31/07/2013

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VETORES DE CLONAGEM PARA E. coli

Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

Tipos de vetores

Vetores de clonagem baseados em plasmdeos;

Vetores de clonagem baseados no bacterifago M13;

Vetores de clonagem baseados no bacterifago lambda ().

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Vetores de clonagem baseados Vetores de clonagem baseados em em plasmdeosplasmdeos

Nomenclatura de vetores plasmidiais

pBR322:

P = plasmdeo

BR = laboratrio onde foi construdo (Bolvar e Rodrigues)

322 = identifica este de outros plasmdeos do mesmo laboratrio.

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pBR322

pequeno (4363 bp) permite clonagem de fragmentos com 6Kbp e clonado facilmente.

Tem duas marcas de seleo (resistncia ampicilina e tetraciclina) cada uma com um local de restrio nico.

Tem vrios locais de restrio nicos que permitem clonar genes com vrios tipos de extremidades coesivas.

Tem um nmero de cpias razoavelmente elevado e que pode ser aumentado na presena de um inibidor da sntese proteica, o cloranfenicol (at 1000-3000 cpias).

No entanto, este plasmdeo conjugativo, o que pode no ser muito benfico devido transferncia indesejada de genes entre espcies.

O plasmdeo pBR322 foi construdo a partir de 3 plasmdeosnaturais de E. coli que forneceram:

R1: ampR

R6.5: tetR

pMB1: ori

A seleo de transformantes utilizando-se pBR322 pode ser feita atravs da resistncia ampicilina ou tetraciclina.

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Se digerirmos o vetor com BamHI e introduzimos o gene deinteresse na regio que codifica o gene tetR. As clulastransformantes vo possuir apenas resistncia ampicilina,mas este antibitico no pode ser usado unicamente para aseleo porque tambm o vetor tem ampR.

Para transpor este problema fazem-se dois riscados decolnias transformantes em placas contendo meio nutritivo eamp ou tet. As colnias que no crescerem em meio comtetraciclina so as que desejamos e podemos isol-las a partirdo meio apenas com ampicilina.

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pBR327

Construdo pela remoo de 1.089 pb de pBR322;

Manteve os genes de resistncia antibiticos;

Difere de pBR322 nos seguintes aspectos:

- Apresenta mais cpias por clula (30 a 40 cpias)

- A deleo eliminou a capacidade conjugativa de pBR322, transformando-o em no-conjugativo.

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pUC8

Elevado nmero de cpias (500-700 por clula);

Identificao de recombinantes num nico passo uso do gene LacZ;

Locais de restrio aglomerados numa nica regio e que permitem que as duas extremidades dos fragmentos sejam cortadas por enzimas diferentes;

Resistncia ampicilina.

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A seleo de recombinantes em pUC8 envolve o gene LacZ.Este gene codifica a sntese da protena -galactosidase,envolvida na degradao da lactose em glucose e galactose.

pGEM3Z

Semelhante a pUC: contm genes ampR e lacZ, alm de ser do mesmo tamanho;

Possui 2 pedaos de DNA extras: regies promotoras para RNA-polimerase atuar;

Transcrio in vitro do DNA clonado

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pGEM3Z

Vetores de clonagem baseados no Vetores de clonagem baseados no bacterifago M13bacterifago M13

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relembrando...relembrando...BACTERIFAGOS

Dois tipos principais de estrutura de fagos:

(a) Cabea e cauda (por ex., lambda)(b) Filamentoso (por ex., M13)

M13mp7

Caractersticas:

Genoma do fago.

Gene LacZ que permite a seleo de recombinantes.

Polylinker local mltiplo de clonagem, no interior do LacZ. Tem locais de restrio para EcoRI, BamHI, SalI e PstI

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M13mp7

O mtodo de seleo utilizado para o M13mp7 semelhante ao do pUC8, embora no se tenha resistncia a ampicilinapara selecionar os transformantes.

Fagomdeos vetores hbridos

um vetor hbrido entre um plasmdeo e um fago M13criado de modo a permitir a clonagem de genes dedimenso superior s 1,5Kbp permitidas pelo M13pm7(ex. pEMBL8);

Como um fagomdeo no contm a informao relativa sntese das protenas da cpsula, quando se querobter um fago tem que se infectar as clulas com umfago auxiliar. mais fcil extrair o DNA utilizando ascaractersticas do fago.

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Com o fagomdeo pEMBL8 podem clonar-se fragmentos de DNA de cadeia simples com 6Kbp.

Vetores de clonagem baseados no Vetores de clonagem baseados no bacterifago lambda (bacterifago lambda ())..

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Antes de se desenvolverem vetores baseados no fago foi necessrio resolver dois problemasdois problemas:

S se podiam adicionar fragmentos com 3Kbp fragmentos maiores tornam o fago demasiado grande para ser encapsulado.

No existiam locais de restrio nicos.

A eliminao de uma regio no-essencial do genoma do fago, responsvel pela integrao do fago no DNA cromossmico e sua posterior exciso, permitiu que fossem disponibilizados mais 15Kbp para a clonagem de fragmentos, perfazendo um total de 18Kbp.

A remoo da regio referida implica que o fago deixa de ser capaz de realizar o ciclo lisognico (realiza apenas o ciclo ltico), o que at uma caracterstica desejvel para os vetores.

Para eliminar os locais mltiplos de clonagem utilizou-se seleo natural (mutantes).

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Vetores de insero e substituioVetores de insero e substituio

Vetores de insero: possuem um nico local de clonagem, adicionando-se o fragmento de DNA desejado ao vetor local (ex. gt10 e ZAPII).

Vetores de insero e substituioVetores de insero e substituio

Vetores de substituio: possuem dois locais de restrio que flanqueiam uma regio do DNA que substituda pelo fragmento pretendido (ex. EMBL4, GEM11 e 12)

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MTODOS DE MODIFICAO

DE EXTREMIDADES DO DNA

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