezentate rezultă că la pomii cu rod anual şi cu recoltă de fructe optimală conţinutul compuşilor fosforici în frunzele pintenilor fără fructe (va forma muguri de rod pentru recolta anului următor), în comparaţie cu frunzele celor cu fructe, prezintă valori mai mari în fenofaza încetinirii creşterii lăstarilor, perioadă ce corespunde cu formarea şi diferenţierea butonilor florali. La pomii cu rod sporit de soiul Golden Delicious şi la pomii cu rod periodic de soiul Wagener premiat s-a constatat diminuarea con-ţinutului de compuşi fosforici şi a sintezei P–organic în frunzele formaţiunilor fructifere, atât cu fructe, cât şi fără fructe, ceea ce se explică prin utilizarea substanţelor energogene la creşterea vegetativă şi a fructelor. Această situaţie subminează posibilitatea acumulării substanţelor metabolice, necesare proceselor inducţiei florale. În cadrul observaţiilor fenologice efectuate ulterior s-a constatat că pomii cu înflorire sporită şi, res-pectiv, recolta de fructe în anul precedent au avut înflorire slabă, sau foarte slabă, şi, ca urmare, pomii au fost predispuşi la alternanţa în rodire – fenomen frecvent în ultimii ani în livezile slab îngrijite.

0

20

40

60

80

100

P–mineral

050

100150200250300350400

P–organic

0

1

2

3

4

5

6

7

Frunzele lăstarilor anualiFrunzele pintenilor cu fructeFrunzele pintenilor fără fructe

15.06 14.07 08.08 15.06 14.07 08.08

P–organic/P–mineral



105

Concluzii Diminuarea proceselor de formare a mugurilor florali are loc în cazul unui regim excedentar de pre-

cipitaţii şi, ca urmare, creşteri negative viguroase şi prelungite [8], consum sporit de substanţe metabolice şi în cazul unei înfloriri sporite, respectiv, cu recoltă de fructe sporită, situaţie ce subminează acumularea substanţelor energogene necesare proceselor inducţiei florale.

Formarea mugurilor florali este consecinţa unor înfloriri optimale şi, respectiv, premisa unei recolte de fructe optimale a pomilor. În acest caz, acumularea compuşilor fosforici şi intensificarea sintezei P–organic în frunzele formaţiunilor fructifere are loc în partea a doua a perioadei de vegetaţie, după încetinirea creşterii lăstarilor. Această legitate se confirmă la pomii cu rod anual.

Acumularea compuşilor fosforici în frunzele formaţiunilor fructifere la pomii cu rod anual are loc mai devreme şi se caracterizează printr-un conţinut mai sporit de P–acidosolubil total şi organic, fapt determinat, probabil, de importanţa acestora în procesele formării şi diferenţierii mugurilor florali.

În anii cu recoltă sporită acumularea substanţelor metabolice şi a compuşilor fosforici este limitată, datorită utilizării acestora la formarea, creşterea şi dezvoltarea fructelor, iar cele rămase nu satisfac pe deplin declanşarea proceselor inducţiei florale şi, ca urmare, pomii sunt dispuşi la alternanţă în rodire – fenomen frecvent în ultimii ani datorat măsurilor agrotehnice insuficiente;

Diminuarea formării şi diferenţierii mugurilor florali se poate realiza prin măsuri agrotehnice, cum ar fi: intervenţii prin tăieri în coroana pomilor, când peste 50% din totalul mugurilor sunt de rod, rărirea florilor prin intermediul substanţelor chimice sau rărirea manuală a fructelor şi asigurarea unor creşteri vegetative; prin luarea de alte măsuri, cum ar fi nutriţia minerală conform cerinţelor plantelor. Aceasta va permite obţinerea unor recolte de fructe optimale şi stabile şi diminuarea alternanţei în rodire a pomilor.

Referinţe:

1. Коломиец И. Преодоление периодичности плодоношения яблони. - Киев: Урожай, 1976, с.236. 2. Сатник К. Фосфорный обмен и рост растений. Физиолого-биохимические основы роста растений. - Киев:

Наукова думка, 1966, с.83-97. 3. Филипов Л. и др. Условия питания, необходимые для образования цветковых почек у яблони // Труды Молд.

НИИСВ и В. – 1965. - Т.10. - С.85-98. 4. Колесников В. Перспективы применения радиоизотопов в плодоводстве // Тезисы докладов Всесоюзной

научно-технической конференций. - Москва: Наука, 1967, с.91. 5. Cecan A. Cercetări privind conţinutul compuşilor cu fosfor în muguri la pomii de măr cu rod optimal şi sporit // Lucrări

ştiinţifice. Seria „Agronomie”. (Iaşi). - 1999. - Vol.1(42). - P.214-217. 6. Плешков Б. Практикум по биохимии растений. - Москва: Колос, 1985, с.184-192. 7. Юдин В. Методика агрохимического исследования. - Москва: Колос, 1971, с.154-182. 8. Cecan A., Robu T. Cercetări privind unele aspecte ale relaţiilor dintre creştere şi rodire la pomii de măr cu rod anual

şi periodic // Lucrări ştiinţifice. Seria „Agronomie”. (Iaşi). - 1998. - Vol.41. - P.22-27.




106

ANATOMIA EPIDERMEI FRUNZEI LA UNELE SPECII

DE VIŢĂ DE VIE (VITIS L.)

Valentin CODREANU

Grădina Botanică (Institut), AŞM In this paper the anatomy of adaxial and abaxial epidermis of the mature leaf at the 11 grapevine species is described.

The adaxial epidermis consists from a raw of polygonal cells, compactly arranged near one to other. The abaxial epi-dermis is formed from basal epidermal cells, stomata, auxiliary cells, and protector hairs. The stomatal apparatus is of the actinocytic type and is specific for the studied species. The values of 8 biometric characters of the leaf epidermis are calculated. It is very notable to emphasize that the stomata density per 1 mm-2 of the foliar area varies from 160.9 stomata mm-2 at the Vitis californica Benth. to the 252.51 in the V.candicans Engelm. The adaxial epidermis cells density varies from 1256 cells mm-2 of the foliar area in V.monticola Buckl. to 3013.3 at V.californica Benth.

Plantele se adaptează la condiţiile de viaţă prin diferite căi, iar adaptările anatomice au un rol însemnat

pentru existenţa lor în condiţii aspre, în condiţii de stres (secetă). Din această cauză, studierea adaptărilor struc-turale este o problemă importantă a anatomiei ecologice a plantelor. Problema adaptării plantelor la secetă este, în ecologie, principală datorită importanţei ei teoretice şi practice.

Una dintre direcţiile principale ale cercetărilor anatomice contemporane este studierea anatomiei acelor grupe taxonomice de plante, care sunt valoroase din punct de vedere economic. Speciile şi soiurile de plante liane ale genului Vitis L. (fam. Vitaceae) şi cunoaşterea mai deplină a biologiei lor stau la baza ampelografiei şi viticulturii moderne. Studierea lor anatomică e necesară pentru a evidenţia speciile şi soiurile de viţă de vie autohtone şi alohtone rezistente la secetă şi a stabili caracterele adaptive structurale ale rezistenţei lor la secetă.

Schimbările adaptive ale plantelor la nivel anatomic pot fi studiate mai bine la frunză, deoarece ea este cel mai plastic organ al plantei, care receptiv reacţionează la schimbările mediului ambiant. Adaptarea ecologică a plantelor la diferite condiţii de asigurare cu apă se realizează pe baza variabilităţii indicilor cantitativi ai structurii anatomice a frunzei.

Reieşind din aceste principii, considerăm că studierea unor caractere anatomice şi morfologice cantitative ale frunzei la diferite specii şi soiuri ale genului Vitis L. (morfologia, densitatea şi biometria stomatelor, pero-zitatea, grosimea frunzei, suprafaţa şi masa ei şi al.) ne va permite să stabilim legităţile anatomice ale adap-tării ecologice a viţei de vie la secetă şi să evidenţiem caracterele ei anatomice adaptive, care pot fi folosite în lucrările de selecţie şi introducţie.

În acest articol prezentăm anatomia epidermei frunzei la 11 specii de viţă de vie.

Material şi metode

Materialul de cercetare – frunzele mature (26.07.2006) ale speciilor viţei de vie, programate pentru studiu – a fost colectat în colecţia ampelografică a Institutului Naţional al Viei şi Vinului, situată în apropierea mun.Chişinău. În studiu au fost incluse următoarele specii ale genului Vitis L.: Vitis aestivalis Mich., V.californica Benth., V.candicans Engelm., V.champini Planch., V.cinerea Engelm., V.monticola Buckl., V.pagnuccii Rom., V.rupestris Scheele, V.solonis, V.sylvestris Gmel., V.wilsonae Veitch. Originea sau locul celei mai largi răspândiri a acestor specii a fost determinată după datele literaturii [1-3].

Anatomia epidermei frunzei a fost studiată la microscopul optic Ergaval pe replicile (amprentele) epidermei adaxiale şi abaxiale, obţinute din lacul incolor de tipul „Olivia”, „Leydi oje”, „Golden Rose”. Au fost folosite 2 variante de obţinere a replicilor (amprentelor) epidermei frunzei viţei de vie.

Varianta 1 Pentru a căpăta replica sectorului dat al frunzei, muiem periuţa flaconului în lac incolor şi tragem o linie

de 1-3 cm lungime pe partea de mijloc a frunzei. După ce replica (amprenta) s-a uscat, rupem frunza de pe plantă şi o introducem în foaia de ierbar. În laborator detaşăm replica epidermei frunzei, apoi o studiem la microscopul fotonic.



107

Varianta 2 (utilizată în lucrare)

În colecţia ampelografică, de la fiecare specie de viţă de vie, din partea mijlocie a 5 frunze, tăiem cu stan-ţatorul de tăiere a plutei 5-6 fragmente rotunde cu diametrul 15-20 mm şi le introducem imediat în flacoane cu etanol de concentraţia 96%. Aceste sectoare de frunze se fixează şi se păstrează în alcool etilic până când vom pregăti de pe ele replicile (amprentele) epidermei adaxiale şi abaxiale.

Pregătirea replicii de pe sectoarele de frunze, fixate în etanol, include următoarele operaţii consecutive. 1. Scoatem fragmentul de frunză din flaconul cu etanol şi absorbim spirtul etilic de pe suprafeţele lui cu

hârtie de filtru. 2. Pe partea adaxială a unui fragment de frunză şi pe partea abaxială a altui fragment de frunză picurăm

cu pipeta soluţie de apă distilată + glicerină (1 : 1, după volum), în aşa cantitate ca să acopere pe deplin frag-mentele de frunze, aşezate pe lama de sticlă curată şi uscată. În această soluţie fragmentele de frunză se vor ţine 2-4 ore, apoi soluţia se va absorbi cu hârtie de filtru.

3. Fragmentele de frunze le acoperim cu un strat de lac incolor „Olivia” cu ajutorul periuţei din flaconul cu lacul corespunzător.

4. După o perioadă de 8-24 ore, cu o pincetă cu vârfurile ascuţite detaşăm replica (amprenta) de lac incolor de pe fragmentul de frunză.

5. Studiem replica la microscopul optic, la mărirea: obiectiv 6,3X ocular 12,5X, ob. 16X oc. 12,5X, ob. 40X oc. 12,5X, ob. 100X oc. 12,5X.

Desenele anatomice au fost efectuate cu aparatele de desen RA-7, la mărirea: obiectiv 40X ocular 10X. Metodele de determinare a caracterelor biometrice ale epidermei frunzei viţei de vie sunt descrise în [4].

Rezultate Epiderma frunzei viţei de vie este un ţesut de protecţie primar, alcătuit dintr-un singur rând de celule,

variate după structură şi funcţii. Acest ţesut înveleşte mezofilul şi formează, pe partea ventrală a frunzei, epiderma adaxială, iar pe partea ei dorsală – epiderma abaxială. Epiderma adaxială a frunzei viţei de vie este alcătuită dintr-un singur rând de celule, în plan, poligonale, compact situate una lângă alta (Fig.1-11a). La speciile studiate epiderma adaxială este alcătuită din celule cu forma de poligon cu 5-8 laturi de diferită lun-gime şi din peri protectori, variaţi după morfologie şi dimensiuni. La unele specii perii (trichomele) lipsesc.

Epiderma abaxială a frunzei este compusă din mai multe componente: celule epidermale propriu-zise (de bază), stomate, celule anexe şi peri protectori, variaţi după formă şi mărime. Stomatele, împreună cu celulele secundare (anexe) şi vecine, formează aparatele (complexele) stomatice (Fig.1-11b).

Funcţia principală a epidermei frunzei la viţa de vie este protecţia plantei de la pierderea excedentară a apei şi a substanţelor nutritive, apărarea de vătămarea mecanică şi de pătrunderea microorganismelor patogene. Epiderma poate îndeplini aceste funcţii datorită faptului că are stomate şi celulele epidermale situate compact una lângă alta. Pereţii tangenţiali exteriori ai celulelor epidermale au o grosime mai mare, comparativ cu cei radiali, straturile lor exterioare sunt îmbibate cu cutină. În cuticulă şi pe suprafaţa ei este prezentă ceara, care determină permeabilitatea cuticulei pentru apă.

Potrivit datelor din literatură [4-7], stomata reprezintă o pereche de celule stomatice (de închidere) cu ostiol(ă) (apertură) între ele. Stomata e înconjurată de celule epidermale obişnuite (celule vecine) sau celule modificate (celule anexe). De obicei, celulele anexe (accesorii) se deosebesc după formă şi mărime de celelalte celule ale epidermei. Tipul morfologic actinocit al aparatelor (complexelor) stomatice ale epidermei frunzei la cele 11 specii de viţă de vie a fost evidenţiat reieşind din dispoziţia celulelor anexe şi vecine faţă de celulele stomatice (de închidere) (a se vedea Fig.1-11b). La tipul actinocit al aparatelor stomatice celulele anexe ale stomatelor se deosebesc după formă şi mărime. Ele formează în jurul celulelor stomatice o rozetă. Pereţii laterali ai celulelor rozetei sunt îndreptaţi spre apertură (a se vedea Fig.1-11b).

Caracterele anatomice cantitative ale epidermei frunzei la 11 specii de viţă de vie studiate sunt prezentate în Tabel. Densitatea medie a stomatelor epidermei abaxiale a frunzei variază de la 160,90 stomate/mm2 de suprafaţă (arie) foliară, la specia Vitis californica, până la 252,51 stomate/mm2, la specia V.candicans. Lungimea medie a stomatelor variază de la 23,15 µm, la specia V.wilsonae, până la 30,83 µm, la specia V.champini. Densitatea celulelor epidermei adaxiale la 1 mm2 de suprafaţă (arie) foliară variază de la 1256 celule/mm2, la specia V.monticola, până la 3013,60 celule/mm2, la specia V.californică. Suprafaţa (aria) medie a unei celule a epidermei adaxiale variază de la 331,82 µm2, la specia V.californica, până la 796,17 µm2, la specia V.monticola.

Tabel

Caractere biometrice ale epidermei frunzei la unele specii de viţă de vie (Vitis L.), 2006

Specia Originea speciei sau locul celei mai largi răspândiri

Densitatea stomatelor (la 1 mm2)

Lungimea stomatelor

(în µm)

Lăţimea stomatelor

(în µm)

Lungimea ostiolei (în µm)

Distanţa între stomate (în µm)

Densitatea celulelor epidermei adaxiale

(la 1 mm2)

Suprafaţa (aria) medie a celulelor

epidermei adaxiale (în µm2)

Vitis aestivalis Mich. SUA: Virginia, Carolina 179,60 30,67 18,58 18,11 46,4 1534,66 651,62

Vitis californica Benth. SUA: California, Oregon 160,90 26,83 16,25 16,79 35,51 3013,60 331,82

V.candicans Engelm. SUA: Texas, Louisiana, Oklahoma, Arkansas 252,51 25,67 17,61 15,69 34,50 1879,20 532,14

V.champini Planch. SUA: Texas 214,01 30,83 21,61 19,37 32,89 2134,40 468,50

V.cinerea Engelm. SUA: Illinois, Missouri, Oklahoma 203,90 26,21 19,47 16,78 40,94 2120,00 471,70

V.monticola Buckl. SUA: Texas 185,30 26,53 16,36 16,39 39,35 1256,00 796,17

V.pagnuccii Rom. du Caillaud. Este răspândită în China 238,47 28,45 19,03 17,36 38,06 1860,80 537,40

V.rupestris Scheele SUA: Missouri, Illinois, Kentucky, Tennessee 226,95 27,20 20,23 14,78 33,02 1841,60 551,07

V.solonis SUA: Oklahoma, Texas 183,86 29,50 19,23 16,91 37,85 1805,60 553,83

V.sylvestris Gmel. Sud-Vestul Asiei, Asia Mică, Nordul Africi, Europa 222,84 25,05 15,45 15,48 39,53 1903,33 528,39

V.wilsonae Veitch. Asia 236,81 23,15 15,55 12,69 36,08 1761,60 567,66



109

a b Fig.1a-b. Vitis aestivalis Mich.

a b

Fig.2a-b. Vitis californica Benth.

a b Fig.3a-b. Vitis candicans Engelm.



110

a b Fig. 4a-b. Vitis champini Planch.

a b Fig.5a-b. Vitis cinerea Engelm.

a b Fig.6a-b. Vitis monticola Buckl.



111

a b Fig.7a-b. Vitis pagnuccii Rom.

a b Fig.8a-b. Vitis rupestris Scheele

a b Fig. 9a-b. Vitis solonis



112

a b Fig.10a-b. Vitis sylvestris Gmel.

a b

Fig.11a-b. Vitis wilsonae Veith.

Legenda la figuri

— Bara în figuri are lungimea de 50 µm. După părerea noastră, din cele 7 caractere biometrice ale epidermei frunzei, determinate la 11 specii de

viţă de vie, mai informative pentru caracterizarea epidermei sunt 4: densitatea stomatelor la 1 mm2 de supra-faţă foliară, lungimea stomatelor (în µm), densitatea celulelor epidermei adaxiale la 1 mm2 de suprafaţă foliară şi suprafaţa (aria) medie a celulelor epidermei adaxiale (în µm2). Din punct de vedere metodic, aceste carac-tere biometrice pot fi calculate mai repede şi mai obiectiv, comparativ cu celelalte 3.

Fig.1a-11a. Epiderma adaxială a frunzei mature la 11 specii ale genului Vitis L. este alcătuită dintr-un rând de celule situate compact una lângă alta. Privite de sus, în plan, ele au forma de poligon cu 5-8 laturi de diferită lungime.

Fig.1b-11b. Morfologia celulelor epidermei abaxiale a frunzei mature, în plan, la 11 specii de viţă de vie. În epidermă se disting stomatele, celulele anexe şi celulele epidermale propriu-zise. Tipul morfologic al aparatelor (complexelor) stomatice este actinocit, dar numărul celulelor anexe şi vecine, care încon-joară celulele stomatice, variază de la 5 până la 9.



113

Concluzii

În rezultatul studierii anatomiei epidermei frunzei la 11 specii de viţă de vie, sunt formulate următoarele concluzii.

1. Epiderma adaxială a frunzei, la speciile studiate, este alcătuită dintr-un singur rând de celule, compact situate una lângă alta. În plan, aceste celule sunt poligonale şi cele 5-8 laturi ale poligonului au lungime diferită. Epiderma adaxială nu are stomate.

2. În plan, epiderma abaxială a frunzei viţei de vie este compusă dintr-un singur rând de celule, variate după dimensiuni, structură şi funcţii: celule epidermale propriu-zise (de bază), stomate, celule anexe (secundare) şi peri protectori de diferită mărime şi formă.

3. Tipul morfologic actinocit al aparatelor (complexelor) stomatice este caracteristic pentru epiderma abaxială a frunzei la speciile viţei de vie studiate.

4. Densitatea stomatelor la 1 mm2 de suprafaţă (arie) foliară este specifică pentru fiecare specie de viţă de vie, dar este influenţată de factorii mediului ambiant. La speciile studiate densitatea stomatelor variază de la 160 stomate/mm2 până la 252 stomate/mm2. Densitatea stomatelor poate fi folosită la clasificarea ecologică a speciilor viţei de vie (Vitis L.).

5. Se observă următoarea legitate, caracteristică pentru stomate şi celulele epidermei adaxiale a frunzei viţei de vie: mărirea densităţii stomatelor şi a densităţii celulelor epidermei adaxiale duce la micşorarea supra-feţei acestor celule.

Referinţe:

1. Негруль А.М. Семейство Vitaceae Lindley (Ampelideae Kunth.) // Ампелография СССР. Том 1. - Москва: Пищепромиздат, 1946, с.45-132.

2. Уинклер А.Дж. Виноградарство США. - Москва: Колос, 1966. 3. Constantinescu Gh., Ciocîrlan V., Alexei O. Sistematica familiei Vitaceae // Ampelografia Republicii Socialiste

România. Vol.1. - Bucureşti: Editura Academiei RSR, 1970, p.219-295. 4. Codreanu V. Anatomia comparată a viţei de vie (Vitis L.): Monografie. - Chişinău: Combinatul Poligrafic, 2006. - 252 p. 5. Зубкова И.Г. Сравнительное морфолого-анатомическое изучение черешка и эпидермы листа у представителей

семейства. Vitaceae Juss. - В кн.: Вопросы сравнительной морфологии семенных растений. - Ленинград: Наука, 1975, с.25-49.

6. Эзау К. Анатомия семенных растений. Книги 1, 2. - Москва: Мир, 1980. 7. Baranova M. Principles of comparative stomatographic studies of flowering plants // Bot. Rev. - 1992. - Vol.58. - No1. -

P.49-99.




114

ВЛИЯНИЕ МЕДИ НА АККУМУЛЯЦИЮ СЕЛЕНА КУКУРУЗОЙ И ПОДСОЛНЕЧНИКОМ

Марина КАПИТАЛЬЧУК, Надежда ГОЛУБКИНА*, Иван КАПИТАЛЬЧУК**, Анна ШУЛЬМАН**, Максим АНГЕЛЮК**

Институт генетики и физиологии растений АН Молдовы *Институт питания РАМН, г. Москва, Россия **Тираспольский университет им. Т.Г. Шевченко, Республика Молдова Au fost stabilite deosebirile principale în caracterul influenţei cuprului care se conţine în sol la asimilarea selenului

în plantele de porumb şi floarea-soarelui. The present paper discusses the differences in nature Cu influence in soil on Se accumulation in maize and

sunflower. Введение Поглощение растениями макро- и микроэлементов находится в прямой зависимости от содержания

элементов минерального питания в почве. Для растений хорошо доступны все растворимые, а также обменно-поглощенные формы элементов питания. Нормальное функционирование растительного организма осуществляется при строго определенном соотношении ионов во внешней среде. При этом увеличение количества элемента, находящегося в недостаточной концентрации, способствует поглоще-нию других элементов, то есть проявляется синергизм. В то же время избыток какого-либо элемента приводит к антагонизму, проявляющемуся в ограничении поступления других элементов питания [1].

Нами исследовалось влияние меди на усвоение растениями селена. Следует ожидать, что взаимо-действие между данными микроэлементами должно проявляться в форме антагонизма [6].

Общеизвестно, что селен относится к условно необходимым элементам питания растений, однако благодаря своим антиоксидантным свойствам селен является эссенциальным микроэлементом для человека и животных [3]. В связи с этим большое значение имеет изучение условий накопления селена растениями, используемыми как продукты питания человека и корм для животных.

Материалы и методы Сбор образцов почв и растений, подготовка их к лабораторным анализам проводились в соответ-

ствии со стандартными методиками [5], на территории двух почвенных районов Молдовы: района типичных и карбонатных черноземов лесостепи юго-западной окраины Волыно-Подольской возвышенно-сти и района обыкновенных и южных черноземов Южноприднестровской степной равнины. При этом анализируемые образцы растений соответствовали следующим фазам вегетации: кукуруза – до начала цветения, подсолнечник – в начале цветения.

Образцы измельченных растений просушивались без доступа прямых солнечных лучей, а затем перемалывались в муку. Содержание селена в почвах определялось атомно-абсорбционным спектро-фотометром [2], а в растениях – флуорометрическим методом с использованием референс-стандартов [10]. Содержание меди в почвах определялось стандартным колориметрическим методом [7].

Результаты и их обсуждение Содержание селена в почвах на изучаемой территории рассматривалось в работах [2, 4, 8-9], поэтому в

таблице 1 представлены данные только по содержанию меди в различных типах почв. Для сравнения в данной таблице указаны также средние значения валового содержания меди для соответствующих типов почв Молдовы, приведенные в монографии В.П. Кирилюка [6].


115

Таблица 1 Валовое содержание меди (мг/кг) в различных типах почв в слое 0-40 см

Почва Кол-во проб

Диапазон наблюдаемых значений

Среднее Стандарт. отклонение

Среднее по [6]

Чернозем выщелоченный 2 56,3 – 68,9 62,0 ±6,31 37,3 Чернозем типичный 8 12,6 – 25,5 17,9 ±4,36 33,1 Чернозем обыкновенный 14 13,3 – 73,8 25,7 ±17,59 37,4 Чернозем карбонатный 6 16,8 – 36,8 23,7 ±8,06 32,6 Пойменная слоистая 3 16,8 – 53,3 24,4 ±19,66 - Все типы 33 12,6 – 73,8 23,6 ±16,59 35,1

Из таблицы 1 следует, что в почвах исследуемой территории валовое содержание меди изменяется

в довольно широком диапазоне – от 12,6 до 73,8 мг/кг, хотя среднее значение концентрации меди в почвах составляет всего 23,6 мг/кг, что существенно меньше среднего значения этого параметра в целом для Молдовы (35,1 мг/кг). Рассматривая содержание меди в отдельных типах почв, можно отме-тить, что наиболее бедными медью оказались типичные черноземы, в которых концентрация этого микроэлемента изменяется в пределах от 12,6 до 25,5 мг/кг, при среднем значении 17,9 мг/кг. Это почти в два раза ниже средней концентрации меди для этого типа почв Молдовы (см. табл.1). Однако нижние пределы диапазона наблюдаемых значений содержания меди в исследуемых почвах все же существенно превышают порог дефицита этого элемента, который составляет менее 2,0–5,0 мг/кг в черноземной зоне [1]. Высокое среднее значение содержания меди (62,0 мг/кг) в черноземе выщелоченном у с. Строинцы обусловлено, видимо, техногенным фактором в условиях малой выборки (всего 2 пробы). Особо следует отметить повышенное содержание меди ( до 73,8 мг/кг) в почвах поймы и террас Днестра у с. Чобручи Слободзейского района, где также наблюдаются аномально высокие концентрации селена (до 1,93 мг/кг) [4, 9].

В таблице 2 представлены данные, характеризующие накопление селена в надземной части растений кукурузы в фазе выбрасывания метелки в зависимости от валового содержания меди и соотношения медь/селен в почве.

Таблица 2 Биоаккумуляция селена в надземной части растений кукурузы

в зависимости от типа почв с различным содержанием меди и селена

Тип почвы Почвообразующая порода Место взятия проб

Cu в почве, мг/кг

Cu/Se в почве

Se в растении, мкг/кг

Чернозем карбонатный Супесь Слободзейский р-н,

с.Терновка 26,8 268 107

Чернозем карбонатный

Лессовидный средний суглинок Каменский р-н, с.Кузьмин 20,1 56,6 90


Лессовидный тяжелый суглинок

Григориопольский р-н, с.Бутор 30,2 111,8 128

Чернозем обыкновенный

Лессовидный средний суглинок

Слободзейский р-н, с.Парканы 44,0 139,7 109



Дубоссарский р-н, с.Гармацкое 21,6 63,5 89

Чернозем типичный

Лессовидный средний суглинок Каменский р-н, с.Грушка 16,5 51,6 90

Пойменная луговая слоистая

Аллювиальные слоистые наносы

Слободзейский р-н, с.Чобручи 30,9 91,2 119

Все типы 27,2 111,8 104,6



116

Как видно из таблицы 2, в надземной части растений кукурузы содержится в среднем 104,6 мкг селена на 1 кг воздушно-сухого вещества. Аккумуляция селена этой сельскохозяйственной культурой в зависимости от геохимических условий варьирует в пределах 89 – 128 мкг/кг. В соответствии с зада-чами исследования, в качестве геохимических параметров среды здесь рассматривается содержание меди в пахотном слое почвы (0-40 см) и отношение медь/селен в этом почвенном слое. Из представ-ленных в таблице 2 данных следует, что содержание меди в почвах, на которых произрастала кукуруза, составляет от 16,5 до 44,0 мг/кг, а сотношение медь/селен варьирует в более широком диапазоне значений, изменяясь от 51,6 до 268.

На рис.1а представлена зависимость величины аккумуляции селена кукурузой от концентрации меди в почве. Здесь и на последующих рисунках кроме экспериментальных точек показаны также аппроксимирующие кривые, приведены соответствующие уравнения регрессии и величина достовер-ности аппроксимации (R2).

Расчеты показали, что между количеством меди в почве и содержанием селена в кукурузе наблюда-ется положительная корреляционная связь со значением коэффициента корреляции r = 0,6377, что явилось неожиданным, поскольку, как указывалось выше, прогнозировалось проявление антагонизма между этими элементами.

а)

y = -0,1097x2 + 7,7263x - 16,495R2 = 0,7529

40

60

80

100

120

140

10 20 30 40 50медь, мг/кг

селе

н, мкг

/кг

б)

y = -0,0121x2 + 2,63x - 19,997R2 = 0,8894

50

75

100

125

150

50 75 100 125 150медь/селен (почва)

селе

н , м

кг/кг

Рис.1. Содержание селена в кукурузе в зависимости от концентрации меди (а) и соотношения медь/селен (б) в почве

Однако из результатов аппроксимации, приведенных на рис.1а, следует, что в имеющемся диапазоне

значений увеличение меди в почве сопутствует повышению содержания селена в растениях кукурузы до определенного предела. При возрастании валового содержания меди в почвах до 30 - 35 мг/кг начинает, видимо, проявляться антагонизм между элементами и содержание селена в растениях уменьшается.

Выше отмечалось, что проявления антагонизма и синергизма зависят от определенного соотношения ионов химических элементов в почве. Поэтому представляется важным рассмотрение интенсивности накопления растениями селена в зависимости от величины соотношения Cu/Se в почве. Результаты такого анализа представлены на рис.1б. Коэффициент корреляции между параметрами «медь/селен (почва)» и «селен (кукуруза)» оказался положительным и составил 0,7386. Причем, увеличение в почве соотношения Cu/Se вначале способствует накоплению селена в растениях кукурузы, но когда величина этого соотношения превышает значение 120, содержание селена в кукурузе уменьшается.

Рассмотрим, каким образом величина концентрации меди в почве влияет на аккумуляцию селена подсолнечником. Как следует из анализа представленных в табл.3 данных, содержание селена в растениях подсолнечника выше, чем в кукурузе, и в среднем составляет 115,6 мкг/кг, варьируя в зависимости от геохимических условий от 104 до 143 мкг/кг. Концентрация меди в рассматриваемых почвах изменяется в диапазоне 13,3 – 47,1 мг/кг, а соотношение Cu/Se – с 31,8 до 268.


117

Таблица 3 Биоаккумуляция селена подсолнечником в зависимости от типа почв

с различным содержанием меди и селена

Тип почвы Почвообразующая порода Место взятия проб

Cu в почве, мг/кг

Cu/Se в почве

Se в растении, мкг/кг


Супесь Слободзейский р-н, с.Терновка 26,8 268 104



Григориопольский р-н, с.Бутор 30,2 111,8 111



Рыбницкий р-н, с.Попенки 13,3 45,9 105



Дубоссарский р-н, с.Гармацкое 21,6 63,5 117



Слободзейский р-н, с.Чобручи 47,1 31.8 114

Чернозем типичный

Лессовидный средний суглинок

Каменский р-н, с.Грушка 16,5 51,6 143

Все типы 25,9 95,4 115,6

На рис.2 отображено содержание селена в подсолнечнике в зависимости от концентрации меди и величины соотношения Cu/Se в почве.

а)

y = 0,0197x2 - 1,4613x + 137,93R2 = 0,0822

100

110

120

130

140

150

10 20 30 40 50медь (почва), мг/кг

селе

н (раст.

), мкг

/кг

б)

y = -1E-04x2 - 0,0382x + 120,84R2 = 0,1808

100

120

140

160

0 100 200 300медь/селен (почва)

селе

н (раст.

), мкг

/кг

Рис.2. Содержание селена в подсолнечнике в зависимости от концентрации меди (а)

и величины соотношения медь/селен (б) в почве

Как видно из рис.2а, характер влияния меди в почве на накопление селена подсолнечником прояв-ляется иначе, чем в случае кукурузы. Здесь прослеживается тенденция к уменьшению аккумуляции селена подсолнечником с ростом концентрации меди в почве. Однако корреляционная взаимосвязь между этими параметрами очень слабая (r= - 0,2240). Теснота корреляционной зависимости несколько возрастает при рассмотрении влияния соотношения Cu/Se в почве на аккумуляцию селена подсолнеч-ником (рис.2б), но все же остается достаточно слабой (r = - 0,4240). При возрастании величины отно-шения Cu/Se в почве наблюдается тенденция к снижению содержания селена в растениях подсолнечника.

Выводы Почвы на рассматриваемых территориях отличаются в среднем более низким содержанием меди,

чем в целом по Молдове. Имеются принципиальные отличия в характере влияния меди, содержащейся в почве, на накопление

селена растениями кукурузы и подсолнечника. В частности, между количеством меди в почве и



118

содержанием селена в кукурузе наблюдается положительная корреляция. Однако когда содержание меди в почве достигает 30 – 35 мг/кг, начинает проявляться тенденция к уменьшению селена в кукурузе.

Для подсолнечника увеличение количества меди в почве сопровождается уменьшением селена в растении, при этом корреляционная зависимость между этими параметрами очень слабая.

Замена абсолютных значений концентрации меди на соотношение медь/селен в почве существенно не изменяет характера влияния меди на аккумуляцию селена растениями.


1. Агрохимия /Б.А. Ягодин, П.М. Смирнов, А.В. Петербургский и др. / Под ред. Б.А. Ягодина: 2-е изд., перераб. и доп. – Москва: Агропромиздат, 1989. - 639 с.

2. Богдевич О.П., Измайлова Д.Н., Капитальчук М.В., Тома С.И. Оценка содержания селена в почвах Молдовы // Buletinul Institutului de Geofizică şi Geologie al A.S.M. - 2005. - Nr.1. - P.83-87.

3. Гмошинский И.В., Мазо В.К. Селен в питании: краткий обзор // Medicina Altera. - 1999. - Nr.4. - P.18-22.

4. Капитальчук М.В. Содержание селена в почвах Южноприднестровской степной равнины // Степи Северной Евразии: Материалы IV Mеждународного симпозиума.- Оренбург, 2006, с.339-341.

5. Ковальский В.В., Гололобов А.Д. Методы определения микроэлементов в органах и тканях животных, растениях и почвах. - Москва: Колос, 1969.- 272 с.

6. Кирилюк В.П. Микроэлементы в компонентах биосферы Молдовы. - Chişinău: Pontos, 2006. - 156 p. 7. Сендел Е. Колориметрические методы определения следов металлов. - Москва: Мир, 1964. 8. Тома С., Капитальчук М., Капитальчук И. Содержание селена в некоторых природных компонентах

на территории Республики Молдова // Analele Ştiinţifice ale USM. Seria “Ştiinţe chimico-biologice”. - Chişinău, 2006, p.348-352.

9. Тома С., Капитальчук М., Капитальчук И. Содержание селена в некоторых типах почв левобережных районов Днестра // Ştiinţa agricolă. - 2006. - Nr.1. - P.11-16.

10. Alfthan G. A micromethod for the determination of selenium in tissues and biological fluids by single-test-tube fluorimetry // Anal. Chim. Acta. - 1984. - Vol. 165. - P.187-194.




119

FLORA IERBOASĂ DIN PARCHETELE DE LA CERNOLEUCA (DONDUŞENI)

Mihail MÂRZA, Victor DONEA*, Ludmila NICORICI*, Eliza MÎRZA**, Tatiana SÎRBU***

Catedra Ecologie, Botanică şi Silvicultură *Universitatea Agrară de Stat din Moldova **Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „N.Testemiţanu” ***Grădina Botanică (Institut), AŞM The forests of Moldova have a reduced bioproductive and ecoproductive efficiency, however, the exploitation of the

national forest fund is realized by razing cuttings. The result of such kind of exploitation leads to temporary appearance of some communities of sinantropic plants, where the herbal plants prevail.

It was found that in the assortment of the herbal plants encountered in cutting (≈over 130 species) in the 1st year over 50% are herbal plants; beginning with the 3rd year, gradually increases the number of the multianual species.

Introducere După cum afirmă P.Cuza [1], pădurile Republicii Moldova, sub aspectul potenţialităţii şi polifuncţio-

nalităţii pe care o asigură astăzi, se caracterizează printr-un randament bioproductiv şi ecoproductiv redus. Neţinându-se cont de aceasta, pentru exploatarea fondului forestier al republicii se folosesc, cu regret, pe larg tăieturile rase şi, ca rezultat, se produc schimbări considerabile în ceea ce priveşte componenţa floristică. Tăieturile rase reprezintă, pentru un anumit timp, „comunităţi de plante sinantrope necultivate din cauza taliei mari a unor plante nou instalate, aborigene sau adventive, care, la prima etapă, formează un amestec întâmplător de numeroase specii ierboase”.

Gh.Dihoru [2] afirmă că acestea constituie scena unor succesiuni de scurtă durată (succesiuni antropice subite). Probleme de ordin teoretic în legătură cu instalarea ierburilor în locul pădurilor defrişate au fost tratate de Al.Borza [3], T.Popova, G. Şabanova [4], L.Nicolaeva [5], Gh.Postolache [6] etc. În cadrul acestor cerce-tări s-a constat că după defrişări, alături de plantele ierboase nemofile, se instalează un şir de specii sinantrope necultivate.

Astfel de observaţii asupra parchetelor din nordul Republicii Moldova aproape lipsesc. Motiv ce ne-a determinat să urmărim, în anii 1987-1988, instalarea comparativă în două parchete cu vârstă diferită (unul creat în 1985 şi altul – în 1987) din cadrul Braniştei de la Cernoleuca (comunitate de Quercus petrea + Cerasus avium).

Rezultate şi discuţii S-a constatat că pe baza speciilor rămase din pădure (cca 25 de specii) încep să se instaleze, chiar din

primul an (la sfârşitul lunii mai – începutul lunii iunie), specii sinantrope necultivate, cum ar fi: Amaranthus hibridus, A. retroflexus, Atriplex oblongifolia, Arctium lappa, Chaerophyllum temulum, Chenopodium album, Ch. Hybridum, Echinocloa crusgali, Erigeron annus, E. canadensis, Lactuca serriola, Senecio vernalis, Setaria glauca, S. viridis, Sinapis arvensis, Solanum nigrum, Sonchus oleraceus, Xanthium albinum, X. californicum.

În luna iulie se evidenţiază noi specii: Amaranthus albus, Artemisia absinthium, Chondrilla juncea, Cirsium vulgare, Clinopodium vulgare, Cynodon dactylon, Cynoglossum officinale, Daucus carota, Descurainia sophia, Fagopyrum tataricum, Fallopia convolvulus, Hypericum hyrsutum, H. perforatum, Lapulla squarrosa, Meli-lotus albus, Polygonum aviculare, Senecio vernalis, Silene noctiflora, Sonchus arvensis, Torilis arvensis, Urtica dioica, Verbascum nigrum, V. phlomoides, Vincetoxicum officinale. În ultima parte a perioadei de vegetaţie (octombrie), lista plantelor s-a completat cu: Artemisia annua, Crepia rhoedifolia, Carduus nutans, Chelidonium majus, Eragrostis minor, Lactuca saligna, Stellaria media.

În anul al doilea (1988) se observă dezvoltarea luxuriantă a unor plante perene nemofile rămase din pădure: Dactylis glomerata, Brachypodium sylvaticum, Poa angustifolia, invadarea masivă a celor anuale, ca: Galium aparine, G. tricornutum etc. şi apariţia de noi elemente: Achillea setacea, A. colina, Anisantha tectorum, Anthemis subtinctoria, Bupleurum rotundifolium, Capsella bursa-pastoris, Carduus acanthoides, Conium maculatum, Erysimum difusum, Festuca valesiaca, Filago arvensis, Lamium purpureum, Leonurus cardiaca,



120

Medicago minima, Myosotis arvensis, Potentilla argentea, Reseda lutea, Silene noctiflora, Sisymbrium loeselii, Sonchus asper, Taracsacum officinale, Thlaspi perfoliatum, Torilis arvensis, Verbascum nigrum, V. speciosum, Veronica arvensis, V. chamaedrys, V. persica. Numărul speciilor de plante sinantrope necultivate invadatoare a crescut de la 17 (în luna iunie) la 23 (în luna iulie), apoi la 8 (în luna octombrie 1987) şi la 29 (în octombrie 1988).

Un alt parchet, din aceeaşi pădure, a fost cercetat în al treilea şi al patrulea an de existenţă. Speciile sinantrope necultivate înregistrate (VI,VII, 1987, 1988) sunt: Acachmena cuspidata, Anchusa procera, Achillea setacea, Anisatha tectorum, Anthriscus sylvestris, Agrimonia eupatoria, Artemisia absinthium, A. austriaca, Arctium tomentosum, Arenaria serpyllifolia, Bromus arvensis, B. squarrossus, Bupleurum falcatum, Capsella bursa-pastoris, Camelina microcarpa, Carduus crispus, Centhaurea biebersteinii, C. diffusa, Crepis rhoedifilia, C. panonica, Cirsium arvense, C. vulgare, Coronilla varia, Daucus carota, Descurainia sophia, Dianthus membranaceus, Filago arvensis, Fragaria viridis, Galium humifusum, G. mollugo, G. verum, Hypericum hyrsutum, H. perfoliatum, Inula britanica, I. conysa, I. germanica, Lactuca serriola, Lamium amplexicaule, L. purpureum, Lappula squarrosa, Lathyrus pratensis, Linaria vulgaris, Matricaria perforata, Melilotus albus, M. officinale, Melica uniflora, Medicago falcata, Origanum vulgare, Potentilla humifusa, Polygonum aviculare, Poa angustifolia, Ranunculus polyanthemos, Senecio vernalis, Sisymbrium altissimum, S. orientale, Silene noctiflora, Sonchus asper, Stachys germanica, Teucrium chamaedrys, Torilis arvensis, T. japonica, Tragopogon dubius, Trifolium hybridum, T. medium, Verbascum austriacum, V. phoeniceum, V. phlomoides, Veronica chamaedrys, V. serpyllifolia, Vicia tenuifolia, V. sylvestris.

Concluzii Din numărul total de cca 136 specii de plante ierboase invadatoare, instalate în tăietură, analiza biomorfelor

ne prezintă un indice de peste 50% pentru plantele anuale, în primii doi ani de la tăiere. Începând cu al treilea an, numărul speciilor anuale scade, dar se dublează, în schimb, numărul speciilor perene. Speciile bianuale rămân aproximativ la acelaşi procent. În privinţa modului de desiminare predomină speciile anemocore, chiar şi în al patrulea an de existenţă a parchetului.

Referinţe:

1. Cuza P. Impactul activităţilor silviculturale asupra stării actuale a fondului forestier din Republica Moldova. - În: Materialele Congresului II al Societăţii de Botanică din Republica Moldova „Biodiversitatea vegetală a republicii în preajma mileniului III”. - Chişinău, 1998, p.14-15.

2. Dihoru Gh. Flora ierboasă din parchetele de la Babadag (Regiunea Dobrogea). - Contr. Bot., Universitatea „Babeş-Bolyai” din Cluj, Grădina Botanică din Cluj, 1967, p.111-117.

3. Borza Al. Cercetări fitosociologice asupra pădurilor basarabene. - Cluj, 1937. 4. Попова Т.А., Шабанова Г.А. Первоначальные этапы сукцесионных смен в растительном покрове вырубок

дубовых лесов, Кодр. // Ученые записки Кишиневского Университета. - 1956. - 23. - С.149-162. 5. Николаева Л.П. Дубравы из пушистого дуба Молдавии. - Кишинев, 1963. - 167 с. 6. Postolache Gh. Vegetaţia Republicii Moldova. - Chişinău: Ştiinţa, 1995. - 340 p.



121

VARIABILITATEA GENETICĂ A UNOR CARACTERE CANTITATIVE LA TOMATE

Nadejda MIHNEA

Institutul de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM There are presented 14 hybrid combinations of tomatoes where gametophyte and sporophyte resisted to the high

temperature. Combinations Onix x Saladette and Nistru x Оnix have superdominant features on gametophyteas as well as on sporophyte. Кал. Дж. ТНМ х Saladette, Э90/7 x Kredo, Katerina x Дanna, Э90/7 х Costral have such features as high production and resistance to heat.

În ultimii ani a sporit interesul faţă de abordarea, din punct de vedere genetic, a unei dintre problemele de

bază ale agriculturii moderne – rezistenţa la factorii stresogeni a mediului. Determinismul genetic complex al caracterelor cantitative, inclusiv al rezistenţei la arşiţă, pune în dificultate reuşita activităţii de ameliorare, al cărei scop este crearea unor genotipuri în care să se îmbine mai multe caractere valoroase.

Întrucât modul de transmitere ereditară a caracterelor este determinat de constituţia genetică a formelor parentale, scopul prezentei lucrări este cercetarea moştenirii unor caractere cantitative la tomate în condiţii de stres abiotic.

Material şi metode În calitate de material de studiu au servit 14 populaţii hibride care au fost obţinute în urma hibridării

soiurilor de tomate de diferită origine geografică şi cu diferit grad de rezistenţă la arşiţă. Materialul analizat a fost supus acţiunii stresului în două faze: germinarea seminţelor şi înflorirea plantelor. Rezistenţa la arşiţă a formelor iniţiale şi a hibrizilor a fost evaluată atât în baza sporofitului, cât şi a gametofitului masculin.

Aprecierea genotipurilor de tomate conform rezistenţei la temperaturi înalte a gametofitului masculin s-a efectuat în baza elaborării metodice efectuate în Institutul de Genetică al AŞM [1]. Rezistenţa tomatelor la temperaturi ridicate pozitive a fost apreciată conform recomandărilor metodice ale Institutului de Fitotehnie din Rusia [2], care este bazată pe capacitatea de creştere a rădăcinilor embrionare după încălzirea lor la tempe-raturi ridicate de 42-43oC în decurs de 6 ore. Pentru stabilirea eredităţii caracterului rezistenţa la arşiţă în generaţia F1 s-a utilizat gradul de dominanţă după J.Briubeiker (1966): F1 – xp

1F xpHdHp xp

−=

− ,

în care: Hd – gradul de dominanţă; F1 – valoarea medie a caracterului la F1; xp – valoarea medie a caracterului la formele parentale, adică P1+ P2 / 2; Hp – valoarea cantitativă a acestui indice la cea mai bună formă parentală. Analiza statistică a fost efectuată după B.Dospehov [3]. Reprezentarea grafică, tabelară şi textuală a fost

efectuată prin intermediul programelor Microsoft Office şi Microsoft Excel. Rezultate şi discuţii În urma studierii genofondului bogat al tomatelor de cultură au fost identificaţi purtătorii de gene ai rezis-

tenţei la arşiţă care au fost implicaţi în hibridare şi, în baza lor, au fost obţinute generaţii hibride [4,5]. Datele obţinute referitor la reacţia populaţiilor hibride de tomate la temperaturi ridicate demonstrează că în

cadrul unor combinaţii hibride F1 s-au înregistrat valori ce determină o rezistenţă sporită a hibrizilor obţinuţi în comparaţie cu genitorii, iar la unele combinaţii valorile F1 au fost mai mici decât media părinţilor. Analiza date-lor obţinute folosind atât metoda de germinare a seminţelor la t +42-43oC, cât şi germinarea polenului la t +45oC demonstrează o variabilitate considerabilă a caracterului studiat (a se vedea Tabelul). Rezistenţa la arşiţă a sporofitului varia de la 23,6% până la 57,5%, iar a gametofitului masculin s-a încadrat în limitele 17,0...79,2%.



122

Testarea formelor hibride conform rezistenţei polenului la temperaturi ridicate a demonstrat că combinaţiile Оnix x Saladette, Viza x Sanmark, Э90/7 x Kredo, Nistru x Оnix posedă o rezistenţă sporită la acest caracter, care s-a încadrat în limitele 60,0...79,2%.

După gradul de rezistenţă la temperaturi ridicate a sporofitului s-au evidenţiat combinaţiile: Э90/7 х Gusar, Katerina x Дanna, Э90/7 х Costral, Viza x Sanmark, a căror rezistenţă a fost, corespunzător, de 52,6%, 52,2%, 53,6%, 46,4%.

Studierea combinaţiilor hibride în baza caracterului rezistenţei la arşită a gametofitului masculin a permis dea evidenţia 3 combinaţii hibride (Onix x Saladette, Nistru x Onix, Viza x Sanmark) ce posedă supradominanţă pozitivă, 6 – cu dominanţă intermediară, 3 – cu dominanţă pozitivă, o combinaţie – cu dominanţă negativă şi o combinaţie – cu supradominare negativă (a se vedea Tabelul).

Analiza rezistenţei sporofitului la temperaturi ridicate a înregistrat o rezistenţă pozitivă faţă de cel mai bun genitor la combinaţiile: Оnix х Saladette, Э90/7 х Gusar, Кал. Дж. ТНМ х Saladette, Э90/7 х Кredо, Katerina x Даnnа, Э90/7 х Соstral, Nistru х Saladettе. Un interes deosebit prezintă combinaţiile care dispun de o rezistenţă înaltă atât a gametofitului, cât şi a sporofitului. Astfel de combinaţii sunt Onix x Saladette şi Nistru x Onix.

Tabel Influenţa stresului de temperatură ridicată asupra genotipurilor de tomate

Rezistenţa, % Gametofit (+45oC) Sporofit (+43oC)

Nr. crt.

Combinaţii hibride

P1 P2 F1 Hd P1 P2 F2 Hd 1 Onix x Saladette 55,5 43,2 60,0 1,73 28,9 31,3 33,6 2,92 2 Katerina x Burnly Metro 48,8 19,0 28,5 -0,53 41,8 38,1 35,5 -2,31 3 Э90/7 x Gusar 79,3 43,6 43,5 -1,0 38,6 20,4 52,6 2,54 4 Narvic x Zastava 67,2 23,6 61,8 0,75 34,3 56,0 39,4 -0,53 5 Кал. Дж. ТНМ х Saladette 64,7 43,2 48,3 -0,53 28,1 31,3 42,7 8,12 6 Katerina x Zastava 48,8 23,6 31,9 -0,34 41,8 56,0 49,6 0,09 7 Nistru x Оnix 9,4 55,5 77,9 2,0 30,9 28,9 40,9 11,0 8 Э90/7 x Кredo 79,3 65,4 79,2 0,98 38,6 35,3 46,9 5,9 9 Viza x Burnly Metro 48,0 19,0 42,0 0,59 38,5 38,1 23,6 -73,5

10 Katerina x Дanna 48,8 37,2 41,0 -0,34 41,8 40,0 52,2 12,5 11 Katerina x Sanmark 48,8 42,1 17,0 -8,6 38,6 47,2 53,6 2,5 12 Э90/7 x Costral 79,3 15,7 39,8 -0,24 30,9 31,3 46,2 75,5 13 Nistru x Saladette 9,4 43,2 21,6 -0,28 38,5 64,0 46,4 -0,37 14 Viza x Sanmark 48,0 42,1 67,4 7,58 41,8 64,0 57,5 -0,4

Rezultatele aprecierii lungimii medii a rădăcinilor embrionare şi a lungimii tubului polenic sunt prezentate

în Figurile 1 şi 2.

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

lung

imea

tubu

lui p

olen

ic

1 3 5 7 9 11 13 15

genotipurile

forma maternăforma paternăcombinaţia hibridă

Fig.1. Influenţa temperaturilor ridicate asupra capacităţii de creştere

a tubului polenic la combinaţiile hibride F1.

, cm


123

0

1

2

3

4

5

6

lung

imea

rădăc

inilo

r em

brio

nare

,cm

.

1 3 5 7 9 11 13 15

genotipurile

forma maternăforma paternăcombinaţia hibridă

Fig.2. Influenţa temperaturilor ridicate asupra capacităţii de creştere

a rădăcinilor embrionare la combinaţiile hibride F2: 1 – Onix x Saladette; 2 – Katerina x Burnley Metro; 3 – Э90/7 x Gusar; 4 – Narvic x Zastava; 5 – Kal. Dж.THM x Saladette;

6 – Katerina x Zastava; 7 – Nistru x Onix; 8 – Э90/7 x Kredo; 9 – Viza x Burnley Metro; 10 – Katerina x Danna; 11 – Katerina x Sanmarк; 12 – Э90/7 x Costral; 13 –Nistru x Saladette; 14 – Viza x Sanmark.

Investigaţiile efectuate asupra combinaţiilor hibride au relevat o variabilitate considerabilă atât la formele

parentale, cât şi la combinaţiile hibride, care s-a încadrat, corespunzător, în limitele 2,2... 5,5 cm şi 2,4 ... 5,8 cm, 2,0 ...4,1 cm şi 1,6...4,6 cm.

Gradul de dominare pentru lungimea rădăcinilor embrionare şi lungimea tubului polenic indică dominarea caracterului de rezistenţă (supradominare) la 9 combinaţii din cele 14 studiate: Onix x Saladette, Katerina x Burnley Metro, Narvic x Zastava, Kal. Dж THM x Saladette, Nistru x Onix, Э90/7 x Kredo, Э90/7 x Costral, Nistru x Saladette, Viza x Sanmarc. Dominarea caracterului de sensibilitate a ambelor caractere a fost înregistrat la 3 combinaţii (Э90/7 x Gusar, Viza x Burnley Metro şi Katerina x Sanmark).

Una dintre direcţiile principale în ameliorare este crearea soiurilor cu productivitate înaltă. Potenţialul bio-logic de producţie la tomate are control poligenic, fiind într-o strânsă interacţiune cu mediul. Acest parametru complex la tomate este condiţionat în definitiv de ramificaţia tufei, numărul de ciorchine pe plantă, numărul de fructe pe tufă, masa fructului, precum şi de rezistenţa la factorii extremali ai mediului.

Producţiile obţinute la combinaţiile hibride au oscilat în limite mari (571,0...1093,5 q/ha), în dependenţă de formele parentale incluse în hibridare (Fig.3).

0

200

400

600

800

1000

1200

1 3 5 7 9 11 13

genotipurile

reco

lta g

ener

ală,

q/ha

forma maternă

forma paternăcombinaţiile hibride

Fig.3. Productivitatea combinaţiilor hibride F1 evaluate în zona centrală a Moldovei.

1 – Onix x Saladette; 2 – Katerina x Burnley Metro; 3 – Э90/7 x Gusar; 4 – Narvic x Zastava 5 – Kal.Dж.THM x Saladette; 6 – Katerina x Zastava; 7 – Nistru x Onix; 8 – Э90/7 x Kredo; 9 – Viza x Burnley Metro; 10 – Katerina x

Danna; 11 – Katerina x Sanmarк; 12 – Э90/7 x Costral; 13 – Nistru x Saladette; 14 –Viza x Sanmark.

Lu

ngim

ea ră

dăci

nilo

r em

brio

nare

, cm

R

ecol

ta g

ener

ală,

q/h

a



124

În procesul investigaţiilor a fost studiat gradul de dominare a productivităţii plantelor şi a masei medii a fructului. S-a stabilit că 8 din 12 combinaţii hibride prezintă efect de heterozis după productivitate şi doar la combinaţia Katerina x Burnly Metro s-a stabilit o supradominare negativă, iar la combinaţiile Э90/7 х Gusar şi Э90/7 х Кredo – o dominanţă intermediară. Manifestarea heterozisului după productivitate a fost mai pro-nunţată la combinaţiile Narvic x Zastava şi Katerina x Sanmark, atingând, repectiv, valorile de 53,6%, 21,85% faţă de forma maternă şi de 34,1%, 25,3% faţă de forma paternă. După masa medie a fructului o supradomunare pozitivă s-a înregistrat doar la 3 combinaţii hibride (Э90/7 x Gusar, Nistru x Onix şi Katerina x Sanmark). Dintre combinaţiile analizate prezintă interes acele care îmbină rezistenţa la arşiţă а gametofitului cu produc-tivitatea înaltă. Astfel de combinaţii sunt: Narvic x Zastava, Кал. Дж. ТНМ х Saladette, Э90/7 х Кredo, Katerina x Dannа.

Concluzii 1. Testarea combinaţiilor hibride conform metodelor de germinare a polenului şi a seminţelor a evidenţiat

două combinaţii cu supradominanţă pozitivă: Onix x Saladette şi Nistru x Onix. 2. S-a stabilit că la combinaţiile hibride Оnix х Saladette, Nistru x Оnix şi Viza x Sanmark rezistenţa la

arşiţă a gametofitului masculin a manifestat o supradominanţă faţă de cel mai bun genitor, ceea ce demonstrează o transgresie pozitivă pentru acest caracter.

3. Investigaţiile efectuate au demonstrat că manifestarea heterozisului după productivitate a fost mai pro-nunţată la combinaţiile Narvic x Zastava şi Katerina x Sanmark.

4. Pentru ameliorare prezintă interes combinaţiile Narvic x Zastava, Кал. Дж. ТНМ х Saladette, Э90/7 х Кredo şi Katerina x Dannа, care îmbină caracterul rezistenţei la arşiţă cu productivitatea înaltă.

Referinţe:

1. Kравченко A., Лях В., Toдераш Л., Солтанович T., Рожневская M., Духовный A. Meтоды гаметной селекции растений. - Кишинёв, 1990. - 47 с.

2. Ивакин A. Определение жаростойкости овощных культур по ростовой реакции проростков после прогревания их при высокой температуре (томаты). - Ленинград, 1979. - 9 с.

3. Доспехов Б. Методика полевого опыта. - Москва, 1970. - 415 с. 4. Grati M., Grati V., Mihnea N. Selecţia tomatelor după rezistenţa la arşiţă. - În: Fiziologia şi biochimia plantelor la

început de mileniu. Materialele Congresului II. Societatea de Fiziologie şi Biochimie vegetală din Republica Moldova. - Chişinău, 2002, p.303-307.

5. Молдовану Л., Грати М., Михня Н., Грати В. Селекция томатов на устойчивость к экстремальным темпера-турам. - B: Селекция и семеноводство овощных культур в ХХI веке. Maтериалы международной научно-практической конференции. - Москва, 2000, с.92-93.




125

EVALUAREA GRADULUI DE INFECŢIE LA UNELE GENOTIPURI DE

FLOAREA-SOARELUI (Helianthus annuus L.) LA INTERACŢIUNEA GAZDĂ-PARAZIT

(Orobanche cumana Wallr.)

Victoria POPESCU

Catedra Biologie Vegetală O. cumana is an important factor that significantly reduces the production of sunflower in the eastern part of the

Mediterranean region. The main purpose of the present work is to reveal the infection ability of this parasite in some genotypes of sunflower

cultivated in Moldova. It has been revealed that a population of broomrape, which had been received from Volgograd, had the most

advanced capability for infection in comparison with populations from Rostov and Moldova. Genotypes of the Xenia variety have shown the greatest resistance in comparison with the Valentino variety. The researchers have revealed the dependence of the infection ability from both genotype and the origin of parasites

Plantele parazitare din genului Orobanche pun în pericol producţia agricolă în multe regiuni ale lumii.

Cele mai periculoase specii de Orobanche sunt răspândite în regiunea Mării Mediteraneene şi în Asia de Vest, parazitând importante culturi [1]. O. aegyptica infectează legumele şi, în special, atacă genul Solanaceae (cartof, tutun, tomate, vânătă). O. cernua şi O. minor preferă să paraziteze cerealele şi plantele furajere. Deşi Orobanche sp. sunt destul de răspândite, pierderi semnificative ale recoltei se observă doar în sudul şi estul Europei, nordul Africii şi în vestul Asiei. În regiunea Mării Mediteraneene şi în vestul Asiei aproximativ 16 mln. ha de pământ arabil sunt ameninţate de paraziţii acestui gen, ceea ce reprezintă aproximativ 1,2% din suprafaţa terenurilor arabile de pe glob.

Floarea-soarelui este des infectată de O. cumana (lupoaia), parazit angiosperm, lipsit de clorofilă, care depinde în totalitate de planta-gazdă, utilizând apa, substanţele minerale şi organice ale acesteia. Absorbţia acestor substanţe poate duce la pierderi importante ale recoltei. Infecţia severă cu O. cumana reduce nu numai producţia de seminţe, dar şi conţinutul de ulei [2].

O. cumana dăunează puternic producţia de floarea-soarelui din bazinul mediteranean şi Europa de Est, la fel din China [3], care dă jumătate din producţia globală de seminţe de floarea-soarelui [4].

Până în prezent au fost studiate şi implementate diverse metode de control al lupoaiei, inclusiv mecanice, biologice şi chimice. Actualmente, însă, rezistenţa genetică se consideră cea mai efectivă, realizabilă, econo-mică metodă şi o soluţie ecologică. Totuşi, utilizarea formelor rezistente este urmată de apariţia de noi rase, mai virulente, care înving sursele existente de rezistenţă [5]. Selecţia formelor rezistente de floarea-soarelui a fost şi rămâne o preocupare de bază a cercetătorilor.

Scopul prezentei lucrări constă în evaluarea gradului de infecţie a acestui parazit la unele genotipuri de floarea-soarelui cultivate pe teritoriul Republicii Moldova.

Material şi metode

Caracteristica obiectului de studiu. Drept obiect de studiu au servit seminţele a doi hibrizi de floarea-soarelui (Valentino şi Xenia) şi liniile lor parentale oferite de către AŞP „Magroselect” SRL (or.Soroca).

Familiile de floarea-soarelui au fost infectate cu trei populaţii de lupoaie din diferite regiuni geografice: Moldova, Rostov şi Volgograd.

Condiţiile de cultivare in vivo. Plantele au fost crescute în vase de vegetaţie în care s-a introdus mixtura de sol (nisip: turba în raport de 1:1) uniform infectată cu seminţe de lupoaie (la 1 kg de amestec 0,8 g de seminţe). Vasele au fost expuse în camera de cultivare, la temperatura de 23-25°C, fotoperiodicitatea de 14-16 ore, umiditatea de 60%.

Materialul a fost colectat şi analizat după 8-9 săptămâni de la semănat. Rădăcinile plantelor de floarea-soarelui au fost spălate cu apă şi analizate la binocular MBS-9. Ataşamentele parazitului de pe rădăcinile plantei-gazde au fost numărate şi clasificate.



126


În urma investigaţiilor efectuate s-a remarcat că nici unul dintre genotipurile studiate nu a manifestat o imunitate totală la atacul parazitului, la toate genotipurile s-au depistat cel puţin câteva ataşamente de lupoaie.

Prima populaţie de lupoaie care a apărut la suprafaţa solului, la 5 săptămâni de la semănare, a fost populaţia din Volgograd atestată la hibrizii Valentino şi Xenia; după 6 săptămâni a răsărit lupoaia din Rostov ( Xenia ), iar la a 7-a săptămână – populaţia din Moldova (Valentino ).

Analizând detaliat rădăcinile de floarea-soarelui, s-au evidenţiat diferite stadii de dezvoltare a lupoaiei (Foto): ataşamente, tuberculi, lăstari subterani şi lăstari aerieni, al căror număr este indicat în Tabel.

Foto. Diferite stadii de dezvoltare a Orobanche cumana Wallr.: A şi B – faza de lăstari aerieni, C – tubercul, D – lăstari subterani.

De regulă, ataşamentele, tuberculii şi lăstarii au o coloraţie galbenă pală, datorită lipsei de clorofilă, dar printre acestea au fost observaţi paraziţi de culoare brună-roşietică. Lupoaia necrotizată are un haustoriu roşu-brun indicând prezenţa compuşilor fenolici în organ. Aşa fenomen a fost descris la interacţiunea dintre Vicia sp. şi O. aegyptica [6] şi dintre floarea-soarelui şi O. cumana [7]. Acumularea acestor compuşi (flavonoide) ca mecanism de rezistenţă duce la dereglarea transportului direct al auxinelor [8], schimbând echilibrul hor-monal al parazitului şi provocând astfel necrotizarea.

Necrotizarea parazitului la populaţia din Volgograd nu s-a observat (0%), în schimb la populaţia din Rostov ea este prezentă într-un număr destul de mare (19,4%) comparativ cu populaţia din Moldova (8,3%).

Rezistenţa ar putea fi caracterizată printr-un număr scăzut de ataşamente sau printr-un număr mare de necroze ale parazitului. Unele necroze apar după 6 săptămâni [9], fapt ce se explică printr-o strânsă competiţie între populaţia parazitului. Aceasta este în concordanţă cu ipoteza lui Hibberd şi colab. (1998), care postulează că fiecare gazdă are o cantitate limitată de asimilate disponibile şi cum numărul de paraziţi creşte, competiţia pentru asimilate micşorează dimensiunile lor individuale [10].

Generalizând datele obţinute, constatăm că cel mai înalt grad de infecţie se atestă la acţiunea populaţiei din Volgograd, după care urmează populaţia din Rostov şi, în cele din urmă, cea din Moldova.

Genotipurile familiei Xenia infectată cu populaţia din Moldova este mai rezistenţă decât familia Valentino, fapt demonstrat de numărul mic de paraziţi (a se vedea Tabelul). Acelaşi genotip a manifestat o rezistenţă sporită la atacul lupoaiei din Volgograd şi Rostov, comparativ cu genotipurile Valentino.

A B

C D



127

Tabel Numărul de ataşamente pe rădăcinile genotipurilor de floarea-soarelui

Orobanche cumana Moldova

Orobanche cumana Rostov

Orobanche cumana Volgograd

Genotipul

Nr.

tube

rcul

elor

Nr.

lăst

arilo

r su

bter

ani

Nr.

lăst

arilo

r ae

rieni

∑ Nr.

tube

rcul

elor

Nr.

lăst

arilo

r su

bter

ani

Nr.

lăst

arilo

r ae

rieni

∑ Nr.

tube

rcul

elor

Nr.

lăst

arilo

r su

bter

ani

Nr.

lăst

arilo

r ae

rieni

∑

Xenia 2 - - 2 11(1n) 1 1 13 1 3 3 7 Xenia 2 (1n) 1 2 5 1n 1n - 2 4 1 1 6 Xenia F1 2 - - 2 2 3(1n) 1 6 3 3 6 12

Valentino 1 1 1 3 2 2(1n) - 4 8 3 4 15 Valentino 4 1n 1 6 12(3n) 1 2 15 9 2 8 19 Valentino F1 5 1 - 6 17(3n) 8(3n) 7 32 9 2 7 18

∑ 16(1n) 4(1n) 4 24 45(8n) 16(6n) 11 72 34 14 29 77

n – Oronanche cumana necrotizată Linia maternă a hibridului Valentino este mai rezistentă decât linia paternă, ceea ce se observă la toate

populaţiile cercetate, în special la populaţia din Moldova. În cadrul populaţiei autohtone şi din Volgograd, hibridul Valentino a fost la nivelul rezistenţei a unuia din

părinţi, şi anume: forma paternă. Analizând manifestările gradului de infecţie la formele parentale şi hibrid, constatăm o dependenţă de

genotip, precum şi de originea populaţiei, şi anume: în unele cazuri, hibridul se manifestă ca şi linia paternă (ex., Valentino populaţia din Volgograd, Valentino populaţia din Moldova). În cel de-al doilea caz, hibridul fie depăşeşte ambele forme parentale (Valentino populaţia din Rostov, Xenia populaţia din Volgograd), fie este mult mai inferior acestora (Xenia populaţia din Moldova). În al treilea caz, hibridul are o manifestare intermediară formelor parentale (Xenia populaţia din Rostov, Fig.1).

Populaţia de O. cumana din Moldova Populaţia de O. cumana din Rostov

0

1

2

3

4

5

6

Nr.

de O

. cum

ana

X X X F1 V V V F1

Nr. total Nr. lăstari aerieni

0

5

10

15

20

25

30

35

Nr.

de O

. cum

ana

X X X F1 V V V F1


Populaţia de O. cumana din Volgograd

02468

101214161820

Nr.

de O

. cum

ana

X X X F1 V V V F1


Fig.1. Numărul de Orobanche cumana la genotipurile de floarea-soarelui infectate

cu diferite populaţii de lupoaie (X – familia Xenia, V – familia Valentino).



128

În baza cercetărilor efectuate putem conchide: 1. Populaţia de lupoaie din Volgograd a avut cel mai înalt grad de infecţie comparativ cu populaţiile din

Rostov şi Moldova. 2. S-a constat că genotipurile familiei Xenia au manifestat un gard de rezistenţă mai înalt în comparaţie

cu familia Valentino la toate cele trei populaţii de lupoaie cercetate (din Moldova, Rostov şi din Volgograd). 3. Cercetările efectuate au pus în evidenţă dependenţa gradului de infecţie de genotip, precum şi de originea

parazitului. S-a constatat că hibridul se manifestă fie ca una dintre liniile parentale sau ca intermediar al acestor forme.

Referinţe:

1. Sauerborn J. Parasitic flowering plants in agricultural ecosystems of West Asia. // Flora Veg. Mundi. - 1991. - Vol.9. - P.83-93.

2. Szoko G. Investigations on the effect of O. cumana on sunflower. // Acta Phytopathol. Acad. Sci. Hung. - 1973. - Vol.8. - P.375-380.

3. Parker C. The present state of the Orobanche problem. - In: Proceedings of the 3rd International Workshop on Orobanchecs and related Striga research. Res. Pieterse A.H., Verkleij J.A.C., Ter Borg S.J. - Amsterdam, The Netherlands: Royal Tropical Institute, 1994, p.17-26.

4. FAO. FAO Production Yearbook 1998, Rome, Italy. - 1999. - Vol.52. 5. Dominguez J. Inheritance od the resistance to Orobanche cumna Wallr. in sunflower. - In: Junta de Andalucia,

Consejeria de Agricultura y Pesca, eds. Resistance to Orobanche: the state of the art, congresos y jornadas. - 1999. - Vol.51. - P.115-120.

6. Goldwasser Y., Hershenhorn J., Plakine D., Kleifeld Y., Rubin B. Biochemical factors involved in vetch resistance to Orobanche aegyptica // Physiological and Molecular Plant Patology. - 1999. - Vol.54. - P.87-96.

7. Dorr I., Staack A., Kollmann R. Resistance to Helianthus to Orobanche – histological and cytological studies. - In: Pieterse A.H., Verkleij J.A.C., Ter Borg S.J., eds. Biology and management of Orobanche. Proceedings of the third International Workshop on Orobanche and related Striga research. - Amsterdam, The Netherlands: Royal Tropical Institute, 1994. p.276-289.

8. Jacobs M., Rubery P.H. Naturally occurring auxin transort regulators // Science. - 1988. - Vol.241. - P.346-349. 9. Labrousse P., Arnaud M.C., Serieys H., Berville A., Thalouarn P. Several mechanisms are involved in resistance of

Helianthus to Orobanche cumana Wallr. // Annals of Botany. - 2001. - Vol.88. - P.859-868. 10. Hibberd J.M., Quick W.P., Press M.C., Scholes J.D. Can source-sink relation explain responses of tobacco to infection

by the root prasitic angiosperm Orobanche cernua // Plant, Cell and environment. - 1998. - Vol.21. - P.333-340.

Notă: Lucrarea a fost efectuată în cadrul Proiectului instituţional 06.407.026F finanţat de CSŞDT al AŞM.




129

PARTICULARITĂŢI DE INTERACŢIUNE TOMATE X FUSARIUM OXYSPORUM

VAR. ORTHOCERAS ÎN DIFERITE CONDIŢII TERMICE

Ludmila ROTARU

Institutul de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM In the papers are presented the data about the interactions of tomatoes genotypes with the isolates of Fusarium

oxysporum var.orthoceras fungus – one of the most pathogenetic species of Fusarium genus, which canses the root rot and plant withering. In laboratory conditions was established that the tomatoes genotypes have different reactions to the fungus isolates in dependence of quantitative indices and temperature conditions and this fact is necesary to apreciate for the elaboration of test systems with the aim to create resistent forms to fusariose.

În condiţiile Republicii Moldova, ciupercile Fusarium spp. sunt agenţi activi ai bolilor de rădăcină la tomate,

manifestate prin necroze, ulceraţii, deformări, ofiliri, reprimări sau stimulări excesive ale creşterii. Fitopatosistemele au apărut pe parcursul evoluţiei ca rezultat al integrării treptate a două sau a câtorva

organisme independente într-un sistem integrat comun [1]. Apariţia complexelor patologice este firească, determinată de evoluţiile comune ale plantei şi patogenului şi acest punct de vedere se reflectă în cel mai direct mod asupra strategiei lucrărilor de ameliorare. Obiectivele de bază urmează a fi axate nu pe obţinerea genotipurilor imune, ci pe a celor cu rezistenţă suficientă pentru a asigura realizarea potenţialului biologic al plantei şi care nu ar prezenta surse de acumulare a infecţiei.

În elaborarea unei strategii de management şi control al bolilor, de rând cu un şir de cunoştinţe importante, precum ar fi diversitatea genetică, structura populaţiilor, virulenţa, rasele, relaţiile biogeografice, de mare actualitate se prezintă elucidarea particularităţilor de specificitate a gazdei în reacţia la patogeni [2-5], întrucât recunoaşterea acestora reprezintă un eveniment crucial în apărarea activă a plantei [6].

Este cunoscut faptul că factorii abiotici, în special temperatura, joacă un rol important în reglarea echilib-rului plantă x patogen. În legătură cu aceasta, scopul prezentei lucrări constă în elucidarea specificităţii de interacţiune a genotipurilor de tomate cu una dintre cele mai virulente specii Fusarium – ciuperca F. oxysporum var. orthoceras, în condiţii termice optime şi stresante, la etăpa iniţială a ontogenezei plantelor.

Material şi metode Genotipuri. A fost utilizat material semincier ce prezintă soiurile Mihaela, Merişor, precum şi liniile L 120,

L 121, L 122 – genotipuri cu rezistenţă pronunţată la temperatură joasă şi cu indici înalţi de producţie şi calitate, obţinute şi oferite cu amabilitate de către dr. biol. Nadejda Mihnea şi dr. biol. Maria Grati.

Inoculul. Pentru aprecierea rezistenţei/sensibilităţii plantelor la putrezirea seminţelor şi rădăcinii s-au utilizat filtratele de cultură a 6 tulpini F. oxysporum var. orthoceras, din colecţia Laboratorului Imunogenetică Vegetală, izolate din rădăcini bolnave de tomate. Filtratele de cultură (FC) au fost preparate prin cultivarea miceliului pe mediul lichid Cszapek, timp de 21 zile, la temperatura 22-23°C. Seminţele de tomate au fost tratate cu filtrate de cultură şi apă distilată (martor) timp de 18 ore.

Condiţiile. Experienţa s-a efectuat conform schemei de analiză bifactorială a varianţei, în 3 repetiţii. Seminţele s-au plasat timp de 6 zile în camere umede, sterile (vase Petri cu hârtie de filtru imectată cu apă distilată). O variantă a experienţei s-a realizat prin menţinerea permanentă a seminţelor/plăntuţelor la temperatura optimă 24°C (I), iar altă variantă – prin alternarea regimurilor de temperatură optimă/stresantă (10°C): 24°C – 2, 10°C – 2, 24°C – 2 zile (II). Datele obţinute au fost prelucrate statistic cu pachetul de soft STATISTICA (SUA).

Rezultate şi discuţii După cum rezultă din datele prezentate (Fig.1,2), filtratele de cultură utilizate FC1...FC6 au acţionat în

mod diferit asupra germinaţiei seminţelor şi creşterii rădăciniţei, în raport cu genotipul plantei, izolata ciupercii şi condiţiile de temperatură. De exemplu, germinaţia seminţelor la I, sub acţiunea FC1, FC2, FC3, FC4, FC5, FC6, la soiul Mihaela a înregistrat valori de 0,0; -12,0; -13,8; -3,3; -11,7 şi -4,9%, iar la linia L 122: +8,9; +24,6; +8,1; +16,8; +0,6 şi +21,2%, respectiv, în raport cu martorul. În cazul regimului termic II,



130

sub acţiunea FC1, FC2, FC3, FC4, FC5, FC6, la soiul Mihaela germinaţia a prezentat valori de +1,6; -3,4; -5,0; -1,7; -88,4 şi -78,4%, iar la linia L 122 valori de -10,0; -11,7; -13,3; -13,3; -25,0, -1,7%, respectiv, în raport cu martorul. În ceea ce priveşte lungimea rădăciniţei, s-a constatat că la I, sub acţiunea FC1, FC2, FC3, FC4, FC5, FC6, soiul Mihaela a înregistrat valori de +19,1; +9,0; +23,8; +31,8; +11,8; +4,3%, iar linia L 122 valori de +31,3; +17,4; +26,4; +26,9; +34,5; +12,5%, respectiv, în raport cu martorul. La II, sub acţiunea FC1, FC2, FC3, FC4, FC5, FC6, soiul Mihaela a prezentat valori de -26,9; -7,0; -19,9; +9,9; -47,4; -42,1%, iar linia L 122 valori de -10,0; -11,7; -13,3; -13,3; -25,0; -1,7%, respectiv, în raport cu martorul.

La mod general, s-a relevat că la I germinaţia seminţelor, cu excepţia L 122 (care a prezentat stimulări semnificative: +8,1... +24,6%), a diminuat, nivelul acesteia fiind diferit la genotipurile cercetate. Seminţele supravieţuite au produs plante care au prezentat reacţii sinergice cu FC, manifestate prin stimularea creşterii rădăciniţei. La alternarea regimurilor termice (II), aproape în toate cazurile s-au atestat reprimări puternice ale germinaţiei, cazurile de stimulare fiind cu frecvenţă redusă şi nesemnificativă. Mai pronunţată s-a dovedit a fi şi reprimarea creşterii rădăciniţei. Sub acţiunea temperaturii joase, creşterea rădăciniţei aproape în toate cazurile a diminuat, în special în cazul tulpinii 5 (FC5).

În raport cu I, la II germinaţia seminţelor de genotipuri Mihaela, Merişor, L 120, L 121, L 122 a fost de -3,3; -5,2; 0,0; -3,3; +19,6, respectiv, iar lungimea rădăciniţei – de -63,3; -62,0; -52,6; -44,1; -60,9%. Deci, linia L 121 s-a dovedit mai puţin sensibilă la stresul termic, comparativ cu celelalte genotipuri.

% %

±Std. Dev.±Std. Err.Mean

50

60

70

80

90

100

110

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35


-10

10

30

50

70

90

110

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35

A B

Fig.1. Influenţa FC F. oxysporum var. orthoceras asupra germinaţiei seminţelor de tomate în condiţii termice optime (A) şi stresante (B):

1...7 – Mihaela; 8...14 – Merişor; 15...21 – L 120; 22...28 – L 121; 29...35 – L 122. 1, 8, 15, 22, 29 – H2O; 2, 9, 16, 23, 30 – FC1; 3, 10, 17, 24, 31 – FC2; 4, 11, 18, 25, 32 – FC3; 5, 12, 19, 26, 33 – FC4; 6, 13, 20, 27, 34 – FC5; 7, 14, 21, 28, 35 – FC6.

Mm Mm


10

20

30

40

50

60

70

80

90

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35


0

6

12

18

24

30

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

3132

3334

35

A B

Fig.2. Influenţa FC F. oxysporum var. orthoceras asupra creşterii rădăciniţei de tomate în condiţii termice optime (A) şi stresante (B):

1...7 – Mihaela; 8...14 – Merişor; 15...21 – L 120; 22...28 – L 121; 29...35 – L 122. 1, 8, 15, 22, 29 – H2O; 2, 9, 16, 23, 30 – FC1; 3, 10, 17, 24, 31 – FC2; 4, 11, 18, 25, 32 – FC3; 5, 12, 19, 26, 33 – FC4; 6, 13, 20, 27, 34 – FC5; 7, 14, 21, 28, 35 – FC6.



131

Prin analiză bifactorială a varianţei a fost apreciată contribuţia diferitelor surse de variaţie – a genotipului de tomate, izolatei F. oxysporum var. orthoceras şi a interacţiunii acestora în formarea fitopatosistemului, drept criterii de evaluare servind parametrii aflaţi în studiu: germinaţia şi lungimea rădăciniţei (Tab.1,2).

Tabelul 1

Analiza bifactorială a relaţiilor tomate x F. oxysporum var. orthoceras la regim termic optim

Sursa de variaţie Grade de libertate

Suma medie a pătratelor

Contribuţia procentuală a sursei de variaţie

Germinaţia Genotip 4* 617,52* 33,04 Izolată 5* 1030,19* 55,12 Interacţiuni genotip x izolată 20* 221,26* 11,84 Lungimea rădăciniţei Genotip 4* 4444,58* 67,03 Izolată 5* 1704,86* 25,71 Interacţiuni genotip x izolată 20 481,80 7,27

* - suport statistic al testului F

Tabelul 2

Analiza bifactorială a relaţiilor tomate x F. oxysporum var. orthoceras la regim termic stresant

Sursa de variaţie Grade de libertate

Suma medie a pătratelor

Contribuţia procentuală a sursei de variaţie

Germinaţia Genotip 4* 1375,28* 26,15 Izolată 5* 2786,67* 52,98 Interacţiuni genotip x izolată 20* 1097,78* 20,87 Lungimea rădăciniţei Genotip 4* 2007,43* 78,48 Izolată 5* 339,63* 13,28 Interacţiuni genotip x izolată 20* 210,84* 8,24

* - suport statistic al testului F S-a stabilit că în ambele condiţii de temperatură, la etapa de germinaţie ponderea mai mare în sursa de

variaţie a revenit izolatei (52,98...55,12%), iar la etapa formării rădăciniţei – genotipului-gazdă (67,03...78.48%). Deci, în urma acţiunii FC (izolatelor) ca factor selectiv, la etapa de germinaţie, rolul genotipului plantei s-a manifestat cu înalt grad de expresie la etapa creşterii rădăciniţei, deşi, după cum rezultă din analiza anterioară – cu orientare diferită în condiţii termice diferite – de stimulare şi reprimare diferenţiată, respectiv, pentru I şi II. De remarcat că, în comparaţie cu I, în cazul II s-a mărit de ~2 ori nivelul interacţiunilor genotip x izolată la etapa germinării seminţelor.

După cum se ştie, unul dintre indicii rezistenţei/sensibilităţii plantelor la stresuri biotice şi abiotice este modul de repartiţie a plantelor în populaţie [7]. Cercetând însuşirile de bază ale histogramelor – modalitatea, aplatizarea, înclinarea (dreapta/stânga), se observă că acestea se deosebesc mult, funcţie de izolată şi regimul termic. De exemplu, soiul Mihaela, la temperatura 24ºC, a prezentat rezistenţă relativă pentru izolata 2, 3, 5 şi 6, iar la alternarea temperaturilor 24º/10º/24ºC – pentru izolatele 3 şi 5. În celelalte cazuri s-au atestat abateri de la distribuţia normală, marcate de dizruperi ale continuităţii claselor, histograme bimodale (2 B), aplatizări care denotă mărirea puternică a variabilităţii plantelor după parametrul cercetat (lungimea rădăciniţei).



132

Num.

1 2 3 4 5 6 7

A

1 2 3 4 5 6 7

B Fig.3. Repartţia plantelor în clase fenotipice sub acţiunea izolatelor F. oxysporum var. orthoceras

şi factorului termic (soiul Mihaela):

1 – martor (H2O), 2 – FC1, 3 – FC2, 4 – FC3, 5 – FC4, 6 – FC5, 7 – FC6; A – temperatura 24ºC, B – alternanţă de temperatură 24º/10º/24ºC

Deci, apariţia a 2 sau a mai multor maximuri, aplatizărilor, dizruperilor în histogramele de distribuţie a

plantelor poate servi în calitate de marcher fenotipic al stresului în reacţia tomatelor la tulpinile de Fusarium şi la temperatură joasă, ceea ce poate fi utilizat în scopuri teoretice şi practice.

Concluzii Interacţiunile tomate x F. oxysporum var. orthoceras sunt specifice în faza de plantulă, funcţie de parametrul

de evaluare şi condiţiile de temperatură, fapt ce trebuie luat în consideraţie la elaborarea metodologiei de testare a rezistenţei la putrezirea fuzariană a rădăcinilor.

În fitopatosistemul tomate x F. oxysporum var. orthoceras procesul de germinare a seminţelor este cont-rolat în mare măsură de patogen: 55,12 şi 52,98%, deşi nu este neglijabil factorul genotipic: 33,04 şi 26,15%, respectiv, pentru condiţiile termice: 24°C şi 24°...10°...24°C. Formarea şi creşterea rădăciniţei este controlată, în mod special, de genotip: 67,03 şi 78,48%, respectiv, pentru condiţiile termice optime şi stresante.

Apariţia abaterilor de la distribuţia normală a plantelor în populaţie, sub acţiunea izolatelor F. oxysporum var. orthoceras şi/sau temperaturii nefavorabile, prezintă marcheri fenotipici ai stresului biotic şi/sau abiotic şi, totodată, pune în evidenţă izolatele virulente care pot fi utilizate în calitate de factori de selecţie pentru crearea genotipurilor rezistente de tomate.

Pentru includerea în programele de ameliorare se recomandă linia L 121, genotip care a prezentat valori înalte pentru nivelul de germinare şi creştere a rădăciniţei în condiţii stresante complexe – biotice şi abiotice.

Referinţe:

1. Хахина Л.Н. Проблема симбиогенеза: Историко-критический очерк. - Ленинград: Наука, 1979. - 154 с. 2. Bao J., Fravel D.R., Lazarovits G., Chellemi D., van Berkum, P., and O’ Neill N. Biocontrol genotypes of

Fusarium oxysporum from tomato field in Florida // Phytoparasitica. - 2004. - No32. - Р.9-20. 3. Research Project: Molecular Genetics and Host-Parasite Interactions of Fungal pathogens of Forage Legumes and

Grasses, 2004, Annual Report//http://www.ars.usda.gov/research/projects/projects.htm 4. Лупашку Г.А., Сашко Е.Ф., Гавзер С.И. Взаимодействие генотипов пшеницы с фузариотоксином // Доклады

Росcийской Академии с.-х. наук. - 2006. - 6. - С.11-13. 5. Серова З.Я., Спиридонова Г.И. Метаболизм нуклеиновых кислот у растений в связи с грибной инфекцией. -

Минск: Наука и техника, 1986. - 224 с. 6. Storti E., Latil C., Salti S., Bettini P., Bogani P., Pellegrini M.G., Simeti C., Molnar A., Buiatti M. The in vitro

physiological phenotype of tomato resistance to Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici // Theoretical and Applied Genetics. - 1992. - Vol.84. - No1-2. - P.123-128.

7. Amzallag J.-M. Critical period as fundamental events in life // Theory in Bioscience. - 2004. - Vol.123. - P.17-32.




133

PURIFICAREA ŞI CARACTERIZAREA PARŢIALĂ A PROTEINAZEI A

DIN SEMINŢELE GERMINATE DE FASOLE

Vitalie I. ROTARI

LCŞ „Biochimia Plantelor” Proteinase A, that possibly participate in the degradation of phaseolin, the main 7S storage protein of kidney bean

(Phaseolus vulgaris L.), was isolated as a 35-kDa polypeptide from germinating kidney bean seeds and partially charac-terised. According to its properties it belong to a group of homologous cysteine proteinases of the papain family that participate in storage protein mobilisation during seeds geminating of many plants. The proteinases of this group hydrolize storage proteins to short peptides. Dispite close similarity to proteinase A from vetch, proteinase A from kidney bean hydrolyse phaseolin by non-co-operative mechanism. This action is limited to the cleavage of subunits into two approxi-mately equal parts and to spliting off a number of short peptides which result in the modification of quaternary structure of phaseolin molecule. It is similar to the action on phaseolin of other proteases, both endogenous and exogenous, and provide another example of the importance of phaseolin structure in the explanation of its resistance to proteolysis.

La germinarea seminţelor proteinele de rezervă (PR) sunt hidrolizate până la aminoacizi, care servesc

drept precursori pentru biosinteza noilor proteine, precum şi a altor compuşi ce conţin nitrogen, ale plantulei. Proteinazele cisteinice sunt principalele proteinaze implicate în acest proces [6,10,18]. Într-o schemă ipotetică propusă pentru explicarea scindării PR în decursul germinării seminţelor plantelor legumenoase rolul prin-cipal în mobilizarea PR a fost atribuit proteinazelor A şi B, sintetizate de novo la germinare [18]. A fost presupus că proteinaza A iniţiază degradarea PR prin modificarea lor limitată (proteoliza limitată), făcându-le astfel susceptibile atacului altor proteinaze. Odată modificate, PR sunt scindate co-operativ atât de protei-naza A, cât şi de proteinaza B, de alte endo- şi exopeptidaze. S-a presupus că proteinaza B, care este de tip legumainic, nu acţionează asupra PR native (nemodificate), aşa ca vicilina şi legumina. În conformitate cu această ipoteză, proteinazei A îi revine rolul central în controlul iniţierii degradării PR.

Investigarea proteinazelor din seminţele de fasole şi a rolului lor în degradarea fazeolinei, globulinei vici-linice 7S, care este proteină de rezervă majoră din această plantă, a arătat că în fasole această schemă nu se reproduce. Numai hidroliza limitată are loc la acţiunea atât a proteinazei CPPh [14], cât şi a legumainei [17].

Fazeolina, spre deosebire de alte PR, este stabilă la acţiunea proteinazelor endogene [3,14] şi exogene [7,12]. Hidroliza ei se termină după scindarea unei cantităţi neînsemnate de peptide. Elucidarea cauzelor acestui com-portament neobişnuit al fazeolinei prezintă un deosebit inters teoretic şi practic.

Între timp, au fost detectate alte proteinaze cisteinice de tip papinic în seminţele încolţite de măzăriche [5,11] ale căror relaţii cu alte proteinaze şi rolul lor la germinarea seminţelor nu sunt clare. Rezultate asemănătoare au fost obţinute şi pentru alte plante [6]. Informaţia despre aceste proteinaze este fragmentară şi nu există nici o plantă pentru care să fie caracterizate toate proteinazele.

În această ordine de idei, cercetarea (purificarea şi caracterizarea) proteinazei A din fasole, precum şi a altor proteinaze ce participă la mobilizarea PR, prezintă un interes deosebit în vederea clarificării funcţiilor ei (lor) în acest proces.

Material şi metode Material. Fazeolina a fost izolată din seminţele de fasole după metoda lui Schlesier şi al. [16]. Vicilina

din măzăriche a fost izolată după cum a fost descris anterior în [14]. Proteinaza CPPh din fasole şi proteinaza A din măzăriche au fost purificate după cum a fost descris anterior

de Rotari şi al. [14] şi de Becker şi al. [2]. DEAE-sefaroza şi CM-sefaroza, pentru cromatografia pe schimbători de ioni, au fost procurate de la

Pharmacia (Uppsala, Suedia). Determinarea activităţii proteolitice s-a efectuat după metoda TNBS (acidul 2,4,6-trinitrobenzosulfonic),

după cum a fost descris anterior în [14]. Proteoliza fazeolinei. Fazeolina (2%) în soluţie-tampon 120 mM fosfat-citrat, care conţinea 180 mM NaCl,

pH 4,6, a fost amestecată cu un volum egal de proteinază A (100 mU ml-1) în soluţie-tampon 200 mM fosfat



134

de sodium, pH 6,5. Ambele soluţii-tampon conţineau 2 mM DTT, 500 µM EDTA şi 0,02% NaN3. Reacţia a fost incubată timp de 42 ore la 30oC, luându-se probe la anumite intervale de timp.

Electroforeza în gel de poliacrilamidă (GPAA). Electroforeza în prezenţa dodecil-sulfatului de sodium (SDS) (SDS-elctroforeză) a fost efectuată în GPAA de 12,5% conform metodei Laemmli [8]. Fosforilaza b (94 kDa), albumina serului bovin (67 kDa), ovalbumina (43 kDa), anhidraza carbonică (30 kDa), inhibitorul Kunitz al tripsinei din soia (20,1 kDa) şi α-lactoglobulina (14,4 kDa) au fost folosite ca standarde pentru determinarea masei moleculare (Mr). Gelurile au fost colorate cu Coomassie brilliant blue G-250 conform procedurii standard.

Electroforeza în condiţii native în gradientul GPAA a fost efectuată într-un gradient vertical (4-30%) al GPAA folosind sistema de soluţie-tampon 90 mM Tris-borat, pH 8,4. Electroforeza a durat 4500 Vh. Feritina (440 kDa), catalaza (232 kDa) şi albumina serului bovin (67 kDa) au fost folosite ca standarde pentru deter-minarea Mr. Procentul proteinei reziduale a fost calculat din descreşterea Mr. Gelurile au fost colorate cu Coomassie brilliant blue R-250 conform procedurii standard.

Analiza western bloting. Benzile proteice au fost transferate din GPAA pe membrane PVDF prin methoda electroblot. Analiza western bloting a fost efectuată după metoda standard [15].

Anticorpii împotriva proteinazei A din măzăriche au fost preparaţi în felul următor. Aproximativ 1 mg de proteinază A [2] a fost purificată prin SDS-electoforeză. După care gelurile au fost colorate puţin, banda proteinazei A tăiată şi proteina eluată din gel prin electroeluare. Antisera a fost obţinută în iepuri prin injec-tarea intradermală a proteinazei A emulsificate cu un volum egal de adjuvant complet al lui Freund, după cum e descris de Sambrook şi al. [15].

Secvenarea amino-terminală. Proteinaza A din fasole, precum şi fragmentele formate în urma proteolizei fazeolinei, au fost separate prin SDS-electroforeză, transferate pe memrane PVDF şi secvenate cu ajutorul secvenatorului LF3400 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA) [17].

Purificarea proteinazei A din seminţele germinate de fasole. Seminţele de fasole au fost muiate în apă distilată timp de 2 ore şi germinate la întuneric pe hârtie umedă la 25oC. Cotiledoanele au fost detaşate la a şasea zi de germinare şi liofilizate. Cotiledoanele liofilizate (30 g) au fost măcinate şi extrase cu 300 ml H2O care conţinea 4 mM DTT. pH-ul extractului a fost adus la 4,0 şi precipitatul înlăturat. Supernatantul primit a fost introdus într-o coloană de CM-sefaroză (14,0x2,6 cm) echilibrată cu soluţie-tampon 10 mM acetat de sodium, pH 4,0. Enzima a fost eluată în aceeaşi soluţie-tampon, numai că avea un pH 4,9. Fracţiile active, eluate la pH 4,75, au fost unite, pH-ul a fost adus la 6,5 şi introduse într-o coloană de DEAE-sefaroză (4,5x0,8 cm), echilibrată cu soluţie-tampon 50 mM fosfat de sodium, pH 6,5 care conţinea 40 mM NaCl. Coloana a fost eluată cu un gradient de NaCl (40-340 mM) în aceeaşi soluţie-tampon. Procedura de purificare a fost efectuată la 4oC şi toate soluţiile conţineau 2 mM DTT, 500 µM EDTA şi 0,02% NaN3. Proteina a fost determinată prin metoda Bradford [4] la toate etapele purificării.

Rezultate şi discuţii Cercetarea proteinazei CPPh din fasole [14] a demonstrat că ea se deosebeşte considerabil de proteinaza

A din măzăriche. De aceea, la investigarea proteinazei, care să efectueze hidroliza profundă a fazeolinei, am reieşit din presupunerea despre existenţa în seminţele germinate de fasole a proteinazei care să se asemene mai mult cu proteinaza A din măzăriche [13]. Analiza western bloting cu anticorpi faţă de proteinaza A din măzăriche a demonstrat că în extractele cotiledoanelor de fasole este prezentă o bandă proteică cu Mr apropriată de 35 kDa (nu este arătat). Pe baza acestor experienţe prealabile, pentru purificarea acestei proteinaze am încercat o schemă din trei etape (Tab.I), care includea:

1. Purificarea preliminară prin precipitarea izoelectrică a extractului la pH 4,0. 2. Cromatografia izocratică pe CM-sefaroză. 3. Cromatografia cu gradient de concentraţie NaCl pe DEAE-sefaroză. Spre deosebire de proteinaza A din măzăriche, proteinaza A din fasole nu se coprecipită cu proteinele la

pH 4,0. La cromatografia pe CM-sefaroză, enzima adsorbită era eluată de mărirea pH-ului de la 4,0 la 4,9, care, probabil, aduce la reîncărcarea proteinazei A din fasole şi, ca rezultat, la desorbţia ei de pe schimbătorul de ioni la pH 4,75. Este posibil de asemenea că se pierde afinitatea enzimei către proteinele de balast. La cromatografia pe DEAE-sefaroză proteinaza A din fasole se elua în diapazonul de tărie ionică 0,35-0,45, sepărându-se de impurităţi. Schema dată fiind compusă din două tipuri complet diferite de schimbători de ioni permite înlăturarea eficientă a proteinelor de balast, ceea ce simplifică cu mult procedura de purificare, care necesită doar două etape cromatografice.



135

94 - 67 - 43 - 30 - 20,1 - 14,4 -

1 2

Fig.1. Electroforeza proteinazei A din fasole: 1 – proteinele standard; 2 – proteinaza A

(Mr ale proteinelor standard (în kDa) sunt arătate la stânga).

Tabel

Schema purificării proteinazei A

Proteina Activitatea V, ml mg % Purificarea,

de n ori mU % mU/mg Extract 270 841,00 100,00 1 - - - Supernatant, pH 4,0 330 154,00 18,30 5 - - - CM-sepharoza 29 1,40 0,16 600 457 100 326 DEAE-sepharoza 5 0,13 0,02 6469 96 21 738

Enzima a fost purificată de 6469 ori cu un randament de 21%. Aceste valori sunt relative, deoarece activi-

tatea proteinazei A în extract, care conţine şi alte proteinaze, nu putea fi determinată. De aceea, am determinat purificarea după scăderea concentraţiei proteinei, iar activităţii enzimatice detectate i-am atribuit valoarea de 100% doar la etapa a treia de purificare. Preparatul obţinut al enzimei pare a fi pe deplin omogen după datele SDS electroforezei (Fig.1). Banda proteică ocupă poziţia ce corespunde Mr 35 kDa (Fig.1) şi arată o reacţie intensă cu anticorpii faţă de proteinaza A din măzăriche (Fig.2). Spre deosebire de proteinaza A din măzăriche, care la separarea electroforetică reprezintă două benzi [2], proteinaza A din fasole reprezintă numai o singură bandă. De asemenea, se deosebesc şi Mr, care sunt de 29 kDa la măzăriche [2] şi de 35 kDa la fasole.

Secvenarea proteinazei A a determinat următoarea secvenţă amino-terminală: VPPSVDWR. La compa-

rarea secvenţei amino-terminale a proteinazei purificate cu secvenţele amino-terminale ale altor proteinaze din seminţe s-a stabilit că ea se aseamănă cu endopeptidazele cisteinice: proteinaza A din măzăriche [2] şi EP-C1 din păstăile de fasole [20] au o secvenţă amino-terminală identică cu aceasta din urmă. Proteinaza EP-C1, care este proteinaza principală a păstăilor de fasole, avea, după datele SDS-electroforezei, Mr egală cu 34 kDa, ceea ce coincide practic cu rezultatele noastre. Evident, aceste proteinaze sunt foarte apropiate una de alta. Astfel, analiza secvenţelor amino-terminale demonstrează că proteinaza A din seminţele de fasole aparţine familiei papainice a proteinazelor cisteinice.

Spre deosebire de seminţele germinate de măzăriche, unde proteinaza A are cea mai mare activitate pro-teolitică, proteinaza A din seminţele de fasole nu este cea mai activă, având o activitate relativ mică atât în comparaţie cu CPPh [14], cât şi cu legumaina [17].

La acţiunea proteinazei A asupra fazeolinei s-a observat (după rezultatele SDS-electroforezei) dispariţia benzilor ce corespund catenelor polipeptidice ale fazeolinei native şi apariţia a trei fragmente principale cu Mr de aproximativ jumate de subunitate (Fig.3). După 30 min. de hidroliză se formează o bandă; după 2 ore –

A B 1 2 3 1 2 3

Fig.2. Analiza western bloting a proteinazei A din fasole.SDS-electroforeza (A) şi analiza western bloting (B):

1 – proteinaza A din măzăriche; 2 – proteinaza CPPh din fasole;

3 – proteinaza A din fasole.



136

o bandă (şi încă una foarte slabă); după 24 ore – 3 benzi, care au fost notate F1-F3 conform descreşterii Mr. Fragmentele F1 şi F3 apar doar după 24 ore de hidroliză, atunci când subunităţile faseolinei sunt scindate practic complet. La acţiunea ulterioară a proteinazei (în decurs de 42 ore) nu se produc schimbări în cantitatea proteinei hidrolizate şi nici în componenţa fragmentelor formate (Fig.3).

Rezultatele secvenării terminaţiilor aminice ale fragmentelor fazeolinei denotă că aceste fragmente au

următoarele secvenţe aminoacidice: F1 (27,7 kDa) – KQDNTIG, F2 (26,6 kDa) – nu a fost determinat, F3 (24,8 kDa) – TSLREEEE. Aceste rezultate atestă că este clivată legătura peptidică S216-K217 (aici şi mai departe numerotarea se efectuează după subunitatea β a fazeolinei) din linkerul dintre domene [9]. Un frag-ment aparţine domenului C, altul, cu Mr mai mică – domenului N al subunităţii fazeolinei. Al treilea fragment nu a fost identificat, dar colorarea pentru glicozilare arată că ambele benzi iniţiale sunt glicozilate, pe cănd numai două din trei fragmente formate sunt colorate (nu este arătat). Luând în considerare locul legăturii peptidice scindate, aceasta arată că el aparţine capătului carboxi-terninal şi poate fi explicat prin deosebirile în gradul de glicozilare a subuniţăţilor fazeolinei [19].

Electroforezea în gradient al GPAA arată că Mr a fazeolinei modificate in vitro de proteinaza A constituia 133 kDA (Fig.3), sau 95% din masa fazeolinei native. Deci, numai 5% din masa moleculei a fost pierdută la hidroliza fazeolinei de către proteinaza A, ceea ce explică scimbarea Mr a fazeolinei.

Astfel, proteinaza A hidrolizează fazeolina nativă in vitro catalizând doar proteoliza limitată a acestui substrat. Metoda folosită nu permite detectarea schimbărilor la capătul carboxi-terminal al subunităţilor fazeolinei. Însă, este posibil ca câteva legături peptidice să fi fost scindate în segmentele carboxi-terminale dezordonate.

Acţiunea proteinazei A asupra fazeolinei se aseamănă cu acţiunea proteinazei CPPh [14], numai că în cazul proteinazei A se formează doar trei fragmente, comparativ cu patru în cazul proteinazei CPPh, iar Mr a oligomerului fazeolinei se micşorează doar cu 5%, comparativ cu 8,6% în cazul proteinazei CPPh [14].

Pe de altă parte, toate proteinazele A izolate sunt capabile să scindeze PR până la peptide scurte [2,18]. Aceste rezultate demonstrează că fasolele şi măzărichea diferă în interacţia dintre proteinele lor 7S de rezervă şi proteinazele A în decursul germinării. Rezistenţa înaltă bine cunoscută a fazeolinei la proteoliză [7,14,17,22] trebuie să fie relatată la particularităţile structurale ale fazeolinei.

A B 1 2 1 2 3 4 5 6

94 – 67 – 43 – 30 – 20,1 – 14,4 –

Fig.3. Spectrul electroforetic al fazeolinei pe parcursul desfăşurării hidrolizei ei la acţiunea proteinazei A din fasole.

A. Electroforeza în gradient al GPAA: 1 – 0 ore; 2 – 42 ore (Mr ale proteinelor standard (în kDa) sunt arătate la stânga);

B. SDS-electroforeza: 1 – proteinele standard (Mr (în kDa) sunt arătate la stânga); 2-6 – 0, 0,5, 2, 24 şi 42 ore.

F1 F2 F3

440 – 232 –

140 – 67 –



137

Oprirea hidrolizei fazeolinei doar după scindarea unei părţi neînsemnate de proteină demonstrează că, spre deosebire de celelalte PR, la a căror degradare se observă decurgerea paralelă a proteolizei după mecha-nismul consecutiv şi unul-câte-unul [21], la acţiunea proteinazei A asupra fazeolinei proteoliza are loc doar după mecanismul consecutiv. Toată scindarea proteinei este determinată de îndepărtarea peptidelor scurte prin proteoliza limitată.

Astfel, aceste rezultate arată că stabilitatea fazeolinei la hidroliza enzimatică este determinată de proteina însăşi. Prin urmare, cauza deosebirilor manifestate trebuie căutată în particularităţile structurii fazeolinei.

Structura fazeolinei este determinată cu un grad înalt de rezoluţie [9]. Pe baza acestor date şi a alinierii a 15 structuri primare cunoscute a proteinelor de rezervă 7S, a fost propus modelul canonic al structurii terţiare [9].

Molecula fazeolinei este alcătuită din trei subunităţi. Fiecare subunitate include două domene structurale foarte asemănătoare (amino- şi carboxi-terminale), unite printr-un linker interdomenic. Fiecare domen este reprezentat de un β-barrel (β-butoiaş, compus din 8 β-structuri principale şi 5 suplimentare) şi α-structură (3 α-helixuri aranjate consecutiv). Două α-helixuri ale fiecărui domen ies pe părţile opuse ale fiecărei subunităţi în formă de cârlig şi joacă un rol important la stabilizarea oligomerului fazeolinei.

Mărimea fragmentelor formate la hidroliza fazeolinei de proteinaza A constituie aproximativ jumătate din subunitate. Mărimea fragmentelor, precum şi lipsa produşilor intermediari ai scindării subunităţilor, arată că atacului proteolitic pot fi supuse numai sectoarele relativ scurte terminale şi cel central. Secvenarea amino-terminală a fragmentelor şi compararea lor cu structura primară a subunităţilor fazeolinei a demonstrat că Ser216 reprezintă aminoacidul din poziţia P1 a situsului scindării. Legătura peptidică scindată S217-K218 este situată în linkerul interdomenic.

Scăderea Mr a fazeolinei la acţiunea proteinazei A (Fig.3) arată că suma maselor moleculare ale peptidelor îndepărtate trebuie să constituie aproximativ 2,3 kDa la fiecare subunitate, ceea ce este mai puţin decât în cazul proteinazei CPPh [14]. Este evident că scindarea peptidelor trebuie să aibă loc la capătul carboxilic, deoarece diminuarea Mr a oligomerului nu poate avea loc la schindarea doar a legăturii peptidice identificate.

Structura cuaternară a PR poate avea o importanţă deosebită pentru prevenirea proteolizei premature la maturizarea seminţelor. Totodată, ea nu trebuie să împiedice mobilizarea PR la germinarea seminţelor, care este un proces tot aşa de regulat ca şi depunerea rezervelor de proteine. Astfel, putem admite că particularităţile proteolizei fazeolinei la acţiunea proteinazei A, ca şi la acţiunea altor proteinaze endogene [3,14] şi exogene [7,12], sunt determinate de deosebirea structurală a fazeolinei de alte proteine 7S.

Trei proteinaze cisteinice, notate proteinaza A, CPPh [14] şi legumaina [17], au fost purificate din seminţele germinate de fasole şi parţial caracterizate. Proteinaza A şi CPPh din fasole sunt asemănătoare proteinazei A [2] şi CPR1 [1] din măzăriche şi, respectiv, aparţin endopeptidazelor cisteinice de tip papainic. Legumaina aparţine endopeptidazelor cisteinice legumainice şi este apropiată de proteinaza B din măzăriche [17]. Deci, aceste endopeptidaze cisteinice, conform datelor structurilor primare, sunt asemănătoare celora din seminţele ger-minate de măzăriche; dar, spre deosebire de ele, acţiunea lor asupra fazeolinei se deosebeşte considerabil. Dacă proteinaza A din măzăriche este capabilă de scindare completă a vicilinei, proteinei 7S de rezervă din măzăriche, atunci proteinaza A din fasole are o acţiune limitată asupra fazeolinei.

Un alt moment interesant îl reprezintă faptul că proteinaza A din fasole aparent participă la două procese fiziologice diferite, precum ar fi scindarea PR la germinarea plantelor şi mobilizarea nitrogenului din păstăile de fasole la maturizarea seminţelor [20]. Aceasta prezintă un interes deosebit, deoarece participarea unei şi aceleaşi enzime la diferite etape ontologice de dezvoltare este un fenomen rar. În această ordine de idei, cercetarea importanţei proteinazei A pentru diferite procese fiziologice în diferite organe ale plantei prezintă un ineres deosebit.

Fragmentele fazeolinei modificate proteolitic în decursul germinării seminţelor de fasole au secvenţe amino-terminale identice cu cele obţinute la incubarea fazeolinei native cu legumaina [17]. Nu au fost detectate fragmente care corespund acţiunii proteinazei A sau CPPh. Prin aceasta fasolele se deosebesc de schema propusă de Shutov şi Vaintraub [18], ceea ce demonstrează că la diferite plante proteinaze asemănătoare pot avea funcţii diferite şi aceste funcţii încă urmează a fi determinate.

Referinţe:

1. Becker C., Fischer J., Nong V.H. and Müntz K. PCR cloning and expression analysis of cDNAs encoding cysteine proteinases from germinating seeds of Vicia sativa L. // Plant Mol. Biol. - 1994. - Vol.26. - P.1207-1212.



138

2. Becker C., Senyuk V.I., Shutov A.D., Nong V.H., Fischer J., Horstmann C. and Müntz K. Proteinase A, a storage globulin degrading endopeptidase of vetch (Vicia sativa L.) seeds, is not involved in early steps of storage protein mobilization // Eur. J. Biochem. - 1997. - Vol.248. - P.304-312.

3. Boyland M.T. and Sussex I.M. Purification of an endopeptidase involved with storage protein degradation in Phaseolus vulgaris L. cotyledons // Planta. - 1987. - Vol.170. - P.343-352.

4. Bradford M.M. A rapid and sensetive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dze binding // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.72. - P.248-254.

5. Fischer J., Becker C., Hillmer S., Horstmann C., Neubohn B., Schlereth A., Senyuk V., Shutov A. and Müntz K. The families of papain- and legumain-like cysteine proteinases from embryonic axes and cotyledons of Vicia seeds: developmental patterns, intracellular localization and functions in globulin proteolysis // Plant Mol. Biol. - 2000. - Vol.43. - P.83-101.

6. Granell A., Cercos M., Carbonell J. Plant cysteine proteinases in germination and senescence - In: Handbook of Proteolytic Enzymes, Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F., eds. Academic Pr Inc., 1999.

7. Jivotovskaya A., Senyuk V., Rotari V., Horstmann C. and Vaintraub I. Proteolysis of phaseolin in relation to its structure // J. Agr. Food Chem. - 1996. - Vol.44. - P.3768-3772.

8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the hed of bacteriophage T4 // Nature. -1970. - Vol.227. - P.680-685.

9. Lawrence M.C., Izard T., Beuchat M., Blagrove R.J. and Colman P.M. Structure of phaseolin at 2.2 Å resolution. Implications for a common vicilin/legumin structure and the genetic engineering of seed storage proteins // J. Mol. Biol. - 1994. - Vol.238. - P.748-776.

10. Müntz K. Proteases and proteolytic cleavage of storage proteins in developing and germinating dicotyledonous seeds // J. Exp. Bot. - 1996. - Vol.47. - P.605-622.

11. Müntz K., Becker C., Pancke J., Schlereth A., Fischer J., Horstmann C., Kirkin V., Neubohn B., Senyuk V., Shutov. A Protein degradation and nitrogen supply during germination and seedling growth of vetch (Vicia sativa L.) // J. Plant Physiol. - 1998. - Vol.152. - P.683-691.

12. Nielsen S.S., Deshpande S.S., Hermodson M.A., Scott M.P. Comparative digestibility of legume storage proteins // J. Agr. Food Chem. - 1988. - Vol.36. - P.896-902.

13. Rotari V. Proteinaza cisteinică din seminţele germinate de fasole şi acţiunea ei asupra proteinelor 7S din fassole şi măzăriche: Teza de doctor în biologie. - Chişinău, 1996.

14. Rotari V., Senyuk V., Jivotovskaja A., Horstmann C. and Vaintraub I. Proteinase A-like enzyme from germinated kidney bean seeds. Its action on phaseolin and vicilin // Physiologia Plantarum. - 1997. - Vol.100. -P.171-177.

15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratorz manual. 2nd ed. - New-York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

16. Schlesier B., Manteuffel R., Armin R., Jüttner G. A simple method for preparation of phaseolin // Biochem. Physiol. Pflanz. - 1984. - Vol.179. - P.665-678.

17. Senyuk V., Rotari V., Becker C., Zakharov A., Horstmann C., Müntz K., Vaintraub I. Cysteine proteinases from kidney bean seedlings // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. - 1998. - P.143-147.

18. Shutov A.D. and Vaintraub I.A. Degradation of storage proteins in germinated seeds // Phytochemistry. - 1987. - Vol.26. - P.1557-1566.

19. Sturm A., Van Kuikll J.A., Vliegenthartll J.F.G., and Chrispeels M.J. Structure, position, and biosynthesis of the high mannose and the complex oligosaccharide side chains of the bean storage protein phaseolin // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol.262. - P.13392-13403.

20. Tanaka T., Yamauchi D. and Minamikawa T. Nucleotide sequence for endopeptidase (EP-C1) from pods of maturing Phaseolus vulgaris fruits // Plant Mol. Biol. - 1991. - Vol.16. - P.1083-1084.

21. Vaintraub I.A. Kinetics of co-operative proteolysis // Nahrung. - 1998. - Vol.42. - P.59–60. 22. Zakharov A., Carchilan M., Stepurina T., Rotari V., Wilson K., and Vaintraub I. A comparative study of the role of

the major proteinases of germinated common bean (Phaseolus vulgaris L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill) seeds in the degradation of their storage proteins // J. Exp. Bot. - 2004. - Vol.55. - P.2241-2249.




139

CHARACTERISATION OF PHASEOLIN MODIFIED BY LEGUMAIN

Vitalie I. ROTARI, Diana MORARI, Tatiana STEPURINA

Laboratory of Plant Biochemistry Fazeolina se deosebeşte de alte proteine de rezervă din seminţele plantelor leguminoase prin faptul că hidroliza ei,

atât la acţiunea enzimelor proteolitice endogene, cât şi a celor exogene, se opreşte după modificarea limitată a moleculei, care rezultă în formarea fragmentelor cu masă moleculară ce corespunde jumătăţii subunităţilor fazeolinei. Legumaina este singura enzimă a cărei acţiune asupra fazeolinei diferă de alte proteinaze. Mai mult decât atât, modificarea fazeolinei de către legumaină iniţiază degradarea ei profundă. Fazeolina modificată de legumaină este compusă din fragmente de două tipuri care rămân legate necovalent în structura terţiară şi cuaternară. Situsurile clivării sunt localizate numai pe una din suprafeţele trimerului fazeolinei ce indică că particularităţile structurii fazeolinei pot influenţa accesibilitatea legăturilor peptidice la atacului proteolitic.

During germination the seed storage proteins (SP) are hydrolysed to free amino acids, which serve as pre-

cursors for the synthesis of new proteins in the seedling. Endopeptidases play key roles in SP degradation, producing oligopeptides. The latter are, in turn, hydrolysed by exopeptidases to free amino acids.

Cysteine proteinases (EC 3.4.22) are the major endopeptidases present in the cotyledons during early seedling growth, and are generally considered to be largely responsible for the mobilization of the SP [1]. They fall into two families, the low-specificity enzymes from the papain family and Asn-specific enzymes from the legumain family. The former exhibit low specificity for the peptide bonds cleaved while the latter are specific for the cleavage of Asn-X peptide bonds. Legumains have almost strict specificity for Asn in the P1 positions with only Asp being tolerated there but at a 100 times lower rate [2]. Due to their narrow specificity and wide distribution [3], these proteases may play a role as regulatory enzymes.

It has been recognized that SP mobilization during germination is a regulated process and a hypothetical scheme of SP degradation in germinating legume seeds was proposed [1]. In this scheme the central role in SP mobilization was attributed to cysteine proteinases termed A and B, which are synthesized de novo during seed germination. Proteolytic modification of storage proteins is the first stage in their degradation in germi-nated seeds [1]. In a number of species type A proteinases, which are members of the papain family [4], were assumed to start SP degradation modifying them by limited proteolysis making SP available to the attack by other proteinases. They are also capable of further hydrolysis of the modified storage proteins to short peptides. However once being modified SP are broken down co-operatively by both proteinases A and B and by carboxypeptidases. So, the complete hydrolysis of protease A modified SP is achieved by the orchestrated action of proteases synthesized de novo and by those pre-existing in seeds [1]. It was claimed that proteinase B, which belongs to the legumain family, does not act on unmodified SP, such as vicilin and legumin [5]. Accor-ding to this hypothesis, proteinase A should play a central role in controlling the initiation of SP breakdown.

Three cysteine proteinases designated CPPh [6], legumain [7] and CPA [8] were found in germinated kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings. CPPh and CPA were shown to be papain-like cysteine endo-peptidases [8] belonging to the clan CA [4] whereas legumain [7] belong to the clan CD of cysteine endo-peptidase [9]. The sequence data showed that these endopeptidases are related to the corresponding protei-nases from cotyledons of germinating vetch (Vicia sativa L.) seeds [8]. Their action on kidney bean vicilin-like 7S storage globulin phaseolin, that is the major SP in this legume, is limited to the cleavage of protein subunits into high-molecular mass fragments and to the splitting off a small number of short peptides [6,7,8]. Thus the three most active proteinases detected in common bean seedlings individually were incapable of the extensive degradation of phaseolin. Extensive hydrolysis of phaseolin was only achieved by the consecutive action of legumain and CPPh [10].

The investigation of the role of proteases from the kidney bean in the degradation of phaseolin showed that the above mentioned hypothetical scheme needs some modifications because only limited proteolysis was achieved by incubating these proteinases individually with phaseolin as a substrate. New results [11] also questioned the triggering role of proteinase A in mobilisation of SP in vetch. Several other papain-like cysteine endopeptidases were detected in germinating vetch [12] at a much earlier stages of germination than protei-



140

nase A and might be the initiators of SP degradation. It may be expected that such a controlling proteinase should have a narrow cleavage specificity like the lugumains. This seems to be the case in kidney bean where phaseolin modified by legumain becomes susceptible to complete hydrolysis at the action of CPPh [10]. Thus the caracterisation of phaseolin modified by legumain is of great interest for the finding of the peculiarities that makes it susceptible to the action of other endopeptidases. Here we report the results of the investigation of the action of legumain on phaseolin that extend the previously obtained results. The phaseolin structural model of Lawrence et al. [13] is used for visualizing the location of the detected cleavage sites.

Materials and Methods Reagents. Phaseolin was isolated according to the method of Schlesier et al. [14]. Legumain was isolated

as previously described [10]. The content of active legumain was determined with the synthetic substrate Bz-Asn-p-nitroanilide.

Proteolysis. Phaseolin solution (2%) in 120 mM phosphate-citrate buffer, containing 180 mM NaCl, 2 mM DTT, 500 µM EDTA, and 0.02% NaN3, pH 5.6 was mixed with an equal volume of legumain solution (100–250 mU ml-1) in 200 mM sodium acetate buffer, containing 2 mM DTT, 500 µM EDTA, and 0.02% NaN3, pH 5.8 and the reaction mixture was incubated for 24 h at 30 oC. The incubation mixtures for the digestion of phaseolin contained 10 µM E64 (trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane), an inhibitor of papain-like cysteine proteinases.

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). For sodium dodecyl-sulfate (SDS) electrophoresis (SDS-PAGE ) the protein samples were treated according to Laemmli [15]. The SDS-PAGE was carried out in a vertical flat-bed 12.5% gel with the ratio of acrylamide to methylenebis(acrylamide) of 200:1 [16]. Phospho-rylase b (94 kDa), bovine serum albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), Kunitz soybean trypsin inhibitor (20.1 kDa), and α-lactoglobulin (14.4 kDa) were used as standards for molecular mass (Mr) determination. The gels were stained with Coomassie brilliant blue G-250 according to the standard procedure.

Nondenaturing gradient pore electrophoresis was carried out in a vertical flat-bed gradient (4-30%) PAGE using 90 mM Tris-borate buffer system, pH 8.4. The duration of electrophoresis was 4500Vh. Ferritin (440 kDa), catalase (232 kDa), and bovine serum albumin (67 kDa) were used as standards. The percent of the residual protein was calculated from the decrease of phaseolin molecule’s Mr. The gels were stained with Coomassie brilliant blue R-250 according to the standard procedure.

2-D electroforesis was carried out in a vertical flat-bed nondenaturing gradient pore (4-30%) PAGE in the first direction and the protein bands were excised from the gel and run in a flat-bed 12.5% PAGE with the ratio of acrylamide to methylenebis(acrylamide) of 37.5:1 in the second direction.

Protein modeling. Tertiary and quaternary structures of the phaseolin molecule was drawn from PDB record 2PHL [17] by use of the Swiss-PdbViewer program [18].

Results and Discussion The modification of phaseolin by legumain seems to trigger its complete hydrolysis [2,7,10]. This modifi-

cation results in the formation of fragments with molecular masses ranged from 12 to 27 kDa (Fig.1A). These fragments broadly fall into two groups:

1. The first group is represented by the fragments with Mr that roughly corresponds to that of a half phaseolin subunit. Fragments of this group resemble those observed during the hydrolysis of phaseolin by both endogenous papain-like [6,19] and exogenous [20,21] proteases.

2. The second group comprises the fragments that have molecular masses less than half phaseolin subunit. Phaseolin fragments of these sizes were observed only under the action of endogenous legumain [2,7,10]. While during the in vitro proteolysis of phaseolin by legumain intermediate fragments were formed some of which disappeared or decreased significantly during extended proteolysis [7] the action of legumain in presence of E64, an inhibitor of papain-like cysteine proteases, results in a stable pattern of formed fragments [2].

The fragments of the first group were labeled F1h through F4h while those of the second group F1 through F6 (according to decreasing apparent Mr). The comparison of the fragments of the second group (Fig. 1A) with the previously reported results [7] showed that they are very similar despite of slight difference in their molecular masses (Table 1). This comparison permits to confirm the same three cleavage sites identified



141

previously [7]: N103-P, N220-T, and N235-S (here and forward the amino acids are numbered according to phaseolin β numbering) which belong to the FG loop in the N-terminal β-barrel domain and to the A’ strand and AB loop in the C-terminal β-barrel domain of the phaseolin subunit respectively, according to the struc-ture model of Lawrence et al [13]. The fragment F3 does not correspond to any of previously identified frag-ments but its apparent Mr is similar to a fragment of phaseolin that is formed during in vivo digestion and results from the cleavage site N235-S. Consequently, in all cases, the cleavage sites were flanked by Asn in P1 position which corresponds to the almost strict Asn-specificity of legumain-like cysteine endopeptidases [2].

Phaseolin is a trimer of three types of similar subunits termed β, α, and α’ consisting of 397, 411, and 412 amino acid residues, respectively [13]. Each subunit has two potential glycosilation sites [22] and both singly and doubly glycosylated species are known to exist in vivo [23] which cause the appearance of molecular heterogeneity of phaseolin subunits [24]. As a result when phaseolin is subjected to SDS-PAGE it can be separated into four polypeptides, called size class [25], with range in Mr from 45 to 52 kDa. It was shown that these bands can be more easily separated by changing the acrylamide:methylenebis(acrylamide) ratio to 200:1 [26].

We decided to use similar conditions for the separation of the fragments of the first group that could not

be separated under standard ratio of 37.5:1 acrylamide/methylenebis(acrylamide) [2,7,10]. Under these conditions four fragments belonging to the first group with have the apparent molecular masses in the range from 24 to 28 kDa were identified (Table 1).

It is peculiar that in the case of CPPh action on phaseolin also four fragments corresponding to half pha-seolin subunit were detected. They, by two, belong to N- and C-terminal domains and were suggested to be due to heterogeneity in the glycosilation and by CPPh cleavage of C-terminus of the formed fragments. The molecular masses of fragments generated by legumain are higher that those generated by CPPh and while four fragments generated by CPPh are of approximately equal quantity in phaseolin modified by legumain the fragment F3h evidently predominates. In order to draw any conclusion from this it is necessary to determine their N-terminal sequence or/and their exact Mr by mass spectrometry.

A B C M 1 2 1 2 1 2

94 67 43 30 20.1 14.4

440 232 140 67

Fig.1. Electrophoretic pattern of the residual protein during phaseolin proteolysis by legumain.

A – SDS electrophoresis: On the right are indicated the fragments detected by SDS electrophoresis in the phaseolin modified by legumain;

B – Gradient pore electrophoresis; C – 2-D electrophoresis; Experimental conditions are detailed in Materials and methods. Lane M – molecular weight standards; lane 1 – native phaseolin; lane 2 – phaseolin modified by legumain. On the left are indicated the molecular masses of the standards (in kDa).

F1h F2h F3h F4h F1 F2 F3 F4 F5 F6

94 67 43 30 20.1 14.4



142

Table 1

The fragments of phaseolin modified in vitro by legumain in presence of E64

Similar to the identified fragment by Senuyk et al. [7] Fragments Mr, kDa Fragments Mr, kDa Cleavage site F1h 28.1 F2h 27.1 F3h 25.6 F4h 24.3 F1 22.9 F1 22.4 N220-T F2 21.6 F2 21.5 N220-T F3 18.6 ? F4 17.5 F5 17.1 N235-S F5 15.7 F6 15.0 N235-S F6 13.4 F8 12.8 N103-P

On the basis of determined high-resolution X-ray structure of phaseolin together with the primary structure

of 15 subunits of 7S proteins, Lawrence et al. [13] developed a canonical model of the structure of 7S proteins. According to this model each phaseolin subunit consists of two domains of similar size and structure. In its turn, each domain consists of two elements: a compact eight-stranded β-barrel and an extended loop consisting of three short α-helix. The interdomain linker consists of helix 4 and of an unfolded sequence, comprising residues 211-219, that was not detected in the X-ray structure. The sequences of 10 N-terminal and 15 C-ter-minal amino acids residues are also absent from the X-ray structure [13].

Proteins from plant seeds are important for food and feed. Among the factors that affect their nutritive value one of the most important is their susceptibility to hydrolysis by proteases [29]. In contrast to other 7S SP, native phaseolin is highly resistant to proteolysis in vitro [6,20, 21,27,28,29]. The greatest part of the phaseolin molecule is remarkably resistant to proteolytic attack. Its degradation generally stopped after a short-term limited proteolysis producing a high molecular-mass oligomeric product [6, 21]. At the action of both endogenous [6,19] and exogenous [20,21] proteases its limited proteolysis stops after a small number of peptides have been cleaved off. It is only completely hydrolyzed under the concerted action of two endogenous proteases – legumain and CPPh [10] which is in contrast to the consecutive action of exogenous proteases that is additive and does not proceed to the complete hydrolysis [21].

An explanation of phaseolin resistance to the action of proteases was proposed on the basis of the diffe-rences of its tertiary structural features from that of other homologues 7S proteins [6,7,21]. In the case of legumain, from the finding of cleavage sites and assumptions, a four-step scheme was proposed by Senyuk et al. [7] for the cleavage of phaseolin subunits by this endopeptidase:

1. Phaseolin degradation presumably starts via cleavage in an inter-module linker of the phaseolin monomer since cleavage products having half the Mr of a monomer were generated first. Thus the first cleavage products are derived from both the N-terminal and the C-termional domains of phaseolin subunits.

2. The A’-A β segment is detached from the C-terminal β-barrel domain. 3. Later, legumain attacks α helices and the disordered segment of the C-terminus that results in the

formation of fragments with lower molecular masses with the same N-terminal sequences. 4. Afterwards or in parallel, the FG loop of the N-terminal β-barrel domain is cleaved off. By cleavage at the sites located in the C-domain: N220-T in the A’ β strand, and N235-S in the AB-loop,

the A’-A β segment, having a calculated molecular mass of 1.6 kDa, must have been dissected from the β-barrel domain of the C-domain. This segment includes the N-glycosilated site N228 [13] which can be glycosilated by two different glycans: Man7(GlcNAc)2 and Xyl-Man3(GlcNAc)2 [23]. These glycans would add to the 1.6 kDa polypeptide chain approximately 1.7 and 1.1 kDa, correspondingly. The loss of these fragments would result in changes to the Mr of the native phaseolin molecule as well as it could destabilize the quaternary structure of the phaseolin.

According to native gradient-pore PAGE (Fig. 1B) Mr of phaseolin decreased during hydrolysis by legumain from 140 to 137 kDa, indicating the loss of 2% protein. Therefore it showed that phaseolin retained its quaternary structure after hydrolysis by legumain. More than that these results indicate that the loss of



143

protein would constitute about 1 kDa per subunit which means that the A’-A β segment is not detached from the phaseolin molecule. All the fragments generated by legumain action remain bound noncovalently in the phaseolin molecule. Our results confirm the high resistance of most of the phaseolin molecule to proteolytic attack of legumain. However the data concerning the content of residual protein during legumain action on phaseolin indicates that a few peptides are cleaved off (Fig. 1B). Whether they are due to the cleavage at the C-terminus of these fragments as suggested previously by Senyuk et al. [7] would be clear only if the exact molecular masses of these fragments is determined by mass spectrometry.

The final high molecular mass product of phaseolin hydrolysis by legumain will be subsequently referred to as phaseolin-L. It’s Mr is higher by 10 kDa than the Mr of the phaseolin modified by CPPh (subsequently referred to as phaseolin-CPPh) [6]. CPPh action on phaseolin result in the splitting of the subunits of phaseolin that is accompanied by the formation of a number of TCA-soluble peptides, resulting in the loss of 8.5% protein. In both cases during proteolysis, the residual phaseolin protein retains its oligomeric structure as indicated by non-denaturing gradient-pore PAGE. But in comparison to phaseolin-CPPh where only fragments correspon-ding to half phaseolin subunits were detected by SDS-PAGE phaseolin-L is composed of fragments of two types which indicated the cleavage in the subunit’s domains. This raised another question and namely whether in the phaseolin-L are present all the fragments detected by SDS-PAGE.

The 2D PAGE (Fig.1C) showed that indeed all the fragments detected by SDS-PAGE are part of the phaseolin-L molecule. This result showed that the cleavage of phaseolin subunits and their further split off does not break quaternary structure. So, the nature of the limited proteolysis of phaseolin by legumain was confirmed by PAGE (SDS, native gradient-pore and 2D).

The methods used in this study do not permit to get an exhaustive information about the phaseolin-L. For example it is difficult to account for 2% protein loss detected by native gradient-pore PAGE. It was suggested previously that legumain could cleave off some peptides from the C-terminus of the formed fragments [7], but for clarifying this, the N-terminal sequencing of all fragments detected by SDS-PAGE and determination of their exact molecular masses by mass spectrometry is highly advisable.

The modification by limited proteolysis of phaseolin by legumain makes phaseolin molecule susceptible to the attack of CPPh [10]. The mechanic by which this happens is still not known. We used the structural model of phaseolin [13] to show the localization of the sites of legumain cleavage of phaseolin (Fig.2).

As we have already mentioned these cleavage sites are located in FG loop in the N-terminal β-barrel domain and in the A’ strand and AB loop in the C-terminal β-barrel domain of the phaseolin subunit. These regions are an essential part of phaseolin structure. In comparison to phaseolin-L the cleavage sites of phaseolin-CPPh can not be mapped on phaseolin structure because they are located in flexible regions with are not present (no electron density was discerned for these regions) in the refined structure of phaseolin [13].

A B Fig.2. Localisation of legumain cleavage sites in the quaternary structure of the phaseolin molecule.

The structure was drawn from PDB record 2PHL by use of the Swiss-Pdb Viewer program [18]. A – Phaseolin trimer viewed down the molecular threefold axis B – The picture in A is rotated 90o in the plane of the view The subunits are colored in different colors. The determined legumain cleavage sites are indicated by labeling the Asn residues in P1 position and the residues in the P1’ position. Cleavage sites are indicated in only one subunit in A and in all subunits in B.



144

As it can easily be seen all the cleavage sites are located in the middle of the subunit’s tertiary structure (Fig. 2A). And what is more interesting they all are located on the same side of the phaseolin molecule’s quaternary structure (Fig. 2B).

The phaseolin trimer is a disc of diameter 90 Å and thickness 35 Å [30,31]. Unlike other 7S storage glo-bulins phaseolin converts to an 18 S tetramer at acid pH [32], and images recorded under these conditions suggest that four of the 7 S trimer discs associate to form the faces of a regular tetrahedron [30]. This tetramer of trimers turned out to be the form of the molecule in the crystals of phaseolin [31]. These results indicate that constraints imposed on seed proteins by their role in sustaining the germinating plant may have imposed restrictions on the structure of phaseolin that are to accumulate in the protein-storage bodies of seeds. Whether the observed arrangement of legumain cleavage sites on phaseolin structure is determined by the accessibility of these sites that results from the packing of phaseolin trimers into tetramers could be answered only by the X-ray structure of phaseolin-L.

Our results confirm the high resistance of most of the phaseolin molecule to proteolytic attack by legumain. This has also been reported for the action of other endogenous [6,19] and exogenous [20,21] proteases. SDS-PAGE showed that all proteases tested except pepsin [21] caused gradual disappearing of the polypeptide bands due to subunits. Concomitantly, irrespective of the type of protease tested, several bands with molecular masses approximately half of a subunit appeared [6,19,20,21]. The split peptide bonds identified were all located in the middle of the subunit [6,20,21]. While the hydrolysis of native storage protein is slow the hydrolysis of heat denaturated storage proteins is rapid and complete which is caused by the disruption of the tertiary and quaternary structures [20,33]. Consequently the limited proteolysis of phaseolin, that distinguish it from other storage proteins, is evidently due to the peculiarities of its structure. The specific features of phaseolin structure probably determine its resistance to enzymatic hydrolysis.

At the best of our knowledge no proteolytic enzyme, carrying out the profound hydrolysis of native pha-seolin, were detected. However it was found that preliminary modification of phaseolin by legumain is ne-cessary for the subsequent action by CPPh [10]. CPPh catalysed the extensive hydrolysis of phaseolin-L [10]. SDS-PAGE however did not detected changes in the fragment composition indicating that further degradation of phaseolin down to trichloroacetic acid-soluble peptides occurs without changes in the number and relative amounts of the fragments generated by legumain. They remained essentially unchanged during the reaction [10], indicating a predominantly co-operative-type of proteolysis [34].

Incubation of phaseolin with legumain generated a fragment pattern different from those observed with other proteases but it is similar to the pattern of fragments observed for phaseolin partialy modified in vivo that was isolated from cotyledons of six day germinated kidney bean [7]. In both cases the splitting sites in phaseolin subunit were on C-side of the same asparagine residues. No such fragment similarity was found after incubating native phaseolin with CPPh. This pattern was also confirmed by immunoblotting of phaseolin mobilization during and after kidney bean germination [7]. The results suggest that is very likely that legumain is responsible for the initiation of phaseolin proteolysis in vivo.

The cysteine endopeptidases found in cotyledons of germinating kidney beans are similar to those detected in cotyledons of germinating vetch [8]. Whereas the papain-like cysteine endopeptidase CPPh degraded in vitro vicilin from vetch profoundly, it’s action on phaseolin is limited. This indicates differences in the struc-ture-function relations between homologous proteinases and homologous storage globulins as substrates from vetch and kidney bean, respectively. Phaseolin that was isolated from dry kidney bean cotyledons is also modified in vitro by the Asn-specific cysteine endopeptidase legumain. This is in contrast to previously reported conclusion that vetch proteinase B, homologous to kidney bean legumain, could not digest neither vicilin nor legumin from dormant vetch seeds in vitro [1,5].

Similarities of in vivo and in vitro cleavage products of phaseolin strongly suggest that legumain could initiate the degradation of phaseolin in the cotyledons of germinating kidney bean. This is in contrast to the hypothesis of Shutov and Vaintraub [1] mentioned above, according to which proteinase B cannot attack native globulins from mature legume cotyledons but only globulins that already underwent limited proteolysis by a papin-like cysteine endopeptidase. Outwardly, it seems that, the action of legumain on phaseolin differs essentially from that of the proteinase B on SP [1,5]. Thus, legumain may control the initiation of phaseolin breakdown in kidney bean, whereas the other cysteine endopeptidases together with carboxypeptidases might contribute to further degradation of this 7S storage globulin.



145

These results indicate that legumain is the enzyme that triggers the degradation of phaseolin. The modifi-cations caused by legumain makes the phaseolin molecule susceptible to the attack of CPPh. The elucidation of the mechanism by which this proteolysis is achieved is of major interest.

Any proteinase is capable of splitting one to several accessible, flexible segments of a particular substrate protein, provided that these segments are situated on the surface of the protein molecules and contain peptide bonds corresponding to the proteinase specificity. If such cleavage(s) destabilize(s) the protein structure then unfolding of the substrate protein occurs leading to subsequent extensive hydrolysis. These considerations allow plausible explanations to be proposed for the differences observed in the course of proteolysis of different 7S proteins. So, the cause of the difference detected should be looked for in the peculiarities of phaseolin structure. Perhaps the determination of X-ray structure of phaseolin-L and/or phaseolin-CPPh could prove decisive in the solution of this conundrum.

References:

1. Shutov A.D. and Vaintraub I.A. Degradation of storage proteins in germinated seeds // Phytochemistry. - 1987. - Vol.26. - P.1557-1566.

2. Rotari V., Dando P. M. and Barrett A. J. Legumain forms from plants and animals differ in their specificity // Biol. Chem. - 2001. - Vol.382. - P.953-959.

3. Barrett A.J. Mammalian legumain. - In: Handbook of Proteolytic Enzymes, Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F., eds. Academic Pr Inc, 1999.

4. Rawlings N.D., Morton F.R., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database // Nucleic Acids Res. - 2006. - Vol.34 (Database issue). - P.D270-272. - (http://merops.sanger.ac.uk)

5. Becker C., Shutov A.D., Nong V.H., Senyuk V.I., Jung R., Horstmann C., Fischer J., Nielsen N.C. and Müntz K. Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B, an asparagines-specific endopeptidase from germinating vetch (Vicia sativa L.) seeds // Eur. J. Biochem. - 1995. - Vol.228. - P.456-462.

6. Rotari V., Senyuk V., Jivotovskaja A., Horstmann C. and Vaintraub I. Proteinase A-like enzyme from germinated kidney bean seeds. Its action on phaseolin and vicilin // Physiologia Plantarum. - 1997. - Vol.100. - P.171-177.

7. Senyuk V., Rotari V., Becker C., Zakharov A., Horstmann C., Müntz K. and Vaintraub I. Does an asparaginyl-specific cysteine endopeptidase trigger phaseolin degradation in cotyledons of kidney bean seedlings? // Eur. J. Biochem. - 1998. - Vol.258. - P.546-558.

8. Senyuk V., Rotari V., Becker C., Zakharov A., Horstmann C., Müntz K., Vaintraub I. Cysteine proteinases from kidney bean seedlings // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. - 1998. - P.143-147.

9. Chen J.-M., Rawlings N.D., Stevens R.A.E., Barrett A.J. Identifcation of the active site of legumain links it to caspases, clostripain and gingipains in a new clan of cysteine endopeptidases // FEBS Letters. - 1998. – Vol.441. – P.361-365.

10. Zakharov A., Carchilan M., Stepurina T., Rotari V., Wilson K., and Vaintraub I. A comparative study of the role of the major proteinases of germinated common bean (Phaseolus vulgaris L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill) seeds in the degradation of their storage proteins // J.Exp. Bot. - 2004. - Vol.55. - P.2241-2249.

11. Becker C., Senyuk V.I., Shutov A.D., Nong V.H., Fischer J., Horstmann C. and Müntz K. Proteinase A, a storage globulin degrading endopeptidase of vetch (Vicia sativa L.) seeds, is not involved in early steps of storage protein mobilization // Eur. J. Biochem. - 1997. - Vol.248. - P.304-312.

12. Becker C., Fischer J., Nong V.H. and Müntz K. PCR cloning and expression analysis of cDNAs encoding cysteine proteinases from germinating seeds of Vicia sativa L. // Plant Mol. Biol. - 1994. - Vol.26. - P.1207-1212.

13. Lawrence M.C., Izard T., Beuchat M., Blagrove R.J. and Colman P.M. Structure of phaseolin at 2.2 Å resolution. Implications for a common vicilin/legumin structure and the genetic engineering of seed storage proteins // J. Mol. Biol. - 1994. - Vol.238. - P.748-776.

14. Schlesier B., Manteuffel R., Armin R., Jüttner G. A simple method for preparation of phaseolin // Biochem. Physiol. Pflanz. - 1984. - Vol.179. - P.665-678.

15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the hed of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol.227. - P.680-685.

16. Knowland J. Protein synthesis directed by the RNA from a plant virus in a normal animal cell // Genetics. - 1974. - Vol.78. - P.383-394.

17. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Research. - 2000. - Vol.28. - P.235-242. - (http://www.pdb.org/)

18. Guex N. and Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. - 1997. - Vol.18. - P.2714-2723. - (http://www.expasy.org/spdbv/)

19. Boyland M.T. and Sussex I.M. Purification of an endopeptidase involved with storage protein degradation in Phaseolus vulgaris L. cotyledons // Planta. - 1987. - Vol.170. - P.343-352.



146

20. Nielsen S.S., Deshpande S.S., Hermodson M.A., Scott M.P. Comparative digestibility of legume storage proteins // J. Agr. Food Chem. - 1988. - Vol.36. - P.896-902.

21. Jivotovskaya A., Senyuk V., Rotari V., Horstmann C. and Vaintraub I. Proteolysis of phaseolin in relation to its structure // J. Agr. Food Chem. - 1996. - Vol.44. - P.3768-3772.

22. Doyle J.J, Schuler M.A., Godette W.D., Zenger V., Beachy R.N. and Slightom J.L. The glycosilated seed storage proteins of Glycine max and Phaseolus vulgaris. Structural homologies of genes and proteins // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol.261. - P.9228-9238.

23. Sturm A., van Kuik J.A., Vliegenthart J.F.G., and Chrispeels M.J. Structure, position, and biosynthesis of the high mannose and the complex oligosaccharide side chains of the bean storage protein phaseolin // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol.262. - P.13392-13403.

24. Lioi L., Bollini R. Contribution of processing events to the molecular heterogeneity of four banding types of phaseolin, the major storage protein of Phaseolus vulgaris L. // Plant Mol. Biol. - 1984. - Vol.3. - P.345-353.

25. Bollini R, Vitale A. and Chrispeels M.J. In vivo and in vitro processing of seed reserve protein in the endoplasmic reticulum: Evidence for two glycosylation steps // J. Cell Biol. -1983. - Vol.96. - P.999-1007.

26. Stockman D.R., Hall T.C. and Ryan D.S. Affinity chromatography of the major seed protein of the bean (Phaseolus vulgaris L.) // Plant Physiol. - 1976. - Vol.58. - P.272-275.

27. Vaintraub I.A., Bassüner R. and Shutov A.D. The action of trypsin and chymotrypsin on the reserve proteins of some leguminous seeds // Nahrung. - 1976. - Vol.20. - P.15-21.

28. Romero J. and Ryan D.S. Susceptibility of the major storage protein of the bean, Phaseolus vulgaris L., to in vitro enzymatic hydrolysis // J. Agric. Food. Chem. - 1978. - Vol.26. - P783-788.

29. Liener I.E., Thamson R.M. In vivo and in vitro studies of the digestibility of the major storage protein of the navy bean (Phaseolus vulgaris) // Qual. Plant. Foods Hum. Nutr. - 1980. - Vol.30. - P.13-25.

30. Tulloch P.A. and Blagrove R.J. Electron microscopy of seed-storage globulins // Arch. Biochem. Biophys. - 1985. - Vol.241. - P.521-532.

31. Lawrence M.C., Suzuki E., Varghese J.N., Davis P.C., Van Donkelaar A., Tulloch P.A. and Colman P.M. The three-dimensional structure of the seed storage proteins phaseolin at 3 Å resolution // EMBO J. - 1990. - Vol.9. - P.9-15.

32. Sun S.M., McLeester R.C., Bliss F.A. and Hall T.C. Reversible and irreversible dissociation of globulins from Phaseolus vulgaris seed // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol.249. - P.2118-2121.

33. Deshpande S.S., Damodaran S. Heat-induced conformational changes in phaseolin and its relation to proteolysis // Biochim. Biophys. Acta. - 1989. - Vol998. - P.179-188.

34. Vaintraub I.A. Kinetics of co-operative proteolysis // Nahrung. - 1998. - Vol.42. - P.59-60.

Acknowledgement: This research was supported by a CGP award MOB1-2822-CS-06 from CRDF.




147

INFLUENŢA OROBANCHE CUMANA WALLR. DE DIVERSĂ ORIGINE

ASUPRA CONŢINUTULUI DE ACIZI NUCLEICI LA FLOAREA-SOARELUI

Elena SAVCA, Victoria POPESCU, Maria DUCA

Catedra Biologie Vegetală The purpose of this work was to estimate the influence of broomrape (Orobanche cumana Wallr.) with different origin

(Moldova, Rostov, Volgagrad) on the content of NA (nucleic acids) in hybrids of the Valentino and Xenia varieties and in their parental lines.

Significant decrease of NA content in leaves of the genotypes infected with broomrape from three geographical areas has been obtained.

The degree of resistance of the studied genotypes by the total content of NA has been revealed: more resistant to broomrape was the Xenia variety, the population of local origin showed a greater tolerance in comparison with the populations from Rostov and Volgagrad.

Activitatea funcţională a genomului este redată de capacitatea de replicare a ADN-ului, de transcripţie a

ARN şi sinteza proteinelor, care reflectă realizarea potenţialului metabolic şi morfogenetic al genotipului [9]. Factorii de stres adesea blochează activitatea funcţională a ADN-ului şi sporesc stabilitatea cromatinei. Numeroase cercetări au demonstrat modificarea conţinutului de acizi nucleici sub acţiunea factorilor de stres [3-5,7,9,12,15]. Nagl şi Capesius [1] indică la variaţii excesive ale conţinutul de ADN nuclear – până la 60%, iar Michaelson [8] şi Cavallini [2] au detectat la unele linii de floarea-soarelui variaţii de 32% şi 58%. Şocul termic induce o reducere semnificativă a numărului cistronilor de ARNr. Media cópiilor de ADN ribozomal reducându-se cu 37% comparativ cu plantele crescute în condiţii normale [11]. Calitatea şi cantitatea luminii de asemenea influenţează asupra stabilităţii conţinutului de ADN la floarea-soarelui [10].

Abilitatea genomului de a răspunde la factorii de stres ar putea fi un mecanism de adaptare la schimbările din mediu.

Variaţiile depistate sunt într-o dependenţă strânsă atât de natura factorului stresogen, cât şi de particulari-tăţile genotipice ale organismelor cercetate [5,13].

În lucrarea de faţă ne-am propus studiul acţiunii lupoaiei (Orobanche cumana Wallr.) din diferite regiuni geografice asupra modificării conţinutului de acizi nucleici (AN) în frunzele de floarea-soarelui.

Material şi metode Caracteristica obiectului de studiu. Drept obiect de studiu au servit seminţele a doi hibrizi de floarea-

soarelui (Valentino şi Xenia) şi liniile lor parentale oferite de către AŞP „Magroselect” SRL (or. Soroca). Familiile de floarea-soarelui au fost infectate cu trei populaţii de lupoaie din diferite regiuni geografice:

Moldova, Rostov şi Volgograd. Condiţiile de cultivare in vivo. Plantele au fost crescute în vase de vegetaţie în care s-a introdus mixtura de

sol (nisip : turbă în raport de 1:1) uniform infectată cu seminţe de lupoaie (la 1 kg de amestec 0,8 g de seminţe). Vasele au fost expuse în camera de cultivare, la temperatura de 23-25°C, fotoperiodicitatea de 14-16 ore, umiditatea de 60% din capacitatea pentru apa solului.

Materialul a fost colectat după o săptămână din momentul apariţiei lupoaiei la suprafaţa solului. Plantele au fost sustrase din vase de vegetaţie, după ce au fost separate rădăcina, tulpina şi frunzele pentru analizele biochimice. Proba medie a fost colectată de la 5 plante din fiecare repetiţie a variantelor.

Metodele de cercetare. Conţinutul acizilor nucleici s-a determinat în materialul proaspăt după metoda spectrofotometrică [6].

Prelucrarea datelor s-a efectuat prin analiza dispersională, rezultatele au fost comparate în baza criteriului Fisher şi estimarea LSD pentru P = 0,95 şi P = 0,99 [14]. Calculele s-au realizat cu utilizarea aplicaţiei Microsoft Excel.

Rezultate şi discuţii Investigaţiile efectuate asupra genotipurilor studiate au remarcat diferenţe vădite în modificarea conţinu-

tului de acizi nucleici sumari (ADN şi ARN) la plantele infectate cu lupoaia.



148

Conţinutul de AN sumari la familia Xenia variază între 0,68 şi 1,69 mg/g (Tab.1). În condiţii normale de creştere AN sumari au valori în limitele 1,32-1,69 mg/g, cea mai mare valoare atestându-se la forma heterozigotă.

Pe fon de infecţie cu lupoaie se constată o micşorare semnificativă a AN în majoritatea cazurilor, cea mai vădită observându-se la genotipul homozigot patern la toate trei populaţii de lupoaie utilizate, mai pronunţat fiind la lupoaia din regiunea Rostov (0,68 mg/g masă proaspătă).

Tabelul 1

Influenţa O. cumana Wallr. asupra conţinutului de acizi nucleici în frunzele de floarea-soarelui (familia Xenia, mg/g masă proaspătă)

ARN ADN Varianta Genotip M ± m td M ± m td AN

1,03 ± 0,012 0,29 ± 0,019 1,35 1,22 ± 0,012 0,12 ± 0,012 1,34 Martor F1 1,53 ± 0,025 0,16 ± 0,012 1,69 0.95 ± 0,015 4,7* 0,11 ± 0,012 8,5* 1,06 0,94 ± 0,009 18,6* 0,14 ± 0,006 1,3 1,08

Mol

dova

F1 1,47 ± 0,012 1,7 0,15 ± 0,015 0,9 1,61 0,70 ± 0,019 15,3** 0,11 ± 0,012 8,6* 0,81 0,57 ± 0,012 39,2** 0,11 ± 0,006 1,0 0,68

Rosto

v

F1 0,73 ± 0,01 29,2** 0,17 ± 0,01 0,4 0,90 1,03 ± 0,009 0,46 0,07 ± 0,007 11,8** 1,10 0,63 ± 0,015 30,5** 0,08 ± 0,009 3,1 0,71

Oro

banc

he c

uman

a W

allr

Vol

gogr

ad

F1 1,47 ± 0,015 1,7 0,15 ± 0,012 0,8 1,61 * - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie 95% ** - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie de 99% La atacul lupoaiei genotipul heterozigot depăşeşte genotipurile homozigote ca şi în cazul martorului (Fig.1),

dar are valori mai mici, cea mai mică atestându-se în varianta cu lupoaia de origine Rostov (0,90 mg/g).

Fig.1. Conţinutul de AN sumari în frunzele de floarea-soarelui la familia Xenia la acţiunea O. cumana Wallr.

Totodată, au fost depistate unele deosebiri în conţinutul ARN-ului şi ADN-ului (Tab.1). În acest context

se relevă o stabilitate a conţinutului ADN-ului la genotipurile homozigote. La nivelul populaţiilor de lupoaie studiate stabilitatea ADN cel mai bine s-a exprimat la plantele infectate cu lupoaie autohtonă.

Menţionăm că raportul ARN/ADN variază pe fon de infecţie (Tab.2). La genotipul homozigot matern se constată o creştere a raportului ARN/ADN, comparativ cu martorul, demonstrând creşterea activităţii funcţionale a aparatului ereditar prin intensificarea proceselor de transcripţie, pe când la forma homozigotă paternă şi cea heterozigotă acest raport scade, ceea ce poate fi condiţionat de blocarea procesului transcripţional.

1,35 1,34

1,69

1,06 1,08

1,61

0,810,68

0,9

1,1

0,71

1,61

0

0,2

0,40,6

0,8

1

1,21,4

1,6

1,8

1 2 3

cont

inut

ul A

N su

mar

i mg/

g martor moldova rostov volgograd

F1

Conţin

utul

de

AN

sum

ari,

mg/

g



149

Tabelul 2

Raportul acizilor nucleici (ARN/ADN) în frunzele de floarea-soarelui la acţiunea O. cumana Wallr. (familia Xenia, mg/g masă proaspătă)

Orobanche cumana Wallr. Genotip Martor

Moldova Rostov Volgograd 5,2 8,6 6,4 14,7 9,9 6,7 5,2 7,9 F1 9,6 9,8 4,3 9,2

Generalizând datele obţinute, constatăm că în cadrul familiei Xenia genotipul heterozigot în toate cele trei

variante studiate după conţinutul sumar de AN şi, în special, de ARN prevalează genotipurile homozigote parentale, iar linia homozigotă maternă are valori apropiate de varianta martor.

În cadrul familiei Valentino conţinutul sumar de AN variază în limitele 0,53-2,08 mg/g masă proaspătă. În condiţii normale, ca şi în cazul familiei Xenia, forma heterozigotă are valori cele mai mari – 2,08 mg/g comparativ cu formele homozigote parentale – 1,49 mg/g (Fig.2).

Datele prezentate în Tabelul 3 şi Figura 2 confirmă micşorarea conţinutului sumar de AN în frunzele plantelor infectate cu lupoaia din diferite regiuni geografice.

Tabelul 3

Influenţa O. cumana Wallr. asupra conţinutului de acizi nucleici în frunzele de floarea-soarelui (familia Valentino, mg/g masă proaspătă)

ARN ADN Varianta Genotip

M ± m td M ± m td AN

1,22 ± 0,015 0,27 ± 0,012 1,49 1,01 ± 0,012 0,48 ± 0,012 1,49 Martor F1 1,77 ± 0,015 0,31 ± 0,012 2,08 0,63 ± 0,024 20,3** 0,053 ± 0,003 17,4** 0,69 0,69 ± 0,009 21,5** 0,11 ± 0,009 25,3** 0,80

Mol

dova

F1 1,02 ± 0,024 26,7** 0,13 ± 0,009 12,5** 1,16 0,82 ± 0,012 20,4** 0,09 ± 0,012 10,6** 0,91 0,50 ± 0,015 27,1** 0,09 ± 0,012 22,7** 0,59

Ros

tov

F1 1,10 ± 0,027 21,8** 0,16 ± 0,009 10,1** 1,26 0,40 ± 0,012 42,8** 0,13 ± 0,006 10,8** 0,53 1,03 ± 0,035 0,36 0,11 ± 0,012 21,8** 1,14

Oro

banc

he c

uman

a W

allr

Vol

gogr

ad

F1 1,67 ± 0,025 3,67 0,17 ± 0,012 8,6* 1,87 * - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie 95% ** - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie de 99% Genotipul heterozigot infectat, după conţinutul AN, de asemenea depăşeşte genotipurile homozigote

parentale. La această familie toate cele trei populaţii utilizate au avut în medie aceeaşi acţiune, în comparaţie cu familia Xenia, unde se observă o diferenţă clară în acţiunea fiecărei populaţii de lupoaie.

Conţinutul ARN-lui şi al ADN-lui în cazul familiei Valentino variază în cadrul genotipurilor, precum şi sub acţiunea populaţiilor de lupoaie. Raportul ARN/ADN la plantele infectate creşte, comparativ cu martorul, la majoritatea genotipurilor, excepţie făcând doar genotipul homozigot matern pe fonul lupoaie din Volgograd (Tab.4).



150

Fig.2. Conţinutul de AN sumari în frunzele de floarea-soarelui la familia Valentino la acţiunea O. cumana Wallr.

Tabelul 4

Raportul acizilor nucleici (ARN/ADN) în frunzele de floarea-soarelui la acţiunea O.cumana Wallr. ( familia Valentino, mg/g masă proaspătă)

Orobanche cumana Wallr Genotip Martor Moldova Rostov Volgograd

4,5 10,5 9,11 3,1 2,1 6,3 5,6 9,4 F1 5,7 7,9 6,87 9,8

Creşterea raportului respectiv indică la intensificarea transcripţiei anumitor gene implicate în răspunsul

defensiv al plantei-gazde la atacul lupoaiei. Studiul mai detaliat al influenţei lupoaiei de origine autohtonă asupra metaboloismului nucleic la plan-

tulele diferitelor genotipuri de floarea-soarelui a permis să constatăm că conţinutul AN la nivelul părţii aeriene a genotipurilor studiate este, în medie, mai mic decât în frunze şi variază de la 0,43 până la 0,96 mg/g masă proaspătă. Genotipurile heterozigote ale familiilor studiate atât în condiţii normale, cât şi la atacul lupoaiei atestă valori mai mari la genotipurile parentale. Pe fon de infecţie are loc diminuarea conţinutului AN la majoritatea genotipurilor, cu excepţia genotipului homozigot patern Xenia şi genotipului homozigot matern Valentino, însă această creştere este nesemnificativă (Fig.3).

Fig. 3. Conţinutul de AN sumari la nivelul părţii aeriene de floarea-soarelui la familiile Xenia şi Valentino la acţiunea O. cumana Wallr.

Rezultatele obţinute relevă o diminuare atât a conţinutului de ARN, cât şi a conţinutului de ADN (Tab.5).

1,49 1,49

2,08

0,690,8

1,160,91

0,59

1,26

0,53

1,14

1,87

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3

Con

tinut

ul A

N su

mar

i mg/

g martor moldova rostov volgograd

F1

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

Con

tinut

ul A

N, m

g/g

mas

a ve

rde

F1

control infectat

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Con

tinut

ul A

N, m

g/g

mas

a ve

rde

F1

control infectat

XENIA VALENTINO

Conţin

utul

de

AN

sum

ari,

mg/

g

Conţin

utul

AN

, mg/

g m

asă

verd

e

Conţin

utul

AN

, mg/

g m

asă

verd

e



151

Tabelul 5 Conţinutul de acizi nucleici la nivelul părţii aeriene la familiile Xenia şi Valentino sub influenţa

O.cumana din Moldova (mg/g masă proaspătă)

ARN ADN

Fam

ilia

Gen

otip

Var

iant

a

AN

M ± m td M ± m td A

RN

/AD

N

Control 0,43 0,51 ± 0,02 0,051 ± 0,006 10,0 Infectat 0,46 0,42 ± 0,08 1,18 0,047 ± 0,004 0,58 8,94

Control 0,56 0,63 ± 0,02 0,060 ± 0,002 10,5 Infectat 0,52 0,39 ± 0,05 4,44** 0,054 ± 0,008 0,73 7,22 Control 0,77 0,69 ± 0,03 0,076 ± 0,018 9,08 Va

lent

ino

F1 Infectat 0,69 0,48 ± 0,04 3,81* 0,043 ± 0,006 1,75 11,16 Control 0,56 0,61 ± 0,05 0,052 ± 0,002 11,73

Infectat 0,54 0,50 ± 0,04 1,64 0,044 ± 0,012 0,68 11,36 Control 0,66 0,74 ± 0,03 0,058 ± 0,002 12,76 Infectat 0,78 0,51 ± 0,01 0,80 0,046 ± 0,001 6,00** 11,09 Control 0,96 0,90 ± 0,01 0,064 ± 0,002 14,06

Xeni

a

F1 Infectat 0,8 0,72 ± 0,01 10,59** 0,055 ± 0,007 1,25 13,09 * - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie 95% ** - diferenţa este statistic autentică cu un prag de semnificaţie de 99% Raportul ARN/ADN la plantele infectate comparativ cu martorul scade la majoritatea genotipurilor,

excepţie făcând doar genotipul heterozigot al familiei Valentino (Tab.5). Astfel, rezultatele obţinute denotă o legitate similară a datelor obţinute anterior în studiul modificării AN

în frunzele diferitelor genotipuri de floarea-soarelui. Concluzii

1. S-a constatat o diminuare vădită faţă de varianta martor a conţinutului de AN în frunzele genotipurilor studiate cultivate pe fon infectat cu lupoaia din toate cele trei regiuni de răspândire.

2. S-a atestat că conţinutul de AN sumari în frunzele genotipurilor heterozigote Xenia şi Valentino cultivate pe fon infectat este mai sporit faţă de genotipurile homozigote parentale. Aceasta majorare fiind exprimată pe contul creşterii ARN-lui.

3. Studiul comparativ al acestor două familii atestă o variaţie a raportului ARN/ADN sub acţiunea parazitului, determinată de intensificarea sau blocarea proceselor de transcripţie.

4. Cercetările efectuate au pus în evidenţă că populaţia de origine autohtonă manifestă o acţiune mai tole-rantă comparativ cu populaţia din Rostov şi Volgograd asupra conţinutului sumar de AN, în special la repre-zentanţii familiei Xenia.

Referinţe:

1. Capesius I., Bierweiler B., Bachmann K., Rücker W., Nagl W. An A + T-rich satelitte DNA in a monocotyledonous plant // Cymbidium. Biochim. Biophys. Acta. - 1975. - Vol.395(1). - P.67-73.

2. Cavallini A., Zolfino C., Natali L., Cionini G., Cionini P.G. Nuclear DNA changes within Helianthus annuus L.: origin and control mechanism // Theor. Appl. Genet. - 1989. - Vol.77. - P.12-16.

3. Duca M., Savca E. Acţiunea giberelinelor exogene asupra conţinutului de acizi nucleici la diferite genotipuri de floarea-soarelui // Anale Ştiinţifice ale USM. - 1998. - P.132-136.

4. Duca M., Savca E., Bîrsan A. Modificarea conţinutului de acizi nucleici la diferite genotipuri de Helianthus annuus L. pe fon de stres // Simpozion Aniversar „90 ani de învăţământ agrochimic universitar” (Iaşi, România). CD, 2002.

5. Duca M., Savca E. Diminuarea ontogenetică a acizilor nucleici la diferite genotipuri de floarea-soarelui // Genetica şi ameliorarea plantelor în Republica Moldova. - 1998. - P.60-63.



152

6. Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetală. Tehnici speciale de laborator. - Chişinău: USM, 2001, p.173. 7. Jui X.C., Jones K., Dickinson H.G. DNA syntesis and cytoplasmic differentiation in vegetal cells of normal and

cytoplasmically male sterilele lines of Petinia hybrida // Teor. Appl. Genet. - 1987. - No74. - P.846-851. 8. Michaelson M.J., Price H.J., Johnston, J.S. and Ellison, J.R.. Variation of nuclear DNA content in Helianthus annuus

(Asteraceae) // Am. J. Bot. - 1991. - Vol.78. - P.1238-1243. 9. Nagl W. Nuclear organization // Ann. Rev. Plant Physiol. - 1976. - Vol.27. - P.39-63. 10. Pirce J.H., Johnson J.S, 1996. Influence of light on DNA content of Helianthus annuus L. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. - Vol.93. - P.11264-11267. 11. Waters, E.R. and B. A. Schaal. Heat shock induces a loss of rDNA repeats in Brassica nigra. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. - 1996. - Vol.93. - P.1449-1452. 12. Барановский А.Т., Вареникова Т.В. Изменение содержания нуклеиновых кислот в онтогенезе подсолнечника

в связи с фосфорным питанием // Физиология и биохимия культурных растений. - 1973. - Т.5. - 3. - C.298-301. 13. Гилязтдвинов Ш.Я., Каталетдинова М.А. и др. Синтез нуклеиновых кислот у гетерозистых гибридов и их

родительских форм при действии температур и биохимические аспекты гетерозиса и гомеостаза у растений // Уфа. - 1976. - С.239.

14. Доспехов А. Методы полевого опыта. - Москва: Агропромиздат, 1985. 15. Удовенко Г.В., Кожушко Н.Н. Характер метаболизма белка и нуклеиновых кислот при адаптации к различным

типам засух // Физиология Растений. - 1975. - Т.22. - Вып.6. - С.1239-1243.

Notă: Lucrarea a fost efectuată în cadrul Proiectului instituţional 06.407.026F finanţat de CSŞDT al AŞM.




153

STORAGE GLOBULIN AND ASPARTIC PROTEINASE FROM UNGERMINATED

CACAO SEEDS: KINETICS AND MECHANISM OF IN VITRO PROTEOLYSIS

Vitalyi SENYUK, Hrinrich HEINRICHS*, Jürgen VOIGT*, Andrei SHUTOV, Böle BIEHL*

Laboratory of Plant Biochemistry *Institute of Botany, Technical University of Braunschweig, Germany Din seminţele negerminate de cacao a fost obţinută proteina de rezervă 7S globulina şi proteinaza aspartică purifi-

cată prin cromatografia de afinitate pe pepstatin A imobilizat. Ca şi celelalte proteinaze aspartice din plante, proteinaza aspartică din cacao este un heterodimer al lanţului polipeptidic mare şi mic (34 kDa şi 16 kDa, respectiv). Hidroliza globulinei 7S cu proteinaza aspartică a fost caracterizată prin SDS-electroforeză şi prin determinarea proteinei reziduale şi a azotului aminic în hidrolizat. Au fost detectate trei reacţii independente de ordinul pseudo-întîi: proteoliza rapidă nelimitată (cooperativă) a parţii nestabile (aproximativ 20%) din globulina 7S sumară, care rapid se elimină la începutul incubaţiei, proteoliza cooperativă lentă a reziduului globulunei 7S stabile şi proteoliza limitată comparativ lentă, care constă în scindarea singulară a subunităţilor globulinei 7S. Rezultatele obţinute descriu degradarea globulinei 7S catalizată de proteinaza aspartică la fermentarea boabelor de cacao.

Proteins and proteolytic enzymes in cacao (Theobroma cacao L.) seeds and proteolysis during cocoa bean

fermentation have been studied with respect to cocoa quality [1-5]. 7S globulin (vicilin) was found to be one of the two storage proteins in cacao seeds [1,4,6,7]. The mature cacao 7S globulin is derived from a 67 kD precursor [6,7], which is cleaved to form a 45-47 kD chain [4,6,8] characteristic of many ordinary vicilins [9]. Two chains of lower molecular mass (31 kD and 16 kD) found to be the other constituents of cacao 7S globulin molecule [4,6] probably resulted from an additional posttrsnslational cleavage some of the 45-47 kD chains. Like other 7S globulins, the cacao 7S globulin molecule seems to be a trimer assembled by the random joining of several non-identical but homologous 45-47 kD and (31+16) kD chains.

Ungerminated cacao seeds are abundant in aspartic proteinase (CAP) accounting for about 98 per cent of the total endoproteolytic activity at pH 4.5 [10]. The enzyme is responsible for 7S globulin breakdown during both fermentation of cocoa beans [1] and autolysis of crude extracts from acetone powder of ungerminated cacao cotyledons [10]. The CAP represented by two closely similar sequences TcAp1 (emb|CAC86003) and TcAp2 (emb|CAC86004) [11] belongs to a highly conserved family of plant aspartic proteinases [12].

Physiological role of CAP in cacao seeds remains unclear. In spite of a high activity of CAP both in un-germinated seeds and seedling cotyledons, the in vivo degradation of the 7S globulin is delayed for about 10 days [1]. Hence, a mechanism of 7S globulin protection against CAP activity should exist. It should be noted that in the experiments cited above [1,10] the CAP has not been purified and might contain admixtures of other proteinases. As it was shown recently, a papain-like proteinase abundant in Phaseolus vulgaris seedling cotyledons acquires the ability to catalyze unlimited degradation of 7S globulin only after its limited proteo-lysis carried out by another endogenous proteinase, namely Asn-specific legumain [13]. Therefore, the ability of CAP to degrade directly the native (non-modified proteolytically) 7S globulin is probable but not proven.

Purification both of CAP and 7S globulin from ungerminated cacao seeds was carried out in this investi-gation. The action of pure CAP on native 7S globulin was followed. Mixed-type limited and unlimited (co-operative) proteolyses occurring in parallel was observed and its kinetics was described according to an approach developed earlier [14].

Materials and Methods Cacao (Theobroma cacao L.) seeds from genetically undefined Forastero pods provided by CRIG, Tafo,

Ghana (Amelonado type) and by MARDI, Malaysia (mixed hybrids) were extracted from ripe, healthy pods about 3 to 5 days after harvest. Acetone dry powder was prepared from cotyledons as described previously [3] by shock freezing, lyophylization, extraction of fat by petroleum benzene followed by complete elimination of polyphenols and purines using ice-cold acetone and mixtures of acetone/water 80:20 (by volume) contain-ning 0.1 % (by volume) thioglycollic acid.



154

Purification of CAP. All procedures were carried out at 4°C or in ice in presence of 0.02% NaN3. The enzyme was extracted from 10 g of acetone powder by 200 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2.0 mM EDTA (Buffer 1). The supernatant was loaded into a column (2.6 x 18 cm) of Phenyl Sepharose CL-4B equili-brated with Buffer 1. After washing of the column with the same buffer, the enzyme was eluted by water, adjusted to pH 4.3 by Buffer 2 (0.1 acetate pH 4.0, 0.5 M NaCl) and loaded into a column (bed volume 2.0 ml) of Pepstatin A agarose (Sigma) equilibrated with Buffer 2. Binding of CAP to the resin was allowed overnight by recycling the enzyme solution through the column. After removal of the non-adsorbed fraction, the column was washed with 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl. CAP was eluted with 0.1 M bicarbonate, pH 10.0, 0.5 M NaCl. The enzyme solution was adjusted to pH 4.3 with Buffer 2 and re-chromatographed.

Assay of CAP activity. The activity was assayed at pH 4.5 (0.15 M citrate/phosphate buffer adjusted by NaCl to ionic strength 0.5), 30°C, using bovine serum albumin as a substrate (final concentration 1%). The reaction was stopped by addition of trichloroacetic acid (final concentration 4%). Amino nitrogen of the super-natant was determined as described earlier [14] using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. The enzyme activity was expressed in international units IU (µmoles per min of amino groups released). The protein in the enzyme preparations was determined according to Bradford [15 using bovine serum albumin as a standard.

Purification of 7S globulin. All the solutions contained 0.02% NaN3. The chromatographic procedures were carried out at room temperature. The acetone dry powder (10 g) was extracted three times in an ice bath by 200 ml of buffer 1 containing proteinase inhibitors (15 µM pepstatin A, 5 mM iodoacetic acid and 5 mM phenylmethylsulfonylfluoride). The supernatants containing protein contaminants were discarded. The pellet was extracted twice by 100 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.5 M NaCl. The combined extracts were adjusted to ionic strength 4.0 by addition of solid (NH4)2SO4 and loaded into a column (2.6 x 18 cm) of Phenyl Sepharose CL-4B equilibrated with 1.33 M (NH4)2SO4. The column was washed by 1.33 M (NH4)2SO4 adjusted to pH 8.0 by NH4OH, and the 7S globulin was eluted with 0.17 M (NH4)2SO4 adjusted to pH 8.0. The globulin solution was concentrated by ultrafiltration, dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, and subjected to gel filtration on a column (2.6 x 80 cm) of Sephacryl S-300 equilibrated with the same buffer. The purified 7S globulin was concentrated by ultrafiltration.

Polyacrylamide gel electrophoresis. SDS-electrophoresis (SDS-PAGE) was carried out on 15% gels according to Laemmli [16] using Sigma molecular mass standards. Image analysis software (QuantiGel Corp., U.S.A) was used for quantitation of polypeptides.

Kinetics of hydrolysis of 7S globulin by CAP. According to Shutov et al. [14], unlimited (cooperative) proteolysis occurs as a pseudo first order reaction described by two equations. First equation, P(t) = P0e-kt, where P(t) and P0 are the residual and initial concentrations (by mass) of the protein substrate, respectively, k is the rate constant, and t is duration of proteolysis. Second equation, N(t) = N(1-e-kt), where N is the molar concentration of peptides per one molecule of protein substrate that are formed by exhaustive cooperative proteolysis.

7S globulin and CAP solutions in 0.15 M citrate/phosphate buffer, pH 4.5, adjusted by NaCl to ionic strength 0.5, 0.02 % NaN3, were mixed and incubated at 30°C (6.0 ml of incubation mixture containing 18 mg of 7S globulin and 0.1 IU of CAP). In aliquots taken after the indicated time periods, the reaction was stopped by addition of trichloroacetic acid up to a final concentration of 6% (w/v). The precipitated protein was determined according to Bradford [15]. Amino nitrogen in the supernatant was determined as described earlier [14] using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. The data obtained were expressed as P0 taken as unit and respective P(t), and as N(t) [14].

Detection of glycosylated polypeptides. Polypeptides separated by SDS-PAGE were analyzed for carbo-hydrate side chains essentially as described by O’Shanessy et al. [17] by use of the DIG glycan detection kit (Boehringer, Mannheim, Germany).

Results Purification of CAP. Phenyl Sepharose chromatography is a convenient way of preliminary purification of

CAP (Table). The 1.3-1.6-fold increase of the total proteolytic activity was observed in different experiments after affinity chromatography. Possibly, it is resulted from removal of an inhibitory factor (either specific or non-specific). SDS-PAGE revealed several bands of contaminating proteins completely eliminated by re-ch-romatography. According to SDS-PAGE of the final enzyme preparation (Fig.1), the CAP is a hetero-dimer of 33.9 kD and 15.7 kD chains. This structure is characteristic most of plant aspartic proteinases [12] including the enzyme from barley grains, whose 3 D structure is available (pdb|1QDM).



155

Table Purification of CAP

Purification step Volume, ml

Protein, mg

Activity IU

Specific activity, IU/mg

Yield, %

Purification -fold

Crude extract Phenyl Sepharose

Pepstatin Sepharose: First run Second run

175 27.0

8.1 6.6

444 61.0

2.20 1.69

11.9 3.76

4.82 5.86

0.0268 0.0616

2.19 3.47

100 31.6

40.5 49.2

1 2.30

81.8 129

In the barley enzyme, 32 kD and 16 kD chains are linked by a disulfide bridge [18] absent in the case of CAP

(Fig.1). This distinction might be explained in a following way (Fig.2). Plant aspartic proteinases are synthe-sized as precursors containing internal plant specific insert (PSI) either totally or partially posttranslationally removed generating long N-terminal and short C-terminal polypeptides of mature enzymes [12. All six disul-fide bonds in the precursors of plant aspartic proteinases are located within limits of long/short polypeptides and PSI. The latter contains Cys residues in its C-/N-termini, which are involved in formation of the disulfide bond C289-C383 (pdb|1QDM). Therefore, only incomplete removal of the PSI might explain disulfide bridging of the polypeptides in mature molecule of the barley enzyme [18]. And vice versa, the absence of a disulfide bond between CAP chains implies either complete or at least extended posttranslational removal of the PSI.

1 2

34 kD →

16 kD →

Fig.1. SDS-PAGE of purified CAP in reducing (1) and non-reducing (2) conditions. A slight shift of the position of both the bands in non-reducing conditions indicates presence of intra-chain

(rather than inter-chain) disulfide bonds in the CAP dimer.

Purification of 7S globulin. Phenyl Sepharose chromatography revealed two 7S globulin fractions eluted with 0.17 M (NH4)2SO4 and water, respectively. Enhanced surface hydrophobicity of the water-eluted fraction might be resulted from partial denaturing of the 7S globulin. This fraction thereunto containing most of contaminating proteins was discarded. The residual contaminating proteins were removed by gel filtration at low ionic strength (≤ 0.01) resulting in purity of 7S globulin (see Fig.3, zero time). During gel filtration, the 7S globulin is eluted as a trimer or as a dimer of trimers at a high and low ionic strength, respectively (data not shown). Dimerization of trimers at low salt concentration also is characteristic of soybean 7S globulin [19].

_________S-S__________ Long chain | | Short chain 1QDM AIADSGTSLLAGPTAIITEINEKIGAAGVVSQECKTIVSQYG//TQDLILDYVNQLCNRLPSPMGESAVDCGSLG CAP AIADSGTSLITGPTAIIAQVNHAIGASGVVSQECKTVVSQYG//TQERILEYINELCDRLPSPMGESAVDCSSLS ********* ****** * *** ********* ***** ** * * * ** ************* **

Fig.2. Possible explanation for the absence/presence of inter-chain disulfide bridge in mature plant aspartic proteinases from barley grains (pdb|1QDM) and cacao seeds (CAP).

Underlined characters indicate position of a 103-residue plant specific insert (PSI). Asterisks denote sequence identities. Non-cleaved off C-/N-terminal segments of the PSI in the barley proteinase, which contain Cys residues, are suggested

to be responsible for the retention of a disulfide bridge between long and short polypeptides in the mature enzyme.



156

45.7 kD → 31.0 kD → ← 27.9 kD

← 20.4 kD 16.0 kD → ← 14.6 kD 0 1 4 8 12 24 30 48

Fig.3. Limited proteolysis of cacao 7S globulin by CAP followed by SDS-PAGE of the residual protein. The numbers below lanes correspond to the duration of proteolysis (hrs). The bands of intact 7S globulin chains

(left side) and their fragments (right side) are shown according to their apparent molecular masses calculated using co-running molecular mass standards.

A hypothetical scheme of 7S globulin limited proteolysis catalyzed by CAP. Three polypeptide chains of apparent molecular masses 45.7 kD, 31.0 kD and 16.0 kD as the constituents of the intact mature 7S globulin were displayed by SDS-PAGE (Fig.3, zero time). Equimolarity of 31 kD and 16.0 kD chains (molar ratio 1:0.96) was found from SDS-PAGE data in accordance with the presumed origin of both from posttranslationally cleaved 45.7 kD chain [4,6]. According to Spencer and Hodge [6], the 31 kD chain corresponds to the N-terminal part of the initial non-cleaved (31+16) polypeptide.

SDS-PAGE revealed three polypeptide fragments (27.9 kD, 20.4 kD and 14.6 kD) formed due to limited proteolysis during the action of CAP on 7S globulin (Fig.3). The origin of these fragments shown in a hypot-hetical scheme (Fig.4) can be deduced on the basis of following data. The 20.4 kD fragment was found gly-cosylated (data not shown). A single potential glycosylation site in cacao 7S globulin sequence (prf|1905429A) is located at the N-terminus of the mature subunits. Thus, the 20.4 kD fragment (as well as the 31 kD chain [6]) belongs to the N-terminal part of the subunit suggesting formation the 20.4 kD fragment from both 45.7 kD and 31 kD chains.

Kinetics of mixed-type proteolysis of 7S globulin by CAP. Linearity of the plot lnP vs t was observed after 1.5-2 hrs of the reaction during all the subsequent period studied up to the breakdown of at least 80 % of the initial protein (Fig.5A). Hence, the decrease in P value during the linear second stage of proteolysis is the result only of the cooperative process in spite of limited proteolysis that occurs in parallel (Fig.3,4). The preservation of linearity of the plot during mixed-type (cooperative + limited) proteolysis of the 7S globulin can be regarded as an indication of (i) the constancy of the molecular mass of non-dissociated protein substrate at all the linear region of the plot lnP vs t irrespective of cleavage of its chains; (ii) the equality of the rate constants of cooperative proteolysis of the intact 7S globulin and of that modified by limited proteolysis, which are both present in the reaction medium (Fig.3).

45.7 kD 31 kD 16 kD |-----------↓------------| |-----------↓-----| |--------| 20.4 kD 20.4 kD |-----------| |-----------| 27.9 kD 14.6 kD |------------| |-----| 16 kD |--------|

Fig.4. A hypothetical scheme of limited proteolysis of cacao 7S globulin chains carried out by CAP. Intact 7S chains and their fragments are designated in accordance with their apparent molecular masses determined by SDS-PAGE. Identical single cleavage points in 45.7 kD and (31+16) kD subunits might explain formation of all

the three polypeptide fragments revealed by SDS-PAGE (Fig.3). According to kinetic analysis (Fig.5) limited proteolysis of the 7S globulin is not accompanied with detachment of any low-molecular mass peptides.



157

0 10 20 30 40 50

-1,8-1,6-1,4-1,2-1,0-0,8-0,6-0,4-0,20,00,2

-2

-1

-3

I

II

III

Duration, h

A

lnP lnPf

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

N(t)

1-e-kt

I

II

I

B

Fig.5. Kinetics of hydrolysis of cacao 7S globulin by CAP.

A, kinetic curves describing cooperative and limited proteolyses. I, the plot lnP vs t. The concentration (by mass) of the total residual protein P(t) is expressed as a fraction of its initial concentration P0. II, the plot lnPf vs t.

The concentration (by mass) of quickly hydrolyzed residual protein Pf is expressed as a fraction of the initial concentration of the total protein P0. The Pf(t) values calculated from the plot I were taken as differences between P(t)

values, experimental and corresponding to the linear part of the plot I, respectively. III, the plot lnI vs t, where I is a relative intensity of the sum of 45.7 kD and 31 kD bands. B, current molar concentration N(t) of peptides formed by cooperative proteolysis from one mole of protein substrate plotted vs (1-ekt) (see Materials and Methods). The N(t) values were calculated for total 7S globulin P, rate constant ks (I) and for its unstable part Pf, rate constant kf, (II). Concentrations of peptides derived from the unstable part of the 7S globulin were taken as an absolute difference

between N(t) values, experimental and corresponding to the linear part of the plot I, respectively. Note: the relationship II was plotted on a twofold scaled down abscissa.

Curvilinear initial part of the plot lnP vs t probably results from the summation of slow and fast pseudo first order reactions (Fig.5A) of sharply different rate constants ks and kf (ks/kf = 1:34). No indications were obtained for the occurrence of a quick limited proteolysis during the first two hrs of the reaction (Fig.3). Therefore, both the quick and slow components of the proteolysis occur via cooperative mechanism. This implies that the initial 7S globulin preparation consists of slowly and quickly hydrolyzed parts (Ps and Pf, respectively). The Ps value calculated by extrapolation of the linear part of the plot lnP vs t to zero time is equal to 0.79. Probably, the existence of two 7S globulins different from each other in susceptibility to cooperative proteolysis is a consequence of its heterogeneity. Recently, we observed that the susceptibility to cooperative proteolysis of Ph. vulgaris 7S globulin depends on subunit composition of its trimers [20].

Along the action of CAP, limited proteolysis consists in a single cleavage of initial 45.7 kD and 31 kD chains. Therefore, gradually decreased values of relative intensity of the sum of these bands I can be used to describe kinetics of 7S globulin limited proteolysis that should be a pseudo-first order reaction [14]. Indeed, the plot lnI vs t is linear during the second stage of proteolysis (Fig.5B). The corresponding rate constant ki is 2.2 times lower than the ks value. This conforms to the detection of a relatively large quantity of the 7S globulin chains, which are still intact even after breakdown via cooperative mechanism of the major part of the initial protein (Fig.5A).

At the first stage of proteolysis, because of the great difference in the rate constants ki and kf (ki/kf = 1:70), the concentration Pf of the unstable part of the 7S globulin declines rapidly by cooperative process, whereas its limited proteolysis is negligible. Therefore, the relative concentration I of the intact protein decreases rapidly at the first stage (Fig. 5 A) because of quick elimination of non-cleaved 7S globulin chains via coope-rative process. The extrapolation of the linear part of the plot III to zero time leads to apparent value Is coin-cided with relative concentration Ps of the stable part of the 7S globulin.

To describe kinetics of formation of peptides derived from exhaustive cooperative proteolysis of stable Ps and unstable Pf parts of the 7S globulin we used rate constants ks and kf, respectively, calculated from Fig.5A. The resulted plots N(t) vs (1-ekt) revealed linearity at the second slow and at the first quick stages of proteolysis (Fig.5 B, the plots I and II, respectively).



158

Discussion

Utmost precautions were taken to prevent in vitro proteolytic modification of 7S globulin during prepa-ration of dry acetone powder from cacao cotyledons and during isolation of the 7S globulin. A portion of the 7S globulin of heightened surface hydrophobicity presumably corresponding to denatured protein was elimi-nated by Phenyl Sepharose chromatography. Therefore, it is likely that at least the relatively stable part (79%) of 7S globulin preparation studied is really native. It can be directly in vitro degraded by CAP preparation containing no admixtures. Thus, the mentioned above in vivo protection of the 7S globulin against CAP activity might be due to their different cellular compartmentation (or even sub-compartmentation, see [21] for references).

Sequence information on cacao 7S globulin subunits is scanty and sometimes even confusing. Several incomplete sequences reveal 99-100% identity to two complete sequences currently available (emb|CAA44493 and prf|1905429A). The complete sequences also reveal 100% identity in 502-residue region, which covers signal peptide, the N-terminal extension posttranslationally removed, and almost total sequence of the mature protein. The region that probably form the C-terminal α-helix domain in prf|1905429A is completely absent in emb|CAA44493. Thus, the latter cannot be involved in formation of 7S trimer characteristic of any genuine vicilin. The source of this confusion is a mystery, and one can conclude that only a single sequence of cacao 7S globulin (prf|1905429A) really is available.

Most probably, subunit structure of cacao 7S globulin is as complicated as it was shown for other seed vicilins (i.e. composed of homologous but non-identical subunits [9]). Possibly, additional posstranslational cleavage that forms 31 kD/16 kD polypeptide pair occurs in a subunit containing specific cleavage site absent in other subunits; this phenomenon is known for some other storage globulins (see [21] for references). Similarly, the presence of the stable and unstable parts in cacao the 7S globulin preparation might be due to heterogeneity of its natural trimers. As it was mentioned above, we found that the stability of Ph. vulgaris 7S globulin depends on subunit composition of its trimers [20].

Degradation of seed storage globulins by endogenous papain-like proteinases and trypsin starts with quick limited proteolysis, which consists in cleavage of specifically extended hydrophilic inserts of a high susceptibility to proteolytic attack [21]. These inserts easily recognizable in cacao 7S globulin (the inter-domain linker and the EF loop in the C-terminal module) are hydrophilic as well. They probably are inacces-sible to CAP, which like other aspartic proteinases of the A1 family [12] should preferentially cleave peptide bonds between bulky hydrophobic side chains. Therefore, limited proteolysis of the 7S globulin by CAP is restricted to a single cleavage (roughly, at the beginning of the α-helix domain of the N-terminal module). It seems believable that the susceptibility of the region of this cleavage, which probably belongs to structurally ordered elements, should be rather low. Thus, the limited proteolysis of the 7S globulin occurs slowly in parallel to protein breakdown via cooperative mechanism.

The linearity of both the plots P(t) = P0e-kt and N(t) = N(1-e-kt) at the second stage of the reaction (after exhaustion of the unstable part) implies constancy of the summary molecular mass of the residual protein irrespective on cleavage of initial polypeptides. This circumstance allowed describing the kinetics of limited proteolysis that occurred as a pseudo-first order reaction as well as the cooperative process.

In summary, the described data shows the pattern of 7S globulin degradation catalyzed by CAP during cacao bean fermentation, which brings about the formation of cocoa flavor precursors [1,5,11].

References:

1. Biehl B., Wewetzer C., Passern D. Vacualar (storage) proteins in cocoa seeds and their degradation during germination and fermentation // J. Sci. Food Agric. - 1982. - Vol.33. - P.1291-1304.

2. Biehl. B., Brunner E., Passern D., Quesnel V.C., Adomako D. Acidification, proteolysis and flavor potential in fer-menting cocoa beans // J. Sci. Food Agric. - 1985. - Vol.36. - P.583-589.

3. Kirshoff P.M., Biehl B., Crone G. Peculiarity of the accumulation of free amino acids during cocoa fermentation // Food Chem. - 1989. - Vol.31. - P.295-311.

4. Voigt J., Biehl B., Kamaruddin S.W. The major seed proteins of Theobroma cacao L. // Food Chem. - 1993. - Vol.47. - P.145-151.

5. Voigt J., Biehl B., Heinrichs H., Kamaruddin S.W., Gaim Marsoner G., Hugi A. In vitro formation of cocoa specific aroma precursors: aroma-related peptides generated from cocoa-seed protein by co-operation of an aspartic endopro-tease and a carboxypeptidase // Food Chem. - 1994. - Vol.49. - P.173-180.



159

6. Spencer M.E., Hodge R. Cloning and sequencing of a cDNA encoding the major storage proteins of Theobroma cacao. Identification of the proteins as members of the vicilin class of storage proteins // Planta. - 1992. - Vol.186. - P.567-576.

7. McHenry L., Fritz P.J. Comparison of the structure and nucleotide sequences of vicilin genes of ccocoa and cotton raise questions about vicilin evolution // Plant Mol. Biol. - 1992. - Vol.18. - P.1173-1176.

8. Yavuz M.O., Ashton S.M., Deakin E.D., Spencer M.E., Sudbery P.E. Expression of the major bean proteins from Theobroma cacao (cocoa) in the yeasts Hansenuls polymorpha and Saccharomyces cerevisae // J. Biotechnol. - 1996. - Vol.18. - P.43-54.

9. Dunwell M.J. Structure, function, and evolution of vicilin and legumin seed storage proteins // In: Polysaccharides and polyamides in the food industry: properties, production, and patents (A. Steinbüchel, S.K.Rhee, eds.). WILEY-VCH Verlag, Weinheim. - 2005. - Vol.2. - P.707-738.

10. Biehl B., Heinrichs H., Ziegeler-Berghaisen H., Hammoor M., Senyuk V. The proteases of ungerminated cocoa seeds and their role in the fermentation process // Angew. Bot. - 1993. - Vol.67. - P.59-65.

11. Laloi M., McCarthy J., Morandi O., Gysler C., Bucheli P. Molecular and biochemical characterization of two aspartic proteinases TcAP1 and NcAP2 from Theobroma cacao seeds // Planta. - 2002. - Vol.215. - P.754-762.

12. Simőes I., Faro C. (2004) Structure and function of plant aspartic proteinases // Eur. J. Biochem. - 2004. - Vol.271. - P.2067-2075.

13. Zakharov A.D., Carchilan M., Stepurina T.G., Rotari V.I., Wilson K.A., Vaintraub I.A. A comparative study of the role of the major proteinases in the degradation of storage proteins in germinating common bean (Phaseolus vul-garis L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill) seeds // J. Exp. Bot. - 2004. - Vol.55. - P.2241-2249.

14. Shutov A.D., Pineda J., Senyuk V.I.., Reva V.A., Vaintraub I.A. Action of trypsin on glicinin: Mixed-type proteo-lysis and its kinetics. Molecular mass of glycinine-T // Eur. J. Biochem. - 1991. - Vol.199 - P.539-543.

15. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - Vol.72. - P.248-254.

16. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol.227. - P.680-685.

17. O’Shanessy D.J., Voorstad P.J., Quarles R.H. Quantitation of glycoproteins on electroblots using the biotin-strepta-vadin complex // Anal. Biochem. - 1987. - Vol.163. - P.204-209.

18. Sarkkinen P., Kalkinen N., Tilgmann C., Siuro J., Kervinen J., Mikola L. Aspartic proteinase from barley grains is related to mammalian lysosomal cathepsin D // Planta. - 1992. - Vol.186. - P.317-423.

19. Thanh V.H., Shibasaki K. Major proteins of soubean seeds. Subunit structure of β-conglycinin // J. Agric. Food Chem. - 1978. - Vol.26 - P.692-695.

20. Rudakova A., Rudakov S., Lapteva N., Morari D., Stepurina T., Rotari V., Kakhovskaya I., Wilson K., Fukuda T., Utsumi S., Shutov A. In vivo and in vitro limited proteolysis of phaseolin: facts, suggestions and problems // Anale stiinţifice ale USM, seria Ştiinţe chimico-biologice. - Chişinău: CEP USM. - 2007.

21. Shutov A.D., Blattner F.R., Bäumlein H., Müntz K. Storage and mobilization as antagonistic functional constraints on seed storage globulin evolution // J. Exp. Bot. - 2003. - Vol.54. - P.1645-1654. Acknowlegement. The authors are grateful to the Cocoa Research Institute of Ghana (CRIG) and the Malaysian Agricultural Research and Development Institute (MARDI), Cocoa and Coconut Division for providing freshly harvested cocoa pods.




160

PROTEIN STRUCTURE NOVELTY CREATED VIA INSERTION OF NON-CODING

ELEMENTS INTO CODING REGION OF SOME ARABIDOPSIS GENES

Andrei SHUTOV, Helmut BÄUMLEIN*, Lothar ALTSCHMIED*

Laboratory of Plant Biochemistry *Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, Germany

Prezenţa unui număr mare de repetări scurte (duplete) este caracteristică genomilor eucariotelor. În genomul Arabi-

dopsis am detectat peste 400 gene, în care segmentul regiunii de codificare este repetat în regiunea necodificată. Pentru estimarea abilităţii potenţiale a dupletelor cu crearea noutăţii în regiunile de codificare a genelor prin încorporarea ele-mentelor din regiunea necodificată am analizat 138 gene de Arabidopsis care conţineau duplete, pentru care este cunos-cută succesiunea mARN. Analiza evolutivă a acestor gene ne-a permis a urmări istoria formării dupletelor. A fost de-monstrat că abilitatea potenţială a dupletelor studiate de a crea noutatea în regiunile de codificare a genelor se realizează la membrii a cel puţin două familii de gene. În prezentul articol va fi pusă în discuţie contribuţia posibilă a dupletelor în evoluţia genomilor eucariotelor.

Recently, short paired duplications in mammalian and Arabidopsis genomes have been described [1]. The

overall frequency of these duplications was shown high enough to suggest that the formation of short sequence copies (doublets) might be a key process in the evolution of protein structure and gene regulation. A potential ability of the doublets to create novelty in protein gene coding regions due to incorporation of non-coding sequence elements was hypothesized [2]. More than 400 genes were detected in the Arabidopsis genome, which exemplify presence of precise copies of a sequence element in both coding and non-coding regions. In this paper we got proofs that the duplication of a pre-existed non-coding sequence element into protein coding region created protein structure novelty in members of at least two different Arabidopsis gene families. Possible contribution of this kind of duplications in the evolution of eukaryotic genomes is discussed.

Materials and Methods The Arabidopsis genome was chosen because the annotation of protein-coding genes is well advanced

(http://mips.gsf.de). Only 138 genes whose models were proved by mRNA sequencing were analyzed among 415 genes in the Arabidopsis genome found to contain precise copies (≥20 nucleotides) in their coding/non-coding regions [2].

CLUSTAL program was used for nucleotide and amino acid alignments. Evolutionary trees based on amino acid sequences were constructed using TREECON [3]. Orthologous sequences closely related to the Arabidopsis paralogs have been used as outgroups. Most conserved part of sequences aligned with minimum gaps was used for tree construction. In the figures, the numbers along branches refer to bootstrap values (% from 100 replicates). Sequence numbering corresponds to that of unspliced genes in MIPS annotations.

Results and Discussion The only possibility to describe the history of formation coding/non-coding doublets is to trace back the

history of respective genes, each being a member of a family of paralogous genes. At least three members of such a family are expected to be required to show whether a doublet has been formed either A) by insertion of a doublet unit (DU) pre-existed as a coding region motif into non-coding region, or B) by insertion of a DU pre-existed in non-coding region into coding region. These members are ancestral gene A and genes B and C (Fig.1), which reflect gene structure immediately before and after duplication event, respectively. The presence of a DU inside the gene B non-coding region would demonstrate the direction of duplication defined as B in Fig.1. Obviously, the non-coding sequence regions of genes B and C should retain homology as a basis for detection of either absence or presence of the DU in the gene B non-coding region.

The identity of the gene C DUs indicates that the duplication had happened very recently (the non-coding DU was not in time to be modified). Therefore, when the gene B containing a single copy of DU motif is a closest gene C relative, it can be considered to reflect the structure of gene C immediate ancestor. In this case the gene A and evolutionary analysis of a gene family are desirable but not strongly necessary.



161

A B non-coding coding non-coding coding

Outgroup Gene A Gene B ↓ ↓ Gene C ↑___________↓ ↓____________↑

Fig.1. Principle possibility to demonstrate insertion of coding sequence into non-coding region (A), and insertion of a non-coding sequence into coding region (B).

The detection of gene families, which exemplify formation of a novelty in the gene C coding region due to incorporation of DU derived from non-coding region (Fig.1B), meet following difficulties.

1. Only the genes C of known mRNAs can be used for analysis to be sure that their structure is evolutionarily adopted and the gene is actually expressed.

2. The presence of paralogous genes in the Arabidopsis genome and the existence of an ortholog as outgroup usually is a prerequisite for analysis. The three members of the Arabidopsis family (genes A, B and C, Fig.1) have to be conserved and closely related to their ortholog. This is a prerequisite for reliable alignment and statistically well-supported evolutionary tree.

3. The evolutionary distance between genes B and C should be short. Only in this case the unspliced sequence of the gene B do reflect gene C features before the duplication event. This is the major problem because of usual instability of gene non-coding regions (5’-leader, introns and 3’-trailer).

The entire collection of 138 genes of known mRNAs found containing coding/non-coding doublets have been analysed aiming to detect examples that demonstrate formation of coding region novelty due to insertion of non-coding sequence elements. The obtained results can be divided into three categories.

Largest category I: The history of doublet formation baffles description. Sometimes, evolutionary rela-tionships of potential members of a gene family are indefinite, and the history of the gene C cannot be traced back. Although in most cases the relationships between members of the family are well defined, the evolutio-nary distance between genes B and C (Fig.1) is too long, and their non-coding regions cannot be aligned. Thus, the doublets cannot be characterised.

Large category II. Well-defined history of doublets demonstrates that non-coding sequences do not affect coding regions.

Smallest category III: The DU present in gene C coding region exhibits dissimilarity to relevant region of the genes B and A. Therefore, sequence features of such a coding region specific for only gene C might be resulted from duplication of non-coding region into coding region. In most cases the analysis of the category III cannot be irreproachable because of instability of relevant non-coding regions in genes B and C. Nevertheless, at least two gene families described below (Fig.2,4) convincingly demonstrate formation of certain protein novelty via insertion of a DU pre-existed in non-coding region into a coding region. Naturally, these examples are less simple than that formalized in Fig.1B.

Family of lipases (Fig.2). Conserved 5’-edge of the exon 4 is characteristic of the family of at least 15 Arabidopsis genes (including the gene C) coding lipases and related proteins (Fig.3). The exon 3 3’-edge also is conserved in all genes of the family but excluding the gene C in the region where the DU is located. Sequences of intron 3/exon 4 borders of genes C and B are almost identical. In combination, these observa-tions are sufficient to conclude that the intron/exon DU sequence, which pre-existed in gene C before dupli-cation, was copied into exon and thereby created its novelty. Formation of the doublet did not cause extension of the site of insertion. This implies that the originally conserved sequence motif inside exon 4 of the gene C immediate ancestor was substituted with the DU sequence. The structural novelty created by this substitution becomes clearly recognizable when the relevant sequence segment of the gene C is compared with homologous sequences present in Arabidopsis and Oryza genomes (Fig.3). Most convincing novelty consists in non-con-served substitution of Pro, which is strictly conserved in all other sequences. Possibly, this peculiar substitution became permissible only in combination with other substitutions (and single-gap deletion), although they are less dramatic. If so, the adopted substitution of conserved Pro might be achieved only via duplication event.

A

0.1 Exon 3 Exon 4 Genes A (5) B (4) ↓ C (6) ↑____________↓

B K E V E E L V P F V I A S I S S T I T E L I G M G G A At1g28600 1501 AAGGAAGTTGAAGAGCTGGTTCCATTTGTAATCGCTTCTATTTCTTCTACAATAACGgtat//tgttgaatccagGAGTTGATTGGTATGGGGGGT 1709 N E I K E L V P L I V K A I S S A I V t k l q D L I D L G G B At1g28670 1335 AATGAAATCAAAGAGCTTGTTCCTCTAATCGTCAAAGCTATTTCTTCTGCTATTGTGgtaa//acaaaactacagGATTTGATTGATTTAGGGGGC 1502 N E T K - L Q D L I I K A I S S A I V t k l q D L I A L G G C At1g28660 1289 AATGAAACCAAA---CTACAGGATTTGATCATCAAAGCTATTTCTTCTGCAATTGTGgtaa//accaaactacagGATTTGATCGCTTTAGGGGGC 1435 inserted DU pre-existed DU

Fig. 2. The gene family of lipases: sequence segment covering intron 3/exon 4 border was copied into exon 3 in the At1g28660 gene. A, evolutionary relationships between genes A, B and C as they specified in Fig. 1 B. In total 292 positions of aligned amino acid sequences coded by the genes A-C and by a gene of bacterial lipase (outgroup) have been used for the tree construction. The tree branches are supplemented by schemes describing the structures of respective genes in the region of exons 3 and 4 (thick rectangles) and intron 3 (thin rectangle). Black rectangles indicate position of the gene C duplication units and homologous (90 % identities) sequence segment in the gene B. The number of mRNAs known for the genes A-C is shown in brackets. B, aligned nucleotide sequences and translated amino acid sequences of exons 3 and 4 (capitals) and intron 3 (low case letters). Underlined characters printed in bold correspond to sequence segments shown schematically as black rectangles in A. Similarity between aligned full-length sequences of introns 3 of the genes B and C (93 positions) exceeds chance level (68.1 % identities).

BAB75333 Nostoc sp.

At1g28600

At1g28670

At1g28660

100

100



163

⇓ At1g28660 ILMGEIGGNDFFYPSSEGKSINETK-LQDLIIKAISSAIVDLIALGGKTFLVPGGFPAG Arabidopsis At1g28670 ILMGEIGGNDYNYPFFEGKSINEIKELVPLIVKAISSAIVDLIDLGGKTFLVPGGFPTG At1g28650 ILMGEIGGNDYNYPFFEGKSINEIKELVPLIIKAISSAIVDLIDLGGKTFLVPGNFPIG At1g28640 ILMGEIGVNDYNYPFFEGKSINEIKQLVPLVIKAISSAIVDLIDLGGKTFLVPGNFPLG At1g28570 ILMGEIGGNDYNYAFFVGKNIEEIKELVPLVIETISSAITELIGMGGKTFLVPGEFPLG At1g31550 ILMGEIGANDYNFPFFQLRPLDEVKELVPLVISTISSAITELIGMGGRTFLVPGGFPLG At1g28580 ILMGEIGGNDYNYAFFVDKGIEEIKELMPLVITTISSAITELIGMGGRTFLVPGEFPVG At1g28600 ILMGEIGGNDYNFPFFNRKPVKEVEELVPFVIASISSTITELIGMGGKTFLVPGEFPIG At1g27360 ILIGEIGGNDYNFPLFDRKNIEEVKELVPLVITTISSAISELVDMGARTFLVPGNFPLG At1g28610 IIMGEIGGNDFNFAFFVNKT-SEVKELVPLVITKISSAIVELVDMGGRTFLVPGNFPLG At1g28590 ILMGEIGGNDYNFALFQRKPVKEVEELVPFVIATISSAITELVCMGGRTFLVPGNFPIG At5g03980 FMVGEIGGNDYNYGFFQGKPMEEIRSYIPHVVGAITAAAREVIRAGAVNVVVPGNFPVG At5g45910 FLVGEIGGNDYNYPLLAFRSFKHAMDLVPFVINKIMDVTSALIEEGAMTLIVPGNLPIG At1g09390 LYMIDIGQNDIADSFSKGLSYSRVVKLIPNVISEIKSAIKILYDEGGRKFWVHNTGPLG At1g56670 LYMIDIGQNDIARSFARGNSYSQTVKLIPQIITEIKSSIKRLYDEGGRRFWIHNTGPLG NP_917249 FLVGEIGGNDYNHPLICGVSIRKIRSFTPSVIAEISSTITELIRLGAKTLVVPGNLPIG Oryza NP_913345 FFMGEFGGNDYVFLQAAGKTVEQLIPYVPKVVGAISAGIEAVIKEGAVQVVVPGELPNG NP_913332 FFVGELGWNDYSAVLLAGRGVDEARSLTPRVVGTIRAATQKLIDGGARTVFVSGITPMG NP_913325 FIVGEFGGNDYNAPLFGGKSMDEVKGYVPQIIAKITSG--TLIGLGAVDIVVPGVMPIG BAB89190 FLVGEIGGNDYNLPLMSGMSIEKIRNFTPSVIAKISSIITELIGLGAKTLVVPGNIPIG BAD68794 FLVGEIGGNDYNYPLMSGVPIEKIRSFTPSVIAKISSTITELIGLGAKTLVVPGNLPIG BAD61220 FLVGEVGGNDYNHLIVRGKSLDELHELVPKVVGTITSAITELINLGAKKLVVPGNFPIG BAA94228 FLVGEIGGNDYNYAFFKGKSLDDAKSYVPTVAGAVADATERLIKAGAVHLVVPGNLPIG AAT01388 FVFGEFGGNDYSFAWKAEWSLEKVKTMVPSVVASMAGGIERLLDEGARHVVVPGNLPAG BAA94220 FFMGEFGGNDYVFLLAAGKTVDEAMSYVPKVVGVISAGVEAVIEEGARYVVVPGQLPTG BAA94224 FFMGEIGGNDYVFLYAAGKTVDEAMSYVPKVVQAISAGVEAVIKEGARYVVVPGQLPTG BAD73016 FFMGEFGGNDYVFILAAGKTLEELVPYVPKVVQAISAGIEAVIKEGARYVVVPGELPNG AAT44175 FVVGEFGGSDYRYLLSGGKSLEQAKSFVPEVVRAICRGVERLVEEGARYVVVTGTPPAG BAD54230 FVVGEFGGNDYNAPLFSGVAFSEVKTYVPLVAKAIANGVEKLIELGAKDLLVPGVLPIG AAT44169 FVVGEFGGNDYNAPLFAGRAMTEVRDYVPQVVSKIIRGLETLIRMGAVDVVVPGVLPIG BAD19158 FVVGEFGGNDYNAPLFAGKGLEEAYKFMPDVIQAISDGIEQLIAEGARELIVPGVMPTG BAD54227 FVVGEFGGNDYNAPLFAGKDLREAYNLMPHVVQGISDGVEQLIAEGARDLIVPGVMPSG BAC16480 FMVGEFGGNDYLHPLFQNKTLEWVRPLVPRVVRYIAGAVEELVGLGATTVYVPGLFPLG

Fig.3. Amino acid sequences of the gene families of lipases and related proteins in Arabidopsis and Oryza genomes aligned in the region homologous to exons 3 and 4 of the At1g28660 gene.

The symbol ⇓ indicates position of intron 3 in the At1g28660 gene. Sequences of DU inside exon 3 and a part of DU inside exon 4 are underlined. Pro residues strictly conserved in all sequences excluding At1g28660 are printed in bold.

The family of vesicular-associated proteins (VAMP) (Fig.4). BLAST searches revealed that similarly sized conserved 5’-edge of the exon 1 is characteristic of VAMPs and related proteins from Arabidopsis, Oryza and other species. The 5’-edge of the exon 1 of the gene C is peculiarly extended due to presence of two copies (identical and almost identical) of non-coding/coding border designated as DU2 in Fig.4. Sequence segment homologous to DU2 (83% identities) forms related non-coding/coding border in the gene B. In combination, these observations are sufficient to conclude that the non-coding/coding DU2 sequence pre-existed in immediate gene C ancestor was copied two times into exon 1 and thereby created its novelty.

The family of VAMP genes represented by the genes A’-C provides sufficient information for a more deep reconstruction of the history of events finalized by formation of the extant gene C structure. The genes A’, A and B structures reflect situation formalized in Fig.1A: black segment designated as DU1 in Fig.4, pre-existed in coding regions of the genes A’ and A, in the gene B was duplicated into non-coding region generating its extension. According to the summary scheme (Fig.4), the non-coding black segment of the gene B has been served as an intermediate between black exon segment of the same gene and black 5’-leader segment of the gene C. Similarity relationships between these three segments (Fig.4C) support this conclusion. The fourth black segment in the gene C designated as DU1 was inherited from black exon segments of the genes A’, A and B and retained their sequence features (Fig.4A).

In summary, coding region novelty in the gene C was created in two-steps: insertion of a segment from coding region into 5’-leader followed by its modification, and triplication of the modified 5’-leader/exon border into coding region. Partial overlapping of sequence segments subjected to successive but independent duplication/triplication events exemplifies suggestive mutual exchange by sequence information between non-coding/coding regions.

EAW10159 Aspergillus

At4g00175

At2g45140

At2g23830

3g60600

100

97

68

A C 0.1 Genes Similarities ----- A’ (4)

-DU1- ----- A (6) B 71% ___________ ↓ ↑ B (0) 49% B ↓ ---DU2--- -DU1- C (8) C 71% ↓___________↑___________↑

B M T T G D L V N I H P T E L K F P A’ At4g00175 501 tcaatctcga-aggatctacaaagaagc--------------ATGACGACCGGAGATCTCGTTAATATCCATCCTACTGAGCTTAAATTCCCCTgta 555 M S N - E L L T I D P V D L Q F P A At2g45140 473 tgaatcggaataaaatatcgcatcagag--------------ATGAGTAAC---GAGCTTCTCACCATCGATCCTGTCGACCTTCAATTCCCTTgta 552 ------DU1----- M S N N E L L E I E P M Y L Q F P B At2g23830 462 tcgatcggaaaa---gtttgaatctccggcgatcttctcaagATGAGTAACAACGAGCTTCTCGAAATCGAGCCTATGTATCTTCAATTCCCTTgta 555 d l i g M S N C At3g60600 459 tctctcggaaaatcgatttgaatctccggcgatctgatcgggATGAGTAACA I D L I G M S N TCGATCTGATTGGGATGAGTAACC R D L I G M S N S E L L T V E P L D L Q F P GCGATCTGATCGGGATGAGTAACAGCGAGCTTCTCACCGTCGAGCCTCTCGATCTTCAATTCCCTTgta 603 ----------DU2-----------

Fig.4. The gene family of vesicular-associated proteins (VAMP) exhibits mutual exchange by sequence information between 5’-leader and flanking exon.

A, evolutionary relationships between genes A’, A, B and C as they specified in Fig.1. In total 119 positions of aligned amino acid sequences coded by the genes A’-C and by a gene of fungal VAMP (outgroup) have been used for the tree construction. The tree branches are supplemented by schemes describing the structures of respective genes in the region of 5’-leaders and exons 1 (thin and thick rectangles, respectively). Black rectangles indicate position of putative doublet units DU1 in the gene B and homologous sequence segments in other genes. In the gene C extended doublet unit DU2 is shown two times copied into exon 1. The number of mRNAs known for the genes A’-C is shown in brackets. B, aligned nucleotide sequences and translated amino acid sequences of exon 1 (capitals) and 5’-leader (low case letters). Three copies of the doublet unit DU2 are shown folded in the alignment. Similarity between aligned regions of 5’-leaders upstream from segments involved in duplication/triplication in the genes B and C (28 positions) exceeds chance level (79.6% identities). C, similarity relationships (identities, %) between coding/non-coding sequence segments homologous to DU1 in the genes B and C.



165

Concluding remarks The deduced ability of non-coding sequence elements duplicated into coding regions to create their novelty

has been convincingly shown realized only in two genes of the Arabidopsis genome. However, it should be taken into account that only recent duplications that left detectable traces are available for description. Mean-while, all adopted coding region alterations derived from non-coding/coding duplications should be accumu-lated during genome evolution. Therefore, in many cases sequence features of gene coding regions (especially those features that are specific within individual members of a gene family) might have been derived from pre-existed non-coding elements. Moreover, a single-step duplication process can be hypothesized to be an exclusive evolutionary tool for creation of a novelty advantageous inside highly conserved coding region; such a novelty might be unattainable by means of several successive independent point mutations. The des-cribed evolutionary process focused to a restricted gene coding region might speed up the fine-tuning and increase the flexibility of the structural and functional adaptation of a protein.

References:

1. Thomas E.E., Srebro N., Sebat J., Navin N., Healy J., Mishra B., Wigler M. Distribution of short paired duplications in mammalian genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - Vol.101. - P.10349-10354.

2. Shutov A., Bäumlein H., Altschmied L. Large numbers of tandem duplications in the Arabidopsis genome contribute novelty to coding sequences // Third Plant GEMs Meeting, Lyon. - 2004. - Poster 040923.

3. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environement // Comp. Appl. Biosci. - 1994. - Vol.10. - P.569-570.




166

BASIC 7S GLOBULIN FROM SOYBEAN SEEDS AS A MEMBER OF A SUPERFAMILY

OF PLANT XYLANASE INHIBITORS AND ASPARTIC PROTEINASES

Andrei SHUTOV, Sergei RUDAKOV, Angela RUDAKOVA, Irina KAKHOVSKAYA, Irina SEFEROVA*, Yuriu CHESNOKOV*, Takako FUKUDA**, Krisna PRAK**, Shigeru UTSUMI**

Laboratory of Plant Biochemistry *All-Russian N.I.Vavilov Institute of Plant Research (VIR), Russia **Kyoto University, Japan

Globulina de bază 7S prezentă în seminţele uscate de soia (Bg) şi eliberată din seminţe prin imersiunea în apă fierbinte (BgH) a fost izolată şi comparată folosind cromatografia pe SP Sefaroza şi SDS-PAGE. Au fost identificate cel puţin patru tipuri de subunităţi Bg care se deosebesc dupa mărime. A fost demonstrat că BgH practic nu se deosebeşte de Bg nici prin comportarea cromotografică, nici prin componenţă şi raportul subunităţilor. A fost urmărită calea evolutivă a Bg ca membru al superfamiliei de inhibitori xilanaseci ai plantelor şi ai proteinazelor aspartice.

Basic 7S globulin (Bg) immunologically and structurally distinct from 7S and 11S seed storage globulins

has been detected in soybean Glycine max seeds long time ago [1-3]. Recently, Bg was described as a dimer of subunits [4]. Each Bg subunit synthesized as a pro-polypeptide undergoes proteolytic processing into disul-fide linked (27 kD) and (16 kD) chains, and glycosylation. Small amount of Bg precursor was found non-cleaved in mature Bg preparations [5]. Bg-like proteins might be widely distributed in legume species [6-8].

Bg was found in the plasma membranes and the middle lamella of the cell wall on the side facing to the intercellular space [9]. When immersed in hot water, mature soybean seeds release large amounts of Bg [7]. Bg forms complexes with insulin and insulin-like growth factors [10-12] and binds leginsulin, a hormone-like 4-kD peptide isolated from the radicles of germinating soybean seeds and characterized [4,13,14]. Bg has protein kinase activity [15] that is stimulated by leginsulin [13], suggesting that Bg is a part of the plant cellular signal transduction system [14].

At least four copies of Bg genes were detected in soybean genome [16]. Two cDNA sequences (Bg1, BAA03681 and Bg2, BAB91077) close to each other are available, and two kinds of Bg polypeptides are detectable using SDS-PAGE [3]. Non-dissociated Bg was shown heterogeneous chromatographically [5]. The N-terminal sequence of Bg released in hot water was found identical to Bg1 [7].

Bg accounts for about 3% of total protein in mature soybean seed [6]. It contains high amounts of Met and Cys, which are deficient in soybean storage globulins.

In this paper we analyzed polypeptide composition of Bg isolated from dry seeds and released from seeds in hot water. Evolutionary pathway of Bg as a member of a superfamily of functionally distinct proteins was followed.

Materials and Methods Soybean seeds (Glycine max [L.] Merr., cv. Licurici, Moldova) were used. Bg preparations from cotyle-

dons of dry seeds were isolated as described earlier (Shutov et al. 2006) with minor modifications. Defatted soybean meal (10 g) was washed tree times with water (1:70, w/v) and the pellet was extracted with 0.1 M Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 M NaCl, 0.02% NaN3 (Buffer A). The extract was filtered through a layer of DEAE Sepharose CL-6 B equilibrated with Buffer A for almost complete removal of contaminating proteins. The filtrate was adjusted to pH 4.5 with 10% acetic acid and loaded onto a column (1.6 x 2.5 cm) of SP Sepharose equilibrated with 0.1 М acetic buffer, pH 4.5, 0.1 M NaCl, 0.02% NaN3 (Buffer B). After removal of non-adsorbed fraction, Bg was eluted with a linear gradient of NaCl concentration in Buffer B (from 0.1 M to 0.5 M, total elution volume 150 ml). In separate experiments, 10 g of mature seeds were soaked in 100 ml of hot (60°C) water for 1.5 h. The released Bg was precipitated via cooling of surrounding water, the precipitate was dissolved in Buffer 2 and subjected to SP Sepharose chromatography as described above. Chromato-graphic materials were obtained from Pharmacia. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was



167

α’α1α’’

β

α2 α3

γ

performed according to Laemmli [17] in 15% gels in reducing conditions. Polypeptides separated by SDS-PAGE were blotted onto PVDF membranes (Millipore) and subjected to N-terminal sequencing.

BLAST searches were conducted for amino acid sequences related to Bg. The CLUSTAL program was used for alignment of amino acid sequences. The evolutionary tree was constructed using TREECON program package [18].

Results and Discussion

Polypeptide composition of Bg isolated from dry seeds (BgD). A high degree of BgD heterogeneity was observed when SP Sepharose chromatography fractions were analyzed by SDS-PAGE (Fig.1). At least three kinds of α-chains (~27 kD) different in their mobility (bands α1-α3) were found partially separated along the elution profile composed of large peak 1 (~90% of total BgD) and small peak 2. Minor bands of α-chains (α’ and α’’) also were found. Heterogeneity of the β-chains (~16 kD) is less obvious. A γ-polypeptide that presumably corresponds to non-cleaved α/β precursor is accumulated specifically in the right slope of the peak I. N-terminal sequences of α1 (VPIPQH), β (STIVGS) and γ (VPIPQH) polypeptides from the left slope of the peak 1 (Fig.1, lane 2) were found identical to Bg2 (BAB91077) sequence. The α2 polypeptide might belong to unknown kind of BgD, and the lower band α3 (peak 2) probably corresponds to the α-chain of Bg1 (BAA03681), which is 0.8 kD smaller than the α-chain of Bg2.

Native BgD exists as a dimer [4] probably formed by chance combination of four kinds of differently charged major subunits, namely α1β, α2β, γ and α3β (enumerated in order of their elution, Fig. 1). Whereas homo-dimers (α1β)2 and (α3β)2 are preferentially present in the extreme parts of the elution profile (peak 1, left slope, and peak 2, respectively), hetero-dimers (α1β)(α2β) and (α1β)γ/(α2β)γ are eluted in central part of peak 1 and its right slope, respectively.

1 2 3 4 5 6 7 8 ---left slope-- -central part- --right slope-- ________________peak1_______________ ___peak2__

Fig.1. Polypeptide composition of Bg released in hot water (BgH) and isolated from dry seeds (BgD). SDS-PAGE of fractions along the elution profile during SP-Sepharose chromatography are shown. To optimize

separation of Bg α-chains, we used gels of bisacrylamide/acrylamide ratio 1:100.

Polypeptide composition of Bg released in hot water (BgH) as well as the chromatography elution profile are closely similar to those observed for Bg isolated from dry seeds; The only difference is smaller proportion of γ polypeptide in BgH preparation (Fig.1). These results contradict with those of Hirano et al. [7] who found specific release of only Bg1 in hot water. The source of this contradiction remains unclear.



168

BAB91077 NLLVLPVQNDASTGLHWANLQKRTPLMQVPVLVDLNGNHLWVNCEQHYSSKTYQAPFCHSTQCSRAN CAC16394 NLLVLPIQQDASTKLHWGNILKRTPLMQVPVLLDLNGKHLWVTCSQHYSSSTYQAPFCHSTQCSRAN BAA03413 SALVVPVKKDASTLQYVTTINQRTPLVSENLVVDLGGRFLWVDCDQNYVSSTYRPVRCRTSQCSLSG 1T6G_A LPVLAPVTKDPATSLYTIPFHD-----GASLVLDVAGPLVWSTCDGGQPPAEIP---CSSPTCLLAN BAD07474 SGVETSV--YAGDGEYLMNLSIGTPAQPFSAIMDTGSDLIWTQCQPCTQCFNQSTPIFNPQGSSSFS 1s 2s 3s 4s 5h BAB91077 THQCLS--C--PAASRPGC----HKNTCGLMSTNPITQQTGLGELGQDVLAIHATQGStqQLGPLVT CAC16394 THQCFT--CtdSTTSRPGC----HNNTCGLISSNPVTQESGLGELAQDVLALHSTHGS--KLGSLVK BAA03413 SIACGD--C--FNGPRPGC----NNNTCGVFPENPVINTATGGEVAEDVVSVESTDGS--SSGRVVT 1T6G_A AYPAPG--C-----PAPSCgsdkHDKPCTAYPYNPVSGACAAGSLSHTRFVANTTDGS--KPVSKVN BAD07474 TLPCSSqlC--QALSSPTC----SNNFCQ-YTYGYGDGSETQGSMGTETLTFGS-----------VS 6s 7s 8s ⇓ BAB91077 VPQFLFSCAPSFLLQKGLPRNIQGVAGLGHAPISLPNQLASHFGLQHQFTTCLSRYPTSKGALIFGD CAC16394 IPQFLFSCAPTFLTQKGLPNNVQGALGLGHAPISLPNQLFSHFGLKRQFTMCLSSYPTSNGAILFGD BAA03413 VPRFIFSCAPTSLLQ-NLASGVVGMAGLGRTRIALPSQFASAFSFKRKFAMCLSGSTSSNSVIIFGN 1T6G_A V-GVLAACAPSKLLA-SLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQKVANRFLLCLP--TGGPGVAIFGG BAD07474 IPNITFGCGENNQGF-GQGNGA-GLVGMGRGPLSLPSQLDVT-----KFSYCMTPIGSSTPSNLLL- 9h 10s 11h 12s 13s BAB91077 --APNNMQQFHNQ-DIFHDLAFTPLTVTP------------QGEYNVRVSSIRINQHSV-------- CAC16394 inDPNNNNYIHNSLDVLHDMVYTPLTISK------------QGEYFIQVSAIRVNKHMViptknpsm BAA03413 --DPYT--FLPNIIVSDKTLTYTPLLTNPVSTSatstqgepSVEYFIGVKSIKINSKIV-------- 1T6G_A --GPVPWPQFT------QSMPYTPLVTKGGSPA-----------HYISARSIVVGDTRV-------- BAD07474 --GSLANSVTA-------GSPNTTLIQSSQIPT----------FYYITLNGLSVGSTRL-------- 14s 15s 16s ↓ BAB91077 FPPNKISSTIV-GS-SGGTMISTSTPHMVLQQSLYQAFTQVFAQQLEKQ-------AQ-VKSVAPFG CAC16394 FPSSSSSSYHE-SSEIGGAMITTTNPYTVLRHSIFEVFTQVFANNVPKQ-------AQ-VKAVGPFG BAA03413 -ALNTSLLSIS-SAGLGGTKISTINPYTVLETSIYKAVTEAFIKESAARn-----ITR-VASVAPFG 1T6G_A -PVPEGAL------ATGGVMLSTRLPYVLLRPDVYRPLMDAFTKALAAQhangapvARAVEAVAPFG BAD07474 -PIDPSAFALNsNNGTGGIIIDSGTTLTYFVNNAYQSVRQEFISQINLPvvng--------SSSGFD 17s 18s 19h 20s BAB91077 LCFNSN-----KINA-YPSVDLVMDKpNGPVWRISGEDLMVQAQPGVTCLGVMN-----GGMQPRAE CAC16394 LCYDTK-----KISGGVPSVDLIMDK-SDVVWRISGENLMVQAQDGVSCLGFVD-----GGVHTRAG BAA03413 ACFSTDNILSTRLGPSVPSIDLVLQS-ESVVWTITGSNSMVYINDNVVCLGVVD-----GGSNLRTS 1T6G_A VCYDTKTLGNNLGGYAVPNVQLGLD--GGSDWTMTGKNSMVDVKQGTACVAFVEmkgvaAGDGRAPA BAD07474 LCFQTPSDPSNL---QIPTFVMHFD--GG-DLELPSENYFISPSNGLICLAM--------GSSSQGM 21s 22s 23s 24s 25s 26h 27s 28s ⇓ BAB91077 VTLGTRQLEEKLMVFDLARSRVGFSTSSLHSHGVKCGDL Glycine basic 7S globulin CAC16394 IALGTHQLEENLVVFDLARSRVGFNTNSLKSHGKSCSNL Lupinus γ conglutin BAA03413 IVIGGHQLEDNLVQFDLATSRVGFSGTLLGSRT-TCANF Daucus extradermal glycoprotein 1T6G_A VILGGAQMEDFVLDFDMEKKRLGFSRLPHF---TGCGGL Triticum xylanase inhibitor BAD07474 SIFGNIQQQNMLVVYDTGNSVVSFAS-------AQCGAS Nepenthes aspartic proteinase 29s 30h 31s 32s

Fig.2. Basic 7S globulin (Bg) as a member of a superfamily of plant xylanase inhibitors and aspartic proteinases. Selected representatives of the superfamily are shown from multiply aligned sequences analyzed by the evolutionary tree (Fig.3). Residues identical at least in four sequences are printed in bold. All Cys residues are black shaded. Low

case letters, inserts peculiar in individual sequences and specific for clusters, including that of aspartic proteinases from Nepenthes and related enzymes from Arabidopsis (AAP21262) and Oryza (CAD40873). Secondary structures of

Triticum xylanase inhibitor (1T6G.pdb) are underlined and numbered (s, β-strands, h, α-helices). Italics, disordered regions, see Fig.4. An arrow indicates processing site of the Bg precursor. Symbol ⇓ indicate position of Cys residues involved in formation of the inter-chain disulfide bond in Bg and conglutin γ. DTG residues underlined in sequence of

Nepenthes aspartic proteinase correspond to active site triads.



169

Evolutionary pathway of Bg. BLAST searches revealed three groups of proteins related to Bg (Fig.2): conglutin γ from Lupinus, xylanase inhibitors from dicots and monocots, and pepsin A-like plant aspartic proteinases. Because of ancient origin and widespread distribution of commonly rooted pepsin A-like enzymes in different kingdoms it seems obvious that an aspartic proteinase rather than any other protein can be consi-dered to be a suitable outgroup for construction of a rooted evolutionary tree. An aspartic proteinase from Nepenthes distillatoria was selected as the best characterized enzyme [19,20]. We restricted analyzed sequence set only to well-characterized proteins. Remarkably, these proteins are similarly sized and reveal homology along almost total-length sequences. Therefore, extensive sequence information can be obtained from ~400 alignment positions (Fig.2). Highly conserved positions emphasized in Fig.2 (especially, Cys residues) are helpful to align distantly related groups of aspartic proteinases and other proteins. The resulting evolutionary tree (Fig.3) is stable. The tree topology is the same when different alignment regions are examined separately or when the analysis is restricted to the sum of conserved regions. Below we provide summary information on proteins related to Bg.

0.1

BAD07474 Nepenthes

CAE46330 Hordeum

BAA03413 Daucus

BAB91077 Glycine

BAA03681 Glycine

CAA46552 Lupinus

CAC16394 Lupinus

AAX81588 Nicotiana

AAN87262 Lycopersicon

1T6G_A Triticum

CAE46333 Secale

100

88

100

100

100

100

100

100

92Monocot HI

Dicot HI/EDGP

Conglutin gamma

Bg

Fig.3. Putative evolutionary pathway of Bg. In total, 398 alignment positions of aligned amino acid sequences of Bg and related proteins have been used for

the tree construction. Sequence region selected for analysis (Fig.2) covers almost total sequences excluding variable N-/C-termini and short inserts peculiar in individual sequences and specific for clusters (see low case letters in Fig.2).

Numbers along branches refer to bootstrap values (% from 100 replicates). Aspartic proteinase from Nepenthes distillatoria has been used as an outgroup. HI, xylanase inhibitors; EDGP, extradermal glycoproteins.

Conglutin γ (C(), a closest relative of Bg (>60 % identities, Fig.2), has been purified from mature Lupinus angustifolius [21] and Lupinus albus [22] seeds. Similarly to Bg, C( subunits are synthesized as precursors [23] that undergo processing into disulfide linked (- and (- chains and glycosylation. L. albus C( has extensively been characterized at molecular level [24-26]. Depending on pH, it exists either as (/( protomer or as a tetramer [27]. C( accounts for about 5 % of total protein in mature L. albus seed [22].

A certain functional relation of C( and Bg can be suggested. As well as Bg, L. albus C( binds insulin [28] and is located in the extracellular spaces of seedling cotyledons [29,30]. When L. albus seeds are immersed in hot water, de novo synthesized portion of C( is secreted in surrounding water [31]. The expression of L. angustifolius C( gene is accompanied with the expression of leginsulin-like homolog [32]. Thus, as well as in soybean, in lupin seeds both components of the putative signal transduction pathway are present.

Xylanase inhibitors (XI), closest sequence relatives both of Bg and C(, are a part of the network of plant defenses against microbial pathogens [33]. The inhibition of microbial xylanases by XI is a direct consequence of a high affinity association of the two proteins. XIs are single-chain glycoproteins sized similarly to Bg/C( precursors. Daucus carota extracellular dermal glycoprotein (EDGP) recently proved to inhibit xylanase [34]



170

is specific to the epidermis and other dermal tissues [35]. As well as Bg, EDGP are localized in the plasma membranes and middle lamella of cell walls. D. carota EDGP is closely related to well-characterized XIs from Lycopersicon esculentum [36] and Nicotiana langsdorffii [37]. XIs from dicots exhibit strict conser-vation of six Cys residue pairs, which have been proved to form disulfide bridges in EDGP molecule [38]. All these Cys residues are present in Bg (Fig.2) suggesting similar folding both of known dicot XIs and Bg.

Cereal XIs exemplified by Triticum aestivum inhibitor TAXI-I and its close relatives from Secale cereale and Hordeum vulgare [39] are of special interest because of solution of crystal structure of TAXI-I pdb|1T6G) [40]. TAXI-I folds as two β-barrel domain protein with a few helical segments and the separate domains are divided by an extended cleft (Fig.4A). As well as in D. carota EDGP [38] six pairs of Cys residues form disulfide bridges in TAXI-I structure [40]. However, only three of six Cys pairs are structurally identical in these proteins suggesting difference in folding of N-terminal polypeptide regions of Bg/EDGP and TAXI-I. The tertiary structure of TAXI-I is highly similar to the core structure of aspartic proteinase from fungi Rhizo-mucor miehei (pdb|2RMP). A least-squares fit (Swiss-Pdb Viewer program, http://www.expasy.org/spdbv/) produced an RMSD of 1.47 Å between TAXI-I and the proteinase using 206 C( atoms (Fig 4 B).

3s4s

4s

5h

7s

8s

N

C

19h

14s

15s

11h12s

31s

32s

30h29s31s

32s

*

*

**

2RMP

1T6G

A B

Fig.4. Structure of xylanase inhibitor TAXI-I from Triticum.

A. The ribbon diagram generated from 1T6G.pdb with the Swiss-Pdb Viewer program (http://www.expasy.org/spdbv/). Selected secondary structures (s, β-strands, h, α-helices) are numbered in accordance with TAXI-I sequence (see Fig. 1). Limits of disordered regions are shown by asterisks. Cys residues involved in formation of inter-domain disulfide bonds are shown as spheres. N and C, respective termini of TAXI-I polypeptide. An arrow indicates position of Bg

processing site projected to the TAXI-I structure (Fig. 2). B. Ribbon diagrams of TAXI-I and fungal aspartic proteinase 2RMP structural regions surrounding proteinase active site. Spheres, two Asp residues globally conserved in Bg

superfamily (Fig. 2) form two active sites in the entire family of aspartic proteinases. The structural regions shown here separately were extracted from superimposed Cα traces of TAXI-I and proteinase.

Plant aspartic proteinases share common ancestry with pepsin A but structurally and evolutionary are highly diverged [41,42]. A structure-based sequence alignment of the entire set of aspartic proteinases deposited in the PDB reveals only 23 strictly conserved residues [40]. Nepenthesin (NEP) from Nepenthes distillatoria [19,20] is a member of a novel family of plant aspartic proteinases that is only distantly related to plant pepsin-like enzymes of known tertiary structures [43,44]. Sequences of NEP and of its close relatives from A. thaliana and O. sativa exibit similarity to Bg, Cγ and EDGP, and might be similarly folded (see conservation of most of NEP Cys residues matching with those of EDGP, Fig.2). NEP-like proteinases are suggested widely distributed in plants and appears to be present even in Chlamidomonas [19].

The evolutionary pathway of Bg can be described as follows. An ancestral pepsin-like proteinase exemplified by extant NEP probably is formed at an early step of diversification of eukaryotes. The structure of putative progenitor of XIs descends from similarly ancient evolutionary step as suggested by Sansen et al. [40]. Tran-



171

sition of an aspartic proteinase into XI consisted in lost of proteolytic activity and formation of structural basis for xylanase inhibition via formation of substrate-mimicking contacts [40]. Dicot XIs that gave rise to Bg and Cγ probably reflect further evolutionary step. Common characteristics of Bg/Cγ as XI-related proteins are their capacity to bind specific proteins or peptides and probable involvement in cellular signal transduction system, and their enhanced expression when the plant is exposed to a stressful stimulus such as heat shock.

Functional distinction of dicot XIs and Bg is not obvious. Although carrot EDGP and Bg belong to different plant orders, they are highly similar to each other suggesting similar folding. They both are dermal proteins that bind insulin [12] and leginsulin [34]. Thus, dicot XIs might be involved both in plant’s defense and signal transduction systems. In this context, it should be mentioned that XI-like activity of Bg and Cγ has never been examined.

A deficiency in sulfur-containing amino acids is a common problem for soybean and other crop legume seeds. Possibly, increased expression of Bg genes that encode protein rich both in Cys and Met can partially recover the deficiency. It is difficult to predict consequences of such an over-expression because of Bg activity as a protein kinase. However, it should be remind presence of Cγ, a close Bg structural and probably functional relative, in protein storage vacuoles of L. angustifolius seeds. Sorting of Bg into protein bodies probably is achievable. If so, tolerance of soybean seeds for relatively large amounts of Bg is can be suggested.

References: 1. Hu B., Esen A. (1981). Heterogeneity of soybean seed proteins: one-dimensional electrophoretic profiles of six

different solubility fractions // J. Agric. Food Chem., 29, 497-501. 2. Yamauchi F., Sato K., Yamagishi T. (1984). Isolation and partial characterization of a salt-extractable globulin from

soybean seeds // Agric. Biol. Chem., 48, 645-650. 3. Sato W., Yamagishi T., Kamata T., Yamauchi F. (1987). Subunit structure and immunological properties of a basic

7S globulin from soybean seeds // Phytochemistry, 26, 903-908. 4. Hanada K., Nishiuchi Y., Hirano H. (2003). Amino acid residues on the surface of soybean 4-kD peptide involved in

the interaction with its binding protein // Eur. J. Biochem., 270, 2583-2592. 5. Шутов А., Рудаков С., Рудакова А., Сеферова И., Каховская И., Алпатьева Н., Тимофеева Г. и Чесноков Ю.

(2006). Легуминоподобный белок семян сои: очистка и некоторые свойства // Analele Ştiinţifice ale USM. Seria “Ştiinţe chimico-biologice”. - Chişinău: CEP USM, с.240-243.

6. Kagawa H., Yamauchi F., Hirano H. (1987). Soybean basic 7S globulin represents a protein widely distributed in legume species // FEBS Lett, 226, 145-149.

7. Hirano H., Kagawa H., Okubo K. (1992). Characterization of proteins released from legume seeds in hot water // Phytochemistry, 31, 731-735.

8. Mendoza E., Adachi M., Bernardo A., Utsumi S. (2001). Mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] globulins: purification and characterization // J. Agric. Food Chem. 49, 1552-1588.

9. Nishizawa N., Mori S., Watanabe Y., Hirano H. (1994). Ultrostructural localization of the basic 7S globulin in soybean (Glycine max) cotyledons // Plant. Cell. Physiol., 35, 1079-1085.

10. Barbashov S.F., Egorov T.A. (1990). The use of monoclonal antibodies against insulin for isolation of proteins inhibiting the cell growth // Mol. Biol. (Russian), 24, 953-961.

11. Barbashov S.F., Egorov T.A., Kochkina V.M. (1991). Isolation and characteristics of insulin-binding proteins from soybeans // Bioorg. Khim. (Russian), 17, 421-423.

12. Komatsu S., Hirano H. (1991). Plant basic 7S globulin-like proteins have insulin and insulin-like growth factor binding actgivity // FEBS Lett, 294, 210-212.

13. Watanabe Y., Barbashov S.F., Komatsu S., Hemmings A., Miyagi M., Tsunasawa S., Hirano H. (1994). A peptide that stimulates phosphorylation of the plant insulin-binding protein: isolation, primary structure and cDNA cloning // Eur. J. Biochem., 224, 167-172.

14. Yamazaki M., Takaoka M., Katoh E., Hanada K., Sakita M., Sakata K., Nishiuchi Y., Hirano H. (2003). A possible physiological function and the tertiary structure of a 4-kD peptide in legumes // Eur. J. Biochem., 270, 1269-1276.

15. Komatsu S., Koshio O., Hirano H. (1994). Protein kinase activity and insulin-binding activity in plant basic 7S globulin // Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1705-1706.

16. Watanabe Y., Hirano H. (1994). Nucleotide sequence of the basic 7S globulin gene from soybean // Plant. Physiol., 105, 1019-1020.

17. Athauda S., Matsumoto K., Rajapakshe S., Kuribayashi M., Kojima M., Kubomura-Yoshida N., Iwamatsu A., Shibata C., Inoue H., Takahashi K. (2004). Enzymic and structural characterization of nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases // Biochem. J., 381, 295-306.

18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol.227. - P.680-685.



172

19. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environement // Comp. Appl. Biosci. - 1994. - Vol.10. - P.569-570.

20. Takahashi K., Athauda S., Matsumoto K., Rajapakshe S., Kuribayshi M., Kojima M., Kubomura-Yoshida N., Iwamatsu A., Shibata C., Inoue H. (2005). Nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases: enzymatic and structural characteristics // Curr. Protein. Pept. Sci., 6, 513-525.

21. Blagrove R.J., Gillespie J.M. (1975). Isolation, purification and characterization of the seed globulins of Lupinus angustifolius // Aust. J. Plant. Physiol., 2, 13-27.

22. Duranti M., Restani P., Poniatowska M., Cerletti P. (1981). The seed globulins of Lupinus albus // Phytochemistry, 20, 2071-2075.

23. Kolivas S., Gayler K. (1993). Structure of the cDNA coding for conglutin γ, a sulphur-rich protein from Lupinus angustifolius // Plant. Mol. Biol., 21, 397-401.

24. Duranti M., Guis C., Sessa F., Vecchio G. (1995). The saccharide chain of lupin seed conglutin γ is not responsible for the protection of the native protein from degradation by trypsin, but facilitates the refolding of the acid-treated protein to the resistant conformation // Eur. J. Biochem., 230, 886-891.

25. Duranti M., Scarafoni A., Di Cataldo A., Sessa F. (2001). Interaction of metal ions with lupin seed conglutin γ // Phytochemistry, 56, 529-533.

26. Duranti M., Di Cataldo A., Sessa F., Scarafoni A., Ceciliani F. (2002). Metal ions restore the proteolytic resistance of denatured conglutin γ, a lupin seed glycoprotein, by promoting its refolding // J. Agric. Food. Chem., 50, 2029-2033.

27. Duranti M., Sessa F., Scarafoni A., Bellini T., Dallocchio F. (2000). Thermal stabilities of lupin seed conglutin γ protomers and tetramers // J. Agric. Food. Chem., 48, 1118-1123.

28. Magni C., Sessa F., Accardo E., Vanoni M., Morazzoni P., Scarafoni A., Duranti M. (2004). Conglutin gamma, a lupin seed protein, binds insulin in vitro and reduces plasma glucose levels of hyperglycemic rats // J. Nutr. Biochem., 15, 646-650.

29. Duranti M., Faoro F., Harris N. (1994a). The unusual extracellular localization of conglutin γ in germinating L. albus seeds rules out its role as a storage protein // J. Plant. Physiol., 143, 711-716.

30. Duranti M., Ferrari F., Gius C., Carzaniga R., Faoro F. (1996). Biochemical and immunocytochemical identification of conglutin γ, a lupin seeds lectin, in the roots of early germinating seedlings // Protoplasma, 194, 208-214.

31. Duranti M., Scarafoni A., Gius C., Negri A., Faoro F. (1994b). Heat-induced synthesis and tunicamycin-sensitive secretion of the putative storage glycoprotein conglutin gamma from mature lupin seeds // Eur. J. Biochem., 222, 387-393.

32. Ilgoutz S.C., Knittel N., Lin J.M., Sterle S., Gayler K.R. (1997). Transcription of genes for conglutin gamma and a leginsulin-like protein in narrow-leafed lupin // Plant. Mol. Biol., 34, 613-627.

33. York W.S., Qin Q., Rose J.K. (2004). Proteinaceous inhibitors of endo-beta-glucanases // Biochim. Biophys. Acta, 1696, 223-233.

34. Shang C., Sassa H., Hirano H. (2005). The role of glycosylation in the function of a 48-kDa glycoprotein from carrot // Biochem. Biophys. Res. Commun., 328, 144-149.

35. Satoh S., Fujii T. (1988) Purification of GP57, an auxin-regulated extracellular glycoprotein of carrots, and its immunocytochemical localization in dermal tissues // Planta, 175, 363-373.

36. Qin Q., Bergmann C.W., Rose J.K., Saladie M., Kolli V.S., Albersheim P., Darvill A.G., York W.S. (2003). Characterization of a tomato protein that inhibits a xyloglucan-specific endoglucanase // Plant. J., 34, 327-328.

37. Nagvi S.M., Harper A., Carter C., Ren G., Guirgis A., York W.S., Thornburg R.W. (2005). Nectarin IV, a potent endoglucanase inhibitor secreted into the nectar of ornamental tobacco plants. Isolation, cloning, and characterization // Plant. Physiol., 139, 1389-1400.

38. Shang C., Shibahara T., Hanada K., Iwafune Y., Hirano H. (2004). Mass spectrometric analysis of posttranslational modifications of a carrot extracellular glycoprotein // Biochemistry, 43, 6281-6292.

39. Raedschelders G., Debefve C., Goesaert H., Delcour J.A., Volckaert G., Van Campenhout S. (2004). Molecular identification and chromosomal localization of genes encoding Triticum aestivum xylanase inhibitor I-like proteins in cereals // Theor. Appl. Genet., 109, 112-121.

40. Sansen S., De Ranter C.J., Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Delcours J.A., Rabijns A. (2004). Structural basis for inhibition of Aspergillus niger xylanase by Triticum aestivum xylanase inhibitor I // J.Biol. Chem., 279, 36022-36028.

41. Simőes I., Faro C. (2004). Structure and function of plant aspartic proteinases // Eur. J. Biochem., 271, 2067-2075. 42. Faro C, Gal S (2005) Aspartic proteinase content of the Arabidopsis genome // Curr. Protein. Pept. Sci., 6, 493-500. 43. Kervinen J., Tobin G.J., Costa J., Waugh D.S., Wlodawer A., Zdanov A. (1999). Crystal structure of plant aspartic

proteinase prophytepsin: inactivation and vacuolar targeting // EMBO J., 18, 3947-3955. 44. Frazão C., Bento I., Coste J., Soares C.M., Verissimo P., Faro C., Pires E., Cooper J., Varrondo M.A. (1999). Crystal

structure of cardosin A, a glycosilated and Arg-Gly-Asp-containing aspartic proteinase from the flowers of Cynara cardunculus L. // J. Biol. Chem., 274, 27694-27701.

Note: This work was supported by joint Moldova-Russia grant No. 0402 / 06-04-90809.



173

CONSANGVINIZAREA ŞI EFECTELE EI ASUPRA CREŞTERII ÎN DIAMETRU

A DESCENDENŢILOR STEJARULUI PEDUNCULAT (Quercus robur L.)

Petru CUZA

Rezervaţia Ştiinţifică „Plaiul Fagului”

The investigated growth processes of pedunculata oak sapling (Quercus robur L.) received the ambassador consanguine. It is shown, that in posterity growth sapling is shown to be miscellaneous. With some people to be sapling results in „inbreeding depressions”, the growth of sapling in diameter is suppressed. This phenomenon speaks of accumulation of harmful recesivitate factors in posterity. At others sapling heterozygosis is shown. On can see, after crossing a parent tree with genetically different trees recesivitate genes of one plant ,,are blocked” by dominant genes of another that does not reduce the sapling growth.

Introducere Populaţiile naturale ale speciilor de stejar poartă o „încărcătură genetică” considerabilă, adică ele sunt hete-

rozigote după majoritatea genelor recesive dăunătoare. Referindu-se la noţiunea de „încărcătură genetică”, S.M. Gherşenzon [1] a considerat acest fenomen drept rezervă mobilizatoare a variabilităţii genetice, datorită căruia populaţia este în stare să-şi păstreze un spectru larg al adaptării în condiţiile schimbătoare ale mediului. În numeroase cazuri, menţinerea în populaţiile naturale a diferitelor alele mutante pentru un număr mare de locuşi se datorează faptului că stejarului îi este proprie polenizarea încrucişată. În asemenea populaţii cu pole-nizare încrucişată predomină o rată de recombinare înaltă. Aceste particularităţi ale sistemului genetic au determinat presupunerea, potrivit căreia speciile cu un asemenea sistem de încrucişare în trecut s-au confruntat cu probleme de insecuritate în medii eterogene [2].

Aşa cum se cunoaşte, menţinerea variabilităţii genetice la speciile de stejar instalate artificial în cadrul efectuării lucrărilor de împăduriri ar asigura buna lor adaptare la condiţiile locului de cultură. Devine clar că stabilitatea ecologică şi vigoarea de creştere a culturilor de stejar depinde de diversitatea ereditară a materialului forestier de reproducere. Pentru atingerea acestui deziderat, în practica forestieră este imperios necesar ca recoltarea ghindei să se efectueze din cuprinsul unor arborete înalt productive, de la un număr mare de arbori. În aşa mod s-ar putea intercepta un număr mare de genotipuri diferite. Valoarea adaptivă diferită a genotipurilor ar asigura supravieţuirea populaţiei de stejar în condiţii staţionale eterogene. Însă, în activităţile silvice gospodăreşti ghinda se recoltează, în dese cazuri, de pe lizierele însorite şi acest mod de colectare nu poate înlătura pericolul consangvinizării. Lucrarea capătă totuşi un caracter uzual pe motivul că la stejar anii cu fructificaţie abundentă se repetă o dată la 6-7 ani [3], însă pe lizierele însorite stejarul fructifică mai regulat şi cu o intensitate mai mare decât în masivul forestier.

Material şi metode Pentru a studia efectele consangvinizării asupra vigorii de creştere a descendenţilor la stejar a fost selectat

un arbore izolat din masivul forestier care aparţine rezervaţiei „Plaiul Fagului”. De pe acest arbore în toamna anului 2001 s-a recoltat ghinda. În primăvara anului 2002 ghinda a fost semănată pe lotul experimental, care se găseşte la baza versantului sud-estic, unde înclinaţia este de 5º. Solul este cenuşiu tipic. Experimentul a prevăzut 5 variante cu 64 repetiţii. Semănatul s-a făcut în interiorul unor parcele pătrate, cu latura de 7х7 m, în 64 cuiburi distanţate la 1 metru. În fiecare cuib au fost introduse la adâncimea de 6-8 cm câte 5-7 ghinde. Populaţia modelată pe baza a 247 genotipuri provenite de la un arbore solitar a fost denumită populaţie consangvină.

Diametrul puieţilor a fost măsurat la colet cu ajutorul şublerului (precizia ± 1 mm). Efectele consangvinizării asupra particularităţilor de creştere în diametru a descendenţilor au fost redate în baza legităţilor distribuţiei caracterului în populaţie. Iniţial, şirul variaţional al diametrului puieţilor s-a aranjat de la valorile mici către cele mari. După aceasta, şirul s-a separat în două colectivităţi folosindu-se valoarea devierii medii pătrate. Colectivitatea în care se manifestă heterozigoţia a fost considerată aceea, ai cărei puieţi au avut diametre care au depăşit valoarea numerică M+. Puieţii care au avut diametre mai mici decât valoarea numerică M– au



174

fost atribuiţi la colectivitatea unde au fost evidente efectele „depresiunii consangvine”. Colectivităţile puieţilor de stejar au fost supuse prelucrării statistice, fiind calculaţi parametrii, precum: media aritmetică şi eroarea mediei, valoarea minimă şi maximă, coeficientul de variaţie şi devierea medie pătrată. Semnificaţia deosebirilor dintre rapiditatea de creştere a puieţilor care alcătuiesc colectivităţile enunţate a fost apreciată cu ajutorul testului Student în baza diferenţelor dintre înălţimile medii ale puieţilor în colectivităţile unde a fost aparentă heterozigoţia şi „depresiunea consangvină” [4].

Rezultate şi discuţii La speciile lemnoase din zona temperată sunt larg răspândite mecanisme speciale care exclud autopolenizarea.

Formarea separată a florilor mascule şi femele în coroana arborelui este un mecanism eficient în acest sens dezvoltat la stejarul pedunculat. Polenizarea prin vânt, care implică transferul polenului de la un arbore la altul, asigură polenizarea încrucişată. Există şi alte mecanisme la stejar pentru preîntâmpinarea autopolenizării. Este o specie dixogamă, la care florile mascule şi femele pe un anumit arbore nu se formează în aceeaşi perioadă de timp [5]. După S.S. Piatniţki [6], ar putea fi mai degrabă o specie la care se remarcă proterandria decât protogenia, fapt dovedit de autor experimental. Din alte surse ştiinţifice rezultă că polenizare încrucişată în exclusivitate nu există şi că autopolenizarea la stejar nu este exclusă, dar există un mecanism biochimic care asigură fecundarea preferenţială cu polen străin [7].

Specificul încrucişărilor indivizilor în populaţiile stejarului cu efective mici face ca în ele să se producă o uşoară şi continuă consangvinizare, care se datorează mai degrabă încrucişării dintre indivizii înrudiţi. Acelaşi fenomen poate fi urmărit şi la descendenţii stejarului proveniţi de la arborii situaţi pe liziere sau cei solitari. În contextul discuţiei este relevantă constatarea făcută de Jonathan W.Wright, care susţine că consangvinizarea ar putea să aibă unele consecinţe posibile: fixarea genelor favorabile, fixarea genelor nefavorabile şi pierderea de variabilitate. Având în vedere cele expuse, studiul întreprins ţine să dezvăluie efectele consangvinizării asupra creşterii în diametru a puieţilor de stejar. Din datele Tabelului 1 rezultă că puieţii consangvini au avut particularităţi de creştere diferite în diametru. Din cauza efectelor nefavorabile ale consangvinizării unii puieţi au manifestat pierderea vigorii de creştere. O altă parte de puieţi s-au caracterizat prin creşteri în general rapide. De exemplu, după al 3-lea sezon de vegetaţie puieţii din colectivitatea în care s-a produs „depresiunea con-sangvină” au avut un diametru mediu de 14,3 mm. Dimpotrivă, stejăreii din colectivitatea în care s-a manifestat heterozigoţia s-au caracterizat prin creşteri rapide (media diametrului fiind de 25,4 mm). Din cele expuse se poate conchide că puieţii consangvini sunt foarte eterogeni după creşterea lor în diametru. Creşterea unora este frânată din cauza fixării genelor nefavorabile, iar a altora este favorizată de „acoperirea” genelor recesive de către cele dominante după încrucişare.

Tabelul 1 Dinamica creşterii în diametru a puieţilor stejarului pedunculat la care este aparentă

heterozigoţia şi depresiunea consangvină

Manifestarea Diametrul mediu, mm

Diametrul min/max al

puieţilor, mm

Devierea medie pătrată

Eroarea mediei

Criteriul Student calculat

P

Creşterea în înălţime la 1 an Heterozigoţiei 6,2 6,0/7,0 0,426 0,114 Depresiunii consangvine 2,9 2,0/3,0 0,242 0,042 26,983 <0,001

Creşterea în înălţime la 2 ani Heterozigoţiei 13,3 12,0/16,0 1,291 0,323 Depresiunii consangvine 6,6 6,0/7,0 0,500 0,125 19,141 <0,001





175

Un anumit interes prezintă analiza valorilor maxime şi minime ale diametrului puieţilor (Tab.1). Sunt evidente diferenţe semnificative de creştere dintre puieţi după caracterul urmărit pe parcursul perioadei de observaţie. Astfel, după primul an de viaţă diametrul cel mai mic al puietului a fost de 2 mm, cel mai mare fiind de 7 mm. După al 3-lea sezon de vegetaţie tendinţa creşterii diferenţiate a puieţilor s-a păstrat, astfel încât puietul cu diametrul cel mai mare l-a depăşit în creştere pe cel mai mic de 2,5 ori. Diferenţe de creştere şi mai pronunţate dintre puieţi au fost semnalate după al 5-lea an de viaţă. Puietul cu creşterea cea mai rapidă l-a depăşit de 18,7 ori în acest an pe cel cu creşterea cea mai lentă. De aici se poate deduce că consangvinizarea provoacă în mod necesar reducerea vigorii de creştere la o parte de puieţi, pentru că în rezultatul segregării la aceşti stejărei probabil au fost fixate genele recesive nefavorabile. În plus, modul de acţiune a genelor dăunătoare devine mai expresiv odată cu înaintarea în vârstă a puieţilor. Factorii recesivi defavorabili care provoacă „depresiunea consangvină” şi care, în consecinţă, frânează creşterea în diametru a puieţilor se exteriorizează progresiv cu vârsta. Din cauza acestei consangvinizări, schimbările genetice la unii puieţi sunt rapide, stejăreii sunt lipsiţi de adaptare, au creşteri slabe, iar careva indivizi încep să se usuce de la vârf. De fapt, reducerea vigorii de creştere în diametru a puieţilor ca rezultat al fixării genelor recesive nefavorabile poate fi evaluată. Dacă, de exemplu, după al 5-lea an de viaţă stejărelul cu diametrul cel mai mare înregistrat avea valoarea de 75 mm, atunci efectul „depresiunii consangvine” asupra creşterii puietului cu cel mai mic diametru are valoarea de 5,3%, a următorului – de 6,7%. De aici rezultă că reducerea vigorii de creştere la stejărei variază de la valori apropiate de zero până la 100%, adică până la manifestarea heterozigoţiei.

0102030405060

0 1 2 3 4 5 6

vârsta, ani

mm heterozigoţia

despres. consang.

Din Figura 1 se remarcă faptul că diferenţele de creştere după diametru a puieţilor de stejar în colectivităţile

unde se manifestă heterozigoţia şi „depresiunea consangvină” de la început au fost neînsemnate, însă, odată cu înaintarea în vârstă a puieţilor, au devenit mai elocvente. Este evident că puieţii din colectivitatea unde se întrevede heterozigoţia au avut o creştere progresiv exponenţială. Aceasta înseamnă că creşterea stejăreilor după diametru a devenit mai rapidă cu vârsta. După al 5-lea an de viaţă ei creşteau aproape de 2,3 ori mai repede decât puieţii din colectivitatea în care a fost observată „depresiunea consangvină”. Se poate presupune că pierderea vigorii de creştere a puieţilor din colectivitatea unde se manifestă „depresiunea consangvină” se datorează acumulării factorilor recesivi defavorabili după încrucişarea dintre arborii înrudiţi.

Tabelul 2 Variabilitatea diametrului puieţilor în colectivităţile de puieţi în care este aparentă

heterozigoţia şi „depresiunea consangvină” (în %)

Manifestarea După un an După 2 ani După 3 ani După 4 ani După 5 ani

Heterozigoţiei 6,9 9,7 8,8 7,0 7,8

Depresiunii consangvine 8,2 7,5 7,5 16,1 28,9

Fig.1. Dinamica creşterii în diametru a puieţilor la care se manifestă heterozigoţia şi depresiunea consangvină.

heterozigoţia despresiunea consangvină



176

În Tabelul 2 este redată magnitudinea de variabilitate a diametrului puieţilor de stejar în colectivităţile de puieţi în care este aparentă heterozigoţia şi „depresiunea consangvină”. Din datele prezentate se observă că în primii trei ani de viaţă puieţii din ambele colectivităţi s-au caracterizat printr-un grad redus de variabilitate (de la 6,9 până la 9,7%). În următorii ani gradul de variabilitate a puieţilor din colectivitatea în care s-a mani-festat heterozigoţia nu s-a schimbat simţitor în comparaţie cu anii precedenţi. Dimpotrivă, în colectivitatea unde a fost aparentă „depresiunea consangvină” a fost sesizată o altă tendinţă de creştere după diametru a puieţilor. Astfel, după al 4-lea an de viaţă variabilitatea diametrului la puieţi a crescut, comparativ cu anul 3 de viaţă, cu 8,6%, iar în al 5-lea – cu 21,4%. Tendinţa creşterii diferite a puieţilor consangvini trebuie pusă în legătură cu sistemul de încrucişare a stejarului. După cum s-a arătat mai sus, stejarul este o specie cu polenizare încrucişată. De aceea, componentele florale femele ale arborelui matern interceptează gameţi purtători de informaţie genetică diferită. Unele încrucişări menţin heterozigoţia, deoarece la polenizare se unesc elemente reproducătoare care conţin gene diferite în cromozomii omologi. În acest caz, genele recesive dăunătoare se „acoperă” cu genele dominante, ceea ce nu se răsfrânge negativ asupra creşterii descendenţilor astfel obţinuţi. Se produc, de asemenea, polenizări ale arborelui matern cu indivizi purtători de informaţie ereditară asemă-nătoare (adică cu indivizi înrudiţi). Asemenea hibridări fac ca pentru mai mulţi locuşi genele recesive să fie prezente în ambii cromozomi omologi. Descendenţii obţinuţi din asemenea încrucişări pot fi homozigoţi după mai multe gene recesive dăunătoare, fapt care reduce vitalitatea şi energia de creştere a puieţilor de stejar.

Concluzii 1. Specificul polenizării încrucişate a arborilor situaţi pe liziere face ca descendenţii obţinuţi de la ei să

aibă tendinţe de creştere diferite. La o parte de puieţi se manifestă o creştere viguroasă, iar la o altă parte creş-terea este frânată.

2. Unele încrucişări care au loc între arborele matern cu alţi indivizi menţin heterozigoţia, ceea ce determină o creştere rapidă la descendenţi. Probabil, în urma încrucişării se unesc elemente reproducătoare diferite, caz în care genele recesive dăunătoare se „acoperă” cu genele dominante.

3. Alte încrucişări se realizează cu polenul provenit de la arborii înrudiţi celui matern. În asemenea condiţii, la descendenţi se manifestă „depresiunea consangvină”, care se datorează acumulării factorilor recesivi defa-vorabili. În consecinţă, puieţii au o creştere lentă şi o adaptare redusă.

Referinţe:

1. Cuza P., Ţîcu L. Starea pădurii şi reconstrucţia ecologică a arboreturilor degradate // Natura rezervaţiei „Plaiul Fagului”. - Chişinău; Rădenii-Vechi: Universul, 2005, - p.397-424.

2. Enescu V. Genetica ecologică. - Bucureşti: Ceres, 1985. - 236 p. 3. Schreiner E.I. Foresttrce Breeding technique. // Journal of Forestry. - 1938. - Vol.36. - No7. 4. Wright W. Jonathan. Aspecte genetice ale ameliorării arborilor forestieri. - Bucureşti: Organizaţia Naţiunilor Unite pentru

Alimentaţie şi Agricultură, 1965. - 368 p. 5. Гершензон С. М. Мобилизационный резерв внутрипопуляционной изменчивости // Журнал общей биологии. -

1941. - Т.2. - 1. - С.85-107. 6. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. - Москва: Наука, 1984. - 424 с. 7. Пятницкий С.С. Селекция дуба. - Москва-Ленинград: Гослесбумиздат, 1954. - 147 с.



177

STUDIUL CREŞTERILOR ÎN ÎNĂLŢIME A PUIEŢILOR STEJARULUI PEDUNCULAT

(Quercus robur L.) DE DIFERITĂ PROVENIENŢĂ

Petru CUZA, Lilia ŢÎCU

Rezervaţia Ştiinţifică „Plaiul Fagului” Features of growth in height of experimental cultures of a pedunculata oak (Quercus robur L.) of a various ecological

origin are investigated. It is revealed, that sapling an oak of a various origin it has peculiar high variability on growth rate in height. During time sapling which has been brought up from acorn collected of a large forest „Plaiul Fagului” differed the average force of growth. They grew much worse sapling of Edineţ origin. Such a character of growth sapling of local origin results in a conclusion that local ecological conditions on the given level of development have no deciding influence on the growth sapling of an oak. The increase with the years of the level of variability sapling occurred with northern and southern ecological zone, speaks of a lower viability of a certain part of these sapling in new conditions of environment.

Introducere Stejarul pedunculat (Quercus robur L.) ocupă în Republica Moldova o suprafaţă de 78,2 mii ha, ceea ce

reprezintă 24% din teritoriul acoperit cu păduri şi 55,7% din cel al cvercineelor [1]. La nordul republicii ste-jarul formează păduri cu cireş; în centru ocupă partea inferioară a văilor până la altitudinea de 200-220 m, unde formează păduri de şleau; în sud se întâlneşte în depresiuni la înălţimi mai mici decât cele ale gorunului [2]. În văile r. Nistru şi Prut stejarul creşte în condiţii ecologice specifice.

Prin multiplele funcţii ecologice pe care le îndeplinesc: de protecţie a solurilor, climatică, hidrologică, sanitară, pădurile de stejar joacă un rol deosebit pentru teritoriul republicii, care constă în menţinerea echilibrului eco-logic. La ora actuală aceste păduri sunt frecvent vizitate de populaţie în scopuri de recreare.

Importanţa economică a stejăretelor reiese din faptul că aceşti arbori formează trunchiuri de dimensiuni mari cu lemn de valoare incontestabilă [3]. După calităţile tehnologice deosebite lemnul de stejar are o între-buinţare largă în construcţii civile şi hidraulice, în industria mobilieră, pentru stâlpi, piloţi şi grinzi [4].

Având în vedere valoarea ecologică şi economică deosebită a pădurilor de stejar pedunculat în Republica Moldova, este nevoie de o corectă folosire în cultură a materialelor forestiere de reproducere (seminţe, puieţi) din această specie, astfel încât devin necesare experimentele cu culturile de provenienţe. De fapt, din punct de vedere teoretic, cercetarea culturilor de provenienţă se desfăşoară pentru a identifica mersul proceselor evolu-tive în relaţia lor cu factorii mediului ambiant, în care s-au dezvoltat arborii. Studiile privind culturile de pro-venienţă se realizează şi cu scopuri strict practice pentru aprecierea variabilităţii genetice naturale şi selectarea celor mai bune familii şi provenienţe pentru lucrările de împădurire sau pentru investigaţiile ulterioare de selecţie [5]. Experimentarea judicioasă a diferitelor provenienţe la stejar poate să-i ofere silvicultorului un câştig în plus de materie lemnoasă de circa 5-15% atunci când se va obţine sămânţa din acele arborete care au produs cele mai bune descendenţe. Deoarece astăzi nu este încă cunoscută cu exactitate distanţa de transfer a ghindei stejarului fără un risc pentru viitoarele plantaţii forestiere, culturile de descendenţe constituite în rezervaţia „Plaiul Fagului” vor oferi în viitorul apropiat informaţii referitoare la oportunitatea transferului ghindei între diferite zone ecologice din Republica Moldova.

Material şi metode În culturile de provenienţă din rezervaţia „Plaiul Fagului” se experimentează caracteristicile de creştere ale

puieţilor de stejar pedunculat proveniţi din ghinda recoltată în masivele forestiere ale ocoalelor silvice Edineţ, Hârjauca, Zloţi, Baimaclia, precum şi din rezervaţia „Plaiul Fagului”. Arboretele naturale din care a fost adunată ghinda sunt bine repartizate şi se găsesc în spaţiul celor trei zone ecologice distincte: nord, centru şi sud [6]. Fiecare provenienţă a inclus ghinda recoltată de la 10 arbori de stejar dominanţi în arborete. La selectarea arborilor s-au luat în vedere caracteristicile dimensionale şi însuşirile lor calitative. Arborii au fost marcaţi cu vopsea albă cu numere de la 1 la 10. Semănatul s-a efectuat în toamna anului 2003 pe loturi experimentale de formă dreptunghiulară delimitate pentru fiecare provenienţă. Ghinda provenită de la un anumit arbore a fost



178

semănată în cincisprezece cuiburi distanţate între ele la 1 metru. În fiecare cuib la adâncimea de 6-7 cm s-au introdus câte 5-6 ghinde. Rândul de puieţi format din ghinda rezultată de la un anumit arbore a fost denumit familie. O anumită provenienţă a fost constituită din 10 familii diferite aşezate în rânduri separate la distanţa de 1 m, orânduite în conformitate cu numerele în creştere ale arborilor de la care s-a recoltat ghinda.

În scopul evidenţierii caracteristicilor de creştere ale puieţilor în diferite provenienţe, s-a recurs la împărţirea lor pe categorii de creştere: rapidă, medie şi lentă. Împărţirea s-a făcut pe baza valorilor medii ale fiecărei provenienţe care s-au comparat cu valoarea medie generală a înălţimii puieţilor. S-a acceptat că provenienţele care au avut valorile medii cuprinse în intervalul unei abateri medii generale () să fie considerate cu creşteri medii, cele care au depăşit sau au fost situate dedesubtul acestei limite să fie atribuite ca având creşteri rapide sau lente [7].

În cadrul investigaţiilor de teren înălţimea puieţilor a fost măsurată cu ruleta (precizia 3 mm). Compararea provenienţelor şi a familiilor s-a făcut pe baza valorilor lor medii aplicându-se testul Student [8].

Rezultate şi discuţii Pretutindeni în lume, în special în ţările din Europa de Vest, la constituirea plantaţiilor forestiere o atenţie

deosebită se atrage calităţii puieţilor. Este ştiut că calitatea puieţilor depinde, în primul rând, de calitatea seminţelor. De aceea, certificarea şi standardizarea care include aprecierea însuşirilor genetice ale seminţelor, provenienţa lor, calitatea loturilor de seminţe au fost adoptate în mai multe ţări. Calitatea culturilor forestiere depinde în mare măsură de provenienţa seminţei. Pentru speciile cu areale întinse, care cresc în diferite zone fitogeografice, folosirea corectă în cultura forestieră a seminţelor conform provenienţei lor este o problemă destul de importantă pentru obţinerea unor plantaţii viabile, durabile şi înalt productive.

După cum s-a menţionat, stejarul pedunculat creşte pe teritoriul republicii în diferite condiţii ecologice. În acest sens un anumit interes prezintă cunoaşterea caracteristicilor de creştere ale puieţilor proveniţi din zona de nord, centru şi sud instalaţi în condiţiile teritoriului rezervaţiei „Plaiul Fagului”. În Tabelul 1 se prezintă particularităţile de creştere în înălţime ale puieţilor de stejar proveniţi din ghinda recoltată din cinci localităţi diferite. Datele Tabelului denotă că pe parcursul anilor al 2-lea şi al 3-lea de viaţă provenienţele din Edineţ şi Hârjauca au crescut, comparativ cu altele, mai repede în înălţime. Astfel, provenienţa din Edineţ avea la 3 ani creşterea cea mai rapidă atingând înălţimea medie de 64,9 cm. Ea a crescut cu 37,2% mai repede comparativ cu provenienţa din Baimaclia, unde a fost surprinsă creşterea cea mai lentă. Diferenţa dintre provenienţe după caracterul urmărit a fost statistic asigurată (P = 99,9%; tcalc. = 6,052) (Tab.3). Provenienţele din Zloţi şi rezervaţia „Plaiul Fagului” aveau o viteză de creştere asemănătoare, însă întrucâtva mai scăzută decât provenienţele din Edineţ şi Hârjauca. La aceste provenienţe după 2 ani de viaţă, de exemplu, înălţimile medii difereau foarte puţin, neputând fi identificate deosebiri semnificative (Tab.2). Din datele prezentate rezultă că dintre proveni-enţele „locale” doar cea din Hârjauca era în grupa din cap, dar nu era cea mai bună, fiind depăşită de cea din Edineţ. Un alt aspect care poate fi sugerat este că stejarul pedunculat se dovedeşte a fi o specie variabilă. Aceasta pentru că majoritatea provenienţelor încercate pot fi identificate statistic dintre celelalte provenienţe pentru caracterul studiat (Tab.2,3).

Tabelul 1 Valorile medii şi coeficienţii de variaţie a înălţimii puieţilor

de stejar pedunculat de diferită provenienţă

O.S. Edineţ O.S. Hârjauca Plaiul Fagului O.S. Zloţi O.S. Baimaclia Vârsta, ani X , cm C,% X , cm C,% X , cm C,% X , cm C,% X , cm C,% 2 43,2 35,2 44,1 29,4 39,4 30,4 41,1 23,6 36,1 29,4 3 64,9 42,8 60,8 31,1 52,0 32,4 52,7 31,7 47,3 38,2

Clasarea valorilor medii ale culturilor comparative de provenienţă în raport cu media generală a evidenţiat

că provenienţele din Edineţ şi Hârjauca ai căror părinţi vegetau în zone ecologice diferite (de nord şi centru) s-au caracterizat prin cele mai mari creşteri. O creştere medie a fost proprie provenienţelor din „Plaiul Fagului” şi Zloţi, care provin şi ele din teritorii diferite (de centru şi sud). Descendenţa din Baimaclia a manifestat o rapiditate de creştere lentă. Clasificarea culturilor de provenienţă după puterea de creştere a puieţilor nu este


179

întâmplătoare, pentru că nu au fost găsite deosebiri semnificative dintre descendenţele care se caracterizau prin rapiditate de creştere similară (cum ar fi, de exemplu, dintre Edineţ şi Hârjauca). În schimb, diferenţele în rapiditatea de creştere a provenienţelor care aveau o putere de creştere diferită erau statistic semnificative (Tab.2,3). De aici rezultă că factorii ecologici ai locului de cultură nu au influenţat substanţial asupra rapidităţii de creştere a provenienţei „locale”.

Tabelul 2 Matricea valorilor lui tcalc. dintre provenienţe apreciate după creşterea puieţilor

în înălţime la vârsta de 2 ani şi semnificaţia lor

Provenienţa 1 2 3 4 5 1. O.C. Edineţ - 0,575 2,378* 1,398 4,679*** 2. O.S. Hîrjauca 0,575 - 3,253** 2,264* 5,858*** 3. Plaiul Fagului 2,378* 3,253** - 1,351 2,529* 4. O.S. Zloţi 1,398 2,264* 1,351 - 4,277*** 5. O.S. Baimaclia 4,679*** 5,858*** 2,529* 4,277*** -

Notă: semnificativ la pragul de: * 5%, ** 1%, *** 0,1%. Analiza creşterii în înălţime a puieţilor din diferite familii în interiorul provenienţelor a evidenţiat diferenţe

pronunţate între înălţimile medii ale familiilor. De exemplu, după al 2-lea sezon de vegetaţie în cadrul pro-venienţei din Edineţ puieţii rezultaţi de la arborele nr.6 au realizat înălţimea medie cea mai mică (de 30,0 cm). În schimb, suficient de mult au crescut puieţii din familiile provenite de la arborii nr.3 şi 4, unde au fost semna-late cele mai mari înălţimi. În fruntea clasamentului s-a plasat familia obţinută de la arborele nr.4, având creşterea cea mai rapidă. Este impresionant faptul că puieţii din această familie, comparativ cu cei proveniţi de la arborele nr.6 au avut o viteză de creştere cu 85,3% mai rapidă. De asemenea, puieţii obţinuţi de la arbo-rele nr.4 au depăşit semnificativ (cu 28,7%) înălţimea medie a descendenţilor proveniţi din Edineţ (P = 99,9%; tcalc. = 4,503). Diferenţe pronunţate între creşterea puieţilor în diferite familii au fost sesizate şi în celelalte provenienţe. De aici rezultă că în interiorul populaţiilor naturale de stejar există o vastă eterogenitate a indi-vizilor după puterea de creştere a descendenţilor. Evidenţierea unor deosebiri semnificative între genotipuri după caracterul cercetat va permite ca peste un anumit interval de timp (pe măsura înaintării în vârstă a puie-ţilor) să se intervină cu lucrări de selecţie pentru interceptarea celor mai bune familii.

Tabelul 3 Matricea valorilor lui tcalc. dintre provenienţe apreciate după creşterea puieţilor

în înălţime la vârsta de 3 ani şi semnificaţia lor

Provenienţa 1 2 3 4 5 1. O.S. Edineţ - 1,386 4,519*** 4,330*** 6,052*** 2. O.S. Hîrjauca 1,386 - 3,965*** 3,730*** 5,892*** 3. Plaiul Fagului 4,519*** 3,965*** - 0,341 2,178* 4. O.S. Zloţi 4,330*** 3,730*** 0,341 - 2,554* 5. O.S. Baimaclia 6,052*** 5,892*** 2,178* 2,554* -

Notă: semnificativ la pragul de: * 5%, *** 0,1%. Cercetarea caracteristicilor de creştere a descendenţilor în diferite provenienţe a scos în evidenţă un grad

înalt de variabilitate a puieţilor de stejar după înălţime. Din datele prezentate în Tabelul 1 reiese că puieţii din provenienţele Zloţi şi Baimaclia după al 2-lea an de viaţă au avut o variabilitate de 23,6-29,4%. În urmă-torul an gradul de variabilitate a puieţilor din interiorul acestor provenienţe a crescut vădit cu 8,1-8,8%. O ten-dinţă similară se observă şi la puieţii din provenienţa Edineţ. Puieţilor din provenienţa „Plaiul Fagului” le-a fost specifică însă o variabilitate similară (de 30,4-32,4%). Devine evident că ritmul de creştere a unui anumit număr de puieţi proveniţi din arborete naturale situate în sudul şi nordul republicii a scăzut cu vârsta, în schimb alţii au crescut suficient de repede. Se poate presupune că puieţii cu creşteri lente devin cu vârsta mai puţin adaptaţi condiţiilor de mediu ale locului de cultură. Creşterea puieţilor în noile condiţii de trai, deosebite de



180

cele din care provin, se răsfrânge, evident, asupra caracteristicilor lor de creştere. Factorii staţionali improprii exigenţelor ecologice ale unor genotipuri fac ca vitalitatea şi adaptabilitatea puieţilor şi a unor familii întregi să scadă treptat.

Concluzii 1. După caracteristicile de creştere în înălţime a puieţilor în culturile de provenienţă stejarul pedunculat

poate fi considerat ca specie variabilă. Această variabilitate se datorează creşterilor statistic deosebite ale puieţilor de diferită provenienţă.

2. Puieţii de provenienţă „locală” se deosebesc de cei de altă provenienţă printr-o creştere medie în înălţime. La această fază de dezvoltare factorii ecologici ai locului de cultură nu influenţează semnificativ rapiditatea de creştere a puieţilor de provenienţă „locală”.

3. Variabilitatea înălţimii puieţilor proveniţi din zona de nord şi cea de sud ale republicii creşte cu înaintarea în vârstă a puieţilor. Este evident că noile condiţii de trai sunt pentru o parte din aceşti puieţi mai puţin prielnice comparativ cu cei de provenienţă locală. Factorii de mediu ai locului de cultură determină o mai mare viabilitate a puieţilor, favorizând creşterea mai viguroasă pentru unii puieţi şi slăbind vigoarea de creştere a altora.

Referinţe:

1. Raport naţional cu privire la starea fondului forestier al Republicii Moldova. - Chişinău: PRAG-3, 1997. - 48 p. 2. Postolache Gh. Vegetaţia Republicii Moldova. - Chişinău: Ştiinţa, 1995. - 340 p. 3. Каппер О.Г. О восстановлении высококачественных дубрав в лесостепи // Научные записки ВЛТИ. - 1960. -

Т.XX. - С.35-45. 4. Negulescu E.G., Stănescu V. Dendrologia, cultura şi protecţia pădurilor. Vol.I. - Bucureşti: Editura Didactică şi

Pedagogică, 1964. - 500 p. 5. Райт В. Джонотан. Введение в лесную генетику. - Москва: Лесная промышленность, 1978. - 471 с. 6. Gociu D., Cuza P. Distribuirea pădurilor pe zone ecologice // Защита растений. - 2004. - 7. C.4-5. 7. Мамаев С.А. Основные принципы методики исследования внутривидовой изменчивости древесных растений //

Труды Ин-та экол. раст. и животных. - 1975. - Вып.94. - С.3-14. 8. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. - Москва: Наука, 1984. - 424 с.




181

DINAMICA DEZVOLTĂRII ALGELOR CHLORELLA VULGARIS ŞI

SYNECHOCYSTIS SALINA PE MEDII CU ADAOS DE APE REZIDUALE DE

CANALIZARE DE LA STAŢIA DE EPURARE DIN mun. CHIŞINĂU

Natalia DONŢU

Catedra Ecologie, Botanică şi Silvicultură

This article includes the research results about the dinamic development of algaes Chlorella vulgaris and Synechocystis salina of medium with addition residue water of the cleaning station of Chisinau municipality.

Introducere Apa este mediul de bază al numeroaselor grupe sistematice din fauna şi flora Terrei [1]. Datorită progre-

sului tehnico-ştiinţific, în ultimii ani s-a extins diversitatea poluanţilor în apă până la gradul suprem, apa devenind periculoasă pentru activitatea vitală a organismelor vii [2]. La stoparea procesului de poluare, pe lângă metodele fizico-chimice aplicate, la ora actuală un mare accent se pune pe metodele biologice [3]. Aplicarea unor specii de microalge are un mare rol la purificarea apelor. Ele au importanţă şi în procesul de constituire a calităţii apei [4]. Este cunoscut faptul că în procesul de cultivare a algelor în apă concomitent au loc două procese interdependente – sinteza biomasei şi purificarea apei. Cu cât mai multă biomasă algală se acumulează în bazin cu atât mai intens şi mai eficient are loc procesul de purificare a mediului acvatic [5]. Biomasa algală sintetizată prezintă o sursă bogată de vitamine şi proteine, care pot fi folosite ca supliment la hrana animalelor [6-8].

Pentru elucidarea rolului microalgelor în procesul de epurare a apelor menajere de canalizare orăşeneşti, în experienţele ulterioare au fost antrenate două specii de microalge: Chlorella vulgaris şi Synechocystis salina.

Material şi metode Probele de apă menajeră au fost prelevate la Staţia de epurare biologică a mun. Chişinău atât de la intarea

în staţie, cât şi la ieşire, înainte de reversarea în râul Bâc. Culturile de microalge Chlorella vulgaris şi Synechocystis salina au fost preluate din Laboratorul de Algologie al USM. Experienţele au fost efectuate în condiţii de laborator. Dinamica efectivului numeric a fost calculată peste două zile timp de două săptămâni, cu ajutorul camerei Goreaev [9]. Variaţia cantităţii de biomasă algală a fost calculată conform metodicii prezentate în [10]. Algele au fost cultivate pe apele menajere relevate la intrare în Staţia de epurare şi după epurare în locul de deversare în râul Bâc. Concentraţiile apelor menajere au fost aceleaşi pentru ambele specii:1, 5, 10, 15 şi 20%.

Rezultate şi discuţii Apa menajeră de la Staţia de epurare a mun. Chişinău conţine o diversitate mare de substanţe şi elemente

chimice, care sunt şi în mediile nutritive de cultivare a algelor (pentru C. vulgaris – Tamia, iar pentru S. salina – Bristol). De aceea, algele pot creşte şi pe medii cu adaos de ape menajere de canalizare, dat fiind faptul că în procesul de purificare biologică are loc creşterea intensă a biomasei algale [11].

În această lucrare sunt elucidate rezultatele experienţelor privitor la particularităţile de dezvoltare a algelor Chlorella vulgaris şi Synechocystis salina pe medii cu adaos de ape menajere de la Staţia de epurare a mun. Chişinău şi la valorificarea biomasei algale obţinute pe aceste medii.

După cum denotă datele din Tabelele 1 şi 2, în primele două zile ale experienţei s-a observat o micşorare bruscă a efectivului numeric. Numărul iniţial la C. vulgaris era de 1680, la S. salina – de 1040, iar la a 2-a zi varia la C. vulgaris între 320 şi 480 şi la S. salina între 160 şi 400 de celule la 1 ml de mediu.

Reducerea bruscă a efectivului numeric a avut loc din cauza că algele erau în perioada de adaptare la astfel de condiţii, iar la a 4-a zi au început să se dezvolte mai intens, ca la a 6-a zi efectivul numeric să se tripleze.

C. vulgaris se înmulţeşte mai intens decât S. salina (Tab.2), fapt demonstrat de punctele lor maximale, la C. vulgaris – 26120 de celule (Tab.1), iar la S. salina – doar 15320 de celule la 1 ml de mediu (Tab.2).



182

Tabelul 1

Dinamica efectivului numeric al algei C. vulgaris cultivate pe medii de apă menajeră a mun. Chişinău

Numărul de celule la 1 ml, în zile % de apă menajeră pH-ul

Numărul iniţial de celule la

1 ml 2 4 6 8 10 12 14 Apa poluată de la intrare în Staţia de epurare

1 480 1280 8280 14880 26120 25280 23040 5 320 1440 5600 7920 18160 17680 16840

10 400 1520 4480 4160 13280 15440 16480 15 480 1440 4880 5280 7440 8080 11760 20

6,0 1680

560 16680 4240 7360 7840 9360 13120 Apa poluată de la ieşire din Staţia de epurare

1 320 960 1600 4880 8960 19360 18080 5 400 1120 3360 3680 7440 7760 8080

10 400 960 3040 6320 5520 6240 6640 15 480 880 3000 3840 6640 6880 76280 20 400 1040 4000 4240 7760 7920 8960

Mediu

6,0 1680

480 960 1600 3200 4960 5680 6080

Tabelul 2

Dinamica efectivului numeric al algei S. salina cultivate pe medii de apă menajeră a mun. Chişinău

Numărul de celule la 1 ml, în zile % de apă menajeră pH-ul

Numărul iniţial de celule la

1 ml 2 4 6 8 10 12 14

Apa poluată de la intrare în Staţia de epurare 1 160 480 1520 2080 2640 2880 3360 5 320 720 1360 1680 2080 2480 3040

10 320 880 1840 2320 2880 3360 3920 15 400 1120 2480 2720 3200 3760 6160 20

6,0 1040

410 1520 2420 8760 14080 15320 15280 Apa poluată de la ieşire din Staţia de epurare

1 320 960 2000 1840 2160 2560 2880 5 480 1120 2320 2080 2240 2880 3280

10 400 1280 2560 2880 3120 3520 3920 15 320 1440 3840 3120 3280 3840 4480 20 400 1920 7800 13760 1424 14720 14960

În Mediu

6,0 1040

480 880 1840 2440 2110 2480 2520 E de menţionat că cu cât efectivul numeric este mai mare în zilele 10-14 ale experienţei, cu atât mai mici

sunt dimensiunile celulelor. La C. vulgaris diametrul celulelor a fost de 2,89 µm, iar la S. salina – de 2,82 µm. La intare, apa este mai poluată şi conţine multe substanţe în suspensie. De aceea, atât la C. vulgaris, cât şi la S. salina se observă o creştere a efectivului numeric pe astfel de medii, fapt ce influenţează şi cantitatea de biomasă. Căci un efectiv numeric înalt va produce o cantitate de biomasă mare.



183

Variaţia cantităţii de biomasă este reprezentantă în figurile ce urmează. La C. vulgaris în variantele cu apă reziduală de la intrare (Fig.1) se atestă oscilări bruşte ale cantităţii de biomasă. La proba cu 5% de apă poluată de la intrarea în Staţia de epurare în primele zile cantitatea este mică, dar spre a 14-a zi atinge rezultatul maxi-mal al experinţei (19,56 g/l).

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7

zilele

biom

asa

g/l

1%5%10%15%20%mediul Tamia

Fig.1. Dinamica biomasei algei Chlorella vulgaris (g/cm3) cultivate pe medii cu diferite

concentraţii de ape reziduale de la intrarea în Staţia de epurare a mun. Chişinău.

În varianta cu 1% de apă poluată are loc o oscilare bruscă a cantităţii de biomasă în zilele a 4-a – a 10-a, după care treptat scade. Pe când la cea cu 10% până la a 6-a zi se observă o creştere bruscă, după care treptat scade spre sfârşitul experimentului, fapt observat şi la proba cu 20% de apă poluată de la ieşirea din Staţie.

În varianta cu apă reziduală de la ieşirea din Staţia de epurare (Fig.2), la cea cu 1% iarăşi are loc o creştere vertiginoasă a biomasei, însă la a 10-a zi are loc o scădere bruscă, dar îşi revine la normal, astfel ca la 12-a zi să atingă cantitatea maximală din toate aceste probe (19,2 g/l).

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7

zilele

biom

asa

g/l

1%5%10%15%20%mediul Tamia

Fig.2. Dinamica biomasei algei Chlorella vulgaris (g/cm3) cultivate pe medii

cu diferite concentraţii de ape reziduale de la ieşirea din Staţia de epurare a mun. Chişinău.

În varianta cu 5% de apă poluată punctul maximal e în a 12-a zi, după care începe o scădere lentă. Iar la cea cu 10% se observă o creşere bruscă la a 6-a şi a 8-a zi, obţinându-se rezultate maximale, dar spre sfârşitul experienţei scade.

Pe când în variantele cu 15 şi 20% de apă poluată au loc mici oscilări ale cantităţii minimale de biomasă. În a 14-a zi la toate probele se atestă o scădere a biomasei algale din cauza micşorării cantităţii de substanţe nutrititive.

După cum am observat, la S. salina variaţia efectivului numeric şi biomasa algală ating cote mai mici, spre deosebire de rezultatele obţinute la C. vulgaris. La probele cu apă poluată de la intrarea în Staţia de epurare (Fig.3) rezultatele maximale se atestă în zilele a 10-a şi a 12-a în variantele cu concentraţia 15-20% de apă poluată, şi anume: 15,36; 15,25 g/l.

2 4 6 8 10 12 14

2 4 6 8 10 12 14

biom

asa,

g/l

biom

asa,

g/l



184

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5 6 7

zilele

biom

asa

g/l

1%5%10%15%20%mediul Bristol

Fig. 3. Dinamica biomasei algei Synechocystis salina (g/cm3) cultivate pe medii cu diferite concentraţii

de ape reziduale de la intrarea în Staţia de epurare a mun. Chişinău.

În variantele de 1% de apă poluată dinamica biomasei are şi urcuşuri şi coborâri, spre deosebire de cea cu 10%, unde cantitatea de biomasă creşte treptat. Însă, punctul său maximal obţinut în a 12-a zi (7,23 g/l) nu se echivaleză celor obţinute anterior.

Cea mai înaltă cotă de biomasă algală s-a observat în varianta cu apa reziduală de canalizare de la intrarea în Staţia de epurare (Fig.3), şi anume: la proba cu 20% în a 12-a zi de cultivare (15,39 g/l).

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7

zilele

biom

asa

g/l

1%5%10%15%20%mediul Bristol

Fig. 4. Dinamica biomasei algei Synechocystis salina (g/cm3) cultivate pe medii cu diferite concentraţii

de ape reziduale de la ieşirea din Staţia de epurare a mun. Chişinău Şi la S. salina în a 14-a zi se observă o scădere a cantităţii de biomasă.

Concluzii Rezultatele investigaţiilor efectuate ne permit să concluzionăm că C. vulgaris cel mai bine se dezvoltă în

probele cu 1 şi 5% de apă poluată – atât în apa poluată de la intrare, cât şi în cea de la ieşire din Staţia de epurare. S. salina mai intens se desvoltă în mediile cu 15,20% adaos de apă poluată. Rezultate optime se obţin la apa reziduală de canalizare de la ieşirea din Staţia de epurare.

Aşadar, apa reziduală de canalizare de la Staţia de epurare biologică a mun. Chişinău poate fi utilizată în calitate de sursă nutritivă la cultivarea algelor C. vulgaris şi S. salina. Doar că este necesar să se mărească treptat procentajul de apă poluată.

2 4 6 8 10 12 14

2 4 6 8 10 12 14

biom

asa,

g/l

bi

omas

a, g

/l



185

În baza rezultatelor obţinute, putem constata că în ce priveşte posibilitatea cultivării algelor pe medii cu adaos de ape reiduale de canalizare se deschid largi perspective pentru obţinerea biomasei algale favorabile, care deja se utilizează în cele mai diverse domenii ale zootehniei, în industria farmaceutică, cosmetologică etc.

Referinţe:

1. Котова Л.И. и др. Биологический контроль качества вод. - Москва: Наука, 1989, с.4. 2. Мельников С.С. Хлорелла: физиологически активные вещества и их использование. - Минск: Наука i тэхнiка,

1991, с.43. 3. Музафаров А.М., Васигов Т.В. Водоросли и водно-болотные растения в биологической очистке сточных

вод. - Ташкент: Фан, 1987, с.3. 4. Оксюк О.П. Водоросли каналов мира. - Киев: Наукова думка, 1973, с.114. 5. Физиолого-биохимические аспекты культивирования водорослей и высших водных растений в Узбекистане.

- Ташкент: Фан, 1976, с.14. 6. Всесоюзное совещание по культивированию одноклеточных водорослей. - Ленинград, 1961, с.10. 7. Саут Р.Т. Основы альгологии. - Москва: Мир, 1990, с.235. 8. Параметрическое управление биосинтезом микроводорослей. - Новосибирск: Наука, 1980, с.88. 9. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев:

Наукова думка, 1975, с.13-23. 10. Владимирова М.Т., Семененко В.Е. Интенсивная культура одноклеточных водорослей. - Москва: Изд-во АН

СССР, 1962, с.45. 11. Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. - Chişinău: Ştiinţa, 1993. - 140 p.




186

ИЗМЕНЕНИЕ СУММЫ АЛКАЛОИДОВ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ЭКСТРАКТА ИЗ РАСТЕНИЯ VERATRUM LOBELIANUM BERNH.

В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ

Д.С. ЕЛИСОВЕЦКАЯ

Институт защиты растений и экологического земледелия A fost studiată suma alcoloizilor în extractele vegetale în procesul păstrării o perioadă de un an. S-a apreciat că

substanţele biologic active din planta Veratrum lobelianum Bernh. nu se descompun pe pаrcursul a 365 de zile cu condiţia dacă extractul e păstrat la o temperatură de 22-24oC în vase ermetic închise. A fost demonstrat că eficienţa biologică (insecticidă sau antifidantă) a extractului în combaterea dăunătorului Leptinotarsa decemlineata Say. nu se deosebeşte esenţial pe parcursul perioadei de păstrare. Astfel, a fost apreciat că extractul din Veratrum lobelianum Bernh. poate fi pregătit în cantităţi necesare pe parcursul întregului an.

The change of alkaloids amount in vegetable extract from Veratrum lobelianum Bernh. plant in the process of storage

during one calendar year was studied. It was established that the active substances of Veratrum lobelianum are very stable compounds, and storing the extract in soldered ampoules at the temperature of +22+24оС during at least 365 days they are not ruined. Also it was determined that the biological (insecticide and antifeedante) activity of the vegetable extract against Leptinotarsa decemlineata Say. larva and imago in the process of storage, incidentally changes. As a result we have established that the alcoholic extract from Veratrum lobelianum plant is possible to be prepared from the necessary quantity of ready raw material during the whole calendar year.

Введение Проблемы получения экологически чистой сельскохозяйственной продукции и оздоровления окру-

жающей среды выдвигают необходимость разработки экологически безопасных систем интегрированной защиты сельскохозяйственных культур, направленных на мобилизацию защитных природных сил агробиоценозов, на снижение формирования резистентности вредных организмов к пестицидам и на снижение энергетических и финансовых затрат.

Реализация таких систем предполагает постепенную замену химических пестицидов экологически безопасными биологическими средствами регуляции численности вредных организмов [2, 8]. Среди биологических средств защиты немаловажное значение придается препаратам и экстрактам растительного происхождения.

Плоды и корнеплоды пасленовых культур являются ценным продуктом питания и возделываются в республике почти повсеместно: баклажаны, перцы, томаты, картофель и другие. В комплексе меро-приятий, направленных на получение высокого и доброкачественного урожая этих культур, большое значение имеет борьба с их вредителями и в первую очередь – с колорадским жуком, Leptinotarsa decemlineata Say., который является наиболее опасным и широкораспространенным. Высокая вредо-носность колорадского жука в условиях открытого грунта связана с тем, что в Молдове развиваются 2-3 поколения вредителя и, как правило, каждое из них обладает высокой численностью. Резистентность вредителей к синтетическим пестицидам развивается на протяжении 10-12 поколений, следовательно – возникает необходимость в замене препаратов каждые 3-4 года или в увеличении концентрации действу-ющих веществ [1].

Существующие меры борьбы с колорадским жуком не всегда позволяют снизить его вредоносность до экономически ощутимых размеров. Интенсивное применение химических препаратов при увеличении дозы действующего вещества или количества обработок приводит к нежелательным последствиям, нарушая экологический баланс в природе.

Целью наших исследований было определение изменения суммы активных веществ (алкалоидов) в экстракте растения Veratrum lobelianum Bernh. в процессе хранения. Нами изучались также биологи-ческие показатели экстракта в зависимости от срока его хранения, а именно – инсектицидная и анти-фидантная активность против L.decemlineata.


187

Материалы и методы Экстракцию проводили по общепринятой методике [4] 96%-ным этиловым спиртом (соотношение

сырье-растворитель 1:5). После экстракции, фильтрования и упаривания готовый сухой остаток рас-творяли в 96% этиловом спирте (готовили 20%-ный маточный спиртовой раствор). Перед биотести-рованием экстракт разбавляли дистиллированной водой до нужной концентрации.

Количественное определение алкалоидов в экстракте проводили согласно методике, описанной в фармакопейной статье [5]. Готовый спиртовой экстракт (маточный 20% раствор) в запаянных ампулах хранили в течение 365 дней при температуре +22+24оС и через определенные промежутки времени (на 3, 5, 10, 20, 30, 90, 180 и 365 день) отбирали по 6 ампул, в которых определяли суммарное коли-чество алкалоидов в пересчете на алкалоид протовератрин. За исходное содержание алкалоидов при-нималось значение, определенное в день приготовления экстракта непосредственно перед его фасовкой в ампулы [4].

Одновременно с количественным анализом проводили лабораторное тестирование экстракта рас-тений на наличие антифидантной и инсектицидной активности против L.decemlineata (имаго и личинок по возрастам), согласно стандартной методике [3].

Был проведен однофакторный дисперсионный математический анализ полученных результатов, согласно методике Доспехова Б.А. (1972) [6].

Результаты Из литературных источников [7, 9, 10] известно, что в чемерице Лобеля – Veratrum lobelianum,

присутствуют стероидные алкалоиды, которые содержат такие легкоразрушающиеся группировки, как α-кетольную, гликозидную, сложноэфирную и др. Нам необходимо было определить срок хранения гото-вого экстракта, в течение которого он не утрачивает своих биологически активных свойств. Полученные результаты показали, что содержание алкалоидов в экстракте в процессе хранения практически не изме-няется и колеблется в пределах 0,258-0,260%, максимальная разница между определениями составляет 0,002% (таблица 1). При проведении математического анализа нами было установлено, что существу-ющее отклонение между различными определениями незначительно и им можно пренебречь.

Стабильность активных веществ, содержащихся в экстракте, подтверждается и результатами лабо-раторных опытов по изучению динамики инсектицидной и антифидантной активности хранящегося экстракта против L.decemlineata.

Таблица 1 Определение содержания алкалоидов в экстракте растения Veratrum lobelianum Bernh. в

зависимости от срока хранения

Срок хранения (дни) Контроль 3 5 10 20 30 90 180 365

max отклон. от контроля,

± Содержание aлкалоидов в экстракте, %

0,260 0,259 0,260 0,260 0,259 0,259 0,258 0,259 0,259 0,002

НСР0,05= 0,0022

Экспериментально нами установлено, что инсектицидная активность экстракта в процессе хране-ния может незначительно изменяться. Однако эти изменения не линейны, т.е. с течением времени абсолютная величина инсектицидной активности экстракта не понижается постепенно, а колеблется ± только в пределах ошибки опыта, что подтверждается и математической обработкой (таблица 2). Результаты показывают, что инсектицидная активность экстракта напрямую зависит только от фазы развития вредителя (личинки младших возрастов менее устойчивы к действию экстракта, чем личинки старших возрастов и имаго Leptinotarsa decemlineata Say.). Соответственно и максимальное отклонение инсектицидной активности экстракта от исходного значения тем выше, чем старше возраст вредителя. Так, например, для личинок 1-2 возраста Leptinotarsa decemlineata Say. отклонение от исходного значения колеблется в интервале ± 1,2%, личинок 2-3 возраста – в интервале ±4,5%, для личинок 3-4 возраста отклонение колеблется в пределах 2,2-4,5%, а для имаго - от 2,2 до 6,2%.



188

Таблица 2 Зависимость инсектицидной активности экстракта растения Veratrum lobelianum

от сроков хранения против Leptinotarsa decemlineata Say.

Инсектицидная активность экстракта на … день хранения,% Фаза

вредителя Контроль 3 5 10 20 30 90 365

max отклон.

от контроля,

±

НСР0,05

Личинки 1-2 возр. 98,8 98,8 98,8 100 100 98,8 98,8 98,8 1,2 3,99

Личинки 2-3 возр. 86,7 82,2 82,2 88,9 91,5 86,7 86,7 82,2 4,8 8,8

Личинки 3-4 возр. 60 57,8 62,2 64,5 62,2 60 62,2 60 4,5 6,12

Имаго 40 33,8 37,8 42,2 40 40 44,5 33,8 6,2 7,34

При определении антифидантной активности экстракта в процессе его хранения не было обнаружено

изменений в сравнении с контролем. Экстракт сохранял высокие антифидантные свойства, и объедание листовой пластины не превышало 5%, что по оценочной шкале соответствует 1 баллу (таблица 3).

Таким образом, нами было доказано, что в процессе хранения готового спиртового экстракта расте-ния Veratrum lobelianum в запаянных ампулах при комнатной температуре (+22, +24оС) не происходит сколько-нибудь существенного снижения суммы активных веществ (алкалоидов)и что инсектицидная и антифидантная активность экстракта сохраняется на первоначальном уровне.

Таблица 3 Зависимость антифидантной активности экстракта растения Veratrum lobelianum

от сроков хранения против Leptinotarsa decemlineata Say.

Фаза вредителя Антифидантная активность экстракта на … день хранения, балл*

1 3 5 10 20 30 90 365

Личинки 1-2 возр 1 1 1 1 1 1 1 1

Личинки 2-3 возр 1 1 1 1 1 1 1 1

Личинки 3-4 возр 1 1 1 1 1 1 1 1

Имаго 1 1 1 1 1 1 1 1

* 1 балл соответствует объеданию листовой пластины от 0 до 5%.

Следовательно, мы можем рекомендовать заблаговременную наработку и хранение экстракта в герметически укупоренных стеклянных ёмкостях при комнатной температуре и его последующее применение для защиты пасленовых культур от Leptinotarsa decemlineata Say.

Выводы 1. Установлено, что активные вещества чемерицы Лобеля являются устойчивыми соединениями

и не разрушаются при хранении экстракта. 2. Содержание алкалоидов в экстракте в процессе хранения колеблется в узких пределах и

составляет 0,258-0,260%. 3. Выявлено, что биологическая (инсектицидная и антифидантная) активность экстракта против

личинок и имаго Leptinotarsa decemlineata Say. в процессе хранения изменяется несущественно.


189


1. Алиев Н.А. Ешимбетов Ж. Пестициды растительного происхождения и фитогормоны. - Ташкент: Фан, 1979. 2. Баннова З.В. Необходимость перехода к экологическому земледелию в России (модель Невельского района

Псковской области.). // Центр гражданских инициатив. http://www.fadr.msu.ru/rin/cci/necess.html. 3. Буров В.Н., Конюхов В.П., Тютерев С.Л., Нестеренко С.А. Некоторые итоги и перспективы использования

пестицидов растительного происхождения для защиты растений от вредных организмов // Агрохимия. - 1995. - 8. - С.70-80.

4. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. - Москва, 1983. - 176 с. 5. Государственная фармакопея СССР. Вып.2, изд. ХI. - Москва, 1990. - 398 с. 6. Доспехов Б.А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка его данных. - Москва: Колос, 1972. -

232 с. 7. Нахатов И., Шакиров Р., Тасханова Э.М., Юнусов С.Ю. Алкалоиды Veratrum dahuricum // ХПС. - 1980. - 1. -

С.131-132. 8. Наумова Г.В., Хрипович А.А., Аутко А.А.и др. Экологически безопасные биологически активные препараты

растительного происхождения и перспективы их использования в овощеводстве. // Овощеводство на рубеже третьего тысячелетия: Материалы международной научно-практической конференции. - Минск, 2000, с.159-162.

9. Султанов М.Б. Фармакология алкалоидов и их производных. - Ташкент: Фан, 1972. 10. Шакиров Р., Юнусов С.Ю. Алкалоиды Veratrum, Petilium и Korolkowia // ХПС. - 1980. - 1. - С.3-22.




190

ALGALIZAREA APELOR REZIDUALE DE LA COMPLEXELE ZOOTEHNICE

CA METODĂ BIOLOGICĂ DE AUTOEPURARE

Maria ICHIM

Catedra Ecologie, Botanică şi Silvicultură Dans notre article nous exposons les résultats de l’analyse de l’alcalisation des eaux résiduelles des complexes

zootechniques dans le but de l’intensification du processus d’épuration biologique. Nous avons prouvé que l’ino-culation d’un consortium de microalgues (Oscillatoria brevis, Synechocystis salina, Cladophora fracta etc.) dans des eaux résiduelles contribue à la décontamination des dernières et à l’intensification du processus d’épuration biologique et d’obtention de la biomasse fourragère.

Una dintre problemele stringente ale monitoringului ecologic este protecţia mediului înconjurător de

influenţa negativă a complexelor mari de creştere a animalelor şi păsărilor. Concentraţia unui număr mare de animale sau păsări pe un teren constrâns exercită un puternic pres negativ asupra mediului.

În rezultatul activităţii complexelor zootehnice în atmosferă se elimină o cantitate mare de diferite gaze (CO2 H2S, CH 4, NH4 etc.) provenite din descompunerea substanţelor organice. În sol nimereşte o gamă largă de diverse substanţe organice şi derivaţi ai scindării lor. În jurul acestor complexe se răspândesc mirosuri urâte provocate de amine, amide, sulfide, metilmercaptane etc. Un deosebit pericol prezintă complexele ani-maliere pentru apele de suprafaţă, cele freatice şi subterane. Majoritatea complexelor mari înlătură gunoiul prin spălatul cu apă, de cele mai multe ori potabilă. E de menţionat că un complex de bovine cu un efectiv numeric de 10 mii capete foloseşte zilnic circa 2000-3000 m3 de apă, ce se echivalează cu cantitatea de apă potabilă necesară pentru întreţinerea unui oraş cu o populaţie de 160 mii locuitori (Калюжный, 1967).

Apa folosită la spălatul grajdurilor, îmbogăţită cu o cantitate enormă de cele mai diverse substanţe orga-nice, multe dintre care sunt toxice, este depozitată în bazine speciale, unde se acumulează în cantităţi enorme şi se păstrează ani la rând. La cele mai multe complexe, sistemele de epurare a apelor reziduale efectuează doar eliminarea particulelor solide. Substanţele dizolvate în apă în cantităţi exagerate rămân intacte o perioadă destul de îndelungată. Tocmai aceste ape şi provoacă poluarea mediului înconjurător. Ele prezintă nu numai un focar de poluare chimică a mediului ambiant, ci şi o sursă de răspândire a celor mai diverse epidemii. Extragerea pe cale chimică din apele reziduale a substanţelor organice dizolvate este foarte costisitoare şi practic aproape că nu se aplică. De aceea, unica cale de epurare a acestor ape rămâne cea biologică cu aplicarea unor specii de microalge dintre cianofite, euglenofite şi clorofite.

În apele depozitate în aşa-numitele iazuri biologice (Винберг, 1961, 1964; Винберг и др., 1966) la primele etape au loc un şir de procese microbiologice de amonificare şi de reducere a sulfului cu eliminarea celor mai diverse gaze. Cu timpul, în aceste bazine se creează condiţii pentru dezvoltarea unui număr redus de specii de alge, în primul rând – dintre cele cianofite, ca Synechocystis salina, Oscillatoria brevis, care posedă o saprobitate sporită şi sunt capabile să suporte o concentraţie înaltă a substanţelor organice dizolvate în apă. Aceste prime organisme fotosintetice, pe lângă faptul că elimină în apă oxigen, au capacitatea de a asimila multe substanţe organice din apă sau derivaţii descompunerii lor, ca aminoacizii, amoniacul, nitraţii etc., pregătind condiţiile necesare apariţiei altor specii de microalge, întâi de toate din grupa celor euglenofite. Peste o anumită perioadă de timp aici apar Euglena viridis, E. texta, E. proxima, care de asemenea asimilează substanţele organice din apă, iar oxigenul eliminat de ele în procesul fotosintezei contribuie la mineralizarea substanţelor organice, diminuând cu mult concentraţia lor în apă. Pe măsura reducerii concentraţiei substanţelor organice în apa acestor iazuri biologice se creează condiţii pentru apariţia şi dezvoltarea unor specii de alge din filumul clorofitelor, ca Chlamydomonas reinhardii, Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Ankistrodesmus angustus, Microactinium pusillum. Pe lângă mal, unde cantitatea de oxigen în apă este mai sporită, apar unele specii din diatomee, unele forme bentonice din cianofite, clorofite etc., care împreună cu algele din plancton asigură epurarea biologică a apelor reziduale pe cale naturală.



191

Cu timpul, comunităţile de alge din iazurile biologice capătă un aspect asemănător celui din bazinele naturale. Însă, procesul formării pe cale naturală a acestor comunităţi se desfăşoară în decursul a mai multor ani. De aceea, pentru intensificarea proceselor de epurare biologică, sau de autoepurare, a apelor reziduale se recurge la algalizarea artificială a iazurilor biologice cu diferite specii de alge selectate în dependenţă de compoziţia chimică a apelor care necesită algalizarea. Algalizarea se efectuează cu suspensie de alge crescute artificial, dar selectate din bazinele naturale.

Pentru obţinerea inoculumului necesar cultura algei sau trupului de alge treptat se acomodează în decursul a câtorva luni la diferite concentraţii ale acelor ape reziduale care urmează a fi algalizate. Adaptarea algei începe cu adaosul la mediul nutritiv a 10% de ape reziduale. Peste 10-12 zile se adaugă 5%, apoi 10%, 20%, 30% şi 50%. Investigaţiile efectuate de noi, ţinându-se cont de faptul că compoziţia chimică a dejecţiilor ani-maliere depinde atât de specia, cât şi de vârsta şi tehnologia întreţinerii animalelor, au demonstrat că majo-ritatea speciilor de alge antrenate în experienţele noastre se dezvoltă în mediile cu adaos de ape reziduale până la 15-20%. Unele specii, însă, ca Synechocystis salina, Chlamydomonas reinhardii, Chlorella vulgaris, Euglena texta, Ankistrodesmus angustus, Micractinium pusillum, suportă concentraţii mult mai sporite.

În Tabel sunt expuse limitele concentraţiei azotului total şi a celui amoniacal, a fosforului, potasiului şi cantitatea de oxigen necesară pentru oxidarea substanţelor organice în apele reziduale de la diferite crescă-torii de animale.

Tabel

Compoziţia chimică a apelor reziduale de la diverse complexe zootehnice

Grupa de animale pH CCO,

mg O2

N, total, mg/l

NH4, mg/l

P, total, mg/l

K, mg/l

Porcine 7,8-8,0 850-1240 650-1360 150-1100 38-42 83-95

Bovine 8,2-8,4 750-880 850-1300 70-1200 32-38 78-93

Găini 8,2-8,4 900-1175 670-1110 120-1130 50-70 80-85

După cum rezultă din datele expuse în acest Tabel, în apele reziduale de la complexele animaliere, indi-ferent de specia de animale, se conţine o cantitate mare de azot, în primul rând cel amoniacal, de fosfor, po-tasiu necesare dezvoltării algelor. După cum relatează şi A.Tereşina (Терешина, 1981), algalizarea acestor ape cu un amestec de specii de microalge contribuie, în primul rând, la dispariţia mirosului neplăcut ce apare în rezultatul amonificării şi reducerii silfului. Oxigenul eliminat de alge în procesul fotosintezei posedă capacităţi înalte de oxidare a substanţelor organice dizolvate în apă. În felul acesta, algele administrate în iazurile biologice exercită un efect dublu în procesul de epurare biologică.

Pe de o parte, ele asimilează substanţe organice dizolvate în apă şi derivaţii descompunerii lor (acizi ami-nici, alcooli, aldehide, amoniac, nitraţi, nitriţi etc.), iar, pe de altă parte, elimină oxigenul necesar în procesul de mineralizare a substanţelor organice.

Experienţele efectuate de noi atât în condiţii de laborator, cât şi nemijlocit în iazurile biologice ale siste-melor de epurare la complexele zootehnice, demonstrează că administrarea a circa 20 mg de biomasă algală la 1 m3 de ape reziduale asigură epurarea lor după azot şi fosfor la 90-97 la sută în decursul a 10-15 zile. Biomasa algală obţinută în iazurile biologice prezintă o sursă furajeră de o importanţă deosebită.

În continuare prezentăm schema descompunerii substanţelor organice din apele reziduale de la un complex de creştere a bovinelor în prezenţa algelor administrate artificial (după А. Терешина, 1981).



192

Toate aceste substanţe provenite din descompunerea proteinelor, glucidelor, lipidelor din apele reziduale,

după cum au demonstrat М.И. Кузьменко (1981) şi П.Д. Клоченко (2002), sunt în mare măsură asimilate de către alge şi transformate în biomasă, care cu succes poate fi administrată în calitate de supliment în nutriţia păsărilor şi animalelor. Experienţele efectuate de noi la complexul de creşterea a puilor-broiler din Republica Moldova au demonstrat că administrarea biomasei de Synechocystis salina în nutriţia păsărilor sporeşte productivitatea lor cu circa 20-25%.

Bibliografie:

1. Винберг Г.Г. Очистка сточных вод в биологических прудах. - Минск, 1961. 2. Винберг Г.Г. Культивирование зеленых водорослей на сточной жидкости // Микробиология. - 1964. - 134. 3. Винберг Г.Г., Сивко Т.Н., Левина Р.Н. Биологические пруды в практике очистки сточных вод. - Минск:

Беларусь, 1966. 4. Деге А. Альгофлора сточных вод животноводческих комплексов и ее значение в процессах биологической

очистки: Автореферат диссертации канд. биол. наук. - Кишинев, 1983. - 18 с. 5. Клоченко П.Д. Метаболизм азота у пресноводных водорослей и его роль в формировании их сообществ и

качества воды: Диссертация докт. биол. наук. - Киев, 2002. 6. Кузьменко М.И. Миксотрофизм синезеленых водорослей и его экологическое значение. - Киев: Наукова

думка, 1981. - 211 с. 7. Терешина А.Н. Альгализация животноводческих стоков как метод их дезодорации и обеззараживания. – В кн.:

Санитарно-гигиенические аспекты сельскохозяйственного использования сточных вод. - Москва, 1981, с.92-100.


Ape residuale de la complexele zootehnicce

Hidrocarburi Substanţe organice azotoase

Substanţe sulfuroase

Hidroliza proteinei

Acizi organici

Alcooli

Aldehide

Chetoni

Acizi aminici

H2S

Sulfide

Mercaptani

Metilmercaptani

Schindare

H2S

NH4+CO2

NH4 + acizi organici

Scindare



193

CULTIVAREA ALGEI CHLAMYDOMONAS REINHARDII PE MEDII

CU ADAOS DE APE REZIDUALE

Cristina MELNICIUC

Catedra Ecologie, Botanică şi Silvicultură This article includes the research results on the posibility to obtain a great quantity of biomass of culture

(Chlamydomonas reinhardii). These are cultivations in the medium with addition of water residue from wastewater purification system of Chişinău municipality.

Introducere Una dintre cele mai dificile probleme ale conteporaneităţii rămâne a fi asigurarea cu proteine comesti-

bile, al căror deficit creşte din an în an. Motiv din care în ultimii ani o deosebită atenţie se acordă cultivării microalgelor, care au o capacitate de reproducere mai înaltă decât plantele superioare şi a căror biomasă conţine până la 60-75% de proteine, vitamine şi alte substanţe biologic active. Administrarea în calitate de supliment la nutriţia păsărilor şi animalelor a unei cantităţi de biomasă sporeşte productivitatea cu 20-30%. Până nu demult, biomasa algală cu un conţinut înalt de proteine se obţinea prin cultivarea algelor pe medii nutritive minerale. Însă, această metodă nu-şi găseşte aplicare în practică, cauza fiind costul exagerat al substanţelor chimice ce intră în componenţa mediilor nuttritive. Astfel, se propune a utiliza ca medii de cultivare apele rezi-duale. Acestea reprezentă un substrat multicomponenţial, conţinând diferiţi compuşi ai azotului şi fosforului, microelemente necesare pentru dezvoltarea algelor [1]. În rezultatul asimilării substanţelor organice din apele poluante şi eliminării oxigenului în procesul fotosintezei, algele contribuie la intensificarea epurării biologice.

În legătură cu aceasta, apare necesitatea elaborării unor metode şi tehnologii de cultivare a algelor pe ape poluate, care ar asigura realizarea celor două procese interdependente: obţinerea biomasei cu un continut bio-chimic favorabil şi purificarea apelor poluate.

Scopul prezentei lucrări constă în elaborarea tehnologiilor de cultivare industrială a unor tulpini de alge pe medii cu adaos de ape reziduale. Pentru realizarea acestui scop au fost trasate următoarele obiective: obţi-nerea unei culturi de alge Chlamydomonas reinhardii cultivate pe medii cu adaos de ape reziduale; studierea particularităţilor fiziologice ale algei şi elucidarea rolului acesteia în procesul de epurare a apelor reziduale.

Material şi metode Toate investigaţiile au fost efectuate în Laboratorul de Algologie al USM, sub conducerea prof. univ.

V.Şalaru. Pentru cultivare au fost folosite apele reziduale de la Staţia de epurare biologică din mun. Chişinău şi specia de algă din clasa Chlorococcophyceae Chlamydomonas reinhardii, care a fost colectată într-o băltoacă de pe teritoriul Staţiei în toamna anului 2006. Cultivarea s-a efectuat în baloanele Erlenmeyr cu volum de 250 ml, timp de 12 zile. Efectivul numeric a fost determinat cu ajutorul camerei Goreaev, iar productivitatea – conform metodei utilizate în cercetările hidrobiologice [2].

Rezultate şi discuţii Analizând componenţa taxonomică algală a apelor reziduale de la Staţie au fost depistate diferite specii de

alge (Pinnularia undulata, Nitzschia tryblionella var. levidensis, N. sigmanoidaea), a căror diversitate denotă că în apele reziduale se creează condiţii pentru dezvoltarea algelor şi, respectiv, posibilităţi pentru utilizarea apei reziduale ca mediu nutritiv. Pentru proiectarea experienţelor s-a determinat compoziţia chimică a acestor ape, care reprezintă un substrat multicomponenţial conţinând substanţe organice, particule în suspensie, ele-mente biogene (Tab.1).

Tabelul 1

Compoziţia chimică a apelor reziduale antrenate în experienţă, mg/dm3

CCO Suspensii Mineralizarea Fe PO43- NH4

+ NO2- NO3

- Cl- SO42- O2 Detergenţi CBO

Intrare 460 312 820 0,4 11,5 70,9 7,08 2,1 116,9 361,3 Nd 0,1 310 Ieşire 25 13,1 620 - 1 8,1 0,01 1,5 95,7 308,5 1,8 0,05 8,3



194

După cum rezultă din datele expuse în Tabel, valorile tuturor indicilor sunt foarte mari, ceea ce întrece cu mult concentraţiile admisibile. Însă, după o purificare prealabilă concentraţia lor se micşorează sau acestea chiar dispar din apă (Fe în apa de la intrare atingea valoarea de 0,4 mg/dm³, apoi la ieşire nu a fost depistat).

În experienţele noastre s-a observat că Chlamydomonas reinhardii se dezvoltă bine în mediile nutritive ce conţin ape reziduale, iniţiale şi în cele supuse purificării. Cel mai intens se dezvoltă pe mediu cu 50% de ape reziduale, efectivul numeric fiind de 21932 cel/l şi, respectiv, biomasa de 0,35 g/l. Însă, după a 9-a zi de cultivare biomasa începe să se micşoreze. Spre exemplu, în mediul de 100% cu adaos de ape reziduale în cea de a 6-a zi biomasa constituia 0,2 g/l, atingând în a 9-a zi valoarea cea mai înaltă (0,25 g/l), după care în ultima zi de cultivare biomasa scade, ajungând până la 0,13 g/l – rezultat al micşorării cantităţii de substanţe nutritive. Pentru ilustrarea rezultatelor ne putem referi la Figurile 1 şi 2 care elucidează dependenţa creşterii biomasei Chlamydomonas reinhardii de concentraţiile mediilor cu adaos de ape reziduale.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 2 3 4

zilele cultivării

biom

asa

mediu de 100 %

mediu de 75 %

mediu de 50 %

mediu de 25 %

Fig.1. Productivitatea Chlamydomonas reinhardii cultivată

pe mediu cu adaos de ape reziduale nepurificate (g/l).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4

zilele cultivării

biom

asa

mediu de 100%

mediu de 75 %

mediu de 50 %

mediu de 25 %

Fig.2. Productivitatea Chlamydomonas reinhardii cultivată pe mediu cu adaos de ape reziduale,

supuse unei purificări prealabile (g/l). Investigaţiile efectuate demonstrează că, indiferent de apa reziduală – iniţială sau finală (supusă unei

purificări prealabile), cele mai bune rezultate se obţin în proba de 50%, iar cea mai mică – în cea de 100%, ceea ce denotă că concentraţiile mari ale substanţelor poluante frânează dezvoltarea algei.

Concomitent cu dezvoltarea algelor are loc şi procesul de epurare a apei reziduale, ca rezultat al asimilării substanţelor organice poluante. Alga utilizează N din NH4, care iniţial constituia 70,9 mg/dm³, după care

3 6 9 12

3 6 9 12



195

scade considerabil ajungând până la 1,16 mg/l la proba de 50%, la cea de 75%–2,33 mg/dm³ şi la cea de 100%–1,66 mg/dm³. Ionii de amoniu sunt instabili şi sub acţiunea algei se oxidează în nitriţi şi nitraţi; ca rezultat, se observă o creştere a NO3 de la 2,1 mg/dm³ la 22,5 mg/dm³ (proba de 25% şi de 100%). O altă grupă de elemente biogene care este consumată de algă o formează fosfaţii. Concentraţia iniţială era de 11,5 mg/dm³, ceea ce indică un grad înalt de poluare, după care se micşorează până la 8,5 mg/dm³ – dovadă a procesului de epurare biologică de către Chlamydomonas reinhardii. În experienţele noastre, ca rezultat al dezvoltării în masă a algei şi, respectiv, al fotosintezei intense, au loc procesele de oxidare biochimică ce duc la micşorarea CBO5 până la 170 mg/dm3.

Un indice important al caracteristicii hidrobiologice şi hidrochimice este pH-ul, care iniţial constituia 7 la probele cu apa de la ieşire şi 6,5 la apa reziduală. Apoi, datorită activităţii algelor, proceselor din apă, valoarea pH-ului se măreşte considerabil, ajungând până la 10; deci, a avut loc concomitent sterilizarea chimică a apei. Potrivit datelor din literatură la un pH de 8,5-10 bacteriile mor. Toate datele sunt redate în Tabelul ce urmează.

Tabelul 2

Eficacitatea epurării apelor reziduale în rezultatul cultivării algei Chlamydomonas reinhardii, mg/dm³

NO-2 NO-

3 NH+4 CCO PO4 pH CBO5

iniţial 7,08 2,1 7,9 460 11,5 6,5 310 25% 0,36 22,5 1,66 485 9,4 10 190 50% 0,05 2,8 1,16 530 8,5 8,1 170 75% 0,3 4,5 2,33 500 9 9,5 187 100% 0,05 22,5 1,66 500 9,35 8,2 180

În aşa mod, alga Chlamydomonas reinhardii exercită o influenţă pozitivă asupra proceselor de epurare a apelor reziduale de la Staţia de epurare biologică din mun. Chişinău.

Concluzie

Studiul efectuat permite să afirmăm că apele reziduale de la Staţia de epurare biologică din mun. Chişinău constituie un mediu nutritiv adecvat pentru cultivarea algei Chlamydomonas reinhardii. În aşa mod, se obţine o biomasă valoroasă cu un sinecost mai eftin, care poate fi utilizată ca supliment în nutriţia păsărilor şi animalelor în scopul sporirii productivităţii lor, concomitent având loc procesul de epurare a apei poluate.

Referinţe:

1. Котова Л.И. и др. Биологический контроль качества вод. - Москва: Наука, 1989, с.4. 2. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев:

Наукова думка, 1975, с.13-23. Bibliografie:

1. Музафаров А.М., Васигов Т.В. Водоросли и водно-болотные растения в биологической очистке сточных вод. - Ташкент: Фан, 1987, с.3.

2. Оксюк О.П. Водоросли каналов мира. - Киев: Наукова думка, 1973, с.114. 3. Физиолого-биохимические аспекты культивирования водорослей и высших водных растений в Узбекистане. -

Ташкент: Фан, 1976, с.14. 4. Всесоюзнoе совещание по культивированию одноклеточных водорослей. - Ленинград, 1961, с.10. 5. Саут Р.Т. Основы альгологии. - Москва: Мир, 1990, с.235. 6. Параметрическое управление биосинтезом микроводорослей. - Новосибирск: Наука, 1980, с.88. 7. Владимирова М.Т., Семененко В.Е. Интенсивная культура одноклеточных водорослей. - Москва: Изд-во АН

СССР, 1962, с.45.




196

BIOMASA ALGALĂ – SURSĂ ALTERNATIVĂ DE ENERGIE,

PRODUSE ALIMENTARE NONPOLUATE ŞI SUBSTANŢE BIOLOGIC ACTIVE

Victor ŞALARU, Vasile ŞALARU, Maria ICHIM, Ion TODERAŞ, Ştefan MANEA

Catedra Ecologie, Botanică şi Silvicultură

Dans le présent article nous exposons les résultats concernant la culture de certains troncs des algues avec l’utilisation en tant que milieu nutritif des eaux résiduelles provenant des complexes avicoles et de ceux de l’élevage des animaux. Nous avons constaté que l’administration de la biomasse des algues obtenue dans des milieux provenant de la déjection des oiseaux et des animaux en tant que supplément dans la nutrition de ceux-ci contribue effectivement à leur productivité. La biomasse des algues peut être aussi facilement convertie en énergie électrique ou thermique.

Epuizarea evidentă a resurselor energetice tradiţionale (petrolul, gazele naturale, cărbunele, slanţul), create

în rezultatul procesului de fotosinteză în decursul a mii şi milioane de ani, pune în faţa oamenilor de ştiinţă problema evidenţierii surselor alternative de energie.

O cale importantă de obţinere a energiei netradiţionale este bioconversia energiei solare conservată în biomasa organismelor fotosintetice, printre care un rol deosebit revine algelor – atât celor microscopice, cât şi celor macroscopice (Сытник et al., 1987). Este bine cunoscut faptul că algele acumulează de zeci şi sute de ori mai multă energie solară decât plantele superioare. După cum menţionează G.Vinberg şi colaboratorii (Винберг, 1957, 1960, 1961; Винберг, Сивко, 1956; Винберг, Сивко, Левина, 1966), o unitate de biomasă a microalgei Chlorella vulgaris, de exemplu, asimilează în procesul fotosintezei de 220-240 ori mai multă energie solară decât aceeaşi unitate de biomasă a plantelor superioare de cultură, producând şi o cantitate de substanţă organică primară impunătoare, care în unele ţări deja este conversată în energie (Холл, 1979).

Un deosebit interes prezintă dezvoltarea algelor în aşa-numitele „iazuri biologice” ale sistemelor de epurare a apelor reziduale şi menajere de cea mai diversă origine, în primul rând în cele ale complexelor zootehnice. Este demonstrat că în iazurile biologice ale sistemelor de epurare a apelor reziduale şi a celor menajere bio-masa microalgelor ajunge până la 50-60 t/ha masă uscată (Винберг, 1957,1964; Винберг et al., 1966; Рудик, Денчикова, 1987; Васигов, Хужахмедов, 1980; Музафаров, Таубаев, 1980, 1984; Sauze, 1978; Overbesk, 1972; Oswald, 1973 a,b; Palmer, 1974). În rezultatul metanizării acestei biomase se poate de obţinut până la 70-80 mii kwt/h energie electrică (Холл, 1979). Obţinerea gazului metan din biomasa algelor crescute pe ape reziduale se practică în mai multe ţări (SUA, Japonia, Olanda etc.) şi este considerată drept o sursă avantajoasă de producere a energiei.

Utilizarea microalgelor este însă dificilă, cauza fiind tehnologiile costisitoare de sustragere a biomasei din apă. De aceea, mult mai convenabilă este elaborarea tehnologiilor de cultivare în bazinele cu ape reziduale a algelor macroscopice, ca: Cladophora, Rhizoclonium, Enteromorpha, Chaetomorpha, Tribonema, Spirogyra, Mongeotia etc. În condiţii optimale de temperatură şi concentraţii favorabile de substanţe nutritive în bazinele naturale eutrofizate, biomasa acestor alge poate să constituie 10-15 kg/m2 masă verde, sau 100-150 t/ha. De exemplu, în limanul Cuciurgan din Republica Moldova, pe o suprafaţă de circa 10 mii ha biomasa algelor macroscopice depăşeşte 120 mii tone (Шаларь, Зубку, 1987).

S-a constatat că un gram de masă verde a acestor alge elimină în procesul fotosintezei de la 70 până la 125 mgO2/ha. Aceasta înseamnă că în limanul Cuciurgan se sintetizează circa 200 t/ha substanţă organică primară care poate fi conversată în energie, pe calea metanizării.

Dacă reieşim din calculele efectuate de F.Sauze (1978) şi Д.Холл (1978) referitor la bioconversia biomasei algale în energie electrică, putem afirma cu siguranţă că numai biomasa algelor macrofite din limanul Cuciurgan în rezultatul conversării ar putea asigura cu energie electrică un orăşel cu populaţia de 4200-4500 locuitori.

Observaţiile efectuate de noi în luna august 2002, în locurile mici şi mlaştinile din lunca Dunării în sectorul Galaţi-Tulcea şi în delta fluviului, confirmă o cantitate enormă de substanţe organice primare sintetizate de algele verzi macrofite, ceea ce prezintă o sursă importantă de energie, dacă toată această biomasă ar fi metanizată.

În ultimii ani se observă o dezvoltare exagerată a algelor verzi macroscopice în bazinele de acumulare ale hidrocentralelor pe diferite râuri. Cert este faptul că cu timpul toate aceste bazine se înnămolesc şi în ele apar



197

suprafeţe imense cu adâncime mică şi apă eutrofizată, unde în abundenţă se dezvoltă un şir întreg de specii de alge filamentoase (Cladophora fracta, Rhizoclonium hieroglyphicum, Enteromorpha prolifera, Chaetomorpha linum, diverse specii de Spirogyra, Mongeotia, Zygonema, Oedogonium, Ulotrix şi multe altele) care produc o cantitate enormă de substanţă organică.

E cazul să amintim că în bazinul de acumulare a hidrocentralei Dubăsari de pe Nistru, construită în anul 1955, circa 1/3 din suprafaţa iniţială de 5600 ha s-a transformat în terenuri cu adâncimea de 0,5-2,5 m, ideale pentru dezvoltarea algelor filamentoase şi a plantelor acvatice superioare demerse şi subdemerse, biomasa verde a lor constituind în medie 10-15 kg/m2.

Lăsată în bazin, biomasa algelor accelerează procesul de înnămolire, deoarece în timpul iernii nu izbuteşte să se mineralizeze complet şi o bună parte din ea se depune pe fundul bazinului sub formă de nămol de culoare neagră-surie, cu miros pronunţat de hidrogen sulfurat. De aceea, extragerea din bazin a biomasei algelor fila-mentoase macroscopice joacă un rol dublu. Pe de o parte, în rezultatul metanizării biomasa algală este con-versată în energie, iar produsele rămase după fermentaţie pot fi utilizate în calitate de supliment în nutriţia animalelor sau ca îngrăşământ organic pentru sol. Pe de altă parte, extragerea biomasei algale contribuie la prelungirea perioadei de existenţă a bazinului. Şi într-un caz şi în altul obţinem avantaje. Dacă luăm în consi-deraţie că împreună cu algele pe aceste suprafeţe de bazin cu adâncimi mici se dezvoltă şi un şir întreg de plante acvatice superioare demerse şi subdemerse (Potamogeton, Ceratophyllum, Myriophyllum, Valisneria, Elodea, Nymphaea, Nymphoides, Typha, Phragmites, Sparganium, Schoenoplectus etc.), a căror masă biologică constituie în medie 50-60 t/ha, ne putem imagina ce cantitate enormă de energie se pierde în aceste bazine.

Însă, nu numai în scopul obţinerii energiei sunt utilizate algele. Un deosebit interes prezintă cultivarea microalgelor în scopul utilizării lor în calitate de supliment în nutriţia păsărilor şi animalelor. Microalgele pot fi cultivate de asemenea pe ape reziduale. Pe de o parte, sintetizează substanţă organică în cantităţi exagerate, iar, pe de altă parte, contribuie la epurarea biologică a apelor poluate.

Investigaţiile efectuate de noi în laborator şi pe teren, pe parcursul a mai multor ani, au demonstrat că în condiţii favorabile de dezvoltare în cultură aşa specii ca Synechocystis salina, Spirulina platensis, Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, S. spinosus, Chlamidomonas reihardii etc. produc până la 120-130 g/m2

biomasă într-o singură zi, sau circa 120 g/ha. De aici rezultă că în condiţiile climaterice ale Republicii Moldova şi României într-un bazin cu suprafaţa de 1 ha, construit sub cerul liber, într-o perioadă de vegetaţie se poate obţine o cantitate de circa 200 t/ha biomasă algală. Valorificarea acestei cantităţi de masă organică vegetală în calitate de supliment în nutriţia păsărilor sau animalelor stimulează mult productivitatea lor, contribuind prin aceasta la obţinerea unui profit economic impunător.

Biomasa microalgelor conţine până 60-70% proteine de cea mai înaltă calitate, lipide, glucide, hormoni ve-getali, vitamine şi o serie de alte substanţe biologic active, care stimulează productivitatea păsărilor şi animalelor.

În Tabelul 1 sunt prezentate rezultalele experienţelor referitor la influenţa biomasei algei Scenedesmus quadricauda asupra greutăţii corporale a puilor de găină.

Tabelul 1

Influenţa masei algei Scenedesmus quadricauda asupra masei corporale a puilor de găină

Dinamica masei corporale pe zile, în grame Viabilitatea puilor Biomasa, mg/kg

Numărul de găini 1 10 20 30 40 45 52 numărul %

100 500 49,6 210,4 489,3 918,3 1614,3 1763,4 2153,2 494 98,8

150 500 50,6 213,5 523,1 935,2 1631,2 1832,2 2193,4 498 99,6

250 500 47,2 216,3 530,4 948,3 1692,1 1993,2 2210,3 498 99,6

martor 500 49,1 183,4 413,2 824,5 1358,2 1695,2 1838,3 483 96,6

În experienţă au fost antrenaţi 2000 pui repartizaţi în patru grupe a câte 500 pui fiecare. La prima grupă de pui s-a administrat 100 mg de masă algală la 1 kg concentrate, în grupa a doua – 150 mg, în cea de a treia – 250 mg. Grupa a patra a servit ca martor, unde puii au fost hrăniţi numai cu concentrate. După cum obser-văm din datele expuse în Tabelul 1, greutatea corporală a puilor de găină cărora li s-a administrat biomasă algală în toate variantele a fost mai înaltă decât în grupa martor. Cea mai înaltă greutate corporală au avut-o puii din varianta unde s-a administrat 250 mg biomasă la 1 kg concentrate. La a 52-a zi de cercetare masa



198

corporală a puilor-broiler în această variantă a constituit 2210,3 gr, fiind cu 20,3% mai mare decât a puilor din grupa martor. E de menţionat că biomasa algei Scenedesmus quadricauda administrată puilor a fost crescută pe medii cu ape reziduale de la complexul de creştere a puilor de găină.

Viabilitatea puilor la cea de a 52-a zi de creştere în mediu pe variantele unde s-a administrat biomasă algală a constituit 99,0%, pe când în varianta martor nu a depăşit 96,6%, sau cu 2,4% mai redusă faţă de primele 3 variante. De aici şi eficienţa economică a utilizării biomasei algale în calitate de supliment în nutriţia păsărilor.

În altă serie de experienţe, efectuate după aceeaşi schemă ca şi în prima serie, puilor de găină li s-a admi-nistrat în aceleaşi concentraţii biomasa algei Synechocystis salina, de asemenea crescută pe medii cu defecţii de găină. Şi în această serie de experienţe greutatea corporală a puilor de găină, care au primit biomasă algală în calitate de supliment la nutriţie în concentraţii de 100, 150 şi 250 mg la 1 kg concentrate, a fost evident superioară celei a puilor din varianta martor (Tab.2).

Tabelul 2

Influenţa biomasei de Synechocystis salina asupra dinamicii masei corporale a puilor de găină

Dinamica masei corporale pe zile, în grame Biomasa administrată,

mg/kg

Numărul de pui 1 10 20 30 40 45 52

Viabilitatea puilor %

100 500 51,2 216,2 503,2 921,2 1523,1 1803,4 2153,2 492 98,4 150 500 50,6 212,4 512,4 941,3 1543,2 1842,2 2210,3 493 98,6 250 500 49,8 232,3 521,3 948,2 1598,2 1923,3 2232,1 495 99,0

martor 500 49,6 198,4 414,2 815,3 1409,2 1796,2 1898,3 486 96,2

La a 52-a zi de creştere greutatea corporală a puilor în varianta cu 250 mg biomasă de Synechocystis a fost cu 334 gr mai sporită decât a puilor din grupa martor. Viabilitatea puilor în grupele care au primit în nutriţie biomasa de Synechocystis a variat între 98,4 şi 99%, mai sporită fiind în grupa unde s-a administrat 250 mg de biomasă la 1 kg de concentrate. În grupa martor viabilitatea puilor a constituit 96,2%, sau cu 2,8% mai redusă decât în grupa de pui cărora li s-a administrat 250 mg biomasă.

Rezultate pozitive au fost obţinute şi în experienţele în care puilor de găină li s-a administrat biomasa algei Chlorella vulgaris, în acelaşi concentraţii ca şi în cazul administrării biomasei de Scenedesmus şi Synechocystis (Tab.3). Greutatea puilor în varianta în care s-a administrat 250 mg biomasă la 1 kg concentrate a fost cu circa 15% mai sporită decât în control.

Tabelul 3

Influenţa biomasei de Chlorella vulgaris asupra dinamicii masei corporale a puilor de găină

Dinamica masei corporale pe zile, în grame Biomasa algei, mg/kg

Numărul iniţial de

pui 1 10 20 30 40 45 52 Viabili-

tatea %

100 500 46,5 194,3 453,8 848,3 1460,2 1809,1 2009,2 492 98,4 150 500 47,2 196,2 419,3 873,2 1480,3 1820,2 2150 496 99,2 250 500 46,8 196,8 420,1 882,2 1510,2 1895,1 2230,1 494 98,6

martor 500 46,8 194,6 413,2 831,3 1397,0 1739,2 1931,2 487 95,4

Dinamica creşterii masei corporale a puilor-broiler care au primit ca supliment în nutriţie biomasă de Chlorella vulgaris puţin diferă de variantele în care s-a administrat biomasă de Scenedesmus şi Synechocystis. Rezultate similare în privinţa influenţei biomasei de Chlorella asupra dezvoltării păsărilor, peştelui şi animalelor bovine au fost obţinute şi de alţi cercetători (Şalaru, Socican, Lupaşcu, 1999; Rudic, 1992; Асраров, 1972; Сытник et al., 1987; Музафаров, Таубаев, 1980, 1984; Джуманазаров et al., 1985; Бахадирова, Бурнев, 1985; Васигов, 1979). În ceea ce priveşte utilizarea biomasei algelor Scenedesmus quadricauda şi Synechocystis salina, menţionăm că aceste alge pentru prima dată au fost utilizate de noi în calitate de supli-ment în nutriţia găinilor şi demonstrată acţiunea pozitivităţii găinilor.



199

Experienţele cu aplicarea biomasei microalgelor Scenedesmus quadricauda au fost efectuate la fabrica de găini a firmei HOFIGAL din apropierea or.Bucureşti. În rezultatul acestor experienţe s-a demonstrat influenţa incontestabilă a biomasei algale asupra dezvoltării organismului păsărilor, fapt ce a contribuit la obţinerea unei cantităţi mari de produse alimentare de o calitate superioară şi nonpoluate.

O particularitate deosebită a speciilor de microalge utilizate în experienţele noastre este capacitatea lor de a se dezvolta în iazurile biologice ale sistemelor de epurare a apelor reziduale de la complexele zootehnice şi a apelor manajere ale oraşelor şi ale altor localităţi care dispun de sisteme de epurare. Biomasa algală obţinută în bazinele sistemelor de epurare a apelor reziduale de la complexele zootehnice se recomandă în calitate de supliment în nutriţia animalelor, dat fiind faptul că compoziţia chimică a biomasei obţinute pe medii minerale artificiale practic nu se deosebeşte de cea crescută pe ape reziduale (Rudic, 1992). În acelaşi timp, este necesar a se ţine cont de faptul că biomasa algală poate fi administrată selectiv animalelor sau păsărilor care produc reziduurile utilizate în procesul de cultivare a algelor. Biomasa crescută pe reziduuri de la complexele avicole poate fi utilizată în primul rând păsărilor de la complexul dat. Tot aşa se procedează şi cu biomasa obţinută pe medii de la complexele de porcine, bovine etc.

Experienţele efectuate de noi la fabrică de găini a firmei HOFIGAL denotă că aplicarea în nutriţia găinilor a biomasei algale obţinute pe reziduuri influenţează pozitiv dezvoltarea păsărilor, manifestată prin viabilitate înaltă, superioritate în greutatea corporală şi prin calitatea producţiei. Investigaţiile efectuate de noi (Şalaru, Socican, Lupaşcu, 1999; Rudic, 1992; M.Ichim, V.M. Şalaru, V.V. Şalaru, 2004) au demonstrat, de exemplu, că ouăle obţinute de la găinile care au primit în nutriţie biomasă algală conţin de două-trei ori mai multe vitamine, în special provitamina A, decât ouăle de la găinile din grupa martor. De aici se observă cu claritate că biomasa algală contribuie nu numai la obţinerea unei cantităţi mai sporite de producţie, dar şi la sporirea calităţii ei.

După cum am menţionat, administrarea biomasei algale în calitate de supliment în nutriţia păsărilor nu a semnalat nici o influenţă negativă; în toate cazurile acţionează pozitiv asupra organismului păsărilor (M.Ichim, V.V. Şalaru, V.M. Şalaru, 2004).

Microalgele cultivate pe ape reziduale de la complexele avicole şi animaliere adesea se utilizează în calitate de stimulatori biologici în fitotehnie (M.Ichim, V.V. Şalaru, V.M. Şalaru, 2004). Investigaţiile profesorului V.V. Şalaru (2006) au demonstrat că tratarea seminţelor de castraveţi, înainte de semănat, cu suspensie de Nostoc linckia, crescută pe ape reziduale de la fabrica de găini, în decurs de 6-8 ore, stimulează mult procesele fiziologo-biochimice din plantă. În rezultat, sporeşte imunitatea plantelor faţă de bolile virotice şi micotice, fapt ce stimulează mult productivitatea plantelor.

Datele prezentate în Tabelul 4 demonstrează că tratarea seminţelor de castraveţi cu suspensie de N.linckia înainte de semănat, timp de 6-8 ore, stimulează mult dezvoltarea organelor plantelor – atât a celor vegetative, cât şi a celor generative.

Tabelul 4

Influenţa suspensiei apoase de biomasă de Nostoc linckia crescută pe dejecţii de la găini asupra dezvoltării organelor vegetative şi generative la castraveţi sortul „Rodnicioc”

Concentraţia biomasei

Nostocc, %

Lungimea plantei, cm

Numărul de flori masculine

Numărul de flori feminine

Numărul de flori căzute

Roada, kg/m2

0,125 323 323 111 39 3,5 0,250 356 356 120 36 5,6 0,500 327 327 114 34 3,0

Spirulina 0,25 mg/l 290 289 93 37 4,05 Martor 311 319 106 40 3,0

Din datele acestui Tabel observăm că prelucrarea cu suspensie apoasă de N.linckia în concentraţie de 0,25% sporeşte roada castraveţilor cu 200% în comparaţie cu plantele din varianta martor. Datele aceluiaşi Tabel 4 denotă că alga N.linckia stimulează dezvoltarea plantelor de castraveţi mult mai puternic decât alga Spirulina platensis, care de asemenea este utilizată ca sursă de stimulare a dezvoltării plantelor de cultură (Rudic, 1992; Саттырeв et. al., 1980; Музафаров, Таубаев, 1984).



200

Aşadar, algele deja sunt utilizate în cele mai diverse scopuri: în primul rând, în calitate de stimulatori bio-logici în zootehnie, fitotehnie, farmaceutică, medicină (Rudic, 2007; M.Ichim, V.V. Şalaru şi V.M. Şalaru, 2004), ca surse de proteine comestibile şi furajere, îngrăşăminte organice, indicatori biologici ai stării com-ponentelor mediului, agenţi ai epurării biologice a apelor şi solurilor poluate etc. Un deosebit interes prezintă elaborarea tehnologiilor de conservare a biomasei algale în energie. În toate aceste probleme se cere o amplă colaborare între specialiştii din cele mai diverse ramuri ale ştiinţei: botanicii, biochimiei, fiziologiei, tehnicii etc.

Bibliografie:

1. Oswald W.I. Complete waste treatament in ponds // Water Qual. Manag. And. Pollut. Contr. Probl. Oxford. E.c., 1973, p.153-163.

2. Oswald W.I. Production of algae in sewage disposal // Sol. Energy. - 1973. - No15. - P.107-117. 3. Overbeck J. Distribution pattern of phytoplankton and bacteria, microbial deconposition of organic matter and

bacterial production in eutrophic, stratified lake // Proc. IBP-UNESCO Symp. Prod. Freshwaters. Warszawa- Krakow, 1972, p.227-237.

4. Rudic V.F. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. - Chişinău: Ştiinţa, 1993. - 140 p. 5. Rudic V. Studii biomedicale şi clinice. - Chişinău, 2007. - 376 p. 6. Şalaru V.M., Socican I.A., Lupaşcu V.A. Utilizarea algelor producătoare de substanţe biologic active în alimentaţia

păsărilor. - Chişinău, 1999. - 50 p. 7. Асраров У. Белкововитаминная паста из хлореллы при откорме бычков на рационах из хлопчатниковых

кормов // Культивирование водорослей и высших водных растений в Узбекистане. - Ташкент: ФАН, 1972, с.58-62.

8. Бахадирова З.А., Буриев С. Промышленное культивирование микроводорослей и их применение в прудовом рыбоводстве // Промышленное культивирование микроводорслей. - Москва, 1985, с.68-69.

9. Васигов Т.В., Хутахмедов Д. Культивирование микроводорослей и высших растений на сточных водах пти-цефабрики «Узбекистан» // Культивирование и применение микроводорослей в народном хозяйстве. - Ташкент, 1980, с.72-75.

10. Васигов Т.В. Протококковые водоросли и их значение для отгонного животноводства. - Ташкент: ФАН, 1979, с.88.

11. Винберг Г.Г., Сивко Т.Н., Левина Р.Н. Биологические пруды в практике очистки сточных вод. - Минск: Беларусь, 1966. - 232 с.

12. Винберг Г.Г., Сивко Т.Н. Фитопланктон как агент самоочищения загрязненных вод // Труды Всесоюзного гидрологического общества, 1956-1957, с.3-23.

13. Винберг Г.Г. Культивирование зелёных планктонных водорослей на сточных жидкостях // Микробиология. - 1964. - 33. - Вып.3. - С.508-515.

14. Винберг Г.Г. Массовые культуры одноклеточных водорослей как новый источник пищевого и промышлен-ного сырья // Успехи современной биологии. - 1957. - Т.18. - 3. - С.332- 351.

15. Дилов Х.В. Микроводоросли: массовое культивирование и приложение. - София, 1985. - 194 с. 16. Джуманазаров В.Н., Батырова А.Ш. Влияние суспензии хлореллы на продуктивность кур-несушек // Про-

мышленное культивирование микроводорослей. - Москва, 1985, с.78-79. 17. Музафаров А.М., Таубаев Т.Т. Значение и перспективы развития микроводорослевого комплекса // Культи-

вирование и применение микроводорослей в народном хозяйстве. - Ташкент, 1980, с.3-6. 18. Музафаров А.М., Таубаев Т.Т. Культивирование и применение микроводорослей. - Ташкент: ФАН, 1984. -

136 с. 19. Рудик В.Ф., Денчикова Л.А. Культивирование спирулины на средах, содержащих отходы животноводства //

Актуальные проблемы современной альгологии. - Черкассы, 1987, с.272. 20. Сатыев Р., Каримова Х.М., Бабев Т.А., Кучкарева М.А., Зарипов Э. О методике культивирования Spirulina pla-

tensis (Gom.) Geitl // Культивирование и применение микроводорослей в народном хозяйстве. - Ташкент, 1980, с.54-57.

21. Сытник К.М., Масюк Н.П., Кондратьева Н.В., Вассер С.П. Альгология на пути в третье тысячелетие // Актуальные проблемы современной альгологии. - Черкассы, 1987, с.278-322.

22. Шаларь В.М., Рудик В.Ф., Могылдя В.М. и др. Эффективность применения некоторых видов микроводорос-лей в птицеводстве // Актуальные проблемы современной альгологии. - Киев: Наукова думка, 1987, с.276-278.




201

CONDIŢIILE CLIMATICE CA FACTOR AL MODIFICĂRILOR

DE MEDIU ÎN BAZINUL RÂULUI RĂUT

Igor CODREANU, Valentin SOFRONI

Universitatea de Stat din Tiraspol, Chişinău Ce matériel reflète les tendances de l’évolution multiannuelle de la quantité des précipitations dans le bassin de Răut

et la réaction de l’écoulement de la rivière pour la période des observations de 1950-1990. Les paramètres météo-rologiques et hydrologiques ont déterminé une série de modifications morphométriques dans le bassin provoquant l’apparition de nouveaux segments de rivières et la diminution des surfaces du drainage dans les plus petits bassins.

Clima Republicii Moldova este temperată continentală, cu iarnă blândă şi puţină zăpadă, iar vara – căl-

duroasă şi lungă. Pentru partea de nord, în care este situat predominant bazinul râului Răut, este caracteristică o durată a zilelor cu soare în medie de cca 2060 ore, temperatura medie anuală a aerului constituind 8-9oC, iar cantitatea multianuală de precipitaţii oscilează între valorile 450-550 mm [Atlasul Moldovei, 1978; 1, 2 etc., etc.).

Cea mai importantă formă de materie care intră într-un bazin hidrografic este dată de precipitaţii. Energia posedată de o anumită cantitate de precipitaţii în cea mai mare parte se consumă în cadrul proceselor care se desfăşoară pe suprafaţa topografică, iar de repartiţia acestora în timp depinde intensitatea proceselor geomor-fologice. Cea mai mare parte din suma precipitaţiilor anuale din ţara noastră (cca 74%) îi revine perioadei calde, iar în mersul multianual al precipitaţiilor se observă perioade cu devieri pozitive şi negative. Analiza în complex a mersului multianual al indicilor meteorologici demonstrează că, de obicei, în perioadele cu devieri negative ale precipitaţiilor atmosferice se observă devieri pozitive de temperatură, care condiţionează evaporarea înaltă şi, ca urmare, formarea situaţiei aride [3].

Tendinţele generale de modificare a regimului de umiditate pe teritoriul ţării noastre urmăresc tendinţele globale ale acestui parametru climatic, ceea ce se determină şi în cadrul studiilor efectuate în bazinul râului Răut. Astfel, observaţiile efectuate pe o perioadă de peste o sută de ani asupra caracterului modificării sumelor anuale ale precipitaţiilor demonstrează un trend pozitiv de cca 0,55 mm/an, iar valoarea medie a crescut pe această perioadă, constituind cca 59 mm [4]. Acest trend este mai evident în special pentru perioada de vară şi mai puţin pentru cea de primăvară.

Analiza unui şir de date statistice, care pun în evidenţă sumele lunare şi anuale ale cantităţilor de precipitaţii (Метеорологический ежегодник, 1988), înregistrate pe perioada de observaţii 1955-1990 la Staţia meteoro-logică din mun. Bălţi (Fig.1), precum şi la celelalte staţii apropiate de bazinul studiat (Corneşti, Soroca) sau posturi meteorologice (Jeloboc, Teleneşti), confirmă cele relatate anterior. Cu atât mai mult, datele statistice sunt reprezentate grafic cu specificare pentru perioada caldă şi rece, conform criteriilor de raionare agroclima-tică a Republicii Moldova [5], care, de fapt, includ lunile calde cu temperatura diurnă a aerului ce depăşeşte +5oC, începând cu aprilie până la sfârşitul lui octombrie, iar perioada rece cu lunile noiembrie – martie.

Ploile torenţiale, care de cele mai multe ori au efecte dezastruoase prin imensele cantităţi de energie puse în mişcare, dislocă volume apreciabile de materiale de pe suprafaţa bazinului, provocând inundaţii, având ca exemplu ploaia torenţială înregistrată în august 1994.

În acest context, aceeaşi bază de date cu referinţă la Staţia meteorologică din mun. Bălţi ne pune în evi-denţă multiple cazuri cu valori lunare de peste 100 mm, în special pentru lunile de vară. Cele mai multe cazuri le constatăm, totuşi, pentru lunile iunie şi iulie, cu valorile maximale de 219,1 mm în iulie, 1971 şi de 246,3 mm în iunie, 1985.

Precipitaţiile au un efect activ de eroziune şi în celelalte luni, când covorul vegetal nu este încă dezvoltat, în special în lunile martie (cu valori maximale de cca 87 mm, în anul 1966), aprilie (83,3 mm, în 1979) şi mai (132 mm, în 1975), sau chiar şi în lunile de iarnă când în rezultatul creşterii temperaturilor are loc topirea intensivă a zăpezilor.

Cantitatea de materie şi energie a precipitaţiilor, care pătrunde şi circulă într-un bazin hidrografic, se înmagazinează sub diferite forme, acţionează asupra componentelor lui, determinând o serie de reacţii în lanţ, sau părăseşte bazinul prin scurgere, evapotranspiraţie, pe cale subterană sau ca urmare a intervenţiei omului. Energia precipitaţiilor este consumată la realizarea proceselor mecanice, gravitaţionale de la suprafaţa solului,



202

sau este absorbită de covorul vegetal. Conform legilor gravitaţiei, apa tinde să se infiltreze în sol şi roci, dar când capacitatea de infiltrare este depăşită se formează scurgerea, panta suprafeţei topografice determinând modul de desfăşurare a proceselor geomorfologice respective. Astfel, versanţii slab protejaţi cu vegetaţie vor permite o intensificare a proceselor de eroziune; ca urmare, o parte din materialul transportat va fi depus la baza versantului, iar cantităţi destul de mari pătrund în reţeaua de talveguri ale râurilor cu tendinţă de a fi scoase din bazin [6].

Fig.1. Suma precipitaţiilor lunare şi anuale între anii 1955-1990 la Staţia meteorologică din mun. Bălţi (mm).

Fig.2. Corelarea sumei precipitaţiilor anuale cu volumul scurgerii anuale la postul hidrologic din mun. Bălţi pe perioada de observaţii.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

1955

1956

1957

1958

1959

1960

1961

1962

1963

1964

1965

1966

1967

1968

1969

1970

1971

1972

1973

1974

1975

1976

1977

1978

1979

1980

1981

1982

1983

1984

1985

1986

1987

1988

1989

1990

Iarna

Vara

0

100

200

300

400

500

600

700

800

1958

1960

1962

1964

1966

1968

1970

1972

1974

1976

1978

1980

1982

1984

1986

mm

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

700000000

800000000

900000000

m3

Precipitatii Scurgerea

m3



203

Analizând comparativ informaţia statistică ce caracterizează cantitatea anuală de precipitaţii şi scurgerea anuală, date înregistrate la Staţia meteorologică şi la postul hidrologic din mun. Bălţi (Метеорологический ежемесячник, 1955-1990, Гидрологические ежегодники, 1955-1988), cât şi diagrama respectivă (Fig.2), apare în evidenţă o relaţie directă dintre aceşti parametri.

Astfel, constatăm că până în anii ’60 al secolului trecut atât variaţiile cantităţilor anuale de precipitaţii, cât şi ale scurgerilor anuale nu sunt mari, după ce urmează o etapă cu evidente abateri de la mersul normal, situaţie determinată de modificările climatice, lucrările de regularizare a albiilor râurilor din bazinul Răutului, de modul de utilizare a terenurilor etc.

Fig.3. Corelarea sumei precipitaţiilor anuale cu volumul scurgerii anuale la postul hidrologic de la Jeloboc pe perioada de observaţii.

Faptul că curba ce caracterizează scurgerea anuală demonstrează o întârziere în raport cu cea a precipita-

ţiilor evidenţiază şi rolul alimentaţiei râului cu ape subterane. Totuşi, în anii ’80-90 ai perioadei de studiu această întârziere este mai puţin evidentă, ceea ce ne spune despre organizarea mai rapidă a scurgerii de suprafaţă, situaţie explicată şi de schimbările elementelor morfometrice din acest bazin [7]. În acest punct de măsurători, cele mai mari valori ale scurgerii anuale pe perioada de observaţii sunt înregistrate în anii 1969 (109 mln. m3) şi 1971 (101 mln. m3), reacţia fiind precedată de o creştere a cantităţii anuale de precipitaţii între anii 1966-1971, fază repetată în anii 1980 - 1981 (125 mln. m3) şi 1985 (93 mln. m3), ca urmare a creşterii precipitaţiilor în perioada 1978-1985.

Analizând aceiaşi parametri măsuraţi (Fig.3) la postul hidrologic de la Jeloboc (Orhei), situat în cursul inferior al râului Răut, constatăm aproape aceeaşi legitate, dar cu valori mai mari, determinate de însumarea scurgerii râurilor Cubolta, Căinr, Ciuluc, Cula, Cogâlnic şi a altor râuşoare mai mici. Valorile cele mai mari pe perioada de observaţii sunt înregistrate iarăşi în anii 1969 (738 mln. m3) şi 1971 (715 mln. m3), ca o reacţie la creşterea cantităţii de precipitaţii în anii 1966-1969, respectiv în 1980 (744 mln. m3) şi 1981 (794 mln. m3), ca urmare a creşterii cantităţii de precipitaţii în anii 1976-1981.

Odată cu creşterea valorică a scurgerii lichide din râul Răut în perioadele menţionate, cresc şi cele ce caracterizează volumul scurgerii solide. Astfel, pentru anii 1969-1971 constatăm o creştere a scurgerii solide de la 41, 44,1, până la 180 mii tone/an la postul hidrologic din mun. Bălţi, iar în a doua perioadă, ce caracte-rizează anii 1980-1985, cu variaţii între 35, 41, 24 şi, respectiv, 54 mii tone/an. Se evidenţiază valoarea carac-teristică anului 1971, determinată în special de cantitatea mare de precipitaţii în lunile iunie (112 mm) şi iulie (219,1 mm). Anume pentru aceste luni constatăm şi valori sporite ale debitului solid, care a constituit 0,96 şi, respectiv, 62 kg/sec., ceea ce confirmă o spălare intensivă a suprafeţei topografice din bazinul studiat. Rezul-tatele observaţiilor efectuate la postul hidrologic de la Jeloboc asupra acestui parametru sunt publicate din anul 1977, de aceea putem scoate în evidenţă doar valorile caracteristice anilor 1979-1981 (630, 980 şi, respectiv,

0

100

200

300

400

500

600

700

800

1958

1960

1962

1964

1966

1968

1970

1972

1974

1976

1978

1980

1982

1984

1986

mm

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

700000000

800000000

900000000

m3

Precipitatii Scurgerea

m3



204

820 mii tone/an), debitul solid maximal fiind caracteristic pentru lunile iunie 1980 (140 kg/sec.) şi mai 1981 (150 kg/sec.).

Ca urmare a studiilor efectuate de către Vera Verina [8], s-a determinat că regimul hidrologic al Răutului pe sectoare variază – rezultat al raportului dintre cantitatea de apă drenată din albie prin procesul de carst şi cantitatea venită din alimentarea subterană. Astfel, debitul lichid măsurat în amonte, la Gura Camencii, constituia 1,63 m3/sec. iar în aval, lângă localitatea Bubuleşti, scade la 0,99 m3/sec., la Ţâra – 3,29 m3/sec., la gura de vărsare a râuşorului Soloneţ – 2 m3/sec., în apropierea conului de dejecţie a ravenei Ciutuleşti – 2,68 m3/sec., iar lângă Prodăneşti creşte la 3,88 m3/sec. Reducerea cantitativă a parametrilor hidrologici analizaţi Vera Verina o explică şi prin extinderea activităţii omului [9].

Referinţe:

1. Костантинова Т.С., Дубовка Ф.В., Кошкодан М.Ф. Климат (Молдавская ССР). - Кишинёв, 1979, с.24-30. 2. Дарадур M. Изменчивость и оценки риска экстремальных условий увлажнения / Институт географии АН

Молдовы. - Кишинёв, 2001. - 160 с. 3. Constantinov T., Sofroni, V., Mangul I. Particularităţile climei. - În: Degradarea solurilor şi deşertificarea. - Chişinău,

2000, p.26-37. 4. Дарадур M. Op. cit. 5. Константинова Т.С., Дубовка Ф.В., Кошкодан М.Ф. Op. cit. 6. Zăvoianu I. Morfometria bazinelor hidrografice. - Bucureşti: Editura Academiei R.S. România, 1978. - 174 p. 7. Codreanu I. Modificări morfometrice ale reţelei de râuri din bazinul r.Răut între 1913-1986 // Revista Geografică.

Academia Română. Institutul de Geografie. T.VIII. - Bucureşti, 2002, p.130-134. 8. Верина В.Н. Подземные воды в закарстовых местностях и задачи их охраны // Охрана природы Молдавии. -

1975. - 13. 9. Верина В.Н. Физико-географическая характеристика бассейна рeки Реут: Диссертация на соискание учёной

степени кандидата географических наук. - Кишинёв, 1965. - 376 с.



Chimie ISSN 1857-1735

213

COMPUŞI COORDINATIVI AI CUPRULUI(II) CU 1,5-BIS-TIOCARBOHIDRAZONE

ALE ALDEHIDEI SALICILICE SUBSTITUITE

Diana DRAGANCEA

Institutul de Chimie al AŞM There is described the synthesis, structure and magneto-chemical investigation of a new series of copper(II) com-

plexes with substituted salicylaldehyde thiocarbohydrazone. The ligands were obtained by condensation of thiocarbo-hydrazide with the respective salicylaldehyde (its 3-methoxy-, 3-ethoxy- and 3,5-di-Br derivatives). The formation of binuclear copper(II) complexes containing as ligand its three- deprotonated form was observed. The donor atom sites used by the ligand for the coordination to the copper(II) are nonequivalent: ONN and SNO. Magnetic measurements of the complexes in the temperature range 2-290K indicated the antiferromagnetic interactions between the paramagnetic copper(II) ions.

Introducere

În ultimii ani, compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie cu baze Schiff au constituit obiectul de studiu al numeroaselor investigaţii. Unui studiu mai detaliat au fost supuşi complecşii în baza tiosemicarbazonei aldehidei salicilice şi derivaţilor acesteia, în care adendul organic se manifestă ca un ligand tridentat [1,2]. Spre deosebire de tiosemicarbazidă, tiocarbohidrazida are o structură simetrică, făcând posibilă condensarea ei cu compuşi carbonilici polifuncţionali la ambii atomi de azot marginali [3]. Astfel, bazele Schiff obţinute în urma condensării reprezintă nişte sisteme de liganzi cu diferite seturi de coordinare, care asigură formarea unor compuşi mononucleari, dinucleari şi chiar tetranucleari. De exemplu, folosind 1,5-bis-tiocarbohidrazona 2-acetilpiridinei sau alţi derivaţi ai acesteia au fost obţinuţi compuşi tetranucleari ai fierului cu valenţă mixtă (Fe(II)-Fe(III)), nichelului(II), cobaltului(II), zincului(II) şi ai cadmiului(II) [4-7]. Interacţiunea unui ligand analog, 1,5-bis-tiocarbohidrazona 2-formilpiridinei, cu cuprul(II) a condus la obţinerea unor dimeri alcătuiţi din fragmente binucleare [8,9].

Analiza surselor bibliografice denotă că printre tiocarbohidrazonele studiate până în prezent derivaţii aldehidei salicilice se întâlnesc destul de rar, iar modurile de coordinare a lor şi structura propusă pentru complecşii obţinuţi este diferită, deseori contradictorie [10-12]. Pentru liganzii de acest tip sunt posibile două

forme tautomerice: forma tionică A şi forma tiolică B, care se află într-un echilibru [13], iar tautomerul tiolic, la rândul său, poate fi în una dintre configuraţiile B syn sau B′ anti (Schema 1). Factorii ce pot deplasa echilibrul A↔B sunt natura ionului metalului, condiţiile reacţiei (natura solventului, pH-ul mediului) şi al. Manifestarea tautomeriei şi izomeriei geometrice de către liganzi a cauzat diversitatea compuşilor (mono-, bi- şi tetranucleari) obţinuţi până în prezent, în care ligandul îşi schimbă modul de coordinare, manifestându-se bi-, tetra-, penta- sau hexadentat [4-12].

În lucrarea de faţă sunt prezentate rezultatele studiului compuşilor cup-rului(II) cu 1,5-bis tiocarbohidrazonele derivaţilor aldehidei salicilice.

Partea experimentală

Prepararea liganzilor. Liganzii 1,5-bis-tiocarbohidrazona 3-metoxi- alde-hidei salicilice (H4LMe), 1,5-bis-tiocarbohidrazona 3-etoxi-aldehidei salicilice (H4LEt) şi 1,5-bis-tiocarbohidrazona 3,5-diBr- aldehidei salicilice (H4LdiBr) au fost obţinuţi după cum urmează. La 2,5 mmol de tiocarbohidrazidă, dizolvată în 20 ml amestec H2O/EtOH (1:3), s-a adaugat 5 mmol de aldehida salicilică substituită corespunzător în 20 ml EtOH. Amestecul format a fost supus, timp de o oră, refluxării. După răcire, precipitatul gălbui format a fost separat, spălat cu etanol, eter dietilic şi uscat la aer. Randamentul – 85-95%.

OH

NNH

NH

N

OHS

NH

N

OHSH

NN

OH

NN

OH

SH

NH

NOH

Forma tiocetonica B

Forma tioenolica syn B

Forma tioenolica anti B l

Schema 1



214

Prepararea compuşilor 1 Cu2(HLMe)(HSO4)·MeOH·3H2O şi 2 Cu2(HLEt)(HSO4)·0,5MeOH·3,5H2O. La suspensia ligandului corespunzător (0,25 mmol) în 10 ml metanol s-a adăugat soluţia de CuSO4·5H2O (0,5 mmol) în 15 ml amestec metanol - apă. Sistemul format a fost ţinut la temperatura de fierbere pe o baie de apă timp de 10 min. Precipitatul cristalin de culoare brună format la răcire a fost filtrat, spălat cu metanol şi uscat la aer. Randamentul – 60-65%.

Găsit, %: C – 31,94; H – 3,50; N – 8,54. Calculat pentru C18H26Cu2N4O12S2 (1), %: C – 31,7; H – 3,84; N – 8,22. Găsit, %: C – 33,51; H – 3,64; N – 8,11. Calculat pentru C19,5H29Cu2N4O12S2, (2), %: C – 33,32; H – 4,17; N – 8,00. Prepararea compusului 3 Cu2(HLdiBr)(HSO4).2DMSO·2CH3OH. La soluţia ce conţine 0,5 mmol CuSO4·5H2O

în amestecul MeOH/DMSO (10:1,22 ml) s-a adăugat 0,25 mmol H4LdiBr solid. Amestecul a fost agitat până la dizolvarea ligandului. A doua zi precipitatul cristalin a fost filtrat şi uscat la aer. Randamentul – 45%.

Găsit, %: C – 23,61; H – 2,39; N – 5,17. Calculat pentru C21H28Br4Cu2N4O10S4 (3), %: C – 23,54; H – 2,64; N – 5,23.

Rezultate şi discuţii Liganzii H4LMe,Et,diBr(Fig.1) au fost preparaţi conform metodei modificate [14] prin refluxarea în etanol a

derivatului corespunzător al aldehidei salicilice cu tiocarbohidrazida în raport molar 2:1 şi au fost caracteri-zaţi cu ajutorul analizei elementale, spectroscopiei IR şi spectrometriei de masă. Compuşii 1-3 au fost pre-paraţi prin interacţiunea sulfatului de cupru(II) cu ligandul corespunzător în metanol apos sau în amestecul metanol/DMSO. Utilizarea raportului Cu:ligand de 2:1 a permis formarea complecşilor binucleari 1-3. Ei sunt insolubili în alcooli, cetone, eteri, dar solubili în solvenţi aprotici polari, ca dimetilformamida şi dimetil-sulfoxidul. În spectrele de masă FAB au fost depistate picurile ionilor [Cu2LMe-3H]+ cu m/e= 499, [Cu2LMeSO4-3H]+ cu m/e = 595, [Cu2LEt-3H]+ cu m/e = 528, [NaCu2LEt-3H]+ cu m/e = 552, [Cu2LdiBr-3H]+ cu m/e = 631, fapt ce confirmă natura binucleară a complecşilor. Structura cristalină şi moleculară a compusului 3 fost stabilită cu ajutorul metodei difracţiei razelor X (Fig.2).

OH

NNH

S

NH

NR2

R1

OHR1

R2

H4LMe

Ligandul R1 R2

OCH3 H

H4LEt OC2H5 H

H4LdiBr Br Br

Fig.1. Structura liganzilor studiaţi. Fig.2. Structura moleculară a complexului 3.

În urma cercetărilor efectuate s-a constatat că prezenţa substituenţilor în inelul benzenic al aldehidei utili-

zate pentru obţinerea bazei Schiff modifică comportamentul agentului organic ca ligand în comparaţie cu cazul aldehidei nesubstituite, asigurând formarea compuşilor complecşi binucleari. Studiul cristalografic a arătat că tiocarbohidrazona are configuraţia tiolică anti, cu 2 seturi de coordinare neechivalente: NNO şi ONS, fiecare din ele coordinându-se la câte un ion de cupru(II). Baza Schiff se comportă ca un acid tribazic şi formează după coordinare unitatea Cu2L+. Un atom de cupru are geometria de coordinare plan pătrată, iar celălalt – tetragonal piramidală, folosind fiecare moleculă de solvent (MeOH sau DMSO) pentru a completa sfera de coordinare. În afară de aceasta, în complecşii 1-3 este prezent anionul hidrogenosulfat, caz neordinar şi destul de rar întâlnit în compuşii coordinativi ai cuprului. Derivatul aldehidei salicilice nesubstituite se comportă ca un acid tetrabazic şi, fiind complet deprotonat, formează cu cuprul segmentul binuclear Cu2L0. Datorită coordinării celui de-al patrulea atom de azot al fiecărui segment Cu2L0 la atomul de cupru ce se află în setul ONS, s-a obţinut un metalomacrociclu cu punţi azinice, astfel ligandul folosind la maximum capaci-tatea de a se coordona într-un mod neobişnuit [15]. Explicaţia fenomenelor observate ar putea fi: a) influenţa



215

reciprocă a grupelor funcţionale asupra proprietăţilor acido-bazice; b) activizarea proprietăţilor protolitice în urma coordinării; c) forma (neutră sau cationică) a speciei complexe şi solubilitatea ei în solventul folosit; d) implicarea factorului steric condiţionat de substituent şi manifestat în procesul de formare a fazei solide etc.

Măsurătorile susceptibilităţii magnetice a probelor policristaline ale compuşilor 1 şi 2 în domeniul de temperaturi 2-300K au arătat prezenţa interacţiunilor antiferomagnetice între ionii paramagnetici de cupru. Valoarea produsului χMT se micşorează de la 0,72 cm3 K mol-1 la temperatura camerei până la 0,01 cm3 K mol-1 la 30K.

Concluzii Prin variaţia substituenţilor în inelul benzenic al aldehidei salicilice poate fi modificată structura şi pro-

prietăţile produşilor finali, ceea ce a permis elaborarea metodelor noi de sinteză a unor combinaţii complexe binucleare ale cuprului(II). Măsurătorile magnetice efectuate au indicat prezenţa unor ineracţiuni de natură antiferomagnetică între ionii paramagnetici.

Referinţe:

1. Campbell M.J. Transition metal complexes of thiosemicarbazide and thiosemicarbazones // Coord. Chem. Rev. -1975. - Vol.15. - No2/3. - P.279-319.

2. Padhye S., Kauffman G.B. Transition metal complexes of semicarbazones and thiosemicarbazones // Coord. Chem. Rev. - 1985. - Vol.63. - P.127-160.

3. Kurzer F., Willkinson M. The chemistry of carbohydrazide and thiocarbohydrazide // Chem. Rev. - 1970. - Vol.70. - No1. - P.111-149.

4. Gang H., Deng G., Duan C.Y., Mo H., Meng Q. Self assembly of a novel mixed-valence tetranuclear square [Fe3

IIFeIIIL2(HL)2]3+ and [M(HL)]44+ squares (M = Ni, Zn, and Cd) H2L = bis(2-acetylpyridine)thiocarbazone //

New. J. Chem. - 2002. - Vol.26. - P.1371-1377. 5. Cheng H., Duan C.Y., Fang C.J., Liu Y.J., Meng Q.J., Self-assembled macrocyclic tetranuclear molecular square

[Ni(HL)]44+ and molecular rectangle [Cu2Cl2L]2 HL=bis[phenyl(2-pyridyl)methanone]thiocarbazone // J.Chem.

Soc., Dalton Trans. - 2000. - P.1207-1212. 6. Duan C.Y., Liu Z.H., You X.Z., Xue F., Mak T.C.W. A self-assembled macrocyclic tetranuclear molecular square

[Co(HL)]44+ [H2L = tetra(2-pyridyl)thiocarbazone] // Chem. Commun. - 1997. - P.381-382.

7. Ali M.A., Bernhardt P.V., Kiem C.L., Mirza AH. Self-Assembly of a Charge-Neutral Molecular Square // Aust. J. Chem. - 2004. - Vol.57. - P.409-413.

8. Moubaraki B., Murray K.S., Ranford J.D., Wang X., Xu Y. Structural and magnetic properties of an asymmetric dicopper(II) anticancer drug analogue // Chem. Commun. -1998. - P.353-354.

9. Moubaraki B., Murray K.S., Ranford J.D., Wang X., Vittal I., Wang X., Xu Y. Preparation, characterisation and structures of copper(II) complexes of an asymmetric anti-cancer drug analogue // J. Chem. Soc., Dalton Trans. - 1999. - P.3573-3578.

10. Singh R., Srivastava I.R., Mishra L.K. Chelates of Thiocarbohydrazide Derivative: Part I. Complexes of Mn(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Pd(II), Cd(II) and Pb(II) with 1,5-Bis(salicylidene)thiocarbohydrazone // Indian J. Chem. - 1977. - Vol.15A. - No9. - P.805-808.

11. Гэрбэлэу Н.В., Индричан К.М. Координационные соединения оксованадия(IV), никеля(II), меди(II) с бис (салицилиден)тиокарбазидом // Координационная Химия. - 1987. - Т.3. - В.10. - C.1527-1529.

12. Badiger M.B., Patil S.A., Angadi S.D., Kulkarni V.H. Homobinuclear complexes of copper(II) with copper(II) thiocarbohydrazones // Synth. React. Inorg. Met. - Org. Chem. - 1986. - Vol.16. - No2. - P.201-211.

13. Bustos C., Burckerhardt O., Scharebler R., Carillo D., Arif A.M., Cowley A.H. Synthesis, Characterisation, and Electrochemistry of cis-Dioxomolibdenum(IV) complexes of Schiff Bases Derived from Carbohydrazide, Thiocar-bohydrazide, and Salicylaldehyde. Crystal Structure of [MoO2(o-OC6H4CH=NN=CSNHN=CHC6H4OH-o)Me2SO] and [(MoO2)2(o-OC6H4CH=NN=CONN=CHC6H4OH-o)Me2SO)2] // Inorg. Chem. - 1990. - Vol.29. - P.3996-4001.

14. Yanping R., Rongbin D., Liufang W., Jigui W. Synthesis, characterization and crystal structure of 1,5-bis(2-hydro-xybenzaldehyde)-dithiocarbohydrazone // Synth. Commun. - 1999. - Vol.29. - P.613–617.

15. Dragancea D., Arion Vl., Shova S., Rentschler E., and Gerbeleu N. Azine-bridged octanuclear copper(II) complexes assembled with a one-stranded ditopic thiocarbohydrazone ligand // Angew. Chem., Int. Ed. - 2005. - Vol.44. - P.7938-7942.

Notă: Lucrarea a fost îndeplinită cu suportul CRDF/MRDA, grantul MTFP-022/05 Follow-On. Aduc sincere mulţumiri prof. Anthony Addison (Universitatea Drexel, SUA) pentru ajutorul acordat la elabo-rarea acestui studiu.




216

SINTEZA ŞI STUDIUL DIOXIMAŢILOR Co(III) CARE CONŢIN ÎN SFERA

EXTERIOARĂ ANIONII [ZrF6]2- sau [TiF6]2-

Andrei RIJA

Institutul de Chimie al AŞM

The synthesis and study of Co(III) dioximates containing [ZrF6]2- and [TiF6]2- anions, with general formula [Co(DioxH)2(L)2]2[MF6]·nH2O where DioxH-–dimethylglyoxime or 1,2-cyclohexanone dioxime monoanion and L–Thio (thiocarbamide), Py (pyridine), An (aniline) or SAM (sulfanilamide) have been performed. The composition and struc-tures were established by elemental analysis, UV-Vis, IR and X-ray methods. The effect of some synthesized compounds on biomass accumulation by fungi Aspergillus niger 33 – producer of amylases was tested.

Introducere Trans-dioximaţii Co(III) reprezintă o clasă de compuşi care posedă un spectru larg de posibilităţi sintetice,

analitice [1-3] şi structurale [4-7]. Varietatea structurală a dioximaţilor Co(III) se datorează condiţiilor de sinteză diferite (pH-ul soluţiei), naturii liganzilor axiali şi anionilor din sfera externă.

Recent, încercările de a realiza sinteza dioximaţilor Co(III) în prezenţa anionului de fluor au permis de a obţine compuşii respectivi [5,6]. Descifrarea cu razele X a structurii acestor complecşi s-a încheiat cu rezul-tate absolut neaşteptate. S-a constatat că în acest caz ionul F- nu se află în sfera internă a compusului.

Interesul faţă de aceşti dioximaţi este condiţionat de deosebirea esenţială în comparaţie cu compuşii tra-diţionali ai acestei serii, atât după caracterul complecşilor obţinuţi, cât şi după particularităţile de structură şi de comportare chimică. Diferenţa dintre aceşti compuşi constă în prezenţa anionilor care, spre deosebire de alte resturi acide, conţin fluor doar în sfera exterioară a complexului, fapt ce creează condiţii deosebite de împachetare într-o reţea supramoleculară. Aceasta se realizează datorită legăturilor de hidrogen care se for-mează între moleculele complexului, la care participă şi atomii de fluor ce posedă o electronegativitate net superioară. Studiul acestor compuşi este important şi prin faptul că anionul influenţează asupra aranjării liganzilor axiali faţă de planul Co(DioxH)2. Cercetarea dioximaţilor, unde în calitate de cation este [Co(DioxH)2(Thio)2]+ (Thio-tiocarbamida) cu anionii [SiF6]2- [7,8], [AlF6]3- [9], [BF4]- [10], a demonstrat posibilitatea unei amplasări diferite (paralelă şi orizontală) a fragmentelor Thio faţă de planul ecuatorial.

Cercetările ştiinţifice efectuate în ultimii ani au relevat faptul că compuşii coordinativi joacă un rol impor-tant în sinteza dirijată a substanţelor bioactive, inclusiv a enzimelor, de către microorganisme. Utilizarea complecşilor metalelor biogene în calitate de stimulatori ai biosintezei se consideră eficientă datorită capaci-tăţii lor mai înalte de penetrare a membranelor celulare şi toxicităţii mai mici în comparaţie cu ionii solvataţi ai metalelor respective. Totodată, aplicarea compuşilor coordinativi ca stimulatori ai biosintezei sau ca sursă de ioni metalici facilitează procesul de purificare şi extracţie a enzimelor din mediul de cultivare [11-13].

Scopul lucrării de faţă constă în elaborarea condiţiilor optime de sinteză, stabilirea compoziţiei şi structurii prin diferite metode fizico-chimice moderne, precum şi a unor proprietăţi utile a unor dioximaţi care conţin în sfera exterioară anionii [ZrF6]2- sau [TiF6]2-.

Material şi metode Compoziţia şi structura acestor complecşi a fost stabilită în baza datelor analizei elementelor, a spectro-

scopiei IR, UV-Vis, analizei termice complexe şi prin difracţia cu raze X (pentru unele din ele). Spectrele IR ale compuşilor obţinuţi au fost înregistrate la spectrofotometrul Specord-75-IR sub formă de paste în ulei de vaselină. Spectrele UV-Vis au fost înregistrate la spectrofotometrul Specord-40, proba pregătită pentru analiză având concentraţia de 10-5 mol/L. Analiza termică a complecşilor a fost efectuată în intervalul de temperaturi 20-500ºC în atmosferă de aer, folosind derivatograful Paulik-Paulik-Erday cu viteza de creştere a tempera-turii 2,5ºC/min., masa probei – 50 mg, atmosfera – aer, sensibilitatea: DTG – 1/3; DTA – 2/10; TG – 50/100.

Partea experimentală Sinteza [Co(DH)2(Thio)2]2[TiF6]·3H2O. La soluţia 0,37 g (0,001 mol) CoTiF6·6H2O în 30 mL apă s-au

adăugat 0,23 g (0,002 mol) dimetilglioximă în 40 mL metanol şi 0,15 g (0,002 mol) tiocarbamidă. Soluţia



217

obţinută s-a încălzit timp de 10 minute la baia de apă într-un creuzet de grafit la temperatura de 70ºC. Din soluţia de culoare cafenie-închis la răcire lentă se separă cristale în formă de plăci neregulate de culoare cafenie-închis (randamentul 53%). Compusul este solubil în metanol şi în apă.

După o metodă analogică, folosind în calitate de substanţe iniţiale sărurile de Co(II) CoZrF6·6H2O, CoTiF6·6H2O, liganzii din planul ecuatorial – dimetilglioxima şi 1,2-ciclohexandion-dioxima; liganzi apicali – anilina, tiocarbamida, sulfanilamida, piridina, se obţin la fel compuşi stabili în aer şi mai bine solubili în apă (în cazul compuşilor cu dimetilglioximă) sau în metanol (în cazul compuşilor cu 1,2-ciclohexandiondio-ximă). Rezultatele analizei elementelor pentru compuşii cercetaţi sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabelul 1

Analiza elementelor şi randamentul sintezei unor dioximaţi ai Co(III)

calculat / (găsit), % Nr. crt. Formula Randament,

% Masa

moleculară Co C H N

I [Co(DH)2(Thio)2]2[TiF6]·2H2O 53 1080,68 10,91 (10,79)

22,23 (21,97)

4,48 (4,16)

20,74 (20,59)

II [Co(NioxH)2(Thio)2]2[TiF6]·3H2O 52 1202,85 9,80 (9,56)

27,96 27,74)

4,86 (4,37)

18,63 (18,51)

III [Co(NioxH)2(SAM)2]2[TiF6]·3H2O 43 1587,18 7,43 (7,26)

36,32 (36,26)

4,70 (4,36)

14,12 (13,98)

IV [Co(DH)2(SAM)2]2[TiF6]·4H2O 37 1501,05 7,85 (7,66)

32,01 (31,89)

4,57 (4,41)

14,93 (14,78)

V [Co(DH)2(Py)2]2[TiF6]·2H2O 51 1092,60 10,79 (10,67)

39,57 (39,42)

4,80 (4,67)

15,38 (15,27)

VI [Co(DH)2(Thio)2]2[ZrF6]·H2O 63 1106,03 10,66 (10,37)

21,72 (21,65)

4,19 (3,82)

20,26 (20,13)

VII [Co(DH)2(An)2]2[ZrF6]·2H2O 68 1192,06 9,89 (9,56)

40,30 (40,75)

5,07 (4,98)

14,10 (14,12)

VIII [Co(NioxH)2(An)2]2[ZrF6]·3H2O 34 1314,22 8,97 (8,56)

43,87 (43,57)

5,36 (5,15)

12,79 (12,47)


În baza analizei elementelor (Tab.1) se poate presupune că în timpul sintezei în amestecul reactant are loc formarea complexului octaedric prin legarea a doi radicali de dimetilglioximă sau 1,2-ciclohexandiondioximă în plan ecuatorial şi a două molecule neutre în poziţiile 1,6 analogic cu dioximaţii Co(III) obţinuţi anterior, structura fiind confirmată prin metoda X-ray.

În spectrul UV-Vis înregistrat pentru compusul I se observă două benzi de absorbţie. Prima bandă cu un maximum la 234 nm caracterizează transferul π-π* în cadrul grupei Co(DH)2, iar a doua bandă aflată la 337 nm indică prezenţa moleculelor coordinate de tiocarbamidă amplasate în poziţie trans. În compusul II la fel sunt prezente două benzi de absorbţie: prima – la 238 nm, iar a doua – la 339 nm. Atât pentru primul compus, cât şi pentru al doilea are loc micşorarea intensităţii în timp a benzii din regiunea 335-340 nm, ceea ce se explică prin substituirea moleculelor de tiocarbamidă cu moleculele de apă.

În spectrele IR ale compuşilor I, IV, V, VI, VII sunt prezente benzile de absorbţie ν(CN) = 1360-1380 cm-1, νas(NO) = 1230-1245 cm-1, νs(NO) = 1080-1095 cm-1, δ(OHO) = 1825-1750 cm-1, γ(OH) = 970-985 cm-1, γ(CNO) = 730-745 cm-1, care indică prezenţa radicalului de dimetilglioximă în complex, iar benzile νas(Co-N) = 505-525 cm-1 şi νs(Co-N) = 425-440 cm-1 arată că acest radical se leagă de generatorul de complex prin atomul de azot. Prezenţa moleculelor de piridină coordinate poate fi confirmată de oscilaţiile de valenţă ν(C-N) = 3120-3230 cm-1 şi ν(C=C) = 1610-1615 cm-1. Aceste benzi sunt deplasate spre valori mai mari faţă de spectrul piridinei necoordinate. Oscilaţiile νas(NH) = 3300-3370 cm-1, νs(NH) = 3210-3240 cm-1, δ(NH2) = 1615-1625 cm-1, [ν(CN)+ν(CS)+δ(HNC)] = 1060-1075 cm-1, δ(NCS) = 412-415 cm-1 indică prezenţa tio-carbamidei coordinate în dioximaţii respectivi, însă aici au fost observate mici modificări în valorile oscilaţiilor de valenţă şi de deformare faţă de valorile caracteristice tiocarbamidei libere. În cazul compuşilor



218

III şi IV, benzile νas(CC)+δ(CCH) = 1580-1610 cm-1, νs(CC)+δ(CCH) = 1480-1495 cm-1, νas(SO) = 1310-1340 cm-1, νs(SO) = 1150-1170 cm-1 dovedesc prezenţa moleculelor de sulfanilamidă în poziţiile apicale. Molecula de anilină la fel are benzi caracteristice inelului benzenic [ν(CC)+δ(CCH)] = 1590-1602 cm-1, ν(CC) = 1035 cm-1, [γ(CCC)+γ(CNC)] = 620-625 cm-1 şi benzile νas(NH) = 3315-3375 cm-1, νs(NH) = 3205-3245 cm-1, δ(NH2) = 1605-1630 cm-1 caracteristice pentru grupa NH2. Prezenţa anionului în complex la fel este confirmată de benzile νas(ZrF) = 580-595 cm-1, νs(ZrF) = 410-420 cm-1 şi δas(FZrF) = 530-545 cm-1, δs(FZrF) = 515-530 cm-1 pentru anionul [ZrF6]2-, şi νas(TiF) = 590-615 cm-1, νs(TiF) = 460-480 cm-1 şi δas(FTiF) = 540-560 cm-1, δs(FTiF) = 525-540 cm-1 pentru anionul [TiF6]2-.

Analiza spectrelor IR şi UV-Vis a permis formularea concluziei despre structura trans-octaedrică a complecşilor obţinuţi.

Studiul comparat al dioximaţilor Co(III) (compuşii I, III şi V) a permis de a elucida comportarea la tem-peratură şi procesele destructive în aceşti complecşi. Destrucţia termică se derulează în trei etape: înlăturarea apei de cristalizare, eliminarea liganzilor axiali şi termoliza totală prin formarea Co2O3 şi TiF4. Pentru compusul I apa se degajă în două etape (30-80ºC şi 90-130ºC), pe când în compuşii III şi V apa de cristalizare se elimină mai greu (100-150ºC), însă într-o singură etapă. Eliminarea oxidativă (exoefect puternic) a mole-culelor liganzilor axiali creşte de la Py<Thio<SAM (170, 180, 200ºC, corespunzător). La etapa a treia la fel au loc efecte exotermice în intervalul 235-295ºC. Procesele descompunerii totale au loc până la temperatura de 500ºC. Se poate presupune că nioxima redă complecşilor o stabilitate sporită faţă de dimetilglioximaţii co-respunzători, însă această concluzie cere un studiu mai detaliat. Presupunerea despre compoziţia rămăşiţei, rezultată după termoliză: Co2O3 şi TiF4 sau Co2O3 şi TiO2, va fi precizată în studiile următoare.

Prin metoda X-ray au fost stabilite structurile compuşilor VI-VIII. Într-adevăr, compuşii posedă o configuraţie trans-octaedrică, unde în planul ecuatorial se află doi radicali monodeprotonaţi de dioximă uniţi între ei prin două legături de hidrogen, iar liganzii neutri ocupă poziţiile apicale.

În Figura 1 este arătată structura unui fragment de moleculă a complexului [Co(DH)2(Thio)2] [ZrF6]·H2O. Dimetilglioxima coordinează biden-tat prin cei doi atomi de azot care, împreună cu atomul de cobalt, formează un ciclu de cinci atomi. Între cei doi radicali ai ligandului ecuatorial se realizează două legături de hidrogen intramole-culare între atomii grupelor oxime O1H···O3 şi O4H···O2.

Tiocarbamida ocupă poziţiile apicale faţă de planul ecuatorial al nodului coordinativ şi coor-dinează prin atomul de sulf. Din datele experi-mentale se observă o aranjare diferită a molecu-lelor de tiocarbamidă faţă de planul ecuatorial. Fragmentul S2 C10 N7 N8 practic este paralel metalociclului Co1 N3 N4 C3 С4, pe când S1 C9 N5 N6 – perpendicular planului Co1 N1 N2 C1 С2, unghiul diedru fiind de 25,4(3)° şi 84,1(3)°, respectiv. Orientarea paralelă a moleculei de tiocarbamidă mai degrabă se explică prin interacţiunea π-π care se realizează între ultimul şi fragmentul metalociclic din planul ecuatorial, distanţa fiind de С10 – Х1А = 2,998(4)Å (Х1А – centrul planului ecuatorial al metalociclului Co1 N3 N4 C3 С4).

În cazul dioximaţilor ce conţin anilină mai apar nişte interacţiuni π–π slabe între inelul benzenic al anilinei şi metalociclu.

Un rol important în formarea structurii cristaline îl joacă legăturile de hidrogen care se realizează între atomii de azot ai liganzilor, atomii de fluor din anionul complex şi moleculele de apă de cristalizare.

Prezintă interes faptul că în compusul VIII anionii din sfera exterioară şi moleculele de apă de cristalizare formează, singure, un sistem supramolecular pe baza realizării unei reţele complicate de legături de hidrogen. În Figura 2 este prezentat fragmentul formării unei reţele paralele a anionilor [ZrF6]2– şi trei molecule de apă de cristalizare O1w, O2w, O3w pe direcţia [001].

Fig. 1. Structura unui fragment de moleculă a

complexului [Co(DH)2(Thio)2][ZrF6]·H2O



219

NNH2

CSNH2

NH2

Capacitatea α-dioximelor de a forma compuşi stabili cu ionii Co3+, care pot fi utilizaţi în calitate de catali-

zatori ai proceselor industriale, stimulatori ai funcţiilor eritropoetice, modele ale vitaminei B12 etc., sporeşte interesul faţă de sinteza noilor complecşi din această serie.

În urma testelor biologice, în cadrul cărora dioximaţii Co(III), care conţin fluor, au fost introduşi în mediul nutritiv al microorganismelor, s-a constatat că ei manifestă proprietăţi de biostimulatori ai biosintezei vita-minei B12 de către alga Spirulina platensis [14].

Tabelul 2 Lista abrevierilor folosite în articol

Formula de structură

Formula moleculară

Masa moleculară Denumirea substanţei Simbolul

C4H8N2O2 116,26 Dimetilglioximă DH2

C6H10N2O2 142,15 1,2-ciclohexandion-dioximă NioxH2

C5H5N 79,10 Piridină Py

C5H7N 81,17 Anilină An

CH4N2S 76,05 Tiocarbamidă Thio

NH2 S

O

O

NH2

C6H8O2N2S 172,2 Sulfanilamidă SAM

De asemenea, s-a constatat că compuşii cobaltului cu fluorul posedă proprietăţi stimulatoare asupra unor microorganisme [15]. Complexitatea structurală şi de compoziţie, prezenţa metalelor în calitate de atom central atestă perspectiva utilizării compuşilor coordinativi în calitate de stimulatori şi reglatori ai proceselor

Fig.2. Sistemul supramolecular format de anionii complecşi din sfera externă [ZrF6]2- şi

3 molecule H2O pe direcţia [001] în [Co(NioxH)2(Anil)2]2[ZrF6]·3H2O.

CH3 C C CH3

HON NOH

CH2C C

CH2 CH2CH2

HON NOH



220

biologice în celula microbiană. De aceea, a apărut necesitatea de a testa în calitate de biostimulatori capaci-tatea acestor compuşi. A fost testat efectul lor asupra randamentului de biomasă a fungului Aspergillus niger 33 – producător de amilaze. S-a observat că la adăugarea compuşilor VII şi VIII în mediul nutritiv al acestor fungi se manifestă o acţiune stimulatoare la etapa iniţială a biosintezei amilazei. Efectul stimulator este cu 8,12 şi 22,09% (amilaze stabile în mediu acid) şi cu 10,85 şi 19,98% (amilaze standard) mai mare faţă de martor. Trebuie de menţionat că compusul ce conţine în sfera internă grupa NioxH2 manifestă efect stimulator mai înalt. Efectul stimulator mai depinde şi de anionul polifluorometalic. În dependenţă de anionul folosit în complex, capacitatea stimulatoare este diferită şi depinde, într-o măsură oarecare, de mărimea anionului. Analizând rezultatele pentru dioximaţii Co(III) s-a observat că activitatea biologică a compuşilor respectivi scade în ordinea [BF4]- > [TiF6]2- > [ZrF6]2-.

Referinţe:

1. Schrauzer G.N., Windgassen R.J. // J. Am. Chem. Soc. - 1967. - Vol.89. - No9. - P.1999. 2. Dolphin D. (ed.) // B12, Wiley, New York, 1982. 3. McCauley K.M., Wilson S.R., Van der Donk W.A // Inorg. Chem. - 2002. - Vol.41. - P.393. 4. Дворкин А.А, Симонов Ю.А., Малиновский Т.И. и др. Кристаллохимия неорганических соединений. -

Кишинев: Штиинца, 1976, с.3-31. 5. Симонов Ю.А., Дворкин А.А., Гуля А.П. и др. // Доклады АН СССР. - 1989. - Т.305. - 3. - C.635-638. 6. Симонов Ю.А., Болога О.А., Дворкин А.А. и др. // Координационная химия. - 1994. - Т.20. - 2. - C.106-110. 7. Симонов Ю.А., Кравцов В.Х., Гэрбэлэу Н.В. и др. // Журнал неоргaнической химии. - 1999. - Т.44. - 9. -

C.1468-1476. 8. Боурош П.Н., Коропчану Э.Б., Симонов Ю.А. и др. // Координационная химия. - 2002. - Т.28. - С.689-697. 9. Боурош П.Н., Коропчану Э.Б., Симонов Ю.А. и др. // Журнал неоргaнической химии. - 2002. - Т.47. - 10. -

C.1604-1609. 10. Малиновский С.Т., Болога О.А., Коропчану Э.Б. и др. // Координационная химия. - 2004. - Т.30. - 5. - С.363-369. 11. Dugas H. Bioorganic Chemistry. A Chemical Approach to Enzyme Action. - Springer-Verlag, New York, 1996,

p.388-460. 12. Haiduc I. Organometallic compounds in the environment, medicine and biology: Proceedings of 3rd International

Symposium on Metal Elements in Medicine and Biology, Timishoara, 1998, p.19-33. 13. Dediukhin E., Eroshin V. Indispensable elements in regulation in metabolism of microorganisms // Successes of

Microbiology (russ). - 1991. - No25. - P.127-141. 14. Гуля A.П., Рудик В.Ф., Гэрбэлэу Н.В. и др. // Авторское свидетельство 1616111 (СССР). 15. Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. - Chişinău: Ştiinţa, 1993.



Fizic= ISSN 1857-1735

221

ИЗЛУЧАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛОВ ZnSe:Cr

Леонид КУЛЮК*, Рейно ЛАЙХО***, Александр ЛАШКУЛ***, Эркки ЛЯХДЕРАНТА**, Дмитрий НЕДЕОГЛО, Наталья НЕДЕОГЛО, Анатолий СИМИНЕЛ*, Вадим СИРКЕЛИ, Раиса СОБОЛЕВСКАЯ, Константин СУШКЕВИЧ

НИЛ физики полупроводников *Институт прикладной физики АН Молдовы **Технологический университет Леппеенранты, Финляндия ***Физическая лаборатория им. Вихури, Университет Турку, Финляндия În lucrare sunt prezentate rezultatele studiului fotoluminescenţei (FL) cristalelor ZnSe:Cr. În spectrele de FL a

cristalelor ZnSe:Cr au fost depistate benzi în regiunile albastră şi IR ale spectrului. Aceste benzi sunt determinate de tranziţiile ionizante de ionii Cr+ şi Cr++ în ZnSe. Se analizează mecanismele de excitare a FL şi mecanismele ce determină FL în regiunea IR a spectrului în ZnSe:Cr. Rezultatele pot fi folosite pentru pompajul optic al laserilor în baza ZnSe:Cr.

Results on photoluminescence (PL) of ZnSe:Cr crystals are reported. Blue and infrared emission were observed in

ZnSe:Cr. These emissions are explained by 2+ to 1+ ionization transitions of chromium ions in ZnSe. The analysis of the mechanism of PL excitation and IR PL emission in ZnSe:Cr are discussed. The results of photoionization excitation mechanism can be applied for optical pumping of lasers based on ZnSe:Cr crystals.

Введение

Cоединения AIIBVI, легированные d-элементами, представляют практический интерес как перспек-тивный материал для создания ИК-лазеров и применения в спинтронике. При внедрении хрома в ZnSe он замещает узлы цинковой подрешётки и создаёт оптически активные центры Cr2+ с электронной конфигурацией 3d4 [1-3]. Под действием кристаллического поля энергетические уровни, соответст-вующие ионам Cr2+, расщепляются, вследствие чего возможны внутрицентровые переходы и генерация лазерного излучения в ближней ИК области (2-3 мкм) [2, 4-17]. При легировании широкозонных соединений хром может создавать также акцепторные однозарядные центры Cr+ [18, 19]. В ряде работ [19, 20] упоминается о возможности существования в селениде цинка состояния хрома Cr3+, который должен создавать донорный уровень в запрещённой зоне ZnSe, однако в литературе не приводятся экспериментальные факты, доказывающие существование центра Cr3+ в ZnSe. Для получения эффек-тивных лазеров на базе ZnSe:Cr, необходимо, чтобы концентрация ионов хрома составляла ∼ 1019 см-3 [21, 22]. Поэтому вопрос о выборе оптимальной технологии легирования кристаллов селенида цинка хромом является актуальным.

Нами исследованы излучательные свойства кристаллов селенида цинка, легированных хромом различными методами. На основании полученных экспериментальных данных анализируется зарядовое состояние ионов хрома в селениде цинка, а также механизмы фотовозбуждения и связанные с ними оптические переходы.

Изготовление образцов и условия эксперимента

Объектом исследования являлись монокристаллы ZnSe, легированные хромом. Легирование крис-таллов осуществлялось двумя способами: 1) в процессе роста кристаллов йодидным методом; 2) в процессе термического отжига кристаллов ZnSe в расплаве Bi+Cr, с различной добавкой в расплав легирующей примеси. Концентрацию хрома в расплаве висмута варьировали от 0,02 ат% до 1 ат%. Исследование оптических и люминесцентных свойств проводилось в интервале температур от 4,2 до 300К. Источником возбуждения ФЛ являлись азотный (337,1 нм) и аргоновый (488,0, 514,5, и 532 нм) лазеры. Спектры ФЛ иследовались монохроматорами МДР-23, ORIEL Instruments MS 257TL и датчи-ками ФЭУ-100, ФЭУ-79 (для видимой области спектра) и PbS (для инфракрасной области спектра).



222

Экспериментальные результаты и их обсуждение

На рис. 1 приведены спектры фотолюминесценции при 77К исходного нелегированного кристалла ZnSe, а также кристалла, легированного хромом из среды Bi+1 ат.% Cr. Из рисунка видно, что в спектре ФЛ исходного ZnSe в краевой области имеется довольно узкая интенсивная полоса с максимумом при 445,3 нм. Поскольку эта полоса расположена вблизи края фундаментального поглощения, то можно предположить, что её появление обусловлено аннигиляцией свободных экситонов, энергия связи которых в ZnSe варьирует от 16 до 24 мэВ [23]. В длинноволновой части спектра ФЛ исходного кристалла имеется широкая полоса с пиками при 585 нм и 629 нм (рис.1, (а)), интенсивность которой примерно в 400 раз меньше интенсивности полосы краевого излучения. Малая интенсивность полосы длинноволнового излучения и большая интенсивность линии излучения свободных экситонов указывают на высокую чистоту исходного нелегированного кристалла ZnSe.

Легирование кристаллов ZnSe хромом из расплава Bi+Cr существенно изменяет структуру спектра ФЛ. Интенсивность краевой фотолюминесценции уменьшается на три порядка (рис.1, (б)). Харак-терной особенностью кристаллов ZnSe, легированных хромом из среды висмута, является полное отсутствие в спектрах ФЛ таких кристаллов полосы длинноволнового излучения и наличие в краевой области спектра излучения с энергией, большей, чем ширина запрещённой зоны ZnSe (Еg=2,72 эВ) (рис.1, (б)).

На рис. 2 представлены спектры краевой ФЛ кристаллов ZnSe:Cr при комнатной температуре.

Видно, что для слаболегированных хромом образцов (>0,01 ат.% Cr) и образца, легированного из расплава Bi+Cr, в спектрах краевой ФЛ наблюдается слабая по интенсивности широкая полоса с энергией, большей, чем ширина запрещенной зоны ZnSe. Мы предполагаем, что наблюдаемая “зона-зонная” излучательная рекомбинация в спектрах ФЛ кристаллов ZnSe:Cr обусловлена присутствием ионов Cr2+ (полоса с максимумом 442,8 нм, рис.1 (б), и полоса 427 нм на рис. 2), а процесс генерации голубого излучения происходит по двухступенчатой схеме, предложенной авторами [24], которые наблюдали в кристаллах ZnSe:Cr антистоксовое излучение при возбуждении ФЛ лазером с длиной волны 514,5 нм. Отсутствие излучения в длинноволновой области спектра ФЛ исследованных кри-сталлов ZnSe:Cr (>0,1 ат.% Cr) обусловлено, по-видимому, высокой концентрацией хрома в образцах. Для слаболегированных образцов ZnSe:Cr (0,01 ат.% Cr) в видимой области спектра наблюдается слабая по интенсивности широкая полоса люминесценции (рис.3), которая быстро гасится с ростом

Рис.1. Спектры фотолюминесценции исходного кристалла ZnSe (а) и кристалла ZnSe, легированного

хромом из среды висмута (б). Т = 77К.

Рис.2. Спектры краевой ФЛ кристаллов ZnSe:Cr. T = 293K.



223

Рис. 5. Положение энергетических уровней, создаваемых центрами Cr+ и Cr2+

в селениде цинка.

температуры. Природа этой полосы связана, вероятно, с собственными дефектами, поскольку с ростом концентрации примеси хрома в образцах эта длинноволновая полоса излучения исчезает.

Были исследованы спектры инфракрасной (ИК) люминесценции исходного кристалла ZnSe и кристаллов ZnSe:Cr, легированных в процессе роста хромом различной концентрации (0,2 ат. % Cr до 1 ат. % Cr). Спектры были измерены при температуре 293К, в качестве детектора использовался датчик PbS, а люминесценция возбуждалась излучением лазера с длиной волны 532 нм. Как уже отмечалось ранее, хром в селениде цинка является гасителем полос видимой ФЛ, а благодаря его двум зарядовым состояниям Cr+/Cr2+ возможны оптические переходы между этими состояниями с излучением (поглощением) квантов света из ближней ИК- области.

На рис. 4 представлены спектры ИК-люминесценции исследованных нами кристаллов. Из рисунка

видно, что для исходного кристалла ZnSe в ИК-области наблюдается одна полоса с максимумом при ~990 нм. Слабое легирование кристалла ZnSe хромом (0,2 ат.% Cr) приводит к появлению в ИК-спектре слабой полосы с максимумом при 1280 нм, при этом интенсивность полосы при 990 нм практически не изменяется.

Умеренное легирование кристаллов ZnSe хромом (0.5 ат. % Cr) существенно изменяет структуру спектра. Интенсивность полосы при 990 нм несколько уменьшается, однако резко возрастает интенсив-ность полосы при 1280 нм (примерно в 4 раза) и появляется интенсивная полоса при 2008 нм (рис. 4). Известно, что ионам хрома Cr+ и Cr2+ в селениде цинка соответствуют два энергетических уровня с глубиной залегания ~ 1,4 эВ и 0,7 эВ от потолка валентной зоны [25]. В свою очередь, Cr2+ под дейст-вием кристаллического поля расщепляется на два состояния: 5Е и 5Т2 (рис. 5). При определённом уровне легирования возможны оптические переходы между двумя этими состояниями, которые приводят к появлению полосы ИК ФЛ с максимумом при 2008 нм.

Увеличение концентрации легирующей примеси до 1 ат.% Cr (рис. 4) приводит к смещению ИК-полосы при 990 нм до 1000 нм и к полному исчезновению других полос ИК-люминесценции. Мы считаем, что полоса ИК ФЛ с мак-симумом при 990–1000 нм обусловлена излучательными переходами «свободный электрон – акцептор», где в качестве акцептора выступает ион Cr+, а полоса ИК-излучения при 1280 нм обусловлена излучательными переходами «электрон в состоянии иона хрома 5Е – дырка в валентной зоне».

Уменьшение интенсивности ИК-полос при концентра-циях Cr в ZnSe, превышающих 1 ат.%, обусловлено изме-нением соотношения между центрами Cr+ и Cr2+, а также

Рис.4. Спектры ИК ФЛ кристаллов ZnSe:Cr. Т =293К. Рис.3. Влияние температуры на спектры ФЛ кристалла ZnSe:Cr (0.01 ат.% Cr).



224

увеличением числа центров безызлучательной рекомбинации. Экспериментально установлено также, что оптимальной концентрацией легирования ZnSe хромом в процессе роста кристаллов является ∼0,5 ат. % Cr. При этой концентрации интенсивность внутрицентровой ИК-полосы с максимумом при 2008 нм максимальна.

Выводы На основании результатов проведенных фотолюминесцентных исследований кристаллов ZnSe:Cr

можно сделать следующие выводы: 1. Легирование кристаллов ZnSe хромом из расплава висмута (Bi+1 ат.% Cr) приводит к появлению

центров безызлучательной рекомбинации. В результате интенсивность краевой фотолюминесценции таких кристаллов уменьшается более чем на 3 порядка по сравнению с интенсивностью краевой ФЛ исходного кристалла ZnSe. Характерной особенностью кристаллов ZnSe, легированных хромом из среды висмута, является практически полное отсутствие в спектре ФЛ таких кристаллов полосы длинноволновой люминесценции.

2. Установлено, что легирование ZnSe хромом приводит к появлению глубоких акцепторных центров Cr+ и Cr2+, которым соответствуют два энергетических уровня в запрещенной зоне ZnSe: ∼0,7 и 1,4 эВ от потолка валентной зоны.

3. Обнаружено появление в спектре ФЛ кристалла ZnSe:Cr полосы зона-зонного излучения при возбуждении лазером с длиной волны 337,1 нм. Полагаем, что обнаруженное излучение может быть обусловлено излучательной рекомбинацией свободных электронов из зоны проводимости с дырками в валентной зоне, образовавшимися в результате процесса двухступенчатого возбуждения через глубокие центры Cr+/Cr2+, согласно модели, предложенной авторами [24].

4. Показано, что легирование кристаллов ZnSe хромом приводит к появлению полос ИК-люми-несценции с максимумами при ∼990 – 1000 нм; 1280 и 2008 нм. Установлено, что полоса ИК ФЛ при ∼990 – 1000 нм обусловлена переходом «свободный электрон – акцептор», где акцептором служит ион Cr+, а полоса с максимумом при 1280 нм обусловлена переходом «электрон с 5Е уровня иона Cr2+ – дырка в валентной зоне».

5. Установлено, что интенсивность полос ИК ФЛ сильно зависит от концентрации хрома в легированных кристаллах. Перестройка интенсивностей полос ИК ФЛ связана с перераспределением концентрации центров Cr+ и Cr2+. Показано, что наибольшая интенсивность ИК полосы с максимумом при 2008 нм наблюдается в образце ZnSe с содержанием хрома ∼0,5 ат.% Cr.


1. B.L. Vanmil, A.J. Ptak, L. Bai, Lijun Wang, M. Chirila, N.C. Giles, T.H. Myers, and Larry Wang // J. Electron. Materials. - 2002. - Vol.31. - No7. - P.770-775.

2. L.D. DeLoach, R.H. Page, G.D. Wilke, S.A. Paye, and W.F. Krupke // IEEE J. Qunatum Electron. - 1996. - Vol.32. - P.885-895.

3. R.S. Title // Phys. Rev. - 1964. - Vol.133. - P.A1613. 4. A. Di Lieto, M. Tonelli // Optics and Lasers in Engineering. - 2003. - Vol.39. - P.305-308. 5. A.Sennaroglu, U.Demirbas, N. Vermeulen, H. Ottevaere, H. Thienpont // Optics Commun. - 2006. - Vol.268. - P.115-120. 6. G.J. Wagner, T.J. Carrig, R.H. Page, K.I. Schaffers, J.-O. Ndap, X. Ma and A. Burger // Opt. Lett. - 1999. - Vol.24. - P.19. 7. I. Sorokina, E. Sorokin // J. Opt. Soc. Am. - 2001. - Vol.18. - No7. - P.1578-1586. 8. A.Gallian, V.V. Fedorov, S.B. Mirov, V.V. Badikov, S.N. Galkin, E.F Voronkin, and A.I. Lalayants // Optics

Express. - 2006. - Vol.14. - No24. - P.11694-11701. 9. K. Graham, S.B. Mirov, V.V. Fedorov, M.E. Zvanut, A. Avanesov, V. Badikov, B. Ignat'ev, V. Panyutin and

G. Shevirdyaeva. Spectroscopic characterization and laser performance of diffusion doped Cr2+:ZnS // Advanced Solid State Lasers, S. Payne and C. Marshall, eds., Vol.46 of OSA Proceedings Series (Optical Society of America, Washington, DC 2001), p.561-567.

10. T.J. Carrig, G.J. Wagner, A. Sennaroglu, J.Y. Jeong, and C.R. Pollock. Acousto-optic mode-locking of a Cr2+:ZnSe laser // Advanced Solid State Lasers, H. Injeyan, U. Keller and C. Marshall, eds., Vol.34 of OSA Proceedings Series (Optical Society of America, Washington, DC 2001), p.182-187.

11. A.V. Podlipensky, V.G. Shcherbitsky, N.V. Kuleshov, V.I. Levchenko, V.N. Yakimovich, M. Mond, E. Heumann, G. Huber, H. Kretschmann, S. Kuck // Appl. Phys. B. - 2001. - Vol.72. - P.253-255.



225

12. E. Sorokin, I.T. Sorokina and R.H. Page. Room-temperature CW diode-pumped Cr2+:ZnSe laser in Advanced Solid State Lasers, S. Payne and C. Marshall, eds., Vol. 46 of OSA Proceedings Series (Optical Society of America, Washington, DC 2001), p.101-105.

13. E. Sorokin and I.T. Sorokina // Appl. Phys. Lett. - 2002. - Vol.80. - No18. - P.3289-3291. 14. R.H. Page, K.I. Schaffers, L.D. DeLoach, G.D. Wilke, F.D. Patel, J.B. Tassano, S.A. Payne, W.F. Krupke, K.T. Chen,

A. Burger. // IEEE Journal of Quantum Electronics. - 1997. - Vol.33. - No4. - P.609-619. 15. J. McKay, K.L. Schepler, G.C. Catella // Opt. Lett. - 1999. - Vol.24. - P.1575-1577. 16. T.J. Carrig, G.J. Wagner, A. Sennaroglu, J.Y. Jeong, and C.R. Pollock // Opt. Lett. - 1999. - Vol.25. - No3. - P.168-170. 17. W.F. Krupke et al. // SPIE. - 1997. - Vol.3176. - No11. - P. 8. 18. G. Grebe, G. Roussos, and H.-J. Schulz // J. Phys. C: Solid State Phys. - 1976. - Vol.9. - P.4511-4516. 19. J. Kreissl and H.-J. Schulz // J. Crystal Growth. - 1996. - Vol.161. - P.239-249. 20. J. Dziesiaty, P. Peka, M. Lehr, et al., Z. Phys. Chem. (Munich). - 1997. - Vol.201. - P.63. 21. U. Demirbas, A. Sennaroglu, M. Somer // Optical Materials. 2006. V.28. - P.231-240. 22. J.T. Vallin, G.A. Slack, S. Roberts, A.E. Hughes // Phys. Rev. B. - 1970. - V.2. - No11. - P.4313. 23. Д.Д. Недеогло, А.В. Симашкевич // Электрические и люминесцентные свойства селенида цинка. – Кишинёв:

Штиинца, 1984. - 150 с. 24. S. Bhaskar, P.S. Dobal, B.K. Rai, R.S. Katiyar, H.D. Bist, J.-O. Ndap, A. Burger // J. Appl. Phys. - 1999. - Vol.85. -

No1. - P.439-443. 25. В. Гаврюшин, А. Кадис, М. Суджюс, К. Яврашюнас // Письма в ЖЭТФ. - 2006. - Т. 83. - 1-2. - С. 24-30.

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства РМ (институциональная тема 06.408.037F) и INTAS (INTAS YSF Ref. Nr. 06-1000014-6370).




226

TRANZIŢII CONFORMAŢIONALE LA INTERACŢIUNEA CÂMPULUI

ELECTROMAGNETIC DE FRECVENŢĂ EXTREM DE ÎNALTĂ

CU BIOMACROMOLECULELE INTRACELULARE

Anatol ROTARU, Nelu CIOBANU, Iurie NICA, Theodor GEREGHI, Leonid CAIREAC

LCŞ „Sinergetica”

In this paper, the nonlinear dynamics of Bose-condensed phonons and millimeter electromagnetic field have been invest-tigated under the influence of external coherent electromagnetic radiation. The phases trajectories and time evolutions for different form of impulses were analyzed.

Introducere Actualmente, interacţiunea undelor electromagnetice milimetrice cu sistemele medico-biologice reprezintă,

incontestabil, una dintre cele mai importante şi interesante domenii ale electromagnitobiologiei moderne. În prezent este acumulat un numar impresionant de material expermental în acest domeniu, ceea ce conduce la concluzia că mecanismele acestei interacţiuni atât la nivel biomacromolecular, celular, cât şi al organismului în întregime poartă un caracter fundamental.

Deşi până în prezent nu au fost identificate mecanismele fizice ale interacţiunii undelor milimetrice de intensitate atermică cu obiectele biologice, se consideră că această interacţiune este un mecanism universal de transmitere a informaţiei între obiectele vii şi între celulele obiectului.

Până în prezent au fost lansate mai multe ipoteze referitor la mecanismele primare ale interacţiunii undelor milimetrice cu obiectele medico-biologice [1-19]. Deveatkov, bunăoară, consideră că undele milimetrice excită în celulele patologice cu generarea ulterioară a celulelor, a semnalelor de dirijare a proceselor de resta-bilire până la normal a celulelor [1].

Şcoala ucraineană condusă de Sitiko consideră că undele milimetrice sunt inerente tuturor obiectelor vii şi, din acest motiv, ele produc efecte terapeutice. Beţkii şi Lebedeva au presupus că ţinta primară pentru undele milimetrice nu este celula organismului viu, ci mediul apos al pielii periferice, ceea ce conduce la mărirea activităţii chimice a moleculelor de apă structurată a organismului [14,15].

Printre celelalte ipoteze vom menţiona mecanismul corelaţional de activare a câmpurilor electromagnetice formate de celulele proprii ale organismului sub acţiunea câmpului extern [9], ipoteza bioenergetică [12,13] şi al.

Deşi, după cum am menţionat mai sus, problema înţelegerii mecanismelor de interacţiune a undelor electro-magnetice milimetrice rămâne una deschisă, experimental s-au stabilit următoarele legităţi distincte:

1. Caracterul de rezonanţă al dependenţei efectului biologic de lungimea de undă (frecventă). 2. Efectul biologic al acţiunii apare la un anumit prag al intensităţii câmpului electromagnetic milimetric. 3. Efectul biologic al acţiunii este invariant la alternarea intensităţii radiaţiei în limite largi, adesea de câteva

ordine. 4. Există un prag temporar: după apariţia efectului biologic expunerea obiectului radiaţiei nu duce la varia-

ţia acestuia. 5. Efectul radiaţiei depinde de starea iniţială a organizmelor vii supuse radiaţiei. Actualmente, radiaţia milimetrică se utilizează pe larg în medicină atât la diagnosticarea, cât şi la tratarea

diverselor maladii [1,2,20-30]. Deşi rezultatele acţiunii radiaţiei milimetrice asupra sistemelor medico-biologice sunt impresionante, trebuie

de menţionat că multe din fenomenele şi particularităţile ce au loc până în prezent nu au o explicaţie bine fundamentată. De aceea, studierea interacţiunii undelor electromagnetice de mică intensitate cu organismele vii necesită o studiere multidisciplinară, cu utilizarea celor mai noi rezultate din teoria sistemelor complexe neliniare, senergetică, biologia fizico-chimică şi moleculară etc.

Vom generaliza lucrarea [23]. În dezvoltarea acesteia s-au obţinut încă două soluţii exacte în formă de funcţii eliptice ale ecuaţiei diferenţiale neliniare ce descrie dinamica liberă a particulei, fiind demonstrată şi posibilitatea principală de apariţie a structurilor temporale la interacţiunea biomacromoleculelor cu radiaţia mili-metrică de diferită forma temporală.

Seria “tiin\e ale naturii” Fizic= ISSN 1857-1735

227

În continuare vom studia procesele ce au loc la inteacţiunea undelor milimetrice cu macromoleculele bio-logice sau biopolimerii. După cum este cunoscut, ultimii reprezintă nivelul specific primar biologic de orga-nizare a materiei vii. Macromoleculele acizilor nucleici sunt responsabile de păstrarea şi transmitrea informaţiei genetice, cataliza efectivă a reacţiilor biochimice, care constituie baza viabilităţii organismelor.

Una dintre particularităţile biopolimerilor constă în faptul că ele se află în anumite stări de izomerie con-formaţională. Conformaţia moleculelor biologice joacă un rol foarte important în funcţionarea acestora. Astfel, procesele de replicare, sinteza proteinelor este însoţită de tranzacţia unor părţi spirale duble ADN din starea fiziologic normală B în starea conformaţională A.

Tranzacţiile dintre diverse stări conformaţionale ale macromoleculelor biologice sunt separate de bariere energetice care, de regulă, sunt mult mai mari decât energia termică kT.

Prin urmare, se poate presupune că unul dintre mecanismele primare ale interacţiunii câmpului electromag-netic milimetric cu biomacromoleculele materiei vii constă în tranzacţia între diferite stări izomerice ale bio-moleculelor sub acţiunea undelor milimetrice.

Dinamica neliniară liberă a particulei în groapa potenţială cu două minimuri Energia câmpului electromagnetic milimetric este absorbită de biomacromolecule şi conduce la depăşirea

barierei ce disparte conformerii respectivi. Comutarea sub acţiunea radiaţiei milimetrice de la o stare iniţială conformaţională în alta este echivalentă cu mişcarea unei particule într-o groapă potenţială cu două minimuri, acestea din urmă fiind separate de o barieră (Fig.1).

Fig.1. Mişcarea particulei în groapa de potenţial cu două minimuri.

Forţa variabilă a câmpului electromagnetic milimetric acţionând asupra particulelor, care iniţial efectuau

oscilaţii în una dintre gropile potenţiale, conduce la mărirea energiei potenţiale a acesteia, după care, sub acţiu-nea fluxurilor termice, particula trece în altă groapă potenţială.

Este cunoscut că excitarea oscilatorului sub acţiunea forţei externe periodice are loc în condiţii de rezonanţă. Prin urmare, iniţial este necesar a determina frecvenţele de oscilaţie ale particulei în absenţa câmpului electro-magnetic extern.

În caz general, ecuaţia de mişcare a particulei sub acţiunea câmpului electromagnetic variabil şi a proceselor de atenuare are forma:

)()(22

2

teEdX

XdWdtdXm

dtXdm =++ λ , (1)

unde m este masa particulei, λ – coeficientul de atenuare, e – sarcina particulei

220

2

)1()(XXEXW −= . (2)

În continuare vom studia dinamica particulei sub acţiunea câmpului electromagnetic exterior de diferite forme. Pentru început, vom studia dinamica particulei sub acţiunea unui câmp monocromatic de amplitudine ε

şi frecvenţă ω

ttE ωε cos)( = . (3)



228

În acest caz, ecuaţia de mişcare a particulei în groapa potenţială cu două minimuri sub acţiunea câmpului electromagnetic milimetric extern şi luând în considerare posibilitatea reală de atenuare a mişcării are forma:

tmeX

mXEX

mXE

dtdX

dtXd ωελ cos442 3

40

20

2

2

=+−+ . (4)

În cele ce urmează este comod să trecem la mărimi adimensionale pentru coordonată şi timp, notând, respectiv:

0XXx = , tλτ = ,

τddxy = ,

λωτω == tz . (5)

Ecuaţia diferenţială ordinară de gradul doi sub acţiunea câmpului electromagnetic extern este echivalentă cu un sistem de trei ecuaţii diferenţiale neliniare de gradul întâi:

yddx

=τ

, zXm

eyxxXm

Eddy cos2)1(4

02

220

2 λε

λτ+−−= ,

λω

τ=

ddz

. (6)

Sistemul de ecuaţii diferenţiale descrie dinamica neliniară a mişcării particulei. Vom menţiona că în prezent nu există un algoritm standard de determinare a soluţiilor sistemelor de ecuaţii

diferenţiale neliniare în formă generală şi obţinerea lor în formă analitică este o problemă extrem de dificilă. În acest context a fost efectuat un experiment numeric.

Evoluţia soluţiilor sistemului de ecuaţii diferenţiale este determinată de evoluţia volumului spaţiului de fază. Considerând mişcarea punctelor în spaţiul de fază ca o mişcare a lichidului, obţinem:

2−=∂∂

+∂∂

+∂∂

zz

yy

xx &&&

. (7)

Drept rezultat, putem constata că orice volum elementar al spaţiului de fază tinde către zero când

∞→τ )2exp(0 τ−= VV . (8)

Aceasta însă nu înseamnă neapărat că orice element de volum al spaţiului de fază se contractă într-un punct. El poate să se răspândească pe o suprafaţă, astfel încât punctele oricărui element al spaţiului de fază să con-veargă către o submulţime, a cărei dimensiune este mai mică decât a spaţiului de fază iniţial. În acest caz, drept atractori în spaţiul de fază pot fi: ciclul limită, torul sau atractorul straniu. Aceştia corespund oscilaţiilor neliniare periodice, cvasiperiodice şi staţionare.

În Figura 2 sunt prezentate dependenţa de timp şi proecţia traiectoriei de fază pentru diferite valori ale

parametrilor 2 20

4EBm Xλ

= şi 0

2 XmeCλ

ε= .

a) b)


229

c) d)

Fig.2. Dependenţa în timp şi proiecţiile traiectoriilor de fază pentru valorile: a), b) λ =107; B=104; C=102; w=1012; c), d) λ =109; B=103; C=102; t→0÷1,5.

După cum observăm, la aceste valori ale parametrilor în sistemul studiat apar oscilaţii periodice neliniare, iar traiectoria de fază tinde către ciclul limită. În Figura 3 este prezentată evoluţia în timp a mişcării particulei.

Fig.3. Dependenţa în timp a mişcării particulei pentru valorile:

λ =109; B=104; C=103; w=1012; t→0÷1,5.

Se observă apariţia unei bifurcări a mişcării neliniare. În Figura 4 sunt prezentate evoluţia în timp a mişcării şi a proiecţiilor traectoriilor de fază.



230

Fig.4. Dependenţa în timp şi proiecţiile traiectoriilor de fază pentru: λ =109; B=105; C=103; w=1012; t→0÷1,5.

Se observă că peste un anumit timp are loc stabilizarea amplitudinei oscilaţiilor, iar traiectoria de fază tinde către atractorul clasic de tip focar.

În Figura 5 este prezentată evoluţia în timp a mişcării particulei pentru diferiţi parametri.

a) b)

c)

Fig.5. Evoluţia în timp a mişcării particulei pentru: a) λ =107; B=107; C=102; w=1012; b), c) λ =107; B=107; C=103; w=1012; t→0÷1,5


231

După cum observăm, dinamica neliniară şi proiecţiile traiectoriei de fază tind către atractorul straniu. Prin urmare, sub acţiunea câmpului electromagnetic monocromatic extern şi în prezenţa atenuării mişcării

în sistemul studiat pentru anumite valori ale parametrilor poate apărea haosul dinamic. Acesta este un rezultat principial sau, spre deosebire de mişcarea liberă a particulei, unde oscilaţiile sunt regulate şi periodic neliniare sau în formă de soliton.

În continuare vom studia dinamica particulei sub acţiunea unui impuls de formă dreptunghiulară cu lun-gimea temporală T. În acest caz, intensitatea câmpului electromagnetic are forma:

)](1[0 TtEE −−= θ , (9) unde: 1)( =− Ttθ pentru Tt > 0)( =− Ttθ pentru Tt < .

Forma impulsului (9) este reprezentată de Figura 6 .

Fig.6. Forma impulsului dreptunghiular de durată T.

În acest caz, ecuaţia de mişcare a particulei sub acţiunea câmpului electromagnetic milimetric dreptun-ghiular de durata T are forma:

)](1[442 0340

20

2

2

Ttm

eEX

mXEX

mXE

dtdX

dtXd

−−=+−+ θλ . (10)

Aceasta reprezintă o ecuaţie neliniară de gradul II, soluţia analitică fiind foarte greu de găsit sau chiar impo-sibil, cauza fiind că până în prezent nu au fost elaborate algoritmele de rezolvare a ecuaţiilor diferenţiale neli-niare. În continuare am efectuat o simulare numerică a ecuaţiei (10), elaborând un program special de soluţioare a ecuaţiei.

În Figura 7 este reprezentată dinamica neliniară a particulei pentru diferite valori ale parametrilor

20

4mX

E=α , 4

0

4mX

E=β şi

meE0=γ .

2 4 6 8 10t

0.91

1.11.21.31.41.5

x

Fig.7. Dependenţa mişcării particulei pentru valorile λ=0,5, α=1,3, β=5, γ=5, T=10.

După cum observăm, particula efectuează oscilaţii neliniare, a căror amplitudine se micşorează stabilizându-se la o anumită valoare. Oscilaţiile au loc în ramura din dreapta a funcţiei potenţiale. Pentru valorile t>T parti-cular trece în ramura stângă a gropii potenţiale stabilizându-se în vecinătatea punctului 0x = -0,5 (Fig.8).

1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9



232

10 20 30 40t

- 0.5

0

0.5

1

1.5x

Fig.8. Dependenţa mişcării particulei pentru t>T.

În Figura 9 este prezentată evoluţia în timp a particulei cu condiţiile modificate. După cum se observă, caracterul mişcării rămâne acelaşi.

2 4 6 8 10t

1.06

1.08

1.12

1.14x

10 20 30 40t

- 0.5- 0.25

0.250.5

0.751

x

a) b)

Fig.9. Dependenţa mişcării particulei pentru valorile: λ=0,5, α=1,3, β=5, γ=5, T=10; a) x[0]=1, x[0]=0; b) x[0]=1, x[0]=1.

Cu mărirea atenuării λ se observă o schimbare a caracterului evoluţiei mişcării particulei. După cum se observă din Figura 10, caracterul oscilator al mişcării neliniare dispare:

2 4 6 8 10t

1.031.041.051.061.071.08

x

10 20 30 40t

0.20.40.60.8

1x

a) b)

Fig.10. Dependenţa mişcării particulei pentru valorile: λ=5, α=1,3, β=5, γ=5, T=10: a) x[0]=0,x[0]=0, b) x[0]=0,x[0]=1.

În sfârşit, în cele ce urmează vom analiza cazul când forma undei electromagnetice este de tip

)][exp(0nTtEE

τ−

−= după cum e reprezentat în Figura11.

1 2 3 4 5t

0.20.40.60.8

11.21.4

E

Fig.11.

1,5

1

0,5

0

-0,5

1,14

1,12

1,08

1,06

10,75

0,50,25

-0,25-0,5

1,081,071,061,051,041,03

10,8

0,6

0,4

0,2

1,41,2

10,80,60,40,2


233

Ecuaţia de mişcare a particulei în acest caz are forma:

)][exp(442 0340

20

2

2nTt

meE

XmX

EXmX

EdtdX

dtXd

τλ −

−=+−+ . (11)

În Figura 12 este reprezentată dinamica particulei sub acţiunea unui impuls exponenţial pentru diverse valori ale amplitudinii câmpului exterior:

2 4 6 8 10t

0.250.5

0.751

1.251.5

x

2 4 6 8 10t

0.250.5

0.751

1.251.5

1.75x

2 4 6 8 10t

0.51

1.52

2.5x

a) b) c)

Fig.12. Dinamica mişcării particulei pentru valorile: λ=0,5, α=15, β=9, T=10, n=1, τ=1, x[0]=0, x[0]=0; a) γ=0,5, b) γ=20, c) γ=100.

După cum observăm, odată cu creşterea amplitudinii câmpului exterior are loc creşterea neliniară a ampli-tudinii oscilaţiilor particulei în groapa potenţială.

În Figura 13 sunt determinate evoluţiile în timp ale particulei în groapa potenţială pentru diferite valori ale mărimii atenuării mişcării:

2 4 6 8 10t

0.250.5

0.751

1.251.5

1.75x

2 4 6 8 10t

0.250.5

0.751

1.251.5

x

2 4 6 8 10t

0.0050.01

0.0150.02

x

a) b) c)

Fig.13. Dinamica mişcării particulei pentru valorile: γ=0,5, α=15, β=9, T=10, n=1, τ=1, x[0]=0: x[0]=0, a) λ=0,1, b) λ=1, c) λ=10.

Aşadar, odată cu creşterea valorii atenuării dispare caracterul oscilator al mişcării. Prin urmare, în dependenţă de formele impulsurilor exterioare, dinamica neliniară a particulei în groapa potenţială (Fig.1) este diferită. O problemă aparte care trebuie studiată este determinarea frecvenţelor de oscilaţie, dependenţa acestora de parametrii sistemului, precum şi studierea stabilităţii mişcărilor oscilatorii.

Referinţe:

1. Девятков Н.Д., Бецкий О.В., Голант М.Б. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности // Радио и связь, 1991.

2. Голант М.Б. Биофизика // 1989. - T.34. - C.339. 3. Fröhlich H. // Phys. Lett. - 1968. - A26. - P.402. 4. Fröhlich H. // Inst. Quantum Chem. - 1968. - Vol.2. - P.641. 5. Fröhlich H. // Nature. - 1970. - Vol.228. - P.1093. 6. Fröhlich H. // Phys. Lett. - 1972. - A39. - P.153. 7. Fröhlich H. // Soviet Phys. Biofiz. - 1977. - Vol.23. - P.743. 8. Fröhlich H. // Adv. In Electronics and Electron Physics. – 1980. - Vol.53. - P.85. 9. Чернавский Д.С., Хургин Ю.Н., Шноль С.Э. О кооперативных (когерентных) явлениях в биологических

макромолекулах (концепции «когерентного возбуждения» и «белок – машина») // Препринт. - 1986. - Т.185.

1,751,5

1,251

0,750,5

0,25

2,5

2

1,5

10,5

1,751,5

1,251

0,750,5

0,25

1,51,25

10,75

0,50,25

0,02

0,015

0,01

0,005

1,51,25

10,75

0,50,25



234

10. Davydov A.S. Kislukha N.I. // Phys. Status Solidi. - 1976. - B.75. - P.735. 11. Давыдов А.С. Биология и квантовая механика. - Киев: Наукова думка, 1979. 12. Ситько С.П., Мкртчан Л.Н. Введение в квантовую медицину. - Киев: Паттерн, 1994. 13. Sitko S. // Physics of the Alive. - 1998. - Vol.6. - No1. 14. Deviatkov N.D., Betskii O.V. Biological Aspects of Low Intensity Millimeter Waves. - Moscow, 1994. 15. Бецкий О.В., Лебедева Н.Н. // http:www.uniphys.ru/journal/No4-01/mainarticle/ main.htm. 16. Хургин Ю.И., Кудряшова В.А., Завизион В.А. Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения //

ИРЭ АН СССР. - 1987. - C.246. 17. Петросян В.Н. и др. Биомедицинская радиоэлектроника. - 2001. - 5-6. - С.63. 18. Чукова Ю.П. Миллиметровые волны в биологии и медицине. - 1996. - 7. - C.5. 19. Чукова Ю.П. Эффекты слабых взаимодействий. - Москва, 2002. 20. Rotaru A., Bucun N., Donica T., Trifan A. Acţiunea undelor milimetrice asupra sistemelor medico-biologice // Rezumate

ale Conferinţei corpului didactico-ştiinţific al USM. - Chişinău, 1998, p.171. 21. Rotaru A., Donica T., Gereghi T., Zolotovschi V., Trifan A. Autoorganizarea structurilor temporare şi spaţiale la

interacţiunea câmpului de radiaţie milimetric cu sistemele vii // Rezumate ale Conferinţei corpului didactico-ştiinţific al USM. - Chişinău, 1998, p.172.

22. Rotaru A. Teoria interacţiunii câmpului electromagnetic coerent cu mediile biologice. // Materialele Colocviului Internaţional de Fizică „EVRICA”. - Chişinău, 2002, p.16.

23. Rotaru A., Ciobanu N. Teoria semiclasică a interacţiunii microundelor de intensitate atermică cu sistemele biologice // Materialele Colocviului Internaţional de Fizică „EVRICA”. - Chişinău, 2002, p.44.

24. Rotaru A. Coherent electromagnetic field interaction with Biological media // 12th National Conference of the Romanian Physical Society „Trends in Physics”. - Târgu Mureş, 2002, p.94.

25. Rotaru A., Ciobanu N., Ghitu D., Nica Iu. A new model of the microwave Interaction with biological systems // 12th National Conference of the Romanian Physical Society „Trends in Physics”. - Târgu Mureş, 2002, p.97.

26. Betskii O.V., Gitsu D.V., Parhomenko V.F., Rotaru A.H. Water in process of the interactions of electromagnetic millimeter waves with living organism // The second International Conference of Ecological Chemistry. Abstract. - Chisinau, 2002, p.300.

27. Betskii O.V., Ghitsu D.V., Nica Iu., Rotaru A., Saulea A. Efecte medico-biologice ale interacţiunii undelor milimetrice cu mediile vii // Analele Ştiinţifice ale USM. - Chişinău, 2003, p.158.

28. Betskii O.V., Ghistu D.V., Groppa S., Roratu A., Rotaru D., Tâbârnă Gh. Utilizarea undelor milimetrice de intensitate atermică în medicină // Analele Ştiinţifice ale USM. - Chişinău, 2003, p.164

29. Гицу Д.В., Пархоменко В.Ф., Ротару А.Х. Фундаментальные и прикладные исследования взаимодействия электромагнитных волн КВЧ с медико-биологическими объектами // 13 Russian symposium with Participation of Foreign Scientists Millimeter waves in medicine and biology. Digest of Papers, - Moscow, 2003, p.115.

30. Betskii O.V., Ghistu D.V., Rotaru A.H., Ciobanu N.V. Тhe nonlinear dielectric permittivity during extraction of coherent phonons in biological objects // 13 Russian symposium with Participation of Foreign Scientists Millimeter waves in medicine and biology. Digest of Papers. - Moscow, 2003, p.118.



235

ГАЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СТРУКТУРЫ

СЛОЙ ХАЛЬКОГЕНИДНОГО СТЕКЛА – МЕТАЛЛ

Евгений ПОКАТИЛОВ, Денис НИКА, Надежда ЗИНЧЕНКО, Артур АСКЕРОВ, Игорь ДЕМЕНТЬЕВ, Сергей ДМИТРИЕВ, Татьяна ГОГЛИДЗЕ

Лаборатория физики многослойных структур и молекулярного магнетизма În articolul de faţă este elaborată teoria sensibilităţii gazoase a straturilor subţiri din sticlă halcogenidă. Au fost obţinute

şi detaliat cercetate dependenţele sensibilităţii gazoase de grosimea şi parametrii straturilor halcogenide. S-a demonstrat că sensibilitatea gazoasă creşte cu micşorarea concentraţiei purtătorilor de sarcină, a permeabilităţii dielectrice şi, de ase-menea, a grosimii stratului.

The theory of the gas sensitivity properties of the chalcogenide glass semiconductor thin film was developed in the

given paper. The dependences of the gas sensitivity on the thickness and material parameters of chalcogenide films were obtained and investigated in details. It was shown that the gas sensitivity increases with the decreasing of film thickness, charge carrier concentration and material dielectric constant.

Развитие мировой промышленности и энергетики, бурный рост мирового автопарка, возрастающая

угроза терроризма настоятельно требуют разработки и внедрения новых систем контроля за состоянием окружающего воздуха. B настоящее время резко возросла потребность в простых, надёжных и дешёвых, как при производстве, так и в эксплуатации (малоэнергоемких), газовых датчиках. В этой связи необыкновенно широкие возможности предоставляет нанотехнология, интенсивно стало развиваться наноразмерное направление газовой сенсорики [1-3]. Экспериментально установлено, что адсорбция газовых молекул на поверхности халькогенидной плёнки влияет на её электрические, оптические или другие свойства [4-5]. Эти молекулы могут действовать как доноры, отдавая элементарный заряд объёму полупроводника и приобретая при этом заряд противоположного знака, или как акцепторы, захватывая заряд из объёма полупроводника, заряжая при этом поверхность и обедняя объём полупро-водника носителями заряда. Пока не удалось точно установить, какой из этих механизмов имеет место на практике. В зависимости от выбора халькогенида и состояния его поверхности может реализовы-ваться любой из описанных вариантов.

Теоретическая модель газового датчика на базе структуры халькогенидное стекло – полупро-

водник (ХСП) Для определённости, в данном случае предположим, что нейтральная молекула, осевшая на поверх-

ности плёнки, захватывает дырку из объёма полупроводника и заряжается положительно. В результате на поверхности плёнки возникает положительный заряд с плотностью Q=eNs, где Q –заряд на единицу поверхности плёнки, e – абсолютная величина заряда электрона, Ns – число активных газовых молекул, осевших на единицу поверхности раздела газ - ХСП.

Мы не будем рассматривать механизм прилипания газовой молекулы к поверхности (химическое сродство с поверхностью), так как эта проблема выходит за рамки поставленных в данном исследо-вании вопросов. Считается, что сродство достаточно велико, больше kBT, так что при рассматриваемых температурах молекулы не испаряются с поверхности. Заметим также, что удержанию заряженных молекул на поверхности способствует образующийся объёмный заряд противоположного знака. На противоположную сторону полупроводниковой плёнки наносится заземлённый электрод. В халькоге-нидных стёклах отрицательные объёмные заряды в токах не проявляются [6-7], поэтому в наших дальнейших расчётах будем считать дырки основными носителями тока.

Опишем схему работы рассматриваемой системы в роли газового датчика. Адсорбированные на поверхности полупроводника (п/п) молекулы газа с плотностью Ns извлекают из слоя п/п такое же количество свободных зарядов. В результате плотность объёмных носителей заряда уменьшается, а электрическое сопротивление слоя в направлении, параллельном поверхности, возрастает. Этот эффект



236

тем сильнее, чем выше плотность поверхностных зарядов и чем ниже равновесная плотность носителей в объёме Np.

Определим чувствительность рассматриваемого газового датчика, как отношение

0

g

ISI

= , (1)

где сила тока до адсорбции газовых молекул

00 0

0

d

y p y pI L j dz e E L N dµ= =∫ , (2)

а сила тока после адсорбции

0

0 0

( )( ) [ ]d d

g y g p y pБ

V zI L j z dz e E L N Exp dzk T

µ= = −∫ ∫ . (3)

В формулах (2-3) d – толщина плёнки, Ly – характеристическая длина плёнки вдоль оси Y, E – напряжённость электрического поля, 0

pN – равновесная концентрация дырок до абсорбции газовых молекул. В (3) интеграл берётся от вычисленной по Больцману плотности носителей с потенциальной энергией V(z) внутри слоя п/п. Подставляя (2-3) в (1), получаем:

0

.( ( ) / )

d

B

dSExp V z k T dz

=−∫

(4)

Принятая в работе система координат показана на рис. 1. Как следует из формулы (4), задача заключается в нахождении распределения потенциала V(z) внутри слоя п/п. Потенциал находится из решения системы уравнений Пуассона с граничными условиями для трёх областей: (I) области, заполненной газом (над поверхностью п/п), (II) области внутри п/п и (III) области под электродом.

Рис. 1. Схематическое изображение рассматриваемой структуры.


237

Объёмная плотность зарядов имеется только в объёме п/п, поэтому для указанных трёх областей уравнения Пуассона приобретают вид:

(I) 2 ( )

2 0Id V

dz= , (5)

(II) ( )02 ( )

20

(1 )B

V zIp k TeNd V e

dz ε ε

−

= − − , (6)

(III) 2 ( )

2 0IIId V

dz= . (7)

Для границы п/п-газ, с учётом заряда на поверхности п/п, максвелловское граничное условие запи-сывается в виде (см. рис. 1):

0 0z zD D Q+ −− = , (8) 0 ,zD Eε ε= (9)

где z+0 означает координату z под поверхностью п/п в области (II), z-0 означает координату z над поверхностью п/п в области (I). Электрическое поле в области (I) равно 0, поэтому

0 0,zD − = (10 a) 0 ( 0) ,z zD D z Q+ = = = (10 b)

0 0 .zdVD Edz

ε ε ε ε= = − (11)

На нижней стороне п/п слоя с заземлённым электродом

( ) 0V d = . (12)

Уравнение (6) с граничными условиями (10 a-b) и (12), используя метод конечных разностей, заме-нялось системой линейных неоднородных уравнений. Полученная система уравнений решалась чис-ленно методом итераций. Для достижения допустимой точности решения (когда невязка для каждого уравнения < 10-6) требовалось порядка 1 000 000 итераций.

Обсуждение полученных результатов

Рис. 2. Зависимость потенциальной энергии дырки от координаты z для различных материальных параметров системы.



238

Графики рис. 2 отражают зависимость потенциальной энергии дырки от заряда Q для различных значений параметров системы. Из рассмотрения этих графиков следует: (1) при увеличении плотности поверхностного заряда Q (и фиксированных остальных параметрах) потенциальная энергия дырки возрастает (кривая 1 (Ns=6×1011 cm-2) и кривая 3 (Ns=5×1011 cm-2)); (2) увеличение равновесной плотности дырок Np ведёт к понижению кривой V(z) (кривые 2 ( 0

pN =9×1015 cm-3) и 3

( 0pN =1016 cm-3)); (3) увеличение диэлектрической проницаемости п/п сдвигает вниз кривую V(z)

(кривые 3 (ε=4) и 4(ε=10)).

Для повышения чувствительности датчика необходимо увеличивать потенциальную энергию дырок в п/п, так как при этом электрическое поле создаёт широкую область с низкой концентрацией носителей. Знаменатель в формуле (4) уменьшается, и чувствительность возрастает. Графики рис. 3 показывают, как уменьшается ширина проводящего участка п/п с уменьшением диэлектрической проницаемости от 2 до 10.

Опишем далее полученные с использованием вычисленных функций V(z) и Np(z) зависимости чувствительности от толщины п/п слоя при различных значениях параметров системы.

На рис. 4 приведены кривые S(d) для различных значений равновесных концентраций дырок 0pN .

Величины других параметров указаны на рис. 4. Характерной особенностью функции 0( , )pS d N явля-

ются максимумы, появляющиеся при всех рассмотренных значениях 0pN . Положение максимума можно

приблизительно определить по формуле max 0s

p

NdN

= , следующей из условия равенства поверхностного

sN и экранированного 0pN d зарядов. Увеличение 0

pN уменьшает чувствительность, так как при этом уменьшается область высокого сопротивления. Важно отметить, что высокие чувствительности могут быть получены на достаточно толстых образцах ~ 500 nm, при условии низких равновесных концен-траций дырок.

Рис.3. Зависимость отношения концентраций дырок в случае адсорбированных молекул газа к концентрации дырок в системе без газа.


239

На рис. 5 отображена зависимость ( , )sS d N . Положение максимумов на этих кривых также опре-

деляется указанной выше формулой. Рост поверхностного заряда при фиксированном d ведёт к увели-чению чувствительности. С ростом d возрастает числитель в формуле (4), а знаменатель при малых d существенно не меняется. Это обусловливает начальный рост S(d). С дальнейшим увеличением d, когда число экранирующих зарядов 0

pN d становится больше числа поверхностных sN , чувствитель-ность уменьшается. Чем больше поверхностный заряд, тем при больших значениях d достигается Smax и тем больше величина максимальной чувствительности.

Рис. 4. Зависимость газовой чувствительности от толщины плёнки.

Рис. 5. Зависимость газовой чувствительности от толщины плёнки для разных поверхностных концентраций молекул газа.

Рис. 6. Зависимость газовой чувстви-тельности от толщины плёнки для различных температур.



240

Температурная зависимость чувствительности показана на рис. 6. При прочих равных условиях повышение температуры понижает чувствительность в соответствии с ростом ширины проводящего участка в плёнке (см. рис. 1.).

В рассматриваемой модели важную роль играет диэлектрическая проницаемость. Рост ε при заданном поверхностном заряде уменьшает величину электрического поля в плёнке (в соответствии с

формулами (10 а) и (11): 0

(0) QEε ε

= ), которое создаёт обеднённый участок в канале (см. рис. 1),

поэтому с увеличением ε чувствительность падает, что проиллюстрировано на рис. 7.

Выводы Нами детально описана модель полупроводникового газового датчика, основанного на способности

адсорбированных на поверхности полупроводника некоторого типа молекул газа захватывать носители тока из объёма п/п.

Возрастающее при этом сопротивление полупроводникового слоя может служить индикатором концентрации этих молекул в газовой среде. Показано, что особенностью рассматриваемой модели является возможность использовать достаточно большие толщины полупроводникового слоя. Расчёт показывает, что датчики рассматриваемого типа функционируют при комнатных температурах. Низкие значения диэлектрической проницаемости, свойственные халькогенидным стёклам, способствуют повышению чувствительности. Процесс экспериментального изучения описанного типа датчиков продолжается.

Литература

1. Cui Y., Wei Q.Q., Park H.K. and Lieber C.M. // Science. - 2001. - Vol. 293. - P. 1289. 2. Dmitriev S., Lilach Y., Button B., Moskovits M. // Nanotechnology. - 2007. - Vol. 18. - P. 055707. 3. Sysoev V., Button B., Wepsiec K., Dmitriev S. // Nano Letters. - 2006. - Vol. 6. - No. 8. - P. 1584-1588. 4. Kornev K.P., Korneva I.P. // Journal of Optoelectronics and Advanced Materials. - 2005. - Vol. 7. - No. 5. - P. 2359. 5. Tsiulyanu D. // Encyclopedia of Sensors. - 2006. - Vol. 2. - P. 113. 6. Popescu M., Andrieş A., Ciumaş V., Iovu M., Şutov S., Ţiuleanu D. Fizica structurilor calgogenice. - Bucureşti:

Editura Ştiinţifică, 1996. - 486 p. 7. Фельц А. Аморфные и стеклообразные неорганические твердые тела. - Москва: Мир, 1986. - 556 с. Работа выполнена при финансовой поддержке фонда CRDF (MOE2-2679), а также проектов РМ

06.408.036F и 06.408.044A.


Рис. 7. Зависимость газовой чувствитель-ности от толщины плёнки для различных значений диэлектрической проницаемости.


Fizică ISSN 1857-1735

241

OBŢINEREA STRUCTURILOR n+SnO2/nSi

ŞI CERCETAREA PROPRIETĂŢILOR ACESTORA

Eugenia BOBEICO*, Leonid BRUC, Mihail CARAMAN, Andrei COVAL, Vladimir FEDOROV, Alexei SIMAŞCHEVICI*, Dormidont ŞERBAN*, Iurie USATÎI

Laboratorul Fizica Semiconductorilor *Institutul de Fizică Aplicată al AŞM

By the method of pyrolitic spraying spirit solutions of chlorides of tin and antimony transparent (transmission ~ 85%)

and conductive (σ ~ 102 Ohm-1cm-1) layers of SnO2:Sb were obtained. By using these layers izotype SIS structures In/n+SnO2:Sb/SiO2/nSi/Cu are produced. Their electrophysical properties are studied. The energy diagram of heterostruc-ture n+SnO2:Sb/nSi is constructed and the mechanism of current transition is determined.

Conversia fotovoltaică contemporană a energiei solare este asigurată de dispozitivele în baza corpului solid [1]. Celulele solare respective în cea mai mare parte funcţionează datorită proceselor fizice ce au loc în joncţiunile p-n, obţinute în siliciu cristalin, policristalin sau în straturi de siliciu amorf. Generarea forţei electromotrice la absorbţia luminii din cauza separării purtătorilor de sarcină de neechilibru poate fi realizată nu numai cu ajutorul joncţiunilor p-n, dar şi în baza structurilor semiconductor-izolator-semiconductor (SIS), folosind pentru fabricarea lor materialele semiconductoare solare (Si, InP, GaAs, CdTe) şi oxizii conductivi şi transparenţi (TCO) [2-9]. Pentru formarea structurilor SIS cel mai frecvent se utilizează oxidul ITO, care prezintă amestecul oxizilor In2O3 şi SnO2 în proporţie de cca 10:1. Acest reprezentant al materialelor TCO posedă o conductivitate electrică metalică (103-104 Ohm-1cm-1) şi practic este absolut transparent (95%) pentru radiaţia solară ce se absoarbă în materialele semiconductoare nominalizate. Însă, în componenţa ITO se conţine în majoritate indiu – element chimic ale cărui zăcăminte nu sunt cu precizie determinate, din care cauză este destul de costisitor. În ultimul timp sunt efectuate încercări de înlocuire a straturilor subţiri ITO în structurile SIS cu straturile subţiri din SnO2, care sunt mai puţin costisitoare [10].

Din aceste considerente, obiectivele principale ale prezentei comunicări sunt: 1) elaborarea procedeului de obţinere a straturilor subţiri SnO2 şi a structurilor fotovoltaice în baza aces-

tora şi a Si cristalin; 2) studiul proprietăţilor electrice şi fotoelectrice ale structurilor obţinute. Straturile SnO2 au fost obţinute prin metoda pulverizării pirolitice. Instalaţia respectivă este descrisă în [9].

Procesul de pulverizare pentru depunerea şi doparea straturilor SnO2 cu Sb se descrie prin următoarele reacţii pirolitice:

SnCl4+O2=SnO2+2Cl2 (1)

4SbCl3 +3O2=2Sb2O3+6Cl2 (2)

Pentru obţinerea straturilor SnO2 au fost utilizate soluţiile SnCl4 (0,5М) în etanol şi, pentru dopare cu Sb, SbCl3 (0,1М) în etanol. În soluţia de bază SnCl4 (11 ml) se adaugă soluţia SbCl3 (până la 2 ml) şi acest amestec se pulverizează timp de 60-80 sec. la temperatura de 450оС pe substraturi de sticlă, cuarţ, safir şi siliciu în formă de plachete cristaline cu diferite concentraţii ale purtătorilor de sarcină. Suprafaţa maximală a substraturilor a fost de 78,5 cm2.

Structura şi componenţa straturilor SnO2 nedopate şi dopate cu Sb au fost cercetate în Centrul Naţional de Testare a Materialelor cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj şi al analizei microstructurale cu raze X. După cum se vede din Figura 1, straturile SnO2 sunt microcristaline. Grosimea lor (p) este de 0,3-0,4 µm, iar diametrul cristalitelor (d) este de cca 100 nm.



242

Fig.1. Imaginea suprafeţei stratului SnO2 în SEM.

Fig.2. Componenţa straturilor SnO2, obţinute pe diverse suporturi: a) – sticlă; b) – cuarţ; c) – safir.

Rezultatele studiului componenţei chimice a straturilor SnO2 sunt prezentate în Figura 2. Se observă că în

rezultatul dopării, indiferent de substrat, atomii de Sb sunt prezenţi în componenţa tuturor straturilor. În Figura 3 sunt prezentate distribuţiile spectrale ale transparenţei straturilor subţiri SnO2, depuse pe suporturi

din cuarţ şi safir. Transparenţa optică în domeniul vizibil al spectrului solar al straturilor depuse variază de la 85% la 54% în cazul nivelului maximal de dopare.

Creşterea lină a transparenţei straturilor SnO2 cu creşterea numărului de undă demonstrează, spre confir-marea celor menţionate mai sus, că structura acestor straturi conţine cristalite de dimensiuni micrometrice. Marginea benzii de transparenţă din partea undelor scurte se află în regiunea 4,96 eV şi nu depinde de natura substratului pe care a fost depus stratul SnO2.

Fig.3. Spectrele de transmisie a straturilor SnO2 depuse pe cuarţ (1) şi safir (2).

a) b) c)



243

Transparenţa mai mică a straturilor depuse pe safir poate fi determinată de valorile mai mari ale indicelui de reflexie la interfeţele SnO2-Al2O3 şi Al2O3-aer decât în cazul interfeţelor SnO2-cuarţ şi cuarţ-aer. Indicele de refracţie n al cuarţului în această regiune a spectrului este egal cu 1,46, pe când pentru safir n = 1,75. Prin aceasta se explică şi diferenţa în intensitatea benzilor de interferenţă în regiunea transparenţei înalte a acestor straturi (λ>0,36 µm). Aceste spectre au permis determinarea grosimii straturilor subţiri SnO2, egală cu valorile determinate prin SEM, şi a lărgimii energetice a benzii interzise a SnO2, care s-a dovedit a fi de 4,7 eV.

Prin metodele pulverizării pirolitice a soluţiei clorurilor de staniu şi de stibiu în etanol cu compoziţia pe suprafaţa plachetelor cristaline de siliciu de conductibilitate prin electroni, evaporării în vid a cuprului pe partea opusă a acestor cristale şi depunerii prin aceeaşi metodă a grilei de contact din indiu pe stratul SnO2:Sb au fost obţinute structurile In/n+SnO2:Sb/SiO2/nSi/Cu, prezentate în Figura 4.

Fig.4. Imaginea schematică a structurii In/n+SnO2:Sb/SiO2/nSi/Cu.

În structurile obţinute parametrii electrici ai straturilor SnO2:Sb erau următorii: concentraţia electronilor

1,4·1020 сm-3, mobilitatea ~9,2 сm2/V.s, ce asigură conductibilitatea electrică a straturilor de 2·102 Ohm-1 сm-1. Informaţia despre proprietăţile electrice ale structurilor In/n+SnO2:Sb/SiO2/nSi/Cu a fost obţinută prin efectu-

area măsurătorilor la întuneric a dependenţelor curent – tensiune (I–V) şi capacitate – tensiune (C-V) cu utilizarea calculatorului personal pentru înregistrarea şi prelucrarea automată a datelor experimentale.

În Figura 5 sunt prezentate dependenţele I–V în scară semilogaritmică în intervalul de temperaturi 77-400 K. Spre deosebire de joncţiunile p-n, o particularitate a acestor dependenţe constă în faptul că ele sunt paralele pentru 4-5 ordine ale curentului şi panta lor se modifică nesemnificativ la variaţia temperaturii. Abaterea de la această legitate se observă la temperaturi comparativ joase. Acest fapt, cât şi dependenţa slabă a curentului la întuneric de temperatură mărturiseşte că în structurile cercetate la aplicarea polarizării externe au loc proce-sele de tunelare, deşi nivelul de dopare a siliciului este prea mic (Nd~1015cm-3) pentru tunelări directe prin stratul de sarcină spaţială. Probabil, tunelarea electronilor din banda de conducţie a Si în banda de conducţie a SnO2 are loc cu participarea capcanelor din regiunea sărăcită de purtători de sarcină. Acest mecanism corespunde modelului Riben şi Feucht [11,12], care au luat în consideraţie tunelarea consecutivă printr-o scară de stări învecinate din stratul sărăcit.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.610-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

I (A

)

V (V)

T=77 K T=94 K T=130 K T=160 K T=206 K T=257 K T=295 K T=365 K T=400 K

Fig.5. Dependenţa I–V a structurii n+SnO2:Sb/nSi polarizate direct la diferite temperaturi.



244

Conform acestui model:

( )[ ]Dt VVAII −= exp' , (3)

unde:

21

38ln

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛==

∗

d

se

NSm

hdVIdA επ

; me* – masa efectivă a electronului; εs – permitivitatea siliciului;

S – variaţia relativă a energiei purtătorilor de sarcină pentru fiecare etapă a procesului de tunelare. Mărimea It΄ este proporţională densităţii capcanelor.

Dependenţa potenţialului de difuzie VD de temperatură este prezentată în Figura 6.

290 300 310 320 3300.4

0.5

0.6

0.7

0.8

V D (V

)

T (K)

Fig.6. Dependenţa potenţialului de difuzie VD a joncţiunii n+SnO2:Sb/nSi de temperatură.

Această dependenţă este liniară şi poate fi reprezentată prin formula:

TVVD α−= 0 , (4)

unde: V0 – valoarea potenţialului de difuzie la 0K; α – coeficientul de variaţie a potenţialului de difuzie cu temperatura. Valorile obţinute ale coeficientului α pentru probe diferite sunt aproximativ egale şi constituie 6·10-3 V/K. Despre dependenţa VD de grosimea stratului dielectric pentru structura SIS ITO-nSi s-a menţionat în [13]. Autorii acestei lucrări au stabilit că valoarea potenţialului de difuzie a acestei structuri se micşora odată cu creşterea timpului de oxidare a suprafeţei siliciului. Această reducere a VD odată cu creşterea grosimii stratului izolator în [13] se explică prin existenţa sarcinii pozitive în stratul dielectric. Deoarece potenţialul de difuzie VD, conform ecuaţiei (4), se micşorează odată cu creşterea temperaturii, expresia (3) poate fi transcrisă în forma:

( ) ( )BTAVII t expexp= , (5) unde A şi B – constante; prima nu depinde de temperatură, iar a doua – de tensiune. Conform expresiei (5), dependenţa ln I de temperatură la o polarizare constantă aplicată structurii trebuie

să fie liniară. Acest fapt este confirmat de rezultatele cercetărilor structurii SnO2/nSi reprezentate în Figura 7. Analizând dependenţele ln I = f(V) şi ln I = f(T), prezentate în Figura 6 şi în Figura 7, au fost determinate valorile numerice ale lui A şi B, care constituie, respectiv, 30 V-1 şi 0,03 K-1.



245

100 150 200 250 300 350 4001E-8

1E-7

1E-6

1E-5

1E-4

I (A

)

T (K)

V=0.2 V V=0.25 V V=0.3 V V=0.35 V

Fig.7. Dependenţele ln I=f(T) ale structurii n+SnO2:Sb/nSi

polarizate direct la diferite tensiuni de polarizare. Cunoscând valoarea coeficientului A s-a calculat mărimea 1/S (egală cu 11), al cărei sens fizic în modelul

lui Riben şi Feucht constă în numărul treptelor în procesul de tunelare a purtătorilor de sarcină pentru trecerea prin stratul de sarcină spaţială.

Astfel, caracteristicile curent-tensiune ale structurii SIS formate de SnO2 şi nSi demonstrează că în hetero-structurile izotipe n+SnO2/nSi trecerea curentului la aplicarea polarizării directe este determinată de un flux de electroni ce tunelează prin multiple trepte prin stratul de sarcină spaţială.

În Figua 8 sunt prezentate caracteristicile I–V ale structurii n+SnO2:Sb/nSi măsurate la întuneric la polari-zare indirectă în domeniul de temperaturi 77-400 K şi reprezentate în scară logaritmică. Observăm că curentul ce trece prin structura menţionată creşte simultan cu mărirea tensiunii electrice aplicate până la valoarea de 0,5 V după o funcţie de putere I~Vm, unde m este aproape de unitate.

Fig.8. Caracteristicile curent-tensiune ale joncţiunii izotipe n+SnO2:Sb/nSi

invers polarizate la diferite temperaturi în K: 1–370, 2–335, 3–290, 4–215, 5–77.

Cu majorarea în continuare a tensiunii indicele puterii m creşte şi devine egal cu 4-7, de unde rezultă schimbarea mecanismului de trecere a purtătorilor de sarcină. A fost presupusă tunelarea purtătorilor de sar-cină prin interfaţa structurii şi, atunci, conform [11,12], dependenţa curentului indirect de tensiune se exprimă în felul următor:

( ) ( )[ ]21exp −−−−= aDainv VVVCI α , (6)



246

unde: C şi α – constante, VD – potenţialul de difuzie, Va – potenţialul aplicat structurii la polarizare indi-rectă. După cum a fost notat în [14], dependenţa (6) poate avea forma funcţiei de putere.

Confirmarea corectitudinii acestei ipoteze despre mecanismul de trecere a curentului prin heterojoncţiunea

izotipă SnO2-nSi polarizată indirect este dependenţa ln [ ]( )21−−= aDinv VVfI liniară. Dependenţa C-2=f(V) pentru n+SnO2:Sb/nSi cu concentraţia purtătorilor de sarcină în semiconductorul de

bază ~1015cm-3 prezintă o linie dreaptă, confirmând caracterul abrupt al joncţiunii formate. Extrapolarea acestei curbe experimentale până la intersecţia cu axa tensiunilor determină valoarea potenţialului de difuzie de 0,6 V, mărime comparabilă cu 0,63 V determinată din dependenţa I–V la temperatura camerei. Lărgimea regiunii de sarcină spaţială a joncţiunii SnO2/Si în echilibru termodinamic, W, este egală cu 0,25 µm.

În Figura 9 este prezentată diagrama energetică a structurii izotipe n+SnO2/nSi în echilibru termodinamic. Majoritatea mărimilor fizice utilizate pentru construirea acestei diagrame au fost măsurate experimental, iar mărimile care nu au putut fi măsurate au fost luate din datele bibliografice.

Fig.9. Diagrama benzilor energetice ale structurii izotipe n+SnO2:Sb/nSi.

Trebuie menţionat rolul important al stratului dielectric la interfaţa structurilor SIS cercetate pentru for-

marea condiţiilor de injecţie a purtătorilor de sarcină. La polarizarea directă a structurii n+SnO2:Sb/nSi o parte din tensiunea aplicată va cădea pe volumul semiconductorului, iar o altă parte – pe stratul dielectric. Mărirea polarizării duce la micşorarea curburii benzilor energetice la suprafaţa siliciului şi la creşterea căderii de ten-siune pe stratul izolator. Sub influenţa acestei tensiuni are loc modificarea benzilor energetice ale dielectricului, astfel că la început se compensează curbarea acestor benzi datorată diferenţei de potenţial de contact, iar apoi are loc curbarea în direcţia inversă. Datorită acestui fapt, are loc mişcarea în întâmpinare a nivelului superior al benzii de valenţă Ev al Si şi a nivelului Fermi EF al stratului SnO2. Deci, poate apărea situaţia când nivelul Fermi EF în SnO2 şi nivelul superior al benzii de valenţă Ev, al semiconductorului de bază, se vor apropia la distanţa kT sau chiar se vor situa la acelaşi nivel energetic. Însă, în acest caz o injecţie intensivă a purtătorilor minoritari (golurilor) în nSi nu va avea loc, deoarece în n+SnO2, de unde golurile trebuie să se injecteze, golurile, de asemenea, sunt purtători de sarcină minoritari.

La aplicarea tensiunii indirecte, curentul (IpE) prin heterostructura izotipă n+-n este determinat de recom-binarea prin stările de suprafaţă ale purtătorilor de sarcină minoritari din banda de valenţă a nSi cu electronii din banda de conducţie a n+SnO2:Sb. Din cauza că acest flux este neglijabil de mic, curentul prin heterojonc-ţiunea izotipă nSi/SiO2/n+SnO2:Sb la tensiuni indirecte până la 0,5 V este determinat de curenţii de scurgere ce se caracterizează prin n = 1. Majorarea tensiunii indirecte, care cade atât pe semiconductor, cât şi pe stratul



247

izolator SiO2, aduce la restructurarea înclinării benzilor în dielectric [15]. Este posibilă situaţia când nivelul Fermi în SnO2 se va apropia la o distanţă energetică kT, sau chiar se va situa la acelaşi nivel energetic ca nivelul inferior al benzii de conducţie la suprafaţa siliciului. La crearea acestei situaţii mecanismul de trecere a curen-tului prin heterojoncţiunea nSi/SiO2/n+SnO2:Sb se va schimba din cauza pătrunderii tunel a electronilor din banda de conducţie n+SnO2 prin stratul izolator SiO2 în banda de conducţie nSi. Fluxul de electroni va fi con-siderabil, deoarece este un flux de purtători de sarcină majoritari (InD). Ca rezultat, curentul prin structură cer-cetată va creşte semnificativ.

Regiunea spectrală a fotosensibilităţii heterostructurii este limitată de lungimea de undă prag a materialului de bază şi de lungimea de undă la care începe recombinarea intensă de suprafaţă în materialul frontal al joncţiunii.

În Figura 10 este reprezentată distribuţia spectrală a fotosensibilităţii structurilor SnO2/nSi cu concentraţia purtătorilor în semiconductorul de bază ~1015cm-3.

Fig.10. Distribuţia spectrală a fotosensibilităţii structurilor izotipe SnO2-nSi. Din figură se observă că regiunea sensibilităţii probei cercetate cuprinde regiunea spectrală 0,35-1,15 µm,

adică toată regiunea vizibilă a spectrului radiaţiei solare. Iluminarea probei s-a efectuat din partea materialului structurii cu bandă largă, deci, din partea semiconductorului frontal SnO2:Sb. Pentru fotonii cu energia apropiată de lărgimea energetică a benzii interzise a siliciului semiconductorul frontal este transparent, de aceea radiaţia trece neabsorbită stratul SnO2:Sb şi ajunge până la siliciu (efectul de fereastră). La energiile fotonilor, ce sunt suficiente pentru realizarea tranziţiilor directe, în semiconductorul de bază creşte absorbţia radiaţiei, generarea şi separarea perechilor electron-gol şi, deci, creşte fotosensibilitatea. În intervalul energiilor 1,2-3,1 eV (0,4-1,05 µm) structura cercetată SnO2/nSi posedă o sensibilitate maximală. Absorbţia fotonilor ce posedă energia >3,3 eV are loc, preponderent, în stratul superficial al semiconductorului frontal SnO2:Sb. Perechile generate electron-gol recombină aici neparticipând în fotocurent, dar îl susţin indirect. La recombi-narea electronilor şi golurilor pot apărea fotoni cu energie mai mică pentru care coeficientul de absorbţie în acest material este mai mic. O parte din aceşti fotoni poate ajunge până la regiunea de separare şi, ca rezultat, să genereze perechile electron-gol şi să aducă aportul lor în fotosensibilitate. În Figura 10 se observă, de ase-menea, că fotosensibilitatea structurilor cercetate în regiunea lungimilor de undă scurte este mai mică decât în cea din regiunea lungimilor de undă lungi.

Forma caracteristicilor spectrale ale fotosensibilităţii structurilor n+SnO2:Sb/nSi depinde de parametrii componentelor ce formează structura, de grosimea stratului dielectric la interfaţa semiconductorului frontal şi a celui de bază şi de temperatura mediului ambiant.

0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 λ



248

Rezultatele obţinute permit formularea următoarelor concluzii: 1. Prin metoda pulverizării pirolitice a soluţiei clorurilor de staniu şi stibiu în etanol la temperatura de

450oC au fost obţinute straturi subţiri (0,3–0,4 µm) SnO2:Sb cu Eg = 4,7 eV de conductivitate electrică 2·102 Ohm-1 cm-1 şi transparenţă ce variază de la 85% la 54%, în dependenţă de creşterea nivelului de dopare.

2. Utilizând metoda nominalizată, prin depunerea straturilor subţiri SnO2:Sb pe plachetele de siliciu cu diametrul 100 mm, preventiv tratate chimic, au fost preparate structurile izotipe SIS In/n+SnO2:Sb/SiO2/nSi/Cu.

3. Studiul proprietăţilor electrice a demonstrat că structurile obţinute sunt abrupte, potenţialul de difuzie este de 0,6 V, al cărui coeficient de variaţie cu temperatura este de cca 10-3 VK-1.

4. Trecerea curentului prin structurile izotipe n+SnO2:Sb/nSi polarizate direct este determinată de fluxul de electroni din banda de conducţie a siliciului, care prin multiple trepte de tunelare prin stratul de sarcină spaţială şi stratul izolator SiO2 pătrund în banda de conducţie a n+SnO2.

5. Dependenţa curent-tensiune a obiectului de studiu, polarizat indirect, la aplicarea tensiunilor electrice mici (până la 0,5 V) demonstrează prezenţa curenţilor de scurgere ce indică funcţia de putere a dependenţei. Majorarea tensiunii aplicate conduce la restructurarea benzilor energetice ale structurii n+SnO2:Sb/nSi şi la pătrunderea tunel a electronilor din banda de conducţie n+SnO2:Sb prin stratul SiO2 în banda de conducţie nSi. Fluxul de electroni este considerabil, deoarece este un flux de purtători de sarcină majoritari.

6. Structurile izotipe n+SnO2:Sb/nSi sunt fotosensibile. Regiunea sensibilităţii acoperă intervalul lungi-milor de undă 0,35-1,15 µm.

Referinţe:

1. Simaşchevici A., Gorceac L., Serban D. Conversia fotovoltaică a energiei solare. - Chişinău: CE USM, 2002. - 249 p. 2. Shewchun J., Dubow G., Myszkowsky A., Singh R. The operation of the semiconductor-insulator-semiconductor

(SIS) solar cells: Theory. // J. Appl. Phys. - 1978. - Vol.49. - No9. - P.855-864. 3. Shewchun J., Dubow G., Wilmsen C., Singh R., Bark D., Wager J. The operation of the semiconductor-insulator-

semiconductor (SIS) solar cells: Experiment // J. Appl. Phys. - 1979. - Vol.50, - No9. - P.2832. 4. Adeeb N., Kretsu I., Sherban D., Sushkevich V., Simashkevich A. Spray deposited ITO-CdTe solar cells // Sol. Energy

Mater. - 1987. - Vol.15. - No1. - P.9-19. 5. Gagara L., Gorcheac L., Simashkevich A., Radu C., Radu S., Sherban D. Photovoltaic converters of solar energy on

the base of SIS structures // Proceedings of the Int. Conf. „Euro-Sun 96”. München. - 1996. - Vol.2. - P.665-669. 6. Simashkevich A., Do Quoc Hung, Bobeico E., Gorcheac L., Sherban D. Solar cells based on SIS structures // Proc.

of the 3rd Int. Workshop on Material Science. Hanoi. - 1999. - Part 1. - P.56-59. 7. Simashkevich A., Sherban D., Bobeico E. Spray deposited SiO2-Si solar cells // Balcan Phys. Letters (supll.). - 1998. -

No4. - P.21-15. 8. Andronic I., Simashkevich A., Gagara L., Gorceac L., Potlog T., Sherban D. InP based radiation stable solar cells //

Proc of the 2nd World Conf. on PV Solar Energy Conversion. Vienna. -1998. - Vol.1. - P.249-252. 9. Simashkevich A., Sherban D., Bruk L. et al. Spray-deposited ITO-nSi solar cells with enlarged area // Proceedings.

of the 20th European PV Solar Energy Conference. Barcelona. - 2005. - P.980. 10. Бpyк Л., Караман M., Симашкевич А., Шербан Д., Федоров В., Усатый Ю. Исследование тонких слоев SnO2:Sb,

полученных пиролитической пульверизацией // Abstr. of Int. Conf. „Physics of low-dimensional structures". – Chişinău, 2007, p.41.

11. Riben R.A., Feucht D.L. Electrical transport in nGe-pGaAs heterojunctions // Int. J. Electronics. - 1966. - Vol.20. - P.583-587.

12. Riben R.A, Feucht D.L. nGe-pGaAs. Heterojunctions // Solid State Electron. - 1966. -Vol.9. - P.1055-1065. 13. Ashok S., Sharma P.P., Fonash S. Spray-deposited ITO-silicon SIS heterojunction solar cells // IEEE Trans.

Electron Devices. - 1980. - ED-27. - P.725-730. 14. Милнс А., Фойхт Д. Гетеропереходы и переходы металл-полупроводник // Пер. с англ. - Москва: Мир, 1975. -

432 c. 15. Roderick E.H. Metal-semiconductor contacts. - Oxford: Clarendon Press, 1980. - 201 p.

Notă: Lucrarea a fost efectuată în cadrul Programului de Stat „Nanotehnologii, materiale noi multifun-

cţionale şi microsisteme electronice”, codul Proiectului 06.408.02.02P.




249

РАЗМЕРНО-КВАНТОВАННЫЕ ОСЦИЛЛЯЦИИ ПОДВИЖНОСТИ ЭЛЕКТРОНОВ,

ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ С ПОЛЯРНЫМИ

ОПТИЧЕСКИМИ ФОНОНАМИ

Артур АСКЕРОВ, Евгений ПОКАТИЛОВ, Денис НИКА

Кафедра теоретической физики În articol este cercetată dependenţa mobilităţii electronice de dimensiunile canalului conductiv în heterostructura

planară AlN/GaN/AlN. Se demonstrează teoretic că dependenţa mobilităţii electronice de dimensiunile canalului con-ductiv are un caracter oscilatoriu. Acest caracter oscilatoriu este explicat de interacţiunea tranziţiilor electronilor între subbenzi şi în cadrul subbenzilor.

The investigation of the dependence of the electron mobility on the conductivity channel thicknesses in planar zinc-

blende AlN/GaN/AlN heterostructures was fulfilled in the presented paper. It was theoretically shown that the electron mobility manifests an oscillatory dependence on the channel thickness. This non-monotonic behaviour was explained by the interplay of intra- and inter-subband electron transitions.

Введение Теоретически нами исследована зависимость электронной подвижности, лимитированной поляр-

ным оптическим рассеянием, от ширины канала в наноразмерных полярных гетероструктурах, c учётом межподзонных переходов электронов. Численные расчёты выполнены с использованием параметров zinc-blende AlN/GaN/AlN гетероструктуры. Как показано в нашей работе, межподзонное рассеяние сильно модифицирует монотонный рост подвижности, полученный при учете только внутризонного рассеяния. Включение межподзонных переходов, происходящее когда энергетическое расстояние от уровня Ферми до возбужденной подзоны становится сравнимым с энергией оптического фонона, преобразует зависимость подвижности от толщины канала в немонотонную функцию.

Мы изучили влияние межподзонных электронных переходов, обусловленных оптическими фоно-нами, на подвижность электронов в плоских гетероструктурах, принимая во внимание (i) несколько размерно-квантованных электронных подзон, (ii) дисперсии оптических фононов и (iii) неупругость электрон-фононного взаимодействия.

Расчеты проведены для гетероструктуры AlN/GaN/AlN (zinc-blende) с толщиной наружных обкла-док AlN, равной 3нм. Во вюртцитных структурах существует встроенное электрическое поле, сильно влияющее на свойства кристалла. Zinc-blende кристаллы GaN были выбраны с целью устранения эффектов, обусловленных встроенным электрическим полем, которые доминируют во вюртцитных материалах. Рассматриваемый эффект присущ всем полярным гетероструктурам, однако большие энергии оптических фононов в GaN и AlN способствуют усилению осцилляций.

Теоретическая модель В данном случае мы ограничимся рассмотрением таких толщин GaN-канала указанной гетеро-

структуры, когда в межподзонные переходы электронов вовлечено не более трёх нижних подзон. Для описания межподзонных переходов достаточно при этом использовать систему из трёх уравнений Больцмана [1-2]:

0

'0 2, 1,

, ' 1,2

(1 ( ( ))[ ( , , ) ( ( ) ( ) )] 1,(1 ( ))

nn n

p m nn

f m q p pW n p n p p pf p

λ

λ

ε ω τ τε′ =±

=

′− + ⋅′ ′ ′→ − =−∑r

r rr r r rh (1)

где n=1, 2, 3.

В уравнении (1) ( )W γ γ ′→ =2

'2 € ' ( )e phH E Eγ γπ γ γ δ−< > −h

– вероятность перехода

электрон-фононной системы из состояния γ с энергией Eγ в состояние γ ′ с энергией 'Eγ ;



250

0 1( ) (exp( ) 1)F

B

fk Tε εε −−

= + – функция распределения Ферми-Дирака; Т – абсолютная температура;

Bk – постоянная Больцмана; ε – энергия электрона; q – волновое число фонона; pr и 'pr – импульсы электрона в начальном и конечном состояниях; λ – поляризационный индекс (квантовое число) кон-файнмент и интерфейсных фононных ветвей; €

e phH − – гамильтониан взаимодействия электрона с

конфайнмент и интерфейсными оптическими фононными модами; 1( )τ ε – кинетическое время рас-сеяния электрона с энергией ε в первой (основной) подзоне, которое включает переходы (1 1), (1 2) и (1 2); 2 ( )τ ε – кинетическое время рассеяния электрона во второй подзоне, которое вклю-чает переходы (2 1), (2 2) и (2 3); 3 ( )τ ε – кинетическое время рассеяния электрона в третьей подзоне, которое включает переходы (3 1), (3 2) и (3 3).

Подвижность электрона вычислялась по формуле:

30 0

1 03

0 0

1 0

1 ( ) ( )(1 ( ))( ) ,

( )

nn

n

Bn

n

mf f d

eTk T

f d

ετ ε ε ε εµ

ε ε ε

∞

=∞

=

−=

+

∑ ∫

∑∫ (2)

где e – заряд электрона; nm – эффективная масса электрона, усреднённая на электронных волновых функциях n-го энергетического уровня [3]; T – абсолютная температура. Процедура усреднения волновой функции необходима для того, чтобы учесть конечное проникновение волновой функции в барьеры и различие эффективной массы электрона в проводящем канале и барьерах.

Результаты и обсуждение Необходимые для расчёта матричных элементов перехода электронные волновые функции на-

ходились из решения уравнения Шрёдингера, с учётом конечной высоты барьеров на интерфейсных границах. Внутриподзонное рассеяние, а также переходы между первой и третьей подзонами, про-исходят благодаря взаимодействию электрона с чётными оптическими модами, тогда как (1 2) межподзонные переходы обусловлены нечётными фононными модами.

На рис. 1 представлены графики функций 12 -2( , 5 10 cм )nF sd N∆ = ⋅ = 0n Fε ε− ( 0

nε – энергия n-го уровня электрона, Fε – энергия уровня Ферми), в зависимости от ширины проводящего канала d(GaN) для n=2 и 3. Горизонтальными линиями отмечены максимальная maxωh ~110 мэВ и минимальная

minωh ~66 мэВ энергия интерфейсных и конфайнмент оптических фононов в рассматриваемой гетеро-

структуре. Точками на графиках отмечены пересечения кривых 12 -2( , 5 10 cм )nF sd N∆ = ⋅ с фонон-ными уровнями.

На рис. 2 показаны зависимости подвижности от ширины канала d . Непрерывной линией на этом графике показана подвижность электронов, рассчитанная с учётом трёх электронных подзон, штриховой – с учётом двух электронных подзон и штрихпунктирной линией – с учётом рассеяния только в основной электронной подзоне. При учёте только внутризонного рассеяния (штрихпунктир-ная линия на рис. 2) с ростом d происходит монотонное увеличение подвижности, описанное в [4]. Есть две основных причины для такого роста подвижности: во-первых, плотность волновой функции

2( , )n z dϕ размерно-квантованного состояния уменьшается с ростом d, что ведёт к уменьшению матричного элемента электрон-фононного взаимодействия, во-вторых, ослабляется взаимодействие электрона с интерфейсными фононами. Как видно из рис.2, применение однозонной модели воз-можно только для очень тонких каналов (d<5нм), когда велико расстояние между энергетическими подзонами (больше нескольких kBT).



251

Рис.1. Разница между энергией второго 2F∆ и третьего 3F∆ энергетических уровней электронов и энергией Ферми как функция толщины проводящего канала.

Рис.2. Зависимости подвижности от ширины канала d с учётом различного количества подзон. Результаты показаны для температуры Т=300К и поверхностной концентрации sN =5х1012 см-2.

Заключение Теоретически мы показали, что подвижность электронов в zinc-blende гетероструктурах демон-

стрирует немонотонную (осцилляционную) зависимость от толщины проводящего канала. Таким образом, учёт межподзонных переходов при оптическом рассеянии электронов может быть сущест-венным для определения верхней границы подвижности при комнатных температурах в полярных наноразмерных гетероструктурах. Немонотонное поведение подвижности объясняется размерным квантованием электронных состояний и одновременным участием в рассеянии внутри- и межподзон-ных переходов электронов.

Полученные эффекты могут быть использованы для инженерии электронных и фононных состояний в наноразмерных электронных устройствах.


1. E.P. Pokatilov, D.L. Nika and A.A. Balandin // Appl. Phys. Lett. – 2006. – Vol. 89. – P. 112110. 2. E.P. Pokatilov, D.L. Nika and A.A. Balandin // Appl. Phys. Lett. – 2006. – Vol. 89. – P. 113508. 3. E.P. Pokatilov, D.L. Nika and A.A. Balandin // J. Appl. Phys. – 2004. – Vol. 95. – P. 5626. 4. D.R. Anderson, N.A. Zakhleniuk, M. Babiker, B.K. Ridley, and C.R. Bennett // Phys. Rev. B – 2001. – Vol. 63. –

P. 245313. Проведенные исследования частично были спонсированы фондом CRDF-MRDA (проект MOE2-

3057-CS-03), государственными проектами Республики Молдова (06.408.036F и 06.35.CRF) и фондом Intas (грант no. 05-104-7656).


Толщина канала (нм)

Толщина канала (нм)



252

ELABORAREA TEHNOLOGIEI DE FABRICARE A CELULELOR SOLARE

ITO/CdS/CdTe PE SUPORTURI FLEXIBILE

Tamara POTLOG, Nicolae SPALATU, Nina CAPROŞ

Catedra Fizică Aplicată şi Informatică The development of high efficiency, stable, lightweight and flexible solar cell is important for terrestrial and space

applications. We have developed a novel process to make solar cells on flexible polymer sheets. A thin layer of CdTe compound semiconductor is used for the absorption of solar light and generation of electrical current. In this work the solar electricity conversion efficiency of 4,66% is the highest efficiency reported for a solar cell grown on a polymer sheet.

Introducere Dacă am putea acoperi 0,1% din suprafaţa terestră cu celule fotovoltaice, am putea înlocui sursele poluante

şi consumabile de energie cu una curată şi regenerabilă. În ultimii 20 de ani tot mai mult sunt cercetate celulele solare (CS) pe bază de CdS/CdTe. CdTe are lărgimea benzii interzise Eg = 1,45 eV, cea mai optimă pentru obţinerea celulelor solare cu randament de conversie ridicat şi coeficient de absorbţie mare (~105cm-1), care permite absorbţia a 90% din lumina solară incidentă pe strat, corespunzătoare unei grosimi de numai câţiva microni [1-3].

O nouă direcţie în dezvoltarea CS, care se află în curs de cercetare, este obţinerea CS pe suporturi flexibile [4]. Suporturile flexibile având mărime, greutate redusă şi evitând pericolele legate de suporturile de sticlă, pot fi integrate în obiecte de diverse forme (telefoane celulare, carduri inteligente, control la distanţă etc.) şi în diverse modele de arhitecturi: corturi, acoperişuri, ferestre etc.

Polimerul este o substanţă ce reprezintă lanţuri de mii de monomeri legaţi covalent împreună, de obicei, din atomi de carbon. Polimerii sunt materiale flexibile rezistente la şoc, abraziune, agenţi chimici şi ţin la temperaturi de 400oC.

Obţinerea straturilor subţiri de CdS şi CdTe

Straturile subţiri de CdS şi CdTe s-au obţinut prin metoda evaporării în vid înalt. În calitate de sursă s-a folosit pulberea de CdS cu un grad de puritate 99,996%. În calitate de sursă de CdTe s-a folosit materialul obţinut prin sinteza dintre Cd şi Te cu o puritate de 99,999%, luate în proporţie stoechiometrică. Pe substratul de polimer acoperit cu un strat de ITO cu rezistenţa 3,5 Ω/ , transparenţa 75%, conductibilitatea (300 K) ~ 300 Ω-1cm-1 şi concentraţia 7·10-19cm-3 prin evaporare consecutivă se depun straturi de CdS şi de CdTe la temperatura suportului de 310oC şi a evaporatorului de 610oC, respectiv. Apoi, structura obţinută se lasă pentru o oră într-o soluţie saturată de CdCl2, după care se tratează în aer la 390 ± 5oC. În calitate de contact ohmic pentru stratul de CdS se foloseşte ITO, iar pentru stratul de CdTe se depune Te/Ni prin evaporare termică (Fig.1a). Lumina este absorbită de stratul de CdTe, după ce aceasta trece prin polimer. Cercetarea transmitanţei supor-tului polimer împreună cu stratul ITO în intervalul vizibil al lungimilor de undă a este reprezentată în Figura 1b şi indică o valoare de 75%.

Fig.1b. Transmitanţa stratului poli/ITO.

Fig.1a. Celula solară poli/ITO/CdS/CdTe.



253

Proprietăţile fotoelectrice ale CS ITO/CdS/CdTe pe suporturi flexibile

Caracteristicile curent-tensiune ale CS ITO/CdS/CdTe fără straturi antireflectante au fost studiate la iluminare prin stratul CdS. Caracteristicile curent-tensiune au fost măsurate la iluminarea de 100 mW/cm2 la temperatura camerei. În Figura 2 sunt prezentate caracteristicile curent-tensiune ale unui set de celule solare fabricate în acelaşi regim tehnologic pe suporturi de polimeri. Forma generală a acestor caracteristici ne aminteşte despre caracteristicile analoage p-n homojoncţiunilor, însă se observă şi unele deosebiri. La celula nr.5, la polarizare directă, observăm aspectul neconvenţional al caracteristicii curent-tensiune: apariţia unei curburi determinată de bariera de contact ce apare la contactul dintre Ni şi CdTe. Însă, dacă între stratul de CdTe şi Ni se depune un strat de Te, aceasta duce la micşorarea barierei de potenţial şi la schimbarea formei caracteristicii curent-tensiune (celulele solare 1-4, Fig.2).

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5

U,V

I,mA

Fig.2. Caracteristicile curent-tensiune ale unui set de celule solare ITO/CdS/CdTe.

Din caracteristicile curent-tensiune s-au determinat următorii parametri: densitatea curentului de scurtcir-

cuit (Jsc,), tensiunea circuitului deschis (Ucd), factorul de umplere (FF), randamentul de conversie al energiei solare în energie electrică (η), rezistenţa serie (Rs) şi rezistenţa şunt (Rsh). Parametrii fotovoltaici obţinuţi din caracteristica curent-tensiune a setului de CS CdS/CdTe sunt prezentaţi în Tabel.

Tabel

Parametrii fotovoltaici ai setului de CS ITO/CdS/CdTe

După cum observăm, parametrii fotovoltaici sunt destul de modeşti în comparaţie cu parametrii obţinuţi pe suporturi de sticlă [5]. Rezistenţa serie este destul de mare, tensiunea circuitului deschis atinge valoarea cea mai mare – 0,61 V. Randamentul de conversie pentru cea mai bună celulă solară este de 4,66%. Randamentul scăzut al CS CdS/CdTe pe suporturi flexibile, în comparaţie cu cel al CS pe sticlă (~10%), este cauzat de rezistenţa serie mare, dar şi de alţi parametri, cum ar fi factorul diodic şi curentul de saturaţie.

Celula solară

Vcd, (V)

Jsc, (mA/cm2)

FF (%)

Eff, (%)

Rsh, (Ω cm2)

Rs, (Ω cm2)

Nr. 1 0,61 17,96 42,45 4,66 95,2 10,85 Nr. 2 0,5 16,98 41,95 3,6 80,9 5,05 Nr. 3 0,56 17,47 43,75 4,34 86,9 10,79 Nr. 4 0,47 18,19 31,05 2,71 31,8 74 Nr. 5 0,38 18,21 45,3 3,14 2003,8 43,5

_.._..Celula 1 ----- Celula 2 ……Celula 3 _._._Celula 4 ____Celula 5



254

Studierea caracteristicii curent-tensiune a unei celule solare CdS/CdTe la diferite iluminări ne-a permis să constatăm ca factorul diodic ia valori mai mari ca 2,0 şi creşte de la 5,8 până la 7,8 odată cu creşterea iluminării de la 10 mW/cm2 la 100 mW/cm2. De asemenea, curentul de saturaţie creşte de la 2,1 mA/cm2 la iluminarea 10 mW/cm2 până la 19,5 mA/cm2 la iluminarea 100 mW/cm2. Modificarea acestor parametri cu iluminarea indică la faptul că se activează centrele de recombinare de la interfaţa structurii. Aceste constatări ne permit să înscriem mecanismul de transport al curentului prin aceste structuri în modelul în care recombi-narea la interfaţă este dominantă.

Caracteristica spectrală a celulei solare cu cel mai ridicat randament de conversie a energiei solare în electrică este ilustrată în Figura 3.

Fig.3. Caracteristica spectrală a CS ITO/CdS/CdTe cu randamentul de conversie a energiei solare în energie electrică 4,66%.

Forma caracteristicii este destul de omogenă în domeniul lingimilor de undă (550-850) nm, la lungimi de

undă mari e limitată de absorbţia în CdTe, iar în domeniul lungimilor de undă scurte – de absorbţia în soluţia solidă ce se formează la interfaţa structurii CdS/CdTe [6]. Pentru micşorarea pierderilor care pot afecta valoarea curentului de scurtcircuit este necesar să se micşoreze pierderile prin reflexie şi absorbţie, în stratul de contact, la interfaţa CdS/CdTe, în stratul de CdTe, precum şi la interfaţa CdS-suport şi în suport.

Referinţe:

1. Mitchell K., Fahrenbruch A., Bube R.J. Appl. Phys. 48, 829-830 (1977). 2. Nakazawa T., Takamizawa K., Ito K.J. Apll. Phys. Lett. 50, 279-280 (1987). 3. Aranovich J., Golmayo D., Fahrenbruch A., Bube R.J. Appl. Phys. 51, 4260-4265 (1980). 4. Romeo A., Khrypunov G., Kurdesau F., Arnold M., Batzner D.L., Zogg H., Tiwari A.N. Solar Energy Materials

and Solar Cells 90 (18-19), p.3407-3415 (2006). 5. Potlog T., Gimpu L., Coval A., Andronic I. 19th European Photovoltaic Solar Energy Conference and Exhibition.

Paris, France, June 7-11, p.1845-1889 (2004). 6. Ibidem.




255

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛОВ ZnSe,

ЛЕГИРОВАННЫХ МАРГАНЦЕМ В ПРОЦЕССЕ РОСТА

Дмитрий НЕДЕОГЛО, Вадим СИРКЕЛИ, Раиса СОБОЛЕВСКАЯ, Константин СУШКЕВИЧ

НИЛ физики полупроводников

Sunt prezentate rezultatele studiului proprietăţilor luminescente ale cristalelor de ZnSe dopate cu Mn în timpul pro-cesului de creştere. Concentraţia manganului introdus în reactor nu a depăşit 1,14 · 10-3 g/g. S-a demonstrat că la diferite lungimi de undă de excităre apar trei benzi de iradiere luminescentă: 590 nm, 608 nm şi 630 nm, cauzate de tranziţii intra-centrate în ionii MnZn

2+. Se discută mecanismele de excitare a iradierii luminescente a manganului în cristalele studiate. We present the results on photoluminescent properties for ZnSe crystals doped with Mn during growth process. The

сontent of Mn in the reactor did not exceeded of 1.14*10-3g/g. It is shown that only long-wave photoluminescence bands exist in PL spectra under different excitation wavelengths. We suppose that Mn2+ ions are responsible for PL bands (590, 608 and 631 nm) observed in the visible PL spectra of ZnSe:Mn crystals. The excitation mechanisms of intra-shell radiation are discussed.

Введение

В последние годы наблюдается значительный прогресс в изучении примесей переходных металлов в полупроводниковых соединениях. Такие примеси в полупроводниках А2В6 наряду с практическим применением являются хорошим модельным объектом для изучения примесных центров с глубокими энергетическими состояниями, сравнительно легко идентифицируемых по серии внутрицентровых переходов. Так, марганец в небольших концентрациях в селениде цинка является центром эффективной оранжевой люминесценции. Помимо этого атомы марганца обладают спином, что дает возможность создания на основе ZnSe:Mn новых функциональных приборов, использующих магнитный резонанс и магнитооптический эффект.

Марганец является единственной примесью 3d-типа, хорошо растворимой в А2В6. Это обусловлено малой степенью гибридизации с зонными состояниями, т.е. размеры иона Mn2+ в решетке незна-чительно изменяются по сравнению со свободным ионом Mn2+ . В ZnSe размеры иона Mn2+ (0,80Ǻ) в решетке сравнимы с размерами Zn2+ (0,74Ǻ), в связи с чем ионы Mn2+ , замещающие Zn2+ , не создают возмущения решетки и образуют твердые растворы Zn1-xMnxSe в широких пределах. Энергия отрыва одного из пяти 3d-электронов марганца больше ширины запрещенной зоны ZnSe, поэтому легиро-вание марганцем изменяет только оптические свойства селенида цинка.

Несмотря на интенсивное исследование оптических свойств ZnSe:Mn, как монокристаллов, так и слоев c большой концентрацией марганца, в кристаллах с концентрациями ионов Mn2+ порядка несколь-ких процентов и ниже внутрицентровые переходы исследованы недостаточно. Эта область концент-раций представляет интерес, так как в ней находится порог миграции внутрицентрового возбуждения ионов марганца. До настоящего времени нет единой точки зрения как относительно природы полос люминесценции, обусловленных легированием марганцем, так и факторов, влияющих на возбуж-дение излучения марганцевых центров.

Настоящее исследование посвящено изучению люминесцентных свойств кристаллов селенида цинка, легированных марганцем в процессе их роста до 0,3 ат.% (1,14 x 10-3г/г).

Изготовление образцов и условия эксперимента

Кристаллы ZnSe и ZnSe:Mn были получены методом химических транспортных реакций. В качестве транспортного агента использовался йод. Легирование марганцем осуществлялось в процессе роста кристаллов. Чистота использованных компонентов: Se, Zn – «осч», йод –«ч», марганец – 99,99%. Кон-центрация вводимого марганца составляла 0,01 ; 0.03 ; 0,06 ; 0,1 ; 0,3 ат.%. Исследовалась однород-ность распределения примеснодефектного состава в выращенных кристаллах, зависимость структуры



256

спектров фотолюминесценции (ФЛ) от концентрации марганца, температуры измерения (4,2 …300К) и интенсивности возбуждения. Источниками возбуждения служили лазеры: импульсный ИЛГИ503 с λвозб. = 337 нм (3,68 эВ), с длительностью импульса 8 нс и мощностью порядка 2,0 мВт, и аргоновый (488,0 нм и 514,5 нм), с мощностью 0,30 Вт (0,6 Вт/см2) и 0,18 Вт (0,36 Вт/см2) соответственно. Была применена стандартная методика синхронного детектирования. Спектры ФЛ исследовались с помощью монохроматоров МДР-2 с обратной линейной дисперсией 2-4 нм/мм, МДР-23 и ORIEL Instruments MS 257TL. Обработка спектральных диаграмм и их коррекция на спектральную чувствительность установки проводилась с помощью оптического интерфейса по методике, описанной в [1].

Экспериментальные результаты и их обсуждение

Спектр нелегированного кристалла (λвозб=337 нм) (рис.1) при 77К и 300К представляет собой широ-кую полосу с полушириной 340 мэВ и 430 мэВ соответственно. Основной максимум 77К расположен вблизи 633 нм (1,96 эВ). С возрастанием температуры он сдвигается в длинноволновую область с температурным коэффициентом -7,5 x 10-4 эВ/К к 700 нм (1,77 эВ) при 300К. Температурный коэффи-циент смещения максимума полосы ФЛ сравним с температурным коэффициентом изменения ширины запрещенной зоны ZnSe [2]. Интерпретация полос ФЛ в этой области спектра носит противоречивый характер. Термостабильную полосу 628 нм, положение которой не зависит от интенсивности возбуж-дения и температуры, приписывают изоэлектронному центру, включающему OSe. Мы склонны отнести излучение, определяющее положение основного максимума, к свободносвязанным переходам. В качестве излучательного центра может выступать OSе

0Cui+VZn

-- [3]. Температурные зависимости интенсивности ФЛ в рамках исследуемого температурного диапазона достаточно хорошо описываются классическим законом:

I= I0[1+W0/Wi1exp(-Ea/kT)] -1,

где I- интенсивность в максимуме спектра ФЛ; Т – температура, I0 – начальная интенсивность при температуре, близкой к абсолютному нулю, Еа – энергия активации, k – постоянная Больцмана, Wi и W0 – вероятности излучательного и безызлучательного переходов. На вставке «а» приведена темпера-турная зависимость интенсивности излучения в максимуме основной полосы в координатах lnIFL, 103/ТК.

Рис.1. Спектр ФЛ нелегированного кристалла селенида цинка, полученного методом газотранспортных

реакций. На вставках: «а» – температурное тушение интенсивности полосы с максимумом 633 нм (1,96 эВ); «б» – зависимость интенсивности этой полосы от интенсивности возбуждения.

На кривой имеется несколько линейных участков, которым соответствуют энергии активации

температурного тушения полосы: 49 мэВ, 26 мэВ, 5 мэВ. Наряду с деформацией полосы при изменении температуры и значительной полушириной, различные значения энергии активации также



257

могут свидетельствовать о её неэлементарности. Зависимость интенсивности полосы от интен-сивности возбуждения (вставка «б») носит линейный характер с угловым коэффициентом, близким к единице, т.е. имеет место внутренний механизм температурного тушения полосы. При 77К с ростом интенсивности возбуждения в спектре проявляется слабое излучение с максимумом вблизи 438 нм (2,83 эВ). Авторы [4] при исследовании кристаллов ZnSe:I наблюдали такое же излучение и отнесли его к рекомбинации электронов, находящихся на уровне Ферми с дырками валентной зоны.

На рисунке 2 представлены нормализованные спектры ФЛ исследованных кристаллов ZnSe при 77 и 300К (λвозб=337 нм). С увеличением концентрации вводимого Mn наблюдается сближение максимумов спектров при 77 и 300К, обусловленное, по-видимому, увеличением вклада излучения Mn (580…610 нм), хотя интегральная интенсивность ФЛ при 300К во всяком случае в три раза меньше, чем при 77К (речь идет об изменении относительного вклада излучения).

Рис.2. Спектры ФЛ кристаллов селенида цинка, легированных марганцем.

С возрастанием температуры отношение интенсивностей ФЛ в голубой и красной областях спектра

изменяется в сторону увеличения. Аналогичное поведение интенсивностей голубой и красной полос при пониженной интенсивности интегральной ФЛ отмечено в кристаллах селенида цинка, легирован-ных йодом [4]. Основной максимум при 77К расположен в интервале длин волн 630…640 нм. На коротковолновом спаде полосы отчетливо выделяется особенность в районе 520…550 нм. Некоторые авторы [5,6] связывают появление излучения в этой области спектра с излучением марганцевых центров. Так как энергия возбуждения 3,68 эВ не совпадает ни с одной из полос поглощения марганца в селениде цинка, то в качестве сенсибилизирующего излучения может выступать излучение с длиной волны 462…488 нм (2,54…2,68 эВ) [7]. Такие значения энергии дают переходы свободный электрон – акцептор [8]. С учетом cтоксового сдвига ~0,4 эВ энергия квантов внутрицентровой ФЛ при переходе с возбужденного уровня Mn на основной уровень – 2,22 эВ (543 нм) или выше. Излучения с длинами волн 488-492 нм и 515-521 нм также могут выступать сенсибилизаторами внутрицентрового излучения Mn2+ с длинами волн, соответственно, 585 нм и 630 нм. Этим можно объяснить слабое излучение в голубой области при 77К для всех исследованных концентраций введенного марганца, т.к. энергия этого излучения может резонансно передаваться марганцевым центрам. В [6] за полосу ФЛ 550…570 нм считают ответственными переходы 4Т2→6А1, а за полосу 630 нм – 4Т1→6А1. Большая полуширина полос (0,26 эВ при 300К) объясняется испусканием и/или поглощением фононов. С



258

возрастанием температуры происходит сдвиг полосы коротковолнового излучения в область меньших энергий, что, по-видимому, уменьшает вероятность резонансного возбуждения марганцевых центров. При этом проявляется коротковолновое излучение, но падает интегральная интенсивность ФЛ.

На рис. 3 приведены спектры ФЛ кристалла с 0,1 ат% Мn при 77К и различных длинах волн воз-буждающего света. Положение максимума основной полосы (вблизи 630 нм) не зависит от длины волны и интенсивности возбуждения. На её длинноволновом спаде при всех длинах волн возбуждения в образцах с содержанием марганца 0,03 ат. % и выше вблизи 680 нм проявляется некая особенность.

Рис.3. Спектры ФЛ при 77К кристалла ZnSe, легированного 0,1 ат.% Mn, для различных длин волн

возбуждения. На вставке: температурное тушение полосы 630 нм. Для выяснения природы этого излучения необходимы дополнительные исследования. На вставке

приведено температурное тушение интенсивности полосы 630 нм. Полученные энергии активации температурного тушения – 108 мэВ и 4 мэВ в областях высоких и низких температур соответственно. Большая величина энергии активации в высокотемпературной области для марганцевой полосы вызвана сближением значений конфигурационных координат основного и возбужденного состояний Mn2+

Zn в этой области температур [7]. Так как мы предполагаем, что за излучение с максимумом 630 нм ответственны внутрицентровые переходы в ионах Mn2+

Zn, то энергия активации температурного тушения может быть связана как с внутренним тушением, так и с температурным гашением излучения центров-сенсибилизаторов.

На образце с концентрацией вводимого марганца 0,1 ат.% при высоких уровнях накачки наблю-далась лазерная генерация с длинами волн 608 нм ( λвозб.=488 нм) и 630 нм при λвозб.=514,5 нм. Логично предположить, что эти излучения связаны с внутрицентровой ФЛ марганца, с переходами с метаста-бильных возбужденных уровней, обусловленных расщеплением кристаллическим полем решетки, на основной. По аналогии с ZnS [9] мы полагаем, что ФЛ марганцевых центров обусловлена внутри-центровым переходом в ионе Mn2+ из первого возбужденного состояния 4Т1(4G) в основное 6А1 (6S). Возбуждение с длиной волны 488 нм по данным [10] происходит непосредственно в первой полосе поглощения 3d-переходов иона марганца (переход 6А1→4Т1). Зонные электронные состояния в одно-фотонном процессе не затрагиваются, поэтому полоса излучения 608 нм (2,04 эВ) может быть отнесена к переходу 4Т1 → 6А1. Энергия этого перехода зависит от реальной картины расщепления уровней иона Mn2+, что, в свою очередь, определяется его ближайшим окружением. Интенсивная лазерная генерация с длиной волны 630 нм возбуждается лазерной накачкой с длиной волны 514,5 нм. Величина стоксового сдвига для этого случая – 0,44 эВ.



259

Выводы 1.Получены кристаллы селенида цинка, легированные марганцем в процессе роста с концентрацией

вводимого марганца 0,01…0,3ат.%. 2. При возбуждении излучением с длиной волны 337 нм увеличение концентрации вводимого

марганца приводит к сближению положений максимумов основных полос ФЛ при 77К и 300К, обусловленному увеличением относительного вклада излучения марганца с максимумом в области длин волн 580…630 нм.

3. При увеличении температуры возрастает отношение интенсивности коротковолнового излучения к интенсивности длинноволнового на фоне падения интегральной интенсивности ФЛ, что связано с уменьшением вероятности резонансного возбуждения марганцевых центров центрами сенсибилизации.

4. Полосы 608 нм и 630 нм относятся к внутрицентровым переходам из первого возбужденного состояния 4Т1(4G) в основное 6А1 (6S) в ионах марганца, находящихся в различном окружении в решетке селенида цинка.

5. Возбуждение излучения марганцевых центров осуществляется по внутрицентровому механизму при возбуждении с длиной волны 488 нм и 514,5 нм или по резонансному механизму через центры сенсибилизации при возбуждении с длиной волны 337 нм.


1. Коротков В.А., Левченко С.В., Брук Л.И., Сушкевич К.Д., Соболевская Р.Л., Коротков А.В. // Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova. Seria ”Ştiinţe fizico-matematice”. - Chişinău, 2003, p.111-113.

2. Недеогло Д.Д., Симашкевич А.В. Электрические и люминесцентные свойства селенида цинка. - Кишинев: Штиинца, 1984. - 150 с.

3. Морозова Н.К., Каретников И.А., Блинов В.В., Гаврищук Е.М. // ФТП. - 2001. T.35. Bып.1. - C.25. 4. Авдонин А.Н., Иванова Г.Н., Недеогло Д.Д., Недеогло Н.Д. // ЖПС. - 2002. - T.69. -2. - С.212-215. 5. Toshiyuki Ido, Hideo Goto, Toshisa Shii et all//J. Cryst. Growth. - 2001. - 233. - P.108-111. 6. Ваксман Ю.Ф., Корнева Н.Н., Тутов Ю.Н., Сердюк В.В.// ЖПС. - 1984 (Деп.). - С.2. 7. Агекян В.Ф. // ФТТ. - 2002. - T.44. - Bып.11. - С.1921-1939. 8. Гавриленко В.И., Грехов A.M., Корбутяк Д.В, Литовченко В.Г. Оптические свойства полупроводников.

Справочник. - Киев: Наукова думка, 1987. - 608 с. 9. Буланый М.В., Клименко А.В., Полежаев Б.А. ЖПС. - 2002. - T.69. - 5. - С.646-649. 10. Агекян В.Ф., Васильев Н.Н., Константинов В.И. и др. // ФТТ. - 2003. - T.45. - 8. - С. 1369-1372.

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства РМ (институциональная тема 06.408.037F) и INTAS (INTAS YSF Ref. Nr. 06-1000014-6370).



265

EFFECT OF THE GRAIN SIZES ON THE PHOTOVOLTAIC PARAMETERS OF CDTE

SOLAR CELLS PREPARED BY CLOSE SPACE SUBLIMATION METHOD

Tamara POTLOG

Moldova State University, Physics Department

Celulele solare CdS/CdTe sunt fabricate prin metoda volumului cvasiînchis la temperaturi ale suportului cuprinse între 300 ± 5ºC şi 340 ± 5ºC. Cei mai buni parametri fotovoltaici au fost atinşi la temperatura suportului de 320ºC şi la temperatura evaporatorului de 610ºC. Tensiunea de circuit deschis şi densitatea curentului de scurtcircuit se modifică semnificativ cu modificarea temperaturii suportului şi depinde de dimensiunea cristalitelor. Cea mai mare valoare a densităţii curentului de scurtcircuit şi a tensiunii de circuit deschis se atinge pentru celulele solare cu dimensiunea cris-talitelor cuprinsă între 1,0 µm şi ~5,0 µm. Au fost obţinute celule solare CdS/CdTe cu o eficienţă de ~ 10%. Aşadar, dimensiunea cristalitelor este un parametru care limitează eficienţa cuantică a celulelor solare.

Thin Film CdS/CdTe solar cells were fabricated by Close Space Sublimation at the substrate temperature ranging

from 300 ºC± 5ºC to 340 ± 5ºC ºC. The best photovoltaic parameters were achieved at substrate temperature 320oC and source temperature 610oC. The open circuit voltage and current density changes significantly with the substrate tempe-rature and depends on the dimension of the grain sizes. Grain size is an efficiency limiting parameter for CdTe layers with large grains. The open circuit voltage and current density are the best for the cells having dimension of grains between 1.0 µm and ~5.0 µm. CdS/CdTe solar cells with an efficiency of~10% were obtained.

Introduction Efficient and low cost solar cells are demanded for the photovoltaic system. An economical cell should be

prepared in the form of a thin film. The CdS/CdTe thin film solar cells is a leading candidate for low cost high-performance applications because as is well known the nature of the band-to band transitions has an important bearing on the cell thickness. The latter should be of the order of the absorption length 1/α, which is much smaller (2 µm or 5 µm for CdTe) for direct non phonon transitions than for the case of indirect phonon-assisted transitions (50 to 100 µm for Si). The large number of techniques for fabrication of CdS/CdTe solar cells have been elaborated for obtaining conversion efficiency up to 16,5 % [1]. Close space sublimation (CSS) growth technique usually gives good electronic properties and high growth rates, and may be amenable to continuous production. The CdTe CSS films deposited above 550oC substrates temperatures has been investigated by researchers from Antec [2], Kodak [3], Matsushita [4], USF [5] and NREL [1].

In this paper has been applied CSS technique to growth CdTe layers onto substrates at temperatures less 400oC. The effect of the substrates temperatures on the photoelectrical properties of the CdS/CdTe solar cells is discussed here.

1. Sample preparation The performance of the devices depends critically on the quality of the semiconducting absorber layer.

Therefore the first strategy for fabrication high-performance solar cells was the elaboration of the techno-logical regime (substrate temperature, evaporation speed, thickness of layers, cleanliness of the substrate, impurities from precipitates and initial material etc...) for high quality thin CdTe layers. The CdTe source was formed by the direct reaction of Cd (99.999%) and Te (99.996%), taken in stoichiometric proportions. In order to determine the optimal technological conditions a set of CdTe layers deposited on SnO2/CdS at differences substrate temperatures were obtained. The structure of CdTe layers deposited at temperatures ranging from 300 ºC± 5ºC to 340 ± 5ºC ºC with a metallographic MMR-2P microscope was studied. The microstructure CdTe films are determined by the substrate temperature and source-substrate temperature gradient. The evaporator temperature and the time of the CdTe-layer deposition were kept constant at (610 ± 5)ºC and four minutes, respectively. The source temperature 610oC was chosen from point of view of granule sizes and a reasonable degree of contamination with impurities from the source. When the substrate temperature increases up to 310oC± 5ºC, the grain sizes increases. With a further increase of the substrate temperature (320oC-340oC)



266

the density of the growth crystallites increases, and it becomes difficult to evaluate. At substrate temperatures near 330 ºC± 5ºC the crystallite size are approximately 3 µm (Table). The decrease of the grain sizes with the increasing of the substrate temperature is explained by the decreasing of the degree of satiation and by the increasing of the migration velocity of Cd and Te atoms on the surface. The atoms can’t become active germs of crystallization for forming the necessary compound. In this case, the speed of the layer’s growth is small and micro-granular structured layers were formed. With decrease of substrate temperature alike with increases of the degree of satiation the diffusion surface velocity of the atoms decreases leading thus to the increasing in the number of the active crystallization centers.

These deposition conditions were used in the standard glass-SnO2/CdS/CdTe cells. Before depositions of CdTe, the SnO2-covered substrates with resistivity ~16 Ω/, thickness of 0.36 µm and transparency 90% were degreased in a solution of 6 g K2Cr2O7 + 10-ml H2O + 100-ml H2SO4 at room temperature, then rinsed in double-distilled water, and dried. Then the CdS was deposited by CSS. For the CdS source, CdS powder with a purity of 99.995% was used. CdS was 0.29 µm thick and had the resistivity 2-3 Ω⋅cm and transparency above 90 %. A set of cells were fabricated with CdTe layers fabricated at substrate temperatures at a fixed source temperature mentioned above in order to find the regime that would lead to the best solar cell performance. After the CdTe layers were deposited, the structures were held in CdCl2:H2O saturated solutions for 3-4 hours. After structures were annealed in the air at 380±5oC for 30 min and etched in K2Cr2O7:H2SO4:H2O. To minimize the back contact barrier [6], an additional layer of Te was deposited by thermal evaporation. Ni was used, and to increase the adherence of the ohmic contact to the CdTe, a post thermal treatment with temperatures of 200 ºC for 30-40 min was made.

2. Photovoltaic parameters of CdS/CdTe solar cells In order to see if there is any effect due to the variation of substrate temperature of CdTe layer on photovoltaic

parameters we have investigated current-voltage characteristic for solar cells where the substrate temperature was changed as mentioned above. The photoelectrical properties of CdS/CdTe/Te solar cells were investigated at the room temperature under illumination 100 mW/cm2 through the wide gap component CdS. The influence of CdTe layer structure on photoelectrical characteristics of CdS/CdTe/Te solar cells at different substrates temperature are illustrated in figure 1. The best photovoltaic parameters were achieved at substrate temperature 320oC and source temperature 610oC. As one can see from the Table the open circuit voltage (Uoc) and current density (Jsc) changes significantly with the substrate temperature and depends of the dimension of the grain sizes. Grain size is an efficiency limiting parameter for CdTe layers with large grains. The larger grain sizes increase the size of voids or pinholes between grains. Voids between grains effectively reduce Uoc by providing shunt paths between the back and front contacts.

Table Photovoltaic parameters of CdS/CdTe/Te solar cells

Ts (oC) d (µm) Jsc (mA/cm2) Uoc (V) FF (%) Efficiency

(%) Rsh (Ohm cm²) Rs (Ohm cm²)

300 12,5 12.27 0.7595 33.27 3.1 758.2 13.68 310 24,8 1.18 0.1924 25.77 0.06 1480.6 10.96 320 4,7 22,75 0,81 51,87 9.56 2917.4 10.68 330 2,6 20.82 0.6025 35.91 4.5 640.5 10.66 340 1,25 20.98 0.6572 36.43 5.02 860.9 11.26

The open circuit voltage and current density achieving in this work are the best for the cells having dimension of grains between 1.0 µm and ~5.0 µm. CdS/CdTe/Te solar cells with efficiency (η) of 9,56% were obtained. Fill factor (FF) is low in general. According to the theory the fill factor is determined by the series resistance, saturated dark current density (Jo) and diode quality factor (A). The Jo and A of the CdS/CdTe/Te cells are in the range of 10-9 – 10-7 A/cm2 and 2.4-3.6 respectively. As one can see from table the low value of FF is mainly determined by high value of series resistance which is due probably with the fact that the cells used wet CdCl2 treatment may contain oxide on the surface of CdTe.


267

-0.5 0.0 0.5 1.0

-30

-20

-10

0

10

20

30

U,V

3000C

3100C

3200C

3300C

3400C

J, m

A/cm

2

Fig.1. Current-voltage characteristics of the CdS/CdTe/Te solar cells

for different substrate temperatures. External quantum efficiency (EQE) data for front illumination of cells with different substrate temperatures

are shown in Figure 3. The thickness of the deposited CdS in all cases was 0, 29 µm. The analysis of the Q (λ) curves showed that the substrate temperature of the CdTe layer has not a strong influence on the form of quantum efficiency spectra, but has the most influence on the carrier generation and collection. The quantum efficiency (QE) for all solar cells is reasonably good for wavelengths between 520 nm and 845 nm. The high collection in the visible region of the spectra has the device obtained at substrate temperature 320oC. The primary loss is the reflection of the cell.

The non-encapsulated CdS/CdTe/Te solar cells were light soaked under one-sun simulated illumination at 85oC. The device was kept under constant and continuous irradiation in air. The results for this “light soaking” test for the best cell are shown in Figure 4. After soaking 30 min the load I-U characteristics is improved due to the fact that the series resistance of the device decreases. A little decrease in open circuit voltage and current density is observed. But after soaking after two hours the modest rapid initial degradation of the open circuit voltage is stabilized.

400 500 600 700 800 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

300oC

310oC

320oC

330oC

340oC

EQ

E. a

rb.u

n

λ, nm

Fig.2. External Quantum Efficiency of the CdS/CdTe/Te solar cells with

different substrate temperatures as indicated in Table.



268

Fig.3. Light J-V characteristics of the CdS/CdTe/Te solar cells before and after light soaked under one-sun simulated illumination at 85oC.

By choosing the right buffer-metal combination stable CdS/CdTe/Te solar cells were obtained. Cells with

a thin layer of Te at the back contact show excellent stability and stress test suggest that these cells will not degrade when properly encapsulated.

Conclusions Processing options relating to processing of thin-film CdTe/CdS/Te solar cells have been discussed. For

the best cells at 300 K and 100 mW/cm2 the following photovoltaic parameters were obtained: Uoc = 0,81 V, Jsc = 22,75 mA/cm2, η = 10%. It must be noted that these results are obtained for unoptimised structures without antireflection coatings and can be improved by reducing both current and voltage losses and by the appropriate choice of component cell thickness.

References

1. Wu X., C.Keane J., Dhere R.G., Dehart C., Albin D.S., Duda A., Gessert T.A., Asher S., Levi D.H., and Sheldon P. 2001. Proc. of 17th European Photovoltaic Solar Energy Conference, 22-26 October, Munich, Germany 995.

2. Bonnet D. 1995. Conf. Rec. 14th European Photovoltaic Solar Energy Conversion 1456. 3. Tyan Y. Perez Albuerne E. 1982. Conf. Rec 16th IEEE Photovoltaic Specialist Conf. 794. 4. Ohyama H. et al. Conf.Rec. 1977. 26th IEEE Photovoltaic Specialist Conf. 343. 5. Ferekides C. et al. 2000. Thin Solid Films 520. 6. Potlog T., Gashin P., Ghimpu L., Pudov A.O., Sites J.R. 2003. Proceedings of the ISES Solar World Congress, June

14-19, Goteborg, Sweden 30. Acknowledgements This research was supported through the Swiss National Science Foundation, via the Institutional Partnership

programme “Scientific Cooperation between Eastern Europe and Switzerland”. The author would like to thank L. Ghimpu and N. Spalatu for growing CdTe solar cells.


-0.5 0.0 0.5 1.0

-30

-20

-10

0

10

20

30

before soaking after soaking 30 min after soaking after 10 min after soaking after 20 min after soaking after 2 hours

J, m

A/cm

2

U, V



269

ДИНАМИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ КОЛЕБАНИЙ РЕШЁТКИ В КВАНТОВЫХ

ПРЯМОУГОЛЬНЫХ НИТЯХ Надежда ЗИНЧЕНКО, Денис НИКА, Евгений ПОКАТИЛОВ

Кафедра теоретической физики În articol sunt prezentate rezultatele investigării proprietăţilor acustice ale heterofirelor şi ale firelor omogene

dreptunghiulare cuantice pe baza Si în cadrul modelului dinamic al reţelei cristaline. Au fost cercetate spectrele ener-getice şi vitezele de grup în heterofirul Si/Ge. S-a făcut comparaţia cu firul omogen din Si. A fost realizată compa-raţia cu rezultatele obţinute în cadrul modelelor dinamic al reţelei cristalinei şi continual. S-a stabilit că abordarea continuală este aplicabilă la fononii acustici cu energie mică (valorile mici ale numărului de undă şi ale numărului cuantic al fononului).

In the present paper the investigations of acoustic properties of quantum rectangular Si-based heterowires and

homogeneous wires in the framework of Face-Centered Cell dynamic lattice model are presented. The energy spectra and group velocities in heterowires Si/Ge are examined. The comparison with Si wire is carried out. The comparison between the results obtained in the framework of dynamic model and continual approximation is realized. It was established that continual approach is applicable for acoustic phonons with small energies (small values of wave number and quantum number).

В конденсированных телах акустические фононы являются важными участниками процессов пе-

реноса энергии [1-2]. Величина акустического вклада сильно зависит от фононной дисперсии. В низко-размерных структурах энергетический спектр акустических фононов значительно изменяется по срав-нению со спектром в объёмных полупроводниках, что проявляется благодаря размерному квантованию энергии фононов, появлению большого числа квантованных фононных ветвей [3]. Для нахождения спектров акустических фононов в квантовых гетероструктурах нанометровых размеров (квантовые слои, нити, точки и сверхрешётки из них) широко используется континуальный подход [4-5], который в длинноволновом приближении (низкие энергетические ветви, малые значения волнового числа q) даёт правильные дисперсионные зависимости. Для рассмотрения акустических фононов с малой дли-ной волны (высокие энергетические ветви, большие значения q) континуальный подход непригоден. В этом случае возникает потребность использовать динамическую модель колебаний кристаллической решётки, имеющую смысл для всех длин волн [6-7].

В работе исследуются энергетические спектры и групповые скорости акустических фононов в квантовых прямоугольных однородных нитях и гетеронитях. В качестве параметров материала внут-реннего слоя взяты параметры кремния. Выполнено сравнение результатов, полученных в рамках динамической модели и континуального приближения.

Теоретическая модель Характерной чертой динамической модели является использование силовых констант, описываю-

щих взаимодействие атомов в кристаллической решётке. При небольшом числе используемых силовых констант их вычисляют из упругих модулей материалов. При некоторых допущениях относительно величины силовых констант, описывающих взаимодействие атомов на границах гетероструктуры, можно обобщить теорию гетероструктур из материалов с различными акустическими свойствами.

Кристаллическая решётка кремния представляет собой две кубические гранецентрированные решётки (FCC-face-centered cubic cell), смещённые друг относительно друга вдоль пространственной диагонали куба на 1/4 её длины. В настоящей работе используется следующее упрощение: FCC решётки совмещаются одна с другой. При этом в каждом узле решётки находятся атомы с удвоенной массой.

Схематичное изображение исследуемой прямоугольной гетеронити, а также однородной нити, представлено на рис.1. Оси 1X и 2X декартовой системы координат располагаются в плоскости поперечного сечения нити параллельно ее сторонам, а ось 3X направлена вдоль оси нити. Начало



270

координат находится в центре гетеронити. Длины сторон прямоугольной нити обозначены (1)1d , (1)

2d , длины внешних сторон нити – 1d , 2d . В работе учитывается взаимодействие атома с двумя ближай-шими атомными сферами. Взаимодействие с первой атомной сферой – центрально-симметрическое, т.е. описывается одной силовой константой 1α . Взаимодействие со второй атомной сферой считается нецентрально-симметрическим и описывается двумя силовыми константами α и β . При расчёте взаимодействия атома из материала (1) с атомом из материала (2) использовались усреднённые константы 1 1 1[ (1) (2)] / 2α α α= + , [ (1) (2)] / 2α α α= + и [ (1) (2)] / 2β β β= + . Силовые константы

1, ,α α β выражаются через независимые модули упругости кубического кристалла 11c , 12c и 44c следующим образом: 1 12 44( ) / 2a c cα = + , 11 12 44( ) / 4a c c cα = − − , 44 12( ) / 8a c cβ = − .

Система уравнений движения атомов имеет вид:

2

'( ) ( , ) ( ', , ) ( ', ), 1, 2,3.i il l

nm n w n q D n n q w n q iω = =∑ (1)

В уравнении (1) n нумерует атомные монослои рассматриваемой наноструктуры, q – это фононный волновой вектор; ω – фононная частота; wi(n,q) – амплитуды компонент вектора смещения; m(n) –

масса узла решётки; ( , ', )ilD n n q – элементы дина-мической матрицы, описывающие взаимодействие атомов n и n’ монослоев.

Рассматриваемая прямоугольная нить имеет две пространственные плоскости симметрии, пересече-ние которых образует ось нити. Из инвариантности системы уравнений по отношению к операции отра-жения в этих плоскостях следует 4 возможных типа решений [8]:

Dilatational: 1 1 2 2 1 2 3 1 2( , ); ( , ); ( , )AS SA SSu x x u x x u x x Diu→ ;

Flexural1: 1 1 2 2 1 2 3 1 2( , ); ( , ); ( , )SS AA ASu x x u x x u x x 1Fiu→ ;

Flexural2 : 1 1 2 2 1 2 3 1 2( , ); ( , ); ( , )AA SS SAu x x u x x u x x 2Fiu→ и

Shear: 1 1 2 2 1 2 3 1 2( , ); ( , ); ( , )SA AS AAu x x u x x u x x Shiu→ .

Здесь S( A ) означает четность (нечетность) функции по отношению к операции обращения знака соответствующей переменной:

1 2 1 2 1 2 1 2( , ) ( , ) ( , ) ( , )SSf x x f x x f x x f x x= − = − → ;

1 2 1 2 1 2 1 2( , ) ( , ) ( , ) ( , )AAf x x f x x f x x f x x= − − = − − → и т.д. Результаты и обсуждение Для отыскания энергетических спектров акустических фононов решалась система уравнений (1).

Были получены дисперсионные соотношения для всех четырех поляризаций. Расчёт проводился для прямоугольной гетеронити с внутренней прямоугольной частью из кремния, имеющей поперечное сечение 5нм х 5нм, в германиевой оболочке, притом что полное поперечное сечение нити бралось равным 8нм х 8нм. Для исследования влияния оболочки наряду с гетеронитью рассматривалась так-же прямоугольная нить без оболочки с поперечным сечением, равным сечению внутренней нити (5нм х 5 нм). Ввиду большого числа поляризаций в квантовых нитях мы будем приводить и обсуждать данные для dilatational поляризации. Полное число фононных ветвей в квантовой нити равняется утроенному числу атомов в поперечном сечении нити. В случае нити размером 8 нм х 8 нм количество фононных ветвей равно 645.

На рис.2 приведены графики дисперсионных кривых dilatational поляризации для нитей: (1а) Si, 5 нм x 5 нм.; (1б) Si/Ge 8нм x 8 нм, поперечное сечение Si нити – 5нм x 5нм. Из приведeнных

Рис.1. Схематичное изображение рассматриваемых прямоугольных квантовых нитей.



271

графиков видно, что при одинаковых q в гетеронити значения энергии фононов ниже, чем в однород-ной нити, благодаря оболочке из Ge, обладающего более низкими упругими свойствами. Сложный ход кривых дисперсии энергии отражается на виде кривых групповых фононных скоростей, описы-

ваемых формулой ( ) ( )dv q qs sdqω= .

Рис.2. Зависимость энергии акустических фононов от волнового числа q для dilatational поляризации в

(а) однородной квантовой нити из Si размером 5нм х 5нм, (б) гетеронити Si/Ge размером 8нм х 8нм (поперечное сечение внутренней нити из Si–5нм х 5нм). Изображены нижайшие 5 уровней энергии,

а также ветви с квантовыми номерами s=10, 20, 30, … 100.

На рис.3 представлены зависимости групповых скоростей dilatational фононных мод от фононного волнового числа q в однородной нити из Si с поперечным сечением 5 нм х 5 нм и в гетеронити Si/Ge с геометрическими размерами 8 нм х 8 нм (поперечное сечение внутренней части Si – 5 нм х 5 нм).

Продольная (8,44 км/с) и поперечная (5,84 км/с) скорости звука в объёмном Si и продольная (4,86 км/с) и поперечная (3,57 км/с) скорости в объёмном Ge на приведенных графиках изображены сплошными горизонтальными линиями.

Рис.3. Дисперсии скорости акустических фононов для dilatational поляризации в (а) однородной

квантовой нити из Si размером 5 нм х 5 нм, (б) гетеронити Si/Ge размером 8 нм х 8 нм (поперечное сечение внутренней нити из Si – 5 нм х 5 нм). Изображены скорости

нижайших 5 акустических ветвей. Из рисунков видно, что: 1) для случая однородной нити и гетеронити скорости всех мод при maxq q= стремятся к нулю; 2) групповая скорость dilatational объёмноподобной моды (s=0) при 0q → в однородной нити

близка к продольной скорости в объёмном Si; 3) групповая скорость для колебательной моды с s=0 при малых q в гетеронити меньше, чем в

однородной нити. Это объясняется влиянием внешней оболочки Ge, обладающего более низкими упругими свойствами по сравнению с Si;



272

4) в случае гетеронити значения групповых скоростей фононов не превосходят значений объёмной скорости в Ge, а для однородной нити скорости не превосходят объёмной скорости в Si,при том, что последняя гораздо выше

Для сравнения полученных результатов с результатами континуального приближения были численно решены уравнения движения (из [8]) для акустических фононов. На рис.4 приведены 3 нижайших фононных ветви, а также фононные ветви с квантовыми номерами s=20, 30, 40, 50.

Как видно из рисунков, континуальное приближение достаточно хорошо описывает нижайшие фононные ветви (s=1-3) при относительно небольших q ( 11,5q нм−= ). С ростом q появляется разница между энергиями, которая при максимальном значении волнового числа становится равной 4-6 мэВ. Энергии более высоких фононных ветвей (s=20-50) отличаются для всех значений волнового числа, причем с ростом q и номера ветви s этот разрыв также увеличивается. Для ветви с s=50 разница в энергиях составляет 7 мэВ для наибольшего q. Следует отметить, что при максимальной величине волнового числа кривые дисперсии в динамической модели становятся плоскими, в то время как в континуальном приближении вблизи maxq кривые имеют значительный наклон. Отличия групповых скоростей, полученных из динамической и континуальной теорий для некоторых дисперсионных кривых, показаны на рис. 5.

Рис.5. Групповые скорости для фононов dilatational поляризации в прямоугольной гетеронити Si/Ge

размером 8 нм х 8 нм (поперечное сечение внутренней Si нити – 5 нм х 5 нм),

рассчитанные в рамках динамической и континуальной моделей.

Как можно видеть из рис.5, для фононной ветви с квантовым номером s=0 для малых 11q нм−<

скорости, полученные в континуальном приближении, близки к скоростям, полученным в динами-ческой FCC-модели. С возрастанием q отличие между скоростями увеличивается и становится наибольшим (3,5 км/с) при максимальном q. Для более высоких уровней энергии (s=10) разность между скоростями возникает даже при малых q и достигает предельного значения, равного 3,5 км/с при maxq q= .

Выводы Развита FCC-динамическая модель колебаний решётки. Найдены энергетические спектры и

групповые скорости фононов в гетеронитях из различных по акустическим свойствам материалов. Рассчитаны дисперсии энергии и скорости в такой модели для однородных нитей и гетеронитей. Изучено влияние оболочки с низкой упругостью на акустические свойства гетеронитей. Произведено сравнение полученных результатов с результатами континуального приближения. Показано, что

Рис.4. Дисперсии энергии для фононов dilatational поляризации в прямоугольной гетеронити Si/Ge

размером 8 нм х 8 нм (поперечное сечение внутренней Si нити – 5 нм х 5 нм), рассчитанные в рамках динамической и континуальной моделей. Показаны 3 нижайших моды, а также ветви с

квантовыми номерами s=20, 30, 40, 50.



273

континуальный подход применим для нижайших фононных ветвей (s<5) и малых значений q (q< 11,5нм− ). Для больших s и q континуальное приближение дает завышенное по сравнению с FCC-динамической моделью значение энергии (на 7-10 мэВ) и скорости (3-4 км/с) акустических фононных мод.

Установленное с использованием FCC-динамической модели понижение энергии и групповых скоростей фононов в гетеронитях может иметь существенное значение при выборе нитей с низкой фононной теплопроводностью.


1. Ансельм А.И. Введение в теорию полупроводников. – Москва: Государственное издательство физико-математической литературы, 1962, с. 66-84.

2. Balandin A.A. Acoustic Phonon Confinement in Nanostructures and its Effect on the Thermal Lattice Conductivity. 11th International Conference on Phonon Scattering in Condensed Matter Physics, St. Petersburg, Russia, July, 2004, Book of Abstract, pp. 6-7.

3. Balandin A. and Wang K.L. // Phys. Rev. B. – 1998. – Vol. 58. – P. 1544. 4. Farvacque J.L. and Bouqrioua Z. // Phys. Rev. B. – 2003. – Vol. 68. – P.035335. 5. Bannov N., Aristov V., Mitin V. and Stroscio M.A. // Phys. Rev. B. – 1995. – Vol.51. – P. 9930. 6. Mingo N. and Liu Yang // Phys. Rev. B. – 2003. – Vol.68. – P.245406-1. 7. Tubino R., Piseri L. and Zerbi G. // J. Chem. Science. – 1972. – Vol.56. – P.1022. 8. Nika D., Zincenco N. and Al-Sabayleh M. // Mold. J. Phys. Sc. – 2006. – Vol.V. – P.103.

Работа выполнена при финансовой поддержке INTAS (грант 05-104-7656), а также проектов РМ

06.408.036F и 06.35.CRF.




274

ИСПАРЕНИЕ ХАЛЬКОГЕНИДНЫХ СТЕКЛООБРАЗНЫХ ПОЛУПРОВОДНИКОВ

ПРИ ПУЗЫРЬКОВОМ МЕХАНИЗМЕ РАЗОГРЕВА

МАТЕРИАЛА В ИСПАРИТЕЛЕ

Владимир ПРИЛЕПОВ, Севастьян НЯМЦУ, Олег КОРШАК, Дорин СПОЯЛЭ

НИЛ фототермопластической записи Se descrie procesul formării vaporilor la evaporarea prin bule a materialelor semiconductoare. Micşorarea energiei

libere a suprafeţei evaporatorului stabilizează centrele de formare a bulelor, ceea ce duce la stabilizarea vitezei de eva-porare a semiconductoarelor vitrefice de pe toată suprafaţa evaporatorului.

The process of vaporization upon bubble boiling of HGS in the evaporator is described. It is shown that reduction of

evaporator surface free energy stabilize the centers of bubbles generation and thereby provide the stable speed of HGS evaporation from the whole active surface of evaporator.

Тонкие пленки халькогенидных стеклообразных полупроводников (ХСП) находят широкое приме-

нение как в практических целях, так и при научных исследованиях [1]. Низкие температуры испарения, хорошая смачиваемость ХСП практически любых поверхностей испарителей, высокая временная стабильность аморфной фазы тонких пленок обеспечивают простоту получения слоев ХСП. Вместе с тем, получение тонких пленок ХСП в виде длинных лент из испарителей открытого типа требует более тщательного установления режимов испарения и применения метода многократных покрытий, что приводит к снижению дифракционной эффективности носителей за счет межслойных дефектов [2]. При получении тонких пленок As2Se3, пластифицированного малыми добавками Sn, авторы [3] применили дискретный метод, что связано с трудностями процесса испарения данного материала.

Ранее было показано [4], что в области температур, обеспечивающих пузырьковое кипение жид-кости ХСП в испарителе открытого типа, характер конденсата приобретает равномерную однородную структуру.

Из физики кипения жидкостей известно [5,6], что для образования пузырьков газа при пузырько-вом кипении необходимы ядра, хотя и очень малого, но конечного диаметра. Такими ядрами могут стать микроскопические дефекты и полости на поверхности твердого тела. Для того чтобы полости действовали в качестве устойчивых центров образования пузырьков, необходимо, чтобы удовлетво-рялись следующие условия: проникновение пара внутрь полости; динамическая устойчивость движе-ния поверхности раздела газ-жидкость внутри полости; статистическое равновесие роста пузырьков, достигших выходного отверстия полости. На рис.1 представлена схема равновесия для границы трех

фаз: твердое тело (3), жидкость (2), газ (1), небольшой капли, расположенной на поверхности твердого тела. Можно записать:

Θ=− cosLVSLSV σσσ или LV

SLSV

σσσ −

=Θcos , (1)

где σSV – поверхностное натяжение между твердым телом и газом, σSL –поверхностное натяжение между твердым телом и жидкостью, σLV – поверхностное натяжение между газом и жид-костью, Θ – краевой угол смачиваемости. Хотя и нельзя независимо изменять поверхностное натяжение жидкости σLV, все же при увеличении σLV краевой угол возрастает и поверх-ность все хуже смачивается жидкостью, при этом возрастает

время освобождения поверхности от пузырьков. Для учета устойчивости полости на поверхности нагрева, являющейся центром зарождения пузырьков, рассмотрим характеристику объема пара, захваченного конусовидной полостью (рис.2).

3

21

Θ O

OσSV σSL σLVcosΘ

σLV

Рис.1. Равновесие на границе трех фаз: газ – 1, жидкость – 2, твердое тело – 3.


Fizică ISSN 1857

275

(a) (б)

Рис.2. Статистическая устойчивость полости. 1 – жидкость, 2 – пар; (а) – хорошее смачивание,

ϕπ+<Θ

2; (б) – плохое смачивание, ϕπ

+>Θ2

.

Угол в вершине полости – 2ϕ, краевой угол – Θ. В этом случае радиус кривизны R поверхности

раздела газ – жидкость принимает вид

( )

( ) ),(2

:

),(2

:;

2sin

sin

b

aXR

ϕπ

ϕππϕ

ϕ

+>Θ−

+<Θ+⋅⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ±−Θ

=

где X – длина образующей коническую поверхность. В обоих случаях коэффициент при X в правой части положителен.

Давление пара внутри полости Рv может быть представлено через радиус кривизны и давления жидкости на полость Р∝:

( )

( ) ),(2

:

),(2

:;2

b

aR

PP LVV

ϕπ

ϕπσ

+>Θ−

+<Θ+±= ∞

(3)

В случае рис.2а, или при малой длине X, давление пара увеличивается и соответствующая ему температура насыщения повышается. Если эта температура станет выше локальной температуры части основного объема пара, то в объеме пара освободится скрытая теплота и произойдет конден-сация. В результате уменьшится объем пара, и этот процесс будет повторяться, пока не наступит термодинамическое равновесие между газом и жидкостью. В случае рис.2б, давление внутри объема пара будет падать и соответствующая этому давлению температура насыщения будет уменьшаться, в результате чего будет достигнуто равновесие, соответствующее давлению РV. Если поверхностное натяжение жидкости σLV велико, или мало натяжение на поверхности раздела твердое тело – пар σSV, или при выполнении обоих условий краевой угол Θ (формула 1) будет увеличиваться, то объем пара, захваченного полостью, стабилизируется. Таким образом, происходит стабилизация центров образо-вания пузырьков. Наиболее простым способом стабилизации полости на поверхности испарителя является использование поверхности нагрева с малой свободной энергией или снижение свободной энергии поверхности на внутренних стенках полостей.

1

Θ

2ϕ R

X

2

1

Θ

2ϕ

R

X 2

(2)



276

Рис.3. Зависимость толщины слоев As2S3 (1) и As2Se3 (2) от времени испарения на неподвижную подложку.

Экспериментально было показано, рис.3, что снижение поверхностной энергии испарителя откры-

того типа из нержавеющей стали за счет его активации приводит к постоянству скорости конденса-ции (испарения) материалов ХСП. Именно такие испарители были использованы для получения варизонных переходов заданного состава как на неподвижных подложках, так и в виде рулонного материала [7,8].


1. Панасюк Л.М. Тезисы докладов на Международном Конгрессе по высокочувствительной фотографии и фотонике. - Москва, 1980, c.318.

2. Ишимов ВМ., Сенокосов Э.А., Дементьев И.В., Гоглидзе Т.И. Технологические условия оптимизации опто-электронных параметров пленок стеклообразных полупроводников, получаемых на рулонной основе // Письма в ЖТФ. - 2002. - Т.28. - Вып.16. - С.79-84.

3. Иову М.С., Коломейко Е.П., Шутов С.Д. Влияние примеси олова на кинетику фотопроводимости тонких аморфных слоев селенида мышьяка // ФТП. - 1997. - Т.31. - С.836-840.

4. Панасюк Л.М., Прилепов В.Д. Особенности кинетики испарения стеклообразных халькогенидов мышьяка // Analele Ştiinţifice аle USM. Seria „Ştiinţe fizico-matematice”, 2001, с.159-161.

5. Несис Е.И. Кипение жидкости. - Москва: Наука, 1973. 6. Петухов Б.С., Гешин Л.Г., Ковалев С.А. Теплообмен в ядерных энергетических установках. - Москва:

Атомиздат, 1974. 7. Прилепов В.Д. Тонкие пленки халькогенидных стеклообразных полупроводников переменного состава //

Studia Universitatis. Seria „Ştiinţe ale naturii”. - Chişinău. - 2007. - Nr.1. - P.307-309. 8. Коршак О.Я., Нямцу С.Н., Наседкина Н.В. Elaborarea tehnologiilor de depunere în vid a structurii varizonice

(As2Se3-As2S3+Sn) // Studia Universitatis. Seria “Ştiinţe ale naturii”. - Chişinău. - 2007. - Nr.1. - P.304-306.


2 4 6 8 103 5 7 9t, min

0

4

8

12

16

d, µ

m

1

2



277

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАНОКОМПОЗИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

ДЛЯ ДАТЧИКОВ МИКРОЭЛЕКТРОНИКИ

Петр ГАШИН, Владимир ПРИЛЕПОВ*, Дорин СПОЯЛЭ**

НИЛ физики полупроводников *НИЛ фототермопластической записи **НИЛ сверхпроводимости и магнетизма

În prezenta lucrare sunt cercetate materialele nanocompozite pe baza metalelor greu fuzibile şi a oxizilor lor.

Proprietăţile funcţionale determinate permit utilizarea acestor materiale la crearea senzorilor cu destinaţie specială. In the presented paper the electro-physical properties of nanocomposite thin films on the basis of V, Cr and their

oxides are investigated. The possibility to use nanocomposite materials in sensor electronics is considered. В настоящее время происходит непрерывный процесс усложнения функций, выполняемых элект-

ронной аппаратурой, количество элементов которой резко возрастает. Возникает потребность в со-здании и использовании многофункциональных сред, которые обеспечивали бы адекватное отобра-жение требуемой функции с помощью возникающих в материале физических явлений.

Известно [1], что нанокомпозитные системы типа металл-диэлектрик (Ме-Ди) могут вести себя и как изолятор, и как проводник. Если предположить объемную концентрацию металла, равную p, то при некоторой концентрации металла pc система испытывает переход диэлектрик-металл (протекание, перколяция, активация), и суммарная проводимость смеси (σΣ) изменяется по закону σΣ=σm(p-pc)t, где σm – проводимость металла, t – некоторый индекс. Универсальность параметра t экспериментально хорошо согласуется с теоретическими вычислениями и для различных структур расположена в пре-делах 0,8-1,7 [2]. Вблизи порога протекания структура характеризуется аномальным поведением про-водимости в зависимости от внешнего воздействия: давления, влажности, температуры и т. д. Наличие тонких связей между проводящими кластерами вблизи порога протекания делают нанокомпозит Ме-Ди чувствительным к внешним воздействиям. В этой связи особый интерес представляют нанокомпозит-ные системы типа металл-диэлектрик (Ме-Ди), связанные размерными эффектами. Соотношение кон-центраций диэлектрической (NДи) и металлической (NМе) составляющих в материале определяет но-минал сопротивления тонкопленочного резистора, механизмы проводимости, величину и знак ТКС.

Нанокомпозитный материал представляет собой диэлектрическую матрицу с равномерно распре-деленными в ней проводящими наночастицами с суммарной толщиной слоя 40-60 нм. Исходными материалами являются тугоплавкие металлы и их окислы. Низкоэнергетические процессы получения и выбранные условия формирования нанокомпозитных структур обусловливают высокую временную стабильность электрофизических параметров слоев и их управляемость.

При изучении слоев на основе ванадия и его окислов наблюдается существенная разница в вели-чине продольного и поперечного сопротивлений. В продольном направлении (NДи>NМе) получаем R=106÷108 Ом/, а в поперечном направлении (NДи<NМе) R=≤1,5-3,0 Ом. ТКС положителен. Термо-чувствительность резистивных пленок в продольном направлении в интервале 293-440К составляет -2400К. В поперечном направлении те же слои в области температур 403-413К переходят из проводя-щего состояния в непроводящее и при снижении температуры полностью воспроизводят ВАХ системы.

Наблюдаемый фазовый переход второго рода [3] определяется размерными эффектами пленки: соотношением толщины слоя, размерами проводящих наночастиц и площадью контакта. Фазовый переход не наблюдается при площади контакта, большей 1,5 мм2, а при контакте с площадью, меньшей 0,25 мм2, более точно устанавливается критическая температура перехода. Температуру фазового перехода можно изменять как условиями формирования структур, так и допированием пленок малой концентрацией Ме, т.е. изменением состава и величины NДи и NМе. Таким образом, на данном мате-риале может быть реализован датчик фиксированной температуры и реле отключения при достижении заданной температуры.



278

Тонкие пленки на основе хрома и его окислов обладают выраженной точкой перколяции, обусло-вливающей смену знака ТКС в зависимости от режимов обработки. Наличие минимального ТКС ∼10-6 град-1 (рис.1) позволяет использовать данный материал в тензометрии, поскольку отпадает надоб-ность в термокомпенсации как измеряемого сопротивления, так и термочувствительности. Тензочувстви-тельность нанокомпозитных структур оценивалась балочным методом в предположении, что отклоне-ние подвижного конца балки δ(0) пропорционально приложенной силе F, а изменение сопротивления тензорезистора ∆R/R пропорционально относительной деформации ε=∆l/l, т.е. ∆R/R=kε (рис.2).

Рис.1. Изменение ТКС структуры в зависимости от температуры обработки.

Рис.2. Изменение относительного сопротивления RR∆в зависимости от δ.

Полученные значения тензочувствительности в 2,5 раза выше, чем у промышленных тензодатчи-ков на основе нихрома. Данные слои были использованы для изготовления датчиков касания с тензо-метрическим эффектом [4]. В предлагаемой конструкции между нагрузочным контактом и поверхно-стью резистивной пленки введен дополнительный потенциал. В момент контакта небольшое на-

-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3δ, mm

-40

-20

0

20

40

-30

-10

10

30

∆R R

×105

50 100 150 200 250 300t, °C

-40

-20

0

20

40

60

TKC×

106 ,

1/°C



279

пряжение U распределяется на малых толщинах зазора, что приводит к изменению сопротивления за счет сильного поля, т.е. практически не нарушается совместимость с измерительным устройством. Верхний контакт можно связать с мембраной или концентратором, расширяя диапазон измерений.

Функциональные свойства нанокомпозитных пленок обусловлены малыми размерами проводящих кластеров, наличием диэлектрической прослойки между ними и квантованием заряда. В определен-ных условиях проводимость наночастиц будет обусловливаться надбарьерным тепловым потоком электронов между наночастицами, т.е. система из двух металлических кластеров образует не туннель-ный контакт, а обычный конденсатор. В этом случае дифференциальная ёмкость двух проводящих кластеров осциллирует или имеет резонансный характер, подобно поведению ёмкости отдельных гранул, внедренных в изолирующий слой туннельного перехода [5].

На исследованных нанокомпозитных структурах нами наблюдалось увеличение зарядового состоя-ния от приложенного электрического поля, что приводит к “прыжковому” увеличению электрического тока через образец (рис.3).

Рис.3. ВАХ нанокомпозитных материалов на основе ванадия и его окислов.

Резонансный характер осциллирующих проводящих кластеров наблюдался нами при воздействии на кровь человека [6]. При прикладывании нанодисперсного слоя к пальцу на 3-5 минут последующий анализ крови на диффузном микроскопе показывает увеличение скорости движения эритроцитов примерно на порядок, при этом происходит их расклеивание. В заключение следует отметить, что любой датчик определяется целевым назначением, конструктивными и эксплуатационными особен-ностями, требованиями отраслевого характера, а предлагаемые функциональные материалы могут быть использованы в качестве чувствительных элементов, обеспечивающих улучшение параметров приборов и придание им новых, порой непредсказуемых возможностей.


1. Cheriet L. et. al. Metal-insulator transition in thin nickel films // Phys. Rev. B. – 1989. – Vol. 39. – Nо14. – P.9828-9830. 2. Gadenne M., Gadenne P. Electrical and optical properties of Au-Al2O3 films, dimensionality effects // Phys. A. –

1989. – Vol. 157. – P. 344-351. 3. Прилепов В. О фазовом переходе в тонкопленочной структуре металл-диэлектрик на основе ванадия //

Analele Ştiinţifice ale USM. Seria „Ştiinţe fizico-matematice”. – Chişinău, 2001, p. 162-164. 4. Prilepov V., Sergentu V. Датчик касания со свойствами тензоэлемента // Tezele Conferinţei Corpului didactico-

ştiinţific al Universităţii de Stat din Moldova. – Chişinău, 1995, p.93. 5. Медведев Ю., Гришин А. Зарядовое состояние проводящих мелкодисперсных систем в диэлектрической

матрице // ФТТ. – 2001. – Том 43. – Вып. 5. – C. 900-905. 6. Prilepov V., Spoiala D. Nanostructured Dispersed Films in Biomedicine for Human Heals // The 4-th Intern. Conf.

on Microelectronics and Computer Science. Chisinau, 15-16 september, 2005. – Chişinău, 2005, p. 276-279.

0.01 0.1 1U, V

1E-005

0.0001

0.001

0.01

0.1

I, A



280




280

ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛОНОВСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

В КВАНТОВОЙ ТОЧКЕ Si/SiO2

Калина ИСАКОВА, Денис НИКА, Артур АСКЕРОВ, Надежда ЗИНЧЕНКО, Евгений ПОКАТИЛОВ

Кафедра теоретической физики În lucrare sunt prezentate cercetările distribuţiei potenţialului în punctul cuantic din Si plasat în mediu dielectric SiO2.

Au fost cercetate dependenţele distribuţiei potenţialului de mărimea razei sferei din Si. Au fost comparate distribuţiile potenţialului pentru diferite permitivităţi electrice ale sferei.

In this paper the investigations of the distribution of the coulomb interaction potential in silicon quantum dot

imbedded in the dielectric medium from SiO2 have been fulfilled. Dependence of the interaction potential on the Si- quantum dot radius has been obtained and investigated in details. The comparison between distributions of Coulomb interaction potentials with different permittivity of the quantum dot has been carried out.

Два последних десятилетия развития физики свидетельствуют о появлении нового направления в

физике твёрдого тела и полупроводников, изучающего свойства наноразмерных структур: квантовых слоёв, квантовых нитей и квантовых точек. Существенный прогресс в развитии технологии изготов-ления таких структур [1-4], достигнутый за последнее десятилетие, стимулирует как интенсивные теоретические, так и экспериментальные исследования наноструктур различной формы [1-6]. Хорошо известно, что в квантовых точках, помещенных в вакуум или диэлектрическую среду, можно светом возбудить экситоны и после их рекомбинации наблюдать излучение света высокой монохроматично-сти [7]. Длина волны излучаемого света зависит от материальных и геометрических параметров кван-товых точек и окружающей среды. Было также показано, что энергия возбужденных экситонных состояний может нерадиационно передаваться акцепторам энергии, локализованным вблизи кванто-вой точки. Этот процесс играет важную роль [1] в биомедицине в целях разрушения клеток ново-образований направленным лазерным излучением и [2] в оптоэлектронике наноразмерных структур для создания оптических усилителей и оптических преобразователей частоты. Для теоретического изучения механизма передачи энергии от экситона к акцептору необходимо рассчитать энергетиче-ские спектры экситона. Для этого надо, в свою очередь, найти потенциал кулоновского электронно-дырочного взаимодействия.

Нами поставлена задача исследования распределения кулоновского потенциала электрического поля, создаваемого точечным зарядом, в квантовой точке из Si, находящейся в среде SiO2. Рассматри-ваемая квантовая точка имеет сферическую форму и нанометровые размеры; расчеты проводились для точек размером 1 нм, 1,5 нм, 2 нм. Диэлектрическая проницаемость материала точки отличается от диэлектрической проницаемости среды. Оптические свойства таких квантовых точек эксперимен-тально изучались в [7].

Исследованы зависимости распределения потенциала от размеров сферы и расположения заряда, а также выполнены модельные расчеты для различных диэлектрических проницаемостей точки и среды.

Теоретическая модель Потенциал электрического поля находился из уравнения Максвелла: ( )div grad 4 ,ε ϕ πρ= − (1)

где ε − диэлектрическая проницаемость среды, ϕ − потенциал поля, ρ − плотность электрического заряда. В рассматриваемом случае диэлектрическая проницаемость неоднородна, поэтому при взятии производных в уравнении (1) необходимо учитывать зависимость ε от координат. В этом случае уравнение (1) можно представить в виде:



281

22 2

2 2 2 4y y yx x x z z z

x x x y y y z z zε ϕ ϕε ϕ ϕ ε ϕ ϕε ε ε πρ∂ ∂ ∂∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂

+ + + + + = −∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂

. (2)

Для решения уравнения (2) использован численный метод конечных разностей. В соответствии с данным методом [8], уравнение (2) записывается в следующей форме:

( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )

( )

2

2

1, , 1, , 1, , 1, ,2 2

1, , 2 , , 1, ,

, 1, , 1, , 1, , 1,2 2

, 1, 2 , , , 1,

, , 1 , , 1 , , 1 , , 12 2

, , 1 2

i j k i j k i j k i j kx x

i j k i j k i j kx

i j k i j k i j k i j ky y

i j k i j k i j ky

i j k i j k i j k i j kz z

i j k

ϕ ϕ ε ε

ϕ ϕ ϕε

ϕ ϕ ε ε

ϕ ϕ ϕε

ϕ ϕ ε ε

ϕ ϕε

+ − − + − −+

∆ ∆+ − + −

+ +∆

+ − − + − −+ +

∆ ∆

+ − + −+ +

∆

+ − − + − −+ +

∆ ∆+ −

+( ) ( )

2

, , , , 14 ( , , ).

i j k i j ki j k

zϕ

πρ+ −

= −∆

(3)

Уравнение (3) представляет собой систему неоднородных линейных уравнений относительно неизвестных значений потенциала в точках разбиения ( ), ,i j kϕ . Данная система решена с помощью численного итерационного метода Якоби – Зейделя.

Граница расчетной области взята на расстоянии 2-3 радиусов сферы [9]. В качестве граничных условий выбраны значения классического сферического кулоновского потенциала с диэлектрической проницаемостью внешней среды.

Для учета плавности перехода диэлектрической проницаемости использована аппроксимирующая одномерная экспоненциальная функция:

( ) ( )( ) ( )

2

2

,

exp exp( ) ,

exp exp

,

d d

d d 1 m dd d

d 1 d

m d

r R dint

r R e r R ef r R dint r R dext

r R e r R e

r R dext

ε

ε ε

ε

≤ −⎧⎪

⋅ − − ⋅ + ⋅ − ⋅⎡ ⎤ ⎡ ⎤⎪ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦= − < < +⎨− − ⋅ + − ⋅⎡ ⎤ ⎡ ⎤⎪ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦

⎪ ≥ +⎩

, (4)

где r расстояние от центра сферы до расчетной точки, R радиус сферы, ,dint dext область аппроксимации внутри и снаружи сферы соответ-ственно, ,m dε ε диэлектрические проницае-мости среды и точки, 1 2e ,e параметры. В работе использованы следующие величины параметров:

0,2nmdint dext= = , 1 2 20e e= = . При расчете распределения потенциала точеч-

ный заряд заменен на размазанный по объему пятой части ячейки разбиения, поэтому в точке нахождения заряда потенциал имеет максимум конечного значения (см. рис. 1). Рис.1. Распределение потенциала на поверхности

расчетной области. Заряд находится вне сферы из Si.



282

Результаты и обсуждение На рис. 2-4 показано распределение потенциала ( )rϕ в зависимости от положения заряда: в

центре сферы (рис. 2), вблизи центра сферы (рис. 3) и в окружающей среде на расстоянии 0,75 нм от точки (рис. 4), а также показаны зависимости сферически-симметричного кулоновского потенциала от r с диэлектрическими проницаемостями внешней (пунктирная линия) и внутренней (штриховая линия) среды. Видно, что в случае, когда заряд находится вне сферы, потенциал электрического поля в ней практически совпадает со сферически-симметричным потенциалом, создаваемым точечным зарядом с диэлектрической проницаемостью внешней среды mε . В случае, когда заряд находится внутри сферы (рис. 2 и 3), потенциал электрического поля вблизи заряда больше похож на значение кулоновского потенциала с диэлектрической проницаемостью сферы dε . С увеличением расстояния от заряда к краям сферы кривая потенциала начинает плавно приближаться к сферическому кулонов-скому потенциалу с диэлектрической проницаемостью внешней среды mε и вблизи границы расчетной области практически совпадает с ним.

Рис.2. Распределение потенциала для заряда, находящегося в центре сферы.

Пунктирная линия dε ; штриховая линия mε ; сплошная линия – расчетный потенциал с аппроксимирующей функцией.

Рис.3. Распределение потенциала для заряда, находящегося вблизи центра сферы.

Заряд находится около центра точки. Пунктирная линия dε ; штриховая линия mε ; сплошная линия – расчетный потенциал с аппроксимирующей функцией.



283

Рис.4. Распределение потенциала для заряда, находящегося вблизи центра сферы. Заряд находится вне точки. Пунктирная линия dε ; штриховая линия mε ; сплошная линия – расчетный потенциал с аппроксимирующей функцией.

На рис. 5 показана зависимость потенциала от диэлектрической проницаемости сферы. Видно,

что с уменьшением различия в диэлектрических проницаемостях уменьшается излом потенциала на границе сферы и что потенциал по абсолютному значению увеличивается с уменьшением диэлектри-ческой проницаемости сферы.

Рис.5. Распределение расчетного потенциала для различных диэлектрических

проницаемостей внешней среды mε (заряд находится в центре сферы).

На рис. 6 представлена зависимость потенциала от радиуса сферы. Из этого графика следует, что потенциал внутри сферы растет по абсолютному значению с уменьшением радиуса сферы.

Рис.6. Распределение расчетного потенциала для сфер различных радиусов

(заряд находится в центре сферы).



284

Выводы В работе исследовано распределение кулоновского потенциала взаимодействия электрона и дырки

в сфере из Si, помещенных в диэлектрическую матрицу из SiO2. Исследованы зависимости распреде-ления потенциала от размера сферы и величины диэлектрической проницаемости внутри сферы. Показано, что потенциал внутри сферы уменьшается по абсолютному значению с ростом радиуса сферы и с увеличением диэлектрической проницаемости сферы.


1. Alivisatos A.P. Perspectives on the Physical Chemistry of Semiconductor Nanocrystals // J. Phys. Chem. – 1996. – Vol. 100. – P.13226.

2. Poole Ch. P, Owens Ch. P. Introduction to Nanotechnology. – John Wiley &Sons, Inc, Publ., 2003. 3. Efros Al., Lockwood D.J., Tsybeskov L. Semiconductor Nanocrystals: From Basic Principles to Applications,

Series: Nanostructure Science & Technology. – Springer Publ., 2004. 4. Kovalev D., Gross E., Kuenzner E., Koch F., Timoshenko V. Yu., Fujii M. Resonant electronic energy transfer from

excitons confined in silicon nanocrystals to oxygen molecules // Phys. Rev. Lett. – 2002. – Vol. 89. – P.137401. 5. Bakalova R., Ohba H., Zhelev Z., Nagase T., Jose R., Ishikawa M., Baba Y. Quantum dot anti-CD conjugates: are

they potential photosensitizers or potentiators of classical photosensitizing agents in photodynamic therapy of cancer? // Nano Lett. – 2004. – Vol. 4. – P.1567.

6. Wang S., Gao R., Zhou F., Selke M. Nanomaterials and Singlet Oxygen Photosensitizers: Potential Applications in Photodynamic Therapy // J. Mat. Chem. – 2004. – Vol. 14. – P.487.

7. Timoshenko V.Yu., Lisachenko M.G., Kamenev B.V., Shalygina O.A., Kashkarov P.K., Heitmann J., Schmidt M., Zacharias M., Highly efficient sensitizing of erbium ion luminescence in size-controlled nanocrystalline Si/SiO2 superlattice structures // Appl. Phys. Lett. – 2004. – Vol. 84. – P.2512.

8. Тихонов А.Н., Самарский А.А. Уравнения математической физики. – Москва: Издательство МГУ им. М.В. Ломоносова, 2004, c.798. Работа выполнена при финансовой поддержке фонда INTAS (грант 05-104-7656), а также

государственных проектов ЗЬ 06.406.036F и 06.35 CRF.




285

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРИБОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

НЕКОТОРЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ

Александр КРАЧУН, Виктор МОРАРУ*, Светлана КРАЧУН**, Елена БУНДУКИ*** НИЛ защиты атмосферы, *Технический университет Молдовы, **Кафедра аналитической и органической химии, ***Кафедра промышленной и экологической химии Au fost studiate proprietăţile tribologice ale unor uleiuri vegetale, inclusiv ale uleiurilor obţinute din sâmburi de

fructe. A fost demonstrat că cel mai efectiv este uleiul din seminţe de rapiţă. Tribologic properties of some vegetable oils including oils from fruit stones have been investigated. It is shown, that

the most effective vegetable oil is a rape seed oil. Основным источником для получения дисперсионных сред (масел) для пластичных смазок являет-

ся нефть. Однако цены на нее постоянно растут, так как основные запасы нефти в мире находятся в распоряжении стран ОПЕК, которые диктуют мировые цены на нее, что, в свою очередь, определяет экономическую безопасность государств, обделенных запасами нефти в своих недрах. Следовательно, такие страны попадают в зависимость от стран, добывающих и реализующих нефть и нефтепродукты. Поэтому все большее внимание привлекают альтернативные, возобновляемые ресурсы для получения горючесмазочных материалов.

Цены на нефть и нефтепродукты – главный фактор, оказавший влияние на интенсивность иссле-дований о возможных способах получения топлива и смазочных мaтериалов из ресурсов раститель-ного происхождения.

В последнее время возросла рентабельность масличных культур, из которых можно получать рас-тительные масла, экологически чистое моторное топливо, масла и смазки: это рапс, хлопчатник и др. По данным продовольственной и сельскохозяйственной организаций ООН, в 2003-2004 гг. было собрано 36 млн.т семян рапса, а в 2004-2005 – 46 млн.т, которые перерабатываются в рапсовое масло для получения пищевого продукта, а также для производства смазочных материалов и биодизеля – топлива для дизельмоторов.

В Молдове сырьем для получения топлива и смазок может служить также масло, получаемое из семян винограда. В виноградных выжимках содержится до 25% семян, являющихся отходами вино-дельческих и сокоэкстракционных производств, перерабатывающих ягоды винограда.

Проведенные УкрНИИНП исследования показали, что по трибологическим свойствам раститель-ные масла и их производные значительно превосходят нефтяные масла. Высокая смазочная способ-ность сложных эфиров дает возможность уменьшить использование химически активных присадок, что существенно увеличивает экологические преимущества растительных жиров. По этой причине в Германии ежегодно расходуется 35-40 тыс.т смазочных материалов на основе рапсового масла.

Из растительных масел можно изготавливать консервационные средства для временной защиты металлов от коррозии, например – при открытом хранении техники. Можно использовать рапсовое масло в качестве компонента индустриальных и трансмиссионных масел. В ФРГ смазочные материа-лы на биооснове производят в виде индустриальных, трансмиссионных и энергетических масел из рапса и продуктов его переработки. Такие масла на 10-15% дороже минеральных (нефтяных) масел, но они обладают лучшими смазочными свойствами и более высоким индексом вязкости. Если у ин-дустриальных масел индекс вязкости 85-90, у трансмиссионных 90-100, то для биомасел из рапса он равен 150-180, что особенно важно для всесезонных масел, вязкость которых не должна существенно меняться в широком диапазоне температур.

Ежегодно, начиная с 1990 г., общемировой прирост производства биомасел составляет около 10%.



286

Растительные масла обладают большой молекулярной массой (табл.1) [1-3], что позволяет исполь-зовать их как в качестве самостоятельных смазочных сред, так и в качестве дисперсионных сред при изготовлении высокоэффективных пластичных смазок, как многоцелевых и специальных, так и для работы в условиях вакуума.

Таблица 1

Основные показатели растительных масел

Из семян Из косточек Показатель клеще-

вины вино-града

тома-тов

рапса арахиса куку-рузы

подсол-нечника

слив абри-косов

вишни Олив-ковое

Плотность при 15°С, г/см3

0,962

0,909… 0,956

0,920… 0,929

0,911…0,918

0,911… 0,929

0,924

0,924

0,91.. 0,920

0,915… 0,921

0,921.. 0,929

0,917

Темпера-тура за-стывания, °С

-18… -10

-20… -10

-12… -7

-10… -4

-3… +3

-15… -10

-19… -16

-8… -5

-22… -12

- 20… +16

-6… -2

Температу-ра деструк-ции, °С

240 … 250

Молекуляр-ная масса

850 … 940

Йодное число

84.. 88 - - 94.106 83…108 - 127..136 - - - 75..88

Дистилля-ционное число

33,5

-

-

36,5

53

-

25

-

-

-

54

Целью предпринятых нами исследований являлось определение наиболее пригодного раститель-

ного масла для использования его в качестве дисперсионной среды (взамен минерального масла) при изготовлении многоцелевой пластичной смазки, на базе которой будут изготавливаться и некоторые специальные пластичные смазки.

Трибологические свойства растительных масел исследовали на четырехшариковой (ЧШМ) машине трения по методике, изложенной в ГОСТ 9490-75: частота вращения верхнего шара 1420-1460 мин-1; осевая нагрузка повышалась ступенчато до наступления сваривания шаров; продолжительность одного испытания 10 с; идентификация нагрузки заедания осуществлялась по резкому изменению диаметров пятен изнашивания на нижних шарах, а также расчетами. На каждой осевой нагрузке проводилось по три эксперимента с поворотом нижних и верхнего шара после каждого эксперимента и с добавлением новой порции масла перед очередным экспериментом. Использовались шары диаметром 12,7 мм из стали ШХ-9 с твердостью HRC 60…62. Температура масел при испытаниях была равной 292…294К. Перед экспериментом шарики промывали в бензине и осушали медицинской ватой.

На рис.1. представлена схема рабочего узла ЧШМ трения. В нижней чашке (1) закреплены три равнорасположенных по окружности шарика (2). Сверху на них упирается зафиксированный в шпин-деле (4) верхний шарик (3), который прижат к шарикам (2) с заданным осевым усилием. Чашка (1) заполняется испытуемым маслом (5). Шарик (3) совместно со шпинделем (4) приводится во враще-ние и скользит по закрепленным шарикам (2). Чашка (1) расположена на подшипниковой опоре (6), но удерживается от поворота тягой (7), соединенной с тензометрическим динамометром (8).

Оценочными показателями противоизносных свойств масел служили величины диаметров пятен изнашивания, образующихся на нижних шарах; dиз.ср. – средняя величина измерений трех пятен изна-шивания, каждое из которых измерялось c помощью микроскопа МБС-2 при 24-кратном увеличении, вдоль и поперек рисок изнашивания.



287

В конце каждого эксперимента измеря-ли величину силы трения, возникающего при контакте нижних шаров с верхним, с помощью тензометрического динамомет-ра, связанного с нижней чашкой машины трения. Электрический сигнал от динамо-метра через усилитель ТА-5 фиксировался стрелочным микроамперметром М266М, шкала которого была проградуирована на величину силы трения, которая затем пересчитывалась в коэффициент трения (формула 3), являющийся показателем антифрикционных свойств растительного масла.

Противозадирные свойства раститель-ных масел оценивались по величине крити-ческой нагрузки (заедания) – Ркр., индексу задира – Из и нагрузке сваривания – Рсв.. Первые две величины рассчитывали по ве-личинам, полученным при испытаниях на ЧШМ трения, а также идентифицировали Ркр. из зависимости dиз.ср= f(Рос). Нагрузку сваривания Рсв. определяли эксперимен-тально. Нагрузкой сваривания считают

наименьшую нагрузку, при которой произошла автоматическая остановка ЧШМ трения при дости-жении момента трения 12 Н·м или произошло сваривание шариков.

Критической нагрузкой (Ркр.) считают нагрузку, при которой средний диаметр пятна изнашивания на нижних шариках находится в пределах значений величины предельного износа (dr+0,15) для дан-ной нагрузки и увеличение которой на величину последующей нагрузки по ряду нагрузок вызывает увеличение среднего диаметра пятна изнашивания на величину, более 0,1 мм.

Для определения индекса задира (Из) предварительно вычисляют величину условной нагрузки (Q) в Н по формуле

Q = P dr/dиз.ср., (1) где Р – осевая нагрузка, Н;

dr – диаметр площади упругой деформации по Герцу при нагрузке Р, мм; dиз.ср. – средний диаметр пятна изнашивания при нагрузке Pi , мм (Рi–осевая нагрузка i-го

испытания). Величина произведения Рi·dr, постоянная для испытания с данной нагрузкой, приведена в

ГОСТ 9490-75. При вычислении Q принимают dr=dиз.ср. в интервале от начальной нагрузки (200Н) до критической

без проведения испытаний. Индекс задира вычисляют по формуле

Из= ∑Q / n, (2) где ∑Q – сумма величин условной нагрузки: от начальной и до нагрузки, предшествующей нагрузке сваривания;

n – количество испытаний. Величина коэффициента кинетического трения подсчитывалась по формуле:

f = 10,82 Fтр./ Pос., (3) где Fтр. – сила трения при контакте шаров с ЧШМ трения, Н; Рос. – осевая нагрузка на пирамиду из четырех шариков, Н.

N 4 5 8 3 7 2 1 6

Рис.1. Схема рабочего узла ЧШМ трения: 1 – нижняя чашка; 2 – нижние три шарика; 3 – верхний шарик; 4 – шпиндель; 5 – испытуемое масло; 6 – подшипниковая опоранижней чашки; 7 – тяга; 8 – динамометр.



288

Формула (1) получена из условия равновесия нижней чашки с тремя шарами под воздействием момента трения, создаваемого силами трения в контакте трех нижних шариков с верхним, и момен-том от силы трения – Fтр. (сила на тяге 7) и соответствующем плече (расстояние от линии действия силы трения до оси вращения шпинделя (4) машины.

Pезультаты трибологических исследований представлены в таблицах 2 и 3. Величины Ркр. и ин-декса задира Из (табл.3) определялись расчетным путём (согласно ГOСТ 9490-75) по данным, при-веденным в таблице 2. Для ряда растительных масел величины Ркр и Из превышают аналогичные по-казатели минеральных масел. Так, например, для масла минерального ИС-12 (Веретенное 2) индекс задира Из =310, критическая нагрузка Ркр.= 670 Н и нагрузка сваривания Рсв.= 1580 Н, а для расти-тельных масел Из = 330-430, Ркр.= 790 Н и Рсв.= 1410-2000 Н. При этом для рапсового масла Из = 435, Ркр.= 790 Н и Рсв.=2000 Н.

Таблица 2

Противоизносные и антифрикционные свойства растительных масел

Рос,Н

Из семян клеще-вины

Из семян арахиса

Из кос-точек абри-коса

Из кос-точек слив

Из семян томатов

Из семян вино-града

Из семян рапса

Из кос-точек вишни

Из семян подcол-нечн.

Олив-ковое масло

Из семян куку- рузы

200 0,39/ 0,07

0,38/ 0,099

0,39/ 0,099

0,39/ 0,099

0,36/ 0,099

0,44/ 0,110

0,31/ 0,099

0,34/ 0,099

0,37/ 0,100

0,38/ 0,099

0,37/ 0,099

250 0,040/ 0,07

0,41/ 0,087

0,41/ 0,095

0,39/ 0,095

0,36/ 0,095

0,46/ 0,100

0,35/ 0,095

0,40/ 0,120

0,39/ 0,100

0,42/ 0,088

0,39/ 0,088

320 0,43/ 0,070

0,45/ 0,093

0,44/ 0,120

0,42/ 0,093

0,38/ 0,098

0,46/ 0,090

0,35/ 0,093

0,43/ 0,120

0,40/ 0,110

0,43/ 0,082

0,42/ 0,083

400 0,45/ 0,070

0,46/ 0,099

0,46/ 0,110

0,44/ 0,099

0,38/ 0,099

0,47/ 0,090

0,40/ 0,084

0,43/ 0,110

0,43/ 0,099

0,45/ 0,075

0,43/ 0,075

500 0,47/ 0,060

0,46/ 0,079

0,56/ 0,120

0,47/ 0,087

0,57/ 0,130

0,48/ 0,120

0,43/ 0,075

0,47/ 0,099

0,45/ 0,099

0,45/ 0,080

0,44/ 0,099

630 0,61/ 0,090

0,47/ 0,079

0,63/ 0,130

0,55/ 0,095

0,85/ 0,140

0,51/ 0,140

0,50/ 0,074

0,50/ 0,098

0,59/ 0,130

0,70/ 0,110

0,64/ 0,130

790 0,66/ 0,110

0,77/ 0,109

0,74/ 0,110

0,57/ 0,083

0,86/ 0,130

0,76/ 0,120

0,77/ 0,073

0,67/ 0,100

0,73/ 0,110

0,74/ 0,100

0,75/ 0,105

1000

0,83/ 0,110

0,84/ 0,099

0,96/ 0,110

0,82/ 0,099

0,92/ 0,120

0,82/ 0,120

0,78/ 0,074

0,79/ 0,120

0,89/ 0,099

0,86/ 0,090

0,82/ 0,100

1120

0,94/ 0,100

0,89/ 0,110

0,89/ 0,120

0,93/ 0,110

0,92/ 0,110

0,85/ 0,110

0,84/ 0,079

0,89/ 0,120

0,90/ 0,110

0,97/ 0,090

0,89/ 0,090

1260

0,98/ 0,110

Сварка шариков

1,01/ 0,130

0,96/ 0,100

0,93/ 0,110

1,10/ 0,099

0,87/ 0,078

1,00/ 0,130

1,07/ 0,100

1,09/ 0,110

0,99/ 0,090

1410



1,00/ 0,085

1,10/ 0,130

1,30/ 0,090


1580

1,10/ 0,100

1,15/ 0,130

Сварка шари-ков

1780

1,41/ 0,120

Сварка шари- ков

2000

Сварка шари-ков

ПРИМЕЧАНИЕ: в числителе указан средний диаметр пятен изнашивания на нижних шариках – dиз.ср., mm,

в знаменателе – величина коэффициента кинетического трения f.



289

Таблица 3

Противозадирные свойства растительных масел

Наименование масла Индекс задира, Из

Критическая нагрузка, Ркр., Н

Нагрузка сваривания, Рсв.,Н

Из семян рапса 435 790 2000 Из косточек вишни 395 790 1580 Из косточек сливы 360 890 1410 Из семян подсолнечника 354 790 1580 Из семян кукурузы 350 790 1410 Из семян томатов 348 790 1410 Из семян клещевины (касторовое) 347 630 1410 Из семян винограда 332 790 1410 Оливковое 331 790 1410 Из косточек абрикоса 325 630 1410 Из семян арахиса 320 790 1410

Все исследованные растительные масла проявили достаточно высокие противоизносные, проти-

возадирные и антифрикционные свойства. По-видимому, это связано с тем, что основу всех масел составляют триацилглицерины, которые в процессе трения, под воздействием повышенных темпе-ратур в зоне контакта шариков и окисляясь кислородом воздуха, образуют перекисные соединения, оксикислоты и продукты полимеризации. Величины йодного и дистилляционных чисел (табл.1) для масла из семян рапса и ряда других масел характеризуют их удовлетворительную склонность к загустеванию и полимеризации.

Анализ результатов трибологических исследований (табл.2 и 3) позволяет сделать вывод о том, что наилучшие противоизносные, противозадирные и антифрикционные свойства присущи маслу из семян рапса, которое к тому же является и наиболее дешевым и, следовательно, может быть рекомен-довано к использованию в качестве дисперсионной среды при получении многоцелевой пластичной смазки.


1. Щербаков Г. Биохимия и товароведение масличного сырья. - Москва: Пищевая промышленность, 1979. - 336 с. 2. Тютюнников Б.Н. Химия жиров. - Москва: Химия, 1971. - 448 с. 3. Краткая химическая энциклопедия / Под ред. И.Л.Кнунянца. - Москва: Советская энциклопедия, 1963, т.2,

с.1006.


ibn.idsi.md ale Naturii 7_2007.pdfSeria “{tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735...

Documents

Transcript of ibn.idsi.md ale Naturii 7_2007.pdfSeria “{tiin\e ale naturii” Biologie ISSN 1857-1735...