BC- Praktikum -...

Datum:06.08.2011 Eveline Gerber Natalie Mennel

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BC- Praktikum

Anreicherung der β- Galactosidase aus E.coli

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Natalie Mennel Klasse: CB05a Dozent: Christiane Zaborosch Betreuer: Miriam Iten Angelika Koller _________________________________________________________________

BC Anreicherung β- Galactosidase N. Mennel, E. Gerber

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Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG ................................... ................................................ 4 1.1 Einleitung ........................................ ...................................................................... 4 1.2 Aufgabenstellung .................................. ............................................................... 4 1.3 β-Galactosidase .................................... ............................................................... 4 1.4 Problemstellung ................................... ................................................................ 5

2 FORMELN ....................................................................................................... 5

3 PUFFER .......................................................................................................... 6 3.1 Theoretischer Hintergrund [4] .............................................................................. 6 3.2 Material und Methoden ............................. ........................................................... 6

4 KALIBRATION DER PIPETTEN .......................... ........................................... 7 4.1 Aufgabestellung Ziel .............................. .............................................................. 7 4.2 Theoretische Darstellung der Versuchsinhalte ...... ............................................ 7 4.3 Material und Methoden ............................. ........................................................... 7 4.4 Ergebnisse ........................................ .................................................................... 8 4.5 Diskussion ........................................ ...................................................................10

5 AKTIVITÄTSBESTIMMUNG .............................. ........................................... 11

6 ZELLAUFSCHLUSS .................................... ................................................. 12 6.1 Aufgabestellung ................................... ...............................................................12 6.2 Theorie ........................................... ......................................................................12 6.3 Material und Methoden ............................. ..........................................................12 6.4 Ergebnisse ........................................ ...................................................................12 6.5 Diskussion ........................................ ...................................................................13

7 AMMONIUMSULFATFÄLLUNG ............................. ...................................... 13 7.1 Aufgabestellung ................................... ...............................................................13 7.2 Theorie [9] ..............................................................................................................13 7.3 Material und Methoden ............................. ..........................................................14 7.4 Ergebnisse ........................................ ...................................................................14 7.5 Diskussion ........................................ ...................................................................14

8 DIALYSE ........................................... ............................................................ 15 8.1 Aufgabestellung ................................... ...............................................................15 8.2 Theorie ........................................... ......................................................................15 8.3 Material und Methoden ............................. ..........................................................15 8.4 Ergebnisse ........................................ ...................................................................15 8.5 Diskussion ........................................ ...................................................................16

9 IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE .................... .......................... 16 9.1 Aufgabestellung ................................... ...............................................................16 9.2 Theorie ........................................... ......................................................................16 9.3 Material und Methoden ............................. ..........................................................17


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9.4 Packen der Säule .................................. ..............................................................18 9.5 Auftragung der Probe auf die Säule................. ..................................................18 9.6 Mikrotiterplatten- Assay........................... ...........................................................19 9.7 Resultate ......................................... .....................................................................19 9.8 Diskussion ........................................ ...................................................................20

10 GELFILTRATION ..................................... .................................................. 21 10.1 Aufgabestellung.................................... ...........................................................21 10.2 Theorie ........................................... ..................................................................21 10.3 Material und Methoden ............................. .......................................................22 10.4 Ultrafiltration ................................... .................................................................24 10.5 Überprüfen der Säule .............................. ........................................................24 10.6 Auftragen der Probe auf die Säule ................. ................................................24 10.7 Bestimmung der theoretischen Bodenzahl ............ .......................................24 10.8 Resultate ......................................... .................................................................25 10.9 Diskussion ........................................ ...............................................................28

11 SPEKTROMETRISCHE BESTIMMUNG ....................... ............................. 29

12 GESAMTPROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD ............. .............. 30 12.1 Aufgabestellung.................................... ...........................................................30 12.2 Theorie ........................................... ..................................................................30 12.3 Material und Methoden ............................. .......................................................30 12.4 Ergebnisse ........................................ ...............................................................31 12.5 Diskussion ........................................ ...............................................................32

13 SDS-PAGE ................................................................................................. 33 13.1 Aufgabenstellung .................................. ..........................................................33 13.2 Theorie ........................................... ..................................................................33 13.3 Material und Methoden ............................. .......................................................33 13.4 Ergebnisse ........................................ ...............................................................35 13.5 Diskussion ........................................ ...............................................................35

14 ABSCHLUSSDISKUSSION ............................... ........................................ 37

15 VERGLEICH DER RESULTATE MIT DER LITERATUR ......... .................. 40

16 LITERATURVERZEICHNIS .............................. ......................................... 41 16.1 Literatur ......................................... ...................................................................41 16.2 Internetadressen .................................. ............................................................42 16.3 Bilder ............................................ ....................................................................42


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1 Zusammenfassung

1.1 Einleitung Das Enzym β-Galactosidase wurde aus dem Darmbakterium Escherichia coli DSMZ 1329 (Phänotyp Lac+, Genotyp i-, z+, y+) isoliert. Das Disaccharid Lactose besteht aus D-Galactose und D-Glucose, welche durch eine β-1,4 -O-glycosidische Bindung verbunden sind. Die β-Galactosidase spaltet dieses Molekül durch Hydrolyse der O-Glykosidischen Bindung. Damit erlaubt es dem E.coli mit Lactose als einzige Kohlenstoffquelle zu leben. [1] Auch der Lactoseabbau des Menschen wird durch dieses Enzym in der Dünndarmschleimhaut reguliert. Vor allem bei Kleinkindern wird es in grösseren Mengen produziert. Mit dem Alter nimmt die Menge dieser Proteine oftmals ab und führt dabei zu Verdauungsstörungen. Allein in Europa leben ca.10% lactoseintolerante Menschen. Erstaunlicherweise liegt diese Zahl im asiatischen Raum um die 80%. β-Galactosidase wird auch für die Herstellung von lactosefreier Milch verwendet.

1.2 Aufgabenstellung Während den acht Praktikumstagen sollte das Enzym β-Galactosidase aus vorgewaschenen E.coli Bakterien isoliert und aufgereinigt werden. Dabei werden alle Hauptschritte des so genannte Downstream Processings durchlaufen. Die Probe muss nach der Ernte aufgeschlossen werden, damit das Enzym aus der Zelle isoliert werden kann. In einem weiteren Schritt müssen die unlöslichen Cytoplasmabestandteile vom Rest getrennt werden. Die gelösten Stoffe werden einer Grobreinigung unterzogen. In diesem Captureschritt werden Zellbestandteile wie DNA und grössere Proteine durch Fällung entfernt. Weitere Reinigungsschritte durch Ionenchromatografie und Gelfiltration folgen dem Aufreinigungsverfahren. Die einzelnen Reinigungsschritte sollten durch die Bestimmung der Proteinmengen nach Bradford verglichen und die Aufreinigung der β-Galactosidase durch die Aktivitätsmessungen analysiert.

1.3 β-Galactosidase Bevor mit der Aufreinigung begonnen werden kann, müssen die Eigenschaften des Proteins bekannt sein. Nur so können die optimalsten Methoden und Bedingungen eruiert werden.

Tab. 1, Zusammengetragene Eigenschaften der β-Galactosidase

Eigenschaften der β-Galactosi dase [3]

Molekulargewicht 540’000 Da Gesamtprotein 116'000 Da Untereinheit

EC-Nummer 3.2.1.23

Isoelektrischer Punkt (pI-Wert) 4.61

Struktur Tetramer aus vier identische Untereinheiten 1023 Aminosäuren pro Untereinheit

pH-Optimum 7.0 – 7.5 Stabil für 20h bei 25°C bei pH 6.5-8.5

Temperatur Optimum 50 – 55 °C

Stabilisator Mg2+ Haltbarkeit bei -20 °C mindestens 6 Monate haltbar Durch das Molekulargewicht kann der prozentuale Anteil an Ammoniumsulfat für die Fällung bestimmt werden. Auch die Porengrössen des Dialyseschlauches ist abhängig von der Grösse des Proteines sowie die Wahl der Gelfiltrationssäule. Der Isoelektrische


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Punkt ist massgebend für die Wahl der ionenchromatographischen Säule. Da sich der pH der mobilen Phase bei 7.5 befindet, liegt das Protein in deprotonierter Form vor. Also muss ein Anionentauscher verwendet werden.

1.4 Problemstellung Da das Enzym aus Bakerien aufgereinigt wurde muss damit gerechnet werden, dass sich auch Proteasen in der Probe befinden. Deshalb müssen die Proben während den Analysen auf Eis gekühlt aufbewahrt werden. So „frieren“ die Enzymaktivitäten ein und die Spaltung der β-Galactosidase kann abgeschwächt werden. Längere Lagerungen der Proben sollten im Tiefgefrierer stattfinden. Aber auch dann ist ein Verlust von der Aktivität nicht ganz vermeidbar.

2 Formeln Tab. 2 Formeln welche für die Berechnungen verwendet wurden.

G1

Gesamtaktivität= ∆E ⋅V ⋅VGes

∆t ⋅ ε ⋅ d ⋅ v

∆E/∆t: Extinktionsänderung pro Zeiteinheit [∆E/min] V: Testansatzvolumen [ml] VGes: Gesamtvolumen der Fraktion [ml] ε: Extinktionskoeffizient der zu messenden Substanz [mM-1cm-1] d: Schichtdicke der Küvette [cm] v: Probevolumen [ml]

G2 CV% = Stabw.

x ⋅100

CV: Präzision Stabw.: Standardabweichung x : Mittelwert

G3 R=100 − (

x ⋅100

SOLL Wert)

x = x1+ x2 + x3+ ....xn

n

R: Richtigkeit x : Mittelwert

G4 Spezifische Aktivität=

einGesamtprot

vitätGesamtakti

Gesamtaktivität entspricht umgesetzten Substrat [µmol /min] Gesamtproteinmenge [mg]

G5 Anreicherungsfaktor= RohextraktimAktivitätspezif

obedAktivitätspezif

.

Pr.. spezifische Aktivität der Probe [µmol mg-1 min-1] spez. Aktivität im Rohextrakt [µmol mg-1 min-1]

G6 Ausbeute= 100

Pr ⋅RohextraktimAktivität

obederAktivität

Aktivität der Probe in Units[U] Aktivität in Rohextrakt in Units [U]

G7 As=

a

b

As: Peaksymmetrie b: Peakbreite bei 10 % Höhe a: Peakbreite bei 10 % Höhe

G8 L1

)w

V(54.5N 2

2/1

e ⋅⋅= N: Anzahl theoretischer Böden pro Meter Ve: Elutionsvolumen des Peaks [ml] W1/2: Peakbreite auf halber Peakhöhe [ml] L: Länge der Säule [m]

G9 F)051.14A416.45(cP ⋅−⋅= A: Absorption cP: Proteinkonzentration [µg/ml] F: Verdünnungsfaktor

G10 1000

VcX PP

P⋅

= XP: Proteinmenge [mg] VP: Volumen der Probe [ml]


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cP: Proteinkonzentration [µg/ml]

3 Puffer

3.1 Theoretischer Hintergrund [4] Puffer werden in der Biochemie sehr häufig verwendet, da in vielen Arbeitsschritten Salze und andere Stoffe beigemengt oder entfernt werden. Diese Substanzen können den pH-Wert beeinflussen. Für die Entwicklung und Herstellung eines Puffers müssen einige Regeln beachtet werden.

• Der pKa des Puffersystems sollte in der Nähe des zu puffernden pHs liegen. • Genügend grosse Pufferkapazität • Die Chemikalien welche für den Puffer verwendet werden dürfen keine Reaktion

mit den Molekülen in der Lösung eingehen und nicht ausfallen.

3.2 Material und Methoden Die folgende Tabelle zeigt alle Puffer, die in diesem Praktikum verwendet wurden. Die Herstellung dieser Puffersysteme wurden nach den Methoden des BCP-Skriptes duchgeführt.

Tab. 3, Auflistung der verwendeten Puffer und ihren Eigenschaften.

Nr Puffer Bemerkung P1 Tris-Puffer

(Dialysepuffer) Der pH des Tris-Puffers ist stark temperaturabhängig [4]. Deshalb sollte immer darauf geachtet werden, dass der pH des Puffers bei gleicher Temperatur eingestellt wird, wie er eingesetzt wird. Dieser Puffer muss kühl (4°C) gelagert werden. Bei der Dialyse wird kurz vor dem Gebrauch des Puffers noch Mercaptoethanol beigemengt. Es dient zur Stabilisierung des Enzyms.

P2 Z-Puffer

Dieser Puffer puffert bei einem pH von 7. Es handelt sich um einen Na2HPO3/NaH2PO3-Puffersystem. Weiter wurde dem Puffer noch KCl und MgSO4 zugegeben, welche das Protein stabilisieren.. Dieser Puffer wird im Kühlschrank aufbewahrt.

P3 Puffer A/B (Tris-Puffer)

Muss vor gebrauch Filtriert (0.45 µm) und im Ultraschallbad Entgast (ca.30 min) werden. Kann bei RT aufbewahrt werden.


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4 Kalibration der Pipetten

4.1 Aufgabestellung Ziel Die Aufgabe bestand darin, die benötigten Arbeitsmaterialien für die folgenden Praktikumstage bereitzulegen. Dazu gehörte das Überprüfen drei verschiedener Pipetten.

4.2 Theorie Pipettenüberprüfung Die Pipetten werden auf ihre Genauigkeit überprüft. Dabei wird pipettiertes Wasservolumen bei minimaler und maximaler Einstellung in jeweils 11 Messungen gewogen. Dieses Gewicht wird über die Dichte bei den jeweiligen Raumtemperaturen in Volumen umgerechnet. Die Standardabweichung darf für eine erfolgreiche Überprüfung die jeweils Vorgegebenen, pipettenspezifischen Werte nicht überschreiten. Präzision (Precision) [19] Unter Präzision wird die Streuung der einzelnen Messungen beachtet und wie weit die Messwerte untereinander auseinander liegen. Sind also alle Messwerte dicht beieinander zeigt die Methode eine hohe Präzision. Die Präzision sagt jedoch nichts darüber aus, ob die Werte auch dem wahren Wert entsprechen. Richtigkeit (Accuracy) [19] Die Richtigkeit sagt aus wieweit der Mittelwert der Messungen vom „wahren Wert“ oder Referenzwert entfernt liegt. Je näher der Mittelwert dem Referenzwert liegt, desto grösser ist die Richtigkeit. Dieser Wert sagt jedoch nichts über die Streuung der einzelnen Werte aus.

Abb. 1, diese Bilder zeigen den Unterschied zwischen Richtigkeit und Präzision. Dabei zeigt die grüne Fläche die Streuung der einzelnen Messungen an. [18]

4.3 Material und Methoden Material -Analysenwaage AE200 Mettler -Soccorex Einkanalpipetten 1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl Methode Die Einkanal-Pipetten wurden mit dest.Wasser gravimetrisch auf ihre Genauigkeit überprüft.

Vorgehen: Um Schwankungen aufgrund von unregelmässigem Verdampfen zu vermeiden wurde die Luft im Wägebereich der Analysenwaage mit Wasser gesättigt. Dafür wurde ein Becherglas mit Wasser in die Waage gestellt.

Vor dem Messen: Es wurde darauf geachtet, dass die Waage während den Messungen nicht im Durchzug stand. Die Waage wurde auf ihre Ausrichtung an der Libelle überprüft und gegebenenfalls angepasst. Die Waage sollte kalibriert sein. Die Pipetten wurden über jeweils 11 Punkte am Maximum und Minimum überprüft.


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Die Spitze wurde aufgesetzt und der Saugraum mit Wasser durch dreimaliges Aufziehen und Entleeren benetzt. Die Spitze wurderd aufgesogen und am Glasrand abgestrichen. Der Pipetteninhalt wurde an der Wandung des Wägegefässes entleert, bis zum ersten Widerstand. Nach drei- sekündigem Ausharren wurde der Stempel ganz durchgedrückt. Nun konnte das Gewicht am Display der Waage abgelesen werden.

4.4 Ergebnisse Soccorex 100-1000ul Die gravimetrisch bestimmten Daten wurden mit der Dichte von Wasser bei 20°C, 0.9982 g/ml in Volumen umgerechnet. Aus den elf gemessenen Werten wurde der Mittelwert und die Standardabweichung ermittelt. Im Weiteren wurde die Präzision und die Richtigkeit berechnet. (→ 2. Formeln, G2/G3)

Tab. 4 Überprüfung der Pipette Soccorex 100-1000ul

Pipettiertes Volumen bei 1000 ul


995.19 ul 99.78 ul 996.99 ul 100.78 ul 996.99 ul 101.18 ul 997.80 ul 100.98 ul 997.40 ul 100.88 ul 999.00 ul 100.98 ul 997.70 ul 101.38 ul 997.30 ul 100.68 ul 997.30 ul 101.48 ul 998.20 ul 100.88 ul 998.20 ul 101.18 ul Mittelwert 997.46 ul 100.93 ul Stabw. 0.96 ul 0.45 ul

Präzision 0.10 % 0.45 % Richtwert Präzision

<0.2 <0.5

Richtigkeit 0.25 % -0.93 % Richtwert Richtigkeit

<±0.5 <±0.7

Diese Pipette liegt im maximalen Pipettierbereich (1000µl) in den vorgeschriebenen Werten. Im minimalen Pipettierbereich (100µl) liegt diese Pipette in der vorgeschriebenen Präzision, jedoch weicht sie um 0.2 µl von der Richtigkeit ab.


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Soccorex 10-100ul Die Messungen und Berechnungen wurden analog Soccorex 100-1000µl durchgeführt.

Tab. 5 Überprüfung der Pipette Soccorex 10-100 µl

Das maximale Pipettiervolumen liegt in der vorgegebenen Richtigkeit, weicht jedoch in der Präzision um 0.4% vom vorgegebenen Wert ab. Beim minimalen Pipettiervolumen liegen die Präzision sowie die Richtigkeit ausserhalb der vorgegebenen Werte. Soccorex 1-10ul Die Messungen und Berechnungen wurden analog Soccorex 100-1000µl durchgeführt.

Tab. 6, Überprüfung der Pipette Soccorex 1-10µl



9.92 ul 1.10 ul 10.02 ul 0.60 ul 9.92 ul 0.70 ul 9.82 ul 0.80 ul 9.92 ul 0.70 ul 9.72 ul 0.70 ul 10.02 ul 0.80 ul 9.72 ul 0.90 ul 9.82 ul 1.10 ul 9.42 ul 0.70 ul 9.82 ul 0.80 ul Mittelwert 9.83 ul 0.81 ul Stabw. 0.17 ul 0.16 ul

Präzision 1.73 % 20.27 % Richtwert Präzision <0.7 <2.5 Richtigkeit 1.73 % 18.95 % Richtwert Richtigkeit <±1 <±2



101.38 ul 9.32 ul 99.28 ul 9.22 ul 99.08 ul 9.32 ul 99.38 ul 9.42 ul 99.38 ul 9.12 ul 99.48 ul 9.42 ul 99.48 ul 9.32 ul 99.58 ul 9.22 ul 99.38 ul 9.62 ul 99.38 ul 9.02 ul 99.38 ul 9.32 ul Mittelwert 99.56 ul 9.30 ul Stabw. 0.62 ul 0.16 ul Präzision 0.62 % 1.73 % Richtwert Präzision <0.2 <1.0 Richtigkeit 0.44 % 7.01 % Richtwert Richtigkeit <±0.8 <±1


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Beim maximalen Pipettiervolumen dieser Einkanalpipette liegen die beiden Werte ausserhalb der vorgegebenen Abweichungen. Das minimale Pipettiervolumen weicht sehr stark von den vorgegebenen Werten ab.

4.5 Diskussion Alle drei Pipetten weichen in mindestens einem Testwert vom Richtwert ab. Auffallend sind die Abweichungen bei einem Volumen von 1µl. Hier fliesst auch der Fehler der Waage ein. Solch kleine Massen müssten auf einer Mikrowaage gewogen werden. Alle drei Pipetten müssten zerteilt und gut gereinigt werden. Es müssten Dichtungen auf Sprödigkeit oder Risse überprüft werden und gegebenenfalls erneuert werden. Falls sich dabei keine Besserung der Resultate einstellt, müssten sämtliche Pipetten zur Kalibration extern eingeschickt werden. Für das Praktikum sollten diese Resultate genügen, um die Pipetten zu gebrauchen. Dabei wurde während dieser Zeit darauf geachtet, dass die Pipette 100-1000µl nur für Voluminas von >100 µl gebraucht wurden. Ab einer Pipettiermenge von 100µl wurde nur noch die 10-100µl Pipette verwendet. Da die Abweichungen der 1-10µl Pipetten bei einem Volumen von 10µl die kleinere Abweichung zeigten, wurde für solche Voluminas nur diese Pipette benutzt.


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5 Aktivitätsbestimmung Theorie Als Aktivität eines Enzyms wird die Menge eines Substrates in µmol bezeichnet, welche in einer Minute umgesetzt wird. Ein Unit entspricht einem µmol Substrat welches in einer Minute umgesetzt wird. Die Aktivität lässt sich nach G1 berechnen. Die Enzymaktivität in diesem Versuch kann durch die Zugabe eines farbigen Substrates, welches dann vom Enzym umgesetzt wird, gemessen werden. Als Substrat dient 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2NPG). Das 2NPG wird zu Galactose und 2- Nitrophenol umgesetzt. Das freigesetzte 2-Nitrophenol ist in alkalischer Lösung gelb. Die Bildung wird photometrisch bei 410 nm gemessen. [6] [7]

Abb. 2 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2NPG) wird von der β-Galactosidase zu 2- Nitrophenol und Galactose umgesetzt. [8]

Um beurteilen zu können, wie gut die Aufreinigung des Zielproteins ist, kann der Anteil des Zielproteins am Gesamtproteingehalt der Lösung bestimmt werden. Dafür wird die spezifische Aktivität berechnet. Sie ist definiert als Aktivität pro mg Protein. und wird nach G1 berechnet. [7] Durch die Aufarbeitung geht Enzym verloren. Daher ist es sinnvoll nach jedem Reinigungsschritt die Aktivität zu messen und danach die Ausbeute nach Formel G6 zu berechnen. Durchführung Die Proben sollten unmittelbar nach dem Reinigungsschritt auf ihre Aktivität überprüft werden. Als Puffer wurde Z- Puffer (→3.2 Material und Methoden, P2) verwendet. Dazu wurde täglich die Substratlösung 2NPG frisch hergestellt. Es wurden 10 mg/ ml in 0.1 M Natriumphosphat- Puffer bei pH 7 gelöst. In die Küvetten wurden jeweils 2.7 ml Z-Puffer, 0. 2 ml 2NPG- Lösung und 100µl Probelösung gegeben. Die Lösung für 5 min, vor der Messung, in den Photometer gestellt um bei 37°C zu temperieren. Wenn die Probe zu konze ntriert war wurde sie verdünnt, oder wenn sie eine zu kleine Konzentration aufwies wurde ein grösseres Volumen zugegeben. Dementsprechend wurde dann weniger Z- Puffer hinein gegeben. Das Volumen sollte insgesamt 3 ml aufweisen. Nach fünf Minuten wurde die Probe zu der Lösung in der Küvette gegeben kurz gewendet und sofort gemessen. Aus der Steigung der Extinktion währen zwei Minuten wurde dann die Aktivität der Probe gemessen.


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6 Zellaufschluss

6.1 Aufgabestellung Das zu Isolierende Enzym β-Galactosidase muss aus der Zelle des Escherichia coli transferiert werden. Dabei werden die Zellen mit Ultraschall zertrümmert.

6.2 Theorie Das zu reinigende Enzym β-Galaktosidase liegt im Cytoplasma des E.colis vor. Um es zu analysieren muss zuerst die Zelle des Bakteriums zerstört werden. Bei dem Zellaufschluss mittels Ultraschallsonde wird die Probelösung durch Ultraschall in Schwingung versetzt. Die resultierenden Kavitationseffekte zerstören die Zelle. Diese Methode führt einen Temperaturanstieg mit sich. Damit die im Probegemisch enthaltenen Proteasen dabei unterdrückt bleiben und die Proteine nicht Denaturieren, muss während dem Aufschluss die Probe gut gekühlt werden. [8]

6.3 Material und Methoden Gerät: Ultraschallsonde: sonics vibra cell Model CV 33, Serial Nr. 330306 Methode: Die Beschallung wurde nach der Methode aus dem BCP-Skript durchgeführt. Dabei wurde die Amplitude des Ultraschalles auf 60% gestellt. Punkte auf die besonders geachtet werden musste während dem Zellaufschluss:

• Während der Beschallung darf die Lösung nicht schäumen. Die Sonde sollte möglichst senkrecht im Tube gehalten werden. Dabei dürfen auch die Ränder nicht berührt werden.

• Die vorgeschriebenen Pausen müssen eingehalten werden. Dabei wurde die Wärme der Zellsuspension immer wieder von Hand überprüft und gegebenenfalls wurden längere Kühlpausen eingesetzt.

Nach dem Zellaufschluss wurde die Suspension in ein Grainer Tube umgeleert und bei 30'000 UpM Zentrifugiert. Achtung: Je nach Zentrifugentyp variieren die Umdrehungen pro Minute, da die Radien unterschiedlich sind. Deshalb wird in Vorschriften die Gravitation (g)-Zahl angegeben. Durch bekannter Radius und g-Zahl kann in Tabellen die Drehzahl nachgeschlagen werden.

6.4 Ergebnisse Um die Ausbeute der B-Galaktosidase zu beurteilen wird eine Aktivitätsmessung durchgeführt. G1

Tab. 7, Resultate des Rohextraktes nach Zellaufschluss

Probe Volumen [ml]

Gesamtaktivität [U] [G1]

spez. Aktivität [U/mg] [G4]

Gesamtprotein [mg] [G6]

Rohextrakt nach Aufschluss 16 11’250 17 667


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6.5 Diskussion Der erhaltene Rohextrakt besass eine Konsistenz, vergleichbar mit dem Eiweiss eines rohen Eies. Diese Viskosität besteht aus einem Cocktail aus lysierten Zellen und freigesetzter DNA, die während dem Waschvorgang entstanden sind. Durch das Beschallen der Probe wurde diese Viskosität deutlich herabgesetzt. Die gesamte Probe schien homogener. Die Menge an Gesamtprotein nach Bradford liegt doppelt so hoch wie erwartet werden konnte. Faustregel: Einen Liter Kulturflüssigkeit mit einem OD von 1,4 entspricht einer Feuchtmasse von 950 mg, was wiederum einem Trockengewicht von 280 mg gleichkommt. In dieser Flüssigkeit befinden sich 155 mg Proteine pro Liter. Die Probe entspricht einem OD von 200. Dies ergäbe eine Proteinkonzentration von 22.14 g/L. Die Probe entspricht einem Volumen von 15 ml. Dabei dürfte die maximale Proteinkonzentration nicht über 332 mg hinaus messen. Nach dieser Faustregel wäre eine Proteinkonzentration von 667 mg gar nicht möglich. Dies liegt vermutlich an der Methode zur Proteinbestimmung. Die hohe Anzahl an Proteine und DNA in der Probe verfälschen das Resultat. (→ 13.5, Diskussion Bradford)

7 Ammoniumsulfatfällung

7.1 Aufgabestellung Ziel dieses Schrittes ist es die Proteine vom übrigen Zellmaterial wie DNA, Zellwand und Organellen zu trennen.

7.2 Theorie [9] Die Ammoniumsulfatfällung ist eine reversible, salzinduzierte Methode, Proteine verschiedener Grössen zu fällen. Die isolierten Proteine werden durch die Fällung nicht denaturiert. Ammoniumsulfat verfügt über eine gute Wasserlöslichkeit, kann somit hoch konzentriert hergestellt werden und so einen grossen Protein-Fällungsbereich abdecken. Diese Verbindung besitzt ausserdem eine niedrige Lösungsenthalpie, was beim Lösen nur geringe Erwärmung der Probe auslöst. Da diese Methode nur in konzentrierter Proteinlösung möglich ist, wird sie nur zur ersten Aufreinigung nach dem Aufschluss benutzt. Die Wirkung besteht in der sich ändernden Ionenstärken in der Probe durch die Zugabe von Ammoniumsulfat. Proteine sind wasserlöslich, da sich um sie herum eine Hydrathülle bildet, sobald sie ins Wasser gegeben werden. Durch die Zugabe von Ammoniumsulfat wird die Ionenstärke enorm erhöht. Die erhöhte Ionenstärke verdrängt die Hydrathülle um die Proteine, welche daraufhin wegen hydrophoben Wechselwirkungen ausfallen. Die Lösung wird zentrifugiert und im Pellet befinden sich die ausgefallenen Proteine. Ist bekannt, bei welchem Sättigungsgrad das gesuchte Protein ausfallen wird, kann die Isolation mehr eingeengt werden. Diese Methode wird fraktionierte Fällung genannt. Dazu wird in einem ersten Schritt bis zur unteren Fällungsgrenze gesättigt und das resultierende Pellet abzentrifugiert. Das gewünschte Protein befindet sich noch immer in Lösung. In einem zweiten Schritt wird die Sättigung bis zur oberen Fällungsgrenze getrieben. Im Pellet kann nun das zu isolierende Protein abzentrifugiert werden.


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7.3 Material und Methoden Materialien - Magnetrührer - Eisbad Methode Das Aussalzen wurde nach Vorschrift BCP-Skript innert 30 min vollzogen. Dabei muss das Ammoniumsulfat in fester Form stetig in kleinen Mengen zugegeben werden. Wird dies nicht beachtet und grössere Mengen werden zu hastig zugegeben, wird die Ionenstärke punktuell höher als gewollt. Dies führt zu Ausfällungen von Proteinen bei höheren Ionenstärken. Der Aufreinigungsschritt wird reduziert. Die Bestimmung der zuzugebenden Ammoniumsulfatmenge konnte aus der Sättigungstabelle aus dem Skript entnommen werden. Dabei wurde nach Vorschrift eine Ammoniumsulfatsättigung von 40 % bei einer Anfangskonzentration an Ammoniumsulfat von 0 % gewählt. Dies ergab eine zuzugebende Ammoniummenge von 226 g/L. Für eine Rohextraktprobe mit einem Volumen von 15 ml wurde demnach eine Menge von 3.65 g Ammoniumsulfat verwendet.

7.4 Ergebnisse Nach der Zentrifugation wurde ein Pelletvolumen von 7.5 ml und ein Überstand von 11 ml isoliert.

Tab. 8, Ergebnistabelle der Auswertungen nach der Ammoniumsulfatfällung

Probe Volumen [ml]

Gesamt-aktivität [U] [G1]

spezifische Aktivität [U/mg] [G4]

Gesamt-protein [mg]

Schritt-Ausbeute [%]

Gesamt-Ausbeute [%] [G6]

Pellet nach (NH4)2SO4-Fällung

7.5 10160 17 615 90 90

Überstand nach (NH4)2SO4-Fällung

11 120 0.3 352 1

Auch hier liegt die Gesamtproteinkonzentration im Pellet mit 615 mg deutlicht über dem Faustregelwert von maximal 332 mg. Dabei wurde die Proteinmenge des Überstandes nicht mitberücksichtigt. Der Anreicherungsfaktor beträgt 1.6.

7.5 Diskussion Der hohe Gesamtproteingehalt im Präzipitat kann, wie schon im Rohextrakt erwähnt durch die noch immer zu hohe Proteinkonzentration zurückzuführen sein. Im Überstand wurden 352 mg Proteine gemessen. Dieser hohe Proteingehalt kann auch nur durch Störsubstanzen erklärt werden. Im Überstand befindet sich die DNA und andere Zellreste, welche den Bradfordtest störend beeinflussen. Auch die hohe Ionenstärke, die nun in der Probe herrscht könnte Auswirkungen auf die Proteinbestimmung zeigen. Die Gesamtaktivität im Überstand zeigt, dass die abgetrennten Proteine kaum β-Galactosidase enthalten und diese Fällung somit ein guter Aufreinigungsschritt war.


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8 Dialyse

8.1 Aufgabestellung Um eine Ionenchromatographie durchführen zu können müssen störende Salze, vor allem die grosse Konzentration von Ammoniumsulfat aus dem Fällungsschritt, aus der Probe getrieben werden. Die Probelösung sollte in diesem Reinigungsschritt durch Dialyse von den gelösten Salzen gesäubert werden.

8.2 Theorie In der Dialyse werden semipermeable Membranen verwendet. Die Poren solcher Membrane sind nur so gross, dass die niedermolekularen Stoffe wie anorganische Salze diffundieren können. Die Proteine, welche grösser sind als die Porengrösse des Dialysesackes, können die Schranke nicht passieren. Die treibende Kraft dieser Diffusion ist das Konzentrationsgefälle. Solche Dialysesäcke bestehen aus Cellulose und können in Porengrössen, sogenannter „cut-off“ von 1-50 kDa kommerziell gekauft werden. Es wird empfohlen, die Dialysesäcke in möglichst grosser Lange und mit kleinem Durchmesser zu wählen, da so die Oberfläche so am grössten wird. Im Versuch wurden Dialysensäcke von einer Porengrösse von 12’000-14'000 Da verwendet. Das zu isolierende Protein β-Galactosidase ist mit einer molekularen Masse von 540’000 Da und einer Untereinheit von 116'000 zu gross um die Dialysemembran zu passieren. [10]

8.3 Material und Methoden Material - Becherglas - Glaspipette - Glasstab - Dialysensack Membra-Cell „cut off“: 12-14 kDa, VWR Methode Die trockenen Dialysesäcke wurden vor deren Befüllung in dest Wasser zur Rehydration gekocht. Der Dialyseschlauch wurde vorsichtig am einen Ende mit einem Knoten zugeknüpft. Die Probe wurde mit einer Glaspipette hineingegeben, wobei darauf geachtet werden musste, dass der Sack nicht durchstochen wurde. Da sich das Volumen durch den osmotischen Ausgleich vergrössert, muss zwischen Flüssikeit und dem abschliessenden Knoten etwa drei cm Platz gelassen werden. Sonst könnte der Sack platzen. Der präparierte Dialyseschlauch wurde an einem Glasstab befestigt, welcher in den Dialysepuffer gestellt wurde. Nach erfolgter Dialyse nach Vorschrift aus dem Skript wurde die Probe in ein Falcon Tube überführt und tiefgefroren.

8.4 Ergebnisse

Tab. 9, Ergebnisse der Auswertung nach der Dialyse

Probe Volumen [ml]



Gesamt-protein [mg]

Schritt-Ausbeute [%]

Gesamt-Ausbeute [%][G6]

nach Dialyse und Einfrieren

12 8825 27 321 96.9 78.4

Der Anreicherungsfaktor beträgt 1.6. Es ist zu beachten, dass die Gesamtaktivität erst nach einmaligem Tiefgefrieren gemessen wurde. Dadurch könnte ein kleiner Verlust entstanden sein. Durch die Dialyse hat das Probevolumen um etwa 5 ml zugenommen.


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8.5 Diskussion Da die Gesamtaktivität eine Schrittausbeute von 97% zeigt und die Gesamtproteinmenge sich beinahe halbiert hat, kann von einer guten Aufreinigung ausgegangen werden. Nach diesen Resultaten wurden die Störsubstanzen, welche die Proteinbestimmung nach Bradford störten ausgewaschen, sowie wahrscheinlich auch viele kleinere Proteine abgetrennt.

9 Ionenaustausch-Chromatographie

9.1 Aufgabestellung Um die β- Galactosidase von störenden Proteinen zu befreien, wird als Reinigungsschritt eine Ionenchromatographie durchgeführt.

9.2 Theorie Um störende Proteine vom Capture- Protein (β- Galactosidase) zu trennen wird eine Säulenchromatographie durchgeführt. Die Wechselwirkung des Zielproteins mit der Säule soll möglichst stark sein. Die unerwünschten Proteine laufen durch die Säule und die β- Galactosidase bindet mit dem Anionenaustauscher. Die Beschaffenheit der Säule, die Art der mobilen Phase und das Elutionsmittel werden von der ausgewählten Wechselwirkung abhängig gemacht. Im Fall der β- Galactosidase wird ein schwacher Anionenaustauscher, welcher aus Diethylamino-Sepharose (DEAE-Sepharose) besteht, verwendet. Die Ladung der β- Galactosidase tritt in Wechselwirkung mit der positiv geladenen, stationären Phase. Die Wechselwirkung ist umso stärker, je stärker das Protein geladen ist. Die mobile Phase besteht aus einer Pufferlösung mit niedriger Ionenstärke damit die Proteine optimal an die stationäre Phase binden. Um dann die Proteine eluieren zu können, wird die Ionenstärke in diesem Beispiel mit Natriumchlorid erhöht.[11]


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9.3 Material und Methoden Puffer A: 10 mM Tris- Base, pH 7.5 mit HCl einstellen 10 mM NaCl 10 mM Mg- Acetat Puffer B: Puffer A plus 1 M NaCl Säule : DEAE Sepharose- Säule XK 16, 1.6 cm Durchmesser, Füllhöhe 15 cm Bettvolumen 30 ml Schlauchquetschpumpe: Pump P1 Pharmacia Biotech UV- Monitor: SINGLE PATH MONITOR UV-1 Control Unit, Pharmacia Biotech Optical Unit UV-1 Schichtdicke 3 mm Fraktionssammler Pharmacia Biotech, Redi Frac Schreiber Pharmacia Biotech Küvetten Präzisions Küvetten aus Quarzglas SUPRASIL Helma, Typ Nr. 105.202-QS Kühlzentrifuge Eppendorf 4124 Schönenbuch Basel Centrifuge 5804 R Spektrophotometer: UV- Visible spectrophotometer CARY 50 Scan Varian Mikrotiterplatten Microtest Plate 96 Well Flat Bottom, Sarstedt Bio Assay Reader: HTS 7000 Perkin Elmer Reaktionsstopplösung: 1 M Dinatriumcarbonatlösung Methode: nach [11]


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9.4 Packen der Säule Es wurden 30 ml DEAE-Sepharose-Gel mit 30 ml Puffer A in einem Messzylinder vorsichtig gemischt. Es durfte nicht mit dem Magnetrührer gerührt werden, da die Beats sonst beschädigt werden könnten und ein Gradient entstände, weil sich kleine Stücke der Beads in der Säule absetzen. Die 60 ml Gelsuspension wurde mit Hilfe eines Glasstabes in die Säule gefüllt. Die Auslaufkapillare wurde geöffnet und das Gel setzte sich unter Druck ab. Die Säule sollte möglichst luftblasenfrei sein. Nach Absetzen des Gels betrug die Säulenhöhe 12 cm. Danach wurde der Adapter möglichst luftblasenfrei in die Säule eingeführt indem die Säule noch etwas mit Puffer gefüllt und der Adapter in einem 45° Winkel aufgese tzt wurde. Um den Zusammenbau des kompletten Systems (Pumpe, Schreiber, UV- Monitor) zu überprüfen, wurde zuerst die Pumpe auf einen Fluss von 1ml/min kalibriert. Danach wurde, als das System luftblasenfrei war, eine 0.6 mg ml-1 Rinderserumalbuminlösung durch den UV- Monitor gepumpt und mit dem Schreiber erfasst, um zu testen ob der Schreiber mit einem Signal auf die Lösung reagiert. Ebenfalls wird der Fraktionssammler so eingestellt, dass die Tropfen, ohne an den Rand des Reagenzgläschens zu gelangen, hinein tropften. Als alles überprüft war, wurde die Säule angeschlossen und alles so vorbereitet, dass mit dem Auftragen der Probe begonnen werden konnte. Es wurde noch eine Aktivitätsbestimmung der Probe, vor dem Auftragen auf die Säule, durchgeführt.

9.5 Auftragung der Probe auf die Säule Um die Probe von Partikeln und ausgefallenen Proteinen zu befreien, wurde die Probe 15 min in einer Kühlzentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl zentrifugiert. Dann wurde die Proteinlösung mit einem Volumen von 7.5 ml in ein 15 ml Falcontube gegeben und über den Flow- Adapter mit einem Fluss der Pumpe von 1 ml/min auf die Säule geladen. Während dem Laden wurden Fraktionen von 10 ml aufgefangen. Nachdem die Probe auf der Säule war, wurde in das Falcontube noch etwas Puffer gegeben, um den Rückstand der Probe zu entfernen. Dann wurde noch mit Puffer A nachgespült, solange bis der Schreiber etwa wieder die Basislinie anzeigte d.h. solange bis die unerwünschten Proteine ausgespült waren. Danach wurde der Gradientenmischer angeschlossen. Das eine Gefäss wurde mit Puffer A und das andere mit Puffer B gefüllt. Der Hebel wurde umgelegt und die Verbindung von Kammer A zu Kammer B geöffnet. In Kammer A befindet sich ein Magnetrührstäbchen, welches die Mischung von Puffer A und B und somit einen Anstieg der Natriumchlorid-konzentration ermöglichte. Nun wurden Fraktionen mit einem Volumen von 3 ml gesammelt. Mit steigendem Gradienten wurde die β- Galactosidase und weitere Proteine herausgespült. Die Chromatographie ging so lange, bis das Signal des Schreibers wieder in etwa der Basislinie entsprach. Die Chromatographie wurde beendet.


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9.6 Mikrotiterplatten- Assay Um die Aktivität der vielen angefallenen Fraktionen möglichst schnell messen zu können wurde ein Mikrotiterplatten- Assay durchgeführt. Dabei wurde die Extinktion nach dem Abstoppen der Reaktion bei einem definierten Zeitraum von 10 min bei 405 nm gemessen. Es wurde in ein 96 Well- Plate in jede Vertiefung jeweils 200 µl Z- Puffer pipettiert. In die erste Zeile wurde 50 µl Probe gefüllt. Durch fünfmaliges Ein- und Ausstossen wurde die Probe gut gemischt. Dann wurden weitere 50 µl von der ersten in die zweite Spalte pipettiert und wieder gemischt immer so weiter bis zur zweitletzten Spalte, die letzte entsprach dem Blindwert. Dies ergaben Verdünnungen der Proben von 1:5, 1:125, 1:625, 1:3125, 1:15625 bis 1:78125. Dann wurden in die Zeilen, in definierten Zeitabständen innerhalb von 5 min (Pro Zeile jeweils 30 s) jeweils 40 µl 2NPG- Lösung (4 mg/ml) zupipettiert. Es wurde bei den verdünntesten Proben gestartet damit die Spitzen nicht gewechselt werden mussten. Nach 10 min wurden in jede Spalte wieder in definierten Zeitabständen 30 µl Stopp- Lösung zugegeben. Durch den hohen pH dieser Lösung wurde die Reaktion gestoppt. Die Well- Plates wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach bei 405 nm gemessen.

9.7 Resultate Die Stellgrösse der Pumpe für einen Fluss von 1ml/min betrug 0.9. Der Schreiber reagierte auf die Rinderserumalbuminlösung mit einem schönen Peak. Somit war der Test des gesamten Systems gut. Die β- Galactosidase positiven Werte wurden in den Vertiefungen gelb gefärbt (siehe Abb.3).

Abb. 3 Aktivitätsmessung der Fraktionen von der Ionenchromatographie

Zur Auswertung der Aktivitätsmessung der 96 Well- Plates wurden die E405- Werte von 0.2 bis 1 genommen. Die Aktivitätsmesswerte wurden ins Excel übertragen. Von diesen wurde ein Blockdiagramm erstellt und die Werte tabellarisch aufgenommen. Anhand der Auswertung der Aktivitätsmessung wurde bestimmt wie gepoolt wurde. Es wurde von Fraktion 29 bis Fraktion 39 gepoolt (→ Abb.4).


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Das Volumen der gepoolten Fraktionen lag bei 33 ml. Von der gesamten Fraktion wurde eine Aktivitätsmessung durchgeführt.

0.0

1000.0

2000.0

3000.0

4000.0

5000.0

6000.0

7000.0

8000.0

9000.0

10000.0

317

a 18 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 40b 42

Fraktion

OD

Abb. 4 Zeigt die Darstellung der Aktivitäten in einem Blockdiagramm gepoolt wurde von der Fraktion 29 bis zur Fraktion 39.

Die Aktivität lag bei 5770 Units. Die Gesamtausbeute nach der Chromatographie lag bei 51.3 %. Im Vergleich nach der Dialyse lag die Aktivität bei 8825 Units und die Ausbeute bei 78.4 %. Dies zeigt einen hohen Verlust der Aktivität und Ausbeute über die Chromatographie.

Tab. 10, Zeigt die Resultate tabellarisch dargestellt

Probe Volumen [ml]


spezifische Aktivität

[U/mg] [G4]

Gesamt-protein

[mg]

Schritt-ausbeute

[%]

Gesamt-ausbeute [%] [G6]

nach Dialyse 12 8825 27 321 87 78.4

Aufgetragen auf IEX 11.5 8457 - - - -

Gesamt-ausbeute nach Pool

33 5770 141 41 68.2 51

9.8 Diskussion Es wurde von Fraktion 29 bis Fraktion 39 gepoolt (siehe Abb. 4). Die Überlegung war, dass gegen vorne eher weniger Fraktionen mitgenommen wurden, da die Wahrscheinlichkeit einer Verschmutzung durch andere Störsubstanzen höher schien. Gegen hinten wurde grosszügig gepoolt, damit eine möglichst hohe Ausbeute an β- Galactosidase erreicht wurde. Die Aktivitat des Pools lag etwas tief, dies könnte daran liegen, dass die Probe nicht so gut gemischt wurde, nachdem die Fraktionen zusammengeleert wurden. Die Probennahme fand wahrscheinlich zu diesem Zeitpunkt statt. So lässt sich die tiefe Aktivität erklären. Ebenfalls kann es aber auch sein, dass ein grosser Verlust der Aktivität durch Verlust über die Säule stattfand.


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10 Gelfiltration

10.1 Aufgabestellung Um das Enzym noch weiter von störenden Proteinen zu reinigen, wird eine Gelfiltration durchgeführt. Bei dieser werden die grösseren Proteine durch die Säule gespült und die kleineren sowie das Captureprotein diffundieren in die Poren der Beads.

10.2 Theorie Gelfiltration Die grossen Moleküle eluieren zuerst von der Gelfiltrationssäule im sogenannten Void- Volumen, die kleineren Moleküle diffundieren in die Poren. Das Void Volumen entspricht dem Zwischenraum der Beads und macht etwa einen Drittel des Säulenvolumens aus. Meistens wird das Gelmaterial so gewählt, dass das Zielprotein genau in die Poren passt und dort verweilt. Der Trennbereich hängt von der Beadsgrösse ab. Die Porengrösse der Beads (Durchmesser) liegt meistens im Bereich von 5- 15 µm. [20] Unter optimalen Bedingungen (bei richtiger Porengrösse) kann ein globuläres Protein von einem doppelt so grossen, anderen Protein getrennt werden. Dazu darf das Auftragsvolumen nicht zu gross sein. Die Viskosität der Säule darf ebenfalls nicht viel höher als die des Eluens sein, da es sonst zu einem unregelmässigen Säulenfluss kommen könnte. [12] Je grösser das Molekül desto schneller geht es durch die Säule. Dieses Prinzip wenn die grossen Moleküle zuerst durch die Säule gehen und die Kleinen verweilen, wird Isokrat genannt.

Abb. 5 Zeigt das Prinzip der Gelfiltration [23]

In diesem Versuch geht es darum, die β- Galactosidase möglichst gut von anderen Proteinen zu befreien und Schmutzpartikel wie Nukleinsäuren zu entfernen.


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Bestimmung der theoretischen Bodenzahl Die Zahl der theoretischen Böden wird berechnet um die Effizienz einer Säule zu bestimmen. Ist der Peak symmetrisch, (kann mit Formel G7 berechnet werden) sollte der Wert zwischen 0.8 und 1.8 liegen. Wird die Bodenzahl aus der normierten Breite auf halber Höhe w1/2, berechnet wird nach Formel G8 (→ 2 Formeln) vorgegangen. Die Gesamtaufenthaltszeit des Stoffes in der Säule muss für die Berechnung der theoretischen Bodenzahl genommen werden, da auch Diffusionsvorgänge in der mobilen Phase eine Rolle spielen könnten bei der Peakverbreiterung. [13] Je länger eine Säule ist desto besser ist auch die Trennung. Bei einer gut gepackten Säule wird eine Bodenzahl von 9000 und mehr erreicht (Material Sephacryl S100-S500 HR). Um die Säule zu testen wird Aceton verwendet. Aceton ist ein kleines Molekül und ist daher gut geeignet. Aceton interagiert auch nicht mit der Säule. Bei kleinen Auftragsvolumen muss sich ein symmetrischer Peak ergeben. Falls sich ein leading Peak zeigt, muss die Säule mit einem kleineren Fluss getestet werden, falls sich ein tailing Peak zeigt, muss die Säule mit einer erhöhten Flussgeschwindigkeit getestet werden. [13]

10.3 Material und Methoden Automatisierter Aufbau: Säule: Superose 6- Säule 24 ml Bettvolumen PC FPLC: Compaq Deskprd 4/66i FPLC- System: Monitor UV-M, Pump P500, Liquid Chromatographie Controller LC- 500 Plus, Fraktion Collector Frac- 100 Küvetten Präzisions Küvetten aus Quarzglas SUPRASIL Helma, Typ Nr. 105.202-QS Spektrophotometer: UV- Visible spectrophotometer CARY 50 Scan Varian


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Mobile Phase: Puffer A: 10 mM Tris- Base, pH 7.5 mit HCl einstellen 10 mM NaCl 10 mM Mg- Acetat Für die Überprüfung der Säule wird ein Standardgemisch verwendet welches Tyroglobulin, γ- Globulin, Ovalbumin, Myoglobin und Vitamin B12 enthält. Methode für Überprüfung: 0.00 FLOW 0.5 ml 0.50 INJ_VALVE Inject 1.00 FRACTION_COLLECTOR Start 15.0 INJ_VALVE Load 60.0 FRACTION_COLLECTOR Stop 60.0 END_METHOD Steigung 0.2 und der Fraktionssammler wechselte nach einer Minute. Methode für Messung: 0.00 FLOW 0.5 ml 0.50 INJ_VALVE Inject 1.00 INJ_VALVE Load 1.00 FRACTION_COLLECTOR Start 60.0 FRACTION_COLLECTOR Stop 60.0 END_METHOD

Abb. 6 Aufbau eines automatisierten Chromatographiesystems


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10.4 Ultrafiltration Die Probe mit einem Volumen von 33 ml wurde mittels Ultrafiltrationszellen zu einem Volumen von 2 ml aufkonzentriert. Von dieser Probe wurde noch eine Aktivitätsmessung durchgeführt.

10.5 Überprüfen der Säule Nach dem Spülen der Anlage und der Säule mit Puffer A, wurde die Säule gemäss Anleitung [14] überprüft. Dazu wurde ein Standardgemisch der Firma Biorad in 0.5 ml Wasser gelöst und ein Volumen von 100 µl auf die Säule aufgetragen. Es wurde kontrolliert, ob eine Trennung der Peaks erfolgte.

10.6 Auftragen der Probe auf die Säule Bevor die Probe auf die Säule aufgetragen werden konnte, musste sie noch von störenden Partikeln befreit werden und wurde daher während 15 min in der Kühlzentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl zentrifugiert. Danach wurde ein Teil des Überstandes auf die Säule aufgetragen. Genau wurden von der konzentrierten Probe 1.35 ml auf die Säule gegeben. Die Messung erfolgte nach der Methode, welche im Kapitel Material und Methoden (siehe nächste Seite) beschrieben wird. Der Fraktionssammler wechselte alle zwei Minuten die Fraktion. Der Fluss lag während der Beladung sowie bei der Messung bei 0.5 ml/min. Nach etwa 8 ml zeigte sich der erste Peak, dieser entsprach etwa dem Void- Volumen. Nachdem dann das Signal wieder zurück zur Basislinie kehrte, wurde die Messung nach 60 min abgebrochen. Es wurde ein Aktivitätstest mit Mikrotiterplatten (→ Kapitel 7.5) durchgeführt.

10.7 Bestimmung der theoretischen Bodenzahl Es wurde eine 1% Acetonlösung hergestellt (50 µl auf 5 ml H2O) und 125 µl auf die Säule aufgetragen. Von dem durch die Messung erhaltenen Peak wurde dann mithilfe der Gleichung G8 (→ Formeln) die theoretische Bodenzahl berechnet.


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10.8 Resultate Überprüfen der Säule Die erste Substanz, welche durch die Säule kam war Tyroglobulin. Diese Substanz weist das höchste Molekulargewicht von 670'000 Da auf. Die beiden Substanzen am Schluss waren Myoglobin und Vitamin B12. Myoglobin war in der Säule als leicht bräunliche Substanz erkennbar. Diese Farbe kommt von dem Eisen- Komplex. Vitamin B12 war in der Säule als rosarote Substanz sichtbar. Dies kommt daher, das Vitamin B12 ein Komplex aus Kobalt ist.

Abb. 8 Vitamin B12 mit Kobalt als zentrales Atom [25]

Abb. 9 Zeigt das Chromatogramm der Standardlösung. Ganz links ist bei 13.04 min Thyroglobulin dann folgt bei 16.59 min Gamma globulin, 17. 96 min Ovalbumin und dann Myoglobin und Vitamin B 12.

Abb. 7 Myoglobin mit Eisen als zentrales Atom [24]


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Auftragen der Probe auf die Säule Die Auftrennung der Probe war auf der Säule nicht so schön sichtbar wie bei der Testlösung. Auf dem Chromatogramm entstand ein breiter Peak welcher sich über das ganze Spektrum ausdehnte. Der erste Peak kam auch etwa nach 8 ml (4 min). Danach kam ein riesen Peak von etwa 9 bis 20 ml. Es sah aus als ob der Riesenpeak aus drei verschiedenen Peaks bestand. Das Histogramm der Aktivitätsmessung wurde eingezeichnet und anhand von diesem konnte besser erkannt werden, wo es sich um β- Gal handelte.

Abb. 10 Zeigt den Peak welcher β - Gal enthält. Dazu das Histogramm der Aktivitätsmessung.

Mithilfe des Histogrammes, in welchem die Werte der Aktivität eingezeichnet wurden und des Riesenpeaks wurde entschieden welche Fraktionen gepoolt wurden. Es wurden nur zwei Fraktionen Nr.16 un 17 miteinander gepoolt. Die restlichen Fraktionen ergaben den Restpool. Von beiden Proben wurde nochmals die Gesamtaktivität bestimmt. Die Aktivität des Restpools lag bei null.


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Tab. 11 Zeigt die Resultate der Aktivitätsmessung vor und nach der Gelfiltration.

Probe Volumen [ml]



Gesamt- protein [mg]

Schritt-Ausbeute [%] [G6]

Gesamt-Ausbeute [%]

Nach Aufkonzentration vor Gelfiltration

2 8201 547 15 142 78.4

Aufgetragen auf Gelfiltration 1.3 5536 - - - -

Endpool Gelfiltration 2 2194 247 8 40 51

Bestimmung der theoretischen Böden

Abb. 11 Aceton- Peak nach 22.67 ml, a und b eingezeichnet. Wurden für die Berechnung der Symmetrie verwendet (G7)

Das Peakmaximum liegt bei 22.67 ml, die Peakbreite w1/2 entsprach 0.84 ml. Diese Werte wurden auch für die Berechnung der Bodenzahl (G8) verwendet. Die Zahl der theoretischen Böden lag bei 13450 m-1. Absolut für die Länge der Säule sind es 4035 theoretische Böden. Die Symmetrie des Peaks betrug 1.4 berechnet gemäss G7.


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10.9 Diskussion Überprüfen der Säule Die Auftrennung der Peaks ist nicht optimal (siehe Abb.9). Dies könnte daran liegen, dass der Puffer eine zu hohe Leitfähigkeit aufweiste. Der Grund für die hohe Leitfähigkeit war, dass zu viel Natriumchlorid zugegeben wurde. Es wurde auch vermutet, dass die Säule nicht mehr gut auftrennte, da sie schon recht alt war. Auftragen der Probe auf die Säule Aufgrund von Abb. 10 wurden die Fraktionen 16 und 17 miteinander gepoolt. Es wurden nur die zwei Fraktionen mit den beiden höchsten Aktivitäten gepoolt, um eine möglichst reine β – Gal zu erhalten. Die restlichen Fraktionen wurden ebenfalls zu einem Restpool zusammengenommen. Die Auflösung des Peaks ist nicht gut dies könnte daran liegen, dass die Ionenstärke des Puffers zu hoch war. Die Aktivität der Probe nach der Aufkonzentration und vor der Gelfiltration lag viel höher als vor der Aufkonzentration (siehe Abb. 5 Gesamtausbeute aus Pool). Dies ist nicht möglich weil die Aktivität nicht zunehmen kann. Eine Begründung dafür wäre, dass die Probenahme bevor des Mischens des Pools der Ionenchromatographie erfolgte. Dann könnte es auch sein, dass die Aktivität durch dies falsch gemessen wurde und daher grösser wurde. Ebenfalls könnte es sein, dass eine Verschleppung stattgefunden haben könnte, bei der Aufkonzentrierung der Probe auf das Volumen von 2 ml. Der Wert von 8201 Units ist aber nicht realistisch weil ein so geringer Verlust fast nicht möglich ist. Die Probe wurde aber aufgrund des hohen Wertes dreimal wiederholt gemessen. Die Aktivität war aber immer gleich hoch. Somit lässt sich dieser hohe Wert auch nicht durch einen Messfehler erklären. Die Aktivität der Gesamtausbeute aus dem Pool der IEX wurde auch nochmals gemessen und die Aktivität war gleichgross wie bei der ersten Messung, bei dieser Probe kann somit ebenfalls ein Messfehler ausgeschlossen werden. Bestimmung der theoretischen Böden Die Säule weist eine Bodenzahl von 4035 auf. Eine gute Säule sollte eine Trennstufenzahl von 9000 aufweisen. Auf einen Meter berechnet hat die Säule eine Bodenzahl von 13450 m-1. Damit sollte die Trennleistung der Säule optimal sein. Der schlechte Peak kann somit durch die eventuell schlechte Trennleistung der Säule nicht begründet werden. Es liegt wahrscheinlich tatsächlich an der hohen Ionenstärke des Puffers.


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11 Spektrometrische Bestimmung Um spektrometrisch das Absorptionsmaximum zu bestimmen wurde ein Scan der Probe über einen Wellenlängenbereich von 240 bis 350 nm gemessen. Über dieses Maximum kann bestimmt werden, wie gross die Verunreinigung durch DNA-Material war. Das Absorptionsmaxima des reinen Proteins liegt bei 280 nm, dasjenige der DNA bei 260 nm. Die Probe wurde vor der Ionenchromatographie und nach der Gelfiltration gescannt. Das Maximum vor der IC lag bei 259 nm und unterschied sich nur sehr gering von der aufgereinigten Probe nach der Gelfiltration mit einem Maximum von 262 nm. Es ist anzunehmen, dass die Probe noch immer mit einem grossen Anteil an DNA verunreinigt war.

Abb. 12 Scan der aufgereinigten Probe nach der Gelfiltration

Durch den Vergleich der Absorptionen bei 260 nm und 280 nm kann eine DNA-Konzentrationsabschätzung berechnet werden. [18]

38.1384.0533.0

A

AFaktorDNA

280

260 ===

Eine reine DNA-Lösung besitzt einen DNA-Faktor von 1,8. Eine 50%ige Protein/DNA-Lösung zeigt ein Absorptionsverhältnis von ca. 1,5. Demnach liegt die DNA-Konzentration mit etwas unter 50%, wie aus dem Spektrum erwartet, ziemlich hoch. Eine Möglichkeit, dieses Resultat noch zu verbessern wäre eine weitere DNA spezifische Fällung. Beispielsweise könnte eine Protaminsulfatfällung gemacht werden. Da diese Fällung jedoch auch zur Fällung von Proteinen verwendet wird, ist bei solch hoch konzentrierten Proben eher davon abzuraten. Als weitere Möglichkeit könnte die Probe mit Benzonase versetzt werden. Dieses Enzym schneidet die DNA in kleine Teile. Danach kann die Probe durch Gelfiltration von der DNA getrennt werden.


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12 Gesamtproteinbestimmung nach Bradford

12.1 Aufgabestellung Die Analyse des Proteingehaltes der einzelnen Aufreinigungsschritte mittels des kolorimetrischen Assays nach Bradford. Der Einfluss der Proteinart sollte durch die Messung zweier Kalibrationsreihen mit IgG und BSA überprüft werden.

12.2 Theorie Bei der Methode nach Bradford werden die Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brillant Blue angefärbt. Die Stabilisierung des Farbstoffs durch Komplexbildung mit dem Protein verschiebt das Absorptionsmaximum von 465 nm zu 595 nm. Der Farbstoff bindet unspezifisch an kationisch, nicht polare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Reaktion erfolgt in saurem Milieu. Die Farbintensität ist abhängig vom Gehalt an basischen und aromatischen Aminosäuren. Am wichtigsten ist die Wechselwirkung mit Arginin. Die Färbung ist also abhängig von der Anzahl der basischen und aromatischen Aminosäuren. Aus diesem Grund muss zur Kalibration ein sehr ähnlich aufgebautes Protein eingesetzt werden. Störsubstanzen sind Triton- X- 100 und SDS sowie Natriumdesoxycholat und allgemein Substanzen welche das Absorptionsmaximum von Coomassie Brillant Blue stören.

12.3 Material und Methoden Material

- Mikrotitterplatten 96 Well Plate - ELISA Reader - Soccorex Mehrkanalpipette 50-200µl

Chemikalien Reagenz Coomassie®brillant blue G-250, Bio-Rad Standardprotein 1: Rinderserumalbumin (BSA) Standardprotein 2: IgG Methode Die Probeverdünnungen wurden nach Vorschrift Proteinbestimmung [5] aus dem Skript hergestellt. Von den Proben wurde eine Einzelbestimmung und von den beiden Kalibrierproteinen je eine Doppelbestimmung auf das 96 Well- Plate aufgetragen.


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12.4 Ergebnisse Kalibration

y = 0.0129x + 0.3115

y = 0.0167x + 0.3383

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

0 10 20 30 40 50

Konzentration [ug/ml]

Abs

orba

nce BSA 9

IgG 11

Linear (IgG 11)

Linear (BSA 9)

Abb. 13 , Kalibrationsgeraden der beiden Standardproteine IgG (Rhomben) und Rinderserumalbumin (BSA, Dreiecke)

Die Doppelbestimmungen der einzelnen Standards liegen nahe beieinander, deshalb wurden nur die einen Bestimmungen dargestellt. Proteinbestimmung Die Gesamtproteinzahl wurde über den Standard BSA berechnet, da dieses Protein am ehesten dem Zielprotein entspricht.

Abb. 14, 96-Well Plate mit der Gesamtproteinbestimmung nach Bradford. Die blauen Färbungen entsprechen Proteinkonzentrationen in der Probe. In den hoch konzentrierten Proben kann das Ausfallen der Proteine und die Schaumbildung deutlich erkannt werden.


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Tab. 12, Auswertung der Gesamtproteinmenge aus der Absorption

Probe Absorbance Verdünnung

F Konzentration [→G9] [mg/ml]

Proteinmenge [→G10] [mg]

Rohextrakt 0.603 3125 41.7 667 Überstand nach Fällung 0.535 3125 32.0 352 Präzipitat 0.887 3125 82.0 615 nach Dialyse 0.498 3125 26.8 321 nach IC 0.526 125 1.2 41 nach Ultrafiltration 0.581 625 7.7 15 nach Gelfiltration 0.445 625 3.8 8 Restpool Gelfiltration 0.566 125 1.5 11

12.5 Diskussion Kalibration Die beiden Kalibrationsgeraden unterscheiden sich deutlich voneinander. Hiermit konnte bewiesen werden, dass die Bestimmung von der Art des Proteins abhängt. Proben Der Gehalt an Gesamtproteinen in den Proben, Rohextrakt und Präzipität liegen viel zu hoch. Nach der Faustregel (→ 6.5 Diskussion) kann sich in der Probe lediglich 332 mg Protein befinden. Solch hohe Konzentrationen an Proteine fallen durch die Zugabe der Färbesubstanz aus. Diese weissen Festpartikel produzieren ein kaum entfernbarer Schaum. Beide Tatsachen können die Messung verfälschen. Auch die hohe Ionenstärke, die nach der Ammoniumsulfatfällung herrscht, kann die Messung stören. Im Weiteren kann das ganze Zellmaterial im Rohextrakt als Störsubstanz wirken.


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13 SDS-Page

13.1 Aufgabenstellung Die Reinheit der verschiedenen Aufarbeitungsschritte ist mit einer Gelelektrophorese durch SDS-Page zu ermitteln.

13.2 Theorie [15] Die Gelektrophorese nach SDS-Page trennt die Probe nach deren Grösse auf. Das Prinzip beruht auf zwei unterschiedlichen Pufferzusammensetzungen. Dem Trenngel und dem Sammelgel. Dabei entscheidet der Anteil an Polyacrylamid im Gel über die grösse der Poren. Je mehr Polyacrylamid in einem Gel steckt, desto kleiner werden die Poren. Wie es der Name schon verrät wird beim Sammelgel die aufgetragene Probe verdichtet. Dieses Gel ist grossporig und kann somit die Proben nicht auftrennen. Der Anteil an Polyacrylamid liegt bei 4%. Dieses Gel besitzt einen pH von 6.8. Das Trenngel, das die Probe der Grösse nach auftrennt besitzt einen höheren Anteil an Polyacrylamid (7.5%) und zeigt dadurch enge Poren. Es besitzt einen pH-Wert von 8.8. Sodiumdodecyl Sulfat (SDS) bindet an die Proteine und denaturiert dessen Quartär, Tertiär und teilweise sogar ihre Sekundärstruktur. Die Proteine werden so auf eine einheitliche Form gebracht. In den Gelpuffer liegen Chloridionen vor, im Laufpuffer dagegen Glycin. Glycin liegt bei dem pH des Sammelgels vorwiegend als Zwitterion vor und bewegt sich so nur sehr langsam. Die negativen Chloridionen sind sehr klein und wandern mit hoher Mobilität zur Anode. Zwischen diesen beiden Zonen entsteht dadurch eine ionenverarmte Zone. In diesem Raum halten sich die verschieden geladenen Proteine nach ihrer elektrophoretischen Mobilität auf. Im Trenngel jedoch wird das Glycin negativ geladen und wandert an die Anode. Das SDS bindet an die Seitenkette der hydrophoben Aminosäuren an das Protein. Damit wird das Protein gleichmässig mycellenartig überdeckt und es entsteht eine grössenabhängige Ladungsverteilung. Durch diesen Effekt wird nicht die Ladung des Proteins, sondern die Grösse für dessen Auftrennung verantwortlich.

13.3 Material und Methoden Material - Probehalter - Elektrodenhalter - Eppendorf Zentrifuge „mini Spin“ - Heizgerät für Eppendorf-Tubes MBT 250 ETG - Schwenkgerät, Platform Rocker STR6 Stuart, Huber und Co AG Chemikalien Trenngel (7.5%) sowie Sammelgel (4%) wurden nach der Vorschrift aus dem Skript hergestellt. Laufpufferherstellung: 160 ml des Vorliegenden SDS-PAGE Probenpuffer pH 8.3 ad 800 ml dest Wasser.


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Referenzen: β-Galactosidase, Fluka High Range Marker, Bio-Rad Besteht aus den Proteinen Myosin (200 kDa), β-Galactosidase (116,3 kDa), Phosphorylase b (97,4 kDa), Serum albumin (66,2 kDa), Ovalbumin (45 kDa) Methode Es wurde mit Methode nach Lämmli gearbeitet. Die beiden Glasplatten wurden zuerst auf ihre Sauberkeit geprüft und gegebenenfalls die Fettflecken mit EtOH entfernt. Dies gewährleistet ein sauberes und gleichmässiges Giessen der Gele. Die beiden Glasplatten wurden durch die Abstände getrennt aufeinander gelegt und in die Vorrichtung gesperrt. Durch senkrechtes Halten der Vorrichtung wurden die beiden Glasplatten zu gleichmässigem Aufliegen gezwungen. Nun wurden die Befestigungsschrauben zum gleichmässigen Druckausgleich diagonal Handfest angezogen. Da die Vorrichtung nicht ganz Dicht war, wurde beim Einrastungsnippel ein Abstandshalter eingesetzt, damit die Glasplatten mit grösserem Druck auf die Dichtung gepresst wurden. Das Befüllen der Gele wurde nach der Vorschrift „SDS-PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis)“ gemacht. Dabei wurden die Gellösungen seitlich eingefüllt. Nach der Befüllung durch das Trenngel wurde die Grenzfläche mit ca. 2 mm Isopropanol bedeckt. Nach abgelaufener Trocknungszeit wurde das Isopropanol mit einem Stück Fliesspapier entfernt, und das Sandwich mit Sammelgel aufgefüllt. Nun wurde der Kamm langsam von einer Seite beginnend bis zum Übergang Zähne/Kamm in das Gel gesteckt. Es dürfen sich dabei keine Luftblasen zwischen den Kammzähnen bilden. Nach dem Trocknen wurde der Kamm vorsichtig entfernt und die Probevolumen gefüllt. Zur Überprüfung der Gelpolymerisation wurden die Pasteurpipetten mit Gellösung gefüllt. Nach erfolgter Trocknung konnte die Lösung nicht mehr aus der Pipette gepresst werden. Die Elektrophorese wurde mit 100V (0.02A) gestartet. Als die Proben die Grenze Sammelgel/Trenngel erreichten, wurde die Spannung auf 200V (0.03A) erhöht. Probevorbereitung Die Probeneinsätze wurden auf eine Proteinkonzentration von 50µl berechnet. Die berechneten Probenvoluminas wurden in Eppendorf Cups mit 5µl Probepuffer versetzt und falls nötig auf 20µl mit dest Wasser ergänzt. Nach dem 5 minütigem Erhitzen bei 95°C wurden die P roben scharf abzentrifugiert, damit sich das Kondenswasser am Deckel wieder in die Lösung mischt. Gelbeladung: 15µl Probelösung 10µl β-Gal-Referenz von Fluka 10µl SDS High-Range-Marker


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Tab. 13, Reihenfolge der Beladung des Geles

Linie Nr

Probe Probevolumen [µl]

1 B-Galactosidase Referenz 10 2 Rohextrakt E.Coli 15

3 Überstand nach Ammoniumsulfatfällung

13

4 Präzipitat nach Ammoniumsulfatfällung 6.5 5 Probe nach Dialyse 15 6 B-Gal Pool nach IC 2 7 Pool des Retentats 3 8 Aufgereinigte Pools nach Gelfiltration 2 9 Restpool nach Gelfiltration 3

10 SDS High-Range-Marker 10

13.4 Ergebnisse

13.5 Diskussion Das Gel wurde teilweise (Banden 2, 4, 7, 8) überbeladen. Vor allem die aufgereinigten Proben 7 und 8 hätten auf 20µl Probeeinsatz berechnet werden sollen. Die beiden Referenzproben Banden 1 und 10 wurden nach aussen hin etwas verzogen. Dies liegt an den Kapillarkräften, die auf die äusseren Grenzschichten des Gels wirken. Der Rohextrakt (1) beinhaltet einen sehr hohen Proteingehalt und ist deshalb für eine elektrophoretische Auswertung nicht gut geeignet. Zu beobachten ist die grosse Menge an kleinen Proteinanteilen. Nach der Ammoniumsulfatfällung (Bande 4) kann eine leichte Verbesserung herausgelesen werden. Jedoch kann aus dieser Bande keine eindeutige Aussage über eine erfolgte Anreicherung der β-Galactosidase gemacht werden. Aus dem Überstand (Bande 3) kann lediglich entnommen werden, dass während diesem Schritt kaum β-Galactosidase verloren gegangen ist. Nach der Dialyse (Bande 5) erfolgte kaum eine Aufreinigung, sie diente vor allem zur Verminderung der Ionenstärke. In der darauffolgenden Ionenchromatografie (Bande 6) konnte die grösste Reinigungswirkung beobachtet werden. Die Zahlreichen Banden mit kleineren molaren Massen sowie auch

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Referenz: β-Galactosidase

200'000 Marker 116'250 Marker 97’400 Marker 66’200 Marker 45’000 Marker

Abb. 15, Angefärbtes Gel der einzelnen Aufreinigungsschritte. 1. Referenz β-Galactosidase, 2. Rohextrakt, 3.Überstand nach Ammoniumsulfatfällung, 4. Präzipitat nach Ammoniumsulfatfällung, 5. nach Dialyse, 6. nach Ionenchromatographie, 7. Retentat nach Ultrafiltration 8. Hauptpools nach Gelfiltration, 9. Restpools nach Gelfiltration, 10. High Range Marker


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im mittleren Bereich konnten entfernt werden. Das Zielprodukt wurde deutlich aufkonzentriert. Da die Proben auf den Banden 7 und 8 zu hoch konzentriert aufgetragen wurden kann kaum eine Aussage über dessen Reinheit gemacht werden. Die Gelfiltration scheint keinen grossen Einfluss mehr auf die Reinigung der Probe beigetragen zu haben. Es wird etwa mit einer Reinheit von 80-85% gerechnet. Im Vergleich zur β-Galactosidase Referenz von der Fluka scheint die Isolierte noch nicht sehr rein, da jene nur eine Scharfe Bande bei 116'250 Da zeigt. Bande 6 zeigt ein schönes Chromatogramm. Sie zeigt deutliche Banden bei 116'250 Da, 97’400 Da und 66'200 Da. 116'250 Da sind die vier Untereinheiten der β-Galactosidase. Die Banden unterhalb des 116’250-Marker entstanden vermutlich aus aktiven Proteasen, welche die β-Galactosidase in kleinere Einheiten gespalten hat.


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14 Abschlussdiskussion Anreicherungstabelle

Tab. 14 Zeigt die Anreicherungstabelle mit allen Aufarbeitungsschritten.

Anreicherungsschritt Volumen der Fraktion[ml]

Gesamt-aktivität[µmol/min]

Protein

[mg/ml]

Gesamt-protein[mg]

SpezifischeAktivität[U/mg]

Schrittaus-beute[%]

Ausbeute

[%]

Anreicherungs-faktor [fach]

Rohextrakt16 11250 42 667 17 100 100 1.0

AmmoniumsulfatPellet

7.5 10160 32 615 17 90 90 1.0

AmmoniumsulfatÜberstand

11 120 82 352 0.3 1

nach Dialyse und einfrieren12 8825 27 321 27 87 78 1.6

Aufgetragen auf IEX11.5 8457

Pool IEX Aufkonzentriert33 5770 1 41 141 68.2 51 8.3

Permeat30 281

Nach Aufkonzentrierung2 8201 8 15 547 142 73 32.4

Aufgetragen auf Gelfiltration1.4 5536

Pool Gelfiltration2 2194 4 8 274 40 19.5 16.3

Am meisten Aktivität ging bei der Ionenchromatographie verloren. Die Proteinmenge welche durch den Bradford- Assay berechnet wurde ist nach der Ionenchromatographie von 321 auf 41 mg gesunken. Dies könnte daran liegen, dass viele andere störende Proteine durch die Ionenaustauschchromatographie entfernt wurden.

An zweiter Stelle liegt der Verlust an Aktivität während der Dialyse. Hier sollte überlegt werden, ob es nicht andere Methoden gäbe, bei welchen nicht so viel Aktivität verloren ginge. HIC oder Ultrafiltration wären noch Ausweichmethoden.

Unrealistisch ist die Zunahme der Aktivität nach der Aufkonzentrierung der Probe. Dies könnte an dem bei Kapitel 10.9 (Gelfiltration) genannten Gründen liegen. Die spezifische Aktivität nach der Aufkonzentration ist sehr hoch, dies liegt aber an der unrealistisch hoher Gesamtaktivität und der kleineren Proteinmenge nach der Aufkonzentrierung der Probe.

Über die Gelfiltration ging viel Aktivität verloren. Der Verlust an Probe über die Säule war wahrscheinlich hoch. Die Gesamtproteinmenge ist am Anfang höher als realistisch wäre. Eigentlich sollte mit einer Gesamtproteinmenge von höchstens 300 mg gerechnet werden. Durch dies wird auch die spezifische Aktivität mindestens doppelt so hoch (siehe Tab.16)


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Tab. 15, Gesamtproteinmenge bei höchstens 300mg

Gesamt-protein[mg]


Rohextrakt300 38

AmmoniumsulfatPellet

300 34

AmmoniumsulfatÜberstand

300 0.4

nach Dialyse und einfrieren300 29

Aufgetragen auf IEX

Pool IEX Aufkonzentriert41 141

Permeat

Nach Aufkonzentrierung15 547

Aufgetragen auf Gelfiltration

Pool Gelfiltration8 274

Durch das Herabsetzten der Proteinmenge auf höchstens 300 mg beträgt die spezifische Aktivität des Rohextraktes nun doppelt soviel wie bei der Gesamtproteinmenge von über 600 mg des Rohextraktes bei Tab. 10.

Aktivität der beta- Gal

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Rohextr

akt

Ammoniumsu

lfat P

ellet

Ammoniu

msulfa

t Übe

rstan

d

nach

Dial

yse un

d einf

riere

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IEX

Pool IE

X Aufk

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riert

Permea

t

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zentrie

rung

Aufge

tragen

auf G

elfiltr

ation

Pool G

elfiltr

ation

Bezeichnung der Aufarbeitung

Akt

ivitä

t in

Uni

ts

0

100

200

300

400

500

600sp

ezifi

sche

Akt

ivitä

t in

Uni

ts/m

g

Gesamtaktivität

spezifische Aktivität

Abb. 16 Zeigt die spezifische Aktivität sowie die Gesamtaktivität über die verschiedenen Aufarbeitungsschritte.

In diesem Blockdiagramm ist deutlich die hohe Aktivität der Ionenaustausch-chromatographie Probe nach der Aufkonzentration zu sehen. Die spezifische Aktivität nach der Gelfiltration ist etwa zweimal tiefer. Dieser Verlust über die Gelfiltration wäre realistisch, wäre der Wert für die Gesamtaktivität nicht zu hoch nach der Aufkonzentrierung.


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Die deutliche Aktivitätsabnahme nach der IEX ist hier auch gut zu erkennen (→13.5 Diskussion SDS-Page).

Anreicherungsfaktor vergl. mit Aktivität

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

Rohex

trakt

Amm

onium

sulfa

t Pell

et

Amm

onium

sulfa

t Übe

rstan

d

nach

Dial

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trage

n auf

Gelf

iltrat

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Pool G

elfiltr

ation

Aufarbeitungsschritt

Anr

eich

erun

gsfa

ktor

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Ges

amta

ktiv

ität i

n U

nits

Anreicherungsfaktor

Gesamtaktivität

Abb. 17 Anreicherungsfaktor mit Gesamtaktivität in einem Balkendiagramm dargestellt.

Der Anreicherungfaktor nimmt mit jedem Reinigungsschritt zu. Ausnahme ist wieder die Probe nach der Aufkonzentration dort steigt der Anreicherungsfaktor extrem hoch und sinkt dann nach der Gelfiltration wieder stark. Es lässt sich aus diesem Blockdiagramm sagen, dass die Ionenaustauschchromatographie am meisten zur Reinigung der β- Gal beiträgt (→ 13.5 Diskussion SDS-Page) (ebenfalls trägt auch die Gelfiltration ein grosses Stück zu Aufreinigung bei wenn der Anreicherungsfaktor mit dem nach der Dialyse verglichen wird. Eigentlich sollte am Anfang die grösste Verunreinigung entfernt werden, demnach sollte auch der Anreicherungsfaktor dementsprechend am Anfang am meisten ansteigen. Um ebenfalls eine gute Proteinaufreinigung zu erhalten, sollte die Probe auch möglichst wenig ein- und aufgetaut werden. Ein Verlust der Gesamtaktivität allgemein kann auch davon kommen, dass zwischen den Aufarbeitungsschritten die Probe eine Woche im Tiefkühler aufbewahrt worden war.


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15 Vergleich der Resultate mit der Literatur

Tab. 16, Anfangs-und Endwerte verglichen mit den Literaturwerten

Anreicherungsschritt Gesamt-aktivität[µmol/min]

Protein

[mgl]

Ausbeute

[%]


Anreicherungs-faktor [fach] Autoren

Rohextrakt (am Anfang) 11250 663 100 17 1 N. Mennel, E. GerberPool (am Ende) 2194 8 19.5 274 16.3Rohextrakt (am Anfang) 80000 15400 100 5 1 HU, Wolfe and ReithelPool (am Ende) 36600 560 46 66 13.2 [16]Rohextrakt (am Anfang) 74860 7200 100 10.4 1 B. Schwenzer, G. Kopper-Pool (am Ende) 50800 278 68 182.7 17.6 schläger [17] Die Ausbeute im Vergleich liegt im BC- Praktikum deutlich tiefer als bei den Literaturwerten. Das führt daher, dass viel Protein während den verschiedenen Aufreinigungsschritten verloren ging. Die Gesamtproteinmenge am Schluss im BC- Praktikum beträgt nur noch 8 mg dies entspricht 1.2 %. Die Gesamtproteinmenge am Schluss von HU, Wolfe and Reithel beträgt am Schluss noch 560 mg dies entspricht immerhin einem Anteil von 3.6%, welcher doch etwas höher ist, als der im BC- Praktikum erhaltene Wert. Die Proteinmenge von B. Schwenzer und G. Kopperschläger beträgt 278 mg dies entspricht einem prozentualen Proteinanteil von 3.9 % vom Anfangswert und ist somit der höchste der drei Werte. Die spezifische Aktivität liegt deutlich höher am Anfang der Aufreinigung sowie auch am Schluss der verschiedenen Aufreinigungsmethoden. Damit ist der Anteil des Zielenzyms von den, im Praktikum erhaltenen Werten, deutlich am höchsten, was auf eine gute Aufreinigung des Zielproteins hindeutet. Dies kann ebenfalls am Anreicherungsfaktor abgelesen werden. Dieser ist am Ende genau zwischen den beiden Literaturwerten und somit kann auch gesagt werden, dass die Proteinaufreinigung vergleichsweise gut gelungen ist


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16 Literaturverzeichnis

16.1 Literatur [1] D. Nelson, M. Cox, Lehninger Biochemie, 3.Auflage, Springer Verlag Berlin, 2005, Seite 1174 [2] D.C.Zaborosch, Praktikumsskript Proteinisolierung [3] Praktikum Skript, Enzymes Diagnostic Reagent Grade, β-Galactosidase from Escherichia coli, Toyobo enzymes [4] Hubert Rehm, Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, 4.Auflage, Spektrum Verlag, Heidelberg Berlin, 2002 [5] D.C.Zaborosch, Praktikumsskript Proteinbestimmung [6] Dr. C. Zaborosch Was ist bei einer Enzymanreicherung grundsätzlich zu beachten? [7] Dr. C. Zaborosch Aktivitätsbestimmung der b-Gal [8] A.Pingoud, C.Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochiemie, Mechanische Aufschlussverfahren, deGruyter, Berlin, 1997, Seite 49 [9] A.Pingoud, C.Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochiemie, Ammonium- sulfatfällung, deGruyter, Berlin, 1997, Seite 53 [10] A.Pingoud, C.Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochiemie, Dialyse, deGruyter, Berlin, 1997, Seite 57 [11] Dr. C. Zaborosch Ionenaustausch- Chromatographie [12] A.Pingoud, C.Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochiemie, Gelfiltration, deGruyter, Berlin, 1997, Seite 72 ff. [13] Dr. C. Zaborosch theoretische Böden [14] Dr. C. Zaborosch Gelfiltration [15] A.Pingoud, C.Urbanke, Arbeitsmethoden der Biochiemie, SDS-Page, deGruyter, Berlin, 1997, Seite 112 [16] HU, Wolfe and Reithel, β-Galactosidase from E.coli, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 81, 500-507 [17] B. Schwenzer, G. Kopperschläger, Puification of E.coli β-Galactosidase, Biomed, Biochim, 1989, Acta 48 [18] F- Lottspeich J.W. Engels, Bioanalytik, Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren, Elsevier Spektrum München, 2.Auflage, 2006 S.637


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16.2 Internetadressen [19] http://www.kowoma.de/gps/zusatzerklaerungen/Praezision.htm [20] http://de.wikipedia.org/wiki/Gelfiltration [21] http://www.pci.uni-heidelberg.de/apc/pcf/PCF_V03.pdf

16.3 Bilder [22] http://www.kowoma.de/gps/zusatzerklaerungen/Praezision.htm [23] http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/5/bc/vlus/gentechnik/prak_d na_isolierung.vlu/Page/vsc/de/ch/5/bc/gentechnik/methoden/aufreinigung/gelfiltr ation/gelfiltration.vscml.html [24] http://chemed.chem.purdue.edu/genchem/topicreview/bp/1biochem/graphics /13.gif [25] http://www.chm.bris.ac.uk/motm/vitb12/b12.gif

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