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Estudio de mutantes de Burkholderia sacchari incapaces de crecer en

propionato (prp) y afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación de

este substrato.

Yeimy Paola Galindo Rozo

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para obtener título de:

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

DICIEMBRE 2007

Estudio de mutantes de Burkholderia sacchari incapaces de crecer en

propionato (prp) y afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación de

este substrato.


TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para obtener título de:

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

DIRECTORA Dra. Luiziana Ferreira da Silva

ASESOR DE TESIS Ana Carolina Suzuki Dias Cintra

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C.

DICIEMBRE DE 2007

NOTA DE ADVERTENCIA

ARTÍCULO 23 DE LA RESOLUCIÓN Nº 13 DE JULIO 1946.

“ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma

y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la

justicia”.

Estudio de mutantes de Burkholderia sacchari incapaces de crecer en propionato (prp) y afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación de

este substrato


APROBADO

_____________________________

Dra. Luiziana Ferreira da Silva Farmacia y Bioquímica

PhD. Ciencias Biológicas (Microbiología)

Directora

_____________________________ Dr. José Gregorio Cabrera Gomez

Ciencias Biológicas PhD. Ciencias Biológicas

(Microbiología) Jurado 1

_____________________________

Ana Carolina Suzuki Dias Cintra Ciencias Biológicas

M. Sc. Ciencias Biológicas (Microbiología)

Asesora

_____________________________ Dra. Érica Mendes Pereira

Química PhD. Ciencias Biológicas

(Biotecnología) Jurado 2

Estudio de mutantes de Burkholderia sacchari incapaces de crecer en propionato (prp) y afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación de

este substrato


APROBADO

_____________________________

Dra. Angela Umaña M. Phill Decana Académica

Facultad de Ciencias

_____________________________

Dra. Janeth Arias Bacterióloga M. Sc

Director de Carrera

DEDICATORIA

Dedico este trabajo a Dios por ser mi fuerza espiritual, por guiarme y brindarme sabiduría para cada uno de los momentos vividos y especialmente, por darme la

oportunidad de tener a mis seres queridos.

A mi padres Joaquín y Myriam por todo su amor, apoyo, por cada uno de los sacrificios que hicieron para que realizara mis sueños, por su constante entrega y

confianza, porque me ayudaron a seguir adelante frente a cada una de las adversidades presentadas.

A mis hermanos Fernando y Laura, por su cariño, apoyo y compañía en todos los

momentos de mi vida, especialmente durante mi formación, por ser parte importante de éste proceso y ser incondicionales en cada una de las etapas vividas.

A mis Marías hermosas por su valiosa y sincera amistad, por ser parte importante

de mi vida y por permitirmen aprender que existe la verdadera amistad… Las adoro niñas… Gracias por ser las mejores amigas del mundo.

A mi novio Edgar Leonardo, por todo su apoyo, comprensión, amor, cariño,

dedicación, entrega, por estar presente en todos los momentos de mi vida y por ser tan incondicional.

§ Paolita §

vi

AGRADECIMIENTOS

Agradezco especialmente a mi directora de Tesis Dra. Luiziana Ferreira da Silva

por el apoyo brindado, por la confianza depositada, por la oportunidad brindada y por generar un mayor gusto por la biología molecular, haciéndome crecer con bases

sólidas en el inicio como investigadora.

Agradezco de forma especial también, al Dr. José Gregorio Cabrera Gomez por la ayuda y acompañamiento a lo largo del desarrollo de mi trabajo de grado, así como por cada una de las discusiones y sugerencias valiosas, que fueron de gran ayuda

para el esclareciendo de dudas.

A la Universidad de Sao Paulo (USP) ubicada en Sao Paulo (Brasil), especialmente al Instituto de Ciencias Biomédicas, por permitirme realizar el presente trabajo, así

como por el préstamos de sus instalaciones y equipos, y demás materiales para el desarrollo de la investigación.

A Ana Carolina Suzuki Dias Cintra y a Renata de Melo Peixoto, agradezco por todas las enseñanzas profesionales y personales, que me hicieron madurar y crecer como profesional, también por todo el apoyo brindado durante la realización de la

investigación, así como por su valiosa amistad y en general por cada uno de los momentos vividos dentro y fuera del laboratorio. Meninas eu adoro vocês!

Agradezco de forma muy especial a mis amigos y compañeros de laboratorio Marco Antonio, Érica, Mateus, Tathi y Dani, que colaboraron para la ejecución de éste

trabajo.

A mis mejores amigas Diana, Prunella, Viviana, Carolina y Rosa Carolina, por su valiosa amistad y cariño desde el inicio de la carrera, así como por enviarmen desde

Colombia todo su apoyo, brindándome su cariño, dándome ánimos para seguir adelante y realizar mis sueños; niñas gracias por todos los momentos vividos, las

adoro!!!

Finalmente quiero agradecer a mi familia, a mi abuelita y a mi novio Edgar Leonardo por la paciencia, apoyo, cariño, confianza, consejos, amor y por estar

siempre presentes en todos los momentos de mi vida.

São Paulo, 12 diciembre de 2007

vii

TABLA DE CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 16

2 REVISIÓN DE LITERATURA..................................................................... 19

2.1 QUÉ SON LOS POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA)? ............................19 2.2 CARACTERÍSTICA DE Burkholderia sacchari LFM 101. ..........................19 2.3 SÍNTESIS DE PHA EN BACTERIAS. ............................................................21 2.4 UTILIZACIÓN DE SUBSTRATOS DE BAJO COSTO EN LA PRODUCCIÓN DE PHA................................................................................................23 2.5 PRODUCCIÓN DEL CO-POLÍMERO P3HB-co-3HV .................................25

2.5.1 UTILIZACIÓN DE ÁCIDO PROPIÓNICO COMO PRECURSOR DE UNIDADES 3HV. ......................................................................................................................................25

2.6 CATABOLISMO DE PROPIONATO EN DIFERENTES ORGANISMOS. .. ..............................................................................................................................26

2.6.1 UTILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS RECOMBINANTES INCAPACEZ DE CRECER EN ÁCIDO PROPIÓNICO........................................................................................32

3 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................... 35

4 OBJETIVOS.................................................................................................... 37

4.1 OBJETIVO GENERAL.....................................................................................37 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................37

5 MATERIALES Y MÉTODOS. ..................................................................... 38

5.1 TIPO Y LUGAR DE ESTUDIO........................................................................38 5.2 POBLACIÓN Y MUESTREO. .........................................................................38 5.3 MICROORGANISMOS Y PLÁSMIDOS UTILIZADOS EN EL ESTUDIO.. ..............................................................................................................................38 5.4 MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................39

5.4.1 Medio Luria-Bertani - LB ...........................................................................................40 5.4.2 Caldo nutriente (CN) ....................................................................................................40 5.4.3 Medio Mineral (MM) ...................................................................................................40

5.4.3.1 Solución de elementos traza................................................................................40 5.4.3.2 Medio mineral con sacarosa................................................................................41 5.4.3.3 Medio mineral con propionato............................................................................41 5.4.3.4 Medio mineral con sacarosa y canamicina..........................................................41 5.4.3.5 Medio mineral con sacarosa e tetraciclina. .........................................................41 5.4.3.6 Medio mineral con glucosa.................................................................................41 5.4.3.7 Medio mineral con glucosa y canamicina...........................................................41

5.5 ANTIBIÓTICOS EMPLEADOS. .....................................................................41 5.6 CONDICIONES DE CULTIVO .......................................................................42

viii

5.7 PRESERVACIÓN DE CEPAS..........................................................................42 5.8 REACTIVACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA BIBLIOTECA GENÓMICA Y DE LOS MUTANTES DE B. sacchari...........................................................................42 5.9 ENSAYO FENOTÍPICO DE MUTANTES. ....................................................43 5.10 COMPLEMENTACIÓN DE MUTANTES. ....................................................43 5.11 EXTRACCIÓN DE DNA PLASMIDIAL (MINIPREP) ................................44

5.11.1 Solución de GETL (Birnborim e Doly, 1979) .........................................................45 5.11.2 Solución de acetato de potasio (Birnboim e Doly, 1979) ........................................45

5.12 GEL DE AGAROSA. .........................................................................................45 5.12.1 Solución TBE ..........................................................................................................46 5.12.2 Solución TAE ..........................................................................................................46 5.12.3 Colorante de corrida ................................................................................................46

5.13 MANIPULACIÓN DEL DNA...........................................................................47 5.13.1 Digestión del DNA ..................................................................................................47

5.14 EXPERIMENTO DE ACUMULO DE PHA PARA EVALUAR EL EFECTO DE LAS COMPLEMENTACIONES OBTENIDAS. .................................47 5.15 DETERMINACIONES ANALÍTICAS. ...........................................................48

5.15.1 Concentración celular. .............................................................................................49 5.15.2 Proporción de polímero ...........................................................................................49

6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................................... 50

6.1 ENSAYO FENOTÍPICO ...................................................................................50 6.2 VALIDACIÓN DE LA BIBLIOTECA GENÓMICA DE Burkholderia sacchari LFM 101. ...........................................................................................................53 6.3 BÚSQUEDA DE CLONES QUE RESTITUYEN EL FENOTIPO prp+ EN MUTANTES AFECTADOS EN INTERMEDIARIOS DE LA ALFA OXIDACIÓN.. ..............................................................................................................................55 6.4 ENSAYO DE ACUMULO.................................................................................59

7 CONCLUSIONES........................................................................................... 61

8 REFERENCIAS .............................................................................................. 62

ix

LISTA DE ABRVIATURAS Y SÍMBOLOS

2 MCC: Ciclo de 2-metilcitrato

2MCS: 2- metilcitrato sintasa

3HV: 3- hidroxivalerato

Amp: Ampicilina

AN: Agar Nutriente

CN: Caldo Nutriente

CoA: Coenzima A

CS: Citrato sintasa

DNA: Ácido desoxirribonucléico

EDTA: Ácido etileno diamino tetracético

IPTG: Isopropil tio-β-D-galactósidos

Kan: Canamicina

Kb: Kilo bases

LB: Medio de cultivo Luria Bertani

LBK: Medio de cultivo Luria Bertani con Kanamicina (Canamicina)

M.S: Masa seca

MCS: Sitio de multiclonage

MM: Medio mineral

MMP: Medio mineral con propionato

x

MMS: Medio mineral con sacarosa

MMPK: Medio mineral con propionato y canamicina

MMSK: Medio mineral con sacarosa y canamicina

MMG: Medio mineral con glucosa

MMAA: Medio mineral con ácido acrílico

MMAAc: Medio mineral con ácido acético

MMAL: Medio mineral con ácido láctico

MMF: Medio mineral con fructosa

MMPir: Medio mineral con piruvato

n: Variación del grupo hidroxilo

ORF: Open Reading Frame

P3HB: Poli-3-hidroxibutirato

pb: Pares de bases

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

PHAs: Polihidroxialcanoatos

prp: Propionato

prp+: Consume propionato

prp-: No consume propionato

rpm: Revoluciones por minuto

Sac: Sacarosa

xi

SDS: Dodecil sulfato de sodio

TCA: Ciclo de los ácidos tricarboxílicos

Tris: Tri-hidroximetil- amoniometano

U.V: Radiación ultravioleta

Y3HV/prop: Factor de conversión de propionato a unidades 3HV en g/g

xii

ÍNDICE DE LAS FIGURAS

Figura 1. Estructura del copolímero de poli-3- hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV). ........................................................................................ 17

Figura 2. Síntesis de P3HB-co-3HV a partir de carbohidratos y ácido propionico. 22 Figura 3. Esquema de los experimentos de acumulo de polímero, realizados a los

mutantes y mutantes complementados de la cepa B. sacchari LFM 101... 48 Figura 4. Via metabólica para la alfa-oxidación de propionato para los mutantes en

estudio. ....................................................................................................... 53 Figura 5. Gel de agarosa después de una corrida electroforética, indicando los

diferentes padrones de bandas de algunos de los 28 clones seleccionados al azar de la biblioteca genómica de B. sacchari: (1)(14) Padrón: DNA λ digerido con Hind III; (2 a 13) clones escogidos aleatoriamente y digeridos con EcoRI................................................................................................... 55

Figura 6. Gel de agarosa, después de una corrida electroforética, indicando los productos de la digestión de pVK100::P1 y de pVK100::P2 con diferentes endonucleasas: (1)(8) Padrón: DNA λ digerido con HindIII; (2) pVK100::P1 digerido con Eco RI; (3) pVK100::P2 digerido con Eco RI; (4) pVK100::P1 de la cepa complementada por el clone, digerido con Eco RI; (5) pVK100::P1 de la cepa complementada por el clone, digerido con Eco RI; (6)(7) pVK100 sin digestión. ........................................................ 57

xiii

ÍNDICE DE LAS TABLAS

Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos (vectores de clonage) empleados. ............ 38 Tabla 2. Antibióticos utilizados. .............................................................................. 42 Tabla 3. Validación del crecimiento de los mutantes prp de B. sacchari LFM 183,

184, 185, 186 y 198 en diferentes compuestos. ......................................... 50 Tabla 4. Validación del crecimiento de los mutantes prp de B. sacchari LFM 183,

184, 185, 186 y 198 en ácido acrílico. ....................................................... 51 Tabla 5. Nueva clasificación de los mutantes en estudio de acuerdo a los sustratos

consumidos................................................................................................. 52 Tabla 6. Mutantes prp de B. sacchari complementados fenotípicamente por los

fragmentos P1 y P2. ..................................................................................... 56 Tabla 7. Tamaños estimados de los subfragmentos estudiados en cada clone capaz

de complementar los mutantes. .................................................................. 57

RESUMEN

Burkholderia sacchari es una bacteria capaza de acumular gránulos intracelulares de

polihidroxialcanoatos (PHA) que son utilizados en la producción de plásticos

biodegradables. A partir de la sacarosa, ésta cepa acumula el homopolímero poli-3-

hidroxibutirato (P3HB). Cuando el propionato es adicionado como cosubstrato, la

bacteria acumula un copolímero de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-

3HV), con mejores características físico-químicas que el P3HB. Sin embargo, apenas un

pequeño porcentaje del propionato suministrado es convertido en unidades 3HV, debido

a la presencia de vías más eficientes del catabolismo; que utilizan el propionato para la

generación de biomasa (sin PHA), CO2 y agua, reduciendo el porcentaje de 3HV en el

copolimero. Mutantes UV previamente obtenidos, incapaces de crecer en propionato

(prp), se tornaron más eficientes en la producción del copolímero, teniendo también el

fenotipo alterado para el crecimiento en intermediarios de la α-oxidación de propionato.

En este trabajo, fueron estudiado 5 de éstos mutantes prp de B. sacchari: LFM 183, 184,

185, 186 y 198. Posterior a la validación de una biblioteca genómica de la cepa salvaje,

compuesta por cerca de 2000 clones, fueron seleccionados y caracterizados

preliminarmente en gel de agarosa dos fragmentos diferentes de DNA (en los clones P1

y P2) capaces de restituir el crecimiento en propionato a todos éstos mutantes. Estos

fragmentos deben contener genes envueltos en el catabolismo de propionato en B.

sacchari, cuya inactivación llevó al aumentos en la eficiencia bacteriana en acumular el

copolimero.

PALABRAS CLAVES: Burkholderia sacchari, propionato, 3-hidroxivalerato (3HV), polihidroxialcanoatos (PHA), plásticos biodegradábles, α- oxidación.

ABSTRACT

Burkholderia sacchari is a bacterial strain able to accumulate intracellular granules of

polyhydroxyalkanoate (PHA), which are applied in the production of biodegradable

plastics. From sucrose this strain accumulates the homopolymer poly-3-hydroxybutyrate

(P3HB). When propionate is supplied as co-substrate the copolyester of 3-

hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (P3HB-co-3HV) is accumulated. However, a low

percentage of the propionate supplied is converted to 3HV units, which can be attributed

to the presence of more efficient catabolic pathways that convert this substrate do CO2,

water and non-PHA biomass, thus reducing the 3HV content. UV mutants previously

obtained were unable to grow in propionate (prp) and also showed the phenotype

affected concerning grow on intermediates of propionate α-oxidation. In the present

work 4 of those B. sacchari prp mutants were studied: LFM 183, 184, 185, 186 y 198.

After a screening in a B. sacchari genomic library (c.a. 2000 clones), the prp+ phenotype

was restored to the mutants by two different DNA fragments harbored by clones P1 and

P2, which were preliminary analyzed by agarose gel electrophoresis. P1 and P2 contain

genes involved in propionate catabolism and their inactivation led to bacterial

improvement on P3HB-co-3HV accumulation.

Key words: Burkholderia sacchari, propionate, 3-hydroxyvalerate (3HV), polyhydroxyalkanoate (PHA), biodegradable plastics, α- oxidation.

16

1 INTRODUCCIÓN

Los Polihidroxialcanoatos (PHA) constituyen una familia de poliésteres acumulados

intracelularmente por microorganismos, en forma de gránulos, que presentan

importancia biotecnológica por ser empleados en la producción de plásticos,

elastómeros biodegradable y biocompatibles.

Burkholderia sacchari LFM 101 es una cepa bacteriana Gram.negativa, aislada de suelo

brasilero en un programa de selección de microorganismos capaces de producir PHA a

partir de sacarosa, materia prima abundante en Brasil, proveniente del bagazo de caña.

Entre las diferentes cepas testadas, ésta se destacó por su capacidad de rápido

crecimiento en esta fuente de carbono, así como en el acumulo de altos porcentajes de

PHA en su interior.

LFM 101 viene siendo estudiada bajo diversos aspectos con el objetivo de conocer su

metabolismo y su potencial para la utilización biotecnológica. Recientemente, estudios

taxonómicos, incluyendo laboratorios de Brasil, Alemania y Bélgica, indicaron que la

cepa LFM 101 representa una nueva especie en el género Burkholderia, proponiendo así

el nombre de Burkholderia sacchari.

Al ser cultivada esta nueva cepa en sacarosa, bajo una limitación de un nutriente

esencial para el crecimiento como el nitrógeno, fósforo, oxígeno, etc., B. sacchari

acumula el homopolímero poli-3-hidroxibutirato (P3HB) y, al ofrecerse como co-

substrato el propionato, la bacteria acumula un co-polímero de poli-3-hidroxibutirato-

co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV) (Figura 1). P3HB y P3HB-co-3HV están entre los

PHA más estudiados y su producción industrial fue viabilizada por su potencial como

substituto de los plásticos convencionales en aplicaciones que van desde la producción

de empaques, hasta aplicaciones médicas que requieren biocompatibilidad y mayor

grado de pureza.

17

Figura 1. Estructura del copolímero de poli-3- hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato

(P3HB-co-3HV).

La incorporación de unidades 3HV, obtenidas por el abastecimiento de propionato como

co-substrato, genera un co-polímero más flexible y con mayor variedad de aplicaciones.

Dado el costo de este co-substrato y al bajo aprovechamiento del mismo por bacterias

para la síntesis del co-polímero, inclusive por B. sacchari, fueron obtenidos por UV

mutantes de esta bacteria más eficientes en la conversión de propionato en 3HV

(mutantes prp), habiéndose aumentado entre tres y ocho veces este factor de conversión

(o Y3HV/ Prop se evaluó de 0,10 para 0, 35 hasta 0,80 g/g), indicando su alto potencial para

su uso industrial en procesos desarrollados por el IPT y permitido para la producción en

una mayor escala. De modo general, los mutantes pueden ser clasificados en dos

grandes grupos: aquellos que además de estar afectados en prp, están afectados en el

uso de intermediarios de la α-oxidación de propionato y aquellos prp no afectados en el

uso de estos intermediarios. Este último grupo ya fue ampliamente estudiado y engloba

mutantes que pasaron a presentar Y3HV/ Prop en torno de 0,80 g/g. En cuanto al primer

grupo, los valores de Y3HV/ Prop están en torno de 0,30 g/g y éstos fueron objetos de éste

trabajo.

Se estudiaron los mutantes prp LFM 183, 184, 185, 186 y 198 de Burkholderia sacchari

afectados en el uso de intermediarios de la α-oxidación en el metabolismo de

propionato, con el fin de seleccionar por medio de metodologías de biología molecular

fragmentos de DNA que contengan parte o todos los genes afectados en estos mutantes

que les confiera la capacidad de crecer en propionato, validándose también la capacidad

de éstos fragmentos para restituir integralmente el fenotipo salvaje (prp+) a estos

mutantes, por medio de experimentos cuantitativos de acumulo de P3HB-co-3HV a

partir de sacarosa y propionato.

18

El presente trabajo de grado hace parte de una línea de investigación de maestría titulado

“Alfa-oxidação de propionato está envolvida na redução da produção de plástico

biodegradável em Burkholderia sacchari?”, el cual está siendo desarrollado en el

Laboratorio de Fisiología de Microorganismo de la Universidad de Sao Paulo, Brasil,

por Ana Carolina Suzuki Dias Cintra, bajo la dirección de la Dra. Luiziana Ferreira da

Silva.

19

2 REVISIÓN DE LITERATURA.

2.1 QUÉ SON LOS POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA)? Los polihidroxialcanoatos (PHA) están compuestos por un grupo bastante diverso de

poliésteres, acumulados por un número significativo de bacterias (Steinbüchel &

Valentin, 1995). Son termoplásticos, biodegradables e biocompatibles, cuya producción

y aplicabilidad vienen siendo estudiadas en todo el mundo. Estas características hacen

que estos materiales sean una alternativa ambientalmente viable para mudar el uso de

los plásticos de origen petroquímico, dado al impacto ambiental que generan. Para las

bacterias, los PHA actúan como reserva de carbono y energía (Steinbüchel & Valentin,

1995).

En Brasil, a partir de 1992 la producción de algunos tipos de PHA esta siendo estudiada,

destacándose por sus propiedades, P3HB y P3HB-co-3HV, en el cual se emplean

materias primas renovables por la agricultura, tales como sacarosa, melaza e hidrolizado

de bagazo de caña, entre otros (Bueno Netto et al., 1993, Gomez & Bueno Netto, 1997;

Silva, 2000; Gomez & Bueno Netto, 2001, Silva et al., 2002). Uno de los resultados más

importantes de este desarrollo en el país es la producción en escala piloto, que se inició

empleándose derivados da caña de azúcar (Nonato et al., 2001). Otro resultado

importante fue el aislamiento e identificación de la nueva especie bacteriana Gram.

negativa Burkholderia sacchari LFM 101 (Brämer et al., 2001) más eficiente y,

recientemente, mejorada para la incorporación de unidades 3HV a partir del uso del

propionato, así como su capacidad de usar xilosa e hidrolizado de bagazo de cana-de-

azúcar (Silva et al., 2002).

2.2 CARACTERÍSTICA DE Burkholderia sacchari LFM 101. Burkholderia sacchari, sacchari de azúcar, refiriéndose al lugar donde fue aislada la

cepa, es decir, de suelo de caña de azúcar. Es capaz de acumular hasta un 68% de su

peso seca como poli (3-hidroxibutirato) cuando es suministrada sacarosa como fuente de

carbono y hasta un 65,9% de su peso seco como poli (3-hidroxibutirato-co-

hidroxivalerato) cuando es adicionada glucosa y ácido propiónico como substratos

(Brämer et al., 2001).

20

Colonias de la cepa LFM 101 crecen sobre medio caldo o agar nutriente (CN),

presentando color blanco, siendo opacas debido a la acumulación de P3HB y P3HB-co-

HV. Las células son cocobacilos Gram. negativos (0,5 – 0,8 µm de ancho, 1,5 – 3,0 µm

de largo) y lisadas con KOH al 3%, móviles debido a la presencia de flagelos polares y

con temperatura óptima de crecimiento entre 25 – 37 ºC, y con un contenido de 63,7 mol

% de G + C. No formador de esporas, oxidasa y catalasa positiva, así como reductor de

nitrato a nitrito, presentando ausencia de licuefacción de gelatina e hidrólisis de

esculina. (Silva et al., 2000)

Los sustratos asimilados por la cepa son los siguientes : acetato, N-acetilglucosamina,

adipate, adonitol, DL-arabinosa, D-arabitol, citrato, D-fructosa, DL-fucosa, galactosa,

gluconato, D-glucosa, glicerol, inositol, 2-cetogluconato, lactato, D-lixose, malato,

manitol, D-manosa, fenilacetato, propionato, piruvato, D-rafinosa, sorbitol, sacarosa and

D-xilosa. Las siguientes Fuentes de carbono no son usadas: almidón, amigdalin, L-

arabitol, arbutin, caprate, celobiosa, dulcitol, eritritol, metil α-D-glucósido, metil α-D-

manósido, β gentiobiosa, glicógeno, inulina, 5-cetogluconato, lactosa, maltosa,

melecitosa, melobiosa, metil β-xilósido, ramnosa, ribosa, salicina, L-sorbosa, D-

tagatosa, trehalosa, D-turanosa, xilitol y L-xilose. Los siguientes carbohidratos son

oxidados por la cepa: adonitol, DL-arabinosa, D-arabitol, D-fructosa, DL-fucosa,

galactosa, gluconato, D-glucosa, glicerol, inositol, 2-cetogluconato, D-lixosa, manitol,

D-manosa, D-rafinosa, ribosa, sorbitol, sacarosa and D-xilosa. Los siguientes

carbohidratos no son oxidados: N-acetilglucosamina, almidón, amigdalina, L-arabitol,

arbutina, celobiosa, dulcitol, eritritol, β-gentiobiosa, glucógeno, inulina, 5-

cetogluconato, lactosa, maltosa, melecitosa, melibiosa, metil α-D-glucósido, metil α-D-

manósido, metil β-xilosido, ramnosa, salicina, L-sorbosa, D-tagatosa, trehalosa, D-

turanosa, xilitol y L-xilose. (Brämer et al.,2001).

Las cepa LFM 101 es susceptible a los antibióticos tetraciclina (100 µg mL-1),

canamicina (50 µg mL-1), cloranfenicol (100 µg mL-1) e ampicilina (15 µg mL-1) (Silva

et al., 2000).

21

2.3 SÍNTESIS DE PHA EN BACTERIAS. En diversas bacterias, a partir del acetil-CoA obtenido del catabolismo de carbohidratos,

por ejemplo, la síntesis del homopolímero 3HB ocurre envolviendo la acción de tres

enzimas (Oeding & Schlegel, 1973; Senior & Dawes, 1973). Primero, por acción de la

3-cetotiolasa, dos moléculas de acetil-CoA se condensan, generando acetoacetil-CoA.

Esta, al seguir, sufre una reducción, formando 3-hidroxibutiril-CoA por acción de la

acetoacetil-CoA reductasa. La PHA sintasa, finalmente, incorpora cada molécula de 3-

hidroxibutiril-CoA a la cadena polimérica en crecimiento.

En la presencia de un co-substrato, como el propionato, por ejemplo, una molécula de

propionil-CoA podrá entonces condensarse como una de acetil-CoA y, siguiendo las

etapas posteriores, formar 3-hidroxivaleril-CoA para finalmente ser incorporada por la

PHA sintasa para formar el co-polímero P3HB-co-3HV (Figura 2).

Aunque la incorporación de unidades 3HV sea obtenida fácilmente, proveyendo ácido

propiónico al cultivo bacteriano en la fase de acumulo (Doi y otros., 1987), la eficacia

de conversión de este sustrato en unidades 3HV es generalmente bajo, representando

cerca del 10% del valor máximo teórico, que es de 1.35 gramos de 3HV por gramo de

ácido propiónico consumido (Gómez y otros., 1996), en caso que todo el propionato

proveído genere propionil-CoA, condensándose como acetil-CoA proveniente

exclusivamente de los carbohidratos. La baja eficiencia en esta conversión, observada en

la mayoría de las bacterias, puede ser atribuida a la existencia de vías bastante eficientes

del catabolismo de este substrato (Sprat et al., 1981), que conducen una importante

parcela para la síntesis de unidades de 3HB o CO2, precedida, de la formación en mayor

proporción de acetil-CoA y no propionil-CoA.

22

Figura 2. Síntesis de P3HB-co-3HV a partir de carbohidratos y ácido propionico.

Cuando el ácido propiónico es suministrado a R. eutropha (posteriormente Waustersia

eutropha y actualmente Cupriavidus necator) como única fuente de carbono, el

polímero resultante posee cerca de 45 mol % en unidades de 3HV (Doi et al., 1987;

Anderson & Dawes, 1990). Suponiendo, que un polímero contiene 50 mol % de

unidades de 3HV fuese formado, esto significaría que por lo menos ¾ del ácido

propiónico suministrado estaría siendo convertido en acetil-CoA (1/4 de los cuales se

condensarían con el propionil-CoA para formar unidades 3HV y 2/4 se condensarían en

forma de acetil-CoA, a los pares, para formar unidades de 3HB). Esta observación

asume gran importancia industrial, ya que el ácido propiónico es un substrato

23

relativamente caro para la producción de PHA, habiendo sido desarrollados programas

de obtención de mutantes más eficientes en la canalización de propionato a unidades

3HV por parte de empresas productoras (Byrom, 1990). Para la obtención de mutantes

más eficientes en la conversión de propionato a unidades 3HV, es de fundamental

importancia el conocimiento de las vías metabólicas envueltas en el catabolismo de este

substrato y que pueden estar actuando de modo competitivo con la vía de síntesis de

P3HB-co-3HV.

2.4 UTILIZACIÓN DE SUBSTRATOS DE BAJO COSTO EN LA PRODUCCIÓN DE PHA

Según Choi y Lee, el mayor obstáculo en la comercialización de PHA es su alto costo,

aproximadamente el 40% del total del costo de producción de PHA son debidos a los

costos de los substratos. Así, para conseguir reducir los costos de producción es

necesaria la utilización de fuentes de carbono más baratas

La producción de P3HB y co-polímeros, integrada la producción de azúcar y alcohol en

plantas de procesamiento de caña de azúcar, puede representar una gran oportunidad de

producir polímero a bajo costo y expandir la industria de caña. La única producción

industrial de P3HB y P3HB-co-3HV a partir de caña de azúcar, utilizando esa

producción integrada en plantas sucro-alcoholera, está siendo realizada por la industria

brasilera PHB Industrial S.A. (www.biocycle.com.br) (Nonato et al., 2001). La resina,

comercialmente conocida como BioCycle®, está siendo producida en escala piloto y

destinada a Universidades, empresas y centros de investigación desarrollo. Hasta el

2005, la empresa pretendía producir 10 mil toneladas por año. Los costos de producción

del PHB industrial son los menores del mundo. En tanto que, en Europa el polímero es

producido a US $ 10-207Kg, en Brasil esos costos están entre US $ 2.5- 5/Kg, sin

embargo, todavía cerca de 4 a 5 veces el costo de los polímeros convencionales (Squio

& Falcão, 2003). Recientemente, la previsión para el establecimiento de la planta

industrial para la producción en gran escala es para 2010 en Ribeirão Preto, São Paulo

(Brasil), con una proyección de generar entre 10 mil y 30 mil toneladas por año

(Pesquisa FAPESP).

24

Gomez e colaboradores (1996), validaron la eficiencia de producción de PHA por

diversas bacterias Gram. negativas, aisladas del suelo de plantaciones de caña de azúcar.

Los medios de cultivo fueron realizados con limitación de nitrógeno y utilizando como

carbohidratos sacarosa, glucosa y fructuosa. Cuando se utilizó la sacarosa, algunos

microorganismos mostraron valores de rendimiento global de carbohidrato en producto,

YP/C, mayores que cuando se utilizó glucosa y fructosa. Los autores explicaron el hecho,

afirmando que la misma masa de sacarosa genera 5% más acetil-CoA y, por

consiguiente PHA, que glucosa y fructuosa. Entre los microorganismos aislados,

Burkholderia sp LFM 101 fue capaz de acumular 75% de su peso seco en P3HB a partir

de glucosa más fructosa y 69% a partir de sacarosa, con una eficiencia mayor que 80%

del máximo rendimiento teórico, que es de 0.48g/g cuando se utiliza glucosa y/o

fructosa, de acuerdo con Yamane (1993), y 5% mayor, de 0.5g/g cuando se usa

sacarosa. La bacteria todavía fue capaz de crecer con velocidad específica de

crecimiento (0.4-0.45h-1), mayor que R. eutropha (0.3 h-1)

Según Wong y Lee 1998, el suero de leche proveniente de la industria de lacticíneos,

resultante de la fabricación de queso o caseína, representa cerca del 80 – 90% del

volumen de leche transformado. Una vez que el suero de leche es rico en nutrientes,

siendo la lactosa su mayor constituyente, se presenta como otra alternativa de substrato

de bajo costo en la producción de PHA.

Wong y Lee (1998), también estudiaron la producción de P3HB en cultivos de alta

densidad celular de Escherichia coli recombinante GCSC 6576, en cultivo alimentado,

utilizando suero de leche concentrado como fuente de carbono. Obtuvieron 87 g/L de

células y 69 g/L de P3HB, realizando un total de 80% de polímero con productividad de

1.4 g/L h. A pesar de haber obtenido valores de concentración y productividad de

polímero menores que con fuentes puras de carbono, relataron que su producción pude

ser económica principalmente si se incorpora a una industria de lacticíneos, agregando

valor al efluente. Sin embargo, aunque hayan conseguido buenas concentraciones de

P3HB, el medio de cultivo necesitaba ser constantemente removido, debido a la

limitación volumétrica del fermentador, causada por la baja solubilidad de la lactosa en

la solución de alimentación (210 g/L), comparada a la de la glucosa (700-800 g/L)

25

Otros estudios se han ido realizando con el fin de reducir los costos de producción de

PHA, usando aceites vegetales, los cuales son productos agrícolas renovables y de bajo

costo. Fukui y Doi (1998), estudiaron la capacidad de R. eutropha H16 de crecer y

producir PHA a partir de aceites vegetales como aceite de oliva, maíz, dende y ácido

oleico como únicas fuentes de carbono. Los resultados mostraron que la bacteria crece

muy bien en dichos substratos, acumulando altas cantidades de P3HB, entre 79 – 82%

de su peso seco.

2.5 PRODUCCIÓN DEL CO-POLÍMERO P3HB-co-3HV Una vez que el P3HB es un material rígido y quebradizo, la incorporación de unidades

3HV es responsable por la mejoría de las características del polímero P 3HB-co-3HV.

Como resultado de la incorporación de unidades 3HV, ocurren alteraciones de

parámetros, como niveles de cristalinidad y punto de fusión, acarreando en la

disminución de la rigidez del polímero y en el aumento de la resistencia al impacto.

Cantidades de 3HV entre 17 y 20 mol% permiten la obtención de un producto con

propiedades termoplásticas, que llevan a una mayor aplicación del polímero (Holmes,

1985). A partir de fuentes de carbono como glucosa y fructuosa, Ralstonia eutropha

produce a penas homopolímero 3HB. Para la producción del co-polímero, son

necesarios precursores como ácido propiónico o valérico, que pueden ser metabolizados

a unidades 3HV (Byrom, 1990).

2.5.1 UTILIZACIÓN DE ÁCIDO PROPIÓNICO COMO PRECURSOR DE UNIDADES 3HV.

La producción industrial del co-polímero P(3HB-co-3HV) por R. eutropha, es realizada

adicionando ácido propiónico al cultivo para la incorporación de unidades 3HV. El valor

de 3HV incorporado al polímero es controlado por la variación de la ración de glucosa y

acido propiónico de la alimentación. Es necesario un control apropiado de la

concentración de propionato adicionado pues, si se presenta en el medio en

concentraciones mayores que 0.1%, puede ser toxico para el microorganismo el inhibir

la síntesis del polímero (Byrom, 1990).

Entre tanto, la fracción de 3HV incorporada al polímero generalmente es baja, una vez

que, más allá de servir como co-substrato para unidades 3HV, el acido propiónico

26

también puede ser asimilado para el crecimiento celular (Doi, 1987) El acido propiónico

es rápido y eficientemente degradado por las células bacterianas, y su uso, durante la

fase de multiplicación celular, implica el mayor desperdicio de este substrato,

impidiendo que cumpla su principal papel en este proceso, o sea, la síntesis de unidades

3HV (Byrom, 1990).

La baja cantidad teórica de P(3HB-co-3HV) y la productividad son atribuidas al hecho

tóxico del co-substrato, las estrategias inadecuadas de alimentación de ácido propiónico

a los cultivos, y al hecho de que la mayoría de los microorganismos presentan bajo

factor de conversión de ácido propiónico en unidades 3HV (Silva, 2000).

Marangoni (2000), estudió diferentes estrategias de alimentación de ácido propiónico en

diferentes substratos en la producción de P(3HB-co-3HV) como R. eutropha DSM 545,

en cultivo alimentado. Cuando utilizó suero de leche, las estrategias de alimentación de

ácido propiónico por pulsos obtuvo baja productividad, sin embargo, con grandes

fracciones de 3HV, cerca de 38%, con conversión de propionato en 3HV de 0.22

molHV/mol ac prop, sugiriendo la posibilidad de la existencia de precursores 3HV en el

suero. Con azúcar invertido, se utilizó alimentación con ácido propiónico, con

regulación de pH, en pulsos de 1g/L y de forma continua, siendo que las fracciones

molares de 3HV obtenidas fueron de 17.5 y 26 mol% 3HV, respectivamente. En cuanto

a los factores de conversión fue obtenido 0.03 molHV/mol ac prop para las estrategias de

regulación de pH y pulsos, y 0.13 molHV/mol ac prop para la alimentación continua,

manteniendo la concentración de ácido propiónico en 0.4g/L en el medio.

2.6 CATABOLISMO DE PROPIONATO EN DIFERENTES ORGANISMOS. El estudio del metabolismo del propionato ha asumido gran importancia tanto en

eucariotas como en procariotas. En humanos, el propionato es formado en consecuencia

de la degradación de una serie de compuestos provenientes de la dieta, como treonina,

metionina, isoleucina e valina, ácidos grasos de cadena impar, colesterol y otros

metabolitos. Deficiencias en su catabolismo llevan a dolencias que pueden ser bastante

severas llevando a la muerte desde el primer día de vida (Fenton & Rosenberg, 1995,

Ugarte et al., 1999, Chloupková et al., 2000) . En rumiantes, el propionato es generado

27

como resultado de la fermentación de carbohidratos por diversos organismos y, junto

con acetato, constituyen la fuente de energía para estos animales. Es también producido

y consumido en ambientes metanogénicos (Stams et al., 1998). El Ácido propiónico

también puede ser producido por fermentación del almidón o azúcar por

Propionibcterium acidipropionici (Carrondo et al., 1988, Blanc & Goma, 1989, Raecker

et al., 1992) y puede ser utilizado para fragancias y agentes flavorizantes (Samel et al.,

1993), además de tener un papel en la producción de quesos.

En bacterias, el catabolismo de propionato viene siendo estudiado por ser el último

compuesto oriundo de la degradación de ácidos grasos de cadena impar a través de la α-

oxidación, teniendo una estructura que no es blanco de las reacciones que a él dieran

origen. Recientemente, el uso de propionato, junto con azúcares, adquirió importancia

en la obtención de polihidroxialcanoatos (PHA), polímeros biodegradables, como

P3HB-co-3HV, justamente para introducir la fracción 3HV y mejorar las propiedades

del polímero (Steinbüchel, 1991). Algunos microorganismos, mostraron ser capaces de

sintetizar polímero con unidades 3HV a partir de substrato no relacionado

estructuralmente a este monómero. Este hecho despertó el interés por el estudio de vías

capaces de formar propionil-CoA para la síntesis de unidades 3HV en Nocardia

coralina, Rhodococcus ruber y otros organismos relacionados (Valentin & Dennis,

1996). Recientemente, Aldor et al. (2002) desarrollaron un sistema de expresión, en los

cuales están envueltos los genes del ciclo de 2-metil citrato (prpC) y los genes de

formación de propionil-CoA en E. coli (sbm e ygfG) y genes de biosíntesis de PHA de

Acinetobacter (phaBCA), que permitió obtener una cepa recombinante de Salmonella

entérica capaz de producir 3HV sin la formación exógena de propionato. Entretanto, se

trata de producir propionil-CoA a partir de succinato, que es la vía con reacciones que se

procesan en el sentido inverso a las del catabolismo de propionato en humanos y otros

eucariontes.

Los trabajos más antiguos que estudiaron el catabolismo de propionato utilizaban

herramientas como el análisis de metabolitos después de la formación de propionato

marcado, o análisis de actividades enzimáticas, que llevaran a la proposición de diversas

vías. Recientemente, análisis moleculares y búsquedas en genomas permitieron

28

comprobar la presencia de pocas vías, en algunos microorganismos, principalmente en

actinomicetos, sin embargo, diversas vías propuestas anteriormente todavía requieren

ser comprobadas. En el momento, la literatura revisada aporta un grupo en la

Universidad de Madison (Horswill & Escalante-Semerena, 1997; Horswill & Escalante-

Semerena, 1999; Horswill & Escalante-Semerena, 2001) estudiando el catabolismo de

propionato en Salmonella en los últimos 8 años, seguido del Instituto de Microbiología

de Münster, que inició en este tema con el estudio realizado por la propia proponente en

aquella institución, extendiéndolo a Ralstonia eutropha

Independiente de la vía propuesta para el catabolismo del propionato, la activación a

propionil-CoA es la primera etapa descrita, la reacción está inicialmente atribuida a las

dos rutas de síntesis de acetil-CoA (Rhie & Dennis, 1995 a,b), una catalizada por la

acetil-CoA sintetasa y otra, por la acetato quinasa y transacetilasa. Kumari et al. (1995)

concluyeron que las células de E. coli requieren ambas vías de activación de acetato.

Recientemente, fueron publicadas evidencias del papel del gene prpE (presente en el

operon prpBCDE) en la síntesis de propionil-CoA sintetasa (prpE) en Salmonella

typhimurium (Horswill & Escalante-Semerena, 1999).

Una vez activada la propionil-CoA, varios destinos han sido propuestos en la literatura

para su catabolismo, muchos de los cuales fueron inferidos con base en estudios

envolviendo determinación de la actividad enzimática en extractos celulares (London et

al.1999). En E. coli y B. sacchari, diferentes vías pudieran actuar simultáneamente

llevando a la producción de acetil-CoA o succinato, que entran en el ciclo de los ácidos

tricarboxílicos (TCA) (Evans et al., 1993, Silva et al., 2000). Aunque diversas vías han

sido propuestas para el metabolismo del propionato, la mayoría todavía necesita

evidencias genéticas. Spratt y colaboradores (1981) localizaron un gen que afecta el

metabolismo del propionato en E. coli, denominado prpA en el mapa de ligación de esta

bacteria (Berlyn, 1998), y que todavía no ha sido correlacionado a ninguna vía, a pesar

del secuenciamiento de todo su genoma (Kroeger & Wahl, 1997; Textor et al., 1997).

Apenas para la vía de 2MCC, inicialmente descrito en hongos y levaduras (Tabuchi et

al., 1974; Tabuchi & Uchyiama, 1975; Pronk et al., 1994) y, recientemente, en bacterias

(Gerike et al., 1998, Horswill & Escalante-Semerena, 1997, Textor et al., 1997, Silva,

29

1998, Brämer et al., 2002), las bases genéticas están bien establecidas. En estas

bacterias, los genes de 2MCC están organizados en un operon prpBCD .

Estudios fisiológicos y moleculares de mutantes prp de B. sacchari sugieren que la baja

conversión de propionato a 3HV por la vía de síntesis del polímero, resulta de la

existencia de por lo menos dos vía de catabolismo que compiten, y son más eficientes,

por este substrato: la α-oxidación y el ciclo de 2metilcitrato (2MCC) (Silva et al., 2000,

Gregorio et al., 2001). Por lo tanto, la propuesta de la existencia de esta primera vía fue

basada apenas en evidencias fenotípicas de mutantes estudiados. Así, la existencia del

ciclo de 2MCC fue recientemente comprobada en B. sacchari por estudios moleculares

(Brämer et al., 2002).

Hasta ahora diversas vías del catabolismo de propionato han sido propuestas en la

literatura, la 2MCC es la única comprobada en el nivel molecular, habiendo sido

descrita en bacterias al final de la década pasada (Textor et al., 1997).

La vía de 2MCC fue descubierta en Candida lipolytica (Tabuchi & Uchyiama, 1975) y

posteriormente, la actividad enzimática de esta vía fue mediada en Saccharomyces

cerevisiae (Pronk et al., 1994). En esta vía, el propionato es oxidado a piruvato pasando

por 2-metilcitrato, por enzimas codificadas por el operon prpBCDE. El propionato es

activado a propionil-CoA por una propionil-CoA sintetasa (PrpE) (ni siempre presente

en el operon). La propionil-CoA es entonces condensada con oxaloacetato, por acción

de la 2-metilcitrato sintasa (PrpC), formando 2-metilcitrato. La conversión de 2-

metilcitrato a 2-metil-cis-aconitato es catalizada por una 2-metilcitrato deshidratasa

(PrpD), propuesta en S. typhimurium. (Horswill & Escalante-Semerena, 2001), cuyo gen

fue localizado en el operon prpBCDE de E. coli (Blank et al., 2002), directamente

relacionado con el operon equivalente de S. typhimurium (Horswill e Escalante–

Semerena 1997, 1999, 2001). Para la posterior conversión de 2-metil-cis-aconitato a 2-

metilisocitrato, fueron descritas en E. coli dos aconitasas AcnA y AcnB, y una menor

actividad de AcnC (Blank et al., 2002). Estos autores demostraron que la 2-metilcitrato

deshidratasa codificada por el gene prpD del catabolismo de propionato es idéntica la

AcnC. Finalmente, el clivaje de 2-metilisocitrato en piruvato y succinato es catalizada

30

por la 2-metilisocitrato liasa (PrpB.). Resultados recién publicados comprueban la

existencia del 2MCC en B. sacchari LFM101 (Brämer et al., 2002) que serán

comentados a seguir.

El uso del propionato viene siendo estudiado en B. sacchari LFM 101, demostrado que,

de modo similar a otras bacterias, la conversión de propionato en unidades 3HV es

restricta a menos que 10% del máximo teórico (Silva et al., 2000; Brämer et al., 2001).

Mutantes de B. sacchari, incapaces de crecer en propionato (prp), que acumulan

unidades 3HV a partir de este sustrato, fueron obtenidos, clasificados y comparados,

buscando mejorar el rendimiento obtenido (Silva et al., 2000). Fueron definidos dos

grupos de mutantes UV: un grupo que se encuentra afectado en la utilización de

intermediarios de la α-oxidación y otro no afectado. En cuanto a los mutantes del primer

grupo alcanzaban al máximo, valores del factor de conversión del propionato a unidades

3HV (Y3HV/Prop) de 0,37 g/g, mutantes no afectados en esta vía alcanzaban hasta 0,80

g/g. La suma de estos valores corresponde a 1,17 g/g, bastante próximo del rendimiento

máximo teórico de 1,35 g/g. Fue propuesto entonces que el ácido propiónico sería

consumido por lo menos tres vías: dos vías de degradación (cada una bloqueada en cada

grupo de mutantes), las cuales competirían todavía con una tercera vía, la de síntesis de

3HV. El mutante LFM 189, no afectado en la α-oxidación, continua siendo estudiado

por ser aquel que presentó el mejor rendimiento (Y3HV/Prp). Mutantes con inativación

sitio específica de genes del 2MCC fueron recientemente estudiados, cuyos resultados

corroboran la hipótesis de que existen dos vías para el catabolismo de propionato en B.

sacchari (Pereira, 2007).

La definición de 2MCC en ésta bacteria se dio a partir del clonage de un fragmento

genómico E2 (2Kb) a partir del cual fue subclonado un fragmento Sal 1 (S1) de 1.1 Kb,

posteriormente secuenciado e identificado como parte del gen prpC y parte de acnM,

capaz de restituir el fenotipo prp al mutante LFM 189 (Silva, 1998). En esta vía, cuatro

genes presentaron identidad de aquellos del locus prp de otras bacterias Gram.

negativas, prpR, prpB, prpC, acnM y una ORF (ORF5), respectivamente, un gen

regulador, genes codificadores de las enzimas 2-metil-isocitrato liasa, 2-metilcitrato

31

sintasa y los dos últimos genes codifican productos implicados en la conversión de 2-

metilcitrato a 2-metilisocitrato (Brämer et al., 2002).

Partiendo de la cepa salvaje, fue clonado un fragmento genómico Sal 1 (S1) de 1 Kb,

capaz de restituir el fenotipo prp al mutante LFM 189 (Silva, 1998). Sin embargo, S1 no

fue capaz de complementar otros 4 (LFM 192, 193, 195 y 196) de los 6 mutantes del

mismo grupo de LFM 189, complementando apenas LFM 197, también de LFM 189. A

partir de resultados del secuenciamiento de S1 y regiones adyacentes, Brämer et al.

(2002) demostraron, del punto de vista molecular, la presencia del 2MCC en B.

sacchari. El operon prp descrito está compuesto de 4 genes (prpB, prpC, acnM y a

open reading frame -ORF5) que muestran identidad con los genes de los loci prp de

muchas bacterias. El gen prpC codifica la 2-metilcitrato sintasa, prpB codifica la 2-

metilisocitrato liasa, y los genes acnM y ORF5 probablemente son requeridos para la

conversión de ácido 2-metilcítrico en ácido 2-metilisocítrico. Otro gene (prpR)

posicionado uspstream al operon, con una orientación invertida, codifica un probable

regulador transicional del operon prp. Tres ORFs adicionales (6, 7, 8), cuyas funciones

son desconocidas, fueron localizados downstream a la ORF5 en el locus prp de B.

sacchari y no fueron encontradas en ningún otro operon. El gene prpD, probablemente

envuelto en la reacción de isomerización en el 2MCC en S. enterica, no fue localizado

en el locus prp de B. sacchari. Si, en B. sacchari, los productos de los genes acnM y

ORF 5 estuvieren también envueltos en la conversión de 2-metilcitrato a 2

metilisocitrato, como ocurre en R. eutropha HFR39 (Brämer & Steinbüchel, 2001), los

autores infieren que el producto del gen prpD no es requerido para la funcionalidad de

este ciclo en esta bacteria. Considerando que los productos das ORFs 6, 7, 8 pueden no

ser necesarios para la funcionalidad de la 2-metilcitrato sintasa en B. sacchari, fue

propuesto un conjunto mínimo de genes estructurales para el locus prp de esta cepa,

responsables por la funcionalidad del ciclo de 2-metilcitrato.

A partir de la identificación de 2MCC en B. sacchari, se estudió la construcción y uso

de “cassetes’’ mutagénicos, teniendo como blanco obtener mutantes específicamente

afectados en regiones de prpC conteniendo posibles sitios activos de la enzima 2-

metilcitrato sintasa (Pereira et al., 2001, Pereira, 2002, Pereira et al., 2005).

32

En lo que se refiere a los mutantes afectados en la utilización de intermediarios da α-

oxidación, se especula que ésta posible vía podría asumir un papel más importante bajo

condiciones de crecimiento celular, y no de acumulo, una vez que el 90% de los

mutantes prp obtenidos en estudios anteriores, presentarán este fenotipo (Silva et al.,

2000). Más allá de estas características fenotípicas y de la alteración característica de los

valores de Y3HV/Prop, se sabe que muchos de estos mutantes no fueron complementados

ni por E2 ni por S1, fragmentos de DNA genómico de B. sacchari portadores de

regiones de genes de 2MCC, ni por otras regiones capaces de complementar otros

mutantes prp del grupo IV (Cintra et al., 2005). Otro dato a ser considerado es que los

resultados de eficiencia de conversión de propionato a unidades 3HV de los mutantes

afectados en 2MCC y en la α-oxidación indican que la deleción de ambas vías podría

resultar en la generación de mutantes presentando valores próximos al máximo teórico

de Y3HV/Prop (Silva et al., 1996, Silva et al., 2000).

A pesar de estos avances, hay todavía lagunas a ser llenadas en cuanto a la presencia de

otras vías en B. sacchari, ya que todavía no fueron estudiados los mutantes afectados en

el uso de intermediarios de la α-oxidación aquí propuesto. El conocimiento de las vías

actuantes y su posible deleción, por modificaciones genéticas, podrían generar mutantes

con eficiencia de conversión de propionato a 3HV más próximas del valor máximo

teórico de Y3HV/Prop = 1,35 g/g.

2.6.1 UTILIZACIÓN DE MICROORGANISMOS RECOMBINANTES INCAPACEZ DE CRECER EN ÁCIDO PROPIÓNICO.

El ácido propiónico es adicionado como co-substrato precursor de unidades de 3HV en

la producción del co-polímero, sin embargo, solamente una pequeña fracción de éste es

incorporada de esta forma al polímero, siendo que el restante es desviado para otras

rutas metabólicas, como crecimiento celular y formación de unidades 3HB. (Squio &

Falcão, 2003).

Como el acido propiónico o propionato de sodio son más caros que mas otras fuentes de

carbono que pueden ser consumidas por los microorganismos durante la fermentación,

la optimización de su aprovechamiento en forma de unidades 3HV en el co-polímero es

de gran importancia en la reducción de los costos de producción. (Silva, 2000).

33

Lee et al, desenvolvieron a partir de A.eutrophus NCIMB 11599, una cepa mutante de

A.eutrophus BK-23, que es incapaz de asimilar el acido propiónico para el crecimiento

celular. Las dos cepas fueron comparadas en cuanto a la habilidad de acumular P(3HB-

co-3HV) y a la composición del polímero producido. Los experimentos fueron realizado

en cultivo alimentado, utilizando la ración de alimentación P/G de 0.21 y limitación en

nitrógeno. Niveles finales similares de contenido de células y del co-polímero fueron

obtenidos para los cultivos, entretanto, se observó que para la cepa mutante, una

fracción de unidades 3HV dos veces mayor (22 mol%), en cuanto para la cepa original

fue menor que 10 mol%. La tasa de conversión de ácido propiónico en unidades 3HV

durante la fase de acumulo fue de 0.4 gHV/g ac prop para el mutante, contra 0.1 gHV/g ac

prop para la cepa original. Así, los autores relatan que con esa cepa se torna posible

producir P(3HB-co-3HV) con mayor fracción de unidades 3HV, usando menos ácido

propiónico.

En estudios semejantes, Sartori (1998) obtuvo una cepa mutantes A. eutrophus UV1,

derivada de R. eutropha DSM 545, incapaz de crecer en propionato, visando su mejor

aprovechamiento para la biosíntesis de las unidades 3HV del polímero. La cepa mutante

UV1 acumuló 37 mol% de 3HV, en cuanto a la cepa original acumuló a penas 8.6 mol%

y se mostró capaz de convertir 60.7% de todo el propionato suministrado a unidades

3HV, siendo que, en las mismas condiciones, la cepa original sólo convirtió 18.5%. Más

allá de eso, la cepa mutante todavía mantiene, o hasta supera, la capacidad de

producción de polímero total de la cepa original. De esta forma, el nuevo mutante es

presentado como un óptimo potencial de aprovechamiento industrial.

Otro microorganismo que está siendo estudiado para la producción de PHA´s es

Burkholderia sp. Burkholderia sp. LFM 101 es presentada como una buena productora

del polímero, entre tanto, la conversión de acido propiónico en unidades 3HV es

restricta a menos de 10% del rendimiento máximo teórico, que es de 1.35g 3HV/g ácido

propiónico de acuerdo con Gómez et al (1996). La intención de aumentar esta eficiencia

de conversión y utilización del ácido propiónico, Silva et al, desenvolvieron mutantes de

Burkholderia sp. LFM 101 incapaces de crecer en ácido propiónico, todavía capaces de

acumular unidades de 3HV del ácido. El mutante Burkholderia sp. LFM 189 y la cepa

34

original fueron comparadas creciendo en un biorreactor con raciones de ácido

propiónico y sacarosa (P/S) de 0.44 para la cepa original y de 0.09 para el mutante, ya

que era esperado que el mutante tuviese mejor utilización del ácido propiónico. Con el

mutante LFM 189 obtuvieron una alta tasa de conversión del ácido propiónico en

unidades de 3HV, de 1.2 gHV/g ac.prop, en cuanto para la cepa original obtuvieron apenas

0.05 gHV/g ac.prop. Entre tanto, las células acumularon poco polímero, siendo cerca del 50%

para la bacteria LFM 189 y 65% para la LFM 101. Loa autores sugieren que la

elucidación de los mecanismos de de crecimiento del acumulo de PHA en la cepa

mutante puede llevar a nuevos rumbos para garantizar la reducción de costos en la

producción de P(3HB-co- HV) usando este mutante y aplicando estrategias adecuadas

de cultivo.

35

3 JUSTIFICACIÓN

La mayoría de los plásticos producidos durante décadas son de origen petroquímico, es

decir, de fuentes naturales no renovables, que por el acelerado crecimiento urbano y la

necesidad de consumo han ido agotando rápidamente dicha materia prima. Esto ha

generando en la población y especialmente en los investigadores un interés particular

por hallar soluciones rápidas y concretas de fuentes naturales y por ende, de organismos

capaces de solucionar el problema ambiental que están generando los plásticos

producidos a partir de petróleo, ya que la degradación de éstos se lleva a cabo en un

tiempo mayor a 100 años (Duarte, 2004).

Por lo anteriormente mencionado, en la actualidad, se están desarrollando diversas

investigaciones que conllevan a la producción de plástico a partir de materias primas

renovables, que minimizan el consumo de petróleo y por ser fabricadas a partir de

fuentes naturales, son fácilmente degradadas y producidas.

Debido a los altos costos de éste plástico, a la participación mínima en el mercado

internacional y a las dificultades de procesamiento, se están buscando cepas altamente

eficientes en la conversión de sustratos en el producto deseado, así como en el desarrollo

de procesos que permitan explorar al máximo el potencial de dichas cepas y del

desenvolvimiento de procesos extracción-purificación, de forma que los costos sean

reducidos drásticamente. (Franchetti, 2006)

Actualmente se produce plástico biodegradable a partir de la sacarosa obtenida del

bagazo de caña (materia prima que es ampliamente cultivada en suelo Brasilero),

utilizando microorganismos que acumulan intracelularmente el polímero PHA como B.

sacchari, a partir del cual es producido plástico. Por los antecedentes mencionados, día

a día se busca investigar nuevas fuentes de carbono que permitan acrecentar el

rendimiento teórico de producción de polímero, disminuyendo así costos de producción

y por ende del producto, haciéndolo accesible al público en general, así como

incrementando sus diferentes usos.

36

Según antecedentes bibliográficos, se están desarrollando metodologías que investigan

la utilización de sacarosa con propionato como fuente de carbono, para obtener un

plástico mucho más maleable y de fácil degradación por diferentes organismos, que

conllevan a la disminución del impacto ambiental. Por ende es de gran importancia

restablecer el fenotipo de los mutantes LFM 183, 184, 185, 186 y 198, conocer los genes

afectados, restituyendo la expresión de los intermediarios de la vía de la α-oxidación,

con el fin de alcanzar un rendimiento teórico cercano al de la cepa salvaje, es decir, de

0,10 g/g.

Una vez obtenido el fragmento que restituyó el fenotipo salvaje a éstos mutantes, debe

ser validada la complementación integral por medio de experimentos en frascos

agitados. Si esto se lleva a cabo, quiere decir que los fragmentos contienen genes

relacionados en el catabolismo de propionato en éstos mutantes afectados en el uso de

intermediarios de la α-oxidación. Siendo así, los fragmentos de DNA con esta propiedad

constituyen una importante herramienta para investigar en trabajos posteriores si existe

la vía en cuestión e propones nuevos experimentos para mejorar aún más la formación

de 3HV.

Dentro de esta fase observada en la literatura está siendo realizado el presente trabajo,

cuyos objetivos se encuentran a seguir.

37

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL El objetivo de este trabajo fue validar mutantes de B. sacchari incapaces de crecer en

propionato como única fuente de carbono (prp), buscando en una biblioteca genómica,

construida a partir de la cepa salvaje, fragmentos de DNA capaces de restituir el

fenotipo prp+ a los mutantes afectados en el uso de intermediarios de la alfa-oxidación

de propionato.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analizar una biblioteca genómica de B. sacchari salvaje, para seleccionar

clones conteniendo fragmentos de DNA originales, capaces de restituir la

capacidad de crecimiento en propionato a los mutantes en estudio.

Corroborar la agrupación de los mutantes LFM 183, 184, 185, 186 y 198, por

medio de repeticiones ensayos fenotípicos, como se encuentra reportado en la

literatura.

Evidenciar en cuál de los posibles intermediarios de la α – oxidación se

encuentran afectados los mutantes en estudio.

Validar cuantitativamente el grado de complementación por medio de

ensayos de acumulo a los mutantes complementados.

38

5 MATERIALES Y MÉTODOS.

5.1 TIPO Y LUGAR DE ESTUDIO. El presente trabajo de Grado fue de carácter investigativo, el cual se realizó en los

laboratorios de Fisiología de Microorganismo, en el Instituto de Ciencias Biomédicas II

de la Universidad de Sao Paulo ubicada en Sao Paulo (Brasil).

5.2 POBLACIÓN Y MUESTREO. Las muestras fueron manejadas en la cámara de flujo laminar, en condiciones

controladas, de acuerdo con la reglamentación empleada en el laboratorio de Fisiología

de Microorganismos, ubicado en el Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad

de São Paulo.

5.3 MICROORGANISMOS Y PLÁSMIDOS UTILIZADOS EN EL ESTUDIO. Los microorganismos y plásmidos (vectores de clonage) utilizados en el estudio fueron

las cepas enunciadas en la Tabla 1, donde se enuncian las características principales de

las mismas. Las cepas anteriormente mencionadas fueron suministradas por el laboratorio

de Fisiología de Microorganismos, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la

Universidad de Sao Paulo, en forma liofilizada y/o preservada en glicerol al 10%.

Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos (vectores de clonage) empleados.

CEPA CARACTERÍSTICAS ORIGEN

Burkholderia sacchari

LFM 101 Sac+, PHA+, prp+, Kans, Amps, Tcs, acet+ lac+ pir+ Gómez et al., 1996


LFM 183

Sac+, PHA+, prp-, Kans, Amps, Tcs, acet- lac-

pir -

Silva et al.,

2000


LFM 184


Sac+, PHA+, prp-, Kans, Amps, Tcs, acet- lac?

pir -

Silva et al.,

2000

39

LFM 185


LFM 186


LFM 198 Sac+ PHA+ acet- prp- lac+ pir- Kans Amps Tcs

Escherichia coli S17-1 PHA-, Tcs, recA, genes tra do plásmido RP4 integrado al

DNA genómico Simon et al.,

1983

pVK100 Cósmido 23,0Kb Tcr, Kmr Knauf e Nester,1982

pVK100::P1 Cósmido 23,0Kb Tcr, Kmr, abrigando inserto en estudio Este trabajo pVK100::P2 Cósmido 23,0Kb Tcr, Kmr, abrigando inserto en estudio Este trabajo

LFM- Laboratorio de Fisiología de Microorganismos del ICB-USP; Sac+- crecimiento en

sacarosa; PHA+- acumulo de PHA; acet- - ausencia de crecimiento en acetato; prp- -

ausencia de crecimiento en propionato; lac-- ausencia de crecimiento en lactato; pir--

ausencia de crecimiento en piruvato; Kans – sensibilidad a canamicina; Amps –

sensibilidad a ampicilina; Tcs – sensibilidad à tetraciclina.

Cada una de las cepas que fueron halladas en el presente trabajo fueron preservadas en

glicerol al 10% y mantenidas en un freezer con temperatura de -80ºC.

5.4 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo empleados en cada uno de los ensayos, fueron esterilizados en

autoclave por 20 minutos (min) a 121ºC, a 1 atmósfera de presión (atm).

Al preparar los diferentes medios minerales que contienen glucosa, sacarosa, propionato,

entre otros, la fuente de carbono fue esterilizada por separado y adicionada después a la

esterilización de las soluciones de sales.

En el preparo de medios minerales sólidos, la solución de sales minerales y de agar

fueron esterilizados separadamente de la fuente de carbono.

Los medios sólidos fueron obtenidos por la adición de agar (20 g/L).

40

5.4.1 Medio Luria-Bertani - LB (Sambrook et al., 1989).

• Triptona 10g

• Extracto de levadura 5g

• NaCl 10g

• H2O 1000mL

5.4.2 Caldo nutriente (CN)

• Extracto de carne 3g

• Peptona 5g

• H2O 1000mL

5.4.3 Medio Mineral (MM) (MM-Ramsay et al., 1990)

• Na2HPO4 3,5g

• KH2PO4 1,5g

• NH4SO4 1,0g

• Solución de elementos traza 1,0mL

• Citrato férrico 6% 1,0mL

• CaCl2. 2H2O 1% 1,0mL

• MgSO4. 7H2O 20% 1,0mL

5.4.3.1 Solución de elementos traza

• H3BO3 0,3g

• CaCl2. 6H2O 0,2g

• ZnSO4.7H2O 0,1g

41

• MnCl2.4H2O 30,0mg

• NaMoO4.2H2O 30,0mg

• NiCl2.6H2O 20,0mg

• CuSO4.5H2O 10,0mg

• H2O 1000mL

5.4.3.2 Medio mineral con sacarosa. Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de sacarosa.

5.4.3.3 Medio mineral con propionato. Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de propionato.

5.4.3.4 Medio mineral con sacarosa y canamicina. Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de sacarosa e canamicina

(100μL/mL).

5.4.3.5 Medio mineral con sacarosa e tetraciclina. Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de sacarosa e tetraciclina

(12,5μL/mL).

5.4.3.6 Medio mineral con glucosa Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de glucosa.

5.4.3.7 Medio mineral con glucosa y canamicina Medio mineral descrito en el ítem 5.3.3 conteniendo 1g/L de glucosa y canamicina

(100μg/mL).

5.5 ANTIBIÓTICOS EMPLEADOS. Las soluciones de antibióticos utilizadas fueron preparadas de acuerdo con Sambrook et

al. (1989) y esterilizadas en un filtro de porosidad de 0.22 μm estéril. Las soluciones stok

fueron mantenidas en freezer -20ºC, y adicionadas a los medios de cultivo, después de la

esterilización y enfriamiento a 50ºC, como se muestra en la tabla 2.

42

Tabla 2. Antibióticos utilizados.

5.6 CONDICIONES DE CULTIVO Las cepas de E. coli fueron cultivadas en medio Luria Bertani (LB) (Sambrook et al.,

1989) e incubadas a 37 ºC durante 18 – 24 horas. Los antibióticos fueron adicionados al

medio conforme al ítem 5.4.

Burkholderia sacchari LFM 101 y los mutantes obtenidos de ella, con los cuales se

realizó el presente estudio, fueron cultivados en caldo nutriente (CN), medio LB, o medio

mineral (MM), con la respectiva fuente de carbono, por 24 horas durante 30 ºC a 200

rpm, conteniendo antibióticos adecuados, cuando fuese necesario.

5.7 PRESERVACIÓN DE CEPAS Todas las cepas bacterianas empleadas en la investigación, fueron preservadas y

almacenadas a través de dos métodos (Silva et al., 1992): a) Criopreservación en glicerol

al 10% (v/v), almacenando a – 80 ºC y b) Liofilización en solución de leche al 10 % y

glutamato de sodio al 5 %, siendo almacenadas finalmente en refrigerador doméstica.

5.8 REACTIVACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA BIBLIOTECA GENÓMICA Y DE LOS MUTANTES DE B. sacchari.

La biblioteca genómica existente, creada por Cintra e colaboradores (2007) fue

reactivada en medio LB con kanamicina (LBK), la cual se construyó con el DNA

genómico de la cepa salvaje (cepa B. sacchari LFM 101), adecuadamente digerido, en

fracciones específicas del mismo, ligándolos posteriormente al cósmido pVK100 (Knauf

& Nester, 1982), para luego ser empacotado en capsides del fago λ y transducido para E.

coli S17-1 (Simon et al., 1983). Como una alternativa, el vector con inserto (s), se

introdujo en esta bacteria por transformación. Los clones se seleccionaron en medio Luria

Bertani con tetraciclina (LBT) y/o canamicina (LBK).

Antibiótico Solución stok (mg/mL) Concentración final (μg/mL)

Ampicilina (Amp) sal sódica 100 (en H2O) 100 Canamicina (Kan) 50 (en H2O) 100

43

Se realizó la recuperación de la biblioteca genómica construida en estudios anteriores, así

como de los mutantes liofilizados o criopreservados, de acuerdo a la cepa bacteriana, se

realizó la semeadura en un medio LBK y LB, los cuales aseguraban un buen crecimiento

y permitiesen validar la viabilidad de las cepas, así como para verificar que todos los

mutantes a lo largo de su almacenamiento mantuvieran las características fenotípicas

(perfil de utilización de intermediarios de la α-oxidación, así como de propionato)

anteriormente observadas, así como la ausencia de contaminantes con la que fueron

preservados.

Así mismo, fue realizada una validación de la biblioteca genómica por medio de un test

de eficiencia, con el fin de verificar si la biblioteca construida poseía fragmentos de

DNA genómico de la bacteria (B. sacchari) conteniendo un numero suficiente de clones

para ser representativo de todo el genoma bacteriano, y así mismo evidenciar si el

cósmido pVK100 había sido empacotado con éxito, conteniendo insertos y segundo, si

éstos fragmentos de DNA eran iguales, o si por el contrario el tamaño de las bandas era

diferente y aseguraba una buena representación del genoma de Burkholderia. Para lo

cual, 28 clones de la biblioteca fueron escogidos aleatoriamente para extraer su DNA

plasmidial y realizar la digestión con endonucleasas de restricción Eco RI.

5.9 ENSAYO FENOTÍPICO DE MUTANTES. Al tener todos los mutantes reactivados y conferir que no tuviesen contaminantes, se

procedió a confirmar las características fenotípicas de cada uno de ellos, como fue

realizado anteriormente (Silva, 1998). Cada uno de los mutantes fue semeado en medio

mineral sólido, con diferentes fuentes de carbono, con concentración final de 1g/L como

sacarosa, fructosa, glucosa, propionato, lactato, acetato y piruvato como se encuentra

descrito en el ítem 5.4.3, y el medio con ácido acrílico con concentraciones finales de 1

g/L, 0,5 g/L y 0,25 g/L para posterior incubación a 30 ºC por un periodo de tiempo

indeterminado, es decir, hasta observar crecimiento de alguna de las cepas.

5.10 COMPLEMENTACIÓN DE MUTANTES. Los fragmentos contenidos en la biblioteca genómica construidos en Cintra y

colaboradores (2005), capaces de complementar los mutantes prp- LFM 183, 184, 185,

44

186 y 198, fueron seleccionados por conjugación, empleándose medio mineral sólido,

conteniendo propionato (1g/L) y canamicina (MMPK). En una placa de medio mineral

conteniendo sacarosa y kanamicina (MMSK) y otra conteniendo propionato y

kanamicina (MMPK), fueron semeados con asa de Drigalski 200 μL de una cultura del

mutante, después de 5 minutos, fueron estriados los clones de la biblioteca genómica.

Posterior a la conjugación, los clones que presentaron un crecimiento significativo en

medio MMPK, fueron transferidos a un nuevo medio MMPK, con el fin de confirmar, la

restitución del fenotipo prp a los mutantes, para finalmente ser semeados en medio LB

con canamicina (LBK), con el objetivo de realizar posteriores análisis.

Es importante resaltar, que cada una de las culturas por separado, no puede crecer en

estos medios, debido a que E. coli S17-1, necesita factores de crecimiento para obtener

un aumento significativo de células, por ende no crece en un medio mínimo con sacarosa

como fuente de carbono. Así mismo B. sacchari no crece en medio que contiene

antibiótico, por tanto en este medio de cultivo, sólo crecen los mutantes de B. sacchari

que recibieron el cósmido pVK100 por conjugación. Los clones de E. coli capaces de

complementar los mutantes, así como cada uno de los mutantes complementados fueron

cultivados en medio LBK. Posteriormente fueron sometidos a extracción de DNA

plasmidial, digeridos con endonucleasa de restricción EcoRI y analizados por

electroforesis en gel de agarosa para verificar si ambas cultivos contenían el mismo

conjunto de cósmido e inserto.

5.11 EXTRACCIÓN DE DNA PLASMIDIAL (MINIPREP) Para la extracción de DNA plasmidial, se utilizó el kit de extracción de la marca

Eppendorf de Brasil Ltda. (Plasmid Mini), Invitrogen Corporation (Plasmid DNA

Purification) y Quiagen (QIAprep Spin Miniprep Kit), así como en algunas ocasiones se

empleó el método de Birnboim y Doly (1979), modificado. La cepa de E. coli que

contiene el plásmido de interés fue cultivada durante toda la noche, aproximadamente 24

horas en 25 mL de medio Luria Bertani (LB), conteniendo el antibiótico adecuado. La

cultura fue centrifugada en alícuotas de 1,5 mL por 5 minutos a 13000 rpm (centrífuga

Eppendorf 5810). El sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas en

100 μL de solución de GETL frío (ver ítem 5.11.1), agitando vigorosamente y siendo

45

incubadas en baño de hielo por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 200 μL de SDS

en NaOH 0,2 M; se mezclo por inversión y se incubó por 5 minutos en baño de hielo.

Para la precipitación del DNA cromosomal e de las proteínas, se adicionaron 150 μL de

solución de acetato de potasio previamente enfriada y, después una nueva incubación por

5 minutos en baño de hielo, se centrifugó por 10 minutos, a 6000 rpm, con una

temperatura de 4ºC. El sobrenadante, el cual contiene el DNA plasmidial fue transferido

para un nuevo tubo, donde se procedió a realizar la extracción con fenol/cloroformo (250

μL de fenol y 250 μL de cloroformo), se centrifugó por 10 min, a 13000 rpm, a 4 ºC. En

seguida, fue realizada la precipitación con etanol absoluto (750 μL), posteriormente se

incubó durante un periodo de 15 – 30 min en baño de hielo, centrifugándose por 10

minutos a 13000 rpm, 4 ºC y el “pellet” fue seco al vacío durante 20-30 min y

resuspendido en agua con 0,01 % del volumen de la solución de RNAse y la mezcla fue

incubada por 1 hora a 37 % y mantenida a -20 ºC. a continuación se encuentran descritas

las soluciones empleadas para la extracción de DNA:

5.11.1 Solución de GETL (Birnborim e Doly, 1979) Lisozima 4 mg/mL

Glucosa 50mM

EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 10mM

Tris/HCL (Hidroclorato de hidroximetil aminometano) 25Mm

pH 8,0

5.11.2 Solución de acetato de potasio (Birnboim e Doly, 1979)

• Acetato de potasio 5M 60mL

• Acido acético 11,5mL

• H2O 28,5mL

5.12 GEL DE AGAROSA. (Sambrook et al., 1989)

46

Para el análisis del DNA, se utilizó gel de agarosa en las concentraciones de 0.8% y 1,0

% (m/v). Se utilizaron las soluciones TBE, TAE y TAE modificado como tampón de

corrida (Sambrook et al., 1989).

Las muestras de DNA fueron aplicadas en los gels, con 1/10 del volumen de colorante de

corrida. Las corridas electroforéticas en mini-gels fueron realizadas a 90 V, 80 mA, 80 W

durante 1 hora.

Los fragmentos fueron observados después de la coloración con brometo de etidio

(0,1mg/100mL de TBE) durante 20 minutos, lavándolo posteriormente en el mismo

tampón, con el fin de mejorar la visualización sobre luz UV (254 nm), en el

transiluminador (Ultralum 100)

5.12.1 Solución TBE Tris (hidroximetil aminometano) 54g

Ácido bórico 27,5g

EDTA de calcio e sodio (etileno diamino tetracetato) 0,5M (20mL)

H2O 1000mL

5.12.2 Solución TAE Tris-base 242g

Acido acético glacial 57,1mL

EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 0,5M (100mL)

H2O 1000mL

5.12.3 Colorante de corrida

• EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 2ml 5M pH=8,0

• Azul de bromofenol 0,5g

47

• Glicerol 5g

• H2O 100mL

5.13 MANIPULACIÓN DEL DNA

5.13.1 Digestión del DNA Para la digestión del DNA, se adicionó la enzima de restricción según las instrucciones

del fabricante (Invitrogen Corporation) incluyendo el tampón adecuado. Para cada 1μL

de DNA, se utilizaron de 1 a 2 unidades de la enzima, de forma que esta representase

máximo 10 % del volumen. La digestión del DNA fue incubada a 37 ºC “overnight”.

Después de la digestión, se inactivo la enzima de restricción a 65 ºC por 10 min.

5.14 EXPERIMENTO DE ACUMULO DE PHA PARA EVALUAR EL EFECTO DE LAS COMPLEMENTACIONES OBTENIDAS.

En esta etapa, fue propuesto un protocolo para validar si los clones restituían la capacidad

de crecimiento en propionato, así como la capacidad de conversión del propionato a

unidades 3HV presentada por la cepa salvaje. A fin de evitar las diversas manipulaciones

diversas propuestas por Silva y colaboradores (2000) en sus experimentos y facilitar la

aplicación de este test simultáneamente para gran número de cepas y controles, y al

mismo tiempo proponer modificaciones en el protocolo de la literatura, los siguientes

procedimientos fueron testados para el ensayo de acumulo. Se realizó la activación de las

cepas a emplear, semeando los mutantes y de los mutantes complementados con

fragmentos de DNA de la biblioteca genómica, en medio CN y en CNK respectivamente.

Posteriormente, fueron inoculadas las cepas mencionadas en medios líquidos (CN y CNK

respectivamente), con un volumen de 25 mL y fueron colocados en agitación constante

de 200 rpm, durante 24 horas a 30 ºC. Cumplido el tiempo de incubación, fueron

transferidos como inóculos para los medios MM con diferentes concentraciones de fuente

de carbono. El volumen de los inóculos representaba 10% del volumen total del medio

mineral utilizado en el experimento. El contenido inicial del MM era apenas glucosa

como fuente de carbono (10 g/L) y sulfato de amonio en 1 g/L, siendo incubados en

shaker a 200 rpm, 30 º C durante 20 horas, con el fin de asegurar el crecimiento de cada

una de las cepas, así como para asegurar que la fuente de nitrógeno y dejar un exceso de

azúcar. Después de acabado el nitrógeno, comienza la fase de acumulo y a parte de la

48

glucosa residual , fue adicionado ácido propiónico con el fin de asegurar la síntesis de

P3HB-co-3HV, manejando 4 concentraciones diferentes, siendo a) sin adición de

propionato (0 g/L), b) concentración de 0,25 g/L, c) concentración de 0,75 g/L, y d)

concentración de 1,00 g/L. Posterior a la adición del propionato, fueron retiradas 4

muestras de 1,5 mL para respectivos análisis de biomasa, azúcares, ácidos, entre otros,

para finalmente incubar las culturas en shaker a 200 rpm, 30 ºC durante 48 horas.

Finalizadas las 72 horas, fueron retiradas 2 muestras de 10 mL, centrifugadas, donde los

“pellets” obtenidos fueron empleados para determinar masa seca celular y para ser

liofilizado con el fin de realizar propanólisis para medir PHA formado, como se muestra

en la figura 3. Fueron determinados biomasa, concentración de fuentes de carbono y de

PHA en el inicio y final del ensayo. Los diferentes análisis fueron realizados como se

encuentra descrito en Silva (1998).

Figura 3. Esquema de los experimentos de acumulo de polímero, realizados a los

mutantes y mutantes complementados de la cepa B. sacchari LFM 101.

5.15 DETERMINACIONES ANALÍTICAS. Las siguientes determinaciones fueron empleadas durante los experimentos de validación

de las cepas y mutantes descritos en el ítem anterior.

49

5.15.1 Concentración celular. Para medir la concentración celular se determinó la masa seca celular, después de la

centrifugación, filtrando en una membrana con diámetro de poro de 0,45 μm y dejándolas

secar en una estufa a 105 ºC hasta obtener un peso constante, así mismo, se colocó como

control una membrana sin filtración de ninguna muestra para evaluar la variación de la

humedad.

5.15.2 Proporción de polímero Los polihidroxialcanoatos producidos en las diferentes condiciones testadas fueron

cuantificados por cromatografía gaseosa, como fue descrito por Riis & Mai (1988)

modificado como se encuentra descrito en Silva (1998).

Se centrifugaron 10 mL de la suspensión celular (siendo éste un volumen de acuerdo a la

concentración de PHB en la célula), a 7000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente se

descartó el sobrenadante y se mantuvo la biomasa, para ser liofilizada. Al tener las

células en dicha condición se procedió a pesar 10 mg en tubos de vidrio de 10 mL con

tapa rosca y fueron adicionados 0,1 mL de la solución ácido benzoico más propanol, más

1,5 mL de la solución de HCl más propanol y 1,5 mL de 1,2 dicloroetano. Seguidamente,

los tubos fueron cerrados fuertemente con ayuda de teflón y se agitaron vigorosamente,

para colocarlos finalmente en baño termostatado a 105 ºC por 3 horas, agitándolos en la

primera media hora. Después de ser retirados y enfriados, se adicionaron 4 mL de agua

destilada y se agitaron vigorosamente, con el fin de recuperar la fase orgánica en el fondo

del tubo para análisis; finalmente se retiró el residuo de agua con sulfato de sodio

anhidro.

Para calcular la concentración de la muestra, se realizó el siguiente cálculo:

FRamostraMasa

benzóicoAMasa

benzóicoAÁrea

PHBÁreaPHB 100.

.% ××=

50

6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

6.1 ENSAYO FENOTÍPICO Los resultados de la validación de las características fenotípicas de los mutantes prp se

representan en la Tabla 3, donde se muestra el consumo de los diferentes sustratos,

pertenecientes a los intermediarios de la α-oxidación, así como la agrupación de los

mismos de acuerdo a los sustratos consumidos. Se observa que el mutante LFM 198 a

diferencia de los otros mutantes en estudio, presenta un buen crecimiento en medio con

ácido láctico, lo cual puede indicar que posiblemente se encuentra afectado en los

anteriores intermediarios de la α-oxidación.

Tabla 3. Validación del crecimiento de los mutantes prp de B. sacchari LFM 183,

184, 185, 186 y 198 en diferentes compuestos.

MMG MMS MMF MMP MMAL MMPir MMAAc

GRUPO

FENOTIPICO

LFM 101 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Salvaje

LFM 183 +++ +++ +++ --- --- --- --- I

LFM 184 +++ +++ +++ --- --- --- --- I

LFM 185 +++ +++ +++ --- --- --- --- I

LFM 186 +++ +++ +++ --- --- --- --- I

LFM 198 +++ +++ +++ --- ++ --- --- III

+++: Crecimiento altamente visible. ++: Buen crecimiento. +: Crecimiento difícilmente notable. ---: Ausencia de crecimiento. MMG (medio mineral con glucosa), MMS (medio mineral con sacarosa), MMF (medio mineral con fructosa), MMP (medio mineral con propionato), MMAL (medio mineral con ácido láctico), MMPir (medio mineral con Piruvato), MMAAc (medio mineral con ácido acético), todos con concentración final de 1 g/L.

Al comparar los resultados del presente ensayo con el experimento realizado cuando se

agruparon los mutantes de B. sacchari obtenidos por UV como se encuentra

mencionados en Silva (1998) se puede observar que la única diferencia existente entre los

grupos II y III es el consumo de lactato.

Medio

Cepa

51

Los mutantes fueron evaluados en presencia de ácido acrílico, como se encuentra

representado en la Tablas 4, donde se observa que se realizaron tres ensayos, en los

cuales fue ofrecido como fuente de carbono ácido acrílico correspondientes a las

siguientes concentraciones finales en el medio: 1 g/L, 0,5 g/L y 0,25 g/L, para cada uno

de los mutantes en estudio.

Tabla 4. Validación del crecimiento de los mutantes prp de B. sacchari LFM 183,

184, 185, 186 y 198 en ácido acrílico.

MMAA

1 g/L 0,5 g/L 0,25 g/L

LFM 101 --- + ++

LFM 183 --- --- ++

LFM 184 --- + ++

LFM 185 --- + ++

LFM 186 --- --- ++

LFM 198 --- + ++

++: Buen crecimiento. +: Crecimiento difícilmente notable. ---: Ausencia de crecimiento. MMAA (medio mineral con ácido acrílico).

Como se observa en la tabla anterior, ninguna de las cepas creció en presencia de 1 g/L

de ácido acrílico, lo cual está de acuerdo con los resultados de Silva (1998). Las cepas

LFM 101, 184, 185 y 198 presentaron crecimiento difícilmente visible incluso después de

10 días de incubación, comparado con 0,5 g/L de ácido acrílico. Al analizar las cepas

LFM 183 y 186, éstas no crecieron en ésta condición. Entre tanto, cuando se trabajó con

una concentración de 0,25 g/L, todas las cepas presentaron un buen crecimiento. Estos

resultados deben ser presentados por la actividad tóxica del acrilato, el cual puede actuar

como inhibidor de la β-oxidación. La literatura presenta trabajos que utilizaron el ácido

acrílico para inhibir la β-oxidación de ácidos grasos en organismos como especies de

Aeromonas (Kobayashi et al 1994) y en E. coli (Lu et al 2003). Los autores

anteriormente mencionados, trabajaron con concentraciones de 0,1 g/L de ácido acrílico

Medio Cepa

52

para inhibir la β-oxidación, sin observar un efecto negativo para las células en dicha

concentración pero sí en una modificación del PHA resultante. En el presente trabajo con

Burkholderia, los efectos inhibitorios sobre el crecimiento fueron evidentes cuando la

concentración de ácido acrílico fue de 1,0 g/L, disminuyendo ya con 0,5 g/l y todavía

más con 0,25 g/L, siendo ésta última un valor 2,5 veces mayor que aquella concentración

utilizada en los artículos mencionados. En este caso, no fueron analizados los impactos

del ácido acrílico sobre el PHA obtenido, una vez que se pretendía validar pasos alterados

de la α-oxidación de propionato en los mutantes alterados. A partir de todos los sustratos

evaluados se procedió a realizar una subclasificación de los mutantes con base en los

resultados presentados por su crecimiento en acrilato, así como ubicarlos de acuerdo a los

sustratos consumidos en los grupos propuestos por Silva (2000), como se puede observar

en la Tabla 3.

Tabla 3. Nueva clasificación de los mutantes en estudio de acuerdo a los sustratos

consumidos.

CEPA GRUPO FENOTÍPICO SUBGRUPO CLASIFICACIÓN

FINAL LFM 101 Salvaje Salvaje LFM 183 I b Ib LFM 184 I a Ia LFM 185 I a Ia LFM 186 I b Ib LFM 198 III a IIIa

I: mutantes que consumen MMG (+), MMS (+), MMP (-), MMAL(-), MMPir(-), MMAAc (-). III: mutantes que consumen MMG (+), MMS (+), MMP (-), MMAL(+), MMPir(-), MMAAc (-). a: mutantes que crecen en ácido acrílico en concentración de 0,5 g/L y 0,25 g/L. b: mutantes que crecen en ácido acrílico en concentración 0,25 g/L, pero no en 0,5 g/L. Al observar los pasos intermediarios de lo que sería la α-oxidación de propionato, fue

elaborada la figura 4, en la cual están indicados los pasos metabólicos en el que cada uno

de los mutantes podría estar afectado y que resultaría en los ensayos fenotípicos

observados en estos test. A pesar de que la presencia de la alfa-oxidación de propionato

había sido propuesta en el pasado por Wegener y colaboradores (1968) y Fernández –

Briera y Garrido - Pertierra (1988), estos autores no validaron el crecimiento de los

organismo estudiados o sus mutantes en ácido acrílico, siendo su afirmación basada en la

53

medida de la actividad de la enzima Acrilil CoA hidratasa y lactato deshidrogenasa, en

otras, en extractos celulares de Salmonella typhimurium L2 y E. coli.

Figura 4. Vía metabólica para la alfa-oxidación de propionato. Son indicados los grupos fenotípicos de los mutantes en estudio, en el último substrato de la vía en que son capaces de crecer.

6.2 VALIDACIÓN DE LA BIBLIOTECA GENÓMICA DE Burkholderia sacchari LFM 101.

De una biblioteca genómica de aproximadamente 2000 clones, 28 clones fueron

escogidos al azar para ser sometidos a extracción de DNA plasmidial. Los plásmidos

fueron entonces sometidos a digestión con la misma enzima de restricción utilizada para

la construcción del banco genómico. Dos fueron los objetivos de este análisis: verificar si

CH3 – CHOH – COSCoA Lactil CoA

CH3 - CH2 - COSCoA Propionil- CoA

CH2 = CH – COSCoA

CH3 – CHOH – COOH Lactato

CH3 - CH2-COOH Propionato

CH3 – CO – COOH Piruvato

CH3 – COSCoA Acetil CoA

LFM 183 y 186 (Grupo Ib), LFM 184 y 185 (Grupo

Ia)

LFM 198 (Grupo IIIa)

54

había sido exitosa la ligación de insertos de fragmentos de DNA genómico en el

cósmido pVK100 y, en caso de ser afirmativo, si estos insertos eran diferentes, de tal

forma que se pueda re presentar el genoma de la cepa salvaje.

Después de la digestión del cósmido que contiene los insertos, cada uno de ellos fue

analizado por electroforesis en gel de agarosa. La figura 5 presenta los resultados

obtenidos a partir de estos 28 clones. Se observa que se obtuvieron bandas de fragmentos

de DNA con tamaños diferentes, demostrando que la ligación de insertos al cósmido, así

como la formación de concatámeros y el empacotamiento fueron eficientes.

De igual forma, para estimar si la biblioteca es compuesta por un número de clones

suficientes para representar todo el genoma de B. sacchari y todavía, como el genoma de

esta bacteria no fue secuenciado, al realizar la validación de la biblioteca, se realizó una

búsqueda en bancos de datos que indicaran el tamaño de los genomas de las diferentes

Burkholderia, el cual varió de 5,2 Mb a 7,3 Mb, siendo en promedio de 6,57 Mb. Según

Clarke & Carbon (1976), a través de la fórmula matemática N = ln (1-P)/ ln (1-f), siendo

P la probabilidad de cualquier secuencia de DNA de ser representada en la biblioteca y f

el tamaño del inserto dividido por el tamaño del genoma, se obtienen el número de clones

(N) necesarios en una biblioteca genómica para que ésta represente bien el genoma de la

bacteria en su totalidad. Se usó una probabilidad del 99 % y tamaños de insertos mínimas

de 25 Kb ( siendo que el vector utilizados posee 23 Kb y el sistema de empacotamiento

del fago lambda reconoce fragmentos de DNAs de 48 a 56 Kb para empacotamiento),

obteniéndose N= 1207 clones. De esta forma, para B. sacchari, se puede considerar que

esta biblioteca genómica construida con aproximadamente 2000 clones representa bien su

genoma.

55

Figura 5. Gel de agarosa después de una corrida electroforética, indicando los diferentes padrones de bandas de algunos de los 28 clones seleccionados al azar de la biblioteca genómica de B. sacchari: (1)(14) Padrón: DNA λ digerido con Hind III; (2 a 13) clones escogidos aleatoriamente y digeridos con EcoRI.

6.3 BÚSQUEDA DE CLONES QUE RESTITUYEN EL FENOTIPO prp+ EN MUTANTES AFECTADOS EN INTERMEDIARIOS DE LA ALFA OXIDACIÓN.

En la biblioteca genómica se buscaron clones capaces de restituir la capacidad de

crecimiento de los mutantes en propionato, por medio de ensayos de complementación

homóloga descrito en materiales y métodos. Como resultado, dos clones fueron capaces

de complementar los mutantes en estudio. Ésta capacidad de complementación fue

detectada inicialmente con el mutante LFM 184. Cuando fueron testados frente a los

mutantes LFM 183, 185, 186 Y 198, se obtuvieron los resultados que se presentan en la

tabla 6.

56

Tabla 5. Mutantes prp de B. sacchari complementados fenotipicamente por los

fragmentos P1 y P2.

Grupo fenotípico

Mutantes complementados por P1

Mutantes complementados por P2

I LFM183 LFM183

II LFM184 LFM185 LFM186 LFM184 LFM185 LFM186

III LFM198 LFM198

IV ------------------- -------------------

Los clones fueron denominados P1 y P2. Éstos clones de E. coli fueron cultivados en LBK

y sometidos a extracción de DNA plasmidial. Después de la digestión con endonucleasas

de restricción EcoRI y análisis electroforética en gel de agarosa (Figura 6), fue posible

observar que P1 y P2 son diferentes, pues puede verse el cósmido pVK100 (23 kb) e

insertos de tamaños diferentes, conforme se encuentra ilustrado en la Tabla 7. Los

fragmentos contenidos en los clones fueron también denominados P1 y P2, y los cósmidos

que contienen éstos fragmentos recibieron respectivamente la denominación de

pVK100::P1 y pVK100::P2.

57

Figura 6. Gel de agarosa, después de una corrida electroforética, indicando los productos de la digestión de pVK100::P1 y de pVK100::P2 con diferentes endonucleasas: (1)(8) Padrón: DNA λ digerido con HindIII; (2) pVK100::P1 digerido con Eco RI; (3) pVK100::P2 digerido con EcoRI; (4) pVK100::P1 de la cepa complementada por el clone, digerido con EcoRI; (5) pVK100::P1 de la cepa complementada por el clone, digerido con Eco RI; (6)(7) pVK100 sin digestión.

Tabla 6. Tamaños estimados de los subfragmentos estudiados en cada clone capaz de

complementar los mutantes.

Clone Plásmido Tamaño aproximado de los fragmentos EcoRI

P1 pVK100::P1 23Kb, 20 Kb e 6Kb

P2 pVK100::P2 23Kb, 20 Kb e 8Kb

Al analizar la Figura 6 del gel de agarosa, se observan sólo dos bandas cuando se realizó

la digestión con Eco RI de los clones P1 y P2, haciendo posible notar la diferencia de

intensidad de DNA que es mayor en la región de 20 Kb. Considerando que el sistema de

empacotamiento sólo es posible para tamaños de DNA entre 48 y 56 KB, se puede inferir

que éstos clones deben tener aparte del pVK100, un fragmento mas en ésta región, y otro

fragmento menor, de aproximadamente 6 y 8 Kb para P1 y P2, respectivamente.

Resultados anteriores habían indicados que dos mutantes del grupo IV (LFM 189 y LFM

195) están afectados en una región del DNA genómico de B. sacchari que codifica

58

regiones del gen prpC del 2MCC envuelto en el catabolismo de propionato (Silva, 1998,

Silva et al., 2000, Brämer et al., 2002), cuya inactivación impide el crecimiento en

propionato en ésta bacteria. Entretanto, estos fragmentos pueden contener otras regiones

del 2MCC, diferentes de aquellos ya estudiados en algunos mutantes del grupo IV (ver

región S1 en el Anexo 1), así como contener genes codificadores de enzimas de vías

metabólicas todavía no encontradas.

Sin embargo, fenotipicamente diferentes, mutantes de los grupos I, II y III fueron

complementados por los clones P1 y P2, esperando así, que posteriores análisis de éstos

fragmentos permita evidenciar las causas de los diferentes fenotipos presentados por los

mutantes testados, así como de la restitución del fenotipo salvaje por ellos.

Trabajos anteriores, que datan desde el inicio de los años 1960 hasta 1980, estudiaron el

catabolismo del propionato en microorganismo utilizando herramientas de análisis de

metabolitos después de adicionar propionato marcado y de analizar la actividad

enzimática presente (Wegener et al., 1968, Fernández-Briera & Garrido-Pertierra, 1988).

Tales herramientas llevaron a proponer diversas vías que pueden actuar en éste

catabolismo (London et al., 1999), sin embargo, estos fueron posteriormente criticados

por otros autores (Textor et al., 1997, Blank et al., 2002, Brämer et al., 2002), debido a la

ausencia de evidencias moleculares de la presencia de dichas vías. Trabajos recientes

comprobaron la existencia en el nivel molecular de 2MCC en B. sacchari (Brämer et al.,

2002) y otros se concentraron en estudiar ésta vía en diversos microorganismos (Lee et

al., 2000, Brock et al., 2002, Palacios et al., 2003, Maercker et al., 2005, Muñoz-Elias et

al., 2006). Pereira (2002, 2007) y Pereira et al. (2005) inactivaron regiones específicas

del 2MCC en B. sacchari, codificadoras de prpC y acnM (Anexo 1). Entre tanto, cuando

la eficiencia de éstos mutantes fue validada, todavía no se alcanzó el valor máximo

teórico de Y3HV/Prp, corroborando la hipótesis de la existencia de otra vía metabólica

actuante en el catabolismo del propionato en ésta bacteria. Hasta el momento, son raros

en la literatura otros trabajos que busquen tales evidencias utilizando herramientas

moleculares (Araújo et al., 2004) y de esta forma, justificar la relevancia del presente

trabajo. Un abordaje similar al de Pereira permitirá en el futuro la construcción de

59

cassettes para la inactivación específica de las regiones afectadas en los mutantes objeto

del presente estudio.

6.4 ENSAYO DE ACUMULO. La metodología empleada para realizar los experimentos de acumulo fue diferente de los

de Silva y colaboradores 2000, conforme se encuentra descrito en materiales y métodos.

En los experimentos de Silva y colaboradores, las células eran cultivadas inicialmente en

200 mL de CN, después de esto eran centrifugadas y lavadas con solución de sales para

remover residuos del CN, después de este procedimiento, 100 mL del cultivo eran

centrifugados y toda la masa seca celular era inoculada en 50 ml de medio mineral libre

de nitrógeno, conteniendo glucosa (5 g/L) y propionato (1 g/L). En estas condiciones de

ensayo, apenas el acumulo era favorecido. Así mismo, Silva y colaboradores no

realizaron experimentos cuantitativos para verificar se los clones capaces de restituir el

fenotipo prp+ también restituían la eficiencia original de la cepa salvaje para transformar

el propionato a unidades 3HV (Y3HV/Prp=0,10 g/g). Así, los ensayos propuestos en este

trabajo presentaban dos diferencias de procedimiento: los medios eran inoculados a partir

de caldo nutriente con kanamicina (CNK) directamente en medio mineral con nitrógeno y

exceso de fuente de carbono (glucosa) para que crecieran y, al agotarse el nitrógeno, era

adicionado el propionato para entonces realizarse el acumulo de PHA por los clones

validados. Esto debería demandar menos manipulación y menos riesgo de contaminación.

Otra diferencia es que, para la manutención del Pvk100 con el respectivo inserto

complementador de los mutantes, hubo la necesidad de la adición de antibiótico. Así en

las condiciones testadas, se observaron notables diferencias en el comportamiento de las

cepas, debido a que los mutantes complementados y la cepa salvaje complementada, no

presentaron un buen crecimiento pasadas las 24 horas de cultivo en medio CNK, por

ende se va a ver reflejado en una disminución del acumulo del polímero, así mismo este

hecho puede ser explicado por la presencia del plásmido, ya que los mutantes y la cepa

salvaje que no contenían el plásmido presentaban un buen crecimiento, notado así por la

turbidez observada en el medio. Éste mismo hecho fue observado en los ensayos

realizados en placas de agar cuando se realizaron ensayos de complementación, donde las

cepas testadas demoraron 7 días para crecer en MM. Es importante aclarar que éste

medio no contiene factores de crecimiento que estimulen el rápido desarrollo de las cepas

60

en él semeadas. Por otro lado, los experimentos de determinación de PHA no

evidenciaran la presencia de unidades 3HV en el polímero producido.

A partir de los resultados obtenidos en el ensayo, se pueden proponer repeticiones del

mismo, debido a la necesidad evidente de ajustes para obtenerse resultados confiables

según lo esperado inicialmente, pues por literatura consultada, se esperaba obtener un

rendimiento superior de los mutantes al ser comparados con la cepa salvaje. Así mismo,

al comparar los mutantes complementados con la cepa salvaje, éstos presentaron un

menor rendimiento y no tan cercano al rendimiento esperado.

A partir de los resultados obtenidos en el ensayo, se pueden proponer repeticiones del

mismo, debido a la necesidad evidente de ajustes para obtenerse resultados confiables

según lo esperado inicialmente, pues por literatura consultada, se esperaba obtener un

rendimiento superior de los mutantes al ser comparados con la cepa salvaje. Así mismo,

al comparar los mutantes complementados con la cepa salvaje, éstos presentaron un

menor rendimiento y no tan cercano al rendimiento esperado. Entre los ajustes

propuestos está la reducción de la concentración de antibiótico a ser empleada y la

realización de test de tiempo necesario para llegar a necesidades celulares más altas hasta

el agotamiento de la fuente de nitrógeno. Una posibilidad es el aumento del tiempo de

incubación inicial, antes de adicionarse el propionato destinado al acumulo y la

introducción de mas de un control que seria la cepa salvaje conteniendo el cósmido

pVK100 sin ningún inserto. La ausencia de unidades 3HV en el polímero final puede

indicar la necesidad de ajustes que podrían ser la reducción de propionato adicionado, o

la adición después de que las culturas tuviesen una mayor densidad.

61

7 CONCLUSIONES

Se realizó la validación de la biblioteca genómica de Burkholderia sacchari, observando

que es una buena representación del genoma.

Se corroboró la agrupación de los mutantes LFM 183, 184, 185, 186 y 198, por medio de

ensayos fenotípicos, generando subgrupos de acuerdo al consumo de ácido acrílico.

Se obtuvieron los clones P1 y P2 de la biblioteca genómica de B. sacchari, capaces de

restituir la capacidad de crecimiento en propionato a los mutantes en estudio.

Se validó cuantitativamente el grado de complementación por medio de ensayos de

acumulo a los mutantes complementados, evidenciando un menor crecimiento

comparado con la cepa salvaje y con los mutantes, así mismo presentaron una menor

producción de HV que la cepa salvaje.

62

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Anexo 1

Principales vías descritas para el catabolismo de ácido propiónico (Textor et al.,

1997): a) alfa-oxidación, b) beta-oxidación, c) alfa-carboxilación, d) carbocilación

reductiva y e-g) condensación de Claisen.

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