Crocus sativus -...

177
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ In vivo μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των στύλων του Crocus sativus. Δημακοπούλου Ανδριάνα Βιολόγος Πάτρα 2008

Transcript of Crocus sativus -...

Page 1: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

In vivo μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των στύλων του Crocus sativus. Δημακοπούλου Ανδριάνα Βιολόγος Πάτρα 2008

Page 2: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

2

Τριμελής Επιτροπή

Λάμαρη Φωτεινή, Λέκτορας του Τμήματος Φαρμακευτικής του

Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπουσα).

Κορδοπάτης Παύλος, Καθηγητής του Τμήματος Φαρμακευτικής του

Πανεπιστημίου Πατρών.

Γεωργακόπουλος Κώστας, Επίκουρος Καθηγητής του Τμήματος

Οφθαλμολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών.

Page 3: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

3

Στη μνήμη του αδερφού μου Δημήτρη.

Page 4: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

4

Ευχαριστίες

Η ερευνητική αυτή εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του

Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών του Τμήματος Φαρμακευτικής του

Πανεπιστημίου Πατρών, στην κατεύθυνση ΄΄Φαρμακοχημεία - Φυσικά Προϊόντα:

Σχεδιασμός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών ενώσεων’’. Εκπονήθηκε στο

εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος

Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Λέκτορος κ.

Λάμαρη Φωτεινής.

Για την πραγματοποίηση αυτής της ερευνητικής εργασίας συνέβαλαν σημαντικά

ορισμένοι άνθρωποι, τους οποίους νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω.

Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην επιβλέπουσά μου κ. Λάμαρη

Φωτεινή, η οποία μου εμπιστεύθηκε το θέμα της διατριβής και είχε ουσιαστική

επίβλεψη και συμβολή σε όλα τα στάδια της ερευνητικής μου εργασίας, καθώς και

για τις πολύτιμες συμβουλές της κατά την συγγραφή της παρούσας διατριβής. Παρά

το μεγάλο φόρτο εργασίας ήταν πάντα πρόθυμη να συζητήσει μαζί μου τις

δυσκολίες που αντιμετώπιζα, να προτείνει λύσεις και να με ενθαρρύνει να συνεχίσω

την προσπάθεια. Κυρίως όμως θα ήθελα να την ευχαριστήσω γιατί εκτός από

καθηγήτριά μου υπήρξε και ένα άτομο το οποίο με στήριξε σε μία πολύ δύσκολη

περίοδο της ζωής μου. Υπήρξε ένα άτομο στο οποίο μπορούσα να μιλήσω ανά πάσα

στιγμή και για οποιοδήποτε πρόβλημα και αν αντιμετώπιζα.

Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή της Ιατρικής Σχολής

του Πανεπιστημίου Πατρών κ.Γεωργακόπουλο Κώστα, καθώς και τον

ειδικευόμενο οφθαλμίατρο κ. Δρίμτζια Βαγγέλη για τη συνεργασία τους και την

ουσιαστική συμβολή τους στην πραγματοποίηση της ερευνητικής αυτής εργασίας.

Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος

Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Μαργαρίτη Μαριγούλα για τη δυνατότητα

που μου έδωσε να πραγματοποιήσω ένα μέρος των πειραμάτων μου στο εργαστήριο

Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιολογίας του

Πανεπιστημίου Πατρών, για τις πολύτιμες συμβουλές της ιδιαίτερα στο πεδίο της

Page 5: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

5

φυσιολογίας του εγκεφάλου και για την συνεχή καθοδήγησή της από τα φοιτητικά

μου χρόνια.

Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στις υποψήφιες Διδάκτορες του

Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Παπανδρέου Μάγδα και κ.

Λιναρδάκη Ζαχαρούλα, για την συνεργασία τους και τη βοήθειά τους, και ιδιαίτερα

την κ. Παπανδρέου Μάγδα για την πολύτιμη βοήθεια και τις συμβουλές της στη

διαχείριση των πειραματόζωων.

Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και

Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής, και ιδιαίτερα τον

Καθηγητή κ. Κορδοπάτη Παύλο και την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαγκαφά

Βασιλική, για την αρμονική συνεργασία τους σε όλη τη διάρκεια της ερευνητικής

μου εργασίας.

Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια Διδάκτορα του Τμήματος

Φαρμακευτικής κ. Χρυσάνθη Δήμητρα για τη συνεργασία της και τη βοήθεια που

μου προσέφερε όποτε και αν τη χρειάστηκα, καθώς και τον προπτυχιακό φοιτητή

του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Βαρεμένο Γιάννη για την πολύτιμη βοήθειά του

στη διεξαγωγή μεγάλου μέρους των πειραμάτων του τελευταίου έτους της

ερευνητικής μου εργασίας.

Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου για την διαρκή και πολύπλευρη

στήριξή τους καθ΄ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου και κυρίως για την

ενθάρρυνσή τους να συνεχίσω τις σπουδές μου μετά την απώλεια του αδερφού μου.

Page 6: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

6

Π Ε Ρ Ι Ε Χ Ο Μ Ε Ν Α

I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ………………………………………………..………………….......11

I.1 Οξειδωτικό στρες……..…………………………………………………………11

1.1 Γενικά περί οξειδωτικού στρες……...……………………………………………11

1.2 Ελεύθερες ρίζες……………………………………………………...…………...15

1.3 Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού………………………...……………… 18

1.4 Υπεροξείδωση λιπιδίων…………………………….…………..……………….. 27

I.2 Εισαγωγή στη λειτουργία του εγκεφάλου…………………...……….……...…35

2.1 Δομή και λειτουργία του εγκεφάλου……………………………………………...35

2.2 Δομή και λειτουργία του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας και του

μεσεγκεφάλου……………………………………………………………………..…..35

2.3 Οξειδωτικό στρες και γήρανση του εγκεφάλου…………………………………..38

2.4 Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές ασθένειες…………………….……….40

I.3 Οφθαλμός…………………...……………………………………………………44

3.1 Οφθαλμός– δομή και λειτουργία…………………………………………………44

3.2 Συγκριτική παρουσίαση οφθαλμού ανθρώπου και επίμυος……………………...45

3.3 Φακός – δομή και λειτουργία………………………………………………….....46

I.4 Καταρράκτης………………...…………………………………...…………..…49

4.1 Γενικά περί καταρράκτη………………………………………………………..…49

4.2 Καταρράκτης και οξειδωτικό στρες………………………………………………51

4.3 Καταρράκτης και διατροφή…………………………………………………….…55

Ι.5. Οξειδωτικό στρες και καροτενοειδή………………………………………….58

I.6 Σεληνιώδες νάτριο…………………...……………………………………….…61

6.1 Σελήνιο (Se) και σεληνιώδες νάτριο (Νa2SeO3)………………………………....61

6.2 Σεληνιώδες νάτριο και καταρράκτης…………………………………………….64

Page 7: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

7

I.7 Crocus sativus…………...…..…………………………………………………...66

7.1 Γένος Crocus……………………………………………………………………..66

7.2 Crocus sativus……..……………………………………………………………..67

7.3 Στύλοι του Crocus sativus……………………………………………………….69

7.4 Χημική σύσταση των στιγμάτων του Crocus sativus……………………………73

7.5 Μελέτες για βιολογική δράση των συστατικών του Crocus sativus…………….76

ΙΙ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ………………………………………………….….80

III. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ…………………………...…………………….…..82

ΙΙΙ.1 Φυτικό υλικό…………..……..................……..…………………………...….82

ΙΙΙ.2 Εκχύλιση C.sativus…………………….………………………………………82

III.3 Πειραματόζωα………….…...…………………………………………………83

ΙΙΙ.4 Κατεργασία των δειγμάτων………………………………………………......85

ΙΙΙ. 5 Αναλυτικές Μέθοδοι………………..…..……………………………………86

ΙΙΙ.5.1 Μέθοδοι προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής ικανότητας…………………...86

ΙΙΙ.5.2 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων………………….……89

ΙΙΙ.5.3 Μέθοδος προσδιορισμού των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών………..……93

ΙΙΙ.5.4 Μέθοδος προσδιορισμού του γλουταθείου……………..…………….…….…96

ΙΙΙ.5.5 Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης των

δειγμάτων………………………………………………………………………….….98

ΙΙΙ.5.6 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου……………………………………………………...…………...100

IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ…………………………………………...………………103

IV.1 Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων………………………………….…...……..103

IV.1.1 Ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (μέθοδος FRAP)……...………..103

IV.1.2 Μέθοδος προσδιορισμού του ασκορβικού οξέος (μέθοδος FRASC)…..……106

IV.1.3 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων…………...………...109

IV.1.4 Μέθοδος προσδιορισμού καρβονυλομάδων πρωτεϊνών………...………….116

IV.1.5 Μέθοδος προσδιορισμού γλουταθείου……………………………...………119

Page 8: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

8

IV.1.6 Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης των

δειγμάτων…………………………………………………………………………...121

IV.1.7 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου…………….………………...…………………………………123

IV. 2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στους επίμυες……….…………...…124

IV.2.1 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο σωματικό βάρος των

πειραματόζωων……………………………………………………………………..124

IV.2.2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο βάρος των φακών των

πειραματόζωων……………………………………………………………………..125

IV.2.3 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην αντιοξειδωτική ικανότητα των

ιστών………………………………………………………………………………..126

IV.2.4 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην υπεροξείδωση λιπιδίων των

ιστών…………………………………………..…………………………………....128

IV.2.5 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης των

ιστών…………………………………………...…………………………………...130

IV.2.6 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην ανάλυση των πρωτεϊνών του

φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου……………………..…131

ΙV.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus στο

πειραματικό μοντέλο………………………………………………………...…….133

IV.3.1 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο σωματικό βάρος

των πειραματόζωων……………………………………………………………...…133

IV.3.2 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο βάρος των φακών

των πειραματόζωων……………………………………………………………...…134

IV.3.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην αντιοξειδωτική

ικανότητα των ιστών…………………………………………………………….…135

IV.3.4 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην υπεροξείδωση

λιπιδίων των ιστών……………………………………………………………….…137

IV.3.5 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στη συγκέντρωση της

πρωτεΐνης των ιστών……………………………………………………………….139

IV.3.6 Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου…………….……………………………………………...…….140

V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ…………………………………………...142

VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ………………………………………………………………160

Page 9: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

9

Συντμήσεις

BSA Bovine Albumin Serum αλβουμίνη ορού βοοειδούς

CAT Catalase καταλάση

DNA Deoxyribonucleic acid Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ

DNPH 2,4-dinitro-phenylhydrazine 2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη

GPx glutathione peroxidase υπεροξειδάση του γλουταθείου

GSH glutathione γλουταθείο

GSSH oxidized glutathione οξειδωμένη μορφή γλουταθείου

LDL low density lipoproteins λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας

MDA malondialdehyde μηλονική διαλδεΰδη

MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin 1-μεθυλ-4-φαινυλ-

1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη

PBS Buffer Phosphate ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών

PUFAs poly-unsaturated fatty acids πολυακόρεστα λιπαρά οξέα

ROS Reactive Oxygen Species Ενεργές μορφές οξυγόνου

SOD Superoxide Dismutase δισμουτάση του σουπεροξειδίου

STZ Streptozotocin στρεπτοζοτοκίνη

TBA Thiobarbituric Acid θειοβαρβιτουρικό οξύ

TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances ενεργές μορφές

θειοβαρβιτουρικού οξέος

TCA Trichloroacetic Acid τριχλωροοξικό οξύ

TEAM Triethanolamine τριαιθανολαμίνη

TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine 2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη

Page 10: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

10

Απόδοση αγγλικών όρων

ascorbic acid ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C)

carbonyl καρβονύλιο

catalase καταλάση

crocin κροκίνη

glutathione γλουταθείο

glutathione peroxidase υπεροξειδάση του γλουταθείου

glutathione reductase αναγωγάση του γλουταθείου

glutathione S-transferase S-τρανσφεράση του γλουταθείου

kaempferol καιμπφερόλη

lipid peroxidation λιπιδική υπεροξείδωση

lutein λουτεΐνη

malondialdehyde μηλονική διαλδεΰδη

picrocrocin πικροκροκίνη

quercetin κερσετίνη

safranal σαφρανάλη

selenium σελήνιο

sodium selenite σεληνιώδες νάτριο

superoxide dismoutase δισμουτάση του σουπεροξειδίου

thiobarbituric acid θειο-βαρβιτουρικό οξύ

trichloroacetic acid τριχλωρο-οξικό οξύ

zeaxanthin ζεαξανθίνη

Page 11: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

11

I.1. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ

1.1 Γενικά περί οξειδωτικού στρες

Οξειδωτικό στρες (oxidative stress) έχει οριστεί η διαταραχή στην ισορροπία

ανάμεσα στην παραγωγή ελευθέρων ριζών (κυρίως ενεργών μορφών οξυγόνου, ROS)

και στην αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού. Έχει δειχθεί ποικιλοτρόπως ότι

ταυτίζεται με μειωμένα επίπεδα αντιοξειδωτικών ουσιών, χαμηλά επίπεδα ενζύμων

τα οποία αποτελούν μέρος του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος, και

αυξημένα επίπεδα οξειδωτικών προϊόντων. Το οξειδωτικό στρες μπορεί να οδηγήσει

σε τραυματισμό των ιστών και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις (Εικόνα 1).

Οξειδωτική Ισορροπία

Οξειδωτικό στρες

Προ-οξειδωτικά:•Κυτταρική λειτουργία

•Κάπνισμα•Ακτινοβολίες

•Μόλυνση

Αντιοξειδωτικά:•Διατροφή•Βιταμίνες

•Συμπληρώματα•Ένζυμα

ΑπενεργοποίησηΕπιδιορθωτικών

Μηχανισμών κυττάρου

ΑπενεργοποίησηΕπιδιορθωτικών

Μηχανισμών κυττάρου

Ενεργοποίησηκυτταρικής

καταστροφής

Κυτταρικήβλάβη

Εικόνα 1: Οξειδωτική ισορροπία μεταξύ προ-οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών. Σε

φυσιολογικές καταστάσεις, η παραγωγή των οξειδωτικών εξισορροπείται από τους

μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού. Σε κάποιες περιπτώσεις, όμως, η παραγωγή

των οξειδωτικών υπερκαλύπτει την λειτουργία των αμυντικών μηχανισμών του

οργανισμού (η ισορροπία μετατοπίζεται προς τα προ-οξειδωτικά), καταλήγοντας σε

οξειδωτικό στρες, κυτταρική βλάβη και διάφορες παθολογικές καταστάσεις.

Page 12: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

12

Οι ελεύθερες ρίζες είναι πολύ δραστικά, ασταθή μόρια, τα οποία φέρουν ένα

ασύζευκτο ηλεκτρόνιο και είναι δυνατόν να βρίσκονται σε οξειδωμένη ή ανηγμένη

μορφή. Η πλειοψηφία των ελευθέρων ριζών που προκαλούν βλάβη στα βιολογικά

συστήματα είναι ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS- reactive oxygen species). Οι ROS

αποτελούν τα κύρια παραπροϊόντα του αερόβιου μεταβολισμού στα κύτταρα. Η

παραγωγή τους πραγματοποιείται στα μιτοχόνδρια κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων

στο Ο2 κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Παραγωγή των ROS πραγματοποιείται

και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Άλλες πηγές ενεργών μορφών οξυγόνου είναι τα

μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα , τα οποία περιέχουν ένζυμα όπως το σύμπλοκο της

NADPH οξειδάσης (NADPH oxidase). Η NADPH οξειδάση παράγει ρίζες

σουπεροξειδίου και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Επιπλέον, ROS παράγονται και ως

αποτέλεσμα του μεταβολισμού ξένων ουσιών, τοξινών, φαρμάκων, από το

κυτόχρωμα Ρ450, καθώς και λόγω της έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες,

όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η περίσσεια αλάτων σιδήρου. Τέλος, ROS

παράγονται και σαν αποτέλεσμα του ατομικού τρόπου ζωής (π.χ. κάπνισμα), καθώς

και των διατροφικών συνηθειών (Εικόνα 2).

Εικόνα 2: Πηγές σχηματισμού των ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες παράγονται

στα μιτοχόνδρια κατά τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο2 κατά την οξειδωτική

φωσφορυλίωση, στις φλεγμονώδεις καταστάσεις, αλλά και λόγω της έκθεσης σε

περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και η ιονίζουσα

ακτινοβολία, η ρύπανση της ατμόσφαιρας και το κάπνισμα.

(www.drnoragindi.com/specialty_freeradicals.jpg)

Page 13: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

13

Οι ROS που παράγονται στα βιολογικά συστήματα είναι ικανές να προκαλέσουν

εκτεταμένη καταστροφή σε αυτά, στοχεύοντας τα λιπίδια, τις πρωτεΐνες και το DNA.

Αυτές οι αντιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών συστατικών και των ελευθέρων ριζών

οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων, υπεροξείδωση λιπιδίων, οξείδωση

των πρωτεϊνών, δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων (μείωση της παροχής ενέργειας στο

κύτταρο), καταστροφή της κυτταρικής μεμβράνης, ενεργοποίηση ή αναστολή της

κυτταρικής ανάπτυξης, και τελικά σε κυτταρικό θάνατο (απόπτωση, η οποία

καταλήγει σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο) (Εικόνα 3).

Οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται στη διαδικασία της γήρανσης. Σύμφωνα με τη

θεωρία αυτή (Harman, 1956) η γήρανση μπορεί να θεωρηθεί ως μία προοδευτική,

αναπόφευκτη διαδικασία η οποία σχετίζεται με τη συγκέντρωση ελευθέρων ριζών

λόγω μιας ανισορροπίας στο σχηματισμό οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών ουσιών

(Εικόνα 3). Τα μιτοχόνδρια έχουν έναν κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία της γήρανσης

αφού αποτελούν όχι μόνο τους ενδοκυτταρικούς παραγωγείς ελευθέρων ριζών, αλλά

και στόχο των ROS.

Σε μεγάλες συγκεντρώσεις, οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται σε διάφορες ασθένειες,

όπως η υπέρταση, ο καρκίνος, ο διαβήτης (ινσουλινο-εξαρτώμενος και ινσουλινο-

ανεξάρτητος), διάφορες αυτοάνοσες καταστάσεις (όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα

και η αγκυλωτική σπονδυλίτιδα), κάποιες ασθένειες του αναπνευστικού συστήματος,

ορισμένες οφθαλμικές παθήσεις και διαταραχές της όρασης, συμπεριλαμβανομένου

του καταρράκτη και της βλάβης του αμφιβληστροειδούς που οδηγεί σε ηλικιακή

εκφύλιση της ωχράς κηλίδας, διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες (όπως η νόσος

του Alzheimer και του Parkinson), η σχιζοφρένεια και το AIDS (Εικόνα 3).

Page 14: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

14

Μεταβολισμός των ROS

Fe2+ / Cu 2+

O2.- +H2O2 OH.-

•Φυσιολογικόςμεταβολισμός

•Φλεγμονή•Αποτοξίνωση

•Καταστροφή ιστών

•Μακροφάγα•Ουδετερόφιλα

•Μιτοχόνδρια•Υπεροξειδιοσώματα(οξειδάσες, καταλάσες)

•Μεμβράνη/Κυτόπλασμα(οξειδάση του NADPH)

•Ενδοπλασματικό δίκτυο(κυτόχρωμα P450)

Θετική επίδρασηΡύθμιση μεταγωγής

σήματος/μεταγραφής

Αρνητική επίδρασηΥπεροξείδωση λιπιδίων,

σταυροσύνδεσμοι,οξείδωση πρωτεϊνών,

μεταλλάξεις

Μεταγωγή σήματος,ανοσοαπόκριση

Οξειδωτικό στρες,γήρανση,παθήσεις

Αντιοξειδωτικά-Σαρωτές

ελευθέρων ριζών:

•ΈνζυμαGPxSODCAT

•Βιταμίνες(A,C,E)

•Ορμόνες(μελατονίνη)

•Συμπαράγοντες(συνένζυμο Q)

+

+

+

+

+

-

-

-

Εικόνα 3: Επιπτώσεις των ROS στα κύτταρα και στους ιστούς. Οι ελεύθερες ρίζες

έχουν διττό ρόλο. Συμμετέχουν σε φυσιολογικές διαδικασίες όπως η μεταγωγή

σήματος και η ανοσοαπόκριση, αλλά η υπέρμετρη παρουσία τους στον οργανισμό

συνδέεται με τη γήρανση και άλλες παθήσεις. (Πηγή: Gabi, Cellscience Reviews,

Vol.1, No.2, 2004).

Page 15: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

15

1.2 Ελεύθερες ρίζες

Στα βιολογικά συστήματα υπάρχουν οι εξής κατηγορίες ελευθέρων ριζών:

α) Ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS)

Οι ROS προέρχονται από το μοριακό οξυγόνο (O2) με διαδοχικές αντιδράσεις

αναγωγής, και είναι: το ανιόν του σουπεροξειδίου (O2.

-), το υπεροξείδιο του

υδρογόνου (H2O2) και η ρίζα του υδροξυλίου (OH.). Το ανιόν του σουπεροξειδίου,

μία πολύ καταστροφική ένωση, σχηματίζεται από τη μεταφορά ενός ηλεκτρονίου στο

μοριακό οξυγόνο (O2), ενώ η μεταφορά δύο ηλεκτρονίων οδηγεί στο σχηματισμό του

υπεροξειδίου (Ο22-). Η πρωτονίωση του ανιόντος του υπεροξειδίου δίνει μία υδρο-

υπεροξυλο-ρίζα (ΗΟ2.), η οποία αντιδρά αυθόρμητα με ένα άλλο ανιόν του

σουπεροξειδίου για να σχηματίσει το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2).

Το O2. - μπορεί να εκκαθαριστεί από τη δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD), ένα

ένζυμο που βρίσκεται σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς, και το οποίο καταλύει

τη μετατροπή δύο τέτοιων ριζών σε H2O2 και O2. Το σχηματιζόμενο H2O2

εκκαθαρίζεται από την καταλάση (CAT), μία αιμοπρωτεΐνη, η οποία καταλύει τη

μετατροπή δύο μορίων H2O2 σε νερό και μοριακό οξυγόνο.

Το O2. - παράγεται όχι μόνο στα μιτοχόνδρια των κυττάρων κατά τη διάρκεια του

αερόβιου μεταβολισμού, αλλά και στα φαγοκύτταρα, κατά την οξείδωση

συγκεκριμένων βιομορίων και ως αποτέλεσμα των φωτοχημικών αντιδράσεων. Το

O2.

- είναι λιγότερο δραστικό από το ΟΗ.. Ωστόσο, η σχετική σταθερότητά του

επιτρέπει τη γρήγορη μεταφορά του από το σημείο παραγωγής του σε άλλες

περιοχές, διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών.

Η ΟΗ. έχει μικρό χρόνο ημιζωής και δρα στο σημείο παραγωγής της ή σε κοντινή

από αυτό απόσταση. Αποτελεί τη δραστικότερη ενεργή μορφή οξυγόνου που

σχηματίζεται in vivo. Σχηματίζεται από το H2O2 παρουσία ενός ιόντος μετάλλου,

όπως Fe+2 ή Cu+1. Η ΟΗ. απαντάται στη φλεγμονώδη απόκριση αλλά και σε πολλά

ενζυμικά συστήματα συμπεριλαμβανομένης της οξειδάσης της ξανθίνης, του

κυτοχρώματος P450, της οξειδάσης του NADPH και κάποιων φωτοχημικών

αντιδράσεων.

Page 16: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

16

β) Ενεργές μορφές αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS)

Το NO. (ρίζα του οξειδίου του αζώτου) στα θηλαστικά από την οξείδωση της L-

αργινίνης που καταλύεται από την συνθετάση του οξειδίου του αζώτου (NOS).

Αποτελεί ένα σημαντικό βιολογικό μηνυματοφόρο μόριο. Διαχέεται αρκετά εύκολα,

μέσω των βιολογικών μεμβρανών, και παίζει ένα αξιόλογο ρόλο στη φυσιολογία του

ΚΝΣ. Παράγεται σε μεγάλα ποσά σε παθολογικές καταστάσεις και προέρχεται από

την ενεργοποίηση της μικρογλοίας ή από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όταν το οξείδιο

του αζώτου χάνει ένα ηλεκτρόνιο παράγεται το ΝΟ+ (nitrosonium cation), ενώ όταν

προσλαμβάνει ένα ηλεκτρόνιο παράγεται το NO- (nitroxyl anion).

Το ανιόν του ONO2- (peroxynitrate anion) παράγεται από την αντίδραση του NO.

με το ανιόν του σουπεροξειδίου. Είναι λιποδιαλυτό. Το ONO2- αποτελεί την πιο

δραστική ενεργή μορφή αζώτου, προκαλεί βλάβες σε πολλά βιομόρια και εμπλέκεται

στην παθογένεση πολλών ασθενειών. Με πρωτονίωση σχηματίζει το ONO2H

(peroxynitrous acid), το οποίο σχηματίζει ΟΗ. και ΝΟ2.

Η ρίζα του υπεροξυνιτρικού ανιόντος (ΟΝΟ2., peroxynitrate radical) παράγεται από

την αντίδραση του NO. με το μοριακό οξυγόνο.

γ) Αλογονωμένες ενεργές μορφές (Reactive Halogonated Species, RHS)

Το HOCl (υποχλωριώδες οξύ) σχηματίζεται από το Η2Ο2 με τη δράση του ενζύμου

της μυελο-υπεροξειδάσης (myeloperoxidase). Είναι λιποδιαλυτό και έχει παρόμοια

δραστικότητα με το ONO2-. Οξειδώνει πρωτεΐνες αντιδρώντας με αμινομάδες,

θειόλες και τη μεθειονίνη. Σχηματίζει ελεύθερες ρίζες σε αντίδραση τύπου Fenton με

το Fe2+, ενώ στην αντίδρασή του με το ανιόν του σουπεροξειδίου σχηματίζει ΟΗ..

Τα NOCl (nitrosyl chloride) και ClNO2 (nitryl chloride) παράγονται στα βιολογικά

συστήματα και δρουν σαν κυτταροτοξικοί παράγοντες.

Page 17: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

17

δ) Ενεργές μορφές θείου (Reactive Sulfur Species, RSS)

Οι θειούχες ρίζες (thiyl radicals, RS.) αν και είναι λιγότερο δραστικές από τη ΟΗ.

είναι αρκετά δραστικές και συμμετέχουν σε αρκετές κυτταρικές λειτουργίες, καθώς

εντοπίζονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στους ζωντανούς οργανισμούς.

ε) Οργανικές ελεύθερες ρίζες

Το ROOH (organic hydroperoxide) σχηματίζεται από την αντίδραση ελευθέρων

ριζών με κυτταρικά συστατικά όπως τα λιπίδια και τα νουκλεοτίδια.

Οι άλκοξυ- (RO.) και υπέροξυ- (ROO.) ρίζες σχηματίζονται παρουσία του

οξυγόνου με προσθήκη ελευθέρων ριζών σε διπλούς δεσμούς ή με αφαίρεση

υδρογόνου. Συμμετέχουν στις αντιδράσεις λιπιδικής υπεροξείδωσης.

Page 18: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

18

1.3 Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού

Ο οργανισμός μας έχει αναπτύξει διάφορα ενδογενή συστήματα ως άμυνα έναντι

των ελευθέρων ριζών. Τα συστήματα αυτά περιλαμβάνουν ενδογενή ένζυμα

(καταλάση CAT, αναγωγάση του γλουταθείου, δισμουτάση του σουπεροξειδίου

SOD, υπεροξειδάση του γλουταθείου GPx, αναγωγάση της μεθειονίνης MsrA),

ενδογενείς παράγοντες (γλουταθείο, ουρικό οξύ, χολερυθρίνη, συνένζυμο Q) και

διατροφικούς παράγοντες ή εξωγενείς (β-καροτένια και άλλα καροτενοειδή, βιταμίνη

C, βιταμίνη Ε και σελήνιο) (Εικόνα 4).

H2O2

Η2Ο

Η2Ο + O.SO2

CAT

Cl-

HOCl.-

GSSHGSHSe

GPx

NADPHNADP

O2.-Fe2+

OH. PUFAs

Καταστροφή ιστών

RO. ROO. Λιπιδικάυπεροξείδια

Φυσιολογικόςμεταβολισμός

Καταστροφή πρωτεϊνών, DNA, υδατανθράκων

β-καροτένιο

ρίζα β- καροτενίου

Φυσιολογικόςμεταβολισμός

Καταστροφή ιστώνSH ομάδες

O2- + O2 - - + 2H+ SOD

GSH reductase

Καταστροφήιστών

Ασκορβικόοξύ

Δεΰδροασκορβικόοξύ

Εικόνα 4: Μηχανισμοί δράσης των αντιοξειδωτικών ενζύμων έναντι των ελευθέρων

ριζών. Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα παίζουν σημαντικό ρόλο στον περιορισμό των

προκαλούμενων από ελεύθερες ρίζες βλαβών των βιολογικών μακρομορίων. Η

υπεροξειδάση του γλουταθείου (GPx) είναι μία σεληνο-πρωτεΐνη που ανάγει το Η2Ο2

σε νερό, προσφέροντας έτσι προστασία έναντι των ενδογενών ελευθέρων ριζών. Η

οξειδωμένη μορφή του γλουταθείου (GSSG) ανάγεται προς την ανηγμένη (GSH) του

μορφή από την αναγωγάση του γλουταθείου (GSH reductase), ένα NADPH-

Page 19: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

19

εξαρτώμενο ένζυμο. Η καταλάση (CAT), είναι μία αιμοπρωτεΐνη, η οποία καταλύει

τη μετατροπή δύο μορίων του H2O2 σε νερό και μοριακό οξυγόνο. H δισμουτάση του

σουπεροξειδίου (SOD), είναι ένα ένζυμο που βρίσκεται σε όλους τους αερόβιους

οργανισμούς, και καταλύει τη μετατροπή δύο ανιόντων του σουπεροξειδίου (O2.–) σε

H2O2 και O2. [Πηγή: Bahorun et al., Internet Journal of Medical Update 2006 Jul-Dec;

1(2)].

Τα ενδογενή αντιοξειδωτικά ανήκουν στην πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των

ελευθέρων ριζών. Παίζουν σημαντικό ρόλο στον περιορισμό των προκαλούμενων

από ενεργές μορφές οξυγόνου βλαβών των βιολογικών μακρομορίων. Εντούτοις, δεν

είναι πάντα αποτελεσματικά καθώς ορισμένες ενώσεις που δημιουργούνται από την

αλληλεπίδραση των ενεργών μορφών οξυγόνου με τα μακρομόρια είναι αρκετά

ενεργές. Επομένως, είναι απαραίτητο να απομακρυνθούν τα δευτερογενή αυτά

προϊόντα, ώστε να παρεμποδιστεί η περαιτέρω ενδοκυτταρική καταστροφή, η

αποικοδόμηση των κυτταρικών συστατικών και τελικά ο κυτταρικός θάνατος.

Αυτή η δεύτερη γραμμή άμυνας του οργανισμού έναντι των ελευθέρων ριζών

παρέχεται από ένζυμα όπως η υπεροξειδάση του γλουταθείου, η S-τρανσφεράση του

γλουταθείου και η αλδεϋδική αφυδρογονάση (Masella et al., 2005).Οι μεταβολίτες οι

οποίοι παράγονται από αυτά τα μόρια είναι λιγότερο επιβλαβείς και απομακρύνονται

από το κύτταρο μέσω αντλιών, όπως ο συζευγμένος με γλουταθείο S-μεταφορέας.

Page 20: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

20

Κύρια αντιοξειδωτικά μόρια στον οργανισμό

Ασκορβικό οξύ

Το ασκορβικό οξύ (Εικόνα 5) είναι το κυριότερο υδατοδιαλυτό εξωκυτταρικό

αντιοξειδωτικό που ο ανθρώπινος οργανισμός αδυνατεί να συνθέσει de novo. Είναι

ιδανικό χάρη στην υδατοδιαλυτότητα, σταθερότητα και κινητικότητά του και στο

γεγονός ότι μπορεί να μεταφερθεί, να επαναπορροφηθεί και να ανακυκλωθεί. Η

βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) είναι ένα σημαντικό και απαραίτητο θρεπτικό συστατικό

για τον ανθρώπο. Δρα ως ηλεκτρονιοδότης και είναι αναντικατάστατο σε πολλές

ενζυμικές αντιδράσεις. Η οξειδωμένη μορφή του ονομάζεται δεΰδροασκορβικό οξύ

(Εικόνα 6).

Εικόνα 5: Ασκορβικό οξύ. Εικόνα 6: Δεΰδροασκορβικό οξύ.

Η έλλειψη ασκορβικού οξέος στον οργανισμό έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση

της ασθένειας σκορβούτο. Το ασκορβικό οξύ, ως αναγωγικό μέσο, συμμετέχει στην

αντίδραση της υδροξυλίωσης της προλυλοϋδροξυλάσης, κατά την μετατροπή των

καταλοίπων προλίνης του κολλαγόνου σε υδροξυπρολίνη, διατηρώντας τη σε ενεργή

μορφή μέσω της διατήρησης των ατόμων σιδήρου της στην ανηγμένη δισθενή τους

μορφή. Το κολλαγόνο που συντίθεται απουσία ασκορβικού οξέος δεν έχει τη

δυνατότητα σχηματισμού κανονικών ινών, με αποτέλεσμα τις κακώσεις του δέρματος

και τη δημιουργία εύθραυστων αιμοφόρων αγγείων, τα οποία είναι τα βασικά

συμπτώματα του σκορβούτου.

Page 21: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

21

Στον οφθαλμό βρίσκεται στα δάκρυα, στο υδατοειδές υγρό, στο επιθήλιο του

κερατοειδούς, στο υαλώδες σώμα και στον κρυσταλλοειδή φακό. Το ασκορβικό οξύ

εκκρίνεται στο υδατοειδές υγρό από το επιθήλιο του άνω και κάτω ταρσού του

βλεφάρου. Παίζει ζωτικό ρόλο στον αμυντικό μηχανισμό του οφθαλμού

προστατεύοντας τους ιστούς από τη φωτοοξειδωτική βλάβη, ενώ έχει και

αντιφλεγμονώδη δράση.

Τα δάκρυα περιέχουν σημαντικά επίπεδα ασκορβικού οξέος. Είναι πολύ πιθανόν ότι

το ενδοκυττάριο ασκορβικό οξύ δρα ως απόθεμα για να διατηρεί ικανοποιητικά

επίπεδα σε εξωκυττάρια υγρά, όπως στα δάκρυα.

Ουρικό οξύ

Το ουρικό οξύ (Εικόνα 7) είναι επίσης, ένα πολύ σημαντικό ενδογενές

αντιοξειδωτικό. Είναι μια ευρέως διαδεδομένη, εκλεκτική, αντιοξειδωτική ένωση,

ιδιαίτερα ικανή να αντιδράσει με διάφορες υδροξυλικές ρίζες, ανιόντα υπεροξειδίου,

ατομικό οξυγόνο και οξυγονωμένα ενδιάμεσα αίμης με τον Fe σε υψηλή οξειδωτική

κατάσταση (+4 και +5), ενώ μετατρέπεται σε αδρανή προϊόντα. Το ουρικό ως

αντιοξειδωτικό είναι περίπου το ίδιο δραστικό με το ασκορβικό οξύ.

Εικόνα 7: Ουρικό οξύ.

Θεωρείται ως ένα μεταβολικά αδρανές τελικό προϊόν του μεταβολισμού των

πουρινών στον άνθρωπο, και όπως και στην περίπτωση της χολερυθρίνης,

αποδεικνύεται ότι μερικά τελικά προϊόντα αποικοδόμησης των μεταβολικών πορειών

δρουν ως προστατευτικοί παράγοντες. Στα περισσότερα θηλαστικά, εκτός των

Page 22: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

22

πρωτευόντων, το ουρικό οξύ οξειδώνεται περαιτέρω προς το σχηματισμό

αλλαντοΐνης. Προφανώς, κατά την πορεία εξέλιξης των ανώτερων θηλαστικών

χάθηκε το ένζυμο που καταλύει την αντίδραση οξείδωσης του ουρικού οξέος. Το

ουρικό οξύ μπορεί, επίσης, να δράσει ως επιπλέον υπόστρωμα για το ένζυμο

κυκλοξυγενάση, ικανό να οξειδωθεί. Αποτρέπει την απενεργοποίηση των

ενδοθηλιακών ενζύμων κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες, υποστηρίζοντας,

έτσι, την ιδιαίτερη σχέση ανάμεσα στο σχηματισμό του ουρικού οξέος και στην

ανάγκη για ένα ισχυρό βιολογικά αντιοξειδωτικό. Στον οφθαλμό βρίσκεται στα

δάκρυα, στο υδατοειδές υγρό και στο υαλώδες σώμα.

Γλουταθείο

Το γλουταθείο είναι η κύρια μη-πρωτεϊνική θειόλη που εμπλέκεται στην

αντιοξειδωτική κυτταρική άμυνα. Είναι ένα τριπεπτίδιο γ-γλουταμινικό – κυστεΐνη –

γλυκίνη (γ-Glu-Cys-Gly). Η ενεργός μορφή του γλουταθείου οφείλεται στη θειόλη (-

SH) της κυστεΐνης. Είναι ένα ευρέως διαδεδομένο μόριο που παράγεται σε όλα τα

όργανα, κυρίως στο ήπαρ, στον σπλήνα, στους νεφρούς και στους φακούς και είναι

παρόν ουσιαστικά σε όλους τους ιστούς των θηλαστικών και σε όλους τους

κυτταρικούς τύπους σε συγκεντρώσεις της τάξης των mM (Pastore et al., 2003).

Η σύνθεση του γλουταθείου στα κύτταρα από τα αμινοξέα που το αποτελούν είναι

μία διαδικασία διαδοχικών ενζυμικών αντιδράσεων, η οποία απαιτεί κατανάλωση

ATP και καταλύεται από την γ-γλουταμυλοκυστική συνθετάση (GCS) και την

συνθετάση του γλουταθείου (GS) (Pastore et al., 2003; Ganea et al., 2006). Οι

παράγοντες που ρυθμίζουν τη σύνθεση του γλουταθείου είναι η ενεργότητα της GCS,

τα αποθέματα κυστεΐνης του οργανισμού και η αναδραστική αναστολή (feedback

inhibition) της σύνθεσης του γλουταθείου.

Το γλουταθείο στο κύτταρο υπάρχει στην ανηγμένη (GSH) και οξειδωμένη (GSSG)

του μορφή (Εικόνα 8) ή δεσμευμένο σε πρωτεΐνες (π.χ. αιμοσφαιρίνη συνδεμένη με

γλουταθείο που αποτελεί κλινικό δείκτη στο αίμα για το οξειδωτικό στρες) (Pastore

et al., 2003). Αποτελεί τον κύριο μη ενζυμικό ρυθμιστή της ενδοκυτταρικής

οξειδοαναγωγικής κατάστασης και συμμετέχει σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, μέσω

της αντιστρέψιμης οξείδωσης της ενεργής του θειόλης.

Page 23: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

23

Εικόνα 8: Η ανηγμένη (GSH) και η οξειδωμένη (GSSG) μορφή του

γλουταθείου.

Υπό φυσιολογικές κυτταρικές συνθήκες, η μεγαλύτερη αναλογία του γλουταθείου

βρίσκεται στην ανηγμένη του μορφή και κατανέμεται στον πυρήνα, στο

ενδοπλασματικό δίκτυο και στα μιτοχόνδρια. Επίσης, η ανηγμένη μορφή μπορεί να

βρίσκεται, όπως προαναφέρθηκε, δεσμευμένη σε πρωτεΐνες και να δρα ως συνένζυμο

διαφόρων ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στην άμυνα του οργανισμού. Με αυτό τον

τρόπο, το γλουταθείο μπορεί να εκκαθαρίζει ελεύθερες ρίζες ή να δρα ως υπόστρωμα

των ενζύμων υπεροξειδάση του γλουταθείου, αναγωγάση του γλουταθείου

(glutathione reductase, GR) και S-τρανσφεράση του γλουταθείου, κατά τη διάρκεια

της αποτοξίνωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου, των λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων

και άλλων ηλεκτρονιόφιλων ενώσεων. Εκτός όμως από τη δράση του ως σαρωτή

ελευθέρων ριζών, το γλουταθείο συμμετέχει σε πλήθος κυτταρικών λειτουργιών

όπως η ρύθμιση της σύνθεσης πρωτεϊνών και DNA, η μεταγωγή σήματος, η ρύθμιση

του κυτταρικού κύκλου, η πρωτεόλυση, η ανασοαπόκριση, καθώς και η συμμετοχή

του σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια (Wu et al., 2004).

Page 24: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

24

Εικόνα 9: Ο κύκλος του γλουταθείου. Η υπεροξειδάση του γλουταθείου, μία

σεληνο-πρωτεΐνη, ανάγει το Η2Ο2 προς το σχηματισμό νερού και παράλληλα

οξειδώνει το γλουταθείο σε GSSG. Η οξειδωμένη μορφή (GSSG) του γλουταθείου

ανάγεται από την αναγωγάση του γλουταθείου (glutathione reductase, GR), ένα

NADPH- εξαρτώμενο ένζυμο. H αναγωγάση του γλουταθείου είναι σημαντική όχι

μόνο για τη διατήρηση των φυσιολογικών επιπέδων του ενδοκυτταρικού

γλουταθείου, αλλά και για τη διατήρηση των σουλφυδρυλομάδων πολλών πρωτεϊνών

στην ανηγμένη τους μορφή, μια απαίτηση για την κανονική τους λειτουργία (Ganea

et al., 2006). Η προσθετική ομάδα FAD (φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο) βρίσκεται

στο ενεργό κέντρο του ενζύμου της αναγωγάσης του γλουταθείου και παίζει

σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ενεργότητας του ενζύμου (Katakura et al., 2004;

Ganea et al., 2006) (lpi.oregonstate.edu)

Οι υπεροξειδάσες του γλουταθείου αποτελούν μία ομάδα ενζύμων τα οποία είναι

ικανά να ανάγουν μία πληθώρα οργανικών και ανόργανων υδροϋπεροξειδίων προς

τις αντίστοιχες υδροξυ-ενώσεις, χρησιμοποιώντας το ανηγμένο γλουταθείο ή άλλα

αντίστοιχα αναγωγικά μόρια. Υπάρχουν πολλές ιστο-ειδικές υπεροξειδάσες του

γλουταθείου, οι οποίες εμφανίζουν ιστο-ειδική δράση. Όλες οι μορφές είναι σεληνο-

Page 25: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

25

πρωτεΐνες και η βασική τους λειτουργία είναι να αντιμετωπίζουν καταστάσεις

οξειδωτικού στρες. Κατά τη διάρκεια του καταλυτικού κύκλου το σελήνιο (Se)

οξειδώνεται από το υδροϋπεροξείδιο προς σεληνικό οξύ. Στη συνέχεια το ενδιάμεσο

αυτό ανάγεται από τον δότη ηλεκτρονίων. Στην περίπτωση του ανηγμένου

γλουταθείου σχηματίζεται ένα σεληνο-δισουλφίδιο, το οποίο διασπάται από ένα

δεύτερο μόριο GSH και αναγεννάται η ενεργός μορφή του ενζύμου (Ursini et al.,

1995; Masella et al., 2005).

Οι S-τρανσφεράσες του γλουταθείου χωρίζονται σε τρεις ενζυμικές οικογένειες: την

κυτταροπλασματική, τη μιτοχονδριακή και τη μικροσωματική. Τα ένζυμα αυτά

αποτοξινώνουν ηλεκτρονιόφιλα ξενοβιοτικά, όπως χημικά καρκινογόνα,

περιβαλλοντικούς παράγοντες μόλυνσης και αντι-ογκογόνους παράγοντες (Hayes et

al., 2005; Masella et al., 2005). Επιπλέον, προστατεύουν από ενεργές ενώσεις, οι

οποίες παράγονται in vivo σε κατάσταση οξειδωτικού στρες, απενεργοποιώντας

ενδογενείς ακόρεστες αλδεΰδες, κινόνες, εποξείδια και υδροϋπεροξείδια. Οι

τρανσφεράσες αυτές ασκούν την προστατευτική τους δράση μέσω της ικανότητάς

τους να καταλύουν τη σύζευξη του ανηγμένου γλουταθείου με τελικά προϊόντα

οξείδωσης. Συνεπώς, τόσο η υπεροξειδάση του γλουταθείου, όσο και η S-

τρανσφεράση του γλουταθείου με τη δράση τους μειώνουν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα

του ανηγμένου γλουταθείου.

Το ανηγμένο γλουταθείο υπάρχει σε μια ασυνήθιστα υψηλή συγκέντρωση στον

κρυσταλλοειδή φακό, όπου λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό ζωτικής σημασίας για τη

διατήρηση της διαφάνειας του φακού (Ganea et al., 2006). Το γλουταθείο

αποτοξινώνει σημαντικά βλαβερά οξειδωτικά, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου

και το δεϋδροασκορβικό οξύ. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει μια σημαντική

λειτουργία του ως σαρωτή υδροξυλικών ριζών στα επιθηλιακά κύτταρα του φακού

ανεξάρτητα από την ικανότητα του κυττάρου να αποτοξινώνει το υπεροξείδιο του

υδρογόνου (Wu et al., 2004). Το γλουταθείο δεν προστατεύει μόνο τις κυτταρικές

μεμβράνες από οξειδωτική βλάβη, αλλά επίσης, βοηθά στη διατήρηση των

σουλφυδρυλομάδων πολλών πρωτεϊνών στην ανηγμένη τους μορφή, μια απαίτηση

για την κανονική τους λειτουργία (Ganea et al., 2006).

Page 26: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

26

Αμετάκλητη βλάβη επέρχεται στα κύτταρα όταν δεν είναι ικανά να διατηρήσουν το

επίπεδο του γλουταθείου, κάτι που συμβαίνει σε παθολογικές καταστάσεις

(καταρράκτης, σακχαρώδης διαβήτης), καθώς και σε προχωρημέν ηλικία (Lou, 2003;

Ganea et al., 2006). Με την πάροδο της ηλικίας τα επίπεδα του ανηγμένου

γλουταθείου στον οργανισμό μειώνονται ενώ αυξάνονται αυτά της οξειδωμένης

μορφής του. Συγκεκριμένα, μειώνεται η σύνθεση του γλουταθείου και του NADPH,

καθώς μειώνεται η ενεργότητα της γ-γλουταμυλοκυστικής συνθετάσης και της

συνθετάσης του γλουταθείου, με αποτέλεσμα τη μείωση της αντιοξειδωτικής δράσης

του γλουταθείου. Αντίθετα, αυξάνεται η συγκέντρωση της υπεροξειδάσης του

γλουταθείου και της S-τρανσφεράσης του γλουταθείου (Sethna et al.,1983; Rathbun

et al., 1993).

Στο φακό, η μείωση της συγκέντρωσης του ανηγμένου γλουταθείου, η οποία

παρατηρείται όπως προαναφέρθηκε με την πάροδο της ηλικίας, προκαλεί οξείδωση

των σουλφυδρυλικών ομάδων των πρωτεϊνών με τελικό αποτέλεσμα την αλλαγή στις

συνδέσεις μεταξύ πρωτεϊνών, αλλαγές στη διαλυτότητα και στη διαύγεια του φακού,

καθώς και την επαγωγή της προκαλούμενης από τις ελεύθερες ρίζες οξειδωτικής

καταστροφής, η οποία ακολουθείται από εκδήλωση καταρράκτη (David et al., 1984;

Shearer et al., 1997). Επίσης, τα διαβητικά άτομα λόγω της αυτοοξείδωσης

σακχάρων (γλυκόζης, φρουκτόζης) η οποία οδηγεί σε αυξημένο οξειδωτικό στρες,

εμφανίζουν καταρράκτη.

Συνεπώς, η μέτρηση των συγκεντρώσεων των διαφόρων μορφών του γλουταθείου

στα βιολογικά δείγματα είναι σημαντική για την κατανόηση της ομοιόστασης σε

φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Η συγκέντρωσή του αποτελεί πολύ

ευαίσθητο δείκτη της κυτταρικής λειτουργικότητας και βιωσιμότητας.

Page 27: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

27

1.4 Υπεροξείδωση λιπιδίων

1.4.1 Μηχανισμοί υπεροξείδωσης λιπιδίων

Η υπεροξείδωση των λιπιδίων, αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταστροφής των

κυτταρικών μεμβρανών που σχετίζεται με την ανάπτυξη σοβαρών ασθενειών,

επάγεται μέσω τριών μηχανισμών:

α) αυτοοξείδωση μέσω της δράσης των ελευθέρων ριζών

Η διαδικασία περιλαμβάνει 3 στάδια (Εικόνα 10) (Laguerre et al., 2007). Στο

πρώτο στάδιο (initiation) απομακρύνεται ένα άτομο υδρογόνου από μία

μεθυλενομάδα (- CH2-) ενός μορίου πολυακόρεστου λιπαρού οξέος, μέσω της

αντίδρασής του με τη OH., και σχηματίζεται μία ρίζα λιπαρού οξέος (lipid radical) με

ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο.

Η παραπάνω αντίδραση μπορεί να ανασταλεί από τις τοκοφερόλες, τη μαννιτόλη

και από το μυρμηκικό ιόν. Η παρουσία του διπλού δεσμού στο λιπαρό οξύ εξασθενεί

τους δεσμούς C-H παρακείμενου του διπλού δεσμού ατόμου άνθρακα, κάνοντας

ευκολότερη την απομάκρυνση του ατόμου υδρογόνου.

Στο επόμενο στάδιο, η ρίζα αυτή αντιδρά με το μοριακό οξυγόνο και σχηματίζει

υπεροξυ-ρίζες των λιπαρών οξέων (lipid peroxyl radicals). Τα μόρια αυτά μπορούν

να αντιδράσουν με πρωτεΐνες, με το DNA ή με άλλα όμοιά τους μόρια. Στη λιπιδική

μεμβράνη όπου βρίσκονται, το πιθανότερο είναι να αντιδράσουν με μόρια

πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, από τα οποία αποσπούν ένα άτομο υδρογόνου

σχηματίζοντας ένα λιπιδικό υπεροξείδιο (lipid peroxide). Η παραπάνω αντίδραση

καταλύεται παρουσία ιόντων σιδήρου ή χαλκού.

Page 28: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

28

Το τελευταίο στάδιο του τερματισμού συνήθως πραγματοποιείται με την

αντίδραση του λιπιδικού υπεροξειδίου με την α-τοκοφερόλη (α-tocopherol).

Με αυτό τον τρόπο ξεκινά η αλυσίδα των αντιδράσεων της υπεροξείδωσης

λιπιδίων. Από μία και μόνο εκκίνηση (initiation) μπορούν να σχηματιστούν έως και

περισσότερα από 100 μόρια λιπιδικών υπεροξειδίων.

Εικόνα 10: Μηχανισμός υπεροξείδωσης λιπιδίων μέσω των ελευθέρων ριζών.

(www.answers.com/topic/antioxidant).

Page 29: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

29

β) φωτο-οξείδωση

To οξυγόνο που παράγεται από τις φωτοχημικές αντιδράσεις αντιδρά εξαιρετικά

γρήγορα με τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (παρουσία χλωροφύλλης, ριβοφλαβίνης,

πορφυρίνης κ.ά.). Οι αντιδράσεις φωτο-οξείδωσης είναι ταχύτερες από τις

αντιδράσεις αυτό-οξείδωσης. Οι αντιδράσεις φωτο-οξείδωσης στα πράσινα φυτά

αναστέλλονται από τα καροτενοειδή και από τις τοκοφερόλες.

γ) ενζυμική υπεροξείδωση

Τα ένζυμα λιποξυγενάσες (lipoxygenases, φυτικών ή ζωικών οργανισμών)

καταλύουν τις αντιδράσεις ανάμεσα στο O2 και τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπως

το αραχιδονικό οξύ. Επίσης, τα ένζυμα κυκλοξυγενάσες (cycloxygenases, φυτικών ή

ζωικών οργανισμών) καταλύουν τις αντιδράσεις ανάμεσα στο μοριακό οξυγόνο και

τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία μετατρέπονται σε βιολογικώς ενεργά μόρια,

τα ενδοϋπεροξείδια (endoperoxides). Τα τελευταία αποτελούν ενδιάμεσα μόρια της

μετατροπής των λιπαρών οξέων σε προσταγλαδίνες (prostagladins).

Page 30: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

30

1.4.2 Δευτερογενή προϊόντα υπεροξείδωσης λιπαρών οξέων

Μηλονική διαλδεΰδη ( MDA)

Η υπεροξείδωση των λιπιδίων, όπως προαναφέρθηκε, είναι αποτέλεσμα της

οξειδωτικής καταστροφής των κυτταρικών μεμβρανών και σχετίζεται με την

ανάπτυξη σοβαρών ασθενειών. Ο πιο σημαντικός και καλύτερα μελετημένος δείκτης

για τον έλεγχο της υπεροξείδωσης των λιπιδίων θεωρείται η μηλονική διαλδεΰδη

(MDA) (Εικόνα 11), η οποία αποτελεί το κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης των

πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Εικόνα 12).

Εικόνα 11: Μηλονική διαλδεΰδη (MDA).

Εκτός από τελικό προϊόν της λιπιδικής υπεροξείδωσης, αποτελεί και ένα ασταθές

παραπροϊόν της ενζυμικής οξυγόνωσης του αραχιδονικού οξέος, καθώς και προϊόν

της αντίδρασης της κυκλοξυγενάσης στον μεταβολισμό των προσταγλαδινών.

Αποδίδει ένα φθορίζον κόκκινο παράγωγο και παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στα

267nm.

Page 31: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

31

Εικόνα 12: Μονοπάτι σχηματισμού της MDA από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα

(PUFAs). Έχουν προταθεί διάφορα μονοπάτια σχηματισμού της MDA, αλλά το

πιθανότερο είναι να σχηματίζεται από μονοκυκλικά υπεροξείδια τα οποία έχουν

σχηματιστεί από λιπαρά οξέα με 3 ή περισσότερους διπλούς δεσμούς, όπως

το λινολενικό οξύ (linolenic acid). (Πηγή: Laguerre et al., Progress in Lipid Research

46 (2007) 244-282).

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, και σε ουδέτερο pH, η MDA βρίσκεται με τη μορφή

ενολικού ανιόντος, χαμηλής χημικής δραστικότητας. Ωστόσο, η αλδεΰδη αυτή είναι

ιδιαίτερα τοξική και ικανή να αλληλεπιδράσει με το DNA, προκαλώντας μεταλλάξεις

(Del Rio et al., 2005). Το κύριο προϊόν της αλληλεπίδρασης αυτής είναι η πυριμιδο-

[1,2-α] πουριν-10(3H)-δεοξυριβόζη (M1G), η οποία βρίσκεται σε ισορροπία με την

ανοιχτή μορφή Ν2-οξοπροπενυλ-γουανοσίνη (Εικόνα 13). Η M1G είναι ικανή να

προκαλέσει πλαισιοτροποποιητικές μεταλλάξεις, καθώς και μεταλλάξεις

υποκατάστασης σε βακτηριακά κύτταρα και σε κύτταρα θηλαστικών (Vanderveen et

al., 2003). Επίσης, η MDA δημιουργεί σταυροσυνδέσμους μεταξύ DNA και

πρωτεϊνών (Voitkun and Zhitkovich, 1999). Οι προαναφερθείσες τοξικές δράσεις της

MDA ενδέχεται να οδηγούν σε καρκίνο. Αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν

παρατηρηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, του στήθους, του τραχήλου, και

του στομάχου (Gonenc et al., 2001; Kolanjiapan et al., 2002; Bakan et al., 2002).

Page 32: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

32

Εικόνα 13: Δομή της πυριμιδο-[1,2-α] πουριν-10(3H)-δεοξυριβόζης (M1G), του

κύριου προϊόντος της αλληλεπίδρασης της MDA με το DNA, η οποία βρίσκεται σε

ισορροπία με την ανοιχτή μορφή Ν2-οξοπροπενυλ-γουανοσίνη.

Η MDA αντιδρά μέσω των καρβονυλομάδων της με πρωτογενείς αμίνες. Τα τελικά

προϊόντα αυτών των in vivo αντιδράσεων της MDA με πρωτογενείς αμίνες

εμπλέκονται στην αθηρογένεση. Η τοξικότητα της MDA μπορεί να προκαλέσει

δυσλειτουργία και του καρδιαγγειακού συστήματος. Επίσης, η MDA παρεμβάλλεται

και στις διαμοριακές συνδέσεις μέσω κολλαγόνου, συμβάλλοντας στην ακαμψία του

καρδιαγγειακού ιστού. Αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς

με συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, καθώς και σε άτομα με αθηροσκλήρωση

(Polidori et al., 2002; Tamer et al., 2002).

Μελέτες σχετικά με την αντίδραση της MDA με αμινοξέα καταλήγουν στο

συμπέρασμα ότι τα τελικά προϊόντα εξαρτώνται από το αμινοξύ. Τα αρωματικά

αμινοξέα και η αργινίνη αντιδρούν με την α-αμινομάδα και σχηματίζουν μονο-

εναμινάλη, ενώ η κυστεΐνη σχηματίζει ένα προϊόν που περιέχει δύο μόρια κυστεΐνης

και τρία μόρια MDA (Nair et al., 1981).

Οι πρωτεΐνες αντιδρούν ευκολότερα με την MDA σε σχέση με τα ελεύθερα

αμινοξέα. Αν και δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί οι λόγοι που συμβαίνει αυτό

μάλλον οι πρωτεΐνες προσφέρουν ένα πιο ενεργό περιβάλλον (υπόστρωμα) για τη

συμπύκνωση της MDA (Esterbauer et al., 1991). Η MDA συνήθως αντιδρά με την ε-

αμινομάδα της λυσίνης των πρωτεϊνών και δημιουργεί ενδομοριακούς και

διαμοριακούς συνδέσμους μεταξύ πρωτεϊνών. Επίσης, η MDA αντιδρά με κατάλοιπα

Page 33: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

33

ιστιδίνης, τυροσίνης, αργινίνης και μεθειονίνης. Τέλος, έχει προταθεί ότι η MDA

αντιδρά με διάφορα νουκλεοζίδια, όπως η δεοξυ-γουανοσίνη και η κυτιδίνη.

Σχετικές έρευνες αποκαλύπτουν αυξημένα επίπεδα της MDA σε εγκύους στο

στάδιο της προ-εκλαμψίας, μία ασθένεια η οποία θεωρείται πολύ πιθανό να

σχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες (Chirico et al., 1993; Orhan et

al., 2001). Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα της MDA έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με

νόσο του Alzheimer και σε ασθενείς με μη-ινσουλινοεξαρτώμενο διαβήτη, ασθένειες

οι οποίες επίσης σχετίζονται με αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες (Delibas et al.,

2002; Dierckx et al., 2003).

Τέλος, μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε υγιή άτομα νεαρής ηλικίας (21-40 ετών)

και ηλικιωμένα (61-85 ετών) απέδειξαν ότι τα επίπεδα της MDA στο πλάσμα ήταν

υψηλότερα στα μεγαλύτερης ηλικίας άτομα, σε συνδυασμό με μειωμένη τιμή της

ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (FRAP). Το παραπάνω γεγονός ενισχύει την

άποψη για στενή σχέση της MDA με το οξειδωτικό στρες (Mutlu-Turkoglu et al.,

2003).

4-υδροξυ-2-ενενάλη (HNE)

Η 4-υδροξυ-2-ενενάλη σχηματίζεται από τη λιπιδική υπεροξείδωση των λιπαρών

οξέων, όπως το αραχιδονικό και το λινολεϊκό οξύ (Van Kuijk et al., 1990). Σε

χαμηλές συγκεντρώσεις εντοπίζεται σε υγιείς ιστούς, ενώ σε υψηλότερες

συγκεντρώσεις εμπλέκεται στην παθογένεση πολλών ασθενειών όπως η νόσος του

Alzheimer, ο καταρράκτης, η αθηροσκλήρωση και ο καρκίνος. Παρουσιάζει ποικίλη

βιολογική δραστικότητα επηρεάζοντας την κυτταρική μετανάστευση και τη

μεταγωγή σήματος, δρώντας σαν χημειοτακτικός παράγοντας και τροποποιώντας την

έκφραση διαφόρων γονιδίων, όπως το c-fos πρωτοογκογονίδιο (Esterbauer et al.,

1991).

Page 34: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

34

Εικόνα 14: Δομή της 4-υδροξυ-2-ενενάλης (HNE).

F2 -ισοπροστάνια (isoprostanes)

Τα F2-ισοπροστάνια σχηματίζονται in situ από τη λιπιδική υπεροξείδωση των

φωσφολιπιδίων που περιέχουν αραχιδονικό οξύ. Αν και μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν

ότι τα F2-ισοπροστάνια σχηματίζονται μόνο μέσω ενός ανεξάρτητου από την

κυκλοξυγενάση μηχανισμού, πρόσφατες μελέτες αποδεικνύουν ότι σχηματίζονται και

μέσω ενός ενζυμικού μονοπατιού. Τα F2-ισοπροστάνια θεωρούνται, σύμφωνα με

μελέτες, οι πιο αξιόπιστοι δείκτες για την in vivo μέτρηση του οξειδωτικού στρες

στον άνθρωπο (Morrow & Roberts, 1999).

Εικόνα 15: Δομή των F2-ισοπροστανίων.

Page 35: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

35

I.2. Εισαγωγή στη λειτουργία του εγκεφάλου

2.1 Δομή και λειτουργία του εγκεφάλου

Ο εγκέφαλος αποτελεί μαζί με το νωτιαίο μυελό το κεντρικό νευρικό σύστημα

(ΚΝΣ). Ο εγκέφαλος του ενηλίκου αποτελείται από τον προμήκη μυελό, τη γέφυρα,

την παραγκεφαλίδα, το μεσεγκέφαλο, το διεγκέφαλο (θάλαμο, υποθάλαμο), και τα

κεντρικά ημισφαίρια (εγκεφαλικός φλοιός και πυρήνες).

Εικόνα 16: Απεικόνιση του εγκεφάλου, όπου διακρίνονται οι περιοχές του

φλοιού (cerebral cortex), της παρεγκεφαλίδας (cerebellum) και του

μεσεγκεφάλου (midbrain).

2.2 Δομή και λειτουργία του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας και του

μεσεγκεφάλου.

Ο εγκεφαλικός φλοιός (cerebral cortex) αποτελεί το εξωτερικό τμήμα (στρώμα) των

κεντρικών ημισφαιρίων. Αποτελείται από τη φαιά ουσία που τη συγκροτούν κυρίως

τα σώματα των νευρικών κυττάρων, τα οποία διατάσσονται σε 6 διακριτές στιβάδες,

ενώ εσωτερικά βρίσκεται η λευκή ουσία η οποία αποτελείται από τις νευρικές ίνες

των κυττάρων του φλοιού που κατευθύνονται προς την περιφέρεια (κινητικές ή

φυγόκεντρες), τις νευρικές ίνες που κατευθύνονται από την περιφέρεια προς τα

Page 36: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

36

κύτταρα του φλοιού (αισθητικές ή κεντρομόλες) και αυτές που συνδέουν το αριστερό

με το δεξιό ημισφαίριο.

Η εξωτερική επιφάνεια των εγκεφαλικών ημισφαιρίων έχει πολλαπλές αυλακώσεις,

τις αύλακες, καθώς και προεξοχές ανάμεσα στις αύλακες, τις έλικες. Με τον τρόπο

αυτό αυξάνεται κατά πολύ η επιφάνεια των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Οι βαθύτερες

αύλακες χωρίζουν κάθε ημισφαίριο σε τέσσερις λοβούς: το μετωπιαίο, το

βρεγματικό, τον ινιακό και τον κροταφικό.

Κάθε περιοχή του φλοιού είναι εξειδικευμένη για μία συγκεκριμένη λειτουργία και

αποτελεί το κέντρο της λειτουργίας αυτής. Ο μετωπιαίος λοβός εμπλέκεται στο

σχεδιασμό και την εκτέλεση των κινήσεων, ενώ ο προμετωπιαίος λοβός είναι

σημαντικός για τις πνευματικές λειτουργίες και τον καθορισμό της προσωπικότητας

του ατόμου. Στο βρεγματικό λοβό εντοπίζονται τα αισθητικά κέντρα των γενικών

αισθήσεων (αφής, πίεσης, πόνου και θερμοκρασίας) και της γεύσης. Στον κροταφικό

λοβό εντοπίζεται το κέντρο ακοής και στον ινιακό το κέντρο όρασης.

Ο μεσεγκέφαλος (midbrain) βρίσκεται μεταξύ γέφυρας και παρεγκεφαλίδας και

αποτελείται από την οροφή (tectum) και το κάλυμμα (tegmentum). Επίσης, περιέχει

ένα κεντρικά τοποθετημένο κανάλι, το οποίο συνδέει την τρίτη και την τέταρτη

κοιλία του εγκεφάλου.

Η οροφή (tectum) σχηματίζει το ραχιαίο ή οπίσθιο τμήμα του μεσεγκεφάλου, το

οποίο αποτελείται από έναν αριθμό δομών με κυριότερα τα άνω και κάτω διδύμια. Τα

διδύμια εμφανίζονται σαν τέσσερα εξογκώματα στο εγκεφαλικό στέλεχος. Τα άνω

διδύμια λαμβάνουν αισθητικές εισόδους από τους οθφαλμούς, μέσω του θαλάμου,

και εμπλέκονται στον έλεγχο της κίνησης των οφθαλμών, ενώ τα κάτω διδύμια

λαμβάνουν κυρίως αισθητικές εισόδους από το αυτί.

Το κάλυμμα (tegmentum) του μεσεγκεφάλου βρίσκεται στο πρόσθιο τμήμα της

οροφής και αποτελεί μία πολύπλοκη δομή, η οποία περιέχει πολλούς πυρήνες,

ορισμένοι από τους οποίους εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων.

Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η μέλαινα ουσία, η οποία αποτελεί τμήμα του

καλύμματος του μεσεγκεφάλου και συμπεριλαμβάνεται στο σύστημα των βασικών

Page 37: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

37

γαγγλίων. Το ραβδωτό σώμα ανήκει στα βασικά γάγγλια και λαμβάνει μία

σημαντική ντοπαμινεργική προβολή από τη μέλαινα ουσία (μελανοραβδωτή οδός).

Εκφυλισμός αυτής της οδού έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της νόσου του

Parkinson. Το κάλυμμα περιέχει, επίσης, το τμήμα του δικτυωτού σχηματισμού, ο

οποίος αποτελεί μία διάχυτη περιοχή, η οποία εκτείνεται μέχρι τον οπίσθιο εγκέφαλο.

Ο δικτυωτός σχηματισμός λαμβάνει αισθητικές πληροφορίες από το σώμα και τις

μεταβιβάζει στον εγκεφαλικό φλοιό κυρίως μέσω του θαλάμου. Παίζει σημαντικό

ρόλο στη ρύθμιση του κύκλου ύπνου-αφύπνισης.

Η παρεγκεφαλίδα (cerebellum) είναι μία αρκετά διευρυμένη περιοχή, η οποία

βρίσκεται πίσω και κάτω από τον υπόλοιπο εγκέφαλο. Αποτελείται από το σκώληκα

στο κέντρο και από τα δύο ημισφαίρια. Όπως στα ημισφαίρια του εγκεφάλου, έτσι

και στην παρεγκεφαλίδα, περιφερικά βρίσκεται η φαιά ουσία (φλοιός της

παρεγκεφαλίδας), η οποία αποτελείται από τρεις στιβάδες κυττάρων και εδώ

σχηματίζει έλικες, ενώ εσωτερικά βρίσκεται η λευκή ουσία και πυρήνες.

Η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει προβολές από τους οφθαλμούς, το αυτί και από τους

σωματαισθητικούς υποδοχείς του σώματος. Οι πληροφορίες στη συνέχεια

μεταβιβάζονται σε άλλες περιοχές, οι οποίες εμπλέκονται στον έλεγχο των κινήσεων,

και κυρίως στον εγκεφαλικό φλοιό. Επίσης, η παρεγκεφαλίδα λαμβάνει πληροφορίες

από τον κινητικό φλοιό.

Οι λειτουργίες της παρεγκεφαλίδας οι οποίες δεν είναι συνειδητές και δεν

υπάγονται στη θέληση μας είναι: α) η διατήρηση του μυϊκού τόνου, β) ο συντονισμός

της συνεργασίας των μυών στις διάφορες κινήσεις και γ) η διατήρηση της ισορροπίας

του σώματος. Σε περιπτώσεις βλάβης της παρεγκεφαλίδας εμφανίζεται μυϊκή

αδυναμία, μη συντονισμός των μυών για την εκτέλεση των διαφόρων κινήσεων,

τρόμος και τάση του ατόμου να πέφτει προς τη μία πλευρά κατά τη στάση ή το

βάδισμα (παρεγκεφαλιδική αταξία).

Page 38: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

38

2.3 Οξειδωτικό στρες και γήρανση του εγκεφάλου

Το νευρικό σύστημα είναι ευπρόσβλητο από την τοξική δράση των ελευθέρων

ριζών. Ο εγκέφαλος περιέχει μεγάλες ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων

(PUFAs) τα οποία είναι ευαίσθητα σε υπεροξείδωση, συγκριτικά με άλλους ιστούς

χρησιμοποιεί την μεγαλύτερη ποσότητα οξυγόνου για την παραγωγή ενέργειας

(υψηλός μεταβολικός ρυθμός) και υστερεί σε αντιοξειδωτικά συστήματα με τις

χαμηλής δραστικότητας υπεροξειδάση του γλουταθείου και καταλάση σε σχέση με

άλλους ιστούς.

Κατά τη διαδικασία της φυσιολογικής γήρανσης, ο εγκέφαλος υπόκειται τόσο σε

μορφολογικές όσο και λειτουργικές μεταβολές, οι οποίες επηρεάζουν τα δενδριτικά

δίκτυα, τις συνάψεις, την νευροδιαβίβαση, την ανακύκλωση και τον μεταβολισμό

μορίων. Οι μεταβολές αυτές αντικατοπτρίζονται σε αλλαγές στην κίνηση, στη

σωματαίσθηση, στον ύπνο, στη μνήμη και τη μάθηση. Ανάμεσα στις αλλαγές που

λαμβάνουν χώρα κατά τη διαδικασία της γήρανσης περιλαμβάνεται και η ελάττωση

στην ευαισθησία του κατεχολαμινεργικού, ντοπαμινεργικού, χολινεργικού και του

ενδογενούς συστήματος αναλγησίας. Οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι εμπλέκονται

σε αυτές τις αλλαγές δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως. Ωστόσο, μία θεωρία η

οποία κερδίζει συνεχώς έδαφος είναι αυτή η οποία αναφέρεται στην αυξημένη

ευαισθησία στις μακροχρόνιες επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες, στην

μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και στην ύπαρξη φλεγμονών ως τους κύριους

παράγοντες που συμβάλλουν στην διαδικασία της γήρανσης. Όντως, η προοδευτική

έκπτωση των εγκεφαλικών λειτουργιών, η οποία σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες,

οφείλεται στην προοδευτικά αυξανόμενη ευαισθησία του εγκεφάλου στις τοξικές

επιδράσεις του οξειδωτικού στρες και επιπλέον στη φθορά των φυσιολογικών

αντιοξειδωτικών μηχανισμών του εγκεφάλου με την πάροδο των ετών.

Η 8-υδροξυ-2΄-δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG) (Εικόνα 17) είναι ένα νουκλεοτίδιο

γουανιδίνης, το οποίο έχει αποκοπεί από την αλυσίδα του DNA με ενδονουκλεάσες,

και αποτελεί τον πιο κοινό βιολογικό δείκτη για την μελέτη των μεταβολών του DNA

οι οποίες οφείλονται στο οξειδωτικό στρες (Mariani et al., 2005).

Page 39: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

39

Εικόνα 17: Σχηματισμός της 8-υδρόξυ-δεοξυγουανοσίνης (8-OHdG) από την 2-

δεοξυγουανοσίνη (2-dG). (www.abcysonline.com)

Η υπεροξείδωση λιπιδίων αποτελεί ένα κύριο χαρακτηριστικό του οξειδωτικού

στρες και μπορεί να μετρηθεί με διάφορες μεθόδους, οι οποίες περιλαμβάνουν την

ποσοτικοποίηση είτε των πρωτογενών (υδροϋπεροξειδίων), είτε των δευτερογενών

(TBARS, ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ και F2-ισοπροστάνια)

προϊόντων της υπεροξείδωσης.

Ανάμεσα σε αυτούς τους βιολογικούς δείκτες τα F2-ισοπροστάνια θεωρούνται,

σύμφωνα με μελέτες, οι πιο αξιόπιστοι δείκτες για την in vivo μέτρηση του

οξειδωτικού στρες στον άνθρωπο (Morrow & Roberts, 1999). Εντούτοις, αν και δεν

έχει διευκρινιστεί αν ο σχηματισμός των F2-ισοπροστανίων αυξάνεται στον

ανθρώπινο εγκέφαλο με την αύξηση της ηλικίας, η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) και η

4-υδροξυ-2-ενενάλη (HNE), δύο αλδεΰδες δείκτες της υπεροξείδωσης λιπιδίων, έχει

αποδειχθεί ότι αυξάνονται κατά την γήρανση στο κυτταρόπλασμα των νευρώνων και

των αστροκυττάρων και στους οφθαλμοκινητικούς νευρώνες (Dei et al., 2002;

Yoritaka et al., 1996).

Πολλές μελέτες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι παρατηρείται μία αύξηση των

οξειδωμένων πρωτεϊνών κατά τη γήρανση του εγκεφάλου. Ειδικότερα έχει δειχθεί

δείχνει μία λογαριθμική αύξηση της οξείδωσης των πρωτεϊνών, με μέτρηση των

καρβονυλικών ομάδων των πρωτεϊνών στον ανθρώπινο εγκεφαλικό φλοιό, με την

Page 40: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

40

πάροδο της ηλικίας (Smith et al., 1991). Η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών σε

καρβονύλια μπορεί να είναι αρκετά υψηλή ώστε να εξηγήσει τη μείωση της

κυτταρικής λειτουργίας με την πάροδο της ηλικίας (5% ή λιγότερο σε νεαρή ηλικία,

10-20% σε ηλικιωμένα άτομα) (Sitte et al., 2000).

Η οξειδωτική απενεργοποίηση ενζύμων είναι ένας ακόμη δείκτης της σχετιζόμενης

με την ηλικία οξειδωτικής καταστροφής των πρωτεϊνών. Το πρωτεόσωμα είναι ένα

ενδοκυτταρικό σύμπλεγμα πρωτεϊνών, το οποίο υπάρχει σε όλα τα κύτταρα του ΚΝΣ

και είναι υπεύθυνο για την πλειοψηφία των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνικών

αποδομήσεων. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι οι αλλαγές στην ενεργότητα του

πρωτεοσώματος μπορούν να συμβούν κατά τη διάρκεια, και πιθανώς συμβάλλοντας

στη διαδικασία της γήρανσης (Keller et al., 2000). Τέτοιες αλλαγές σε πρωτεολυτικά

μονοπάτια, σχετιζόμενες με τη διαδικασία της γήρανσης, μπορούν να συνεισφέρουν

στην αύξηση της πρωτεϊνικής οξείδωσης, συσσωμάτωσης και της νευροεκφυλιστικής

διαδικασίας στο γερασμένο εγκέφαλο (Keller et al., 2002).

2.4 Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές ασθένειες

Νόσος του Alzheimer (AD)

Η νόσος του Alzheimer αποτελεί την πιο κοινή μορφή άνοιας στα ηλικιωμένα

άτομα, παγκοσμίως. Η κλινική της εικόνα χαρακτηρίζεται από δυσλειτουργία της

μνήμης, απώλεια λεκτικής ικανότητας κατά διαστήματα, παροδική απώλεια

προσανατολισμού και κριτικής ικανότητας. Ιστοπαθολογικά, η AD χαρακτηρίζεται

από καταστροφή των νευρικών συνάψεων, απώλεια νευρικών κυττάρων (κυρίως

στον εγκεφαλικό φλοιό, στον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή), εξωκυτταρική απόθεση

β-αμυλοειδούς πρωτεΐνης (Αβ, η οποία σχηματίζει αμυλοειδείς πλάκες) και

ενδοκυτταρική καθίζηση υπερφωσφορυλιωμένων ταυ πρωτεϊνών (σχηματισμός

νευροϊνιδιακών πλεγμάτων).

Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός της παθογένεσης της νόσου δεν έχει διευκρινιστεί,

αλλά ιδιαίτερη σημασία δίνεται στην μαζική απώλεια του νευροδιαβιβαστή

ακετυλοχολίνη (εμπλέκεται στη διαδικασία της μνήμης και μάθησης) και στην

πιθανή εμπλοκή του οξειδωτικού στρες στην ανάπτυξη της νόσου. Η ηλικία αποτελεί

Page 41: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

41

καθοριστικό παράγοντα κινδύνου για την AD, καθώς διάφορες μελέτες δείχνουν

λογαριθμική αύξηση της οξείδωσης πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων με

την αύξηση της ηλικίας (Floyd et al., 2002). Πολλές μελέτες αναφέρουν μεταβολικές

(μιτοχονδριακές) δυσλειτουργίες στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες, οι οποίες

καταλήγουν σε αυξημένο οξειδωτικό στρες (Zhu et al., 2004).

Διάφοροι οξειδωτικοί δείκτες έχουν ευρέως μελετηθεί στη νόσο του Alzheimer

(Pulido et al., 2005). Σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε στην 8-OHdG στο πυρηνικό

και το μιτοχονδριακό DNA, το οποίο απομονώθηκε από τρεις περιοχές του

εγκεφαλικού φλοιού και από την παρεγκεφαλίδα ασθενών με Alzheimer. Τα επίπεδα

στο μιτοχονδριακό DNA ήταν υψηλότερα από ότι στο πυρηνικό, αντικατοπτρίζοντας

την αυξημένη ευαισθησία των μιτοχονδρίων στο οξειδωτικό στρες (Markesberry et

al., 1999; Mecocci et al., 1994). Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα της 8-OHdG

ανιχνεύθηκαν και στο DNA των λεμφοκυττάρων ασθενών με Alzheimer (Mecocci et

al., 1998). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι η συγκέντρωση της

οξειδωμένης αυτής βάσης στα λεμφοκύτταρα σχετίζεται με τη συγκέντρωση στο

πλάσμα κάποιων συγκεκριμένων καροτενοειδών (λουτεΐνη, λυκοπένιο, α- και β-

καροτένιο) (Mecocci et al., 2002).

Σε μεταθανάτιους εγκεφάλους ασθενών με νόσο του Alzheimer η υπεροξείδωση

λιπιδίων ποσοτικοποιείται με μέτρηση των TBARS, HNE, MDA, των υδροξυ-

υπεροξειδίων των λιπιδίων και των ισοπροστανίων. Τα επίπεδα των TBARS

βρέθηκαν αυξημένα στον πρόσθιο και κροταφικό φλοιό σε σχέση με τους μάρτυρες

(Lovell et al., 1995; Marcus et al., 1998). Άλλες μελέτες δεν κατάφεραν να δείξουν

σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των TBARS μεταξύ μαρτύρων και ασθενών με

νόσο του Alzheimer, ενώ μόνο μετά από επώαση με προ-οξειδωτικά οι εγκέφαλοι

των ασθενών με Alzheimer παρουσίαζαν αυξημένα επίπεδα TBARS σε σχέση με

τους μάρτυρες (Palmer et al., 1994; Ramassamy et al., 1999).

Οι μελέτες δεν αναφέρουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της MDA στις

μεταθανάτιες εγκεφαλικές περιοχές ασθενών με AD σε σχέση με τους μάρτυρες

(Hayn et al., 1996; Lyras et al., 1997). Αντίθετα, αναφέρουν αύξηση των επιπέδων

των F2- ισοπροστανίων στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Roberts et al., 1998). Η

υπεροξείδωση λιπιδίων προκαλεί αλλαγές στις κυτταρικές μεμβράνες (Chen et al.,

1994; Choi et al., 1995). Μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε μιτοχόνδρια από

Page 42: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

42

διάφορες εγκεφαλικές περιοχές έδειξε σημαντική μείωση στην ρευστότητα των

μεμβρανών, η οποία σχετίζεται και με μία αύξηση των επιπέδων της 8-OHdG του

μιτοχονδριακού DNA (Mecocci et al., 1996). Τέλος, αυξημένα επίπεδα

καρβονυλικών ομάδων βρέθηκαν στις μεταθανάτιες περιοχές του ιππόκαμπου και

στον κατώτερο βρεγματικό λοβό ασθενών με Alzheimer, γεγονός που συμφωνεί με

την κατά τόπους παθοφυσιολογία της νόσου (Hensley et al., 1995).

Νόσος του Parkinson (PD)

Η νόσος του Parkinson είναι αποτέλεσμα νευροεκφύλισης της μελανοραβδωτής

οδού με αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα. Η

κλινική της εικόνα χαρακτηρίζεται από βραδυκινησία, αστάθεια στην όρθια στάση,

δυσκολία στο βηματισμό και τρόμο. Αποχρωματισμός, απώλεια νευρώνων και

γλοίωση (υπερανάπτυξη νευρογλοίας) στη μέλαινα ουσία αποτελούν τις τυπικές

εγκεφαλικές ανωμαλίες, οι οποίες συναντώνται στην νόσο του Parkinson. Οι ακριβείς

αιτίες της νόσου που οδηγούν σε απόπτωση δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί, αλλά το

αυξημένο οξειδωτικό στρες και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία θεωρούνται οι

σημαντικότερες αιτίες ή μεσολαβητές της νευρωνικής καταστροφής.

Η συμβολή των ελευθέρων ριζών στη νόσο του Parkinson υποστηρίζεται από την

παρατήρηση ότι η οξείδωση της ντοπαμίνης αποδίδει τοξικές ημικινόνες

(semiquinones) καθώς και ότι ο επιταχυνόμενος μεταβολισμός της ντοπαμίνης από

την μονοαμινο-οξειδάση Β (ΜΑΟ-Β) αυξάνει τον σχηματισμό υπεροξειδίων του

υδρογόνου, ανιόντων υπεροξειδίου και υδροξυλικών ανιόντων (Olanow, 1990).

Μία επιπλέον απόδειξη του ρόλου του οξειδωτικού στρες στη νόσο του Parkinson

προέρχεται από μελέτες σχετικά με την επιλεκτική τοξικότητα της 1-μεθυλ-4-φαινυλ-

1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνης (MPTP) στη μέλαινα ουσία, η οποία προκαλεί τα

συμπτώματα που μιμούνται αυτά της νόσου του Parkinson στα πρωτεύοντα. Η MPTP

δρα μέσω του μεταβολίτη της MPP+ για να αναστείλει το σύμπλοκο Ι στην

αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων. Μελέτες σε μεταθανάτιους ιστούς

ασθενών με νόσο του Parkinson δείχνουν επιλεκτική και ανεξάρτητη από φάρμακα

δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων των κυττάρων της μέλαινας ουσίας των ασθενών

(Hattori et al., 1991; Shapira et al., 1992; Burkhardt et al., 1993). Επίσης, έχει δειχθεί

ότι η MPP+ αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων στο οξειδωτικό στρες (Lee et al.,

2000).

Page 43: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

43

Η νόσος του Parkinson συνδέεται με αυξημένα επίπεδα οξειδωτικής βλάβης του

DNA καθώς και με σημαντική αύξηση στα επίπεδα της 8-OHdG στον κερκοφόρο

πυρήνα και τη μέλαινα ουσία (Sanchez-Ramos et al., 1994; Beal, 1995). Αυξημένα

επίπεδα της 8-OHdG βρέθηκαν επίσης στον ορό και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό

ασθενών με PD (Kikuchi et al., 2002).

Μελέτες αποδεικνύουν την αύξηση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων στον

μεταθανάτιο εγκέφαλο ασθενών με νόσο του Parkinson (Yoritaka et al., 1996). Τα

επίπεδα της MDA είναι περισσότερο αυξημένα στη μέλανα ουσία σε σχέση με τις

υπόλοιπες εγκεφαλικές περιοχές των ασθενών και τους μάρτυρες (Dexter et al.,

1989). Επίσης, το υπεροξείδιο του λιπιδίου της χοληστερόλης, ένας δείκτης της

υπεροξείδωσης λιπιδίων, εμφανίζει μία αύξηση της τάξης των 10 φορών στη μέλανα

ουσία ασθενών με νόσο του Parkinson σε σχέση με τους μάρτυρες (Dexter et al.,

1994).

Αύξηση στις καρβονυλικές ομάδες των πρωτεϊνών παρατηρήθηκε σε αρκετές

μεταθανάτιες εγκεφαλικές περιοχές ασθενών με νόσο του Parkinson

συμπεριλαμβανομένης της μέλαινας ουσίας, των βασικών γαγγλίων, της ωχράς

σφαίρας, του πρόσθιου φλοιού και της παρεγκεφαλίδας (Alam et al., 1997).

Χορεία του Huntington (HD)

Η χορεία του Huntington είναι μία θανατηφόρος νευροεκφυλιστική ασθένεια, η

οποία εμφανίζει αυτοσωμική κληρονομικότητα. Χαρακτηρίζεται από προοδευτική

άνοια, ψυχιατρικά συμπτώματα, και από μία δυσκολία στην κίνηση με τη μορφή της

χορείας και καταλήγει σε πρόωρο θάνατο. Η χορεία του Huntington προκαλείται από

αυξημένη επανάληψη της τριπλέτας CAG στην αλληλουχία ενός γονιδίου που

κωδικοποιεί μία άγνωστης λειτουργίας πρωτεΐνη, την huntingtin.

Οι διάφορες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί αναφέρουν μία σημαντική

μεταβολή (της τάξης του 35%) στα επίπεδα των F2-ισοπροστανίων στους ασθενείς με

χορεία του Huntington σε σχέση με τους μάρτυρες καθώς και αυξημένα επίπεδα

υπεροξείδωσης λιπιδίων στις περιοχές του εκφυλισμού (Browne et al., 1999).

Page 44: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

44

Ι.3. ΟΦΘΑΛΜΟΣ

3.1 Οφθαλμός– δομή και λειτουργία

Εικόνα 18: Οφθαλμός ανθρώπου. (retina: αμφιβληστροειδής χιτώνας, iris: ίριδα,

pupil: κόρη οφθαλμού, crystalline lens: κρυσταλλοειδής φακός, cornea:

κερατοειδής χιτώνας, vitreous body: υαλοειδές σώμα, sclera: σκληρός χιτώνας,

anterior chamber: εμπρόσθιος θάλαμος οφθαλμού, macula: ωχρά κηλίδα, optic

nerve: οπτικό νεύρο).

Τα τμήματα από τα οποία αποτελείται ο οφθαλμός (Εικόνα 18, 19) με τη σειρά

κατά την οποία διέρχεται από αυτά το φως είναι τα εξής: 1) ο κερατοειδής χιτώνας

(cornea), μέσω του οποίου διέρχεται αρχικά το φως και ο οποίος αποτελεί το πρώτο

τμήμα του συστήματος εστίασης του οφθαλμού. 2) Ο εμπρόσθιος θάλαμος του

οφθαλμού (anterior chamber), ένας χώρος γεμάτο με υγρό, πίσω ακριβώς από τον

κερατοειδή χιτώνα. Το υγρό αυτό ονομάζεται υδατοειδές υγρό και παράγεται από

έναν αδένα, το ακτινωτό σώμα (ciliary body). 3) Η κόρη του οφθαλμού (pupil), μία

στρογγυλή οπή στο κέντρο της ίριδας (iris). Η ίριδα αποτελεί το χρωματιστό τμήμα

Page 45: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

45

του οφθαλμού και ρυθμίζοντας το μέγεθος της κόρης ελέγχει την ποσότητα του

φωτός που εισέρχεται στο μάτι. Η κόρη διαστέλλεται στο σκοτάδι και συστέλλεται

στο έντονο φως. 4) Ακολουθεί ο φακός (lens), αμφίκυρτος και διαπερατός, ο οποίος

αλλάζει το σχήμα του προκειμένου να εστιάσει το φως στον αμφιβληστροειδή

χιτώνα. 5) Μετά το φακό, το φως διέρχεται από το υαλοειδές σώμα (vitreous body),

μία πηκτή ουσία, και 6) εστιάζεται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα (retina) στο πίσω

μέρος του οφθαλμού. Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας διαθέτει φωτοευαίσθητα κύτταρα

τους φωτοϋποδοχείς (photoreceptors), οι οποίοι μετατρέπουν την φωτεινή ενέργεια

σε ηλεκτρικό σήμα. Τα ηλεκτρικά σήματα μεταβιβάζονται στον εγκέφαλο μέσω του

οπτικού νεύρου (optic nerve). Κάτω από τον αμφιβληστροειδή χιτώνα βρίσκεται ο

χοριοειδής χιτώνας (choroid), μία μεμβράνη πλούσια σε αγγεία, μέσω του οποίου

περνούν τα θρεπτικά συστατικά προς τον αμφιβληστροειδή χιτώνα.

3.2 Συγκριτική παρουσίαση οφθαλμού ανθρώπου και επίμυος

Ο οφθαλμός του επίμυος αποτελείται από τα ίδια βασικά τμήματα με τον οφθαλμό

του ανθρώπου παρουσιάζει όμως κάποιες βασικές διαφορές. Ο φακός του ανθρώπου

επιτρέπει τη διέλευση μόνο του ορατού φωτός, ενώ ο φακός του επίμυος όχι μόνο του

ορατού αλλά και το 50% περίπου της υπεριώδους ακτινοβολίας. Ο φακός του

ανθρώπου έχει την ικανότητα αλλαγής του σχήματός του για να εστιάζεται το φως

στον αμφιβληστροειδή χιτώνα. Αντίθετα, ο φακός του επίμυος δεν έχει αυτή την

ικανότητα, λόγω του υποπλασμένου ακτινωτού μυός. Στον αμφιβληστροειδή χιτώνα

του ανθρώπου υπάρχουν δύο τύποι φωτοϋποδοχέων: ένας τύπος για το φως (ραβδία)

και ένας για τα χρώματα (κωνία). Στον άνθρωπο υπάρχουν τρεις τύποι κωνίων: για το

πράσινο, το κόκκινο και το μπλε. Στον επίμυ υπάρχουν δύο τύποι κωνίων (μπλε και

πράσινο), και συνεπώς, δεν μπορεί να δει το κόκκινο χρώμα. Τέλος, η όραση του

ανθρώπου εμφανίζει μεγαλύτερη οξύτητα από αυτή του επίμυος, επειδή στον επίμυ

κάθε νευρικό κύτταρο του αμφιβληστροειδούς ελέγχει μεγαλύτερο αριθμό

φωτοϋποδοχέων από ότι στον άνθρωπο.

Page 46: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

46

Εικόνα 19: Συγκριτική παρουσίαση οφθαλμού ανθρώπου (αριστερά) και επίμυος

(δεξιά). (retina: αμφιβληστροειδής χιτώνας, iris: ίριδα, pupil: κόρη οφθαλμού, lens:

φακός, cornea: κερατοειδής χιτώνας, ciliary body: ακτινωτό σώμα, choroid:

χοριοειδής χιτώνας, vitreous body: υαλοειδές σώμα, sclera: σκληρός χιτώνας,

anterior chamber: εμπρόσθιος θάλαμος οφθαλμού).

(www.ratbehavior.org/Eyes.htm)

3.3 Φακός – δομή και λειτουργία

Ο φακός του οφθαλμού βρίσκεται πίσω από την ίριδα και όπως προαναφέρθηκε

αλλάζει το σχήμα του προκειμένου να εστιάσει το φως στον αμφιβληστροειδή

χιτώνα. Το 35% του οφθαλμού αποτελείται από πρωτεΐνες και το υπόλοιπο 65% από

νερό (Lou, 2003). Η τέλεια φυσικοχημική ισορροπία των πρωτεϊνών του φακού έχει

ως αποτέλεσμα την διαύγειά του. Οποιαδήποτε αλλαγή στην ομοιογένεια του φακού

καταλήγει σε μείωση της διαύγειάς του.

Ο φακός (lens) αποτελείται από τρεις περιοχές: τον πυρήνα (nucleus), τον φλοιό

(cortex) και την κάψα (capsule). Ο φλοιός αποτελεί το κεντρικό τμήμα του φακού, το

οποίο περιβάλλεται από τον φλοιό και η κάψα αποτελεί την εξώτερη στιβάδα.

Page 47: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

47

Εικόνα 20: Φακός οφθαλμού (crystalline lens).

Στην κατασκευή του φακού η φύση είχε να αντιμετωπίσει μία μοναδική πρόκληση.

Έπρεπε να κατασκευάσει έναν ιστό ο οποίος να εστιάζει το φως στον

αμφιβληστροειδή χιτώνα με την ελάχιστη δυνατή παραμόρφωση και τη μέγιστη

σταθερότητα, έτσι ώστε το όργανο να παραμένει αμετάβλητο για κάποιες δεκαετίες.

Το πρόβλημα λύθηκε με την ανάπτυξη ενός ενθυλακιωμένου (στο εσωτερικό της

κάψας), χωρίς αγγεία, διαπερατού οργάνου, σε επαφή με ένα γρήγορα

μεταβαλλόμενο υγρό, το υδατοειδές υγρό. Ταινιωδείς ίνες (zonular fibers)

συγκρατούν το φακό και αντιστέκονται στις δυνάμεις που προκαλούν αλλαγή στην

φακοειδή καμπυλότητα που απαιτείται για την ικανότητα εστίασης σε αντικείμενα τα

οποία βρίσκονται σε διαφορετικές αποστάσεις από το μάτι.

Ο φακός αποτελείται από μία μονή στιβάδα επιθηλιακών κυττάρων στο ισημερινό

επίπεδο, η οποία διαφοροποιείται τελικώς σε κυτταρικές ίνες. Κατά τη διάρκεια της

ανάπτυξης, οι ίνες επιμηκύνονται προς τους πόλους. Οι καινούριες ίνες

αναπτύσσονται πάνω στις προϋπάρχουσες, αυξάνοντας τον όγκο του φακού και

αντικαθιστώντας τις παλιές ίνες προς το κέντρο του φακού. Έτσι, η εσωτερική

περιοχή, γνωστή ως πυρήνας, αντιπροσωπεύει τον εμβρυϊκό φακό, ενώ περιφερειακά

βρίσκονται οι νεαρότερες ίνες, οι οποίες αποτελούν και το μεταβολικά ενεργό τμήμα

του φακού. Ο πυρήνας, τα μιτοχόνδρια και τα υπόλοιπα κυτταρικά οργανίδια

αποικοδομούνται κατά τη διάρκεια της τελικής διαφοροποίησης, με αποτέλεσμα οι

Page 48: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

48

τελικώς διαφοροποιημένες ίνες του φακού, οι οποίες αποτελούν ένα μεγάλο τμήμα

του ώριμου φακού, να έχουν χάσει την ικανότητα να συνθέτουν πρωτεΐνες και να

διατηρούν τη μεταβολική δραστηριότητα. Στον άνθρωπο κατά τη διάρκεια της

ενδομήτριας ανάπτυξης και την πρώτη περίοδο μετά τη γέννηση, οι ίνες

αναπτύσσονται με πολύ γρήγορους ρυθμούς στον φακό. Μετά τα πρώτα χρόνια της

ζωής του ανθρώπου, ο ρυθμός αυτός μειώνεται σημαντικά και στη συνέχεια

διατηρείται σε ένα χαμηλό, αλλά σταθερό επίπεδο για το υπόλοιπο της ζωής.

Αποτέλεσμα αυτού του γεγονότος είναι το ότι το μεταβολικά ενεργό τμήμα του

φακού να συρρικνώνεται συνεχώς. Πιστεύεται, χωρίς να έχει αποδειχθεί, ότι τα

επιθηλιακά κύτταρα και μόνο ασκούν όλες τις κυτταρικές λειτουργίες (Spector,

1995).

Οι κυτταρικές ίνες του φακού περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις κρυσταλλινών

(crystallins), πρωτεϊνών οι οποίες συμβάλλουν στην δημιουργία ενός ενιαίου δείκτη

διάθλασης και στην ελαχιστοποίηση της σκέδασης του φωτός (Zigler, 1994). Οι

ώριμες ίνες δεν έχουν την ικανότητα αντικατάστασης, αλλά περιορισμένη ικανότητα

επιδιόρθωσης των κατεστραμμένων μακρομορίων και χαμηλά επίπεδα άμυνας έναντι

των εξωτερικών εισβολέων. Έτσι, η βαθμιαία αναπτυσσόμενη εσωτερική περιοχή του

οργάνου στηρίζεται στο επιθήλιο και σε μία λεπτή στιβάδα αναπτυσσόμενων ινών

για την διατήρηση της μορφολογίας του οργάνου, την προστασία από εξωτερικούς

εισβολείς και την διατήρηση της διαύγειας (διαφάνειας) του φακού.

Ο φακός είναι ένας ιστός ευπρόσβλητος, ο οποίος διατηρεί την φυσιολογική του

κατάσταση χάρη στην απομόνωσή του και στην μεταβολικά ενεργή περιφέρειά του.

Όντας ενθυλακιωμένος, χωρίς αγγεία και με έναν αποτελεσματικό φραγμό για αίμα

και νερό προστατεύεται από βακτηριακές και ιικές μολύνσεις. Η βασική του

λειτουργία είναι η εστίαση του φωτός στον αμφιβληστροειδή χιτώνα. Φως του

κατάλληλου μήκους κύματος κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες μπορεί να

προκαλέσει τον σχηματισμό ενεργών συστατικών που μπορούν να προκαλέσουν

οξειδωτική βλάβη. Εκτιμάται ότι η πίεση του οξυγόνου στην περιοχή του φακού είναι

χαμηλή, γύρω στα 30mm Hg, είναι όμως αρκετή για την πραγματοποίηση αερόβιων

μεταβολικών αντιδράσεων και για τον σχηματισμό ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS)

(Kwan et al., 1972).

Page 49: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

49

I.4. Καταρράκτης

4.1 Γενικά περί καταρράκτη

Ο καταρράκτης αποτελεί πολύ συχνή ανωμαλία του κρυσταλλοειδούς φακού, η

οποία παρατηρείται περισσότερο σε άτομα μεγάλης ηλικίας. Καταρράκτης

ονομάζεται η θολωμένη ή τελείως αδιαφανής περιοχή του φακού. Οι ακτίνες του

φωτός δεν μπορούν να διέλθουν λόγω της θολερότητας του φακού και, έτσι,

παρακωλύεται η ευκρινής όραση, η οποία, μάλιστα, μειώνεται, με συνέπεια

προοδευτική ανώδυνη απώλεια της όρασης.

Η εμφάνιση του καταρράκτη είναι πολύ διαδεδομένη στις μεγαλύτερες ηλικίες. Τα

άτομα μεταξύ 52 και 64 ετών έχουν 50% πιθανότητα να εμφανίσουν καταρράκτη. Η

πιθανότητα αυτή αυξάνεται στο 70% για τα άτομα άνω των 70 ετών. Αποτελεί την

πιο συχνή αιτία χειρουργικών επεμβάσεων για τα άτομα άνω των 65 ετών (Kupfer et

al., 1984; Kupfer et al., 1994; Pizzarello, 1987).

Η εμφάνιση καταρράκτη σε νεαρά άτομα είναι αρκετά σπάνια και ανήκει σε μία

από τις παρακάτω κατηγορίες: 1) συγγενής καταρράκτης στα νεογέννητα, ο οποίος

οφείλεται είτε σε κάποια γενετική ανωμαλία είτε σε μόλυνση ή ασθένεια της μητέρας

κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, 2) καταρράκτης ο οποίος εμφανίζεται σε

διαβητικά άτομα (συσσώρευση σορβιτόλης και φρουκτόζης στο φακό), και 3)

καταρράκτης ο οποίος οφείλεται σε τραυματισμό του οφθαλμού. Καταρράκτης

μπορεί επίσης να προκληθεί και από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) ή σε

χημικές ουσίες (π.χ. στεροειδή). Τέλος, ο σύγχρονος τρόπος ζωής (κάπνισμα,

αλκοόλ, δίαιτες πλούσιες σε κορεσμένα λίπη) συμβάλλει στην εμφάνιση καταρράκτη.

Υπάρχουν πολλοί διακριτοί τύποι καταρράκτη ανάλογα με την περιοχή (τμήμα) του

φακού στην οποία εντοπίζεται η θολερότητα (Chylack et al., 1994). Αναφέρονται οι

εξής τύποι καταρράκτη:

α) φλοιώδης (cortical), όταν η θολερότητα εντοπίζεται στην εξωτερική περιοχή του

ιστού (φλοιός) και προοδευτικά εκτείνεται προς το εσωτερικό του φακού, αυτός ο

τύπος καταρράκτη εντοπίζεται συχνά στα διαβητικά άτομα,

Page 50: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

50

β) πυρηνικός (nuclear opacity, όταν η θολερότητα εντοπίζεται στον πυρήνα (κέντρο)

του φακού και ο συνηθέστερος τύπος καταρράκτη στα ηλικιωμένα άτομα,

γ) οπίσθιος υποθυλακιώδης (posterior subcapsular), όταν η θολερότητα εντοπίζεται

στην επιφανειακή περιοχή κάτω από το θυλάκιο στην οπίσθια περιοχή του φακού και

εμφανίζεται συνήθως σε διαβητικά άτομα, άτομα με μελαγχρωματική

αμφιβληστροειδίτιδα καθώς και σε άτομα που λαμβάνουν στεροειδή, και τέλος

δ) καταρράκτης στον οποίο η θολερότητα καλύπτει όλη την περιοχή του φακού.

Εικόνα 21: Σχηματική απεικόνιση φακού με καταρράκτη (οφθαλμός

ανθρώπου).

Επίσης, υπάρχει βαθμολογική κλίμακα (βαθμός 0 έως 4) η οποία έχει αναπτυχθεί με

βάση τη μορφολογία και το χρώμα της αδιαφανούς περιοχής και η οποία

χαρακτηρίζει την σοβαρότητα του περιστατικού (Pollack et al., 1999). Η

βαθμολογική κλίμακα έχει ως εξής: βαθμός 0: καθόλου θολερότητα, καθαρός φακός,

βαθμός 1: θολότητα που καλύπτει λιγότερο από το 1/3 της περιοχής του φακού,

βαθμός 2: η θολότητα εμφανίζεται στην περιφέρεια του φακού καλύπτοντας μία

περιοχή μεταξύ 1/3 και 2/3 της περιοχής του φακού, βαθμός 3: η θολότητα καλύπτει

τα 2/3 της περιοχής του φακού, ενώ να εμφανιστεί και πυρηνικός καταρράκτης,

βαθμός 4: η θολότητα καλύπτει όλη την περιοχή του φακού, η οποία εμφανίζεται

λευκή ακόμη και με γυμνό μάτι.

Page 51: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

51

Εικόνα 22: Φωτογραφία οφθαλμού επίμυος με πυρηνικό καταρράκτη (nuclear

opacity) (αριστερά) και φυσιολογικού (δεξιά).

Η πρόκληση της νόσου στον άνθρωπο (πέρα από τα δεδομένα της πειραματικής

έρευνας στα ζώα) φαίνεται ότι επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, οι κυριότεροι

από τους οποίους είναι:

α) βιολογικοί (αποτέλεσμα γήρανσης ή γενετικής διαταραχής),

β) ανοσολογικοί (μέσω αντισωμάτων κ.ά.),

γ) μεταβολικοί γενικοί (από διαταραχές ορμονών, έλλειψη βιταμινών, διαταραχές

ιχνοστοιχείων και ιόντων κ.ά.) που επιδρούν και σε τοπικό επίπεδο. Η υπεροξείδωση

των λιπιδίων ερευνήθηκε σαν ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς

καταρρακτογένεσης στον άνθρωπο.

δ) τοπικοί παράγοντες (διαταραχές μεταβολισμού μέσα από το φακό ή στο υδατοειδές

υγρό από γενικότερες ή τοπικές διαταραχές, μεταβολές στο υδατοειδές, μείωση της

ενέργειας στο φακό, οξειδώσεις) και

ε) περιβαλλοντικοί παράγοντες (ακτινοβολίες κ.ά.).

4.2 Καταρράκτης και οξειδωτικό στρες

Ο καταρράκτης εμφανίζεται, όπως προαναφέρθηκε, σε προχωρημένη ηλικία. Τα

συστατικά του φακού του νεαρού ατόμου διαφέρουν από αυτά του ηλικιωμένου. Το

γεγονός αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βάση για την μελέτη των φυσιολογικών

αλλαγών που συμβαίνουν στο φακό με την πάροδο του χρόνου. Οι διαφορές στον

φακό με την πάροδο της ηλικίας πραγματοποιούνται μέσω τριών κύριων

διαδικασιών. Μέσω μεταμεταγραφικών τροποποιήσεων στις πρωτεΐνες του

Page 52: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

52

εσωτερικού του φακού, όπου η σύνθεση πρωτεϊνών είναι αμελητέα και τα κύρια

πρωτεϊνικά μακρομόρια διατηρούνται για πολλά χρόνια. Αυτές οι μεταμεταγραφικές

τροποποιήσεις περιλαμβάνουν γλυκοζυλιώσεις, απαμινώσεις, αποικοδομήσεις

καρβοξυτελικού άκρου οι οποίες τροποποιούν την χωροδιάταξη των πρωτεϊνών του

φακού (Van Kleef et al., 1975; De Jong et al., 1988). Επιπλέον, είναι γνωστό ότι ένας

μεγάλος αριθμός γονιδίων ελέγχει την παραγωγή των κρυσταλλινών, των κύριων

δομικών πρωτεϊνών του φακού. Μετάλλαξη, απενεργοποίηση ή αλλαγή στην

έκφραση ενός ή περισσοτέρων από αυτά τα γονίδια έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή

των πρωτεϊνών που αυτά εκφράζουν (Piatigorsky, 1989; Hejtmancik et al., 1994).

Τέλος, διάφορα μεταβολικώς ενεργά μόρια του φακού τα οποία εμπλέκονται στην

διαδικασία της προστασίας από το οξειδωτικό στρες χάνουν την ενεργότητά τους ή

μέρος αυτής με την πάροδο των χρόνων (Hockwin et al., 1984).

Στον φακό των ατόμων νεαρής ηλικίας δεν συμβαίνει οξείδωση των πρωτεϊνών του

κυταρροπλάσματος ή των κυτταρικών μεμβρανών (Garner & Spector, 1980). Στους

φυσιολογικούς φακούς αρχίζει να παρατηρείται οξείδωση των μεμβρανικών

πρωτεϊνών στην ηλικία των 60-65 ετών, χωρίς να παρατηρείται κάτι ανάλογο στις

πρωτεΐνες του κυταρροπλάσματος.

Αντίθετα, εντελώς διαφορετική παρουσιάζεται η εικόνα του φακού στον

καταρράκτη. Οι πρωτεΐνες είναι οξειδωμένες τόσο στις κυτταρικές μεμβράνες όσο

και στο κυτταρόπλασμα φακών με καταρράκτη. Επίσης, χαρακτηριστικό του

καταρράκτη αποτελεί ο σχηματισμός πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων μεγάλου

μοριακού βάρους, τα οποία συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Μερικά από τα

συσσωματώματα είναι μεγαλύτερα από 5x107 Da, αρκετά μεγάλα δηλαδή ώστε να

σκεδάζουν το φως και να συμβάλουν στην απώλεια της διαύγειας του φακού

(Spector, 1984). Τέλος, στον καταρράκτη παρατηρείται και εκτεταμένη οξείδωση

των μεμβρανικών λιπιδίων, κάτι που δεν συμβαίνει στους φυσιολογικούς φακούς

(Bhuyan et al., 1986).

Μελέτες σε φακούς ατόμων με καταρράκτη αποκαλύπτουν ότι οξείδωση των

πρωτεϊνών συμβαίνει τόσο στις διαυγείς περιοχές του φακού, όσο και στις περιοχές

με θολότητα, αλλά τα μεγάλου μοριακού βάρους συσσωματώματα, τα οποία

συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς, εμφανίζονται μόνο στις περιοχές με

θολότητα (Garner & Spector, 1980). Συνεπώς, η οξείδωση συμμετέχει στην ανάπτυξη

Page 53: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

53

του καταρράκτη και στην απώλεια της διαύγειας του φακού, αλλά δεν αποδεικνύεται

ότι αποτελεί και την πρωταρχική αιτία αυτών.

Άλλες μελέτες αποδεικνύουν ότι το οξειδωτικό στρες αποτελεί ένα από τα

πρωταρχικά γεγονότα στον καταρράκτη. Η συγκέντρωση του υπεροξειδίου του

υδρογόνου (H2O2) στους φυσιολογικούς φακούς και στο υδατοειδές υγρό

ανθρώπινου οφθαλμού είναι περίπου 20 έως 30 μΜ. Μελέτες σε φακούς με

καταρράκτη δείχνουν μία αύξηση των επιπέδων του H2O2 από 2 έως 7 φορές σε

σχέση με τους φυσιολογικούς φακούς (Spector et al., 1981). Η αυξημένη

συγκέντρωση του H2O2 οφείλεται σε ένα συνδυασμό των παρακάτω παραγόντων:

μείωση της ενεργότητας των συστημάτων που μεταβολίζουν το H2O2 με την πάροδο

των χρόνων, αυξημένη παραγωγή H2O2 στον οφθαλμό λόγω παθολογικών αιτίων,

οφθαλμικές φλεγμονές οι οποίες είναι αρκετά συνηθισμένες στις μεγάλες ηλικίες και

τέλος η παρουσία στον οφθαλμό μορίων τα οποία μέσω φωτοχημικών αντιδράσεων

αυξάνουν την συγκέντρωση του H2O2 (Zigman, 1985).

Για τη μελέτη της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στην ανάπτυξη του

καταρράκτη έχουν πραγματοποιηθεί και in vivo μελέτες, σε επίπεδο κυττάρων ή

ιστού. Ο φακός μπορεί σχετικά εύκολα να αφαιρεθεί από τον υπόλοιπο οφθαλμό και

να διατηρηθεί σε κυτταρική καλλιέργεια για διάστημα 2 εβδομάδων χωρίς σημαντική

μεταβολή στις βιοχημικές του παραμέτρους. Μελέτες στις οποίες οι φακοί της

καλλιέργειας βρίσκονταν σε περιβάλλον με αυξημένα επίπεδα H2O2 απέδειξαν ότι

αυξημένες συγκεντρώσεις H2O2 μπορούν να προκαλέσουν καταρράκτη (Garner et al.,

1982; Spector et al., 1993). Επιπλέον, το πρότυπο της πρωτεϊνικής καταστροφής που

προκάλεσε το H2O2 είναι παρόμοιο με αυτό που εμφανίζεται στον καταρράκτη

(Zigler et al., 1989). Τέλος, παρατηρήθηκε ότι στα μεταβολικά συστήματα που

παρουσιάζουν αυξημένες συγκεντρώσεις H2O2 το ποσοστό θνησιμότητας των

επιθηλιακών κυττάρων ήταν αυξημένο (Giblin et al., 1990) .

Μελέτες σε καλλιέργεια επιθηλιακών κυττάρων φακού κουνελιών επιβεβαιώνουν

την άποψη ότι ο κύκλος οξειδοαναγωγής του γλουταθείου αποτελεί τον κύριο

μηχανισμό άμυνας των κυττάρων έναντι της προερχόμενης από εξωκυτταρικό H2O2

οξειδωτικής βλάβης, ενώ σημαντική αντιοξειδωτική δράση παρουσιάζει και η

καταλάση (Giblin et al., 1990). Κύτταρα στα οποία είχε ανασταλεί η δράση της

καταλάσης ήταν ικανά να επιδιορθώσουν την οξειδωτική βλάβη, ενώ αντίθετα

Page 54: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

54

κύτταρα στα οποία λειτουργούσε το σύστημα της καταλάσης αλλά είχε ανασταλεί η

δράση της αναγωγάσης του γλουταθείου παρουσίαζαν αυξημένη οξειδωτική βλάβη.

Μία πιθανή εξήγηση δίνεται από τον Flohe (1982), ο οποίος υποστηρίζει ότι η

τοξικότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου οφείλεται σε ένα δευτερογενή

μεταβολίτη του, ο οποίος μπορεί να μεταβολιστεί μόνο από το σύστημα

οξειδοαναγωγής του γλουταθείου.

Το περιβάλλον του φακού χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα καλίου και

χαμηλά επίπεδα νατρίου. Η ισορροπία αυτή διατηρείται μέσω μιας K+/Na+ ATPάσης

η οποία εντοπίζεται στα επιθηλιακά και στα επιφανειακά κύτταρα του φλοιού. Στον

καταρράκτη η ενεργότητα αυτής της K+/Na+ ATPάσης μειώνεται σημαντικά

(Kobayashi & Spector, 1983). Μελέτες αποδεικνύουν ότι το H2O2 αναστέλλει την

αντλία Κ+/Νa+ εμποδίζοντας την υδρόλυση του ATP και την ανταλλαγή ιόντων.

Σημαντικό παράγοντα για τη λειτουργία της K+/Na+ ATPάσης αποτελεί και η

συγκέντρωση του γλουταθείου (GSH- ανηγμένη μορφή) στα επιθηλιακά κύτταρα του

φακού, καθώς η οξείδωσή της προκαλεί μείωση της ενεργότητας της K+/Na+

ATPάσης και ανισορροπία στην κατανομή ιόντων καλίου, νατρίου, χλωρίου (Giblin

et al., 1976).

Με βάση τις προηγούμενες μελέτες οι οποίες υποστηρίζουν ότι αυξημένες

συγκεντρώσεις H2O2 μπορούν να προκαλέσουν καταρράκτη, μπορούμε να

υποθέσουμε ότι το οξειδωτικό στρες δεν θα επηρέαζε τον φακό αν η συγκέντρωση

του H2O2 διατηρούνταν στα φυσιολογικά για το φακό επίπεδα. Ο πιο

αποτελεσματικός τρόπος ελέγχου των επιπέδων του H2O2 στο φακό είναι ο ενζυμικός,

μέσω της ανάπτυξης χαμηλού μοριακού βάρους μιμητών της υπεροξειδάσης του

γλουταθείου (Wilson & Spector, 1989). Οι μιμητές αυτοί είναι δύο τύπων: σύμπλοκα

μετάλλων μετάπτωσης και αρωματικές ενώσεις με βάση το σελήνιο (Se). Οι μελέτες

αυτές αποδεικνύουν ότι το οξειδωτικό στρες μπορεί να προκαλέσει καταρράκτη και

ότι ο περιορισμός των επιπέδων του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2) μέσω των

συνθετικών μιμητών της υπεροξειδάσης του γλουταθείου προστατεύει τον φακό,

παρά το γεγονός ότι οι συνθετικές αυτές ενώσεις δεν περνούν στο εσωτερικό του

ιστού.

Page 55: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

55

Πρόσφατες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε επίμυς, οι οποίοι εμφάνισαν

καταρράκτη ύστερα από χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης (STZ), αναφέρουν αυξημένα

επίπεδα καρβονυλίων και μειωμένα επίπεδα σουλφυδρυλίων στους φακούς των ζώων

με καταρράκτη σε σχέση με τους μάρτυρες (Kyselova et al., 2005). Η STZ προκαλεί

ινσουλινο-εξαρτώμενο διαβήτη (τύπος Ι-IDDM) καθώς καταστρέφει τα κύτταρα

Langerhans (Langerhans β-cells) του παγκρέατος (Rakieten et al., 1963). Συνεπώς, ο

καταρράκτης στην περίπτωση αυτή είναι αποτέλεσμα του διαβήτη. Η συσσώρευση

ελεύθερων καρβονυλίων σχετίζεται στενά με την ανάπτυξη του καταρράκτη

(γεροντικού και λόγω διαβήτη) (Boscia et al., 2000). Οι παραπάνω μελέτες μάλιστα

υποστηρίζουν ότι στον άνθρωπο υπάρχει ένα ανώτατο όριο οξείδωσης των

πρωτεϊνών πάνω από το οποίο αρχίζουν να εμφανίζονται τα πρώτα κλινικά

συμπτώματα του καταρράκτη. Η οξείδωση των καρβονυλίων θεωρείται ως ένα από

τα κύρια παθολογικά αίτια που οδηγούν μέσω της δημιουργίας μοριακών

συσσωματωμάτων στην εμφάνιση καταρράκτη (Duhaiman, 1995).

Πολλά μοντέλα έχουν αναπτυχθεί για την επαγωγή του καταρράκτη μέσω

οξειδωτικού στρες. Τα γνωστότερα από αυτά είναι τα εξής: ακτινοβολία Χ, χορήγηση

σεληνιώδους νατρίου (Νa2SeO3) και φωτοχημική επαγωγή οξειδωτικού στρες.

4.3 Καταρράκτης και διατροφή

Όπως προαναφέρθηκε, ο οργανισμός μας έχει αναπτύξει διάφορα ενδογενή

συστήματα ως άμυνα έναντι του οξειδωτικού στρες. Στα συστήματα αυτά

περιλαμβάνονται και διατροφικοί παράγοντες όπως το β-καροτένιο και άλλα

καροτενοειδή, η βιταμίνη C, η βιταμίνη Ε και το σελήνιο. Πολλές έρευνες έχουν

αποδείξει τον προστατευτικό ρόλο αρκετών αντιοξειδωτικών που περιέχονται σε

τρόφιμα, καθώς και συμπληρωμάτων διατροφής που περιέχουν βιταμίνη-C, λουτεΐνη

και ζεαξανθίνη έναντι του οξειδωτικού στρες και της πιθανότητας πρόκλησης

καταρράκτη.

Σε αρκετά πειραματικά μοντέλα εφαρμόστηκε επιτυχώς η χρήση αντιοξειδωτικών

ουσιών, όπως η βιταμίνη-A, η βιταμίνη-C, βιταμίνη-E καθώς και διαφόρων

καροτενοειδών, στη μείωση του κινδύνου εμφάνισης καταρράκτη. Επίσης, έχει

διαπιστωθεί ότι διατροφή ελλιπής σε βιταμίνη-C και βιταμίνη-E, καθώς και σε

Page 56: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

56

αμινοξέα (κυρίως τρυπτοφάνη και ιστιδίνη) συντελεί σε πιο γρήγορη ανάπτυξη

καταρράκτη (Bunce et al., 1990). Αντιθέτως, τα άτομα με καταρράκτη δεν θα πρέπει

να λαμβάνουν συμπληρώματα διατροφής που περιέχουν βιταμίνη-Β2, καθώς η ουσία

αυτή είναι ιδιαίτερα φωτοευαίσθητη και η επαφή της με το φως αυξάνει την

συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών, επιδεινώνοντας την κατάσταση του καταρράκτη.

Έρευνες αποκαλύπτουν ότι πρόσληψη βιταμίνης-C σε ποσότητα 362mg ημερησίως

για 10 χρόνια ή περισσότερο από γυναίκες κάτω των 60 ετών συνδέεται με 57%

μείωση του κινδύνου εμφάνισης καταρράκτη (Taylor et al., 2002). Παρόμοιες

έρευνες αναφέρουν 28% χαμηλότερα ποσοστά εμφάνισης καταρράκτη σε γυναίκες

που λάμβαναν συμπλήρωμα βιταμίνης-C για 10 χρόνια ή περισσότερο (Chesan-Taber

et al., 1999).

Παρόμοιο προστατευτικό ρόλο έχουν και θρεπτικά συστατικά της κατηγορίας των

ξανθοφυλλών, όπως η λουτεΐνη που βρίσκεται σε μεγάλες ποσότητες σε λαχανικά

όπως το σπανάκι, το καλαμπόκι, καθώς και στον κρόκο των αυγών. Η λουτεΐνη και η

ζεαξανθίνη είναι τα μόνα καροτενοειδή τα οποία βρίσκονται αποθηκευμένα στον

αμφιβληστροειδή του ματιού (Fernandez & Afshari, 2008). Επίσης, η λουτεΐνη και η

ζεαξανθίνη έχουν την ικανότητα εκκαθάρισης των ελευθέρων ριζών, ενώ

προστατεύουν τον οφθαλμό από την υπεριώδη ακτινοβολία (Trevithick et al.,

2006).

Αντιοξειδωτικά Τροφές που περιέχουν υψηλές

συγκεντρώσεις των αντιοξειδωτικών.

Βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) Φρούτα και λαχανικά.

Βιταμίνη E (τοκοφερόλη) Φυτικά έλαια.

Πολυφαινολικά

(φλαβονοειδή)

Τσάι, καφές, σόγια, φρούτα, ελαιόλαδο,

σοκολάτα, κόκκινο κρασί.

Καροτενοειδή

(λυκοπένιο, καροτένια) Φρούτα και λαχανικά.

Page 57: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

57

Εικόνα 23: Λουτεΐνη

Εικόνα 24: Ζεαξανθίνη

Δύο πρόσφατες μελέτες αναφέρονται στον προστατευτικό ρόλο των ξανθοφυλλών

έναντι του καταρράκτη. Η πρώτη συνδέει την πρόσληψη υψηλών ποσοτήτων

λουτεΐνης και ζεαξανθίνης με τον μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης καταρράκτη (Vu et

al., 2006). Η δεύτερη αναφέρει 75% μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης καταρράκτη στα

άτομα με αυξημένα ποσοστά ζεαξανθίνης στο πλάσμα, χωρίς να κάνει λόγο για τα

ποσοστά της λουτεΐνης (Delcort et al., 2006).

Όλες οι μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με τον ρόλο της διατροφής

στην πρόληψη του καταρράκτη έχουν καταλήξει στα εξής συμπεράσματα: τα

συμπληρώματα βιταμίνης C, λουτεΐνης, ζεαξανθίνης, καροτενοειδών κ.ά. μπορούν να

επιδράσουν στην πρόοδο του καταρράκτη ή να έχουν προστατευτική δράση έναντι

του καταρράκτη σε άτομα που έχουν εκτεθεί σε αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού

στρες, όπως οι χρόνιοι καπνιστές καθώς και τα άτομα που υποσιτίζονται στις

αναπτυσσόμενες χώρες (Isik et al., 2007). Αντίθετα, δεν έχει αποδειχθεί ότι μπορούν

να επηρεάσουν ή να αναστείλουν την πορεία του καταρράκτη στο σύνολο του

πληθυσμού, καθώς και στα άτομα που ήδη πάσχουν από καταρράκτη. Όσον αφορά

στη διατροφή τα συμπληρώματα ουσιών με αντιοξειδωτική δράση θα πρέπει να

λαμβάνονται από νεαρή ηλικία και σε συνδυασμό με χαμηλή σε λιπαρά και θερμίδες

διατροφή ώστε να έχουν κάποια ευεργετικά αποτελέσματα έναντι του καταρράκτη

(Fernandez & Afshari, 2008).

Page 58: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

58

Ι.5. Οξειδωτικό στρες και καροτενοειδή

Τα καροτενοειδή είναι οι σημαντικότερες χρωστικές των ζωντανών οργανισμών και

ευθύνονται για το χρώμα πολλών φυτών, φρούτων και λαχανικών. Οφείλουν την

ονομασία τους στο ότι αποτελούν την κύρια χρωστική ουσία του καρότου. Τα

καροτενοειδή είναι τετρατερπένια, τα οποία αποτελούνται από 40 άτομα άνθρακα.

Αποτελούνται από 8 ισοπρενοειδείς μονάδες, οι οποίες είναι συνδεδεμένες με τέτοιο

τρόπο ώστε η αλληλουχία τους να αναστρέφεται στο κέντρο. Ο βασικός γραμμικός

και συμμετρικός σκελετός τους, ο οποίος μπορεί να υποστεί κυκλοποίηση στο ένα ή

και στα δύο άκρα σχηματίζοντας δακτυλίους, χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη

μεθυλομάδων μεταξύ των οπίων παρεμβάλλονται 5 ή 6 άτομα άνθρακα. Η

κυκλοποίηση καθώς και άλλες τροποποιήσεις στο σκελετό όπως υδρογόνωση,

αφυδρογόνωση, μετάθεση διπλού δεσμού, ισομερείωση, οξυγόνωση κ.ά. έχει ως

αποτέλεσμα την ύπαρξη μεγάλου αριθμού δομών. Τις ενώσεις αυτές διακρίνει

συζυγιακό σύστημα διπλών δεσμών, το οποίο αποτελεί τη χρωμοφόρο ομάδα και

ευθύνεται για το ανοιχτό κίτρινο έως βαθύ κόκκινο χρώμα.

Τα καροτενοειδή διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στα καροτένια και στις

ξανθοφύλλες (οξοκαροτενοειδή). Τα καροτένια αποτελούνται από άτομα άνθρακα

και υδρογόνου μόνο. Οι ξανθοφύλλες έχουν μία τουλάχιστον ομάδα που περιέχει

οξυγόνο, δηλαδή αποτελούν τα οξυγονωμένα παράγωγα των απλών καροτενοειδών,

και απαντώνται κυρίως στα πράσινα λαχανικά, ενώ στα κίτρινα απαντώνται όλα

σχεδόν τα καροτένια. Στη φύση απαντώνται κυρίως στην trans ισομορφή τους, η

οποία είναι και η πιο σταθερή, αλλά υπάρχουν αναφορές και για την ύπαρξη cis

ισομερών.

α-καροτένιο

Page 59: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

59

ß-καροτένιο

ε-καροτένιο

γ- καροτένιο

φουκοξανθίνη

λυκοπένιο

Εικόνα 25: Δομές καροτενοειδών.

Στα καροτενοειδή έχει αποδοθεί αντιοξειδωτική δράση (κυρίως προστατευτικός

ρόλος έναντι κάποιων μορφών καρκίνου και καρδιαγγειακών παθήσεων). Η

ικανότητα των καροτενοειδών να προστατεύουν τα κύτταρα και τους ιστούς,

δεσμεύοντας μόρια οξυγόνου και ελεύθερες ρίζες, είναι άμεσα συνδεδεμένη με τη

συζυγία των διπλών δεσμών. Τη μεγαλύτερη προστατευτική ικανότητα

παρουσιάζουν τα μόρια που έχουν 9 ή περισσότερους διπλούς δεσμούς (Rodriguez-

Amaya, 2001).

Page 60: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

60

Χαρακτηριστικό παράδειγμα της αντιοξειδωτικής δράσης των καροτενοειδών

αποτελεί το άκυκλο λυκοπένιο, στο οποίο οφείλεται το χαρακτηριστικό κόκκινο

χρώμα της τομάτας, το οποίο είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό και

μάλιστα περισσότερο από το β-καροτένιο. Συγκεκριμένα το λυκοπένιο έχει βρεθεί να

εμποδίζει την οξείδωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL), μειώνοντας

έτσι τις πιθανότητες ανάπτυξης αθηροσκλήρωσης και καρδιακών επεισοδίων. Η

μελέτη αυτή έδειξε ότι ημερήσια κατανάλωση προϊόντων τομάτας τα οποία περιείχαν

τουλάχιστον 40mg λυκοπενίου (~2 ποτήρια τοματοχυμού), ήταν αρκετή για να

μειώσει την οξείδωση των LDL (Zeb & Mehmood, 1991). Βρέθηκε επίσης ότι η

ποσότητα του λυκοπενίου απορροφάται καλύτερα από τον οργανισμό όταν η τομάτα

επεξεργαστεί σε σάλτσα, πάστα, τοματοχυμό ή κέτσαπ (Zeb & Mehmood, 1991).

Παρόμοιο προστατευτικό ρόλο έχουν και θρεπτικά συστατικά της κατηγορίας των

ξανθοφυλλών, όπως η λουτεΐνη που βρίσκεται σε μεγάλες ποσότητες σε λαχανικά

όπως το σπανάκι, το καλαμπόκι, καθώς και στον κρόκο των αυγών. Η λουτεΐνη και η

ζεαξανθίνη είναι τα μόνα καροτενοειδή τα οποία βρίσκονται αποθηκευμένα στον

αμφιβληστροειδή του ματιού (Fernandez & Afshari, 2008). Επίσης, η λουτεΐνη και η

ζεαξανθίνη έχουν την ικανότητα εκκαθάρισης των ελευθέρων ριζών, ενώ

προστατεύουν τον οφθαλμό από την υπεριώδη ακτινοβολία (Trevithick et al., 2006).

Επίσης, ευεργετικά αποτελέσματα των καροτενοειδών που μπορεί να σχετίζονται

με την αντιοξειδωτική τους δράση, περιλαμβάνουν την προστασία από ηλιακά

εγκαύματα, την ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος και την πιθανή αναστολή

της ανάπτυξης ορισμένων τύπων καρκινικών κυττάρων.

Page 61: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

61

I.6. Σεληνιώδες νάτριο

6.1 Σελήνιο (Se) και σεληνιώδες νάτριο (Νa2SeO3)

Το σελήνιο (Se) είναι ιχνοστοιχείο απαραίτητο για τον ανθρώπινο οργανισμό, σε

μικρές ποσότητες. Το έδαφος αποτελεί την πρωταρχική πηγή του, από το οποίο

εισέρχεται στην τροφική αλυσίδα, μέσω της απορρόφησής του από τα φυτά. Σελήνιο

περιέχεται σε διάφορες τροφές όπως το κρέας, τα ψάρια και οι ξηροί καρποί. Η

συνιστώμενη ημερήσια πρόσληψη σεληνίου μέσω της τροφής ανέρχεται στα 55μg,

ενώ το συνιστώμενο όριο για την πρόσληψη συμπληρωμάτων που περιέχουν σελήνιο

ανέρχεται στα 50-200μg/ ημέρα.

Απαντάται με διάφορες μορφές στον οργανισμό όπως το σεληνιώδες νάτριο

(Νa2SeO3), η σεληνο-μεθειονίνη (SeMet) (Εικόνα 26) και η σεληνο-κυστεΐνη

(SeCys). Σε μεγάλες ποσότητες είναι ιδιαίτερα τοξικό και καρκινογόνο, με

τοξικότητα παρόμοια με αυτή του αρσενικού. Υψηλές συγκεντρώσεις σεληνιώδους

νατρίου (Νa2SeO3) προάγουν το σχηματισμό της ρίζας του σουπεροξειδίου και τη

δημιουργία βλαβών στο DNA. Η τοξικότητα του σεληνίου οφείλεται επιπλέον στην

ικανότητά του να καταλύει την οξείδωση των θειολών, οδηγώντας τα κύτταρα σε

απόπτωση. Η ικανότητα του σεληνίου να προάγει το σχηματισμό της ρίζας του

σουπεροξειδίου, καθώς και το οξειδωτικό στρες επάγεται μέσω της αντίδρασής του

με το ανηγμένο γλουταθείο (Kim et al., 2002).

Εικόνα 26: Σεληνο-μεθειονίνη.

Page 62: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

62

Η σεληνο-μεθειονίνη διαθέτει ένα άτομο σεληνίου στη θέση του ατόμου θείου του

αμινοξέος μεθειονίνη. Αποτελεί την πιο συνηθισμένη μορφή συμπληρωμάτων

σεληνίου για τον άνθρωπο, καθώς οι ανόργανες μορφές επάγουν το σχηματισμό

ελευθέρων ριζών. Οι ανόργανες ενώσεις που περιέχουν σελήνιο και

προσλαμβάνονται από τον οργανισμό ανάγονται προς το ενδιάμεσο σεληνιούχο ιόν

(Se2-), το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη σύνθεση των σεληνο-πρωτεϊνών

(Suzuki et al., 2002).

Το σελήνιο (Se) παρουσιάζει δύο θεμελιώδεις τύπους δράσης: αντιοξειδωτική μέσω

της ενσωμάτωσής του στα σεληνο-εξαρτώμενα ένζυμα (selenoenzymes) και προ-

οξειδωτική μέσω της δράσης των ενώσεων που περιέχουν σελήνιο

(selenocompounds) (Forceville et al.).

Tα σελήνο-εξαρτώμενα ένζυμα (σεληνο-πρωτεΐνες, όπως η υπεροξειδάση του

γλουταθείου, η ιωδοθυρονίνη 5’-δεϊωδινάση και η αναγωγάση της θειορεδοξίνης), τα

οποία απαιτούν την παρουσία ενός ατόμου σεληνίου στο ενεργό τους κέντρο ώστε να

είναι λειτουργικά, έχουν σημαντικές βιολογικές λειτουργίες, με κυριότερη την

προστασία των κυττάρων από το οξειδωτικό στρες (αντιοξειδωτική δράση) (Cronin,

2000). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η σεληνο-πρωτεΐνη Ρ, η οποία

συντίθεται στο ήπαρ και στη συνέχεια εκκρίνεται στο πλάσμα, και προστατεύει τα

ενδοθηλιακά κύτταρα από την σήψη (Suzuki et al., 2002). Tα σελήνιο-εξαρτώμενα

ένζυμα ρυθμίζουν πολλά ενδοκυτταρικά μεταβολικά μονοπάτια, όπως ο καταρράκτης

του αραχιδονικού οξέος, η ενεργοποίηση του παράγοντα NF-κΒ, μεταγραφικές

δραστηριότητες και μιτοχονδριακές λειτουργίες. Το σελήνιο είναι επίσης απαραίτητο

για την ομαλή λειτουργία του θυρεοειδούς αδένα, του ανοσοποιητικού συστήματος,

του παγκρέατος κα του προστάτη αδένα. Εξαιτίας των πολλαπλών βιολογικών

λειτουργιών των σεληνο-εξαρτώμενων ενζύμων, το σελήνιο θεωρείται ένα

αντιοξειδωτικό μικροστοιχείο, το οποίο συμμετέχει στην προστασία από πολλές

χρόνιες παθήσεις, όπως ο καρκίνος, οι καρδιαγγειακές παθήσεις, διάφορες

φλεγμονώδεις παθήσεις, οι ιογενείς λοιμώξεις και η ανοσοανεπάρκεια

(συμπεριλαμβανομένου και του AIDS) (Rayman, 2000; Letavayova et al., 2006).

Επιπλέον, το σελήνιο παρουσιάζει και μιμητική της ινσουλίνης δράση, όπως έχει

αποδειχθεί in vivo και in vitro (Sheng et al., 2005). Όπως γίνεται αντιληπτό από τα

παραπάνω, η ανεπάρκεια σεληνίου στον οργανισμό μπορεί να αποβεί θανατηφόρα.

Page 63: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

63

Εικόνα 27: Σεληνιώδες νάτριο.

Αντιθέτως, οι ενώσεις που περιέχουν σελήνιο, κυρίως το σεληνιώδες νάτριο

(Νa2SeO3) (Εικόνα 27), παρουσιάζουν προ-οξειδωτικές ιδιότητες οι οποίες μπορεί να

είναι τοξικές για τα κύτταρα. Πράγματι, το σελήνιο ήταν αρχικά γνωστό ως

δηλητηριώδες στοιχείο λόγω της δηλητηρίασης των ζώων από φυτά πλούσια σε

σελήνιο. Στα ζώα η ελάχιστη θανατηφόρος ενδοφλέβια δόση σεληνιώδους νατρίου

βρίσκεται μεταξύ 1,5 και 3 mg/kg σωματικού βάρους. Στον άνθρωπο σπάνια έχει

αναφερθεί δηλητηρίαση από σεληνιώδες νάτριο, ενώ η κλινική εικόνα ήταν ίδια με

αυτή της δηλητηρίασης από αρσενικό. Η ελάχιστη θανατηφόρος δόση είναι η ίδια με

αυτή για τα ζώα. Η τοξικότητα του σεληνιώδους νατρίου εξαρτάται από τις προ-

οξειδωτικές του ιδιότητες. Η ημερήσια πρόσληψη μέσω της τροφής ορίζεται στα 400

μg ανώτερο ανεκτό όριο, ενώ μία εφάπαξ πρόσληψη 4mg σεληνίου θεωρείται μη

τοξική για ένα υγιές ενήλικο άτομο. Η ελάχιστη απαιτούμενη ημερησία δόση

ανέρχεται στα 40μg, ενώ πρόσληψη μικρότερη των 11μg/ημέρα θεωρείται ανεπαρκής

(Letavayová et al., 2006).

Το σελήνιο έχει, σύμφωνα με μελέτες, την ιδιότητα της αποτοξίνωσης του

οργανισμού από διάφορα βαριά μέταλλα (Diplock et al., 1986). Η αλληλεπίδραση

του σεληνίου (Se) με τον υδράργυρο (Hg) στο σώμα των θηλαστικών είναι γνωστή

εδώ και δεκαετίες και εμπλέκεται σε διάφορες βιοχημικές διεργασίες. Μελέτες οι

οποίες ασχολήθηκαν με την συσσώρευση Se και Hg σε ιστούς κατέληξαν στο

συμπέρασμα ότι η τοξικότητα του ανόργανου υδραργύρου μειώνεται σημαντικά από

την ταυτόχρονη χορήγηση σεληνίου. Συγκεκριμένα δημιουργείται ένα σύμπλοκο Hg-

Se με τη σεληνο-πρωτεΐνη Ρ, το οποίο προκαλεί ανακατανομή του Hg στον

οργανισμό και μείωση της απορρόφησής του. Οι ακριβείς μηχανισμοί αυτής της

αλληλεπίδρασης δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί (Su et al., 2007; El-Demerdash,

2001).

Page 64: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

64

6.2 Σεληνιώδες νάτριο και καταρράκτης

Η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε νεογέννητους επίμυς αποτελεί ένα δημοφιλές

μοντέλο πρόκλησης καταρράκτη. Η καταρρακτογένεση με χορήγηση σεληνιώδους

νατρίου αναφέρεται για πρώτη φορά το 1977 (Ostadalova et al., 1977). Ο

καταρράκτης προκαλείται από μία και μόνο υποδόρια ένεση σεληνιώδους νατρίου

19-30 μmoles/kg σωματικού βάρους σε επίμυς 9-14 ημερών. Το σεληνιώδες νάτριο

προκαλεί καταρρακτογένεση μόνο σε νεαρούς επίμυς, οι οποίοι βρίσκονται πριν την

κρίσιμη περίοδο ωρίμανσης του φακού (περίπου στις 16 ημέρες).

Αν και το μοντέλο αυτό χρησιμοποιείται για την πρόκληση πυρηνικού καταρράκτη

(nuclear cataract), εντοπίζεται και φλοιώδης (cortical) καταρράκτης, ο οποίος

υποχωρεί μετά από κάποιους μήνες, ενώ ο πυρηνικός καταρράκτης είναι μόνιμος.

Το σεληνιώδες νάτριο φαίνεται να εκδηλώνει τη δράση του στο φακό μέσω της

επαγωγής οξειδωτικού στρες στο φακό, αλλά ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν

έχει πλήρως διευκρινιστεί. Διάφορες βιοχημικές αλλαγές λαμβάνουν χώρα κατά τη

διαδικασία της καταρρακτογένεσης, οι οποίες εμφανίζουν ομοιότητες με τον

γεροντικό καταρράκτη (senile cataract) στον άνθρωπο και οι οποίες περιλαμβάνουν:

συσσώρευση ασβεστίου στο φακό, αλλαγές στο μεταβολισμό των επιθηλιακών

κυττάρων του φακού, επαγωγή της πρωτεόλυσης της καλπαΐνης (calpain,

πρωτεολυτικό ένζυμο που εμπλέκεται στην καταρρακτογένεση), καθίζηση των

κρυσταλλινών και απώλεια του κυτταροσκελετού (Yagci et al., 2006). Το σεληνιώδες

νάτριο προκαλεί οξείδωση των σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών, γεγονός που

οδηγεί σε καταστροφή των ιοντικών αντλιών των κυττάρων και σε διατάραξη της

ηλεκτρολυτικής ισορροπίας. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου αυξάνονται και

ενεργοποιείται η επαγώμενη από το ασβέστιο πρωτεόλυση της καλπαΐνης. Η

καλπαΐνη υδρολύει ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες και κυρίως τις β-κρυσταλλίνες. Τα

πρωτεϊνικά συσσωματώματα σκεδάζουν το φως, συμβάλλοντας στην απώλεια της

διαύγειας του φακού (Spector., 1984). Παράλληλα, μειώνεται η ενεργότητα των

αντιοξειδωτικών ενζύμων του φακού, όπως η καταλάση, η αναγωγάση του

γλουταθείου, η δισμουτάση του σουπεροξειδίου, η υπεροξειδάση του γλουταθείου

και η S-τρανσφεράση του γλουταθείου (Shearer et al., 1997).

Page 65: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

65

Θα πρέπει να τονιστεί ότι αν και το παραπάνω αποτελεί σημαντικό in vivo μοντέλο

για τη μελέτη του καταρράκτη, εντούτοις παρουσιάζει εκτός από ομοιότητες και

διαφορές σε σχέση με τον γεροντικό καταρράκτη στον άνθρωπο. Σημαντικότερη

διαφορά αποτελεί ο χρόνος δημιουργίας του καταρράκτη. Ενώ ο προκαλούμενος από

σεληνιώδες νάτριο καταρράκτης εμφανίζεται σε διάστημα μερικών ημερών (ένεση

την 9η ημέρα, εντοπισμός καταρράκτη την 16η ημέρα), στον άνθρωπο η δημιουργία

του γεροντικού καταρράκτη αποτελεί μία μακροχρόνια διαδικασία, η οποία

προκαλείται από το αυξημένο οξειδωτικό στρες.

Page 66: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

66

I.7. Crocus sativus

7.1 Γένος Crocus

Ο κρόκος είναι γνωστός από τα αρχαία χρόνια τόσο ως αυτοφυές, όσο και ως

καλλιεργούμενο φυτό στη Μικρά Ασία, στο Αιγαίο και στη Σικελία. Σύμφωνα με τον

Θεόφραστο, η Μικρά Ασία παρήγαγε την καλύτερη ποιότητα κρόκου. Μία

ενδιαφέρουσα διάσταση δίνει η μυθολογική ερμηνεία της ελληνικής λέξης για το

φυτό και το άρτυμα. Ο θεός Ερμής παίζοντας στην εξοχή με το φίλο του τον Κρόκο,

τον τραυμάτισε άθελά του στο κεφάλι. Καθώς ο νεαρός έπεφτε νεκρός, τρεις

σταγόνες από το αίμα του έπεσαν στο κέντρο του λουλουδιού και έγιναν τα τρία

νηματίδια του φυτού, το οποίο έκτοτε πήρε το όνομα του νέου. Η ιδιαίτερη εύνοια

της φύσης προς το μικρό αυτό φυτό φαίνεται μέσα από το μύθο απόλυτα

δικαιολογημένη. Η θεϊκή μεταμέλεια για τον –έστω και αθέλητο– φόνο, το

ανθρώπινο αίμα –σύμβολο του βιολογικού όντος– μεταφέρει σε ένα απλό λουλούδι

σπάνια χαρίσματα (Μίχα-Λαμπράκη, 1984).

Το γένος Crocus (Iridaceae) εξαπλώνεται από την Πορτογαλία και το Μαρόκο ως

τη Δυτική Κίνα και περιλαμβάνει περίπου 80 είδη. Η πλειονότητα των ειδών είναι

συγκεντρωμένη στη Βαλκανική Χερσόνησο και στην Τουρκία και κυρίως στη

βορειοανατολική Μεσόγειο. Το γένος είναι προσαρμοσμένο στα ξηρά καλοκαίρια

και στους υγρούς χειμώνες που χαρακτηρίζουν το κλίμα της περιοχής (Heywood and

Zohary, 1995).

Εικόνα 28: Άνθη του Crocus sativus.

Page 67: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

67

Ένα χαρακτηριστικό που είναι σταθερό για τον προσδιορισμό των ειδών του

κρόκου είναι οι πεπλατυσμένοι στύλοι, οι οποίοι μπορεί να είναι ακέραιοι,

οδοντωτοί, δισχιδείς ή πολυσχιδείς (έως και 30 ή 40 βραχίονες). Υπάρχουν ενδείξεις

ότι οι τελευταίοι αποτελούν τους χρωμοπλάστες (Caiola and Canini, 2004).

Άλλα στοιχεία που βοηθούν στον προσδιορισμό ενός κρόκου είναι: η περίοδος

άνθησης (φθινόπωρο ή άνοιξη), ο χρόνος εμφάνισης των φύλλων (πριν, συγχρόνως ή

μετά την εμφάνιση του άνθους), ο αριθμός τους, το μέγεθος, το σχήμα της διατομής,

η υφή των βολβών και άλλα ανατομικά χαρακτηριστικά του φυτού. Κάποιες

παράμετροι που λαμβάνονται υπόψη στην ποιότητα της δρόγης είναι μεταξύ άλλων

το μήκος και η ποσότητα των στύλων, το περιεχόμενο της υγρασίας στους 40o και

103o C, καθώς και το ποσοστό των πτητικών συστατικών (Alonso et al., 2000).

7.2 Crocus sativus

O Crocus sativus έχει στενή σχέση με τον Crocus cartwrightianus και τον Crocus

thomasii, ανήκει στην οικογένεια των ιριδοειδών (Iridaceae) και αναπαράγεται μέσω

των βολβών. Καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τις αρτυματικές και

χρωστικές ιδιότητες των στύλων του. Επίσης, καλλιεργείται στην Ισπανία, στην

Ιρλανδία, στη Γαλλία (Γκατινέ), στην Ιταλία (Ακουΐλα), στην Αγγλία (Έσεξ), στην

Τουρκία και στη Μέση Ανατολή.

Ο Crocus sativus ήταν ήδη γνωστός από τη Μινωική εποχή και υπάρχουν

τοιχογραφίες οι οποίες απεικονίζουν γυναίκες που συλλέγουν τον κρόκο, γνωστές ως

κροκοσυλλέκτριες (Εικόνα 29). Οι κροκοσυλλέκτριες που απεικονίζονται στις

τοιχογραφίες είναι ωραίες κοπέλες με γιορτινές φορεσιές και εξαιρετικά κοσμήματα.

Η συλλογή του κρόκου μάλλον ήταν μία πράξη με τελετουργικό χαρακτήρα. Ήταν

επίσημη γιορτή του μινωικού κόσμου και είναι πιθανό να συνέδεε τη συλλογή του

κρόκου με το πέρασμα από την παιδική ηλικία στην ενηλικίωση. Η συγκομιδή του

κρόκου σχετίστηκε με τη Μεγάλη Μητέρα, τη Μητέρα-Θεά του προϊστορικού

κόσμου, στην οποία αφιέρωναν την ετήσια σοδειά.

Page 68: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

68

Εικόνα 29: Τοιχογραφία Μινωικής εποχής.

Ο Crocus sativus συλλέγεται από κροκοσυλλέκτες, οι οποίοι μαζεύουν τα άνθη κάτω

από δυσμενείς συνθήκες, ακόμη και σε απότομες πλαγιές. Η συλλογή του Crocus

sativus πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια του φθινοπώρου (Οκτώβριος,

Νοέμβριος). Η διαδικασία απομόνωσης είναι επίπονη και πρέπει να γίνεται γρήγορα,

αλλά με προσοχή, μακριά από τον ήλιο και τη βροχή.

Εικόνα 30: Συλλογή κρόκου.

Page 69: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

69

7.3 Στύλοι του Crocus sativus

Το τμήμα του φυτού το οποίο παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, λόγω των

ιδιοτήτων του, είναι οι στύλοι του, οι οποίοι κυκλοφορούν στο εμπόριο σε

αποξηραμένη μορφή με τις ονομασίες saffron, saffran ή ζαφορά (Εικόνα 31).

Εικόνα 31: Αποξηραμένοι στύλοι κρόκου (saffron).

Αξίζει να σημειωθεί ότι για την παραγωγή ενός γραμμαρίου saffron χρειάζονται

περίπου 150-200 στύλοι. Κύριος υπεύθυνος για τη συλλογή του προϊόντος στην

Ελλάδα είναι ο Αναγκαστικός Συνεταιρισμός Κροκοπαραγωγών Κοζάνης, ο οποίος

παράγει 6-8 τόνους saffron ετησίως. Η Ελλάδα εξάγει κρόκο διαθέτοντας σχεδόν το

100% της ετήσιας παραγωγής της σε χώρες της Ευρώπης, της Αμερικής και της

Ασίας. Η μεγαλύτερη ποσότητα κρόκου εξάγεται στην Ισπανία, στην Ιταλία και στη

Γαλλία, οι οποίες απορροφούν περισσότερο από το 80% της ετήσιας παραγωγής της

Ελλάδας.

Page 70: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

70

Εικόνα 32: Καλλιέργεια κρόκου.

Ο Crocus sativus χρησιμοποιείται στη μαγειρική και στη βαφική λόγω των

αρτυματικών και χρωστικών ιδιοτήτων των στύλων του. Από την αρχαιότητα έχουν

αποδοθεί θεραπευτικές ιδιότητες στους στύλους του, όπως αναφέρεται συγκεκριμένα

σε έργα του Ιπποκράτη (5ος π.Χ. αιώνας) και του Διοσκουρίδη (1ος π.Χ. αιώνας). Ο

Ιπποκράτης τον συνιστούσε και για την αντιμετώπιση παλαιών και πρόσφατων

τραυμάτων, για έλκη των γεννητικών οργάνων και άλλα νοσήματα.

Συγκεκριμένα, ο Διοσκουρίδης στο βιβλίο του ‘’Περί ύλης ιατρικής Α΄’’ αναφέρει:

<< Έχει πεπτικές, μαλακτικές, ελαφρώς στυπτικές και διουρητικές ιδιότητες, ενώ δίνει

και καλό χρώμα και εμποδίζει το μεθύσι, όταν πίνεται με το γλυκό κρασί. όταν

επαλειφθεί στα μάτια μαζί με το γυναικείο γάλα, αναστέλλει τις καταρροές των ματιών.

Προστίθεται με ωφέλεια και στα ροφήματα για τα εσωτερικά όργανα, και στα βύσματα

και στα καταπλάσματα που εισάγονται στη μήτρα και τον πρωκτό. Είναι και

αφροδισιακός, καταπραΰνει τις φλεγμονές του ερυσιπέλατος όταν επαληφθεί, ενώ

χρησιμεύει και στις παθήσεις των αυτιών. Λένε και ότι είναι θανατηφόρος, όταν πίνεται

μαζί με νερό σε ποσότητα τριών δραχμών. Για να μπορεί να τριφτεί εύκολα, πρέπει να

τον ξεραίνουμε στον ήλιο μέσα σε θερμό καινούριο πήλινο αγγείο και πρέπει γρήγορα

να τον γυρίζουμε. Αλλά και η ρίζα του, όταν πίνεται μαζί με το γλυκό κρασί, προκαλεί

τα ούρα.>> [Διοσκουρίδης, ΑΠΑΝΤΑ 1, ‘’Περί ύλης ιατρικής Α΄’’, <<Οι

Έλληνες>>, Εκδότης Οδυσσέας Χατζόπουλος].

Page 71: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

71

Εικόνα 33: Άνθος κρόκου (διακρίνονται οι στύλοι του).

Οι στύλοι (Εικόνα 33) αποτελούν τη δρόγη του φυτού. Στη λαϊκή θεραπευτική, ο

κρόκος θεωρείται ότι είναι αντισπασμωδικός, καταπραΰνει τους πόνους των νεφρών,

διεγείρει την όρεξη, διευκολύνει την πέψη, περιορίζει τις γαστραλγίες και τους

νευρικούς κολικούς. Χρησιμοποιείται ως καταπραϋντικό και τονωτικό για τη

θεραπεία της ακμής, των φλεγμονών, των παθήσεων του στήθους, του βήχα, της

αϋπνίας και του άσθματος. Θεωρείται φάρμακο κατά των οδυνηρών δυσμηνορροιών

με ευεργετικά αποτελέσματα στην τεκνοποιία (Abdullaev, 2003).

Οι στύλοι του χρησιμοποιούνταν ως διεγερτικά της όρεξης, καθώς και για την

ομαλή λειτουργία του πεπτικού συστήματος. Γνωστά ήταν και στην κινεζική ιατρική

για τις αντισηπτικές και αναλγητικές τους ιδιότητες. Αναφέρεται ότι εκχύλισμα

στύλων συνεισφέρει στην αντιμετώπιση του προεμμηνορυσιακού συνδρόμου και της

δυσμηνόρροιας, ενώ χρησιμοποιείται ως φάρμακο κατά του βήχα, της αϋπνίας, των

στομαχικών διαταραχών, καθώς και ως αντιπυρετικό ( Ma et al., 2001; Abdullaev,

2003).

Οι στύλοι χρησιμοποιούνται ευρέως στη μαγειρική και στη βαφική. Το saffron είναι

γνωστό για τις αρτυματικές του ιδιότητες, το αρκετά ευχάριστο άρωμα και την

ιδιαίτερη γεύση που δίνει στα φαγητά. Χρησιμοποιείται για την πικάντική του γεύση

κυρίως στα ζυμαρικά, στο ρύζι, στα τυροκομικά προϊόντα, στο κρέας, καθώς και σε

διάφορα θαλασσινά. Αποτελεί σημαντικό υλικό της βιομηχανίας τροφίμων, της

Page 72: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

72

ζαχαροπλαστικής και της καπνοποιίας. Ένα από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα

των καροτενοειδών (οικογένεια στην οποία ανήκουν τα συστατικά των στύλων του

Crocus sativus) είναι η ιδιότητά τους να προσδίδουν χρώμα στα τρόφιμα, το οποίο

κυμαίνεται από ανοιχτό κίτρινο ως βαθύ κόκκινο.

Αρκετά γνωστή είναι και η χρήση του saffron στη βαφή υφασμάτων. Ο κρόκος

αναφέρεται ως μία από τις πρώτες χρωστικές που χρησιμοποιήθηκαν στην Ινδία, ήδη

από το 2500 π.Χ. Είναι γνωστό ότι οι αρχαίοι Έλληνες χρησιμοποιούσαν τους

κόκκινους στύλους του φυτού για τη βαφή των επίσημων ενδυμάτων τους. Ο

κροκωτός (μανδύας ή πέπλο) ταίριαζε σε πριγκίπισσες, θεές και ωραίες γυναίκες.

Σήμερα ο κρόκος όπως και όλες οι φυσικές χρωστικές έχουν αντικατασταθεί από

συνθετικά χρώματα, τα οποία παράγονται σε βιομηχανική κλίμακα με πολύ

χαμηλότερο κόστος και καλύτερες βαφικές ιδιότητες. Το saffron είναι κατάλληλο και

για την παρασκευή καλλυντικών και αρωμάτων. Οι γυναίκες το χρησιμοποιούσαν

σαν μακιγιάζ, ενώ παραδοσιακά οι νύφες στην Ινδία βάφουν με αυτό μέρη του

σώματός τους.

Page 73: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

73

7.4 Χημική σύσταση των στύλων του Crocus sativus

Τα κύρια συστατικά των στύλων του Crocus sativus είναι οι cis- και trans-κροκίνες,

οι οποίες είναι μονο-γλυκοζιτικοί και δι-γλυκοζιτικοί εστέρες της κροκετίνης

(πολυενικό δικαρβοξυλικό οξύ). Η κροκετίνη αποτελείται από 16 άτομα άνθρακα,

ενώ στις θέσεις C-2, C-6, C-11 και C-15 υπάρχουν διακλαδώσεις με μεθύλια. Η

κροκετίνη έχει cis ή trans διάταξη, ανάλογα με την αναστροφή του μορίου στη θέση

C-8. Η εστεροποίησή της γίνεται με μονάδες β-D-γλυκόζης και β-D-γεντιοβιόζης.

Εικόνα 34: Κύρια συστατικά του saffron (κροκίνη, πικροκροκίνη, σαφρανάλη).

Page 74: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

74

Οι κροκίνες είναι ασυνήθιστα υδατοδιαλυτά καροτενοειδή, ενώ αποτελούν τις

σημαντικότερες χρωστικές των στύλων (4-6%) με το μεγαλύτερο ποσοστό να

αναλογεί στο διγεντιοβιοζυλεστέρα της κροκετίνης (κροκίνη-4) (Abdullaev et al.,

2002).

Οι γλυκοζίτες των καροτενοειδών του saffron είναι γενικώς ασταθή στη θέρμανση,

ενώ τα άγλυκα μέρη είναι φωτοευαίσθητα (Tarantilis et al., 1995; Lozano et al.,

1999).

Άλλα καροτενοειδή που πιθανώς υπάρχουν σε μικρό ποσοστό είναι τα α-, β- και γ-

καροτένιο, η ζεαξανθίνη και το λυκοπένιο. Επίσης, πιθανώς να υπάρχουν και ίχνη

φλαβονοειδών, όπως η καιμπφερόλη (kaempferol) και η κερσετίνη (quercetin) (Kubo

and Kinst-Hori, 1999).

Σημαντικές ουσίες είναι επίσης η σαφρανάλη (μονοτερπενική αλδεΰδη) και η

πικροκροκίνη, η οποία προέρχεται από τη γλυκοζυλίωση της σαφρανάλης. Η

πικροκροκίνη (Εικόνα 34) είναι υπεύθυνη για την πικάντικη και ιδιαίτερη γεύση των

στύλων. Είναι άχρωμος γλυκοζίτης και συγκεκριμένα αποτελείται από μονάδα D-

γλυκόζης και το άγλυκο μόριο HTCC (2,2,6-τριμεθυλ-4-υδροξυ-1-καρβοξυ-αλδεϋδο-

1-κυκλοεξένιο ή όξινη μορφή της πικροκροκίνης).

Η σαφρανάλη είναι το κύριο συστατικό (70%) του αιθέριου ελαίου, το οποίο

προσδίδει το άρωμα στους στύλους. Η σαφρανάλη σχηματίζεται από την

πικροκροκίνη και το HTCC κατά τη διεργασία ξήρανσης (Εικόνα 35).

Στο αιθέριο έλαιο του Crocus sativus απαντάται επίσης η ιζοφορόνη, καθώς και

άλλα τερπενοειδή των οποίων παράγωγα αποτελούν και οι κροκοσατίνες (Chia-Ying

and Tian-Shung, 2002).

Page 75: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

75

Εικόνα 35: Υδρόλυση πικροκροκίνης.

Εικόνα 36: Κερσετίνη.

Εικόνα 37: Καιμπφερόλη.

Page 76: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

76

7.5 Μελέτες για βιολογική δράση των συστατικών του Crocus sativus

Αντιλιπιδαιμική δράση

Το εκχύλισμα του Crocus sativus σύμφωνα με έρευνες χαρακτηρίζεται από

αντιλιπιδαιμικές ιδιότητες. Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν σε κουνέλια, τα οποία

ακολουθούσαν πλούσια σε λίπη διατροφή, έδειξαν μείωση των επιπέδων της

χοληστερόλης ύστερα από ενδομυϊκή ένεση εκχυλίσματος στύλων του Crocus

sativus, ενώ παρατηρήθηκε και μείωση των επιπέδων της αθηρωματικής πλάκας στα

ίδια ζώα (Zheng et al., 2006). Επιπλέον έρευνες που πραγματοποιήθηκαν σε ομάδες

ατόμων, τα οποία κατανάλωναν λιπαρές τροφές, απέδειξαν ότι μετά από κατανάλωση

saffron τα άτομα αυτά εμφάνιζαν σημαντική μείωση των καρδιαγγειακών παθήσεων

και πρόληψη της αθηροσκλήρωσης (Wang et al., 1996; Giaccio, 2004).

Ο πιθανός μηχανισμός δράσης των συστατικών των στύλων είναι η ισχυρή

δέσμευσή τους με την αλβουμίνη στους ίδιους υποδοχείς που φυσιολογικά

προσδένονται οι εστέρες των λιπαρών οξέων. Η ανταγωνιστική αυτή δράση έχει

αποδοθεί στην κροκετίνη (Singh et al., 2004).

Δράση στο Κ.Ν.Σ.

Έρευνες απέδειξαν ότι οι κροκίνες έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την

απόπτωση των νευρώνων (PC-12 cells), επηρεάζοντας τη δράση του παράγοντα

νέκρωσης όγκου (tumor necrosis factor, TNF-α) (Soeda et al., 2001). Χορήγηση

εκχυλίσματος στύλων κρόκου στα πειραματόζωα συμβάλλει στην ομαλή λειτουργία

του ΚΝΣ, καθώς και στις διεργασίες μνήμης και μάθησης. Νεότερες έρευνες

απέδειξαν ότι η χορήγηση κροκίνης σε PC-12 νευρώνες αυξάνει τα επίπεδα του

γλουταθείου (GSH) και καταστέλλει το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του κεραμιδίου

(ceramide), το οποίο οδηγεί σε απόπτωση των νευρώνων (Ochiai et al., 2004).

Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε παρκινσονικό μοντέλο επίμυων (χρήση 6-

υδροξυ-ντοπαμίνης, 6-OHDA) στους οποίους χορηγήθηκε κροκίνη έδειξαν

σημαντική προστασία των νευρώνων της μέλαινας ουσίας και του ραβδωτού, σε

Page 77: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

77

σχέση με τα ζώα στα οποία δεν χορηγήθηκε κροκίνη και τα οποία παρουσίασαν

σημαντικό βαθμό εκφύλισης των κυττάρρων της μέλαινας ουσίας και του

ραβδωτού(Ahmad et al., 2005). Επίσης, οι επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε

κροκίνη διατήρησαν τα επίπεδα της ντοπαμίνης του εγκεφάλου κοντά στα

φυσιολογικά επίπεδα.

Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η κροκίνη είναι η πιο αποτελεσματική από τα 3

καροτενοειδή του Crocus sativus (δι-κροκίνη, τρι-κροκίνη και κροκίνη) στην

διατήρηση της φυσιολογικής μορφολογίας των νευρώνων PC-12, καθώς και στην

προστασία τους από το οξειδωτικό στρες (Ochiai et al., 2007).

Επιπλέον, έρευνες σε μύες αποκάλυψαν ότι το εκχύλισμα Crocus sativus οδηγεί σε

μείωση των προκαλούμενων από το οινόπνευμα βλαβών. Πιθανότατα στη δράση

αυτή εμπλέκονται οι κροκίνες, οι οποίες εμφανίζουν ανταγωνιστική δράση έναντι της

αιθανόλης (Abe & Saito, 2000).

Προηγούμενη in vitro μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας έχει δείξει ότι το

εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus εμφανίζει ανασταλτική δράση έναντι της

συσσωμάτωσης του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου. Η ανασταλτική αυτή δράση

αποδόθηκε κυρίως στην trans-κροκίνη-4 και κατά μικρότερο βαθμό στη διμέθυλο-

κροκετίνη (Papandreou et al., 2006).

Αντινεοπλασματική δράση

Αρκετές αναφορές υπάρχουν τόσο σε in vitro, όσο και σε in vivo πειράματα για την

αντινεοπλασματική δράση των συστατικών των στύλων του Crocus sativus και την

ικανότητά τους να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό διαφόρων καρκινικών

κυττάρων (Sharoni et al., 2004).

Τα καροτενοειδή, όπως προαναφέρθηκε αποτελούν ένα σημαντικό μέρος των

συστατικών του κρόκου. Εκχύλισμα κρόκου το οποίο εφαρμόστηκε σε διάφορες

κυτταρικές καρκινικές σειρές, όπως ΚΙΜ-1 (ηπατικό καρκίνωμα), MOLT-4B, HL60

και K562 (λευχαιμικές σειρές), S-180 (σάρκωμα), Α549 (καρκίνωμα του πνεύμονα),

Page 78: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

78

παρουσίασε δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική δράση. Επιπλέον, εκχύλισμα στύλων

διαφόρων taxa του γένους Crocus ενδημικών της Ελλάδας, το οποίο εφαρμόστηκε

στις καρκινικές κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA-MB-231 (καρκίνος του στήθους)

παρουσίασε δοσοεξαρτώμενη, οιστρογονο-ανεξάρτητη ανασταλτική δράση

(Chryssanthi et al., 2007).

Οι κροκίνες και οι διμεθυλοκροκετίνη, οι οποίες ανήκουν στα καροτενοειδή,

αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των παραπάνω

καρκινικών κυττάρων, τα οποία καταλήγουν στην απόπτωση (Palozza et al., 2004;

Abdullaev et al., 2003; Abdullaev, 2002). Αντίθετα, η κροκετίνη δεν παρουσιάζει την

ίδια ανασταλτική δράση (Escribano et al., 1996). Στην προαναφερθείσα μελέτη της

ερευνητικής μας ομάδας (Chryssanthi et al., 2007), η ανασταλτική δράση του κρόκου

αποδόθηκε στις κροκίνες, ανεξάρτητα από το βαθμό γλυκοζυλίωσής τους.

Αντιοξειδωτική δράση

Το οξειδωτικό στρες όπως προαναφέρθηκε αποτελεί μία από τις κύριες αιτίες

γήρανσης και ανάπτυξης διαφόρων ασθενειών, όπως οι νευροεκφυλιστικές, η

αθηροσκλήρωση καθώς και διάφορες νεοπλασματικές ασθένειες. Για αυτό το λόγο

υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον, στις μέρες μας για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες

διαφόρων φυτών, εκχυλισμάτων και διατροφικών συμπληρωμάτων.

Πρόσφατες in vitro μελέτες σε PC-12 νευρώνες έδειξαν ότι η αντιοξειδωτική δράση

της κροκίνης είναι παρόμοια με εκείνη της τρι-κροκίνης, της δι-κροκίνης και της α-

τοκοφερόλης. Αντίθετα, η πικροκροκίνη δεν παρουσιάζει ανάλογη αντιοξειδωτική

δράση. Συνεπώς, η κροκετίνη, κοινό συστατικό των 3 παραπάνω κροκινών παίζει ένα

ρόλο κλειδί στην αντιοξειδωτική δράση των κροκινών, σε αντίθεση με τη

μονοτερπενική δομή της πικροκροκίνης, η οποία δεν παρουσιάζει κάποια

δραστικότητα. Η σημαντική διαφορά στη δομή μεταξύ των 3 κροκινών εντοπίζεται

στα σάκχαρα (Ochiai et al., 2007).

Page 79: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

79

Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργεια ηπατοκυττάρων επίμυων, η

προστασία των κυττάρων αυτών από οξειδωτική καταστροφή αποδόθηκε στην

αντιοξειδωτική δράση της κροκετίνης (Giaccio, 2004). Επιπλέον, μελέτη σε επίμυες

με εγκεφαλική ισχαιμία στους οποίους χορηγήθηκε σαφρανάλη από στύλους του

Crocus sativus αποδεικνύει ότι η σαφρανάλη εμφανίζει προστατευτική δράση έναντι

του οξειδωτικού στρες στον ιππόκαμπο των πειραματόζωων (Hosseinzadeh et al.,

2005).

Πρόσφατες μελέτες, αναφορικά με τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες των στύλων του

Crocus sativus, αναφέρουν ότι το εκχύλισμα των στύλων σε μεθανόλη εμφανίζει

υψηλή αντιοξειδωτική δράση σε συγκεντρώσεις πάνω από 2000ppm. Συγκεκριμένα,

η κροκίνη έδειξε υψηλή ικανότητα σάρωσης των ελευθέρων ριζών (DPPH radical

scavenging activity), ενώ η σαφρανάλη έδειξε επίσης υψηλή αντιοξειδωτική δράση,

αλλά χαμηλότερη αυτής της κροκίνης (Assimopoulou et al., 2005).

Μελέτη σε άτομα που κατανάλωναν δύο φορές ημερησίως 50mg saffron διαλυμένα

σε 100ml γάλακτος έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων της οξείδωσης των

λιποπρωτεϊνών μετά από 3 και 6 εβδομάδες χορήγησης (Verma & Bordia, 1998).

Επιπλέον, σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας μελετήθηκαν in vitro οι

αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus σε σύγκριση

με εκχυλίσματα τομάτας και καρότου. Όπως αποδεικνύει η μελέτη αυτή, το

εκχύλισμα των στύλων του C.sativus έχει υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα και

μάλιστα υψηλότερη από αυτή της τομάτας και του καρότου (Papandreou et al.,

2006).

Page 80: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

80

ΙΙ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

Το οξειδωτικό στρες, όπως προαναφέρθηκε, αποτελεί μία από τις κύριες αιτίες

γήρανσης και ανάπτυξης διαφόρων ασθενειών, όπως οι νευροεκφυλιστικές, η

αθηροσκλήρωση, ο καταρράκτης, καθώς και διάφορες νεοπλασματικές ασθένειες.

Για αυτό το λόγο υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον, στις μέρες μας για τις

αντιοξειδωτικές ιδιότητες διαφόρων φυτών, εκχυλισμάτων και διατροφικών

συμπληρωμάτων.

Ένα φυτικό είδος που απαντάται στην ελληνική χλωρίδα και είναι γνωστό για τις

αντιοξειδωτικές του ιδιότητες, το οποίο λόγω των συστατικών του έχει ιδιαίτερο

φαρμακολογικό και διατροφικό ενδιαφέρον, είναι το Crocus sativus. Καλλιεργείται

στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τις αρτυματικές και χρωστικές ιδιότητες των

στύλων του. Οι στύλοι αποτελούν τη δρόγη του φυτού με αρκετά σημαντικές

φαρμακευτικές ιδιότητες, όπως είχε ήδη παρατηρηθεί από την αρχαιότητα. Ο κρόκος

σε γενικές γραμμές είναι αντισπασμωδικό, καταπραΰνει τους πόνους των νεφρών,

διεγείρει την όρεξη, διευκολύνει την πέψη, περιορίζει τις γαστραλγίες και τους

νευρικούς κολικούς. Χρησιμοποιείται ως καταπραϋντικό και τονωτικό για τη

θεραπεία της ακμής, των φλεγμονών, των παθήσεων του στήθους, του βήχα, της

αϋπνίας και του άσθματος. Θεωρείται φάρμακο κατά των οδυνηρών δυσμηνορροιών

με ευεργετικά αποτελέσματα στην τεκνοποιία. Στην κινεζική ιατρική

χρησιμοποιούνταν για τις αντισηπτικές και αναλγητικές τους ιδιότητες (Abdullaev,

2003; Ma et al., 2001).

Το μοντέλο του επαγόμενου μέσω του σεληνιώδους νατρίου καταρράκτη αποτελεί

ένα από τα γνωστότερα in vivo μοντέλα για τη μελέτη του καταρράκτη, το οποίο

παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες με τον γεροντικό καταρράκτη στον άνθρωπο. Το

σεληνιώδες νάτριο φαίνεται να εκδηλώνει τη δράση του μέσω της επαγωγής

οξειδωτικού στρες στο φακό. Διάφορα φυτικά εκχυλίσματα έχουν μελετηθεί σχετικά

με την επίδρασή τους στο φακό νεογνών επίμυων που εμφανίζουν καταρράκτη. Είναι

η πρώτη φορά που μελετάται η επίδραση του, γνωστού για τις αντιοξειδωτικές

ιδιότητές του, εκχυλίσματος του Crocus sativus στον καταρράκτη και στις βιοχημικές

παραμέτρους του οφθαλμού.

Page 81: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

81

Επιπλέον, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του

επαγόμενου από το σεληνιώδες νάτριο οξειδωτικού στρες και των επιπτώσεων αυτού

σε εγκεφαλικές περιοχές των πειραματόζωων, καθώς και η επίδραση του

εκχυλίσματος του Crocus sativus στις περιοχές αυτές. Η αντιοξειδωτική δράση των

συστατικών των στύλων του C.sativus σε εγκεφαλικές περιοχές πειραματόζωων έχει

προσδιορισθεί και σε προηγούμενες μελέτες της εργαστηριακής μας ομάδας, είναι

όμως η πρώτη φορά που μελετάται η επίδραση αυτή σε συνδυασμό με τις επιπτώσεις

του οξειδωτικού στρες στον εγκέφαλο.

Με βάση τα ανωτέρο, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η

επίδραση αρχικά του σεληνιώδους νατρίου και κατόπιν του εκχυλίσματος των

στύλων του Crocus sativus στον καταρράκτη, καθώς και σε βιοχημικές παραμέτρους

του φακού, του ήπατος και διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών νεογνών επίμυων.

Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα και η συγκέντρωση του

περιεχόμενου ασκορβικού οξέος του φακού, του ήπατος, του εγκεφαλικού φλοιού και

της παρεγκεφαλίδας, ενώ μελετήθηκε και η υπεροξείδωση λιπιδίων των παραπάνω

περιοχών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε και συγκριτική μελέτη των εγκεφαλικών

περιοχών των επίμυων-μαρτύρων ως προς την αντιοξειδωτική τους ισχύ και την

απόκρισή τους στο οξειδωτικό στρες.

Page 82: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

82

ΙΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΙΙΙ.1 Φυτικό Υλικό

Χρησιμοποιήθηκαν αποξηραμένοι στύλοι του Crocus sativus (saffron) προσφορά

του Αναγκαστικού Συνεταιρισμού Κροκοπαραγωγών Κοζάνης. Έτος συγκομιδής

2005.

ΙΙΙ.2 Εκχύλιση Crocus sativus

Αποξηραμένοι στύλοι Crocus sativus υπεβλήθησαν σε εκχύλιση με διαλύτη

μεθανόλη/νερό 50/50 v/v (4mL ανά 60mg δρόγης) για 4h υπό ανάδευση και απουσία

φωτός, σε θερμοκρασία δωματίου. Οι συνθήκες αυτές (απουσία φωτός, χαμηλές

θερμοκρασίες) επιλέχθηκαν επειδή τα καροτενοειδή -κύρια συστατικά των στύλων

του Crocus sativus- είναι ιδιαίτερα φωτοευαίσθητα και θερμοευαίσθητα.

Στη συνέχεια το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus υπέστη ξήρανση υπό

κενό για 4h σε θερμοκρασία μικρότερη των 40οC. Πριν τη χορήγηση του στα

πειραματόζωα το εκχύλισμα διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό (διάλυμα NaCl 0,9%,

w/v) και αποστειρώθηκε μετά από διήθηση σε ειδικά φίλτρα με μεμβράνη διαμέτρου

πόρων 0,2μm (Whatman).

Page 83: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

83

ΙΙΙ.3 Πειραματόζωα

Τα πειραματόζωά που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν νεογνά επίμυων

(Wistar rats) (Εικόνα 38). Τα νεογνά ζούσαν σε κλουβιά μαζί με τους γονείς τους

στους οποίους παρέχονταν τροφή και νερό σε αφθονία και υπό κανονικές συνθήκες

θερμοκρασίας και υγρασίας. Τα νεογνά χωρίστηκαν σε 3 ομάδες:

α) ομάδα Ι: μάρτυρες (n=9), στην οποία χορηγείται διάλυμα NaCl 0,9% w/v,

β) ομάδα ΙΙ: ομάδα στην οποία χορηγείται το σεληνιώδες νάτριο (sodium selenite)

(n=7) και

γ) ομάδα ΙΙΙ: ομάδα στην οποία χορηγείται το εκχύλισμα του κρόκου και το

σεληνιώδες νάτριο (n=7).

Εικόνα 38: Νεογνό επίμυος.

Σε επίμυες 9 ημερών χορηγήθηκε με υποδόρια ένεση (Εικόνα 39) σεληνιώδες

νάτριο σε συγκέντρωση 20 και 25 μmol/kg σωματικού βάρους (Na2SeO3, 44-46%

από την εταιρία ACROS Organics) (Gupta et al., 2003; 2005). Οι ενέσεις που έγιναν

στους επίμυες ήταν όγκου 20μL. Παρά το γεγονός ότι σε πολλές πρόσφατες εργασίες

χρησιμοποιείται η δόση των 25 μmol/kg σωματικού βάρους για πρόκληση

καταρράκτη, στα πειράματά μας η δόση των 25 μmol/kg σωματικού βάρους

αποδείχθηκε θανατηφόρος (σε 4 πειραματόζωα). Η παρατήρησή μας συμφωνεί με

προηγούμενες μελέτες (Ostadalova et al., 1977). Τα πειράματα συνεχίστηκαν με τη

δόση των 20 μmol/kg σωματικού βάρους.

Page 84: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

84

Εικόνα 39: Υποδόρια ένεση σε επίμυ.

Την 10η και 11η ημέρα χορηγήθηκε το εκχύλισμα του κρόκου με ενδοπεριτοναϊκή

ένεση (Εικόνα 40) σε συγκέντρωση 60mg/kg σωματικού βάρους. Οι ενέσεις που

έγιναν στους επίμυες ήταν όγκου 20μL.

Εικόνα 40: Eνδοπεριτοναϊκή ένεση σε επίμυ.

Την 16η ημέρα, όταν οι νεογέννητοι επίμυες άνοιξαν τα μάτια τους,

πραγματοποιήθηκε οφθαλμική εξέταση για την ύπαρξη καταρράκτη (Εικόνα 41).

Page 85: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

85

Εικόνα 41: Οφθαλμός επίμυος με καταρράκτη.

Την 20η ημέρα οι επίμυες αναισθητοποιήθηκαν με διαιθυλαιθέρα και στη

συνέχεια θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό. Μετά τη θυσία απομονωθήκαν οι υπό

μελέτη ιστοί (φακός, μεσεγκέφαλος, εγκεφαλικός φλοιός, παρεγκεφαλίδα, ήπαρ).

ΙΙΙ.4 Κατεργασία των δειγμάτων.

Μετά τη θυσία των ζώων οι φακοί διαχωρίστηκαν και απομονώθηκαν με posterior

approach. Η φύλαξή τους γίνεται στους -70ο C. Η ομογενοποίηση των φακών έγινε

σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS, 10mM Na2HPO4 , 150mM NaCl, pH 7.4)

με ομογενοποιητή glass- glass (Thomas USA BB287) (3 φακοί/1 mL ρυθμιστικού

διαλύματος). Μετά από φυγοκέντριση του ομογενοποιήματος σε 10000g για 10min

στους 4oC, το υπερκείμενο διατηρείται σε βαθιά κατάψυξη.

Ο μεσεγκέφαλος, ο εγκεφαλικός φλοιός, η παρεγκεφαλίδα και το ήπαρ

ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PBS. H ομογενοποίηση

πραγματοποιήθηκε σε ομογενοποιητή glass-teflon (Thomas USA BB287) (100mg

ιστού/1mL ρυθμιστικού διαλύματος) και ομογενοποίηση 30Χ. Ακολούθησε

φυγοκέντρηση σε 10000g για 15min (30min για το ήπαρ). Μετά το τέλος της

φυγοκέντρισης, το υπερκείμενο διατηρείται σε βαθιά κατάψυξη. Για την

πραγματοποίηση του προσδιορισμού των διαφόρων παραμέτρων πραγματοποιήθηκε

αραίωση του υπερκειμένου στα 12,5mg/mL (125μL υπερκειμένου σε 875μL

ρυθμιστικού διαλύματος).

Page 86: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

86

ΙΙΙ.5 Αναλυτικές μέθοδοι

ΙΙΙ.5.1. Μέθοδοι προσδιορισμού της αντιοξειδωτικής ικανότητας

Αρκετές μέθοδοι είναι γνωστές για τη μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής

ικανότητας βιολογικών δειγμάτων. Βασίζονται είτε στη δέσμευση ελευθέρων ριζών

είτε στην αναγωγή ιόντων (Perez et al., 2000). Για τον προσδιορισμό της ολικής

αντιοξειδωτικής ικανότητας των υπό μελέτη ιστών εφαρμόστηκε η μέθοδος

προσδιορισμού της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (FRAP). Επίσης,

εφαρμόστηκε η μέθοδος προσδιορισμού του ασκορβικού οξέος (FRASC).

α) Ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (Ferric Reducing Antioxidant

Power, μέθοδος FRAP).

Η μέθοδος FRAP αναπτύχθηκε αρχικά από τους Benzie και Strain, για τη μέτρηση

της αναγωγικής ικανότητας του πλάσματος, όμως αργότερα χρησιμοποιήθηκε και για

άλλα βιολογικά δείγματα (Prior et al., 2005).

Η μέθοδος μετράει την αλλαγή της απορρόφησης στα 490nm που οφείλεται στην

ικανότητα των αντιοξειδωτικών να ανάγουν την άχρωμη οξειδωμένη μορφή του

[Fe(TPTZ)2]3+ για το σχηματισμό του μπλε χρώματος συμπλόκου [Fe(TPTZ)2]2+

(Εικόνα 42) (Benzie & Strain, 1996).

Εικόνα 42: Αναγωγή της άχρωμης οξειδωμένης μορφής του [Fe(TPTZ)2]3+ από

αντιοξειδωτικά για το σχηματισμό του μπλε χρώματος συμπλόκου [Fe (TPTZ)2]2+

(Πηγή: J.Agric. Food Chem., 2005, 53, 1841-1856).

Page 87: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

87

Η αύξηση της απορρόφησης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης και της δομής των

προς ανάλυση ουσιών (Szeto et al., 2002; Choy et al., 2000). Η αντιοξειδωτική

ικανότητα των δειγμάτων εκφράζεται ως ισοδύναμη συγκέντρωση του FeSO4, η

οποία παράγει την ίδια απορρόφηση στα 490nm (Katalinic et al., 2005).

Εικόνα 43: Μικροπλάκα τύπου ELISA (96-well plate) για τη μελέτη της

αντιοξειδωτικής δράσης των δειγμάτων. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της

αντιοξειδωτικής ισχύος.

Τα υλικά και διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl3x6H2O) (Sigma- Aldrich)

• 2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη (TPTZ) ≥99% (Sigma- Aldrich)

• ένυδρος θειικός σίδηρος (FeSO4x7H2O) (Sigma- Aldrich)

• ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 300mM pH 3,6

Η μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 60 μL δείγματος τοποθετούνται σε

κελίο μικροπλάκας τύπου ELISA. Ακολούθως, στο κελίο προστίθενται 20 μL

ρυθμιστικού διαλύματος οξικών 300mM, pH 3.6 και 32μL ddH2O. Τα δείγματα

επωάζονται στους 37οC για 1h. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 88μL του

αντιδραστηρίου της FRAP στα δείγματα. Το αντιδραστήριο της FRAP

προετοιμάζεται με ανάμιξη 5mL ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 300mM, pH

3.6 με 0,5mL διαλύματος 10mM TPTZ (2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη) και 0,5mL

διαλύματος 20mM FeCl3x6H2Ο, απουσία φωτός, ώστε να σχηματιστεί το σύμπλοκο.

Η προσθήκη του αντιδραστηρίου της FRAP στα δείγματα οδήγησε σε αύξηση της

απορρόφησης στα 490nm.

Page 88: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

88

β) Μέθοδος προσδιορισμού του ασκορβικού οξέος (Ferric Reducing Ascorbic

Acid, μέθοδος FRASC).

Τα υλικά και διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl3x6H2O) (Sigma- Aldrich)

• 2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη (TPTZ) ≥99% (Sigma- Aldrich)

• ένυδρος θειικός σίδηρος (FeSO4x7H2O)

• ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 300mM

• ασκορβική οξειδάση (ascorbic oxidase from Curcubita species, A157-100

Units) (Sigma-Aldrich)

• L-ασκορβικό οξύ 99% (Sigma-Aldrich)

Αν στην προηγούμενη μέθοδο (FRAP) τα δείγματα επωαστούν με ασκορβική

οξειδάση πριν την προσθήκη του αντιδραστηρίου της FRAP, μπορεί να

προσδιοριστεί η συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος.

Λεπτομερέστερα, 60 μL δείγματος αναμειγνύονται με 20 μL 300mM ρυθμιστικού

διαλύματος οξικών, pH 3.6 και τοποθετούνται σε δύο διαφορετικά κελία στην

μικροπλάκα τύπου ELISA. Στο ένα κελίο προστίθενται 32 μL ασκορβικής οξειδάσης

(4 U/mL), ενώ στο άλλο 32 μL δις απεσταγμένου νερού (ddH2O). Όλα τα δείγματα

καθώς και τα πρότυπα του ασκορβικού οξέος τοποθετούνται στην μικροπλάκα εις

διπλούν. Μετά από την προσθήκη των διαλυμάτων και ανάμιξη όλα τα δείγματα, με

ασκορβική οξειδάση (+ao) και με ddH2O (-ao), επωάζονται για 1h στους 37ºC. Μετά

το τέλος της επώασης προστίθενται 88μL του αντιδραστηρίου της FRAP στα

δείγματα. Το αντιδραστήριο της FRAP προετοιμάζεται με ανάμιξη 5mL διαλύματος

TPTZ 10mM με 0,5mL διαλύματος FeCl3x6H2Ο και 0,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος

οξικών 300mM, pH 3.6. Η προσθήκη του αντιδραστηρίου της FRAP στα δείγματα

οδήγησε σε αύξηση της απορρόφησης στα 490nm (Lee et al., 1997; Choy et al.,

2000).

Page 89: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

89

ΙΙΙ.5.2. Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων

Ο πιο σημαντικός και καλύτερα μελετημένος δείκτης για τον έλεγχο της

υπεροξείδωσης των λιπιδίων θεωρείται η μηλονική διαλδεΰδη (MDA). Ο

προσδιορισμός της MDA πραγματοποιείται μέσω της αντίδρασής της με το

θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA).

Η αντίδραση της MDA με το TBA οδηγεί στο σχηματισμό του συμπλόκου MDA-

TBA2, το οποίο έχει χαρακτηριστικό έντονο ροζ χρώμα και παρουσιάζει ισχυρή

απορρόφηση στα 532nm (Εικόνα 44).

Εικόνα 44: Αντίδραση της MDA με το TBA (thiobarbituric acid) και σχηματισμός

του συμπλόκου MDA-TBA2, το οποίο παρουσιάζει ισχυρή απορρόφηση στα 532nm

και χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της MDA σε βιολογικά δείγματα.

(www.nwlifescience.com)

Τα υλικά και διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• 2,6-δι-τερτ-βουτυλ-4-μεθυλ-φαινόλη (BHT) 99% (Sigma-Aldrich)

• θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) 98% (ACROS Organics)

• μηλονική διαλδεΰδη 97% (ACROS Organics)

• Τριχλωροοξικό οξύ (TCA) (Panreac)

• διάλυμα 20% οξικού οξέος pH 3,5

• διάλυμα κορεσμένου NaCl

• SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο) 99,5% (Applichem)

Page 90: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

90

Για τον προσδιορισμό της περιεχόμενης στα δείγματά μας MDA ακολουθήθηκαν οι

παρακάτω πορείες:

α) Προσδιορισμός της MDA με χρήση φωτομέτρου

Μέθοδος Ι

Σε 200μL δείγματος προστίθενται 200 μL SDS 99,5%, 1,5mL διαλύματος οξικού

οξέος 20% pH 3,5 και 1,5mL διαλύματος TBA 0,81% (Ohkawa et al., 1979; Gupta et

al., 2005). Το μείγμα βράζει για 1h στους 90οC. Στη συνέχεια και αφού παγώσει σε

RT, ακολουθεί προσθήκη 5mL n-βουτανόλης, ανάδευση, φυγοκέντριση, μεταφορά

της πάνω φάσης (οργανική) σε κυψελίδες φωτομέτρου και ακολουθεί φωτομέτρηση

στα 550nm.

Στην ποσότητα δείγματος που απομένει κάνουμε επανεκχύλιση με 0,4mL n-

βουτανόλης, ενώ προστίθενται και 40μL διαλύματος κορεσμένου NaCl, το οποίο

βοηθά στον καλύτερο διαχωρισμό των δύο φάσεων (οργανικής-ανόργανης) (Jentzsch

et al., 1996). Ακολουθεί φυγοκέντριση, μεταφορά 200μL της πάνω φάσης σε

μικροπλάκα τύπου ELISA (96-well plate) και φωτομέτρηση στα 550nm.

Μέθοδος ΙΙ

Στη συνέχεια και λόγω των πολύ χαμηλών απορροφήσεων, οι οποίες δεν

συμφωνούσαν με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, τροποποιήσαμε την παραπάνω

μέθοδο.

Σε 100μL δείγματος προστίθενται 200μL διαλύματος TCA 10% για την

κατακρίμνηση των πρωτεϊνών και τα δείγματα τοποθετούνται στον πάγο για 15min.

Ακολουθεί φυγοκέντριση των δειγμάτων (10000g, 10min), μεταφορά του

υπερκειμένου σε νέο σωλήνα και προσθήκη ίσης ποσότητας διαλύματος 0,8% TBA.

Μετά το βρασμό των δειγμάτων σε υδατόλουτρο για 1h στους 90οC προστίθενται

0,5mL n-βουτανόλης και σε 50μL διαλύματος κορεσμένου NaCl, το οποίο βοηθά

στον καλύτερο διαχωρισμό των δύο φάσεων (οργανικής-ανόργανης). Τέλος,

Page 91: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

91

μεταφέρεται η πάνω φάση (οργανική) σε μικροπλάκα τύπου ELISA (96-well plate)

και ακολουθεί φωτομέτρηση στα 550nm.

Μέθοδος ΙΙΙ

Επειδή και μετά τις παραπάνω τροποποιήσεις τα αποτελέσματα συνέχιζαν να μην

είναι ικανοποιητικά αναζητήσαμε μία νέα μέθοδο προσδιορισμού της MDA. Η

πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: σε 200μL δείγματος προστίθενται 25μL

διαλύματος BHT 90mM σε αιθανόλη 95% και 200μL διαλύματος 0,2M H3PO4. Μετά

από ανάδευση προστίθενται 300μL διαλύματος TBA 0,81% και τα δείγματα βράζουν

για 45min στους 90oC σε υδατόλουτρο. Το pH μετά την προσθήκη του ΤΒΑ πρέπει

να βρίσκεται στην περιοχή μεταξύ 2,5 και 4,5 (Badcock et al., 1997). Μετά το τέλος

του βρασμού τα δείγματα τοποθετούνται για 15min στον πάγο, για να τερματιστεί η

αντίδραση με το TBA, και ακολούθως για 15min σε θερμοκρασία δωματίου. Στη

συνέχεια προστίθενται 0,5mL n-βουτανόλης (για την εκχύλιση) και 50μL διαλύματος

κορεσμένου NaCl, το οποίο βοηθά στον καλύτερο διαχωρισμό των δύο φάσεων

(οργανικής-ανόργανης). Ακολουθεί φυγοκέντριση στα 10000g για 2min. Τέλος,

μεταφέρονται 100μL υπερκειμένου (οργανικής φάσης) σε μικροπλάκα τύπου Elisa

και ακολουθεί φωτομέτρηση στα 550nm (Jentzsch et al., 1996).

Μέθοδος ΙV

Νέες τροποποιήσεις πραγματοποιήθηκαν και στη μέθοδο Jentzsch (μέθοδος ΙΙΙ):

αύξηση του χρόνου βρασμού σε 90min στους 90οC, προσθήκη της ποσότητας της n-

βουτανόλης σε 2 δόσεις και επανεκχύλιση, μετά την προσθήκη και των δύο δόσεων

n-βουτανόλης, με 50μL διαλύματος NaOH 4N (Badcock et al., 1997).

Ύστερα από αρκετές επαναλήψεις και τροποποιήσεις, και ενώ η μέθοδος

προσδιορισμού της MDA με τη χρήση φωτομέτρου έδινε πολύ χαμηλές

απορροφήσεις (έλλειψη ευαισθησίας) και δεν παρουσίαζε ικανοποιητική

επαναληψιμότητα, αποφασίστηκε η μέθοδος να πραγματοποιηθεί με τη χρήση

φθορισμομέτρου.

Page 92: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

92

β) Προσδιορισμός της MDA με χρήση φθορισμομέτρου

Σε 0,25mL δείγματος (ομογενοποιήματος) προστίθενται με 25μL διαλύματος BHT

(2,6-δι-τερτ-βουτυλ-4-μεθυλ-φαινόλη) 90mM σε αιθανόλη (95%) και 12.5μL

διαλύματος 10N NaOH, για την πραγματοποίηση της αντίδρασης σε αλκαλικές

συνθήκες (Agarwall et al., 2002; Carbonneau et al., 1991). Τα δείγματα

τοποθετούνται για 30min σε υδατόλουτρο (60οC) υπό ανάδευση (Carbonneau et al.,

1991). Στη συνέχεια προστίθενται 0,75mL διαλύματος TCA 10%, για την

κατακρίμνηση των πρωτεϊνών. Ακολουθεί ανάδευση και τοποθέτηση των δειγμάτων

για 10 min σε πάγο. Ύστερα από φυγοκέντριση (για 10 min σε 10000g) προστίθενται

στο υπερκείμενο (περίπου 0,9mL) 0,5mL υδατικού διαλύματος TBA 0,8%. Το pH

μετά την προσθήκη του ΤΒΑ πρέπει να βρίσκεται στην περιοχή μεταξύ 2,5 και 4,5

(Badcock et al., 1997). Ακολουθεί επώαση των δειγμάτων σε υδατόλουτρο για 90min

στους 95οC (Lykkesfeldt J., 2001).

Μετά το τέλος του βρασμού προστίθεται 1mL n-βουτανόλης στα δείγματα,

ακολουθεί ανάδευση, η πάνω φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα και προστίθεται n-

βουτανόλη έως τον όγκο των 2mL. Στη συνέχεια το μείγμα μεταφέρεται σε κυψελίδα

φθορισμομέτρου (Jentzsch et al., 1996). Ακολουθεί μέτρηση του φθορισμού σε μήκη

κύματος 553nm (εκπομπή) και 515nm (διέγερση), excitation slit 15 και emission slit

10, σε φθορισμόμετρο (Perkin- Elmer LS 55 Fluorescence Spectrometer)

(Lykkesfeldt, 2001; Badcock et al., 1997; Agarwall et al., 2002).

Page 93: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

93

ΙΙΙ.5.3. Μέθοδος προσδιορισμού των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών

Ο προσδιορισμός των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω

του αντιδραστηρίου DNPH (Εικόνα 45).

Εικόνα 45: Δομή του DNPH.

Το αντιδραστήριο DNPH αντιδρά με τις καρβονυλομάδες των πρωτεϊνών και

σχηματίζει την 2,4- δινιτρο-φαινυλ-υδραζόνη (DNP) (Εικόνα 46) (Dalle-Donne et al.,

2003).

Εικόνα 46: Ο μηχανισμός της αντίδρασης μεταξύ του DNPH και μίας αλδεΰδης ή

κετόνης. (en.wikipedia.org)

Page 94: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

94

Τα υλικά και διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• DNPH (2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη) 30% υγρασία (ACROS Organics)

• Τριχλωροοξικό οξύ (TCA) (Panreac)

• διάλυμα αιθανόλης/οξικού αιθυλεστέρα 50/50 v/v

• γουανιδίνης (guanidine carbonate, CH5N3.0,5H2CO3) 99% (ACROS

Organics)

• NaBH4

• EDTA

• Fe(NH4)2(SO4)2

• BSA (αλβουμίνη ορού βοοειδούς) 98% (Fluka)

• L-ασκορβικό οξύ 99% (Sigma-Aldrich)

Η πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής:

Μέθοδος Ι

Μεταφέρονται 200μL από κάθε δείγμα (ομογενοποιήμα) σε δύο eppendorf. Ο ένας

σωλήνας αποτελεί τον πειραματικό σωλήνα (S) και ο άλλος το μάρτυρα (C). Στον

σωλήνα S προστίθενται 800μL 10mΜ DNPH (2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη) σε HCl

2Μ, ενώ στο σωλήνα μάρτυρα προστίθενται 800μL διαλύματος HCl 2M.

Τα δείγματα επωάζονται για 1h στο σκοτάδι σε RT, ενώ αναδεύονται κάθε 15min.

Μετά το τέλος της επώασης προστίθεται 1mL διαλύματος TCA 10% για την

κατακρήμνιση των πρωτεϊνών και τα δείγματα τοποθετούνται για 15min στον πάγο.

Ακολουθεί φυγοκέντριση (10000g, 10min). Απορρίπτεται το υπερκείμενο και

ακολουθεί έκπλυση του ιζήματος σε 1mL TCA 10%. Τα δείγματα τοποθετούνται για

15min στον πάγο και ακολουθεί φυγοκέντριση (10000g, 10min). Απορρίπτεται το

υπερκείμενο και οι πρωτεΐνες που βρίσκονται στο ίζημα πλένονται 3 φορές με

διάλυμα αιθανόλης/οξικού αιθυλεστέρα 50/50 v/v. Τα ιζήματα, μετά την πλύση,

διαλύονται σε 500μL διαλύματος 6Μ γουανιδίνης σε 2Μ HCl, ολονύχτια. Τα μη

διαλυμένα κλάσματα απομακρύνονται με φυγοκέντριση. Μεταφορά 220μL

υπερκειμένου σε μικροπλάκα τύπου ELISA (96-well plate) ή σε κυψελίδες

Page 95: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

95

φωτομέτρου και φωτομέτρηση στα 370nm και στα 280nm (Levine et al., 1990;

Reznick et al., 1992; Zusterzeel et al., 2000).

Μέθοδος ΙΙ

Η πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η πορεία της μεθόδου Ι με τις εξής

τροποποιήσεις: προσθήκη 300μL δείγματος και 700μL 12mΜ DNPH σε 2,5Μ HCl,

επώαση των δειγμάτων για 1h στο σκοτάδι στους 37oC, θερμοκρασία διαλύματος

αιθανόλης/οξικού αιθυλεστέρα στους 4oC.

Page 96: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

96

ΙΙΙ.5.4. Μέθοδος προσδιορισμού του γλουταθείου (glutathione)

Για τον προσδιορισμό του γλουταθείου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος που προτάθηκε

από τον Ellman. Το DTNB (5,5΄-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)), γνωστό και ως

αντιδραστήριο Ellman’s (Εικόνα 47), αντιδρά με χαμηλού μοριακού βάρους θειόλες,

όπως το γλουταθείο, και χρησιμοποιείται για την ανίχνευσή τους σε βιολογικά

δείγματα. Το DTNB αντιδρά με τη σουλφυδρυλική ομάδα του GSH (ανηγμένη

μορφή γλουταθείου) και σχηματίζεται το 5-θειο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ (ΤΝΒ) το οποίο

έχει χαρακτηριστικό κίτρινο χρώμα και προσδιορίζεται φωτομετρικά στα 412nm

(Ellman, 1959) (Εικόνα 48).

Εικόνα 47: Δομή του DTNB.

Εικόνα 48: Αντίδραση του DTNB με θειόλη και σχηματισμός του TNB.

Page 97: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

97

Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• Τριχλωροοξικό οξύ (TCA) (Panreac)

• Ανηγμένο γλουταθείο (GSH) 99%(Sigma- Aldrich)

• Τριαιθανολαμίνη (TEAM) 98% (Sigma- Aldrich)

• DTNB ή αντιδραστήριο Ellman (5,5΄- Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)

(Sigma- Aldrich)

Η πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: σε 150μL δείγματος προστίθενται 50μL

διαλύματος TCA 20% (για την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών). Τα δείγματα

ανακινούνται και τοποθετούνται για 10min στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντριση

(15min, 10000g). Στη συνέχεια, προστίθενται στο υπερκείμενο (100μL) 22,5μL

υδατικού διαλύματος τριαιθανολαμίνης (TEAM, 5,31mL TEAM σε 4,69mL ddH2O),

ώστε να ρυθμιστεί το pH του διαλύματος στην τιμή 8. Τέλος, προστίθενται 100μL

DTNB. Για την παρασκευή του διαλύματος DTNB διαλύουμε 4mg DTNB σε 10mL

ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (Na2HPO4) 0,6Μ και ακολούθως κάνουμε νέα

αραίωση στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα σε αναλογία 1:4 v/v. Ακολουθεί φωτομέτρηση

των δειγμάτων στα 412nm.

Page 98: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

98

ΙΙΙ.5.5. Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης

των δειγμάτων.

Η μέθοδος Bradford χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της

περιεχόμενης πρωτεΐνης σε βιολογικά δείγματα. Το αντιδραστήριο Bradford

αποτελείται από τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250 σε φωσφορικό οξύ και

μεθανόλη. Η μέθοδος στηρίζεται στον σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ της χρωστικής

Brilliant Coomassie Blue G και των πρωτεϊνών του δείγματος (Εικόνα 49) (Bradford,

1976).

Η πρόσδεση της πρωτεΐνης στη χρωστική προκαλεί αύξηση της απορρόφησης της

χρωστικής από τα 465 στα 595nm. Η αύξηση της απορρόφησης είναι ανάλογη με την

περιεχόμενη στο δείγμα πρωτεΐνη.

Εικόνα 49: Δομή της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G.

Page 99: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

99

Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• αντιδραστήριο Bradford (Sigma- Aldrich)

• BSA (αλβουμίνη ορού βοοειδούς) 98% (Fluka)

Σε μικροπλάκα τύπου ELISA (96-well plate) προστίθενται 10 μL δείγματος και 110

μL αντιδραστηρίου Bradford (το οποίο πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία

δωματίου) και ακολουθεί ανάμιξη για περίπου 30sec. Ακολουθεί επώαση των

δειγμάτων για 45 min σε θερμοκρασία δωματίου και τέλος μέτρηση της

απορρόφησης σε φωτόμετρο στα 595 nm.

Page 100: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

100

ΙΙΙ.5.6. Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE).

Η τεχνική SDS-PAGE χρησιμοποιείται ευρέως για το διαχωρισμό πρωτεϊνών

σύμφωνα με το μοριακό τους βάρος (πρωτοταγή δομή ή αριθμό αμινοξέων). Το SDS

(δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο) είναι ένα ανιονικό απορρυπαντικό, το οποίο προσδένεται

στις πρωτεΐνες του δείγματος αποδιατάσσοντας τη δευτεροταγή και τριτοταγή δομή

τους και προσδίδοντάς τους αρνητικό φορτίο.

Τα υλικά και τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

• 30% ακρυλαμίδιο

• 10% APS (υπερθειϊκό αμμώνιο)

• TEMED (N,N,N’,N’-τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη)

• Ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού pH 8,8 4Χ (separating buffer)

• Ρυθμιστικό διάλυμα πακεταρίσματος pH 8,8 4Χ (stacking buffer)

• Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (sample buffer)

• Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 10Χ (running buffer)

• Διάλυμα για πλύσεις των πηκτωμάτων

• Διάλυμα για βαφή των πηκτωμάτων (stain)

• Διάλυμα για αποχρωματισμό των πηκτωμάτων (destain)

• Διάλυμα οξικού οξέος 7%

• SDS (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο) 99,5% (Applichem)

Οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες από το ομογενοποίημα των φακών των

πειραματοζώων αναλύθηκαν σε 10% πήκτωμα πολυακριλαμιδίου (SDS-PAGE). Η

ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων γίνεται ως εξής:

α) αρχικά συναρμολογείται η συσκευή του πηκτώματος (πλακάκια) και

παρασκευάζεται το πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel). H ηλεκτροφόρηση

γίνεται σε πήκτωμα διαχωρισμού με περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου 10%. Οι

ποσότητες φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί:

Page 101: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

101

10% πήκτωμα

ddH2O 3,15mL

30% ακρυλαμίδιο 2,5mL

Ρυθμιστικό δ/μα

διαχωρισμού pH

8,8

1,875mL

10% APS 75μL

TEMED 7,5μL

β) αμέσως μετά την προσθήκη του πηκτώματος στη συσκευή ακολουθεί προσθήκη 1-

2mL βουτανόλης. Η υπερκείμενη βουτανόλη εξασφαλίζει τη συμπαγή δομή του

πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. Απομακρύνεται μετά τον

πολυμερισμό του πηκτώματος (σε περίπου 30min) και πριν την προσθήκη του

πηκτώματος πακεταρίσματος των πρωτεϊνών.

γ) παρασκευάζεται το πήκτωμα πακεταρίσματος (stacking gel). Οι ποσότητες

φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί:

πήκτωμα πακεταρίσματος

ddH2O 4,2mL

30% ακρυλαμίδιο 0,65mL

Ρυθμιστικό δ/μα

πακεταρίσματος

pH 8,8 (stacking

buffer)

1,6mL

10% APS 67μL

TEMED 6,7μL

Μετά την προσθήκη του πηκτώματος πακεταρίσματος προσαρμόζεται στη συσκευή

ένα πλαστικό εξάρτημα (χτενάκι) που χρησιμεύει ως καλούπι για το σχηματισμό των

θέσεων (κελία) στις οποίες θα τοποθετηθούν τα δείγματα. Το πήκτωμα αφήνεται να

πήξει για περίπου 30min.

Page 102: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

102

δ) Μετά την πήξη του πηκτώματος πακεταρίσματος, αφαιρείται το πλαστικό

εξάρτημα και προσαρμόζεται η συσκευή που περιέχει το πήκτωμα στη συσκευή

ηλεκτροφόρησης. Μεταφέρεται ίση ποσότητα κάθε δείγματος (10μL, 5μL δείγματος

και 5μL sample buffer) στα κελία (πηγαδάκια), τα οποία έχουν σχηματιστεί στο

πήκτωμα πακεταρίσματος. Πρωτεΐνες γνωστού μοριακού βάρους (MW 14-200kDa)

χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες στην ίδια συγκέντρωση των 10μL. Πριν τη μεταφορά

τους στα κελία του πηκτώματος πακεταρίσματος τα δείγματα βράζουν για 2min σε

υδατόλουτρο για την αποδιάταξη των πρωτεϊνών και ακολουθεί φυγοκέντρηση των

δειγμάτων για 2min.

ε) ακολούθως, εφαρμόζεται σταθερή τάση 100V και ρεύμα έντασης 12 mA, με

αποτέλεσμα τη μετακίνηση των πρωτεϊνών των δειγμάτων από τον αρνητικό προς το

θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανεύει κάθε πρωτεΐνη είναι

αντιστρόφως ανάλογη του μοριακού της βάρους. Το πήκτωμα τρέχει για περίπου 1h.

στ) το πήκτωμα μεταφέρεται σε ειδικό δοχείο, όπου βάφεται με τη χρωστική

Coomassie Brilliant Blue για 30min. Ακολούθως, αποχρωματίζεται με τη χρήση

διαλύματος οξικού οξέος 10% και μεθανόλης 30% για 20min (Gupta S.K. et al.,

2005; Kyselova Z. et al, 2005).

ζ) τέλος, ακολουθεί επεξεργασία (σάρωση) του πηκτώματος σε ηλεκτρονικό

υπολογιστή για τη δημιουργία της τελικής εικόνας του.

Page 103: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

103

IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

IV.1 Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων

IV.1.1. Ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (Ferric Reducing Antioxidant

Power, μέθοδος FRAP).

Στη μέθοδο FRAP ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα FeSO4x7H2O

γνωστής συγκέντρωσης (10 έως 600 μΜ). Η μέτρηση της απορρόφησης στα 490nm

για διαφορετικές συγκεντρώσεις FeSO4x7H2O έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει

καλή γραμμικότητα (R2=0,9926) στην περιοχή 10-600 μΜ FeSO4 x7H2O (Γράφημα

1).

y = 0,001x + 0,0027R2 = 0,9926

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200 300 400 500 600 700

FeSO4x7H2O (μΜ)

Απορ

ρόφησ

η(49

0nm

)

Γράφημα 1: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού αντιοξειδωτικής δράσης δειγμάτων

με τη μέθοδο FRAP. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων FeSO4.

Page 104: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

104

Η αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων εκφράστηκε ως η ισοδύναμη

συγκέντρωση FeSO4x7H2O σε μmol/ g ιστού που δίνει την ίδια απορρόφηση στα

490nm και υπολογίστηκε με παρεμβολή των τιμών της απορρόφησης των δειγμάτων

στην πρότυπη καμπύλη.

Πίνακας 1: Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ιστών των

μαρτύρων.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του

φακού). Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή±τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές

αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων που αναλύθηκαν εις τριπλούν.

* p=0.0079 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ φλοιού-μεσεγκεφάλου

(Mann-Whitney test).

Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική

ικανότητα ολικού ομογενοποιήματος εγκεφάλου ενηλίκων μυών με τη μέθοδο FRAP,

καθώς και η αντιοξειδωτική ικανότητα επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών με την ίδια

μέθοδο (Papandreou et al., 2008; Linardaki et al., 2008). Στις μελέτες αυτές η τιμή

που δίνεται για ολικό ομογενοποίημα εγκεφάλου είναι 8,637±1,059 μmol FeSO4/ g

ιστού, για την περιοχή του εγκεφαλικού φλοιού 6,05±0,27 nmol FeSO4/ mg ιστού,

για την παρεγκεφαλίδα 3,40±0,27 nmol FeSO4/ mg ιστού και για το μεσεγκέφαλο

2,19±0,20 nmol FeSO4/ mg ιστού. Επομένως, υπάρχει συμφωνία των τιμών των

αποτελεσμάτων μας με τις προηγούμενες μελέτες.

μmol FeSO4/ g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι)

Φακός 14,83±0,59

Ήπαρ 17,05±1,15

Εγκεφ.φλοιός 8,13±0,62*

Παρεγκεφαλίδα 6,36±0,23

Μεσεγκέφαλος 6,33±0,81*

Page 105: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

105

Από τον συγκριτικό πίνακα 1, παρατηρούμε ότι η αντιοξειδωτική ικανότητα των

εγκεφαλικών περιοχών των μαρτύρων παρουσιάζει διαφορές και συγκεκριμένα οι

τιμές FRAP του εγκεφαλικού φλοιού είναι σημαντικά υψηλότερες από αυτές της

παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου. Από τη στατιστική ανάλυση προέκυψε ότι οι

διαφορές στα επίπεδα της αντιοξειδωτικής ικανότητας μεταξύ φλοιού και

μεσεγκεφάλου είναι στατιστικώς σημαντικές (p=0.0079). Το εύρημα αυτό συμφωνεί

με τα αποτελέσματα των Linardaki et al., οι μελέτες των οποίων πραγματοποιήθηκαν

σε ενήλικες μύες.

Page 106: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

106

IV.1.2. Μέθοδος προσδιορισμού του ασκορβικού οξέος (Ferric Reducing

Ascorbic Acid, μέθοδος FRASC).

Στη μέθοδο FRASC ως πρότυπη ουσία χρησιμοποιήθηκε το ασκορβικό οξύ (Lee et

al., 1997). Η μέτρηση της απορρόφησης στα 490nm για διαφορετικές συγκεντρώσεις

ασκορβικού οξέος έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή γραμμικότητα (R2=0,9962)

στην περιοχή 5-250 μΜ ασκορβικού οξέος (Γράφημα 2).

y = 0,0015x - 0,0254R2 = 0,9962

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 50 100 150 200 250 300

Συγκέντρωση ασκορβικού οξέος (μΜ)

Απορ

ρόφησ

η (4

90nm

)

Γράφημα 2: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού αντιοξειδωτικής δράσης δειγμάτων

με τη μέθοδο FRASC. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων

ασκορβικού οξέος.

Η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος προσδιορίστηκε με παρεμβολή στην πρότυπη

καμπύλη της απορρόφησης του δείγματος.

Page 107: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

107

Η συγκέντρωση του περιεχόμενου στα δείγματα ασκορβικού οξέος υπολογίζεται

με βάση τον παρακάτω τύπο:

ΔΑ490 nm ασκορβικού οξέος(0-1 h) = (ΔΑ490 nm δείγματος(-ao) (0-1 h))-( ΔΑ490 nm δείγματος

(+ao) (0-1 h) )(1)

Πίνακας 2: Συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος στους ιστούς των μαρτύρων.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του

φακού). Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές

αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων που αναλύθηκαν εις τριπλούν.

*p=0.0004 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ φλοιού-

παρεγκεφαλίδας (Mann-Whitney test).

** p=0.0001 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ παρεγκεφαλίδας-

μεσεγκεφάλου (Mann-Whitney test).

Στις προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος

ολικού ομογενοποιήματος εγκεφάλου ενηλίκων μυών με τη μέθοδο FRASC, δίνεται

στα 134,39±5,027 μg ασκορβικού οξέος/g ιστού για τους φυσιολογικούς μύες

(Papandreou et al., 2008). Η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος με τη μέθοδο της

ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές (capillary electrophoresis) δίνεται στα 0,656±0,110

μmol ασκορβικού οξέος/g ιστού για την περιοχή του μεσεγκεφάλου στους

φυσιολογικούς μύες (Linardaki et al., 2008). Στην βιβλιογραφία οι τιμές που

μg ασκορβικού οξέος/g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι)

Φακός 2190,05±471,47

Ήπαρ 510,83±94,68

Εγκεφ. φλοιός 121,26±41,30*

Παρεγκεφαλίδα 538,67±28,29*,**

Μεσεγκέφαλος 103,15±17,49**

Page 108: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

108

δίνονται για τον εγκεφαλικό φλοιό νεογνών επίμυων είναι 11μg/ mg πρωτεΐνης

(Sgaravatti et al., 2008).

Όπως προκύπτει από τον συγκριτικό πίνακα 2, η συγκέντρωση του ασκορβικού

οξέος στην παρεγκεφαλίδα είναι σημαντικά υψηλότερη από αυτή του εγκεφαλικού

φλοιού και του μεσεγκεφάλου. Από τη στατιστική ανάλυση προέκυψε ότι οι διαφορές

στη συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος μεταξύ παρεγκεφαλίδας-φλοιού (p=0.0004)

και παρεγκεφαλίδας-μεσεγκεφάλου (p=0.0001) είναι στατιστικώς σημαντικές.

Όσον αφορά στην περιοχή του φακού η συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος είναι

σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με τις υπόλοιπες υπό μελέτη περιοχές. Το εύρημα

αυτό συμφωνεί με τη φυσιολογία του φακού, αφού το ασκορβικό οξύ αποτελεί το

κύριο αντιοξειδωτικό μόριο του οφθαλμού. Παίζει ζωτικό ρόλο στον αμυντικό

μηχανισμό του οφθαλμού προστατεύοντας τους ιστούς από τη φωτοοξειδωτική

βλάβη, ενώ έχει και αντιφλεγμονώδη δράση.

Page 109: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

109

IV.1.3. Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων

α) Προσδιορισμός της MDA με χρήση φωτομέτρου

Μέθοδος Ι

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα της MDA γνωστής

συγκέντρωσης (0,625 έως 100μΜ). Η φωτομέτρηση στα 550nm για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις διαλυμάτων MDA έδωσε τα παρακάτω αποτελέσματα:

MDA (μΜ) 0,625 1,25 2,5 5 10 50 100

Απορρόφηση

στα 550nm

1,229 0,912 0,037 1,196 1,762 2,138 1,238

Page 110: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

110

Μέθοδος ΙΙ

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα της MDA γνωστής

συγκέντρωσης (0,625 έως 100μΜ). Η φωτομέτρηση στα 550nm για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις διαλυμάτων MDA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει γραμμικότητα

(R2=0,9396) στην περιοχή 0,625-100 μΜ MDA (Γράφημα 3).

y = 0,02x - 0,0627R2 = 0,9396

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Συγκέντρωση MDA (μΜ)

Απορρόφησ

η (5

50nm

Γράφημα 3: Πρότυπη καμπύλη μεθόδου προσδιορισμού της

υπεροξείδωσης λιπιδίων με μέτρηση της απορρόφησης στα 550nm.

Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων MDA.

Page 111: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

111

Μέθοδος ΙΙΙ

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα της MDA γνωστής

συγκέντρωσης (1 έως 6μΜ). Η φωτομέτρηση στα 550nm για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις διαλυμάτων MDA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή

γραμμικότητα (R2=0,9737) στην περιοχή 1-6 μΜ MDA (Γράφημα 4).

y = 0,0118x

R2 = 0,9737

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 1 2 3 4 5 6 7

Συγκέντρωση MDA (μΜ)

Απορρόφηση (

550nm

Γράφημα 4: Πρότυπη καμπύλη μεθόδου προσδιορισμού της

υπεροξείδωσης λιπιδίων με μέτρηση της απορρόφησης στα 550nm.

Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων MDA.

Page 112: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

112

Μέθοδος ΙV

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα της MDA γνωστής

συγκέντρωσης (1 έως 6μΜ). Η φωτομέτρηση στα 550nm για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις διαλυμάτων MDA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή

γραμμικότητα (R2=0,9968) στην περιοχή 1-6 μΜ MDA (Γράφημα 5).

y = 0,0104x - 0,0044R2 = 0,9968

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 1 2 3 4 5 6 7

Συγκέντρωση MDA (μΜ)

Απορρόφησ

η (5

50nm

Γράφημα 5: Πρότυπη καμπύλη μεθόδου προσδιορισμού της

υπεροξείδωσης λιπιδίων με μέτρηση της απορρόφησης στα 550nm.

Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων MDA.

Page 113: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

113

β) Προσδιορισμός της MDA με χρήση φθορισμομέτρου

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα της MDA γνωστής

συγκέντρωσης (0,05 έως 10μΜ) (Del Rio et al, 2003; Jentzsch et al., 1996). Αρχικά

παρασκευάζεται ένα διάλυμα MDA συγκέντρωσης 1000μΜ με την προσθήκη

8,334μL διαλύματος μηλονικής διαλδεΰδης (97%) σε 1mL αιθανόλης 95% και 49mL

ddH2O (Agarwall et al., 2002). Στη συνέχεια, παρασκευάζεται ένα διάλυμα MDA

συγκέντρωσης 100μΜ με αραίωση του διαλύματος συγκέντρωσης 1000μΜ σε

διάλυμα HCl 0,1N. Από το διάλυμα των 100μΜ παρασκευάζονται διαλύματα MDA

συγκέντρωσης 0,05-10 μΜ με διαδοχικές αραιώσεις με ddH2O. Η μέτρηση του

φθορισμού στα 553nm (εκπομπή) και 515nm (διέγερση) για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις διαλυμάτων MDA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή

γραμμικότητα (R2=0,9787) στην περιοχή 0,05-10 μΜ MDA (Γράφημα 6).

y = 2,6198x + 1,1292R2 = 0,9787

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12

Συγκέντρωση MDA (μΜ)

Φθορισμ

ός

Γράφημα 6: Πρότυπη καμπύλη μεθόδου προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων

μέσω φθορισμού. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων MDA.

Page 114: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

114

Πίνακας 3: Επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων στους ιστούς των μαρτύρων.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL [πλην του

φακού και του ήπατος (3,125mg/mL)]. Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό

σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων.

*p=0.0055 (<0.05). Στατιστικώς σημαντική διαφορά στη σύγκριση μεταξύ

παρεγκεφαλίδας-φλοιού (Mann-Whitney test).

** p=0.0290 (<0.05). Στατιστικώς σημαντική διαφορά στη σύγκριση μεταξύ

παρεγκεφαλίδας-μεσεγκεφάλου(Mann-Whitney test).

Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται τα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων στους ιστούς

των μαρτύρων (ομάδα Ι). Τα δεδομένα της βιβλιογραφίας για φυσιολογικά ζώα

(μάρτυρες) δίνουν τις παρακάτω τιμές:

Πηγή βιβλιογραφίας Τιμή MDA στους μάρτυρες

Elanchezhian et al., 2007 60,16±3,33nmol/g ιστού (φακός)

Gupta et al., 2003 28,8±1,56nmol/g ιστού (φακός)

Yagci et al., 2006 0,72±0,19nmol/g πρωτεΐνης (φακός)

Sathyasaikumar et al., 2007 35 nmol/g ιστού (εγκ.φλοιός), 32 nmol/g ιστού (παρεγκεφαλίδα)

μmol MDA/ g πρωτεΐνης μmol MDA/ g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι)

Φακός 107,05±21,97 3,987±0,620

Ήπαρ 6,06±0,58 0,536±0,038

Εγκεφ. φλοιός 13,01±1,39* 0,553±0,090

Παρεγκεφαλίδα 19,93±2,83*, ** 0,481±0,056

Μεσεγκέφαλος 12,62±1,85** 0,380±0,051

Page 115: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

115

Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας, μελετήθηκαν τα επίπεδα της

λιπιδικής υπεροξείδωσης του εγκεφάλου ενηλίκων μυών με τη μέθοδο

προσδιορισμού της MDA με χρήση φθορισμομέτρου (Papandreou et al., 2008). Στις

μελέτες αυτές η τιμή που δίνεται για ολικό ομογενοποίημα εγκεφάλου είναι

2,233±0,255 μmol/g πρωτεΐνης. Επομένως, υπάρχει συμφωνία των τιμών των

αποτελεσμάτων μας με τις προηγούμενες μελέτες.

Από τον συγκριτικό πίνακα 3, παρατηρούμε ότι τα επίπεδα της λιπιδικής

υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών περιοχών των μαρτύρων παρουσιάζουν διαφορές

και συγκεκριμένα οι τιμές της παρεγκεφαλίδας είναι σημαντικά υψηλότερες από

αυτές του εγκεφαλικού φλοιού και του μεσεγκεφάλου. Από τη στατιστική ανάλυση

προέκυψε ότι οι διαφορές στα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης είναι

στατιστικώς σημαντικές μόνο μεταξύ παρεγκεφαλίδας-φλοιού (p=0.0055) και

παρεγκεφαλίδας- μεσεγκεφάλου (p= 0.0290).

Page 116: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

116

IV.1.4. Μέθοδος προσδιορισμού καρβονυλομάδων πρωτεϊνών

Η συγκέντρωση των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών υπολογίζεται από τον τύπο:

συγκέντρωση καρβονυλομάδων (nmol/L)= [(CA)/( 0,022μΜ-1)] (x μL/ y μL), όπου:

CA: η διαφορά της απορρόφησης του μάρτυρα (C) στα 370nm από την απορρόφηση

του δείγματος στα (S) 370nm,

x: η ποσότητα γουανιδίνης στην οποία διαλύεται το ίζημα και

y: η ποσότητα δείγματος (S) ή μάρτυρα (C) που προστίθεται αρχικά.

Η συγκέντρωση της περιεχόμενης στα δείγματα πρωτεΐνης υπολογίζεται από τον

τύπο:

συγκέντρωση πρωτεΐνης (mg/mL)= [(A280- b)/ a] (x/y)(συντελεστής αραίωσης), όπου:

A280: η απορρόφηση στα 280nm,

x: η ποσότητα γουανιδίνης στην οποία διαλύεται το ίζημα και

y: η ποσότητα δείγματος (S) ή μάρτυρα (C) που προστίθεται αρχικά και

a, b: προκύπτουν από την εξίσωση Α= aC + b της ευθείας η οποία αντιστοιχεί σε μία

πρότυπη καμπύλη απορρόφησης διαλυμάτων BSA .

Ως πρότυπα χρησιμοποιούνται γνωστές συγκεντρώσεις ανηγμένης και οξειδωμένης

BSA (bovine albumin serum) (Alamdari et al., 2005). Η παρασκευή των προτύπων

ανηγμένης και οξειδωμένης BSA γίνεται ως εξής:

ανηγμένη BSA: διάλυση 1g BSA σε 100mL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών,

προσθήκη 0,1g NaBH4 και επώαση για 30min σε RT. Εξουδετέρωση με 1N HCl και

μεταφορά σε μεμβράνη διαπήδησης. Ακολουθεί ολονύκτια διάλυση σε ρυθμιστικό

διάλυμα φωσφορικών (4οC, υπό ανάδευση) με 2 αλλαγές του ρυθμιστικού

διαλύματος. Τέλος, η ποσότητα της ανηγμένης BSA χωρίζεται σε κλάσματα και

αποθηκεύεται στους -80οC.

οξειδωμένη BSA: διάλυση 50mg BSA σε 1mL ρυθμιστικού διαλύματος

φωσφορικών, 20μL EDTA (100mM), 57μL ασκορβικού οξέος (833mM) και 2μL

Fe(NH4)2(SO4)2 (100mM). Επώαση για 90min στους 37οC και μεταφορά σε

Page 117: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

117

μεμβράνη διαπήδησης. Ακολουθεί ολονύκτια διάλυση σε ρυθμιστικό διάλυμα

φωσφορικών (4οC, υπό ανάδευση) με 2 αλλαγές του ρυθμιστικού διαλύματος. Τέλος,

η ποσότητα της οξειδωμένης BSA χωρίζεται σε κλάσματα και αποθηκεύεται στους -

80οC.

Η μέτρηση σε φωτόμετρο στα 280nm για τις διαφορετικές συγκεντρώσεις

διαλυμάτων BSA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει γραμμικότητα (R2=0,9377) στην

περιοχή 0,3125-2,5 mg/mL BSA (Γράφημα 7) (Buss et al., 1997).

y = 0,0276x + 0,2414R2 = 0,9377

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Συγκέντρωση BSA(mg/mL)

Απορρόφησ

η (2

80nm

Γράφημα 7: Πρότυπη καμπύλη μεθόδου προσδιορισμού των καρβονυλομάδων.

Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων BSA.

Page 118: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

118

Πίνακας 6: Συγκέντρωση καρβονυλομάδων (nmol/L) στα δείγματά μας.

Δείγματα Συγκέντρωση καρβονυλομάδων (nmol/L)

BSA 1,25mg/mL 17,34±7,02

BSA 2,5mg/mL 33,51±17,04

BSA 5mg/mL 45,11±15,09

BSA 10mg/mL 35,09±13,62

Οξειδωμένη BSA 2,5mg/mL 26,43±13,47

Πλάσμα ανθρώπου 82,78±16,87

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE).

Τα δεδομένα της βιβλιογραφίας για φυσιολογικά ζώα (μάρτυρες) δίνουν τις

παρακάτω τιμές:

Μετά από αρκετές επαναλήψεις της μεθόδου χρησιμοποιώντας δείγματα

ανθρώπινου πλάσματος (στα αρχικά δοκιμαστικά πειράματα δεν είχαμε παραλάβει

τους ιστούς των επίμυων) και πρότυπα διαλύματα BSA τα αποτελέσματά μας δεν

παρουσίαζαν επαναληψιμότητα, εμφάνιζαν μεγάλο τυπικό σφάλμα (SE) και τέλος

δεν συμφωνούσαν με τα αποτελέσματα της βιβλιογραφίας. Για τους παραπάνω

λόγους η μέθοδος δεν εφαρμόστηκε στα δείγματα (ομογενοποιήματα) των ιστών των

πειραματόζωων.

Πηγή βιβλιογραφίας Τιμή carbonyls στους μάρτυρες

Yagci et al., 2006 4,65±0,80 μmol/g πρωτεΐνης (φακός)

Indian Journal of opthalmology 1,33±0,32 nmol/mg πρωτεΐνης (πλάσμα)

Page 119: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

119

IV.1.5. Μέθοδος προσδιορισμού γλουταθείου

Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν γνωστές συγκεντρώσεις ανηγμένου γλουταθείου

(GSH) 5 έως 200μM. Τα πρότυπα διαλύματα ανηγμένου γλουταθείου

παρασκευάζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,6M, pH 8. Η μέτρηση σε

φωτόμετρο στα 415nm για τις διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων GSH έδειξε

ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή γραμμικότητα (R2=0,9995) στην περιοχή 5-200 μΜ

GSH (Γράφημα 8).

y = 0,0009x + 0,0444R2 = 0,9995

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 50 100 150 200 250

Συγκέντρωση GSH (μΜ)

Απορρόφησ

η (4

15nm

Γράφημα 8: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού του περιεχόμενου στα δείγματα

γλουταθείου. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων ανηγμένου

γλουταθείου.

Page 120: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

120

Στα πειράματά μας, η συγκέντρωση του ανηγμένου γλουταθείου στο ήπαρ επίμυων

στους οποίους χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο (ομάδα ΙΙ) ήταν 65,27±23,07 nmol

GSH/ mg ιστού. Στους επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε εκχύλισμα C.sativus

(ομάδα ΙΙΙ) ήταν 136,91±72,25 nmol GSH/mg ιστού. Τέλος, η συγκέντρωση του

GSH σε ολικό εγκεφαλικό ομογενοποίημα φυσιολογικών ζώων ήταν 29,265mg

/100gr ιστού.

Τα δεδομένα της βιβλιογραφίας για φυσιολογικά ζώα (μάρτυρες) δίνουν τις

παρακάτω τιμές:

Αν και η μέθοδος επαναλήφθηκε αρκετές φορές με τροποποιήσεις (προσθήκη ή όχι

TCA, προσθήκη ή όχι TEAM) τα αποτελέσματα δεν ήταν ικανοποιητικά (πολύ

χαμηλές απορροφήσεις, μεγάλο τυπικό σφάλμα (SE)) και δεν συμφωνούσαν με τη

βιβλιογραφία. Για τους παραπάνω λόγους η μέθοδος δεν εφαρμόστηκε στα δείγματα

(ομογενοποιήματα) των ιστών των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε

σεληνιώδες νάτριο και εκχύλισμα των στύλων του C.sativus.

Πηγή βιβλιογραφίας Τιμή GSH στους μάρτυρες

Gupta et al., 2005 5 umol/g φακού

Gupta et al., 2003 4,92±0,26 μmol/g φακού

Elanchezhian et al., 2007 8,36±0,37 μmol/gm ιστού (φακός)

Latha et al., 2004 46,76±3,90 mg/100mg ιστού

(ήπαρ-ενήλικα ζώα)

Leelavinothan et al., 2004 35,19±2,21 mg/100g ιστού

(εγκέφαλος-ενήλικα ζώα)

Papandreou et al., 2008 37,49±3,50 μmol/ g πρωτεΐνης

Page 121: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

121

IV.1.6. Μέθοδος Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης

των δειγμάτων.

Ως πρότυπη ουσία στη μέθοδο Bradford χρησιμοποιήθηκε η BSA σε συγκεντρώσεις

0,05 έως 1 mg/mL. Η μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm για τις διαφορετικές

συγκεντρώσεις της BSA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή γραμμικότητα

(R2=0,9656) στην περιοχή 0,05 έως 1 mg/mL BSA (Γράφημα 9).

y = 0,3499x - 0,0056R2 = 0,9656

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Συγκέντρωση BSA (mg/mL)

Απορρόφησ

η (5

95 n

m

Γράφημα 9: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού της συγκέντρωσης πρωτεΐνης των

δειγμάτων με τη μέθοδο Bradford. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων

διαλυμάτων BSA.

Page 122: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

122

Πίνακας 7: Συγκέντρωση περιεχόμενης πρωτεΐνης στους ιστούς των μαρτύρων.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του

φακού). Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές

αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων.

Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της περιεχόμενης πρωτεΐνης των δειγμάτων

πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο Bradford.

mg πρωτεΐνης/mg ιστού

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι)

Φακός 0,052±0,005

Ήπαρ 0,089±0,004

Εγκεφ.φλοιός 0,041±0,005

Παρεγκεφαλίδα 0,024±0,001

Μεσεγκέφαλος 0,030±0,004

Page 123: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

123

IV.1.7. Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE).

kDaCntlCntlSeSeCrCr

324762

83175

Εικόνα 50: SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση φακού επίμυων, όπου απεικονίζονται οι

φακοί των μαρτύρων της ομάδας Ι (Cntrl).

Στα δείγματά μας, οι κύριες ζώνες (bands) οι οποίες εμφανίστηκαν στην

ηλεκτροφόρηση των φακών των μαρτύρων (ομάδα Ι) ήταν οι κρυσταλλίνες

(crystallins) μεταξύ 20 και 28kDa (Εικόνα 50).

Page 124: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

124

IV.2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στους επίμυες

Το σεληνιώδες νάτριο χορηγήθηκε με υποδόρια ένεση σε επίμυες 9 ημερών σε

συγκέντρωση 20 και 25 μmol/kg σωματικού βάρους (Gupta et al., 2003; 2005). Όπως

προαναφέρθηκε, η δόση των 25 μmol/kg σωματικού βάρους αποδείχθηκε

θανατηφόρος, παρατήρηση που συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες (Ostadalova et

al., 1977). Τα πειράματα συνεχίστηκαν με τη δόση των 20 μmol/kg σωματικού

βάρους, η οποία μετά από οφθαλμική εξέταση των πειραματόζωων, την 16η ημέρα

που οι επίμυες ανοίγουν τα μάτια τους, αποδείχθηκε ότι προκαλεί καταρράκτη. Όπως

προέκυψε από την οφθαλμολογική εξέταση, η δόση των 20 μmol/kg σωματικού

βάρους, προκάλεσε καταρράκτη σε ποσοστό 60% (4 στα 7 πειραματόζωα).

IV.2.1. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο σωματικό βάρος των

πειραματόζωων

Πίνακας 8: Επίδραση της χορήγησης του σεληνιώδους νατρίου στο σωματικό βάρος

των πειραματόζωων.

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE).

Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι)

και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ).

Το βάρος των πειραματόζωων ελέγχθηκε την 9η ημέρα, αμέσως πριν την χορήγηση

του σεληνιώδους νατρίου, καθώς και την 20η ημέρα, αμέσως πριν τη θυσία τους. Το

σωματικό βάρος της ομάδας Ι των φυσιολογικών επίμυων αυξήθηκε σε ποσοστό

52,95%, ενώ της ομάδας ΙΙ στην οποία χορηγήθηκε το σεληνιώδες νάτριο σε ποσοστό

Σωματικό βάρος (g) Ημέρα ζύγισης Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

9η ημέρα 21,23±0,35 20,62±0,45

20η ημέρα 45,13±0,37 44,75±0,25

Page 125: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

125

53,95%. Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα, η χορήγηση του σεληνιώδους

νατρίου με υποδόρια ένεση στα πειραματόζωά μας δεν προκάλεσε κάποια

στατιστικώς σημαντική μεταβολή στο σωματικό τους βάρος σε σχέση με τους

μάρτυρες. Η παραπάνω παρατήρηση συμφωνεί και με προηγούμενες μελέτες (Orhan

et al., 1999).

IV.2.2. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο βάρος των φακών των

πειραματόζωων

Πίνακας 9: Επίδραση της χορήγησης του σεληνιώδους νατρίου στο βάρος των

φακών των πειραματόζωων.

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE).

Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι)

και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ).

Οι φακοί ζυγίστηκαν αμέσως μετά τη θυσία και την αφαίρεσή τους από τον

οφθαλμό των πειραματόζωων. Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα, η

χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωά μας δεν προκάλεσε κάποια

στατιστικώς σημαντική μεταβολή στο βάρος των φακών τους σε σχέση με τους

μάρτυρες.

Δείγματα Βάρος φακού (mg)

Μάρτυρας (ομάδα Ι) 18,73±2,90

Νa2SeO3 (ομάδα ΙΙ) 18,95±2,46

Page 126: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

126

IV.2.3. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην αντιοξειδωτική ικανότητα των

ιστών

Οι περιοχές που επιλέχθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης του σεληνιώδους

νατρίου ήταν οι εξής: φακός, ήπαρ, εγκεφαλικός φλοιός, μεσεγκέφαλος και

παρεγκεφαλίδα. Με σκοπό την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των

δειγμάτων (ομογενοποιημάτων) χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι FRAP και FRASC.

α) Μέθοδος FRAP

Πίνακας 10: Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην αντιοξειδωτική ικανότητα

των υπό μελέτη ιστών.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο

όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ) που αναλύθηκαν εις τριπλούν.

* p=0.0355 (< 0.05) Στατιστικώς σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα Ι)

(Mann-Whitney test).

μmol FeSO4/ g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

Φακός 14,83±0,59 16,88±0,91

Ήπαρ 17,05±1,15* 21,85±1,57*

Εγκεφ.φλοιός 8,13±0,62 8,50±0,23

Παρεγκεφαλίδα 6,36±0,23 6,60±0,44

Μεσεγκέφαλος 6,33±0,81 6,91±0,45

Page 127: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

127

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα εμφανίζει μία τάση αύξησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας στις

υπό μελέτη περιοχές. Η αύξηση είναι στατιστικώς σημαντική μόνο στο ήπαρ, όπου το

ποσοστό της μεταβολής ισούται με 28,15%.

β) Μέθοδος FRASC

Πίνακας 11: Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην συγκέντρωση του

ασκορβικού οξέος στους υπό μελέτη ιστούς.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του

φακού). Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές

αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ) που

αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη

συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος στους υπό μελέτη ιστούς. Στην περιοχή του

φακού, παρατηρείται μία μείωση στη συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος της τάξης

του 35,62%, ο μικρός αριθμός δειγμάτων (λόγω της ειδικής επεξεργασίας 3

φακών/mL) όμως δεν την καθιστά στατιστικώς σημαντική.

μg ασκορβικού οξέος/g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι) Νa2SeO3 (ομάδα ΙΙ)

Φακός 2190,05±471,47 1409,83±1086,92

Ήπαρ 510,83±94,68 565,15±134,71

Εγκεφ. φλοιός 121,27±41,30 264,63±99,32

Παρεγκεφαλίδα 538,67±28,29 440,11±69,09

Μεσεγκέφαλος 103,15±17,49 324,85±77,77

Page 128: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

128

IV.2.4. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην υπεροξείδωση λιπιδίων των

ιστών.

Πίνακας 12: Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην υπεροξείδωση λιπιδίων στους

υπό μελέτη ιστούς.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Η συγκέντρωση του ομογενοποιήματος του ήπατος είναι 3,125mg/mL Στον πίνακα δίνεται η

μέση τιμή±τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι)

και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ) που αναλύθηκαν εις τριπλούν.

*p=0.0238 (< 0.05).Στατιστικώς σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα Ι).

**p=0.0019 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα

Ι) (Mann-Whitney test).

***p=0.0388 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα Ι) (Mann-Whitney test).

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα προκάλεσε αύξηση στην υπεροξείδωση λιπιδίων σε όλες τις υπό

μελέτη περιοχές σε σχέση με τους φυσιολογικούς επίμυες. Στις περιοχές του φακού,

του ήπατος και του εγκεφαλικού φλοιού η αύξηση αυτή ήταν στατιστικώς σημαντική.

Συγκεκριμένα, στο φακό το ποσοστό της αύξησης ήταν 303,85%, στο ήπαρ 62,71%,

ενώ στον εγκεφαλικό φλοιό 66,64%.

μmol MDA/g πρωτεΐνης

Ιστοί Μάρτυρες (ομάδα Ι) Νa2SeO3 (ομάδα ΙΙ)

Φακός 107,05±21,97* 432,33±51,01*

Ήπαρ 6,06±0,58** 9,86±1,42**

Εγκεφ. φλοιός 13,01±1,39*** 21,68±1,54***

Παρεγκεφαλίδα 19,93±2,83 23,64±1,18

Μεσεγκέφαλος 12,62±1,85 14,77±5,60

Page 129: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

129

Τα διαφορετικά ποσοστά αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης στις υπό μελέτη

περιοχές, υποδεικνύουν τη διαφορετική ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες

των διαφορετικών ιστών. Οι λόγοι αυτής της ιστο-ειδίκευσης δεν έχουν πλήρως

διευκρινιστεί. Η διαφορετική απόκριση έναντι του οξειδωτικού στρες πιθανώς να

οφείλεται στο γεγονός ότι κάποιες περιοχές παρουσιάζουν μεγαλύτερο οξειδωτικό

φορτίο ή χαμηλότερη αντιοξειδωτική προστασία, χωρίς αυτό να ισχύει πάντοτε.

Επιπλέον, η ιστο-ειδίκευση που παρατηρείται ως προς τα επίπεδα της υπεροξείδωσης

λιπιδίων δεν έχει ακόμη πλήρως αναλυθεί ως προς τη βιοχημική της βάση. Οι

διαφορές στη σύσταση των λιπαρών οξέων των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών

ίσως εξηγεί το πρότυπο της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Srivastava et al., 2005). Τέλος,

οι διαφορές στην απόκριση έναντι του οξειδωτικού στρες μεταξύ των εγκεφαλικών

περιοχών ίσως να ερμηνεύονται και από το γεγονός ότι στην ηλικία που βρίσκονται

τα πειραματόζωά μας η παρεγκεφαλίδα δεν έχει ολοκληρώσει τη φυσιολογική

ανάπτυξή της, σε αντίθεση με τον εγκεφαλικό φλοιό και το μεσεγκέφαλο, οι οποίοι

μοιάζουν με τους αντίστοιχους ιστούς των ενήλικων επίμυων.

Όσον αφορά στον φακό η μεγάλη αύξηση στην τιμή της λιπιδικής υπεροξείδωσης

υποδεικνύει την αυξημένη ευαισθησία του φακού έναντι του οξειδωτικού στρες, το

οποίο αποτελεί ένα από τα πρωταρχικά γεγονότα στον καταρράκτη (Spector et al.,

1981). Οι φακοί της ομάδας ΙΙ εμφανίζουν καταρράκτη μετά τη χορήγηση του

σεληνιώδους νατρίου, συνεπώς εμφανίζουν και αυξημένο οξειδωτικό στρες, το οποίο

είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διάφορες οφθαλμικές παθήσεις και διαταραχές της

όρασης, συμπεριλαμβανομένου του καταρράκτη και της βλάβης του

αμφιβληστροειδούς που οδηγεί σε ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας

Page 130: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

130

IV.2.5. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης

των ιστών.

Πίνακας 13: Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης

στους υπό μελέτη ιστούς.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο

όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδα ΙΙ).

Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης των δειγμάτων υπολογίστηκε με τη μέθοδο

Bradford. Όπως προκύπτει από τον πίνακα 13, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη

συγκέντρωση της πρωτεΐνης στους υπό μελέτη ιστούς σε σχέση με τους ιστούς των

μαρτύρων.

mg πρωτεΐνης/mg ιστού

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

Φακός 0,052±0,005 0,044±0,002

Ήπαρ 0,089±0,004 0,090±0,006

Εγκεφ.φλοιός 0,041±0,005

0,034±0,001

Παρεγκεφαλίδα 0,024±0,001 0,028±0,001

Μεσεγκέφαλος 0,030±0,004 0,025±0,001

Page 131: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

131

IV.2.6. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην ανάλυση των πρωτεϊνών του

φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE).

Οι κύριες ζώνες (bands) οι οποίες εμφανίστηκαν στην ηλεκτροφόρηση των φακών

των μαρτύρων (ομάδα Ι) ήταν οι κρυσταλλίνες μεταξύ 20 και 28kDa. Στους φακούς

των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο εμφανίστηκε μία τάση

μείωσης των ζωνών 20-28kDa και συγχρόνως μία αύξηση στις πρωτεΐνες μοριακού

βάρους μικρότερου των 19kDa. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν και με

προηγούμενες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε φακούς πειραματόζωων στα

οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο (Gupta et al., 2005).

kDaCntlCntlSeSeCrCr

324762

83175

Εικόνα 51: SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση φακού επίμυων, όπου απεικονίζονται οι

φακοί των μαρτύρων της ομάδας Ι (Cntrl), καθώς και της ομάδας ΙΙ στην οποία

χορηγήθηκε το σεληνιώδες νάτριο (Se).

Page 132: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

132

Se SeSe C C kDa kDa175

83

32

4762

Εικόνα 52: SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση φακού επίμυων, όπου απεικονίζονται οι

φακοί των μαρτύρων της ομάδας Ι (C), καθώς και της ομάδας ΙΙ στην οποία

χορηγήθηκε το σεληνιώδες νάτριο (Se).

Page 133: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

133

ΙV.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο πειραματικό

μοντέλο

Την 10η και 11η ημέρα χορηγήθηκε στα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙΙ (n=7) το

εκχύλισμα των στύλων του C.sativus με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε συγκέντρωση

60mg/kg σωματικού βάρους. Οι ενέσεις που έγιναν στους επίμυες ήταν όγκου 20μL.

Όπως προέκυψε από την οφθαλμολογική εξέταση, η χορήγηση του εκχυλίσματος των

στύλων του Crocus sativus ανέστρεψε τη δράση του σεληνιώδους νατρίου στα

πειραματόζωα. Μόνο 1 από τα 7 πειραματόζωα της ομάδας ΙΙΙ εμφάνισε καταρράκτη.

IV.3.1. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο σωματικό

βάρος των πειραματόζωων

Πίνακας 14: Επίδραση της χορήγησης του εκχυλίσματος του C.sativus στο

σωματικό βάρος των πειραματόζωων.

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE).

Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι)

και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ).

Το βάρος των πειραματόζωων ελέγχθηκε την 9η ημέρα, αμέσως πριν την χορήγηση

του σεληνιώδους νατρίου, καθώς και την 20η ημέρα, αμέσως πριν τη θυσία τους. Το

σωματικό βάρος της ομάδας Ι των φυσιολογικών επίμυων αυξήθηκε σε ποσοστό

52,95%, της ομάδας ΙΙ στην οποία χορηγήθηκε το σεληνιώδες νάτριο σε ποσοστό

53,95%, ενώ της ομάδας ΙΙΙ στην οποία χορηγήθηκε το σεληνιώδες νάτριο και το

εκχύλισμα των στύλων του C.sativus σε ποσοστό 52,26%. Όπως προκύπτει από τον

Σωματικό βάρος (g) Ημέρα Ζύγισης

Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeΟ3

(ομάδα ΙΙ)

C.sativus

(ομάδα ΙΙΙ)

9η ημέρα 21,23±0,95 20,62±1,45 21,12±0,97

20η ημέρα 45,13±0,57 44,75±0,25 44,24±0,93

Page 134: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

134

παραπάνω πίνακα η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα

πειραματόζωά μας δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στο

σωματικό τους βάρος τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα

πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ. Η παραπάνω παρατήρηση συμφωνεί και με

προηγούμενες μελέτες (Orhan et al., 1999).

IV.3.2. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο βάρος των

φακών των πειραματόζωων

Πίνακας 15: Επίδραση της χορήγησης του εκχυλίσματος του C.sativus στο

βάρος των φακών των πειραματόζωων.

Δείγματα Βάρος φακού (mg)

Μάρτυρες (ομάδα Ι) 18,73±2,90

Νa2SeO3 (ομάδα ΙΙ) 18,95±2,46

C.sativus (ομάδα ΙΙΙ) 18,47±1,33

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE).

Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι)

και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ).

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση του εκχυλίσματος των

στύλων του C.sativus στα πειραματόζωά μας δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς

σημαντική μεταβολή στο βάρος των φακών τους τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες

(ομάδα Ι), όσο και σε σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ.

Page 135: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

135

IV.3.3. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην

αντιοξειδωτική ικανότητα των ιστών.

α) Μέθοδος FRAP

Πίνακας 16: Επίδραση του εκχυλίσματος του C.sativus στην αντιοξειδωτική

ικανότητα των υπό μελέτη ιστών.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο

όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ) που αναλύθηκαν εις τριπλούν. * p=0.0355 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση της ομάδας ΙΙ σε σχέση με τους

μάρτυρες (Mann-Whitney test).

**p=0.0070 (<0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση της ομάδας ΙΙΙ σε σχέση με τους

μάρτυρες (Mann-Whitney test).

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση εκχυλίσματος των στύλων

του C.sativus στα πειραματόζωα προκάλεσε αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας

σε όλες τις υπό μελέτη περιοχές, τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση

με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ. Η αύξηση είναι στατιστικώς σημαντική μόνο στο

ήπαρ, όπου το ποσοστό της αύξησης ισούται με 39%, σε σχέση με τους μάρτυρες.

μmol FeSO4/ g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

C.sativus

(ομάδα ΙΙΙ)

Φακός 14,83±0,59 16,88±0,91 16,99±3,92

Ήπαρ 17,05±1,15*,** 21,85±1,57* 23,70±1,65**

Εγκεφ. φλοιός 8,13±0,62 8,50±0,23 9,83±0,67

Παρεγκεφαλίδα 6,36±0,23 6,60±0,44 6,61±0,33

Μεσεγκέφαλος 6,33±0,81 6,91±0,45 6,96±0,56

Page 136: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

136

Σε μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με την επίδραση του C.sativus στην

αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου, αποδεικνύεται ότι η χορήγηση

εκχυλίσματος στύλων του C.sativus (συγκεκριμένα η σαφρανάλη που αποτελεί ένα

από τα κύρια συστατικά των στύλων) αυξάνει την αντιοξειδωτική ικανότητα (τιμές

FRAP) του ιππόκαμπου των επίμυων με εγκεφαλική ισχαιμία (Hosseinzadeh et al.,

2005). Συγκεκριμένα, η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus

αύξησε την τιμή της FRAP από 1,16±0,2 σε 4,12±0,33 μmol/g ιστού στον ιππόκαμπο

των πειραματοζώων. Επομένως, υπάρχει συμφωνία των αποτελεσμάτων της

παραπάνω μελέτης με τα αποτελέσματά μας, σχετικά με την επίδραση του C.sativus

στην αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου των πειραματόζωων.

β) Μέθοδος FRASC

Πίνακας 17: Επίδραση του εκχυλίσματος του C.sativus στην συγκέντρωση του

ασκορβικού οξέος στους υπό μελέτη ιστούς.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο

όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ) που αναλύθηκαν εις τριπλούν.

*p=0.0350 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση των πειραματόζωων της ομάδας ΙΙΙ σε

σχέση με τους μάρτυρες (Mann-Whitney test).

**p=0.0220 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση των πειραματόζωων της ομάδας ΙΙΙ σε

σχέση με τους μάρτυρες.

μg ασκορβικού οξέος/g ιστού

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

C.sativus

(ομάδα ΙΙΙ)

Φακός 2190,05±471,47 1409,83±1086,92 1308,52±430,84

Ήπαρ 510,83±94,68 565,15±134,71 570,77±142,70

Εγκεφ. φλοιός 121,27±41,30* 264,63±99,32 344,52±79,83*

Παρεγκεφαλίδα 538,67±28,29 440,11±69,09 492,22±16,60

Μεσεγκέφαλος 103,16±17,49** 324,85±77,77 241,49±47,90**

Page 137: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

137

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα η χορήγηση εκχυλίσματος των στύλων

του C.sativus στα πειραματόζωα προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση στην

συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος στον εγκεφαλικό φλοιό και στο μεσεγκέφαλο,

σε σχέση με τους μάρτυρες. Στον εγκεφαλικό φλοιό το ποσοστό της αύξησης ισούται

με 184,1%, ενώ στο μεσεγκέφαλο το ποσοστό ισούται με 134,1%.2

IV.3.4. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην

υπεροξείδωση λιπιδίων των ιστών.

Πίνακας 18: Επίδραση του εκχυλίσματος του C.sativus στην υπεροξείδωση λιπιδίων

στους υπό μελέτη ιστούς.

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL [πλην του φακού και

του ήπατος (3,125mg/mL)]. Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές

αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ).

* p=0.0238 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση των πειραματοζώων της ομάδας ΙΙ σε

σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα Ι) (Mann-Whitney test).

**p=0.0388 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση των πειραματοζώων της ομάδας ΙΙ σε

σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα Ι) (Mann-Whitney test).

***p=0.0349 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική μείωση των πειραματοζώων της ομάδας ΙΙI σε

σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ (Mann-Whitney test).

**** p=0.0019 (< 0.05). Στατιστικώς σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες (ομάδα

Ι) (Mann-Whitney test).

# p=0.0224 (< 0.05) Στατιστικώς σημαντική μείωση των πειραματοζώων της ομάδας ΙΙI σε

σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ (Mann-Whitney test).

μmol MDA/g πρωτεΐνης

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα ΙΙ)

C.sativus

(ομάδα ΙΙΙ)

Φακός 107,05±21,97* 432,33±51,01* 286,37±112,88

Ήπαρ 6,057±0,58**,*** 9,86±1,42**,*** 5,78±0,81***

Εγκεφ. φλοιός 13,01±1,39**** 21,68±1,54****, # 16,03±1,27#

Παρεγκεφαλίδα 19,93±2,83 23,64±1,18 18,54±4,2

Μεσεγκέφαλος 12,62±1,85 14,77±5,6 10,21±1,53

Page 138: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

138

Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα, η χορήγηση του εκχυλίσματος των

στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙΙ προκάλεσε μείωση των

επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε όλες τις υπό μελέτη περιοχές σε σχέση με

τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο (ομάδα ΙΙ) και όχι

το εκχύλισμα του κρόκου. Μάλιστα, στο ήπαρ και στον εγκεφαλικό φλοιό η μείωση

των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων που παρατηρήθηκε ήταν στατιστικώς

σημαντική. Συγκεκριμένα, το ποσοστό της μείωσης στο ήπαρ ήταν 41,38% σε σχέση

με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ, ενώ στον εγκεφαλικό φλοιό το ποσοστό της

μείωσης ήταν 26,06% σε σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας ΙΙ. Στο φακό, το

ποσοστό της μείωσης ισούται με 33,76%, ο μικρός αριθμός δειγμάτων (λόγω της

ειδικής επεξεργασίας 3 φακών/mL) όμως δεν το καθιστά στατιστικώς σημαντικό,

σύμφωνα με το Mann-Whitney test.

Επιπλέον, σε κάποιες περιοχές (ήπαρ, παρεγκεφαλίδα και μεσεγκέφαλο) το

εκχύλισμα του κρόκου μείωσε τα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε σχέση και

με τους μάρτυρες (ομάδα Ι), χωρίς η μείωση αυτή να είναι στατιστικώς σημαντική.

Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν την αντιοξειδωτική δράση των

συστατικών των στύλων του C.sativus.

Page 139: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

139

IV.3.5. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στη συγκέντρωση

της πρωτεΐνης των ιστών.

Πίνακας 19: Συγκέντρωση πρωτεΐνης (mg πρωτεΐνης/mg ιστού) στους υπό μελέτη

ιστούς.

mg πρωτεΐνης/mg ιστού

Ιστοί Μάρτυρες

(ομάδα Ι)

Νa2SeO3

(ομάδα IΙ)

C.sativus

(ομάδα IIΙ)

Φακός 0,052±0,05 0,044±0,002 0,46±0,007

Ήπαρ 0,089±0,004 0,090±0,006 0,096±0,007

Εγκεφ.φλοιός 0,041±0,005

0,034±0,001 0,034±0,003

Παρεγκεφαλίδα 0,024±0,001 0,028±0,001 0,029±0,001

Μεσεγκέφαλος 0,030±0,004 0,025±0,001 0,027±0,002

Οι τιμές αντιστοιχούν σε συγκέντρωση ομογενοποιήματος 12,5mg/mL (πλην του φακού).

Στον πίνακα δίνεται η μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο

όρο 9 ζώων (ομάδα Ι) και 7 ζώων (ομάδες ΙΙ και ΙΙΙ).

Ο υπολογισμός της περιεχομένης στους ιστούς πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με τη

μέθοδο Bradford. Όπως προκύπτει από τον πίνακα 19, η χορήγηση η χορήγηση του

εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα δεν προκάλεσε κάποια

στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στους υπό μελέτη

ιστούς τόσο σε σχέση με τους ιστούς των μαρτύρων, όσο και σε σχέση με τους ιστούς

των επίμυων της ομάδας ΙΙ.

Page 140: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

140

IV.3.6. Ανάλυση των πρωτεϊνών του φακού με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα

πολυακρυλαμιδίου (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE).

Όπως προαναφέρθηκε, οι κύριες ζώνες (bands) οι οποίες εμφανίστηκαν στην

ηλεκτροφόρηση των φακών των μαρτύρων (ομάδα Ι) ήταν οι κρυσταλλίνες

(crystallins) μεταξύ 20 και 28kDa. Στους φακούς των πειραματόζωων στα οποία

χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο εμφανίστηκε μία τάση μείωσης των ζωνών 20-28kDa

και συγχρόνως μία αύξηση στις πρωτεΐνες μοριακού βάρους μικρότερου των 19kDa.

Στους φακούς της ομάδας των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε το εκχύλισμα

των στύλων του κρόκου (ομάδα ΙΙΙ) οι ζώνες οι οποίες εμφανίστηκαν στην

ηλεκτροφόρηση των φακών ήταν παρόμοιες με αυτές των φακών των μαρτύρων

(ομάδα Ι). Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν και με προηγούμενες μελέτες που έχουν

πραγματοποιηθεί σε φακούς πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες

νάτριο (Gupta et al., 2005).

Εικόνα 52: SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση φακού επίμυων της ομάδας ΙΙ ( Se) και της

ομάδας ΙΙΙ (C).

Page 141: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

141

kDaCntlCntlSeSeCrCr

324762

83175

Εικόνα 53: SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση φακού επίμυων της ομάδας Ι (Cntl), της

ομάδας ΙΙ ( Se) και της ομάδας ΙΙΙ (Cr).

Page 142: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

142

V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Καθώς ο μέσος όρος ηλικίας του παγκόσμιου πληθυσμού αυξάνεται τα ποσοστά

εμφάνισης του καταρράκτη συνεχώς αυξάνονται. Ο καταρράκτης αποτελεί την κύρια

αιτία τύφλωσης και σοβαρών προβλημάτων όρασης για περίπου 20 εκατομμύρια

άτομα παγκοσμίως. Στις ανεπτυγμένες χώρες το ποσοστό των προκαλούμενων από

καταρράκτη τυφλώσεων ανέρχεται σε ποσοστό 50-90% του συνόλου των

τυφλώσεων. Η χειρουργική επέμβαση αποτελεί το μοναδικό αποτελεσματικό τρόπο

αντιμετώπισης του καταρράκτη, καθώς όλες οι φαρμακολογικές δοκιμές που έχουν

πραγματοποιηθεί δεν είχαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η πρόκληση στις μέρες μας

εκτός από τη θεραπεία του καταρράκτη είναι και η παρεμπόδιση ή καθυστέρηση της

εμφάνισής του. Ο ακριβής μηχανισμός σχηματισμού του καταρράκτη δεν έχει

πλήρως διευκρινιστεί. Διάφορα πειραματικά μοντέλα χρησιμοποιούνται στην

προσπάθεια ερμηνείας των μηχανισμών της καταρρακτογένεσης. Το μοντέλο

επαγωγής καταρρακτογένεσης μέσω της χρήσης σεληνιώδους νατρίου αποτελεί ένα

από τα δημοφιλέστερα πειραματικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται.

Το σεληνιώδες νάτριο φαίνεται να εκδηλώνει τη δράση του στο φακό μέσω της

επαγωγής οξειδωτικού στρες στα κύτταρα του φακό, αλλά ο ακριβής μηχανισμός

δράσης του δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Διάφορες βιοχημικές αλλαγές λαμβάνουν

χώρα κατά τη διαδικασία της καταρρακτογένεσης, οι οποίες περιλαμβάνουν:

συσσώρευση ασβεστίου στο φακό, αλλαγές στο μεταβολισμό των επιθηλιακών

κυττάρων του φακού, επαγωγή της πρωτεόλυσης της καλπαΐνης (calpain,

πρωτεολυτικό ένζυμο που εμπλέκεται στην καταρρακτογένεση), καθίζηση των

κρυσταλλινών και απώλεια του κυτταροσκελετού (Yagci et al., 2006). Το σεληνιώδες

νάτριο προκαλεί οξείδωση των σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών, γεγονός που

οδηγεί σε καταστροφή των ιοντικών αντλιών των κυττάρων και σε διατάραξη της

ηλεκτρολυτικής ισορροπίας. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου αυξάνονται και

ενεργοποιείται η επαγόμενη από το ασβέστιο πρωτεόλυση της καλπαΐνης. Η

καλπαΐνη υδρολύει ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες και κυρίως τις β-κρυσταλλίνες. Τα

πρωτεϊνικά συσσωματώματα που δημιουργούνται σκεδάζουν το φως, συμβάλλοντας

στην απώλεια της διαύγειας του φακού (Spector, 1984). Παράλληλα, μειώνεται η

ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων του φακού, όπως η καταλάση, η

αναγωγάση της γλουταθειόνης, η δισμουτάση του σουπεροξειδίου, η υπεροξειδάση

του γλουταθείου και η S-τρανσφεράση του γλουταθείου.

Page 143: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

143

V. 1 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα

Στην παρούσα μελέτη το σεληνιώδες νάτριο χορηγήθηκε σε συγκέντρωση 25

μmol/kg σωματικού βάρους και 20 μmol/kg σωματικού βάρους. Στη συγκέντρωση

των 25 μmol/kg σωματικού βάρους, παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιείται σε πολλές

πρόσφατες εργασίες, αποδείχθηκε θανατηφόρο (σε 4 πειραματόζωα). Η παρατήρησή

μας συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες (Ostadalova et al., 1977). Η συγκέντρωση

των 20 μmol/kg σωματικού βάρους προκάλεσε καταρράκτη σε όλα τα πειραματόζωα

στα οποία χορηγήθηκε, όπως αποδείχθηκε μετά από οφθαλμική εξέταση των

πειραματόζωων.

Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς

σημαντική μεταβολή στο σωματικό βάρος των πειραματόζωων σε σχέση με τους

μάρτυρες, παρατήρηση που συμφωνεί και με προηγούμενες μελέτες (Orhan et al.,

1999).

V. 1.1 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο ήπαρ

Όσον αφορά στην υπεροξείδωση λιπιδίων, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα προκάλεσε αύξηση στην υπεροξείδωση λιπιδίων σε όλες τις υπό

μελέτη περιοχές. Στην περιοχή του ήπατος το ποσοστό της αύξησης ήταν 62,71% και

η αύξηση αυτή είναι στατιστικώς σημαντική. Τα παραπάνω αποτελέσματα

συμφωνούν με την επικρατούσα άποψη ότι οι ενώσεις που περιέχουν σελήνιο

(selenocompounds), κυρίως το σεληνιώδες νάτριο, παρουσιάζουν προ-οξειδωτικές

ιδιότητες οι οποίες μπορεί να είναι τοξικές για τα κύτταρα (Forceville et al.). Η προ-

οξειδωτική δράση του σεληνιώδους νατρίου επάγεται μέσω του σχηματισμού του

ανιόντος του σουπεροξειδίου, το οποίο αποτελεί μία πολύ δραστική ελεύθερη ρίζα η

οποία προκαλεί τη δημιουργία βλαβών στο DNA (Kim et al., 2002). Επιπλέον, σε

σχετική εργασία αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε ενήλικες

επίμυες σε συγκέντρωση 2mg/kg σωματικού βάρους προκαλεί αύξηση στην

υπεροξείδωση λιπιδίων στο ήπαρ σε ποσοστό 35% (El-Demardash, 2001). Τα

αποτελέσματα της παραπάνω εργασίας βρίσκονται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα

της δικής μας μελέτης.

Page 144: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

144

Εργασία των Tos-Luty et al. (2003) στην οποία πραγματοποιήθηκε ιστοπαθολογική

μελέτη της επίδρασης του σεληνιώδους νατρίου στο ήπαρ, στους νεφρούς, στους

πνεύμονες και στην καρδιά μυών κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η χορήγηση του

σεληνιώδους νατρίου προκάλεσε αλλοιώσεις σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν,

και κυρίως στο ήπαρ και στους νεφρούς. Συγκεκριμένα, στο ήπαρ παρατηρήθηκαν

αλλοιώσεις των ηπατικών κυττάρων μετά τη χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου, η

έκταση των οποίων ήταν ανάλογη της συγκέντρωσης του χορηγούμενου

σεληνιώδους νατρίου.

Σε εργασία των Zhang et al. (2008) αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους

νατρίου σε μύες προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα των ελευθέρων ριζών στο ήπαρ

(μειωμένη ενεργότητα της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου και της υπεροξειδάσης

του γλουταθείου) μέσω των προ-οξειδωτικών ιδιοτήτων του σεληνιώδους νατρίου, οι

οποίες εκδηλώνονται με τον καταλυτικό ρόλο του στην οξείδωση των

σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών. Παράλληλα, παρατηρήθηκε αύξηση της

συγκέντρωσης της ηπατικής αναγωγάσης της θειορεδοξίνης 1 (TrxR 1), η οποία

παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην άμυνα του οργανισμού έναντι του οξειδωτικού στρες,

και τα αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες επάγουν το σχηματισμό της. Η αυξημένη

συγκέντρωση της TrxR 1 παρατηρήθηκε κατόπιν της προκαλούμενης από την

τοξικότητα του σεληνιώδους νατρίου ηπατικής βλάβης. Επιπλέον, στην παραπάνω

μελέτη παρατηρήθηκε και αύξηση της συγκέντρωσης της S-τρανσφεράσης του

γλουταθείου, η οποία προηγούνταν της ηπατικής βλάβης. Η παραπάνω μελέτη

βρίσκεται σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα της δικής μας μελέτης, στην

οποία τα αυξημένα επίπεδα των ελευθέρων ριζών μετά τη χορήγηση του

σεληνιώδους νατρίου υποδεικνύονται από τις αυξημένες τιμές της λιπιδικής

υπεροξείδωσης στο ήπαρ (και σε όλους τους υπό μελέτη ιστούς), ενώ η ενεργοποίηση

των αμυντικών μηχανισμών υποδεικνύεται από την αύξηση της αντιοξειδωτικής

ισχύος όλων των ιστών. Αυξημένη ενεργότητα της TrxR 1 και της S-τρανσφεράσης

του γλουταθείου παρατηρήθηκε και σε μελέτη των El-Sayd et al. (2006) η οποία

όμως παρατηρήθηκε σε συνδυασμό με μη τοξική δράση του σεληνιώδους νατρίου.

Σε εργασία των Nakayama et al. (2007) σχετικά με την πρόσληψη σεληνίου από

τους ιστούς μυών οι οποίοι ακολουθούσαν δίαιτες με διαφορετική περιεκτικότητα

σεληνίου καθώς και μυών στους οποίους δεν εκφράζεται το γονίδιο που είναι

υπεύθυνο για την σεληνιο-πρωτεΐνη 1 (Sepp 1) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: η

Page 145: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

145

Sepp 1 συντίθεται κυρίως στο ήπαρ και είναι υπεύθυνη για την κατανομή του

σεληνίου στους ιστούς των πειραματόζωων, καθώς και για την ομοιόστασή του.

Υπάρχει μία ιεραρχία των ιστών στην πρόσληψη του σεληνίου μέσω της δίαιτας.

Συγκεκριμένα, οι νεφροί, το ήπαρ και οι όρχεις παρουσίαζαν υψηλότερη

συγκέντρωση σεληνίου σε σχέση με τον εγκέφαλο και τους μύες, ενώ ο εγκέφαλος

και οι μύες παρουσίαζαν μεγαλύτερη ικανότητα διατήρησης των επιπέδων του

σεληνίου όταν μειώνονταν τα προσλαμβανόμενα μέσω της διατροφής αποθέματα.

Όσον αφορά στην αντιοξειδωτική ικανότητα των υπό μελέτη ιστών, η χορήγηση

του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα εμφανίζει μία τάση αύξησης της

αντιοξειδωτικής ικανότητας σε όλες τις υπό μελέτη περιοχές. Η αύξηση είναι

στατιστικώς σημαντική μόνο στο ήπαρ, όπου το ποσοστό της μεταβολής ισούται με

28,15%. Η παρατήρηση αυτή πιθανώς να εξηγείται από την αντιοξειδωτική δράση

του σεληνίου, η οποία ασκείται μέσω της ενσωμάτωσής του στα σελήνιο-εξαρτώμενα

ένζυμα (selenoenzymes). Tα σελήνιο-εξαρτώμενα ένζυμα (σεληνιο-πρωτεΐνες, όπως

η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η ιωδοθυρονίνη 5’-δεϊωδινάση και η αναγωγάση

της θειορεδοξίνης), τα οποία απαιτούν την παρουσία ενός ατόμου σεληνίου στο

ενεργό τους κέντρο ώστε να είναι λειτουργικά, έχουν σημαντικές βιολογικές

λειτουργίες, με κυριότερη την προστασία των κυττάρων από το οξειδωτικό στρες

(αντιοξειδωτική δράση) (Cronin, 2000). Επιπλέον, σε μελέτη των Sheng et al. (2005)

αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε φυσιολογικούς μύες είχε

τοξική δράση στους ιστούς των πειραματόζωων, ενώ παρατηρήθηκε αυξημένη

εναπόθεση σεληνίου στο ήπαρ και τον εγκέφαλο. Αντίθετα, σε διαβητικούς μύες

στην ίδια μελέτη το σεληνιώδες νάτριο παρουσίασε αντιοξειδωτική δράση

αυξάνοντας τα επίπεδα του ανηγμένου γλουταθείου στο ήπαρ και τον εγκέφαλο. Η

αντιοξειδωτική αυτή δράση του σεληνιώδους νατρίου στους διαβητικούς μύες

έρχεται σε πλήρη αντίθεση με την τοξική του δράση στους φυσιολογικούς μύες τις

παραπάνω μελέτης.

Τέλος, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα δεν προκάλεσε

κάποια στατιστικώς σημαντική αλλαγή στη συγκέντρωσης του ασκορβικού οξέος

στο ήπαρ.

Page 146: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

146

V. 1.2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο φακό

Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα προκάλεσε αύξηση στην

υπεροξείδωση λιπιδίων στο φακό. Η αύξηση αυτή ήταν στατιστικώς σημαντική και

το ποσοστό της αύξησης ήταν 303,85%. Η μεγάλη αύξηση στην τιμή της λιπιδικής

υπεροξείδωσης υποδεικνύει την αυξημένη ευαισθησία του φακού έναντι του

οξειδωτικού στρες, το οποίο αποτελεί ένα από τα πρωταρχικά γεγονότα στον

καταρράκτη (Spector et al., 1981). Οι φακοί της ομάδας στην οποία χορηγήθηκε το

σεληνιώδες νάτριο, εμφανίζουν καταρράκτη, συνεπώς εμφανίζουν και αυξημένο

οξειδωτικό στρες, το οποίο είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διάφορες οφθαλμικές

παθήσεις και διαταραχές της όρασης, συμπεριλαμβανομένου του καταρράκτη και της

βλάβης του αμφιβληστροειδούς που οδηγεί σε ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς

κηλίδας. Η παρατήρησή μας ότι η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου αυξάνει τα

επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων συμφωνεί και με άλλες μελέτες στις οποίες

χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό μοντέλο του επαγόμενου από το σεληνιώδες νάτριο

καταρράκτη (Gupta et al., 2003; Gupta et al., 2005; Yagci et al., 2006; Elanchezhian

et al., 2007).

Σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις στο ήπαρ, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα εμφανίζει μία τάση αύξησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας και

στο φακό, η οποία όμως δεν είναι στατιστικώς σημαντική. Οι παραπάνω μεταβολές

(αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων, αυξημένη αντιοξειδωτική ισχύς) στον φακό είναι

αποτέλεσμα της απόκρισης του ιστού στο αυξημένο οξειδωτικό στρες ή/και της

επαγόμενης από το σεληνιώδες νάτριο απόκρισης και βρίσκονται σε συμφωνία τόσο

με τις παρατηρήσεις μας στο ήπαρ, όσο και με την εργασία των Zhang et al. (2008).

Στην προαναφερθείσα εργασία τα αυξημένα επίπεδα των ελευθέρων ριζών μετά τη

χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου συνδυάζονται με την ενεργοποίηση των

αμυντικών μηχανισμών και την αύξηση της αντιοξειδωτικής ισχύος των ιστών.

Στην ηλεκτροφόρηση των φακών των φυσιολογικών επίμυων οι κύριες ζώνες

(bands) οι οποίες εμφανίστηκαν ήταν οι κρυσταλλίνες μεταξύ 20 και 28kDa. Στους

φακούς των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο εμφανίστηκε

μία τάση μείωσης των ζωνών 20-28kDa και συγχρόνως μία αύξηση στις πρωτεΐνες

μοριακού βάρους μικρότερου των 19kDa. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν και με

Page 147: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

147

προηγούμενες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε φακούς πειραματόζωων στα

οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες νάτριο (Gupta et al., 2005).

V.1.3.1 Αντιοξειδωτική ικανότητα και λιπιδική υπεροξείδωση των εγκεφαλικών

περιοχών φυσιολογικών επίμυων

Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της

λιπιδικής υπεροξείδωσης των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών των μαρτύρων.

Συγκεκριμένα, οι τιμές της παρεγκεφαλίδας (19,93±2,83 μmol MDA/g πρωτεΐνης)

είναι σημαντικά υψηλότερες από αυτές του εγκεφαλικού φλοιού (13,01±1,39 μmol

MDA/g πρωτεΐνης) και του μεσεγκεφάλου (12,62±1,85 μmol MDA/g πρωτεΐνης).

Από τη στατιστική ανάλυση προέκυψε ότι οι διαφορές στα επίπεδα της λιπιδικής

υπεροξείδωσης είναι στατιστικώς σημαντικές μόνο μεταξύ παρεγκεφαλίδας-φλοιού

(p=0.0055) και παρεγκεφαλίδας- μεσεγκεφάλου (p= 0.0290).

Τα αποτελέσματά μας βρίσκονται σε συμφωνία με βιβλιογραφικές αναφορές οι

οποίες κάνουν λόγο για διαφορετική απόκριση των διαφορετικών εγκεφαλικών

περιοχών στο οξειδωτικό στρες. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η εργασία

των Feoli et al. (2006). Συγκεκριμένα, η παρεγκεφαλίδα έδειξε αυξημένα επίπεδα

υπεροξείδωσης λιπιδίων σε σχέση με τον εγκεφαλικό φλοιό, ενώ τα επίπεδα των

ελευθέρων ριζών ήταν ελαφρώς υψηλότερα στο φλοιό. Τα αποτελέσματα της

εργασίας αυτής συμφωνούν με τη δική μας μελέτη στην οποία η παρεγκεφαλίδα

έδειξε αυξημένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων σε σχέση με τον εγκεφαλικό φλοιό.

Σε μελέτη των Manikandan et al. (2005) σχετικά με την απόκριση των

διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών ζώων-μαρτύρων στο οξειδωτικό στρες, ο

εγκεφαλικός φλοιός και η παρεγκεφαλίδα παρουσίασαν τα ίδια, και υψηλότερα από

τον μεσεγκέφαλο, επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων.

Σε σχετική εργασία των Srivastava et al. (2005), αξιολογήθηκε η απόκριση

εγκεφαλικών περιοχών φυσιολογικών ενήλικων επίμυων έναντι του οξειδωτικού

στρες. Ο μεσεγκέφαλος των φυσιολογικών επίμυων παρουσίασε τις υψηλότερες τιμές

υπεροξείδωσης λιπιδίων, ακολούθησε ο εγκεφαλικός φλοιός και τέλος η

παρεγκεφαλίδα.

Page 148: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

148

Ιστο-ειδίκευση ως προς το βαθμό ευαισθησίας έναντι του οξειδωτικού στρες,

παρατηρήθηκε στον εγκεφαλικό φλοιό και στην παρεγκεφαλίδα φυσιολογικών

επίμυων, σε μελέτη των Candelario- Jalil et al. (2001). Ο φλοιός των φυσιολογικών

επίμυων παρουσίασε υψηλότερα επίπεδα λιπιδικής υπεροξείδωσης, σε σύγκριση με

την παρεγκεφαλίδα.

Από τη μελέτη μας προκύπτει ότι οι εγκεφαλικές περιοχές των επίμυων-μαρτύρων

εμφανίζουν μία ιεραρχία ως προς την ολική αντιοξειδωτική τους ικανότητα.

Συγκεκριμένα, ο εγκεφαλικός φλοιός παρουσιάζει την υψηλότερη αντιοξειδωτική

ικανότητα (8,13±0,62 μmol FeSO4/g ιστού) ακολουθεί η παρεγκεφαλίδα (6,36±0,23

μmol FeSO4/g ιστού) και την χαμηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα από τις τρεις

εγκεφαλικές περιοχές παρουσιάζει ο μεσεγκέφαλος (6,33±0,81 μmol FeSO4/g ιστού).

Σε εργασία των Srivastava et al. (2005), προσδιορίστηκαν οξειδωτικοί δείκτες σε

διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές φυσιολογικών ενήλικων επίμυων. Για το σκοπό

αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο οξειδωτικού στρες επαγόμενο από το ισχυρά

νευροτοξικό εντομοκτόνο εξαχλωρο-κυκλοεξάνιο (HCH). Η ενεργότητα της

δισμουτάσης του σουπεροξειδίου ήταν υψηλότερη στην παρεγκεφαλίδα των

φυσιολογικών επίμυων και ακολούθησε ο εγκεφαλικός φλοιός και ο μεσεγκέφαλος.

Ο μεσεγκέφαλος παρουσίασε τις υψηλότερες τιμές ενεργότητας των ενζύμων

καταλάση, ρεδουκτάση και τρανσφεράση του γλουταθείου, ενώ ο φλοιός

παρουσίασε τις χαμηλότερες τιμές και η παρεγκεφαλίδα ενδιάμεσες. Η ενεργότητα

της υπεροξειδάσης του γλουταθείου ήταν υψηλότερη στο μεσεγκέφαλο και

χαμηλότερη στην παρεγκεφαλίδα των φυσιολογικών ζώων, ενώ ο φλοιός και ο

μεσεγκέφαλος παρουσίασαν σχεδόν ίσες και χαμηλότερες τιμές του ανηγμένου

γλουταθείου σε σχέση με την παρεγκεφαλίδα.

Τα αποτελέσματά μας βρίσκονται σε συμφωνία με βιβλιογραφικές αναφορές οι

οποίες κάνουν λόγο για την ύπαρξη ιστο-ειδίκευσης όσον αφορά στην

αντιοξειδωτική ισχύ των διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών. Η προαναφερθείσα

εργασία των Feoli et al. (2006) αναφέρει σημαντικές διαφορές σε ορισμένους δείκτες

της οξειδωτικής κατάστασης εγκεφαλικών περιοχών φυσιολογικών επίμυων.

Επιπλέον, η ενεργότητα του ενζύμου της υπεροξειδάσης του γλουταθείου ήταν πολύ

ισχυρότερη στον εγκεφαλικό φλοιό σε σχέση με την παρεγκεφαλίδα. Αντίθετα, με

την καταλάση και τη δισμουτάση του σουπεροξειδίου, οι οποίες παρουσίαζαν την

Page 149: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

149

ίδια ενεργότητα και στις δύο εγκεφαλικές περιοχές. Τέλος, η συνολική

αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν υψηλότερη στον εγκεφαλικό φλοιό σε σχέση με την

παρεγκεφαλίδα των επίμυων.

Στη μελέτη των Manikandan et al. (2005) σε ζώα-μάρτυρες και σε ότι αφορά στην

ενεργότητα των ενζύμων δισμουτάση του σουπεροξειδίου, υπεροξειδάση του

γλουταθείου και καταλάση, εμφάνισαν την υψηλότερη ενεργότητά τους στην

παρεγκεφαλίδα, ακολούθως στο μεσεγκέφαλο και την χαμηλότερη στο φλοιό.

Διαφορές παρατηρήθηκαν και στην κατανομή των μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών

στις διάφορες εγκεφαλικές περιοχές των ζώων-μαρτύρων. Υψηλότερη επίπεδα

ανηγμένου γλουταθείου και βιταμινών C και E, παρατηρήθηκαν στο φλοιό, με το

μεσεγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα να ακολουθούν.

Ιστο-ειδίκευση ως προς την κατανομή των ενζυμικών και μη ενζυμικών

αντιοξειδωτικών, αλλά και ως προς το βαθμό ευαισθησίας έναντι του οξειδωτικού

στρες, παρατηρήθηκε στον εγκεφαλικό φλοιό και στην παρεγκεφαλίδα επίμυων με

επαγόμενο από την τοξίνη καϊνικό οξύ (kainate) οξειδωτικό στρες (Candelario- Jalil

et al., 2001). Ο φλοιός των φυσιολογικών επίμυων παρουσίασε υψηλότερα επίπεδα

λιπιδικής υπεροξείδωσης, σε σύγκριση με την παρεγκεφαλίδα, ενώ τα επίπεδα του

ανηγμένου γλουταθείου ήταν σχεδόν τα ίδια στις δύο περιοχές. Το καϊνικό οξύ

προκάλεσε σημαντική μείωση στα επίπεδα του ανηγμένου γλουταθείου στην

παρεγκεφαλίδα, σε αντίθεση με το φλοιό, όπου δεν παρατηρήθηκε στατιστικά

σημαντική αλλαγή. Τέλος, το καϊνικό οξύ δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στην

ενεργότητα της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου ούτε στην παρεγκεφαλίδα, ούτε στο

φλοιό.

Από τις παραπάνω μελέτες είναι προφανές ότι οι διάφορες εγκεφαλικές περιοχές

παρουσιάζουν διαφορετική απόκριση έναντι του οξειδωτικού στρες, καθώς και

διαφορετική αντιοξειδωτική ικανότητα. Οι λόγοι αυτής της ιστο-ειδίκευσης δεν

έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Η διαφορετική απόκριση έναντι του οξειδωτικού στρες

πιθανώς να οφείλεται στο γεγονός ότι κάποιες περιοχές παρουσιάζουν μεγαλύτερο

οξειδωτικό φορτίο ή χαμηλότερη αντιοξειδωτική προστασία, χωρίς αυτό να ισχύει

πάντοτε όπως αποδείχθηκε στα παραπάνω παραδείγματα. Επιπλέον, η ιστο-ειδίκευση

που παρατηρείται ως προς τα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων δεν έχει ακόμη

πλήρως αναλυθεί ως προς τη βιοχημική της βάση. Οι διαφορές στη σύσταση των

Page 150: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

150

λιπαρών οξέων των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών ίσως εξηγεί το πρότυπο της

λιπιδικής υπεροξείδωσης (Srivastava et al., 2005). Συγκεκριμένα, η λευκή ουσία η

οποία είναι πλούσια σε μυελίνη έχει χαμηλότερη περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα

λιπαρά οξέα τα οποία αποτελούν τους κύριους στόχους των ελευθέρων ριζών μεταξύ

των μεμβρανικών λιπιδίων, σε σχέση με τη λευκή ουσία (Svennerholm, 1968).

V.1.3.2 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στον εγκέφαλο

Όσον αφορά στην υπεροξείδωση λιπιδίων, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου

στα πειραματόζωα προκάλεσε αύξηση στην υπεροξείδωση λιπιδίων σε όλες τις υπό

μελέτη εγκεφαλικές περιοχές. Στον εγκεφαλικό φλοιό η αύξηση αυτή ήταν

στατιστικώς σημαντική (66,64%). Στις περιοχές της παρεγκεφαλίδας και του

μεσεγκεφάλου διαπιστώνεται μία τάση αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης μετά

τη χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου, η οποία όμως δεν είναι στατιστικώς

σημαντική. Σε σχετική εργασία αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου

σε επίμυες προκαλεί αύξηση στην υπεροξείδωση λιπιδίων στον εγκέφαλο σε ποσοστό

17% (El-Demardash, 2001). Τα αποτελέσματα της παραπάνω εργασίας βρίσκονται σε

συμφωνία με τα αποτελέσματα της δικής μας μελέτης.

Η προαναφερθείσα εργασία των Nakayama et al. (2007) σχετικά με την πρόσληψη

σεληνίου από τους ιστούς μυών οι οποίοι ακολουθούσαν δίαιτες με διαφορετική

περιεκτικότητα σεληνίου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι υπάρχει μία ιεραρχία των

ιστών στην πρόσληψη του σεληνίου μέσω της δίαιτας. Συγκεκριμένα, οι νεφροί, το

ήπαρ και οι όρχεις παρουσίαζαν υψηλότερη συγκέντρωση σεληνίου σε σχέση με τον

εγκέφαλο και τους μύες, ενώ ο εγκέφαλος και οι μύες παρουσίαζαν μεγαλύτερη

ικανότητα διατήρησης των επιπέδων του σεληνίου όταν μειώνονταν τα

προσλαμβανόμενα μέσω της διατροφής αποθέματα. Μεταξύ των εγκεφαλικών

περιοχών που μελετήθηκαν σχετικά με την προσλαμβανόμενη μέσω δίαιτας

ποσότητα σεληνίου (μεσεγκέφαλος, εγκεφαλικό στέλεχος, φλοιός, παρεγκεφαλίδα,

ιππόκαμπος) η παρεγκεφαλίδα παρουσίαζε την υψηλότερη πρόσληψη σεληνίου σε

σχέση με τους υπόλοιπους εγκεφαλικούς ιστούς.

Page 151: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

151

Τα διαφορετικά ποσοστά αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης στις υπό μελέτη

περιοχές, υποδεικνύουν τη διαφορετική ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες

των διαφορετικών ιστών. Οι λόγοι αυτής της ιστο-ειδίκευσης δεν έχουν πλήρως

διευκρινιστεί. Η διαφορετική απόκριση έναντι του οξειδωτικού στρες πιθανώς να

οφείλεται στο γεγονός ότι κάποιες περιοχές παρουσιάζουν μεγαλύτερο οξειδωτικό

φορτίο ή χαμηλότερη αντιοξειδωτική προστασία, χωρίς αυτό να ισχύει πάντοτε.

Επιπλέον, η ιστο-ειδίκευση που παρατηρείται ως προς τα επίπεδα της υπεροξείδωσης

λιπιδίων δεν έχει ακόμη πλήρως αναλυθεί ως προς τη βιοχημική της βάση. Οι

διαφορές στη σύσταση των λιπαρών οξέων των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών

ίσως εξηγεί το πρότυπο της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Srivastava et al., 2005).

Σε σχετική εργασία των Srivastava et al. (2005), αξιολογήθηκε η απόκριση

διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών επίμυων έναντι του οξειδωτικού στρες. Για το

σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο οξειδωτικού στρες επαγόμενο από το

ισχυρά νευροτοξικό εντομοκτόνο εξαχλωρο-κυκλοεξάνιο (HCH). Όσον αφορά στην

ευαισθησία των εγκεφαλικών περιοχών στο οξειδωτικό στρες, αύξηση της

υπεροξείδωσης λιπιδίων παρατηρήθηκε γενικά σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές, με

υψηλότερη αύξηση στο φλοιό και την παρεγκεφαλίδα, σε σχέση με το μεσεγκέφαλο.

Ιστο-ειδίκευση ως προς το βαθμό ευαισθησίας έναντι του οξειδωτικού στρες,

παρατηρήθηκε στον εγκεφαλικό φλοιό και στην παρεγκεφαλίδα επίμυων με

επαγόμενο από την τοξίνη καϊνικό οξύ οξειδωτικό στρες (Canderino- Jalil et al.,

2001). Tο οξειδωτικό στρες προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση στη λιπιδική

υπεροξείδωση μόνο στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας.

Στην εργασία των Srivastava et al. (2005), στην οποία χρησιμοποιήθηκε ένα

μοντέλο οξειδωτικού στρες επαγόμενο από το ισχυρά νευροτοξικό εντομοκτόνο

εξαχλωρο-κυκλοεξάνιο (HCH), η επίδραση της νευροτοξίνης HCH στα

αντιοξειδωτικά ένζυμα παρουσίασε ιστο-ειδίκευση. Γενικά η ενεργότητα της

δισμουτάσης του σουπεροξειδίου μειώθηκε στον εγκέφαλο των HCH-μοντέλων

επίμυων, με τη μεγαλύτερη μείωση να παρατηρείται στο φλοιό. Αντίθετα, το

οξειδωτικό στρες προκάλεσε σημαντική επαγωγή της ενεργότητας των ενζύμων

καταλάση, υπεροξειδάση του γλουταθείου, ρεδουκτάση και τρανσφεράση του

γλουταθείου σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές. Η αύξηση της ενεργότητας αυτών των

Page 152: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

152

ενζύμων ήταν υψηλότερη στο φλοιό, ακολούθως στην παρεγκεφαλίδα και

χαμηλότερη στο φλοιό. Τέλος, σημαντική μείωση στα επίπεδα του ανηγμένου

γλουταθείου παρατηρήθηκε στα HCH-μοντέλα επίμυων, με τη μέγιστη μείωση να

παρατηρείται στον εγκεφαλικό φλοιό.

Στην δική μας εργασία, η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα

δεν επηρέασε σημαντικά την αντιοξειδωτική ισχύ των υπό μελέτη εγκεφαλικών

περιοχών, ούτε τη συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος στις ίδιες περιοχές.

V. 2 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα

Στις μέρες μας όλα και πιο συχνά χρησιμοποιούνται διάφορα φαρμακευτικά φυτά

ως μία μορφή προληπτικής ιατρικής. Οι ευεργετικές ιδιότητες των φυτών ώθησαν τη

σύγχρονη φαρμακολογία να στραφεί προς την απομόνωση και ταυτοποίηση των

βιοδραστικών συστατικών από διάφορα φυτικά είδη, με αποτέλεσμα ένα μεγάλο

μέρος της έρευνας σχετικά με την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών σκευασμάτων να

εντοπίζεται προς αυτή την κατεύθυνση. Συχνά η αποτελεσματικότητα ενός φυτικού

εκχυλίσματος οφείλεται στη συνεργατική αλληλεπίδραση διαφόρων συστατικών του

και όχι σε κάποιο απομονωμένο συστατικό.

Τα τελευταία χρόνια ένα μεγάλο κομμάτι της έρευνας έχει στραφεί προς τη μελέτη

των καροτενοειδών, στα οποία έχει αποδοθεί αντιοξειδωτική δράση (κυρίως

προστατευτικός ρόλος έναντι κάποιων μορφών καρκίνου και καρδιαγγειακών

παθήσεων). Η ικανότητα των καροτενοειδών να προστατεύουν τα κύτταρα και τους

ιστούς, δεσμεύοντας μόρια οξυγόνου και ελεύθερες ρίζες, είναι άμεσα συνδεδεμένη

με τη συζυγία των διπλών δεσμών (Rodriguez- Amaya, 2001). Χαρακτηριστικό

παράδειγμα της αντιοξειδωτικής δράσης των καροτενοειδών αποτελεί το λυκοπένιο,

το οποίο εμποδίζει την οξείδωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL),

μειώνοντας έτσι τις πιθανότητες ανάπτυξης αθηροσκλήρωσης και καρδιακών

επεισοδίων. Παρόμοιο προστατευτικό ρόλο παρουσιάζουν η λουτεΐνη και η

ζεαξανθίνη οι οποίες έχουν την ικανότητα εκκαθάρισης των ελευθέρων ριζών, ενώ

προστατεύουν τον οφθαλμό από την υπεριώδη ακτινοβολία (Trevithick et al., 2006).

Η λουτεΐνη και η ζεαξανθίνη είναι τα μόνα καροτενοειδή τα οποία βρίσκονται

Page 153: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

153

αποθηκευμένα στον αμφιβληστροειδή του ματιού (Fernandez & Afshari, 2008). Δύο

πρόσφατες μελέτες αναφέρονται στον προστατευτικό ρόλο των ξανθοφυλλών έναντι

του καταρράκτη. Η πρώτη συνδέει την πρόσληψη υψηλών ποσοτήτων λουτεΐνης και

ζεαξανθίνης με τον μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης καταρράκτη (Vu et al., 2006). Η

δεύτερη αναφέρει 75% μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης καταρράκτη στα άτομα με

αυξημένα ποσοστά ζεαξανθίνης στο πλάσμα, χωρίς να κάνει λόγο για τα ποσοστά της

λουτεΐνης (Delcort et al., 2006).

Διάφορα ουσίες ή φυτικά εκχυλίσματα με αντιοξειδωτική δράση έχουν δοκιμαστεί

για την επίδρασή τους στον καταρράκτη, στο μοντέλο επαγωγής καταρρακτογένεσης

με τη χρήση σεληνιώδους νατρίου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το

λυκοπένιο (Gupta et al., 2003).

Στην παρούσα μελέτη μελετήθηκε η επίδραση στον καταρράκτη του είδους Crocus

sativus του γένους Crocus. Ο Crocus sativus είναι ένα φυτικό είδος που απαντάται

στην ελληνική χλωρίδα και είναι γνωστό για τις αντιοξειδωτικές του ιδιότητες, το

οποίο λόγω των συστατικών του έχει ιδιαίτερο φαρμακολογικό και διατροφικό

ενδιαφέρον. Τα κύρια συστατικά των στύλων του Crocus sativus (κροκίνες) ανήκουν

στην οικογένεια των καροτενοειδών.

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωά μας

δεν προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στο σωματικό τους βάρος

τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία

χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο.

V. 2.1 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο ήπαρ

H χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα

προκάλεσε αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας σε όλες τις υπό μελέτη περιοχές,

τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία

χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο. Το ποσοστό της αύξησης σε σχέση με τους

μάρτυρες στο ήπαρ ισούται με 39%, ενώ η αύξηση είναι στατιστικώς σημαντική. Τα

αποτελέσματά μας συμφωνούν με μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με

την αντιοξειδωτική δράση του C.sativus (Hosseinzadeh et al., 2005) και

Page 154: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

154

αποδεικνύουν τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων του

C.sativus.

Η χορήγηση εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα δεν

προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη συγκέντρωση του

ασκορβικού οξέος στο ήπαρ, σε σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας στην οποία

χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο.

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωά μας

προκάλεσε μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων στο ήπαρ σε σχέση με

τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο και όχι το

εκχύλισμα του κρόκου. Η μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων που

παρατηρήθηκε ήταν στατιστικώς σημαντική, ενώ το ποσοστό της μείωσης ήταν

41,38%.

Επιπλέον, στο ήπαρ το εκχύλισμα του κρόκου μείωσε τα επίπεδα της

υπεροξείδωσης λιπιδίων σε σχέση και με τους μάρτυρες, χωρίς η μείωση αυτή να

είναι στατιστικώς σημαντική. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν την

αντιοξειδωτική δράση των συστατικών των στύλων του C.sativus έναντι του

οξειδωτικού στρες και των επιπτώσεών του.

V. 2.2 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο φακό

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα δεν

προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή της αντιοξειδωτικής ικανότητας

ή της συγκέντρωσης του ασκορβικού οξέος στο φακό, τόσο σε σχέση με τους

μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο

σεληνιώδες νάτριο.

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωά μας

προκάλεσε μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε όλους τους υπό

μελέτη ιστούς σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες

νάτριο και όχι το εκχύλισμα του κρόκου. Το ποσοστό της μείωσης στο φακό ήταν

Page 155: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

155

33,76%, σε σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας στην οποία χορηγήθηκε μόνο

σεληνιώδες νάτριο, ο μικρός αριθμός δειγμάτων όμως δεν το καθιστά στατιστικώς

σημαντικό. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν την αντιοξειδωτική δράση

των συστατικών των στύλων του C.sativus έναντι του οξειδωτικού στρες και των

επιπτώσεών του.

Σε σχετική εργασία των Gupta et al. (2003), στην οποία χρησιμοποιήθηκε το

επαγόμενο από το σεληνιώδες νάτριο μοντέλο καταρράκτη, η χορήγηση

εκχυλίσματος λυκοπενίου στα νεογνά επίμυων αύξησε σημαντικά την αντιοξειδωτική

ισχύ του φακού των πειραματόζωων και μείωσε τα επίπεδα της λιπιδικής

υπεροξείδωσης, σε σχέση με τους επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε μόνο το

σεληνιώδες νάτριο. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα ανηγμένου

γλουταθείου, αυξημένη ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων δισμουτάση του

σουπεροξειδίου, καταλάση και τρανσφεράση του γλουταθείου, ενώ μειώθηκαν

σημαντικά τα επίπεδα της MDA. Τα αποτελέσματα της παραπάνω εργασίας

συμφωνούν με τη δική μας μελέτη σχετικά με την αντιοξειδωτική δράση των

καροτενοειδών στο φακό των επίμυων του επαγόμενου από το σεληνιώδες νάτριο

μοντέλου καταρράκτη.

Όπως προαναφέρθηκε, οι κύριες ζώνες (bands) οι οποίες εμφανίστηκαν στην

ηλεκτροφόρηση των φακών των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες

νάτριο εμφανίστηκε μία τάση μείωσης των ζωνών 20-28kDa και συγχρόνως μία

αύξηση στις πρωτεΐνες μοριακού βάρους μικρότερου των 19kDa, σε σχέση με τους

μάρτυρες. Στους φακούς της ομάδας των πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε το

εκχύλισμα των στύλων του κρόκου οι ζώνες οι οποίες εμφανίστηκαν στην

ηλεκτροφόρηση των φακών ήταν παρόμοιες με αυτές των φακών των μαρτύρων. Τα

αποτελέσματά μας συμφωνούν και με προηγούμενες μελέτες που έχουν

πραγματοποιηθεί σε φακούς πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε σεληνιώδες

νάτριο (Gupta et al., 2005).

Page 156: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

156

V. 2.3 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στον εγκέφαλο

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα

προκάλεσε αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας σε όλες τις υπό μελέτη

εγκεφαλικές περιοχές, τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα

πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο. Το ποσοστό της

αύξησης στον εγκεφαλικό φλοιό σε σχέση με τους μάρτυρες ισούται με 20,91%.

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα δεν

προκάλεσε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή στη συγκέντρωσης του

ασκορβικού οξέος στις εγκεφαλικές περιοχές, τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο

και σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο.

Από τα αποτελέσματά μας διαπιστώνουμε ότι το εκχύλισμα των στύλων του

C.sativus ενίσχυσε το αντιοξειδωτικό σύστημα όλων των υπό μελέτη εγκεφαλικών

περιοχών, παρουσιάζοντας όμως κάποια ιστοειδικότητα. Σε εργασία των Subathra et

al. (2005) στην οποία καταναλώθηκε εκχύλισμα του φυτού Centella asiatica από

νεαρούς επίμυες για διάστημα 60 ημερών, διαπιστώθηκε μία τάση ενίσχυσης του

αντιοξειδωτικού συστήματος του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας, του

ραβδωτού, του υποθαλάμου και του ιπποκάμπου. Αν και οι μεταβολές δεν ήταν

στατιστικώς σημαντικές, ο εγκεφαλικός φλοιός παρουσίασε υψηλότερα ποσοστά

μεταβολής ορισμένων αντιοξειδωτικών δεικτών με την πάροδο της ηλικίας,

αποκαλύπτοντας την αυξημένη ευαισθησία αυτής της περιοχής έναντι του

οξειδωτικού στρες. Στην ίδια μελέτη η περιοχή της παρεγκεφαλίδας παρουσιάζει μία

ενδιάμεση ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα αυτά

συμφωνούν και με τη δική μας μελέτη στην οποία η χορήγηση του εκχυλίσματος των

στύλων του C.sativus στα πειραματόζωα προκάλεσε μία τάση αύξησης της ολικής

αντιοξειδωτικής ικανότητας του εγκεφαλικού φλοιού πολύ υψηλότερη σε σχέση με

την παρεγκεφαλίδα.

Μελέτη των Florek et al. (2005), στην οποία μελετήθηκε η επίδραση του

φλαβονοειδούς rutin στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα ιστών φυσιολογικών

επίμυων, έδειξαν ότι ο εγκεφαλικός ιστός των ζώων-μαρτύρων παρουσίασε την

υψηλότερη ολική αντιοξειδωτική ικανότητα σε σχέση με το ήπαρ, τους νεφρούς και

Page 157: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

157

τους πνεύμονες. Τα παραπάνω αποτελέσματα πιθανώς να οφείλονται στο γεγονός ότι

ο εγκέφαλος έχει αναπτύξει ισχυρότερο ενδογενές αντιοξειδωτικό σύστημα σε σχέση

με τους περιφερειακούς ιστούς και αποκρίνεται λιγότερο στις μεταβολές της

αντιοξειδωτικής του κατάστασης. Στην ίδια μελέτη αναφέρεται ότι την υψηλότερη

μεταβολή της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητάς τους παρουσίασαν το ήπαρ και οι

νεφροί. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν και με τη δική μας μελέτη, στην

οποία η περιοχή του ήπατος παρουσίασε την υψηλότερη αύξηση της ολικής

αντιοξειδωτικής ικανότητας, σε σχέση με τις εγκεφαλικές περιοχές που μελετήθηκαν,

τόσο μετά τη χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου (28,15%), όσο και μετά τη

χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus, όπου το ποσοστό της

αύξησης ισούται με 39%.

Η χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στα πειραματόζωά μας

προκάλεσε μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε όλους τους υπό

μελέτη ιστούς σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες

νάτριο και όχι το εκχύλισμα του κρόκου. Στον εγκεφαλικό φλοιό η μείωση των

επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων που παρατηρήθηκε ήταν στατιστικώς

σημαντική. Συγκεκριμένα, το ποσοστό της μείωσης στον εγκεφαλικό φλοιό σε σχέση

με τα πειραματόζωα της ομάδας στην οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδες νάτριο,

ήταν 26,06%. Επιπλέον, στις περιοχές της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου το

εκχύλισμα του κρόκου μείωσε τα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε σχέση και

με τους μάρτυρες, χωρίς η μείωση αυτή να είναι στατιστικώς σημαντική.

Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματά μας, ο εγκεφαλικός φλοιός παρουσίασε

υψηλότερη τάση αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης μετά τη χορήγηση του

σεληνιώδους νατρίου (66,64%) σε σχέση με την περιοχή της παρεγκεφαλίδας.

Επίσης, μετά τη χορήγηση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus το ποσοστό

της μείωσης της λιπιδικής υπεροξείδωσης στον εγκεφαλικό φλοιό ήταν 26,06% σε

σχέση με τα πειραματόζωα της ομάδας στην οποία χορηγήθηκε μόνο σεληνιώδους

νατρίου, ενώ στην παρεγκεφαλίδα το ποσοστό της μείωσης ήταν 21,57%. Οι

παραπάνω παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ο εγκεφαλικός φλοιός είναι μία πιο

ευμετάβολη περιοχή, με μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες σε

σχέση με την περιοχή της παρεγκεφαλίδας και βρίσκονται σε απόλυτη συμφωνία με

τα αποτελέσματα της μελέτης των Subathra et al. (2005).

Page 158: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

158

Έρευνες αναφορικά με τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των

στιγμάτων του Crocus sativus, αναφέρουν ότι παρουσιάζει προστατευτική δράση

έναντι του οξειδωτικού στρες (Martinez-Tome et al., 2001). Σε άλλη μελέτη η

προστασία ηπατοκυττάρων επίμυων από τις επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες

αποδόθηκε στην αντιοξειδωτική δράση της κροκετίνης (Giaccio M., 2004). Επιπλέον,

μελέτη σε επίμυες με εγκεφαλική ισχαιμία στους οποίους χορηγήθηκε σαφρανάλη

από στύλους του Crocus sativus αποδεικνύει ότι η σαφρανάλη εμφανίζει

προστατευτική δράση έναντι του οξειδωτικού στρες στον ιππόκαμπο των

πειραματόζωων (Hosseinzadeh et al., 2005).

Πρόσφατες in vitro μελέτες, αναφορικά με τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες των

συστατικών των στιγμάτων του Crocus sativus, αναφέρουν ότι το εκχύλισμα των

στιγμάτων σε μεθανόλη εμφανίζει υψηλή αντιοξειδωτική δράση και συγκεκριμένα, η

κροκίνη παρουσίασε υψηλή ικανότητα σάρωσης των ελευθέρων ριζών, ενώ η

σαφρανάλη παρουσίασε χαμηλότερη αντιοξειδωτική δράση σε σχέση με την κροκίνη

(Assimopoulou et al., 2005).

Επιπλέον, σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας που μελετήθηκαν in

vitro οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus σε

σύγκριση με εκχυλίσματα τομάτας και καρότου αποδείχθηκε ότι το εκχύλισμα των

στύλων του C.sativus παρουσιάζει υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα σε σχέση με

τα εκχυλίσματα της τομάτας και του καρότου (Papandreou et al., 2006).

Τέλος, εκτός από τα καροτενοειδή, αντιοξειδωτική δράση εμφανίζουν και ορισμένα

φλαβονοειδή των στύλων του Crocus sativus, όπως η καιμπφερόλη, η οποία

συμβάλλει στη δέσμευση ελευθέρων ριζών στον οργανισμό και στην απελευθέρωση

οξυγόνου (Abe and Sato, 2000).

Page 159: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

159

Συμπεράσματα

Οι εγκεφαλικές περιοχές των επίμυων-μαρτύρων εμφανίζουν μία ιεραρχία ως

προς την ολική αντιοξειδωτική τους ικανότητα, καθώς και ως προς τα

επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης.

Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στους επίμυες επάγει το οξειδωτικό

στρες (προ-οξειδωτικές ιδιότητες). Αποτέλεσμα του επαγομένου οξειδωτικού

στρες αποτελεί η εμφάνιση του καταρράκτη στα πειραματόζωα, καθώς και τα

αυξημένα επίπεδα λιπιδικής υπεροξείδωσης.

Τα διαφορετικά ποσοστά αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης στις υπό

μελέτη περιοχές, υποδεικνύουν τη διαφορετική ευαισθησία έναντι του

οξειδωτικού στρες των διαφορετικών ιστών.

Το σεληνιώδες νάτριο παρουσιάζει και αντιοξειδωτική δράση μέσω της

ενίσχυσης των αμυντικών μηχανισμών του οργανισμού (ενίσχυση

αντιοξειδωτικής ισχύος).

Η χορήγηση του εκχυλίσματος κρόκου εμπόδισε σε μεγάλο ποσοστό την

εμφάνιση του καταρράκτη.

Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος του Crocus sativus

υποδεικνύονται από την από την μείωση των επιπέδων της λιπιδικής

υπεροξείδωσης όλων των υπό μελέτη ιστών.

Page 160: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

160

VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Abdullaev F.I. Biological effects of saffron. Biofactors 1993, 4, 83-86.

Abdullaev F.I. Crocus sativus against cancer. Archives of Medical Research, 34:

354, 2003.

Abdullaev F. Cancer Chemopreventive and Tumpral Properties of saffron

(Crocus sativus L.) Exp. Biol. Med. (Maywood), 227(1):20-5, 2002.

Abe K, Saito H. Effects of Saffron Extract and its Constituent Crocin on

Learning, Behavior and Long-term Potentiation. Phytother. Res. 14(3):149-152,

2000.

Ahmad A.S., Ansari M.A., Ahmad M, Saleem S, Yousuf S, Hoda M.D, Islam F.

Neuroprotection by crocetin in a hemi-parkinsonian rat model. Pharmacology,

Biochemistry and Behavior 81 (2005) 805-813.

Agarwal R., Chase S.D., Rapid fluorimetric-liquid chromatographic

determination of malondialdehyde in biological samples. Journal of

chromatography B, 775 (2002) 121-126.

Alamdari D.H., Kostidou E, Paletas K, Sarigianni M, Konstas A.G.P., Karapiperidou

A, Koliakos G. High sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

method for measuring protein carbonyl in samples with low amounts of protein.

Free Rad. Biol. Med. 39 (2005) 1362-1367.

Assimopoulou AN, Sinakos Z, Papageorgiou VP. Radical Scavening Activity of

Crocus sativus L. Extract and its Bioactive Constituents. Phytotherapy Research

19, 997-1000 (2005).

Badcock N.R., Zoanetti G.D., Martin E.S. Nonchromatographic assay for

malondialdehyde-thiobarbituric acid adduct with HPLC equivalence. Clinical

Chemistry 43: 1655-1657 (1997).

Page 161: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

161

Badrakhan C.D., Petrat F, Holzhauser M, Fuchs A, Lomonosova E.E., De Groot H,

Kirsch M. The methanol method for quantification of ascorbic acid in biological

samples. J. Biochem. Biophys. Methods 58 (2004) 207-218.

Bartlett H. & Eperjesi F. Possible contraindications and adverse reactions

associated with the use of ocular nutritional supplements. Opthalm. Physiol. Opt.

2005; 25: 179-194.

Benzie I.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure

of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal. Biochem. 1996; 239(1):70-76.

Bhuyan KC, Bhuyan DK. Lipid peroxidation in cataract of the cataract. Life Sci.

38, 1463-1471 (1986).

Boscia F, Grattagliano I, Vendemiale G, Micelli-Ferrari T, Altomare E. Protein

oxidation and lens opacity in humans. Invest. Opthalm. Vis. Sci. 41: 2461-2465,

2000.

Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

Biochem. 72: 248-254 (1976).

Bunce GE, Kinoshita J, Horwitz J. Nutritional factors in cataract. Annu. Rev.Nutr.

1990; 10: 233-254.

Buss H, Chan T.P., Sluis K.B., Domigan M, Winterbourn C.C. Protein carbonyl

measurement by a sensitive ELISA method. Free Radical Biology & Medicine,

Vol.23, No 3, pp.361-366 (1997).

Candelario-Jalil E, Al-Dalain S.M., Castillo R, Martinez G, Leon-Fernandez O.S.

Selective Vulnerability to Kainate-induced Oxidative Damage in Different Rat

Brain Regions. J. Appl. Toxicol. 21, 403-407 (2001).

Page 162: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

162

Carbonneau M.A. et al, Free and bound malondialdehyde measured as

thiobarbituric acid adduct by HPLC in serum and plasma. Clin.Chem. 37/8,

1423-1429 (1991).

Chesan-Taber L, Willet WC, Seddon JM. A prospective study of vitamin

supplement intake and cataract extraction among U.S. women. Epidemiology

1999; 10: 679-684.

Chirico S, Smith C, Marchant C, Mithison MJ, Halliwell B. Lipid peroxidation in

hyperlipidemic patients. A study of plasma using an HPLC-based thiobarbituric

acid test. Free Radical Res. 1993; 19: 51-57.

Choy C.K.M, Benzie I.F.F, Cho P. Ascorbic acid concentration and total

antioxidant activity of human tear fluid measured using the FRASC assay.

Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 2000; 41:3293-3298.

Chryssanthi D.G., Lamari F.N., Iatrou G., Pylara A., Karamanos N.K., Cordopatis P.

Inhibition of breast cancer cell proliferation by style constituents of different

Crocus species. Anticancer Research 27: 357-362 (2007).

Chylack LT Jr, Khu PM. Subjective classification and objective quantification of

human cataract. Principles and Practise of Opthalmology. (Albert DM & Jakobiec

FA, eds) pp. 591-113 (1994).

Cronin J.R. Dietary selenium: Elemental Nutrition for Muscles Immunity, Well-

Being and Cancer Prevention. Alt.Complement. Therap. 2000; (6): 342-346.

Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl

groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta 329 (2003) 23-38.

David L.L., Shearer T.R. State of sulphydryl in selenite cataract. Toxicol. Appl.

Pharmacol. 1984; 74:109-115.

Dei R, Takeda A, Niwa H, Li M, Nakagomi Y, Watanabe M, Inagaki T, Washimi Y,

Yasuda Y, Horie K, Miyata T, Sobue G. Lipid peroxidation and advanced

Page 163: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

163

glycation end products in the brain in normal aging and in Alzheimer's disease.

Acta Neuropathol. (Berl.) 104 (2002) 113.

De Jong WW, Mulders JWM, Voorter CEM, Berbers GAM, Hoekman WA,

Bloemendal H. Post-translational modification of eye lens crystallins, crosslinking

phosphorylation and deamination. Advances in Post-translational Modification of

Proteins and Aging (Zappia V, Galletti P, Porta R, Wold F. eds) pp.95-108 (1988).

Delcort C, Carriere I, Delage M. Plasma lutein and zeaxanthin and other

carotenoids as modifiable risk factors for age-related maculopathy and cataract:

the POLA study. Invest. Ophthalmol. Vis.Sci. 2006; 47: 2329-2335.

Del Rio D, Stewart A.J, Pellegrini N. A review of recent studies on

malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress.

Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases (2005) 15, 316-328.

Del Rio D, Pellegrini N, Colombi B, Bianchi M, Serafini M, Torta F, Tegoni M,

Musci M, Brighenti F. Rapid Fluorimetric Method to Detect Total Plasma

Malondialdehyde with Mild Derivatization Conditions. Clinical Chemistry 49,No

4, 2003.

Dierckx N, Horvath G, Van Gils C, Vertomment J, Van de Vliet, De Leeuv I,

Manuel-y-Keony B. Oxidative stress status in patients with diabetes mellitus :

relationship to diet. European Journal of Clinical Nutrition (2003) 57, 999-1008.

Duhaiman AS. Glycation of human lens proteins from diabetic and (nondiabetic)

senile cataract patients. Glycoconj. J. 12: 618-621, 1995.

Elanchezhian R, Ramesh E, Sakthivel M, Isai M, Geraldine P, Rajamohan M,

Jedudasan N.C., Thomas P.A. Acetyl-L-Carnitine Prevents Selenite-Induced

Cataractogenesis in an Experimental Model. Current Eye Research, 32: 961-971

(2007).

El-Demerdash. Effects of Selenium and Mercury on the enzymatic activities and

lipid peroxidation in brain, liver and blood of rats. J Environ.Sci.Health B 36(4):

489-499 (2001).

Page 164: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

164

Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch.Biochem.Biophys. 82 (1):70-7, 1959.

El-Sayed WM, Aboul-Fadl T, Lamb JG, Roberts JC, Franklin MR. Effect of

selenium-containing compounds on hepatic chemoprotective enzymes in mice.

Toxicology 220: 179-188 (2006).

Emirit J. et al. Neurodegenarative diseases and oxidative stress. Biomedicine &

Pharmacotherapy. 58: 39-46 (2004).

Escribano J, Alonso G.L, Coca-Prados M, Fernández A. Crocin, saffranal and

picrocrocin from saffron (Crocus sativus L.) inhibit the growth of human cancer

cells in vitro. Cancer Lett. 27; 100(1-2):23-30, 1996.

Esterbauer H, Eckl P, Ortner A. Possible mutagens dirived from lipids and lipid

precursors. Mutat. Res.238:223-233 (1990).

Feksa LR, Latini A, Cielo-Rech V, Bartels-Feksa P, Walterreith-Koch GD, Arevalo-

Amaral MF, Leipnitz G, Dutra-Filo CS, Wajner M, Duval Wannmacher CM.

Tryptophan administration induces oxidative stress in brain cortex of rats.

Metab. Brain Dis. (2008) 23: 221-233.

Feoli A.M., Siqueira I.R., Almeida L, Tramontinaa A.C., Vanzellac C, Sbarainic S,

Schweigert I.D., Netto C.A., Marcos L, Perry S, Goncalves C.A. Effects of protein

malnutrition on oxidative status in rat brain. Nutrition 22 (2006) 160-165.

Fernandez M.M, Afshari N.A. Nutrition and the prevention of cataracts. Current

Opinion in Ophthalmology. 19:66-70 (2008).

Florek E, Ignatowicz E, Wrzosek J, Piekoszewski W. Effect of rutin on total

antioxidant status of rats exposed to cigarette smoke. Pharmacological Reports

57: 84-89 (2005).

Floyd RA, Hensley K. Oxidative stress in brain aging. Implications for

theurapeutics of neurodegenarative diseases. Neurobiol. Aging 23 (5): 795-807

(2002).

Page 165: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

165

Forceville X. et al. Effects of high doses of selenium, as sodium selenite, in septic

shock: a placebo-controlled, randomized, double-blind, phase II study. Critical

Care, Vol.11, No 4.

Ganea E and Harding J.J. Glutathione-Related Enzymes and the Eye. Current Eye

Research, 31:1-11, 2006.

Garner MH, Spector A. Sulfur oxidation in selected human cortical cataracts and

nuclear cataracts. Exp. Eye Res. 31, 361-369 (1980).

Garner MH, Spector A. Selective oxidation of cysteine and methionine in normal

and senile cataractous lenses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1274-1277 (1980).

Garner MH, Garner WH, Spector A. The effect of H2O2 on Na/K- ATPase. Invest.

Opthalm.Vis. Sci. 22, 34.

Giaccio M. Crocetin from saffron: an active component of an ancient spice. Crit.

Rev. Food Sci. Nutr., 44(3):155-172 (2004).

Giblin FJ. Glutathione: a vital lens antioxidant. J Ocul Pharmacol Ther. 2000;

16(2): 121-135.

Giblin F.J., Reddan J.R., Schrimscher L, Dziedzic D.C., Venkat R.N. The Relative

Roles of the Glutathione Redox Cycle and Catalase in the Detoxification of H2O2

by Cultured Rabbit Lens Epithelial Cells. Exp. Eye Res. (1990) 50, 795-804.

Giblin F.J., Chakrapani B., Reddy V.N. Glutathione and lens epithelial function.

Investigative Opthalmology (1976), Vo 15, No 5.

Gonenc A, Ozkan Y, Torun M, Simsek B. Plasma malondialdehyde (MDA) levels

in breast and lung cancer patients. Journal of Clinical and Therapeutics (2001) 26,

141-144.

Page 166: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

166

Gupta S.K., Srivastava S., Trivedi D., Joshi S., Halder N. Ocimum sanctum

Modulates Selenite-Induced Cataractogenic Changes and Prevents Rat Lens

Opacification. Current Eye Research, 30:583-591, 2005.

Gupta S.K., Trivedi D., Srivastava S., Joshi S., Halder N., Verma S.D. Lycopene

Attenuates Oxidative Stress Induced Experimental Cataract Development: An

In Vitro and In Vivo Study. Nutrition 19:794-799, 2003.

Haque A.M., Hashimoto M., katakura M., Tanabe Y., Hara Y., Shido O. Long-term

administration of green tea catechins improves spatial cognition learning ability

in rats. J Nutr. 136: 1043-1047, 2006.

Harman (1956). Aging, a theory based on free radical and radiation on

Chemistry. J Gerontol. 11: 298-300.

Hayes JD, Flanagan JU, Jowsey IR. Glutathione transferases. Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 2005; 45: 51-88.

Hejtmancik JF, Piatigorsky J. Molecular biology of the lens. Principles and Practise

of Opthalmology. (Albert DM & Jakobiec FA, eds) pp. 1249-1255 (1994).

Hockwin O, Ohrloff C. The eye in the elderly: lens. Geriatrics (Platt D. ed.) pp.

373-424 (1984).

Hosseinzadeh H. & Sadeghnia H.R. Safranal, a constituent of Crocus sativus

(saffron), attenuated cerebral ischemia induced oxidative damage in rat

hippocampus. J Pharmaceut. Sci.8 (3): 394-399, 2005.

Isik B, Ceylan A, Isik R. Oxidative stress in smokers and nonsmokers. Inhal.

Toxicol. 2007; 19: 767-769.

Jentzsch A.M., Bachmann H., Furst P., Bielsalski H.K. Improved analysis of

malondialdehyde in human body fluids. Free Radic. Biol. Med. 20: 251-256, 1996.

Katakura K, Kishida K, Hirano H. Changes in rat lens proteins and glutathione

reductase activity with advancing age. Int J Vitam Nutr Res. 2004; 74(5): 329-333.

Page 167: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

167

Katalinic V. et al. Gender differences in antioxidant capacity of rat tissues

determined by 2, 2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonate; ABTS) and

ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays. Comparative Biochemistry and

Physiology, Part C 140, 2005, 47-52.

Keller JN, Gee J, Ding Q. The proteasome in brain aging. Ageing Res. Rev. 1

(2002): 279-293.

Keller JN, Hanni KB, Markesbery WR. Possible involvement of proteasome

inhibition in aging: implications for oxidative stress. Mechanisms of Ageing and

Development 113(1): 61-70, 2000.

Kim T, Jeong D, Yun BY, Kim IY. Dysfunction of rat liver mitochondria by

selenite: induction of mitochondria permeability transition through thiol-

oxidation. Biochemical & Biophysical Research Communications 294: 1130-1137

(2002).

Kobayashi S, Roy D, Spector A. Sodium/potassium ATPase in normal and

cataractous human lenses. Curr. Eye Res. 2,327-344 (1983).

Kupfer C, Underwood B, Gillen T. Leading causes of visual impairment world

wide. Principles and Practise of Opthalmology. (Albert DM & Jakobiec FA, eds) pp.

1249-1255 (1994).

Kupfer C. The conquest of cataract: a global challenge. Trans. Opthalmol.

Soc.U.K. 104, 1-10.

Kwan M, Ninikoshi J, Hunt TK. In vivo measurements of oxygen tension in the

cornea, aqueous humor and anterior lens of the open eye.

Invest.Opthalmol.Vis.Sci. 11, 108-114.

Kyselova Z, Garcia S.J, Gajdosikova A, Gajdosik A, Stefek M. Temporal

relationship between lens protein oxidation and cataract development in

Streptozotocin-induced diabetic rats. Physiological Research 54: 49-56, 2005.

Page 168: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

168

Laguerre M, Lecomte J, Villeneuve P. Evaluation of the ability of antioxidants to

counteract lipid oxidation: Existing methods, new trends and challenges.

Progress in Lipid Research 46 (2007) 244-282.

Lee W, Roberts S.M, Labbe R.F. Ascorbic acid determination with an automated

enzymatic procedure. Clinical Chemistry 43:1; 154-157 (1997).

Letavayová L, Vlčková V, Brozmanová J. Selenium: from cancer prevention to

DNA damage. Toxicology 227 (2006) 1-14.

Levine R.L., Garland D, Oliver C.N., Amicia A, Climent I, Lenz A.G., Ahn B.W.,

Shaltiel S, Stadtman E.R. Determination of carbonyl content in oxidatively

modified proteins. Methods Enzymol. 186:464-478, 1990.

Linardaki Ζ, Papandreou Μ.Α., Iatrou G, Lamari F.N., Margarity M.

Consumption of tea of Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca alters

the antioxidant properties of adult mouse brain in a region-specific way.

(2008), υπό δημοσίευση.

Li Su, Ming Wang, Shu-Ting Yin, Hui-Li Wang, Liang Chen, Li-Guang Sun, Di-Yun

Ruan. The interaction of selenium and mercury in the accumulations and

oxidative stress of rat tissues. Exotoxicology & Environmental Safety (2007).

Lou M.F. Redox regulation in the lens. Retinal and Eye Research 22 (2003) 657-

682.

Lykkesfeldt J. Determination of malondialdehyde as dithiobarbituric acid adduct

in biological samples by HPLC with fluorescence detection: comparison with

ultraviolet-visible spectrophotometry. Clinical Chemistry 47, No 9 (2001).

Manikandan S, Srikumar R, Jeya- Parthasarathy N, Sheela-Devi R. Protective Effect

of Acorus calamus LINN on Free Radical Scavengers and Lipid Peroxidation in

Discrete Regions of Brain against Noise Stress Exposed Rats. Biol. Pharm. Bull.

28(12) 2327-2330 (2005).

Page 169: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

169

Mariani E., Polidori M.C., Cherubini A., Mecocci P., Oxidative stress in brain

aging, neurodegenerative and vascular diseases: An overview. Journal of

Chromatography B, 827 (2005) 65-75.

Marksberry WR, Carney JM. Oxidative alternations in Alzheimer’s disease.

Pathol.9: 133-146 (1999).

Masella R. et al. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in

biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes.

Journal of Nutritional Biochemistry 16, 2005, 577-586.

Mecocci P, Polidori MC, Ingegni T, Cherubini A, Chionne F, Cecchetti R, Senin U.

Oxidative damage to DNA in lymphocytes from AD patients. Neurology 51:1014-

1017 (1998).

Mecocci P, MacGarvey U, Beal MF. Oxidative damage to mitochondrial DNA is

increased in Alzheimer’s disease. Annals of Neurology 36(5): 747-751 (1994).

Moeslinger T, Brunner M, Volf I, Spieckermann P.G. Spectrophotometric

Determination of Ascorbic Acid and Dehydroascorbic Acid. Clin. Chem. 41/8,

1177-1181 (1995).

Morrow J.D. & Roberts. L.J. Mass spectrometry quantification of F2-isoprostanes

in biological fluids & tissues as measure of oxidant stress. Methods Enzymol.,

1999, 300:3-12.

Mutlu-Turkoglu U, Ilhan E, Oztezcan S, Kuru A, Aykac-Toker G, Uysal M. Age-

related increase in plasma malondialdehyde and protein carbonyl levels and

lymphocyte DNA damage in elderly subjects. Clinical Biochemistry 36 (2003)

397-400.

Nakayama A, Hill KE, Austin LM, Motley AK, Burk RF. All Regions of Mouse

Brain Are Dependent on Selenoprotein P for Maintenance of Selenium. J.Nutr.

137: 690-693 (2007).

Page 170: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

170

Nair V, Vietti DE, Cooper CS. Degenerative chemistry of malondialdehyde.

Structure, stereochemistry and kinetics of formation of enaminals from reaction

with amino acids. J Am. Chem. Soc.103, 3030-3096 (1981).

Ochiai T, Soeda S, Ohno H, Tanaka H, Shoyama Y, Shimeno H. Crocin prevents

the death of PC-12 cells through sphingomyelinase-ceramide-signaling by

increasing glutathione synthesis. Neurochemistry International 44 (5): 321-330

(2004).

Ochiai T, Shimeno H, Mishima K, Iwasaki K, Fujiwara M, Tanaka H, Shoyama Y,

Toda A, Eyanagi R, Soeda S. Protective effects of carotenoids from saffron on

neuronal injury in vitro and in vivo. Biochimica et Biophysica Acta 1770 (2007)

578-584.

Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay of lipid peroxide in animal tissue by

thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 1979; 82:67-78.

Orhan H, Marol S, Hepsen I.F., Sahin G. Effects of some probable antioxidants on

selenite-induced cataract formation and oxidative stress-related parameters in

rats. Toxicology 139 (1999) 219-232.

Ostadalova I, Babicky A, Obenberger J. Cataract induced by administration of a

single dose of sodium selenite to suckling rats. (1977).

Ottonello S, Foroni C, Carta A, Petrucco S, Maraini G. Oxidative stress and age-

related cataract. Ophthalmologica 2000; 44(1): 78- 85.

Palloza P, Serini S, Di Niculo F, Calviello G. Modulation of apoptotic signalling by

carotenoids in cancer cells. Arch Biochem Biophys, 430(1):104-9, 2004.

Papandreou M.A., Dimakopoulou A., Cordopatis P., Klimis-Zacas D., Margarity M.,

Lamari F.N. Effect of Polyphenol Rich Blueberry Extract on Cognitive

Performance of Mice; Concomitant Changes of Brain Antioxidant Markers and

Acetylcholinesterase. (2008), υπό δημοσίευση.

Page 171: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

171

Papandreou M.A., Kanakis C.D., Polissiou M.G., Efthimiopoulos S, Cordopatis P.,

Margarity M., Lamari F.N. Inhibitory Activity on Amyloid-β Aggregation and

Antioxidant Properties of Crocus sativus Stigmas Extract and Its Crocin

Constituents. Journal of Agricultural Food and Chemistry 54: 8762-8768 (2006).

Pastore A, Federici G, Bertini E, Piemonte F. Analysis of glutathione: implication

in redox and detoxification. Clinica Chemica Acta 333 (2003) 19-39.

Perez D.D., Leighton F, Aspee A, Aliaga C, Lissi E. A comparison of methods

employed to evaluate antioxidant capabilities. Biol. Res. 33(2), 2000.

Piatigorsky J. Lens crystallines and their genes: diversity and tissue- specific

expression. FASEB J. 3, 1933-1940 (1989).

Pizzarello LD. The dimensions of the problems of eye disease among the elderly.

Opthalmology 94, 1191-1195.

Pollack A, Oren P, Stark AH, Eisner Z, Nyska A, Madar Z. Cataract Development

in Sand and Galactosemic Rats Fed a Natural Tomato Extract. J. Agric. Food

Chem. 1999, 47, 5122-5126.

Pollidori M.C. et al. Plasma lipophilic antioxidants and malondialdehyde in

congestive heart failure patients. Free Radical Biology & Medicine. Vol.32, Issue

2, pp. 148-152 (2002).

Prior R.L., Wu X., Schaich K. Standardized methods for the determination of

antioxidant capacity and fenolics in foods and dietary supplements. J Agric. Food

Chem. 53: 4290-4302 (2005).

Pulido R, Jimenez-Escrig A, Orensanz L, Saura-Calixto F. Study of plasma

antioxidant status in Alzheimer’s disease. European Journal of Neurology. 12:531-

535, 2005.

Rakieten N, Rakieten ML, Nadkarni MV. Study on the diabetogenic action of

streptozotocin. Cancer Chemother. Rep. 29: 91-98 (1963).

Page 172: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

172

RathbunWB, Schmidt AJ, Holleschau AM. Activity loss of glutathione synthesis

enzymes associated with human subcapsular cataract. Invest. Opthalm. Vis. Sci.

34 (6): 2049-2054 (1993).

Rayman M.P. The importance of selenium in human health. Lancet. 2000; 356:

223-241.

Reznick A.Z., Cross C.E., Hu M.L. Modification of plasma proteins by cigarette

smoke as measured by protein carbonyl formation. Biochem. J. 286, 607-611

(1992).

Sathyasaikumar K.V., Swappa I, Reddy PVB, Murthy CRK, Gupta AD,

Senthilkumaran B, Reddanna P. Fulminant hepatic failure in rats induces

oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla.

Neurochem. Res. (2007) 32: 517-524.

Sgaravatti AM, Vargas BA, Zandona BR, Deckmann KB, Rockenbach FJ, Moraes

TB, Monserrat JM, Sgarbi MB, Pederzolli CD, Wyse ATS, Wannmacher CMD,

Wajnner M, Dutra-Filho CS. Tyrosine promotes oxidative stress in cerebral cortex

of young rats. International Journal of Developmental Neuroscience.(2008) (Article

in press).

Shearer T.R., Ma H, Fukiage C, Azuma M. Selenite Nuclear Cataract: Review of

the Model. Molecular Vision 3: 8, 1997.

Sheng XQ, Huang KX, Xu HB. Influence of alloxan-induced diabetes and selenite

treatment on blood glucose and glutathione levels in mice. Journal of Trace

Elements in Medicine and Biology 18: 261-267 (2005).

Sethna SS, Holleschau AM, RathbunWB. Activity of glutathione synthesis enzymes

in human lens related with age. Curr. Eye Res. 1982-83; 2(11): 735-742.

Sitte N, Merker K, Von Zglinicki T, Davies KJ, Grune T. Protein oxidation and

degradation during cellular senescence of human BJ fibroblasts: part I-effects of

proliferative senescence. The FASEB Journal, 2000;14:2495-2502.

Page 173: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

173

Smith C.D., Carney J.M., Starke-Reed P.E., Oliver C.N., Stadtman E.R., Floyd R.A.,

Markesbery W.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (1991) 10540.

Soeda S, Ochiai T, Shimeno H, Saito H, Abe K, Sugira M, Tanaka H, Taura F,

Moromito S, Shoyama Y. Promising pharmacological actions of crocin in Crocus

sativus on the central nervous system. Studies in Natural Products Chemistry, vol.

28, Elsevier Science B.V., pp. 313-329.

Soeda S, Ochiai T, Paopong L, Tanaka H, Taura F, Shoyama Y, Shimeno H. Crocin

suppresses tumor necrosis factor-α-induced cell death of neuronally

differentiated PC-12 cells. Life Sciences 69: (2001) 2887-2898.

Spector A, Garner WH. Hydrogen peroxide and human cataract. Exp. Eye Res. 33,

673-681 (1981).

Spector A. The search for a solution to senile cataracts. Proctor lecture. Invest.

Opthalm. Vis. Sci. 25, 130-146 (1984).

Spector A, Wang Gm, Wang RR, Garner WH, Moll H. The prevention of cataract

caused by oxidative stress in cultured rat lenses. H2O2 and photochemically

induced cataract. Curr. Eye Res. 12, 163-179 (1993).

Spector Abraham, Oxidative stress-induced cataract: mechanism of action. The

FASEB Journal, 1995; Vol.9: 1173-1182.

Spector A. & Gamer W.H. Hydrogen peroxide & human cataract. Exp.Eye Res.

33, 673-681 (1981).

Srivastava A, Shivanandappa T. Hexachlorocycloexane differentially alters the

antioxidant status of the brain regions in rat. Toxicology 214 (2005) 123-130.

Subathra M, Shila S, Devi MA, Paneerselvam C. Emerging role of Centella asiatica

in improving age-related neurological antioxidant status. Exp. Gerontol. 40: (8-9):

707-715 (2005).

Suh-Yuh Wu, M.Christina Leske. Antioxidants and Cataract Formation: A

Summary Review.

Page 174: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

174

Suzuki KT, Orga Y. Metabolic pathway for selenium in the body: speciation by

HPLC-ICP MS with enriched Se. Food Additives and Contaminants 19 (10): 974-

983 (2002).

Szeto Y.T., Tomlinson B, Benzie I.F. Total antioxidant and ascorbic acid content

of fresh fruits and vegetables: implications for dietary planning and food

preservation. Br J Nutr. 87(1):55-59 (2002).

Taylor A, Jacques PF, Chylack LT Jr, et al. Long-term intake of vitamins and

carotenoids and odds of early age-related cortical and posterior subcapsular lens

opacities. Am. J Clin. Nutr.2002; 75:540-549.

Tos-Lutty S, Obuchowska-Przebirowska D, Latuszynska J, Musik I, Tokarska-Rodak

M. Comparison of histological and ultrastructural changes in mice organs after

supplementation with inorganic and organic selenium. Ann. Agric.Environ. Med.

10:87-91 (2003).

Trevithick-Sutton CC, Foote CS, Collins M, Trevithick JR. The retinal carotenoids

zeaxanthin and lutein scavenge superoxide and hydroxyl radicals: a

chemiluminescence and ESR study. Mol. Vis. 2006; 12:1127-1135.

Ursini F, Maiorino M, Brigelius- Flohe R, Aumann KD, Roveri A, Schomburg D et

al. The diversity of glutathione peroxidases. Methods Enzymol. 1995; 252B: 38-53.

Van Kleef FSM, De Jong WW, Hoenders HJ. Stepwise degradation and

deamination of the eye lens protein α-crystallin in aging. Nature 258, 264-266

(1975).

Van Kuijk FG, Holte LL, Dratz EA. 4-Hydroxyneonal: A lipid peroxidation

product derived from oxidized docosahexaenoic acid. Biochem. Biophys. Acta

1043, 116-118 (1990).

Verma S.K., Bordia A. Antioxidant property of Saffron in man. Indian J Med Sci,

52(5):205-7, 1998.

Page 175: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

175

Voitkun V. and Zhitkovich A. Analysis of DNA-protein cross-linking activity of

malondialdehyde in vitro. Mutat Res 1999; 424:97-106.

Vu HT, Robman L, Hodge A. Lutein and zeaxanthin and the risk of cataracts: the

Melbourne visual impairment project. Invest.Ophthalmol. Vis.Sci. 2006;47: 3783-

3786.

Willcox TK, Ash SL, Catignani GL., Antioxidants and prevention of chronic

disease. Crit Rev Food Sci Nutr. 2004; 44(4): 275-95.

Wilson S, Zucker P.A., Huang R.R. & Spector A. Development of synthetic

compounds with glutathione peroxide activity. J.Am.Chem.Soc. 111, 5936-5939

(1989).

Wu G, Fang Y.Z., Yang S, Lupton J.R., Turner N.D. Glutathione metabolism and

its implications for health. J. Nutr. 134:498-492 (2004).

Yagci R, Aydin B, Erdurmus M, Karadag R. Use of Melatonin to Prevent Selenite-

Induced Cataract Formation in Rat Eyes. Current Eye Research, 31: 845-850

(2006).

Yarat A, Zulal U, Ali U, Nesrin E. Lens glutathione glycation and electrophoretic

patterns of lens proteins in STZ induced diabetic rats. Glycoconjugate Journal

(1995) 12:622-626.

Yoritaka A,Hatorri N, Uchida K, Tanaka M, Stadtman ER, Mizuno Y.

Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in

Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33 (1996) 2696.

Zannoni V, Lynch M, Coldstein S, Sato P. A rapid micro method for the

determination of ascorbic acid in plasma and tissues. Biochem. Med. 1974; 11:41-

48.

Zhang J, Wang H, Peng D, Taylor EW. Further insight into the impact of sodium

selenite on selenoenzymes: High dose selenite enhances hepatic thioredoxin

reductase 1 activity as a consequence of liver injury. Toxicology Letters 176: 223-

229 (2008).

Page 176: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

176

Zheng S, Qian Z, Sheng L, Wen N. Crocetin Attenuates Atherosclerosis in

Hyperlipidemic Rabbits Through Inhibition of LDL Oxidation. Journal of

Cardiovascular Pharmacology. 47(1):70-76, 2006.

Zhu X, Smith MA, Perry G, Aliev G. Mitochondrial failures in Alzheimer’s

disease. Am. J Alzheimer’s dis. Other Demen. 19(6): 345-352 (2004).

Zigler JS Jr. Lens proteins. Principles and Practise of Opthalmology. Basic Science

(Albert DM & Jakobiec FA, eds) pp. 97-113 (1994).

Zigler JS Jr., Huang QL, Du XY. Oxidative modification of lens crystallins by

H2O2 and chelated iron. Free Radic. Biol. Med. 7, 499-505 (1989).

Zigman S. Photobiology of the lens. Ocular Lens (Maisel H. ed) pp. 301-347 (1985).

Zusterzeel P.L.M., Mulder T.P.J., Peters W.H.M. Plasma protein carbonyls in

nonpregnant, healthy pregnant and preeclamptic women. Free Radic.Res. 33,

471-476 (2000).

ΣΥΓΓΡΑΜΜΑΤΑ

1. Stryer L., Tymoczko J.L., Berg J.M. Βιοχημεία ( Ε΄ έκδοση), 2004.

2. Berne R.M., Levy M.N., Αρχές Φυσιολογίας (Έκδοση 1999).

3. Μίχα- Λαμπράκη Α., ‘’Η διατροφή των Ελλήνων κατά τους αρχαίους

κωμωδιογράφους’’. Διδακτορική διατριβή, 1984.

4. Rodriguez- Amaya B.D. ‘’A guide to carotenoid analysis in foods’’, 2001.

5. Majeed M. & Prakash L. ‘’Targeting Trace Mineral Bioavailability: The Case

of Selenium’’, 2007.

6. Διοσκουρίδης, ΑΠΑΝΤΑ 1, ‘’Περί ύλης ιατρικής Α΄’’, <<Οι Έλληνες>>,

Εκδότης Οδυσσέας Χατζόπουλος.

Page 177: Crocus sativus - nemertes.lis.upatras.grnemertes.lis.upatras.gr/jspui/bitstream/10889/1498/1/Master... · οδηγούν σε καταστροφή των νουκλεϊκών οξέων,

177