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Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA-DEAÇÚCAR NA LEVEDURA Pichia pastoris ILÍTIA GANAÊ DE OLIVEIRA COSTA Agosto – 2016 Goiânia - GO Brasil

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Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA-DEAÇÚCAR NA

LEVEDURA Pichia pastoris

ILÍTIA GANAÊ DE OLIVEIRA COSTA

Agosto – 2016

Goiânia - GO Brasil

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ILÍTIA GANAÊ DE OLIVEIRA COSTA

CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UMA β-EXPANSINA DE CANA-DE-

AÇÚCAR NA LEVEDURA

Pichia pastoris

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade

Federal de Goiás, como exigência para obtenção do título de

Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientador:

Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

Coorientador:

Profa. Dra. Fabrícia Paula de Faria

GOIÂNIA, GO – Brasil

2016

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“Tudo neste mundo tem o seu tempo;

Cada coisa tem a sua ocasião.

Há tempo de nascer e tempo de morrer;

Tempo de plantar e tempo de arrancar;

Tempo de matar e tempo de curar;

Tempo de derrubar e tempo de construir.

Há tempo de ficar triste e tempo de se alegrar;

Tempo de chorar e tempo de dançar;

Tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntá-las;

Tempo de abraçar e tempo de afastar.

Há tempo de procurar e tempo de perder;

Tempo de economizar e tempo de desperdiçar;

Tempo de rasgar e tempo de remendar;

Tempo de ficar calado e tempo de falar.

Há tempo de amar e tempo de odiar;

Tempo de guerra e tempo de paz.

O que é que a pessoa ganha com todo o seu trabalho?

Eu tenho visto todo o trabalho que Deus dá às pessoas

para que fiquem ocupadas.

Deus marcou o tempo certo para cada coisa. ”

Eclesiastes 3: 1-11a (NTLH)

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Dedico este trabalho aos meus pais, Ana e

Jander, e meus irmãos, Ádila e Jander Felipe

que SEMPRE me apoiaram nessa jornada.

Ofereço a todos aqueles que persistem e nunca

desistem da ciência, meus companheiros de

laboratório e sala de aula.

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“A ingratidão azeda o nosso coração, nos distancia de Deus e nos enche de cobiça. ”

Pra. Helena Tannure

Eu quero agradecer primeiramente a Deus, por ser tão lindo e maravilhoso na minha

vida, e por ter me guiado a escolher um curso tão fantástico como a Biologia. Lembro como se

fosse hoje o dia da minha inscrição para o vestibular. Ao longo desses anos eu aprendi tanto,

principalmente a nunca dizer nunca. Quando me formei, eu disse que eu NUNCA ia trabalhar

com DNA, e hoje estou maravilhada com a Biologia Molecular. Então eu só tenho a agradecer

pela oportunidade que tive de conhecer esse universo!

Quero agradecer à minha família por todo o apoio que recebi, pela compreensão e

estímulos nos dias difíceis. Agradeço a meus pais, Ana e Jander por terem acreditado e investido

em mim, e aos meus irmãos, por serem sempre meus fiéis e leais amigos. Foi sempre a minha

família que ouviu minhas lamentações nos dias ruins, mas que também fez festas comigo

quando um experimento funcionava, mesmo quando eles não entendiam que o resultava

significava. Quero agradecer todas às minhas amigas de vida que sempre me encorajaram e

motivaram: Fernanda, Byancarine, Gabi, Samara, Obrigada!! Justin, thank you so so so much

for all your care, support and encouragement, your words made the difference!!

Quero agradecer à professora Fabrícia por ter aberto as portas do laboratório na

época da iniciação científica e me ajudado a descobrir a Biotecnologia dentro da Biologia:

Obrigada! Agradeço profundamente ao professor Alexandre por ter me dado a oportunidade de

fazer esse mestrado, que mesmo sem me conhecer antes do processo seletivo acreditou em mim

e me apoiou. Sou muito grata!!

Agradeço profundamente aos meus eternos companheiros do Laboratório de

Biotecnologia de Fungos (LBF) que fizeram com que essa experiência fosse muito, muito,

muito, mas muito mais divertida!!! Alex, Aline, Amanda, Carol, Doug, Fernanda, Francieli,

Francielly, Isabelle, Izadora, Léo, Lorena, Ludmylla, Lucas, Natânia, Saulo, Syd, Thatielly,

Thuana (que já está em seu novo e lindo laboratório) e professora Rosália - vocês foram minha

motivação diária nesse laboratório. Vocês são minha segunda família!!!! O que tenho que

agradecer a cada um de vocês não cabe aqui, mas faço questão de dizer pessoalmente. Também

agradeço a Tia Divina pelo cuidado que sempre teve com a gente. Ela também faz parte da

AGRADECIMENTO

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família LBF!!

Agradeço aos professores Luiz Artur, Guilherme e Ivan por sempre terem deixado

a porta do laboratório aberta para mim, e terem me ensinado nos momentos que eu buscava

ajuda. Agradeço ao professor Cirano e seu laboratório pela parceria e por estarem sempre

prontos a nos ajudar. Obrigada professora Raphaela por se mostrar sempre pronta a me ajudar!

Sou muito grata.

Quero agradecer imensamente aos meus companheiros do Laboratório de Genética

e Genômica de Plantas. Ivone, Stella, Rewther, Isabella - muito obrigada por sempre me ajudar,

principalmente nessa reta final. Lud, muito obrigada de todo o coração por ter me auxiliado

nessa última fase de experimento, contar com sua ajuda foi fundamental.

Agradeço a todos meus colegas de disciplinas, principalmente Ariany e Bárbara que

foram minhas duplas de tantos estudos e trabalhos.

Agradeço à professora Leila por ter me incentivado a prestar o processo seletivo no

PGMP, eu não acreditava que eu seria capaz, mas a senhora me convenceu. Kellen e Jack, vocês

sempre estiveram prontas a me ajudar e escutar, desde antes entrar no PGMP. Sou muito mais

do que grata.

Agradeço à UFG, ICB e EA por me dar a oportunidade de ter conhecido

maravilhosos professores, até o que eu não gostava, mas aprendi a admirar.

Acho que poderei ser injusta se esqueci o nome de alguém aqui. Mas nessa reta

final minha mente está tão ruim. Não é por maldade que poderei esquecer, mas sou grata por

cada pessoa que fez parte desse processo. Só foi possível executar esse trabalho, porque tive

ajuda, e ajuda em todas as áreas da minha vida: familiar, emocional, profissional, espiritual,

intelectual, social.

E por último, mas não menos importante quero agradecer à banca por ter aceitado

o convite de me avaliar. Sou muito grata por poder aprender e crescer com vocês!!

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

10

13

14

15

1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 16

2 OBJETIVOS ........................................................................................ 18

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................. 18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................... 19

3.1 CANA DE AÇÚCAR NO BRASIL E NO MUNDO ............................. 19

3.2 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DA CANA-DE-AÇÚCAR ........ 21

3.3 VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR ........................................... 21

3.4 PRODUÇÃO DE ETANOL NO BRASIL ............................................. 23

3.5 LIGNOCELULOSE .............................................................................. 24

3.5.1 Celulose ................................................................................................ 26

3.5.2 Hemicelulose ........................................................................................ 27

3.5.3 Lignina .................................................................................................. 29

3.6 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA LIGNOCELULÓSICA .................... 29

3.7 CARBOHYDRATE-ACTIVE ENZYME (CAZY) ................................... 31

3.8 EXPANSINAS ...................................................................................... 32

3.8.1 β-expansinas (EXPB) ........................................................................... 35

3.9 SINERGISMO ...................................................................................... 36

3.10 EXPRESSÃO HETERÓLOGA EM Pichia pastoris........................... 38

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 41

4.1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE expb11................................................... 41

4.2 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL DE CANA-DE-AÇÚCAR ................. 41

4.3 ISOLAMENTO DO GENE DE exbp11 IN VITRO ................................ 43

4.4 OBTENÇÃO DO CDNA A PARTIR DA EXTRAÇÃO DE RNA DOS

DIFERENTES TECIDOS DE CANA-DE-AÇÚCAR ..........................

43

4.5 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE CLONAGEM PGEMT-expb11...... 44

4.5.1 Preparação de células bacterianas termo competentes de E. 44

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coli................................................................................................... ......

4.5.2 Transformação bacteriana por choque térmico................................. 45

4.5.3 Análise das colônias transformadas com pGEMT-expb11................ 45

4.6 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO E DO CASSETE DE

EXPRESSÃO PPIC9-expb11 ................................................................

45

4.6.1 Construção do plasmídeo pPIC9-expb11........................................... 45

4.6.1.1 Preparação de células eletro competentes de E. coli............................... 46

4.6.1.2 Transformação bacteriana por eletroporação ......................................... 47

4.6.1.3 Análise das colônias transformadas com pPIC9-expb11........................ 47

4.6.2 Construção do cassete de expressão pPIC9- expb11 .......................... 47

4.6.2.1 Preparação de células competentes de Pichia pastoris........................... 49

4.6.2.2 Transformação das células de P. pastoris 49

4.7 SELEÇÃO DOS TRANSFORMANTES CONTENDO O CASSETE

PPIC9-expb11 ........................................................................................

50

4.7.1 Extração de DNA genômico da levedura P. pastoris ......................... 51

4.7.2 Análise dos transformantes por produção da proteína

recombinante (EXPB11r) em frasco .................................................

51

4.7.3 Ensaio de Swelling com o sobrenadante de cultura para a

verificação de atividade funcional de expansina EXPB11r .............

52

4.7.3.1 Ensaio de atividade de FPase ................................................................. 53

4.8 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE expb11........................... 53

4.8.1 Extração de RNA da levedura P. pastoris .......................................... 53

4.8.2 Síntese de cDNA total .......................................................................... 54

4.9 SEQUENCIAMENTO DO GENE E CDNA DE expb11...................... 55

4.9.1 Reações de sequenciamento ................................................................ 56

4.9.2 Precipitação de reação de sequenciamento......................................... 56

4.9.3 Análises das sequências obtidas por bioinformática ........................ 57

4.9.4 Análise da sequência de aminoácidos ................................................. 57

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 58

5.1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE Β-EXPANSINAS DE CANA-DE-

AÇÚCAR ........................................................................................

58

5.2 ISOLAMENTO DO GENE expb11....................................................... 60

5.3 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO PGEMT-expb11........ ................... 63

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5.4 CLONAGEM DO GENE expb11 em P. pastoris.................................. 63

5.4.1 Construção do vetor de expressão pPIC9-expb11.............................. 63

5.5 SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DO GENE ................................... 67

5.5.1 Análise do gene expb11 ....................................................................... 67

5.5.2 Análise da sequência de cDNA de expb11 ......................................... 67

5.5.3 Análise in silico da proteína EXPB11 ................................................. 68

5.6 ANÁLISE DA PRODUÇÃO EM FRASCO DE EXPB11

RECOMBINANTE ...............................................................................

73

5.7 ANÁLISE DA ATIVIDADE FUNCIONAL DE EXPB11R POR

ENSAIO DE SWELLING E FPASE ................................................

75

5.8 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE expb11 EM Pichia pastoris

...............................................................................................................

76

6 CONCLUSÃO ..................................................................................... 79

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................. 80

ANEXO ................................................................................................ 92

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Cana-de-açúcar no Brasil atual............................................................. 20

Figura 2. Distribuição global dos países produtores de cana de açúcar (Leff et

al., 2004) .............................................................................................. 21

Figura 3. Representação das variedades mais plantadas no Brasil até 2008

(Ridesa, 2008) ....................................................................................... 22

Figura 4. Estrutura morfológica da cana de açúcar................................................ 23

Figura 5. Estrutura da biomassa lignocelulósica. (Adaptado de Quiroz-

Castañeda; Folch- Mallol, 2013) ......................................................... 25

Figura 6. Representação da estrutura da celulose na parede celular mostrando as

regiões de celulose amorfa e cristalina, e as ligações de hidrogênio

entre as cadeias paralelas de celulose (Rojas et al., 2015, adaptado)

.............................................................................................................. 27

Figura 7. Parede celular primária das angiospermas (representação da estrutura

do complexo celulose-xiloglucana) (Carpita & Gibeaut, 1993

adaptado) ............................................................................................. 28

Figura 8. Parede celular secundária da família Poaceae. GAX:

glucuronoarabinoxilana (Carpita & Gibeaut, 1993, adaptado)

.............................................................................................................. 29

Figura 9. Sistema hidrolítico da celulose com enzimas livres e micro-

organismos aeróbicos............................................................................. 30

Figura 10. Esquema molecular representando o domínio catalítico de uma GH7

acoplada com o CBM de celulase Cel7A de Trichoderma reesei

(Greene et al., 2015) ............................................................................. 32

Figura 11. Estrutura dos domínios das expansinas e modelo de ação das

expansinas (adaptado de Cosgrove, 2000-2005) .................................. 34

Figura 12. Via do metanol da levedura P. pastoris................................................... 39

Figura 13. Mecanismo de integração do cassete de expressão no genoma da

levedura................................................................................................. 40

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Figura 14. Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de sequências

específicas do gene expb11.................................................................... 42

Figura 15. Vetor de Clonagem. A: Esquema do vetor pGEM T Easy mostrando a

região do sítio múltiplo de clonagem. B: Construção pGEMT-expb11

............................................................................................................... 44

Figura 16. Esquema da construção pPIC9-expb11. A: Vetor pPIC9 vazio. B:

Plasmídeo pPIC9- expb11, mostrando em vermelho o gene de

interesse ................................................................................................ 46

Figura 17. Construção do cassete de expressão pPIC9-expb11 a ser integrado no

genoma da levedura............................................................................... 48

Figura 18. Esquema de digestão da construção para controle negativo pPIC9

vazio...................................................................................................... 49

Figura 19. Esquema representativo das estratégias para a obtenção de diferentes

transformantes ...................................................................................... 50

Figura 20. Placa de contagem dos transformantes ................................................. 51

Figura 21. Ilustração do anelamento da combinação de oligonucleotídeos

EXPB11F1/EXPB11R4 e EXPB11-2FS/EXPB11-2R para as reações

de sequenciamento da versão genômica do gene expb11

............................................................................................................... 55

Figura 22. Ilustração do anelamento dos oligonucleotídeos para sequenciamento

do cDNA expb11.................................................................................... 56

Figura 23. Dendrograma representativo das relações filogenéticas entre

expansinas............................................................................................. 60

Figura 24. Dendrograma de classificação das sequências de expansinas de cana-

de-açúcar (verde) e sorgo (vermelho) com base nas sequências

deAarabidopsis (azul) e arroz (preto) .................................................... 61

Figura 25. Perfil eletroforético dos produtos de PCR amplificados a partir DNA

genômico da variedade de cana-de-açúcar RB867515, com os

oligonnucleotídeos EXPB11F1 e EXPB11R4....................................... 62

Figura 26. Amplificação do cDNA expb11 de cana-de-açúcar................................ 62

Figura 27. PCR de colônia com as células transformadas com o vetor pGEMT-

expb11................................................................................................... 63

Figura 28. Análise dos transformantes da construção pGEMT-expb11por 64

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digestão com EcoRI e NotI....................................................................

Figura 29. PCR de colônia para transformantes com vetor pPIC9-

expb11................................................................................................... 64

Figura 30. Construção dos cassetes de expressão: estratégias com intenção de

gerar fenótipos Mut+ e MutS................................................................... 65

Figura 31. Transformantes recuperados da transformação da levedura P. pastoris

com o cassete de expressão pPIC9-expb11............................................ 66

Figura 32. Amlificação por PCR do cDNA expb11 a partir do DNA total dos

transformantes de P. pastoris.................................................................. 66

Figura 33. Análise da sequência de nucleotídeo do gene expb11........................... 68

Figura 34. Análise da sequência de nucleotídeos do cDNA expb11 e

determinação da região do peptídeo sinal.............................................. 69

Figura 35. Sequência de aminoácidos da proteína EXPB11 gerados pela

plataforma Translate Tools (Expasy) ..................................................... 69

Figura 36. Análise dos domínios de EXPB11 pelo blastP e ProDom....................... 72

Figura 37. Representação dos sítios de N-glicolisação nas sequências de

aminoácidos de EXPB11....................................................................... 72

Figura 38. Modelo tridimensional para EXPB11.................................................... 73

Figura 39. Análise do perfil de proteínas secretadas pelos transformantes

EXPB11r da linhagem GS115 sob indução do promotor AOX por

metanol 1% ........................................................................................... 74

Figura 40. Papel de filtro incubado com a expansina recombinante.

............................................................................................................... 75

Figura 41. Ensaio de celulase total sob papel de filtro para os transformantes

GS115-BglII.......................................................................................... 76

Figura 42. Análise dos RNAs extraídos dos pontos de 0 h a 24 h do transformante

Gs115-BglII e controle negativo em gel de agarose 1.......................... 77

Figura 43. Análise dos eletroforética em gel de agarose 1% da PCR com

oligonucleotídeos específicos de expansinas e oligonucleotídeos para

o gene gapdh ........................................................................................ 78

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LISTA DE TABELA

Tabela 1. Composição em celulose, hemicelulose e lignina nos diferentes

materiais lignocelulósico (Anwar et al., 2014) ................................ 26

Tabela 2. Lista de oligonucleotídeos específicos sintetizados a partir da

sequência de expb11 .......................................................................... 41

Tabela 3. Dados de proteínas do tipo alergênicos vegetais clonados, isolados

e/ou caracterizados (Andersson & Lidhom, 2003 modificado)

........................................................................................................... 70

Tabela 4. Expansinas com alta identidade com

expb11............................................................................................... 71

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COSTA, I. G. O. Clonagem e expressão de uma β-expansina de cana-de-açúcar na levedura

Pichia pastoris. 2016. 99 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) –

Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás. Goiânia, 2016.1

Nos últimos anos tem crescido a busca por novas fontes de energia renováveis, e uma das

tecnologias utilizadas é a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (etanol de

segunda geração). Para a obtenção de açúcares fermentáveis a partir dessa biomassa, é

necessário um complexo de enzimas e proteínas que atuarão sobre os polissacarídeos da parede

celular vegetal. As expansinas são proteínas que podem auxiliar as enzimas no processo de

degradação, promovendo o afrouxamento da parede celular das plantas pelo rompimento de

ligações de hidrogênio entre fibras de celulose e hemicelulose. A superfamília das expansinas

foi descrita principalmente em plantas, entretanto, há relatos em fungos e bactérias. São

descritas 4 famílias de expansinas: α-expansinas, β-expansinas, expansinas like-A e expansinas

like-B. As α e β-expansinas já são caracterizadas, desempenhando importante função no

crescimento vegetal. As α-expansinas são mais presentes em plantas dicotiledôneas, enquanto

que as β-expansinas estão envolvidas no processo de expansão celular de monocotiledôneas da

família Poaceae. Para analisar a sequência e verificar a atividade funcional de uma β-expansina

sobre bagaço de cana-de-açúcar, neste trabalho foi isolado, clonado e expresso um gene de β-

expansina (expb11) de cana-de-açúcar na levedura Pichia pastoris. A sequência de nucleotídeos

do gene de β-expansina da cana-de-açúcar foi obtida a partir da biblioteca de cDNA de cana-

de-açúcar do projeto SUCEST. Sequências de referências de expansinas de sorgo, milho e arroz

foram utilizadas para identificar ESTs de expansinas no banco de dados SUCEST. Foram

identificadas 227 ESTs. Essas ESTs foram submetidas à clusterização e foram obtidos 30

contigs e 92 singletons. Após o desenho de oligonucleotídeos, o fragmento genômico

correspondente ao gene expb11 foi amplificado por PCR. A região codificadora do gene expb11

foi obtida por RT-PCR a partir de RNA total obtido de colmo da cultivar RB867515. Esse

material foi clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado no vetor pPIC9. Os fragmentos

genômico e cDNA obtidos foram analisados por sequenciamento. O cassete de expressão

gerado pela subclonagem em vetor de expressão pPIC9 foi integrado no genoma de P. pastoris

linhagem GS115, mas não foi possível detectar atividade funcional da expansina. O gene

expb11 possui 1367 pb, contendo 3 íntrons, enquanto o cDNA 801 pb. Pelo alinhamento das

sequências genômicas do gene expb11 obtidas de cana-de-açúcar e de sorgo, foi possível se

observar que estes genes possuem 95 % de identidade, e estrutura de íntrons/éxons semelhantes.

Pela análise in silico da sequência de aminoácidos da proteína EXPB11 foi possível verificar

que ela possui dois domínios, um similar ao da família GH45, e outro similar ao módulo de

ligação ao carboidrato (CBM). A proteína EXPB11 possui peso molecular de aproximadamente

26,4 kDa, pI 4,88, e contém dois sítios de glicosilação. Os resultados obtidos através das

análises in silico mostraram que o gene expb11, isolado e clonado, corresponde a um gene de

β-expansina de cana-de-açúcar, e ao ser produzida, a EXPB11 recombinante poderá integrar o

mix de enzimas e proteínas para a degradação de biomassa lignocelulósica.

Palavras-chaves: Saccharum spp; expressão heteróloga; etanol de secunda geração

___________ 1 Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

Coorientador: Profa. Dra. Fabrícia Paula de Faria

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COSTA, I. G. O. Cloning and expression of a β-expansin of sugarcane in the yeast Pichia

pastoris. 2016. 99f. Dissertation (Master in Genetics and Plant Breeding) –

Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, 2016.1

In the last decades the search for new renewable energy sources have increased and one of the

emerged technologies was the production of ethanol from lignocellulosic biomass (second

generation ethanol). For obtaining fermentable sugars from biomass, a complex of enzymes and

proteins that acts on polysaccharides of the plant cell wall is required. Expansins are proteins

that can help enzymes in the degradation process, promoting the loosening of the cell wall of

plants by breaking hydrogen bonds between cellulose fibers and hemicellulose. The

superfamily of expansins has been described mainly in plants, although they are also found in

fungi and bacteria. Four families are described to this superfamily: α-expansins, β-expansins,

expansins-like A and expansins-like B. The α-expansins are present in most eudicots, whereas

the β-expansins are involved in cellular expansion process of the monocots family Poaceae. To

analyze the sequence and to verify the functional activity of a β-expansin on filter paper, in this

work a gene of β-expansin (expb11) of sugarcane was isolated, cloned and expressed in the

yeast Pichia pastoris. Nucleotide sequences of expansin genes from sugarcane were initially

obtained from the public SUCEST database using reference sequences of expansins from

sorghum, maize and rice as query. A total of 227 ESTs were identified. These ESTs were

submitted to clustering and 30 contigs and 92 singletons were obtained. Specific oligos were

designed and used to capture the genomic fragment corresponding to the expb11 gene by PCR.

The coding DNA fragment of expb11 was obtained by RT-PCR from the total RNA extracted

from stalks of the RB867515 sugarcane cultivar. This fragment was cloned into the pGEM-T

Easy vector and subcloned into the pPIC9 vector. Genomic and cDNA fragments were

sequenced. The expression cassette generated by subcloning into the pPIC9 expression vector

was integrated into the P. pastoris strain GS115 genome, but it has not been possible to detect

a functional activity of expansin. The expb11 gene comprises 1367 bp, containing 3 introns,

and its cDNA is 801 bp long, with an ORF of 776 bp. The alignment of sugarcane and sorghum

sequences of expb11 showed that the two species share a 95% sequence identity along these

genes and that the gene structure is highly conserved in these species. The in silico analysis of

the putative EXPB11 amino acid sequence allowed the detection of two conserved domains,

one similar to the GH45 family, and the other to the carbohydrate binding module (CBM). The

putative EXPB11 protein has a predicted molecular weight of approximately 26.4 kDa, an

isoelectric point (pI) of 4.88, and contains two glycosylation sites. Our results confirmed that

the isolated and cloned expb11 gene corresponds to a β-expansin gene from sugarcane, paving

the way to the expression, isolation and use of recombinant EXPB11 in the mix of enzymes and

proteins for lignocellulosic biomass degradation.

Keywords: Saccharum officinarum; heterologous expression; second generation ethanol

___________ 1 Adviser: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho

Co-Adviser: Profa. Dra. Fabrícia Paula de Faria

ABSTRACT

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A conversão da biomassa vegetal em etanol tem sido uma das opções estudadas

para a produção de biocombustíveis (etanol celulósico). A lignocelulose presente na parede

celular vegetal é composta por celulose, hemicelulose e lignina. No processo de produção de

etanol celulósico, as frações de celulose e hemicelulose da biomassa são convertidas a

monossacarídeos pela ação de celulases, hemicelulases e proteínas acessórias, e os

monossacarídeos são fermentados a etanol por leveduras.

As celulases compreendem um consórcio de enzimas (sistema celulolítico) que

hidrolisam a cadeia de celulose em monômeros de glicose e que é formado por endoglucanases

(EG), celobiohidrolases (CBH) e β-glicosidases (BGL). A xilana é o principal tipo de

hemicelulose e compreende um polissacarídeo ramificado com a cadeia central de monômeros

de xilose. As enzimas envolvidas na conversão da fração de xilana em xilose (sistema

xilanolítico) são endoxilanases (EX), exoxilanases e as β-xilosidases (BXL) (Teeri, 1997; Lynd

et al., 2002; Polizeli et al., 2005).

Diversos estudos têm sido realizados para o estabelecimento do processo de

produção de etanol celulósico a partir de resíduos agrícolas como bagaço de cana-de-açúcar,

palha de arroz e farelo de trigo. O bagaço de cana-de-açúcar (BCA) é o resíduo agroindustrial

que tem se destacado pela abundância em várias regiões do Brasil e pelo baixo custo. O uso

adequado do BCA pode aumentar seu valor agregado e também pode ser uma solução para a

diminuição do acúmulo deste resíduo no campo, resolvendo um problema da indústria

açucareira e aumentando a produtividade econômica do processo. Portanto, um duplo efeito é

obtido, econômico e ecológico (Kilicaslan et al., 1999).

As expansinas são proteínas envolvidas na expansão da parede celular vegetal e

estão envolvidas na quebra das ligações de hidrogênio entre as fibras de celulose e xilana. Por

promover a expansão das fibras, as expansinas aumentam a eficiência da hidrólise enzimática

da fração de celulose e xilana e podem ser empregadas como proteínas acessórias na mistura

enzimática empregada na etapa de hidrólise (Kim et al., 2009; Lee et al., 2010).

As β-expansinas são uma das classes de expansinas envolvidas no processo de

expansão celular, principalmente em monocotiledôneas. Diversos trabalhos têm estudado o

1 INTRODUÇÃO

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sinergismo das celulases microbianas e proteínas com atividade de expansinas, entretanto não

há relatos na literatura sobre as expansinas de cana-de-açúcar e sua aplicação na hidrólise da

fração de celulose e xilana do BCA (Saha, 2003; Sun et al., 2004). Destaca-se que em estudo

realizado pelo grupo de pesquisa da Universidade Federal de Goiás foram identificadas

sequências codificadoras de α- expansinas e β-expansinas, expansinas like-A e expansinas like-

B em bancos de dados de ESTs de cana de açúcar a partir de sequências de sorgo.

Visando melhorar a eficiência da hidrólise enzimática do BCA, tem sido proposto

o uso de proteínas acessórias juntamente com as enzimas do sistema celulolítico. As expansinas,

bem como outras enzimas acessórias podem auxiliar na conversão da biomassa lignocelósica

por enzimas celulolíticas e xilanolíticas em açúcares fermentáveis. Acredita-se que uma β-

expansina proveniente da própria cana-de-açúcar possa atuar de forma eficiente no mix

enzimático, afrouxando as fibras a serem degradadas, permitindo que as enzimas celulolíticas

hidrolisem completamente a celulose.

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2.1 OBJETIVO GERAL

Este estudo teve como principal objetivo expressar o gene da β-expansina,

correspondente ao contig 11 (expb11), de cana-de-açúcar e produzir a β-expansina

recombinante (EXPB11r).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter a sequência completa do gene iexpb11 em suas versões genômica e de cDNA;

Isolar e clonar o fragmento codificador do gene expb11 obtido de canade-açúcar;

Expressar o gene expb11 na levedura Pichia pastoris;

Produzir a EXPB11 recombinante in vitro;

Avaliar a expressão do gene expb11 na levedura;

2 OBJETIVOS

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3.1 CANA DE AÇÚCAR NO BRASIL E NO MUNDO

A cana-de-açúcar teve sua origem na região tropical do sul e sudeste asiático. A

produção de açúcar cristalizado a partir de sacarose extraída do seu caule começou a ser

realizada na Índia por volta de 5000 anos atrás. No século VII, a tecnologia da produção de

açúcar da cana-de-açúcar foi iniciada na China. A partir do século VIII, esta tecnologia foi

difundida para o mundo árabe, Mesopotâmia, Egito, norte da África e Espanha, assim chegando

ao novo mundo no século XVI com os espanhóis (Fischer et al., 2008).

No Brasil, o plantio da cana-de-açúcar tem sido economicamente importante desde

o século XVI, pois com a ocupação portuguesa, estes europeus buscaram explorar seu cultivo

em terras brasileiras. Durante o período colonial, a cana-de-açúcar proporcionou a geração de

grande riqueza, sendo que o valor de todo o açúcar exportado naquela época superava o valor

de todo o ouro e diamantes extraído por mineração naquele mesmo período (Nastari, 1983).

Após o período colonial, muitas outras culturas começaram a fazer parte da

economia brasileira, mas mesmo assim o Brasil continuou a ser um dos maiores produtores de

cana-de-açúcar. No último século, o Brasil teve a oportunidade de escrever uma nova história

em torno da produção dessa cultura. Guiado por políticas internas, o país promoveu a

exploração de cana, principalmente a partir da década de 1930, momento em que a cana-de-

açúcar tornou-se a matéria prima na produção em larga escala de bioetanol como combustível

automotivo (De Souza et al., 2014).

Atualmente, o Brasil é líder mundial na produção de cana-de-açúcar, e segundo

dados da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) no relatório de acompanhamento

da safra 2015-2016, a área de plantio da cultura abrange um território de aproximadamente 9

milhões de hectares, com sua maior concentração nos estados da região sudeste brasileira

(62%), principalmente no estado de São Paulo (Fig. 1B). Dentre os anos de 2005 e 2015 houve

um aumento na produtividade de cana-de-açúcar de aproximadamente 50% (Fig. 1A),

alcançando uma produção acima de 600 milhões de toneladas. A produção total de etanol na

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

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safra 2015/2016 ultrapassou os 29 bilhões de litros e a produção de açúcar atingiu mais que 34

milhões de toneladas (CONAB, 2016).

Figura 1. Cana-de-açúcar no Brasil atual. A: Evolução da área, produtividade e produção de cana-de-

açúcar. B: mapeamento dos estados produtores de cana-de-açúcar. (Estimativa Conab,

dezembro de 2015.)

Diante desses números nota-se que a indústria sucroalcooleira é um dos principais

segmentos econômicos do Brasil, consequentemente possui grande influência na economia do

país. Mas apesar do Brasil ser o principal produtor dessa cultura, a produção de cana-de-açúcar

está presente em diversos países da zona tropical e subtropical do mundo, como Índia, China,

Tailândia e Paquistão que somando com a produção brasileira possuem ao todo 80% da

produção mundial de cana-de-açúcar (Fig. 2).

A

B

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Figura 2. Distribuição global dos países produtores de cana de açúcar (Leff et al., 2004).

3.2 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DA CANA-DE-AÇÚCAR

Quanto à taxonomia, a cana de açúcar é uma cultura pertencente ao gênero

Saccharum (estabelecido por Carl Linnaeus in 1773), na família Poaceae (família das

gramíneas), ordem Graminales, classe Lilipsida, divisão Magnoliophyta (Hoang et al., 2015;

Silva & Silva, 2012). O genêro Saccharum (do sanscrito sakara que significa açúcar) é dividido

em seis diferentes espécies: Saccharum barberi, Saccharum edule, Saccharum officinarum,

Saccharum robustum, Saccharum sinense, e Saccharum spontaneum (Amalraj &

Balasundaram, 2006). Todas as espécies do gênero Saccharum são relatadas como polipoides,

sendo que o número de cromossomos nas células é diferente para cada espécie.

3.3 VARIEDADES DE CANA-DE-AÇÚCAR

As variedades modernas de cana-de-açúcar são produtos de cruzamentos entre

espécies do gênero Saccharum. As espécies que mais contribuíram para as variedades de cana-

de-açúcar modernas são S. officinarum, que possui a característica de acumular sacarose em seu

caule, e S. spontaneum, que é uma espécie selvagem amplamente adaptada com genes

resistentes a doenças e estresses (Cheavegatti-Gianotto et al., 2011). A espécie S. officinarum é

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uma espécie também conhecida como “canas nobres”, sendo uma espécie que apresenta alto

teor de açúcar e baixa porcentagem no conteúdo de fibras (Amalraj & Balasundaram, 2006).

Seus colmos são grossos, com média de 3,5 cm de diâmetro, e são leves devido à baixa

porcentagem de fibras.

Pelo fato de S. officinarum apresentar tais características, essa espécie tem sido

amplamente utilizada no desenvolvimento de diferentes tipos de cultivares. Atualmente existem

diversos centros de melhoramento genético de cana-de-açúcar no Brasil. E muitas

universidades federais integram a Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor

Suenergético (PMGCA/RIDESA). Uma das variedades desenvolvida pelo programa de

melhoramento genético de cana-de-açúcar da RIDESA foi a RB867515, que é uma das

variedades mais cultivadas no Brasil (Fig. 3), ocupando área superior a 20% da área cultivada

de cana-de-açúcar devido a sua característica de poder ser cultivada em solos de baixa

fertilidade natural e de textura arenosa como no cerrado brasileiro.

Essa variedade foi desenvolvida a partir da série RB86, do ano de 1986, pela

Universidade Federal de Viçosa, e foi selecionada como clone de maior destaque numa região

onde o solo era pobre em nutrientes com época de corte no período de maio a julho (RIDESA,

2010). A RB867515 possui alta velocidade de crescimento, porte alto, hábito de crescimento

ereto, alta densidade de colmo, de cor verde amarelado (Fig. 4) e com alto teor de sacarose

(Barbosa et al., 2008; Ridesa, 2008).

Figura 3. Representação das variedades mais plantadas no Brasil até 2008 (Ridesa, 2008).

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3.4 PRODUÇÃO DE ETANOL NO BRASIL

A cana-de-açúcar como descrita possui alto teor de sacarose em seu caldo, e devido

à essa característica foi explorada por séculos para a produção de açúcar. Porém no último

século, após a invenção do automóvel, foi proposta a utilização desse caldo para a produção de

combustível, como alternativa ao sistema utilizado na época, o petróleo. Em 1975, Henry Ford

desenhou um automóvel, Model T, que era abastecido à gasolina e etanol, na época produzido

a partir de batatas (Claxton, 2015; De Souza et al., 2014).

Durante os anos de 1970 houve a crise mundial do petróleo, o que fez com que o

seu preço ficasse muito elevado. Nessa época, o Brasil importava 80% de todo o petróleo

consumido, o que consequentemente fez com que houvesse uma alta despesa para o país (Hira

& De Oliveira, 2009). Segundo relata a União dos Produtores de Bioenergia, entre os anos de

1973 e 1974 as despesas com as importações de petróleo saltaram da casa dos U$ 600 milhões

para U$ 2 bilhões. Diante disso, o Brasil iniciou vários programas com a iniciativa de produzir

seu próprio combustível, e um desses programas foi a intensa produção de etanol a partir do

caldo de cana-de-açúcar.

Figura 4. Estrutura morfológica da cana de açúcar. A: Fotografia do colmo do cultivar RB867515. B:

Ilustração da morfologia da cana de açúcar Kohler (1887).

O etanol pode ser produzido a partir da fermentação de açúcares contidos em caldos

de algumas culturas. Açúcares como a sacarose são convertidos no monossacarídeo glicose por

microrganismos, e a glicose é então fermentada por leveduras. Esses açúcares podem ser

A B

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provenientes de grãos como de milho, sorgo, trigo e arroz (Gawande & Patil, 2014), e caldos,

como caldo de cana, de beterraba, de sorgo, e melancia (Zabed et al., 2014). Vários estudos já

têm demonstrado que existe um consenso de que o etanol proveniente de cana-de-açúcar é mais

eficiente do aquele de outras culturas. Diferentemente do que acontece com culturas como o

milho (nos Estados Unidos, por exemplo), plantações de cana-de-açúcar utilizam menos

fertilizantes e agroquímicos. Além disso,as refinarias brasileiras têm utilizado a queima do

bagaço de cana-de-açúcar para produção de energia, assim evitando mais ainda o uso de

combustíveis fósseis (Banschbach & Letovsky, 2010).

A queima de combustíveis fósseis, que tem como matéria prima o petróleo, causa o

aumento no nível de CO2 no ambiente, o qual é diretamente responsável pelo aquecimento

global. Os efeitos adversos causados pelo alto nível de gases do efeito-estufa ou greenhouse

gas juntamente com a diminuição das reservas de petróleo prevista para as próximas décadas,

têm sido percebidos (Naik et al., 2010). Além de suprir um mercado que é bastante dependente

de petróleo, é necessário buscar outras alternativas para a produção de energia e produção de

combustíveis menos agressivos ao meio ambiente, ou seja, renováveis. Nesse ponto, diversas

tecnologias têm sido desenvolvidas para substituir os combustíveis fósseis como as

hidroelétricas, biomassa vegetal, energia solar, energia geotermal, energia eólica e de outras

fontes renováveis (Claxton, 2015; Popp et al., 2014).

O Brasil é um país com dimensão continental e é rico por contar com a presença de

praticamente todas as fontes de energia renovável. É um país com sua maior área em zona

tropical, e, além do potencial de utilização do sol e do vento como fontes de energia solar e

eólica, possui enormes bacias hidrográficas as quais fornecem energia hidroelétrica. O país tem

sido um dos pioneiros no desenvolvimento de tecnologias para o reaproveitamento da biomassa

vegetal para a produção de biocombustível.

Além da produção de etanol usando o caldo de cana como matéria prima, o Brasil

e outros países têm procurado utilizar a grande fração de biomassa vegetal ou lignocelulósica,

os açúcares presentes na parede celular vegetal para a produção de etanol de segunda geração

(Joelsson et al., 2016; Moraes et al., 2014; Naik et al., 2010). Essa biomassa não apenas reduzirá

a dependência dos combustíveis fósseis, mas também poderá impactar positivamente em vários

problemas ambientais, como na redução dos gases do efeito estufa (De Souza et al., 2014).

3.5 LIGNOCELULOSE

Materiais lignocelulósicos são os principais componentes da biomassa vegetal,

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incluindo cerca da metade do material vegetal produzido pela fotossíntese e representa a mais

abundante fonte de recursos biológicos renováveis do solo (Pérez et al., 2002). Esta biomassa

vegetal é composta principalmente por materiais lignocelulósicos formados por celulose (40-

50%), hemicelulose (15-30%) e lignina (10-30%) (Fig. 5; Dekker; Wallis, 1983).

A parede celular das células vegetais é uma estrutura rica em carboidratos, sendo

esta uma das fontes renováveis mais abundantes do planeta (Silva, 2007). A parede celular

primária é composta principalmente por polissacarídeos (90%) e proteínas (10%). Os

polissacarídeos que constituem a parede celular vegetal são celulose, hemicelulose e pectina.

Estes juntamente com a lignina, que é um polímero fenólico, conferem uma rígida estrutura de

proteção para a célula vegetal (Fig. 5; Lagaert et al., 2014).

Figura 5. Estrutura da biomassa lignocelulósica. (adaptado de Quiroz-Castañeda; Folch- Mallol, 2013)

A determinação da composição do substrato lignocelulósico é uma etapa crucial

para determinar a eficiência do processo de conversão da lignocelulose em etanol (Adeeyo et

al., 2015), isso porque os materiais lignocelulósico têm estruturas muito mais difíceis de serem

degradadas e solubilizadas, devido a diferentes composições de carboidratos que os materiais

usados na produção de etanol de primeira geração possuem, como pode ser observado na tabela

1 (Anwar et al., 2014; Joelsson et al., 2016). Essa resistência da biomassa lignocelulósica à

degradação e solubilização é denominada recalcitrância, e esta tem sido a grande barreira a ser

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superada no processo de hidrólise (TEMPLETON et al., 2016)

Tabela 1. Composição em celulose, hemicelulose e lignina nos diferentes materiais lignocelulósico

(Anwar et al., 2014)

Material Lignocelulósico Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%)

bagaço de cana-de-açúcar 42,0 25,0 20,0

sorgo 45,0 27,0 21,0

palha de milho 38,0 26,0 19,0

palha de arroz 32,1 24,0 18,0

3.5.1 Celulose

A celulose é o principal polissacarídeo da parede celular. A celulose é formada por

uma cadeia linear de monômeros de D-glicose, unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1,4

(Lagaert et al., 2009; Terrasan, 2007). Aproximadamente 100 unidades de glicose formam

microfibrilas que se empacotam ou se conectam por ligações de hidrogênio intra e

intermoleculares e por forças de Van der Waals (Bidhendi & Geitmann, 2016).

Um entendimento das forças de atração que mantém as microfibrilas de celulose

unidas tem fundamental importância quando se considera sua estrutura e seu crescimento, pois

a interação entre as cadeias de celulose influenciam na adesão, na fricção (atrito), e na

turgescência das fibras de celulose (Notley et al., 2004). A forte interação entre as fibras de

celulose por ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals contribui para uma maior

estabilidade do polímero de celulose, tornando as fibrilas de celulose rígidas. São estas fibrilas

que conferem rigidez as árvores, plantas, alguns animais marinhos (Tunicados) e algas (Moon

et al., 2011).

Em plantas terrestres, as microfibrilas elementares de celulose, que apresenta um

diâmetro com uma variação de 2 a 5 nm, são ligadas para formar as microfibras com 20 nm

(Cosgrove, 2014). Essas microfibras são organizadas em regiões cristalina ou não cristalina.

Nas regiões cristalinas, que inclui aproximadamente 65% da celulose total da célula, as

microfibrilas de celulose são ordenadas e ligadas por ligações de hidrogênio, sendo esta

estrutura inacessível à água ou aos outros solventes (Bidhendi & Geitmann, 2016). Os 35%

restantes são compostos de cadeias menos orientadas e parcialmente acessíveis à água (região

amorfa ou não cristalina) (Fig, 6; Rowell, 1992).

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Figura 6.. Representação da estrutura da celulose na parede celular mostrando as regiões de celulose

amorfa e cristalina, e as ligações de hidrogênio entre as cadeias paralelas de celulose

(adaptado Rojas et al., 2015).

3.5.2 Hemicelulose

Todas as células das plantas superiores estão revestidas por parede celular, que

consiste de inúmeros polímeros incluindo a celulose, polissacarídeos não celulósicos,

glicoproteínas estruturais e lignina. A classe de polissacarídeos não celulósicos é constituída

por cadeias centrais heterogêneas, e historicamente esse grupo de polissacarídeos foram

designados de hemiceluloses (Pauly et al., 2013). A hemicelulose é um heteropolissacarídeo

com estrutura altamente diversificada e é classificada de acordo com os açúcares predominantes

da cadeia principal formada por ligações do tipo β-1,4 (Álvarez et al., 2016). Entre eles são as

D-xilose, D-manose, D-glicose, ácido D-galacturônico, ácido D-glucorônico, D-galactose, L-

arabinofuronose e L-ramnose (Janes, 1969; Sánchez, 2009). Assim, a hemicelulose pode ser

denominada conforme a presença dos principais açúcares identificados, podendo receber o

nome de xiloglucana, xilana, manana, galactana ou galacturana.

A xiloglucana (XyG) é a hemicelulose mais abundante na parede celular primária

das eudicotiledôneas, correspondendo de 20 a 30 % do peso seco (FRY et al., 1989), mas em

monocotiledôneas da família das gramíneas (Poaceae) seu conteúdo é reduzido, a

aproximadamente 5%. A XyG promove a ligação entre as microfibrilas de celulose (Fig. 7),

formando uma forte e extensível rede interconectada de celulose-xiloglucana que funciona

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como o principal suporte da parede celular primária (Cosgrove, 2016; Pauly et al., 2013). Esse

polissacarídeo consiste em uma cadeia central de glucanas ligadas por ligações do tipo β-1,4

que é substituída parcialmente por resíduos de α-D-xilose ligados à glicose na posição O-6.

Figura 7. Parede celular primária das angiospermas (representação da estrutura do complexo celulose-

xiloglucana) (adaptado Carpita & Gibeaut, 1993).

A xilana é a principal hemicelulose encontrada na parede celular secundária das

eudicotiledôneas e todos os tipos de parede das monocotiledôneas (Pauly et al., 2013), e

corresponde à aproximadamente 39% do peso seco das plantas terrestres, sendo, após a

celulose, o polissacarídeo mais abundante na natureza. O polímero de xilana é formado por uma

cadeia central de resíduos de D-xilopiranose (xilose) unidos por ligações do tipo β-1,4,

apresentando ramificações de arabinofuranose, ácido glucurônico e grupamento acetil,

formando as arabinoxilanas (AX), arabinoglucuronoxilanas (GAX) e glucuronoxilanas (GX)

(Fig. 8; Benedetti, 2009; Gírio et al., 2010; Kumar et al., 2016).

Arabinoxilana é a classe de xilana predominante na família das gramíneas, e nas

paredes celulares do endosperma pode constituir até 70% do peso seco. As AX de gramíneas

são constituídas de uma cadeia principal de β-1,4-xilana com ramificações na posição O-2 ou

O-3 com resíduo de arabinose (Pauly et al., 2013) e ácido ferúlico na posição O-5 da arabinose.

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As AX estão presentes na matriz da parede celular ligada covalentemente ou não entre si ou a

outros componentes estruturais da parede (Niño-Medina et al., 2010).

3.5.3 Lignina

A lignina é um composto fenólico, polímero de fenilpropanóides, sintetizado a

partir de álcoois sinapil, coniferil e p-hidroxifenil, que fornece resistência às paredes celulares

(Kumar et al., 2016). Ligninas de madeiras moles (softwood), como as das gimnospermas do

tipo coníferas, são referidas como ligina guaiacil, contendo mais de 95% de unidades de álcool

coniferil. Ligninas de madeiras duras (hardwood), como as das angiospermas, são classificadas

como lignina guaiacil-siringil, possuem subunidades derivadas de álcool coniferil e sinapil. Os

polímeros de lignina são altamente resistentes à degradação química e biológica e conferem

resistência, pois atuam como um cimento entre as fibras (Guillén et al., 2005).

Figura 8. Parede celular secundária da família Poaceae. GAX: glucuronoarabinoxilana (Carpita &

Gibeaut, 1993, adaptado)

3.6 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA LIGNOCELUOSE

Para a degradação das frações de celulose e xilana da biomassa é necessário um

complexo enzimático produzido por fungos e bactérias. A biodegradação realizada por esses

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micro-organismos acontece de forma lenta, devido à lignina que dificulta o acesso as enzimas

hidrolíticas. O complexo enzimático capaz de converter o polímero de celulose a monômeros

de glicose é denominado sistema celulolítico (Daroit, 2007). Existem dois tipos de sistema de

degradação da celulose: sistema de celulossomos, como as enzimas presentes na superfície das

células de bactérias anaeróbicas, e sistemas com enzimas livres, como as enzimas secretadas

em fungos aeróbicos não produtores de celulossomos (Bae et al., 2013; Doi et al., 2003).

O sistema celulolítico é composto por três tipos de enzimas: as endoglucanase,

celobiohidrolases e as β-glicosidases (Fig 9). As endoglucanases (EGLs – EC 3.2.1.4) clivam

as ligações internas das microfibrilas, entre unidades de glicose, que se encontram nas regiões

amorfas da fibra de celulose, liberando celooligossacarídeos. As exoglucanases ou

celobiohidrolases (CBHs – EC 3.2.1.9.1) atuam sobre as ligações entre as unidades de glicose

a partir das extremidades redutoras (CBHI) e não redutoras (CBHII) da região cristalina das

fibras de celulose, liberando unidades de glicose e de celobiose. As β-glicosidases (BGLs – EC

3.2.1.21) são as enzimas que convertem celooligossacarídeos e celobiose a monômeros de

glicose (Horn et al., 2012; Lynd et al., 2002; Teeri, 1997).

Figura 9. Sistema hidrolítico da celulose com enzimas livres e micro-organismos aeróbicos.

Abreviações: EG, endoglucanase; CBH, celobiohidrolases; CBM, domínio de ligação ao

carboidrato (Horn et al., 2012).

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O sistema xilanolítico é um complexo enzimático responsável pela conversão da

xilana a monômeros de xilose, e compreende três classes de enzimas: as endoxilanases,

exoxilanases e β-xilosidases. As endoxilanases (EX – EC 3.2.1.8) clivam as ligações entre as

unidades de xilose da cadeia central de xilana, liberando xilooligossacarídeos. As β-xilosidases

(BXL – EC 3.2.1.37) convertem os xilooligossacarídeos em monômeros de xilose (Polizeli et

al., 2005). E as exoxilanases compreendem as enzimas consideradas acessórias, como as

arabinofuranosidases, glucuronidases e acetil-xilana-esterases, que clivam as ligações entre a

xilose e as ramificações de arabinofuranose, ácido glucurônico e grupamento acetil,

respectivamente). Todas estas enzimas atuam cooperativamente para converter a xilana em

unidades de xilose (Álvarez et al., 2016; Subramaniyan & Prema, 2002).

3.7 CARBOHYDRATE-ACTIVE ENZYME (CAZY)

Carboidratos em forma de glicoproteínas, glicolípideos, ou polissacarídeos de

parede celular desempenham funções importantes na fisiologia dos seres vivos. Enzimas que

sintetizam e degradam as ligações desses glicoconjugados compreendem um grupo de enzimas

designadas Carbohydrate-Active enZymes (CAZymes) (Cantarel et al., 2009). As CAZys têm

sido classificadas em várias famílias com base na sua similaridade na sequência de aminoácidos

(Henrissat et al., 2001). Seu sistema de classificação contém mais de 300 famílias de glicosídeo

hidrolases (GHs – EC 3.2.1-), glicosiltransferases (GT), polissacarídeo liases (PL) e

carboidratos esterases (CE) e módulo de ligação ao carboidrato (CBM) (Cantarel et al., 2009).

As GHs incluem as glicosidases e transglicosidases, e atualmente, são

constituídas por 135 famílias de proteínas. Essas proteínas são responsáveis pela hidrólise e

transglicosilação das ligações gliosídicas. As GHs constituem o conjunto de proteínas mais bem

caracterizados presentes no bancos de dados (http://www.cazy.org/) (Cantarel et al., 2009;

Davies et al., 2005; Henrissat et al., 2001). O mecanismo de ação das glicosidases foi

primeiramente esboçado por Koshland (1953), em que existem dois mecanismos padrão de

clivagem por duplo deslocamento, ou por inversão ou retenção da configuração do carbono

anomérico (Zechel & Withers, 2000), sendo o sitío catalítico da GHs constituídos pelo

aminoácidos aspartato-aspartato (Asp-Asp) como para a família GH45 e aspartato-glutamato

(Asp-Glu) para as GH43 (Cintra, 2016; Davies et al., 2005; Palomares-Rius et al., 2014).

Enzimas celulolíticas tipicamente consistem de um domínio catalítico ligado ao

módulo de ligação ao carboidrato (CBM) (Fig. 10; Georgelis et al., 2012). Os CBMs foram

inicialmente classificados como domínio de ligação à celulose. No entanto, foram encontrados

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módulos que se ligavam também a outros carboidratos, surgindo a necessidade de se

reclassificar estes polipeptídios. Assim, os CBM são um polipeptídios que formam um domínio

que está ligado a um outro domínio catalítico de uma enzima (Shoseyov et al., 2006). São

polipeptídios que contém de 30 a 200 aminoácidos existindo como um domínio único, duplo

ou triplo. São domínios funcionais de proteínas que não apresentam atividade enzimática em

si, mas auxiliam na potencialização da atividade das enzimas, direcionando e promovendo uma

interação prolongada com o substrato da enzima (Cantarel et al., 2009; Davies et al., 2005).

Esses domínios reconhecem diversos polissacarídeos tais como celulose, quitina, β-glucanas,

glicogênio, xilanas e muitos outros açúcares como arabinofuranose, lactose, galactose, manana,

etc. (Guillén et al., 2010).

Figura 10. Esquema molecular representando o domínio catalítico de uma GH7 acoplada com o CBM

de celulase Cel7A de Trichoderma reesei (Greene et al., 2015).

3.8 EXPANSINAS

A células vegetais, diferentemente das células animais, são envolvidas por uma fina,

porém forte parede celular. Essa parede celular é constituída por uma complexa mistura de

polissacarídeos e polímeros ligados por interações covalentes ou não covalentes. Em plantas

terrestres, a parede celular é composta por pectinas e hemiceluloses do tipo xiloglucanas, com

exceção das gramíneas, nas quais predomina a hemiceluloses do tipo arabinoxilanas (Cosgrove,

2015).

A parede celular pode sofrer modificações estruturais que estão ligadas a diversos

eventos da planta, como: reprodução (divisão celular, formação do tubo polínico), crescimento

dos tecidos, amadurecimento dos frutos, entre outros. Pelo fato da parede celular ser uma

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estrutura forte, os vegetais necessitam de agentes que atuarão na sua modificação física e

química. Na matriz da parede celular é possível se encontrar estruturas como proteínas,

enzimas, e outros materiais que auxiliam nessa modificação (Taiz & Zeiger, 2016). Esses

agentes podem ser divididos em dois grupos: agentes primários e agentes secundáriso. Os

agentes primários são enzimas que catalisam reações de estresse-relaxamento diretamente nas

fibras da parede celular, resultando na expansão da parede celular. Os agentes secundários

modificam a parede indiretamente de forma sinergística, permitindo a ação do agente primário

(Cosgrove, 2000). Esses agentes podem ser: expansinas, xiloglucana

endotransglicolases/hidrolasess, endo-(1,4)-β-D-glucanase e radicais hidroxil (Cosgrove,

2005).

As expansinas são proteínas presentes na parede celular vegetal e desempenham

uma importante função no crescimento da planta e em seu desenvolvimento (Cosgrove et al.,

2002). Seu mecanismo de ação é o rompimento das ligações de hidrogênio entre as microfibrilas

de celulose e as ligações cruzadas de glucanas na parede celular. Elas são conhecidas por se

ligarem à celulose e/ou hemicelulose e separar as fibras de celulose e hemicelulose levando à

expansão da mesma (Fig. 11.A; Lee et al., 2010; Li et al., 2003).

A estrutura tridimensional das expansinas é um fator importante para seu

mecanismo de ação. São proteínas contendo de 250 a 275 aminoácidos composta por dois

domínios (domínio I e II) precedidos por um peptídeo sinal (Fig. 11.B). O domínio I possui

uma homologia distante com a família das glicosídeo-hidrolases 45 (GH45 – família da maioria

das endoglucanase fungicas), compartilhando com essa família um número conservado de

cisteínas que permitem a formação das pontes dissulfeto (Sampedro & Cosgrove, 2005). Apesar

da similaridade com a estrutura das GH45, as expansinas não possuem atividade enzimática

como as outras proteínas dessa família (Cosgrove, 2016).

O domínio II é conhecido como o módulo de ligação ao carboidrato (CBM),

domínio que fará a interação proteína-polissacarídeo. O tipo de CBM determina o

polissacarídeo que a expansina irá se ancorar. Os CBMs podem ser classificados em dois tipos:

Tipo-A - usa a superfície plana rica em aminoácidos aromáticos que se ligarão a celulose

cristalina e o Tipo-B - usa um profundo sulco que se liga às cadeias de glucanas da celulose não

cristalina (Boraston et al., 2004; Georgelis et al., 2012).

As expansinas fazem parte de uma superfamília. Essa superfamília é formada por

quatro famílias designadas de α-expansinas (EXPA), β-expansinas (EXPB), expansinas-like A

(EXLA) e expansinas-like B (EXLB). As α-expansinas e β-expansinas são conhecidas por

afrouxarem a estrutura da parede celular e por estarem envolvidas em outros eventos do

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desenvolvimento da planta. A função desempenhada pelas expansinas like-A e like-B ainda é

desconhecida, sendo conhecidas apenas suas sequências gênicas (Sampedro & Cosgrove, 2005;

Tabuchi et al., 2011). A expressão das expansinas é diferencialmente regulada nas fases de

desenvolvimento da planta por hormônios e também por fatores ambientais (Cho & Cosgrove,

2002).

Figura 11. Estrutura dos domínios das expansinas e modelo de ação das expansinas (adaptado de

Cosgrove, 2000-2005). A: Em verde estão representadas as fibras de celulose, que são

conectadas por glucanos (em amarelo e vermelho). A expansina (em azul) rompe as ligações

de hidrogênio existente entre as fibras de celulose e os glucanos. B: Estrutura de expansinas

de planta com o peptídeo sinal e domínio I e II (mostrando o modelo tridimensional).

As α-expansinas e algumas β-expansinas atuam em “crescimento ácido”, ou seja,

participam do processo de expansão das fibras que ocorre em pH baixo. Link & Cosgrove

(1998), por meio de um estudo realizado com a expansina de Nicotiana tabacum L.,

demonstraram que estas proteínas são capazes de induzir a extensão da parede em células vivas

em valores de pH fisiologicamente baixos pH 4,5. Como anteriormente descrito, as expansinas

estão relacionadas ao afrouxamento da parede celular das plantas durante o crescimento celular

e essa conexão tem sido confirmada por experimentos em que os genes de expansinas foram

manipulados em plantas transgênicas (Cho & Cosgrove, 2002). Em muitos casos, o

silenciamento de genes de expansinas causa a inibição do crescimento celular, enquanto que a

super-expressão destes genes ocasiona crescimento anormal (Sampedro & Cosgrove, 2005).

A

B

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3.8.1 β-expansinas (EXPB)

Estudos realizados com expansinas de várias espécies vegetais revelaram grande

quantidade destas proteínas no reino vegetal. Porém dependendo da espécie existe variação no

número de representantes de cada família. Em espécies de eudicotiledôneas como Arabidopsis

thaliana, Populus e Glicine max, a família de genes correspondentes as EXPB é pequena, com

6, 3 e 9 genes, respectivamente, enquanto que a família de EXPA é representada por 26, 27 e

49 genes respectivamente (Cho & Cosgrove, 2002; Zhu et al., 2014).

Espécies de monocotiledôneas da família Poaceae apresentam um contraste quanto

ao número de representantes das famílias de expansinas. Em gramíneas a família de EXPB

expandiu consideravelmente para 18 genes de EXPB vs. 36 genes de EXPA (Cosgrove, 2015).

No trabalho de Wu et al. (2001), foi demonstrado que Zea mays apresentou um contraste em

relação a Arabidopsis sp., 8 e 6 genes respectivamente, em que β-expansinas têm sido mais

numerosas e mais expressa que as α-expansinas. Esta disparidade é devido à função

especializada realizada pelas β-expansinas, sendo mais abundante em paredes celulares de

gramíneas(Liu et al., 2007).

β-expansina divergem quanto à sequência de aminoácidos quando comparada com

as α-expansinas (Sampedro et al., 2015). Essas duas famílias compartilham, em termos de

identidade, somente de 20% a 40% de seus aminoácidos, compartilhando poucas regiões

conservadas, como uma série de cisteínas conservadas na região N-terminal (domínio I), um

motivo HFD (histidina, fenilalanina e aspartato) também presente em algumas GH45

(Palomares-Rius et al., 2014) e uma série de triptofanos (W) perto da região C-terminal. EXPB

e EXPBA são similares em tamanho (25-28 kDa) e possuem atividades semelhantes no

afrouxamento da parede celular (Cosgrove et al., 1997).

As α-expansinas exibem fraca atividade em paredes celulares de monocotiledôneas,

porém possuem forte efeito em eudicotiledôneas e em algumas monocotiledôneas que

apresentam parede celular semelhante à eudicotiledôneas, isso porque a atividade de extensão

da parede celular vegetal tem padrão espécie-específico (Mcqueen-Mason et al., 1992). A

estrutura da parede celular vegetal, principalmente a fração de hemicelulose, está relacionada

com a maior quantidade de proteína produzida. Monocotiledôneas da família Poaceae, como

cana-de-açúcar, arroz, trigo, cevada, etc., têm como principal hemicelulose a arabinoxilana. Já

as eudicotiledôneas, como feijão, café, algodão, têm as xiloglucanas como principal

hemicelulose (Kellogg, 2001; McNeil et al., 1984; Peña et al., 2016).

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As β-expansinas se acumulam em altos níveis nos grãos de pólen, uma característica

aparentemente única das gramíneas. Essas proteínas auxiliam no processo de formação do tubo

polínico (Tabuchi et al., 2011) no momento da penetração do grão de polén no estigma. Lin et

al. (2005) isolaram 18 α-expansinas e β-expansinas de trigo, das quais 4 β-expansinas estão

provavelmente envolvidas com a heterose observada no comprimento nos entrenós e na altura

da planta. Essas proteínas eram vistas exclusivamente como o grupo I de alergênicos de pólen,

glicoproteínas com peso molecular por volta de 30 kDa, porém com as recentes pesquisas, elas

têm sido consideradas importantes no processo de mudança da parede celular vegetal durante a

fase de crescimento dos tecidos vegetativos, como as raízes (Jin et al., 2006).

3.9 SINERGISMO

Além das celulases e xilanases, existem indicações que muitas outras proteínas

atuam no processo de degradação da celulose, como as glicosídeo-hidrolases ou glicosidases,

expansinas e swolleninas, denominadas de proteínas acessórias. Estas proteínas são importantes

para uma ação eficiente das enzimas na degradação da parede celular de plantas.

A escolha e o balanço correto das enzimas utilizadas na etapa de hidrólise enzimática

são fundamentais para o sucesso do processo de produção de etanol celulósico, pois é nesta

etapa que ocorre efetivamente a produção de açúcares fermentescíveis, os quais serão

convertidos a etanol. Muitos estudos têm sido realizados sobre a eficiência de misturas

enzimáticas, mas para atingir um bom custo-benefício ainda são necessários estudos da

interação das enzimas na degradação da biomassa até etanol, os estudos de sinergismo

enzimático.

Diversos estudos têm analisado o uso de celulases, hemicelulases e expansinas na

degradação das frações de celulose e hemicelulose do BCA (Lee et al., 2010, 2013; Liu et al.,

2014). Estudo realizado por Murashima et al. (2002) mostrou que a mistura de celulossomos

contendo CBH e EGL possui alta atividade enzimática e alto grau de sinergismo. Zhou &

Ingram (2000) analisaram o uso de duas EGLs na hidrólise de carboximetilcelulose (CMC), os

efeitos da atuação delas em conjunto e separadas, e concluíram que a modificação do substrato

pela endoglucanase (CelY) aumentou a taxa e a extensão da hidrólise do substrato realizada

pela outra endoglucanase (CelZ), ou seja, houve eficiência na atividade de CelZ quando a

endoglucanase CelY foi usada como a primeira enzima.

Muitos microrganismos, como algumas bactérias anaeróbias, produzem um

complexo multienzimático denominado celulossomo, que possui o papel de degradar a celulose.

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Moraïs et al. (2010) estudaram a sinergia de celulases e xilanases em celulossomos para

melhorar a degradação de um substrato celulolítico. Duas celulases, uma endoglucanase e uma

exoglucanase, e duas endoxilanases, foram escolhidas como componentes enzimáticos do mix

do celulossomo. A incorporação das enzimas da bactéria Thermobifida fusca no celulossomo

tetravalente levou o conjunto a uma melhora na atividade (~ 2,4 vezes) sobre a palha de trigo.

Os resultados forneceram evidências de que o trabalho em conjunto entre celulases e xilanases

é a chave para a degradação do substrato, sendo que as atividades das diferentes enzimas

facilitam nas atividades das demais, pois permitem o acesso das enzimas em regiões do

substrato que antes eram inacessíveis. Morais et al. (2012), em outro estudo com duas celulases

(endo e exoglucanases), relataram que as atividades dos celulossomos foi igual ou maior do que

a observada em sistemas livres, refletindo que a combinação das duas enzimas e a alta

flexibilidade melhoram a atividade enzimática.

Em relação à hemicelulose, três tipos de sinergismos têm sido identificados:

homosinergia, heterosinergia e anti-sinergia. A homosinergia se dá quando as enzimas atuam

sobre a cadeia principal da hemicelulose. A heterosinergia se dá quando as enzimas atuam sobre

as ligações da cadeia principal e as dos pontos de ramificações. E por último, a anti-sinergia é

quando uma enzima inibe a ação da outra enzima (Van Dyk; Pletschke, 2012).

No processo de hidrólise da lignocelulose já foi estabelecido a necessidade do uso

de um complexo multienzimático, e que cada proteína desempenha um papel fundamental. O

sinergismo se faz importante devido à elevada complexidade dos polímeros da lignocelulose.

A degradação da xilana requer um conjunto de esterases e glucanases (Chávez et al., 2006). As

endoxilanases e as β-xilosidases são as enzimas responsáveis pela clivagem das ligações

glicosídicas da cadeia central da xilana. O trabalho de sinergia na xilana é importante para a

obtenção do monômero de xilose. O primeiro passo da hidrólise é a quebra desse polímero em

oligossacarídeos menores pela endoxilanase. O principal produto de hidrólise são os oligômeros

β-D-xilanopirosil, mono-, di- e trissacarídeos. A β-xilosidase só atua quando esses

oligossacarídeos estão presentes na mistura, ela não hidrolisa a xilana, seu melhor substrato é a

xilobiose e sua afinidade por xilooligossacarídeos é inversamente proporcional ao grau de

polimerização (Gírio et al., 2010).

Trabalhos publicados mostram que algumas expansinas recombinantes produzidas

por sistemas de expressão, como Escherichia coli e Pichia pastoris, desempenham atividade

funcional atuando como um agente de sinergia na hidrólise de celulose e hemicelulose. Muitos

desses trabalhos clonaram e expressaram genes de expansinas: expansina-like da bactéria

marinha Hahella chejuensis (Lee et al., 2010; Lee et al, 2012), Xanthomonas campestres (Junior

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et al., 2015), e uma α-expansina de tomate (Lycopersiconum esculentum; Liu et al., 2014).

3.10 EXPRESSÃO HETERÓLOGA EM Pichia pastoris

Uma estratégia bastante utilizada para isolar genes, obter a proteína alvo e produzi-

la in vitro tem sido a expressão heteróloga desses genes. Segundo a Enciclopédia de

Neurociência (Binder et al., 2009), expressão heteróloga é o processo de expressar um gene

exógeno/heterólogo em uma célula que não produz a proteína alvo usualmente. As células

“receptoras” desses genes exógenos podem ser organismo unicelulares, como bactérias e

leveduras, mas também multicelulares, como fungos filamentosos e plantas.

A bactéria E. coli foi o primeiro e mais usado sistema de expressão heteróloga

procariótico, isso porque é de fácil manipulação, tem baixo custo de cultivo e possui

crescimento rápido (portanto rápida expressão do gene exógeno). Apesar dessas vantagens,

existem algumas desvantagens em se utilizar E. coli como hospedeiro: a inesxistência de

organelas capazes de realizar modificações pós-traducionais nos polipeptídeos, como

dobramentos das proteínas, glicosilação, fosforilação etc. (Francis & Page, 2010; Yesilirmak &

Sayers, 2009).

Para produção de proteínas eucarióticas, o ideal é clonar os genes heterólogos em

um sistema de expressão eucariótico, onde a proteína produzida terá maior probabilidade de

apresentar as características da proteína nativa. As leveduras são sistemas de expressão bastante

utilizados, pois se constituem em sistemas unicelulares com características bioquímicas,

genéticas e moleculares bastante similares aos outros organismos eucarióticos (Yesilirmak &

Sayers, 2009).

Nas últimas décadas, algumas espécies de leveduras têm sido utilizadas como

sistema de expressão de genes heterólogos por apresentarem vantagens sobre as bactérias, como

a bactéria E. coli. Entre as razões que justificaram esta mudança pode-se citar: a conformação

incorreta de proteínas, a ausência de modificações pós-traducionais e os baixos níveis de

expressão (Torres & Moraes, 2002). Dentre esses novos sistemas de expressão destaca-se

atualmente a levedura P. pastoris.

Saccharomyces cerevisiae é um organismo eucarioto muito bem caracterizado para

produção de proteínas heterólogas. Ao contrário das bactérias, essa levedura realiza as

modificações pos-traducionais requeridas. Porém mesmo tendo a vantagem de realizar essas

modificações, essa levedura possui algumas limitações como hiperglicosilar as proteínas

produzidas e produzir pouca quantidade de proteínas heterólogas, pela falta de um promotor

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induzível forte (Liu et al., 2012; Yesilirmak & Sayers, 2009), como o encontrado na levedura

P. pastoris.

A produção de proteínas recombinantes na levedura P. pastoris tem muitas

vantagens sobre outros sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos. Esse organismo

possui rápida taxa de crescimento acoplada com a alta facilidade de fermentação, elevados

níveis de produtividade para proteínas livres, facilidades na manipulação genética utilizando

vetores de expressão já bem caracterizados, diversidade das modificações pós-traducionais

como, dobramentos de polipeptídeos, metilação, acilação, entre outros (Looser et al., 2015;

Potvin et al., 2012).

Essa levedura se destaca por ser metilotrófica, ou seja, capaz de crescer em meio de

cultura contendo metanol como sua única fonte de carbono (Torres & Morais, 2000). As

leveduras metilotróficas possuem uma via metabólica para a utilização do metanol, e as reações

iniciais do metabolismo do metanol ocorrem no peroxissomo, seguindo para o citoplasma.

Essa levedura se destaca como um dos mais versáteis sistemas de expressão

heteróloga devido ao forte promotor do gene álcool oxidase 1 (AOX1), usado para transcrever

genes heterólogos (Cregg et al., 1993; Potvin et al., 2012). A levedura possui dois genes que

codificam a enzima álcool oxidase, AOX1 e AOX 2. Essas enzimas atuam no peroxissomo

juntamente com catalases, as quais degradam as moléculas de peróxido de hidrogênio (H2O2)

em oxigênio (O2) e água (H2O) (Fig. 12; Cereghino; CREGG, 2000).

Figura 12. Via do metanol da levedura P. pastoris. Em vermelho evidenciando as enzimas álcool oxidase

(1) e catalase (2) (CEREGHINO & CREEG, 2000 adaptado).

O promotor AOX1 é ativado na presença de metanol e reprimido na ausência

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deste ou na presença de glicerol ou glicose (Balamurugan et al., 2007). A presença de metanol

é essencial para obtenção de altos níveis de transcrição, sendo o único indutor neste sistema de

expressão, e ótimas concentrações deste indutor melhoram a produção da proteína heteróloga e

o crescimento da célula (Minjie & Zhongping, 2013).

Devido à existência desse promotor forte, a levedura P. pastoris começou a ser

utilizada como um sistema de expressão para produção de proteínas recombinantes. Muitos

vetores foram construídos usando o promotor AOX, como pPIC9, pHILD2, pPICZ , etc. Esses

vetores de expressão em P. pastoris são do tipo integrativo. O cassete de expressão do vetor

pPIC9 é formado pelo promotor 5’ do gene AOX1, peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae,

sítios múltiplos de clonagem (onde será inserido o gene de interesse), sítio de terminação de

transcrição, marcador de seleção (HIS4), e gene que confere resistência à ampicilina (Ampʳ).

Assim, a expressão do gene in natura e in vitro é induzida na presença de metanol, e quando in

vitro a proteína recombinante é secretada para o meio de cultura, quando o vetor de expressão

possui esse promotor. O cassete de expressão é liberado pela digestão do plasmídio com

enzimas de restrição, as quais permitem a linearização do vetor para a eficiente integração no

genoma da P. pastoris no locus AOX1 (Fig. 13; Torres & Moraes, 2002; LI et al., 2007).

Figura 13. Mecanismo de integração do cassete de expressão no genoma da levedura. A: pareamento

das regiões homólogas do cassete de expressão (superior) e genoma da levedura (meio).

B: Adição do cassete no loco de AOX1 (Adaptado manual “Pichia Expression Kit K1710-

01 - Invitrogen®).

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4.1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE expb11

Sequências codificadoras de α- expansinas e β-expansinas, expansinas like-A e

expansinas like-B foram identificadas no banco de dados de ESTs de cana de açúcar - SUCEST

(Vettore et al., 2001), a partir de sequências de expansinas de sorgo utilizando a ferramenta

tblastn do NCBI (National Center for Biotechnology Information -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As 227 ESTs presentes no banco de dados do SUCEST foram

clusterizadas utilizando o programa CAP3. Foram obtidos 30 contigs e 92 singletons. Este

conjunto de unigenes foi realinhado às sequências de sorgo para fins de identificação. No

presente trabalho, a sequência de expansina de cana-de-açúcar que foi escolhida foi a

correspondente ao Contig 11, corresponde a uma β-expansina, expb11, tendo sido utilizada

como referência para o desenho de oligonucleotídeos (primers) (Tabela 2 e Fig 14).

Tabela 2. Lista de oligonucleotídeos específicos sintetizados a partir da sequência de expb11.

Oligonucleotídeo Sequência (5’- 3’) Posição Par Sítio de

Restrição

EXPB11F1 ATGGCCACCTTCTCCTCCAC Senso F1/R4 -

EXPB11F3 gtgaattcGCTAGACCGGTGAGCTTTAACG Senso F3/ R4 EcoRI

EXPB11-1F CAAGTACCACTTCGACCTCAG Senso 1F/1R -

EXPB11-2F TCTCGGCAATGACATCGTG Sens 2F /2R -

EXPB11R4 ttgcggccgcCTAATACTGGACGATGGAAC

GGT

Anti-senso F1/R4 - F3/ R4 NotI

EXPB11-1R ACGTGGAAAGTCACCTTCTG Anti-senso 1F/1R -

EXPB11-2R GGGTAGTAGTTCATGTCAGTGATGAT Anti-Senso 2F/2R -

4.2 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL DE CANA-DE-AÇÚCAR

A extração de DNA genômico de cana-de-açúcar foi feita a partir de gemas laterais

de colmo da cultivar RB867515, utilizando o protocolo estabelecido por Aljanabi et al. (1999).

4 MATERIAL E MÉTODOS

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Figura 14. Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação de sequências específicas do gene expb11.

Em vermelho a dupla de oligonucleotídeos EXPB11F1/EXPB11R4 que amplificam a

sequência de expb11 contendo o peptídeo sinal, e a dupla EXPB11F3/EXPB11R4.

A gemas foram colocadas em tubos tipo eppendorf de 2 mL juntamente com esferas para

maceração do tecido (3 de tungstênio ou 2 de aço). Foram adicionados 300 µL de tampão de

extração (Tris 200 mM, EDTA 50 mM, NaCl 2,2 M, CTAB 2%) para cada tubo e as gemas

foram maceradas em aparelho Tissuelyser (Quiagen) por 2 minutos em velocidade máxima.

Após a maceração, foram adicionados 750 µL de tampão (solução 1:1:1 de CTAB

20%, PVP 10% e sarcosil 5%, contendo 0,06% de sulfito de sódio) em cada tubo de extração.

Os tubos foram incubados a 65°C em banho-maria por um período de 1 h, com homogeneização

da solução a cada 10 min. Em seguida, foram adicionados 750 µL de CIA (álcool isoamílico e

clorofórmio 1:4), homogeneizando por 10 min. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por

10 min. O sobrenadante foi transferido para novos tubos tipo eppendorf contendo 500 µL de

isopropanol e 80 µL de NaCl 6 M. A solução foi misturada por inversão do tubo e incubada a -

20 °C por no mínimo 40 minutos.

Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 10 min a 10.000 rpm. O

precipitado foi então lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70%, e submetido à centrifugação

como na etapa anterior. Uma nova lavagem com etanol 95% foi realizada, seguida de

centrifugação. Após a secagem do DNA precipitado, este foi ressuspendido em 50 µL de tampão

tris-EDTA ou água ultrapura contendo 1 µL de solução RNase (10 mg/mL) e guardados a – 20

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°C até o momento do uso.

4.3 ISOLAMENTO DO GENE DE exbp11 IN VITRO

Com o objetivo de se estudar a estrutura gênica e com base na sequência de

referência obtida in silico do gene expb11, foi feito um estudo comparativo com a sequência de

expansina de sorgo que apresentou a maior identidade em relação à expb11. As sequências das

versões CDS (Coding DNA Sequence) e genômica de sorgo foram alinhadas à sequência de

expb11 obtida de cana-de-açúcar utilizando o software ClustalX (Thompson et al., 1997).

Para fins de amplificação da sequência genômica de expb11 in vitro, o DNA

genômico extraído foi utilizado como fita molde na reação de polimerização em cadeia (PCR),

utilizando-se os oligonucleotídeos específicos, EXPB11F1 (desenhado para a amplificação do

gene expb11 contendo o peptídeo sinal) e EXPB11R4 (desenhado para a região do stop-códon),

e o Multiplex PCR Kit (Qiagen®) seguindo o protocolo do fabricante. A amplificação do gene

expb11 por PCR foi realizada no termociclador T-100 Thermal Cycler (BioRad®), utilizando o

seguinte ciclo de temperatura: etapa de desnaturação inicial e ativação da HotStarTaq DNA

Polymerase 15 min a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 30 s a 94 ºC, 45 s a 57 ºC, 1 min e 30 s a

72ºC; e incubação final com 30 min a 60ºC e 15 min a 4ºC. O produto de PCR foi utilizado nas

reações de sequenciamento.

4. 4 OBTENÇÃO DO cDNA A PARTIR DA EXTRAÇÃO DE RNA DOS DIFERENTES

TECIDOS DE CANA-DE-AÇÚCAR

Conforme proposto por Chang et al. (1993), o RNA total foi extraído de diferentes

tecidos estruturais (colmos, folhas, gemas) e plântula de cana-de-açúcar. As amostras de RNA

total foram submetidas à reação de RT-PCR com a enzima transcriptase reversa para a obtenção

da primeira fita do DNA complementar (cDNA), na qual utilizou-se o kit First Strand cDNA

Synthesis (Thermo Scientific®).

Após a síntese dos cDNAs totais, para a obtenção do cDNA do expb11, foi realizada

uma reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos EXPB11F3 (desenhado para amplificar a

sequência de cDNA de expb11 sem o peptídeo sinal) e EXPB11R4 incluindo a sequência dos

sítios de restrição para as endonucleases EcoRI e NotI. O programa de amplificação por PCR

neste caso foi o seguinte: desnaturação inicial a 95ºC por 3 min, trinta e nove ciclos de 45 s a

95º C, 30 s a 55ºC, 1 min e 30 s a 72ºC, finalizando com 10 min a 72ºC e 15 min a 4ºC. O

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produto de PCR foi armazenado a -20º C.

4.5 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE CLONAGEM pGEMT-expb11

O cDNA amplificado de expb11 foi clonado no vetor de clonagem pGEM-T Easy

(Promega Corporation©, Fitchburg, Wisconsin, United States), resultando no plasmídeo

pGEMT-expb11 (Fig. 15). Esse plasmídeo foi inserido em células termo competentes de E. coli

DH5α.

Figura 15. Vetor de Clonagem. A: Esquema do vetor pGEM-T Easy mostrando a região do sítio múltiplo

de clonagem. B: Construção pGEMT-expb11.

Figura 16. Vetor de Clonagem. A: Esquema do vetor pGEM-T Easy mostrando a região do sítio múltiplo

de clonagem. B: Construção pGEMT-expb11.

4.5.1 Preparação de células bacterianas termo competentes de E. coli

O preparo de células termo competentes para o protocolo de transformação foi

realizado utilizando-se a linhagem DH5α (Sambrook & Russell, 2001). Uma colônia isolada

em placa de LB ágar (peptona 1%, extrato de levedura 0,5%, cloreto de sódio 1%) sem

antibiótico foi inoculada em 5 mL de LB líquido a 37° C, over night, sob agitação a 200 rpm.

Após esse período, 500 µL do pré-inóculo foram adicionado em 200 mL de meio SOC em

frascos de 1 litro (triptona 2%, extrato de levedura 0,5%, cloreto de sódio 0,058%, cloreto de

sódio 0,018%, glicose 20 mM, cloreto de magnésio 20 mM) nas mesmas condições até se atingir

uma OD600 entre 0,35 e 0,45.

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As células foram incubadas por 30 min em banho de gelo, e coletadas por

centrifugação a 3000 g, por 10 min a 4 ºC. O pellet de células foi lavado com solução CaCl2

100 mM e submetido novamente à centrifugação. As células foram ressuspendidas em 15 mL

da mesma solução e mantidas no gelo por 1 h, e então recolhidas por centrifugação. Elas foram

ressuspedidas em 4 mL de solução de Glicerol 15% CaCl2, aliquotadas em 100 µL e

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a -80ºC até o momento do uso.

4.5.2 Transformação bacteriana por choque térmico

A construção pGEMT-expb11 foi adicionada a uma alíquota de célula termo

competente (até 10% do volume da alíquota). O sistema foi incubado em banho de gelo por 45

min. Depois o sistema foi submetido a choque térmico a 42ºC por 1 min e 30 s, seguido de

incubação em gelo por 2 min. Foram adicionados 1 mL de meio SOC, incubando por 1 h a

37ºC, sob agitação a 200 rpm, e então “estricadas” em placas com meio LB ágar contendo 100

mg/mL de ampicilina e 2% X-Gal.

4.5.3 Análise das colônias transformadas com pGEMT-expb11

Para a análise das colônias transformadas com o plasmídeo pGEMT-expb11,

algumas colônias foram amostradas e submetidas à PCR de colônia, utilizando os

oligonucleotídeos específicos de expb11 EXPB11F3 e EXPB11R4. As colônias que

apresentaram um resultado positivo na PCR, foram submetidas ao processo de extração de DNA

plasmidial, que foi analisado quanto ao seu perfil de digestão com as enzimas de restrição EcoRI

(Thermo Scientific®).

4.6 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO E DO CASSETE DE EXPRESSÃO PPIC9-

expb11

4.6.1 Construção do plasmídeo pPIC9-expb11

Para a construção do vetor de expressão pPIC9-expb11, o plasmídeo pGEMT-

expb11 foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e NotI (Thermo Scientific®), para a

liberação do fragmento expb11. A digestão foi analisada por eletroforese em gel de agarose

0,8%. O fragmento correspondente ao tamanho esperado de expb11 foi eluído do gel pelo uso

do kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). O vetor pPIC9 (Invitrogen)

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também foi digerido com as mesmas enzimas com o objetivo de gerar extremidades coesivas,

assim facilitando a ligação vetor-inserto.

Antes da montagem do sistema de ligação do gene de interesse e o vetor de

expressão, o vetor foi tratado com ATP Fosfatase (Thermo Scientific®) para a sua

defosforilação, com o objetivo de diminuir a religação do mesmo. O sistema de ligação foi

montado (relação 5:1) adicionando inserto, vetor e a enzima T4 DNA ligase (Thermo

Scientific®), a 4ºC, over night. Esse sistema de ligação, representado na Figura 3, foi então

utilizado na transformação bacteriana de células eletrocompetentes de E. coli.

Figura 17. Esquema da construção pPIC9-expb11. A: Vetor pPIC9 vazio. B: Plasmídeo pPIC9- expb11,

mostrando em vermelho o gene de interesse.

4.6.1.1 Preparaça o de ce lulas eletro competentes de E. coli

As células de E. coli da linhagem DH5α foram plaqueadas em meio LB sólido a

37ºC por 16 h. Após esse período, uma colônia isolada foi inoculada em 10 mL de meio SOC

em erlenmeyer de 125 mL e incubada a 37ºC, over-night, sob agitação a 200 rpm. Em seguida,

500 µL do pré-inóculo foram adicionados a 200 mL de meio SOC em erlenmeyer de 1 L e essa

cultura foi incubada a 37º C sob agitação (200 rpm) até atingir uma OD600 de 0,5 a 0,7. As

células foram resfriadas em gelo por 45 min e em seguida coletadas por centrifugação a 3000

rpm por 20 min a 4ºC. Em seguida, as células foram lavadas em água destilada estéril gelada, e

recolhidas por centrifugação. Esse procedimento foi realizado por 2 vezes. Após isso, as células

foram lavadas três vezes com glicerol 10% e centrifugadas 3000 rpm por 20 min a 4ºC.

Posteriormente, ressuspendeu-se cuidadosamente as células em 2 mL de glicerol 10%.

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Finalmente, as células foram aliquotadas em volume de 50 µL em tubos tipo eppendorf e

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. As células eletro competentes foram

estocadas a -80ºC até o momento do uso.

4.6.1.2 Transformaça o bacteriana por eletroporaça o

Para a transformação por eletroporação das células bacterianas, foi adicionado 1 µL

do sistema de ligação pPIC9-expb11 no tubo contendo as células eletro competentes e incubada

no gelo por 5 minutos. A mistura de células e o sistema de ligação foram transferidos para a

cubeta de 0,1 mm (Biorad®), esta previamente resfriada, e submetida a eletroporação conforme

instruções do fabricante (Gene Pulser Xcell – BioRad®). Imediatamente após o choque elétrico,

foi adicionado na cubeta 1 mL de meio SOC, para ressuspensão das células, e esse volume

transferido para a um tubo tipo falcon com mais 1 mL de SOC. As células foram incubadas por

um período de 1 h, a 37ºC sob rotação de 200 rpm, e posteriormente plaqueadas em meio LB

ágar contendo 100 mg/mL de ampicilina. A células transformadas foram incubadas a 37ºC, over

night.

4.6.1.3 Ana lise das colo nias transformadas com pPIC9-expb11

Para a análise das colônias transformadas com o plasmídeo pPIC9- expb11, foram

amostradas algumas colônias as quais foram submetidas à PCR de colônia, utilizando-se os

oligonucleotídeos específicos de expb11 EXPB11F3 e EXPB11R4. As colônias que

apresentaram um resultado positivo na PCR foram submetidas ao processo de extração de DNA

plasmidial que foi analizado quanto ao seu pelo perfil de digestão do plasmídeo com as enzimas

de restrição EcoRI e NotI em gel de agarose 0,8%.

4.6.2 Construção do cassete de expressão pPIC9- expb11

Para a construção do cassete de expressão a ser integrado no genoma da levedura,

foram escolhidas duas estratégias com a intenção de gerar transformantes Mut+ e MutS. A

estratégia para obter transformantes Mut+ foi a digestão do plasmídeo pPIC9- expb11 com a

enzima de restrição Sal I, que permite a linearização do plasmídeo na região da open read frame

(ORF) de HIS4 (Fig. 17A). Os sistemas de digestão dos plasmídeos (pPIC9- expb11 e pPIC9

vazio) foram feitos com 15 µg de DNA plasmidial, 10 U/µL Sal I (Thermo Scientific), 10%

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Tampão da enzima e água ultrapura (q.s.p.). Os sistemas foram incubados a 37º C por 7 horas.

A mesma estratégia foi realizada com o vetor pPIC9 vazio, com a intenção de obter

se o controle negativo com perfil Mut+(Fig. 18A). Os materiais digeridos com Sal I foram

analisados em eletroforese em gel de agarose 0,8 %, e confirmada a completa digestão foram

então submetidos a precipitação com acetato de sódio 3 M e os precipitados foram

ressuspendidos em 10 µL de água ultrapura.

Para obtenção de possíveis transformantes com perfil MutS, a digestão foi realizada

com a enzima de restrição BglII, a qual cliva em duas posições no plasmídeo, gerando dois

fragmentos: um menor (contendo a parte funcional na bactéria, com a origem de replicação do

plasmídeo e gene de seleção Ampr) e um maior (cassete de expressão, com as partes funcionais

a serem expressas na levedura, gene de interesse e gene de seleção em levedura His4) (Fig.

17B).

A mesma estratégia foi usada somente com o vetor pPIC9 vazio, para a tentativa de

se obter do controle negativo com perfil MutS (Fig. 18B). O sistema de digestão dos plasmídeos

(pPIC9- expb11 e pPIC9 vazio) foram feitos com 40 µg de DNA, 10 U/µL Bgl II (Thermo

Scientific), 10% Tampão da enzima e água ultrapura (q.s.p.). Os sistemas foram incubados a

37ºC por 7 horas. O volume total foi analisado em eletroforese 0,8%, e o fragmento maior

liberado na digestão foi eluído do gel (QIAquick® Gel Extraction Kit – Quiagen®) e

posteriormente precipitado com acetato de sódio 3 M. O precipitado foi ressuspenso em 10 µL

de água ultrapura.

Figura 18. Construção do cassete de expressão pPIC9-expb11 a ser integrado no genoma da levedura.

A: Esquema representando o plasmídeo ao ser digerido com a enzima Sal I, apenas

pPIC9-expb11

~8.7 kb

pPIC9-expb11

~6.3 kb

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linearizando. B: Esquema representando o fragmento contendo o gene expb11, obtido pela

digestão plasmídeo.

4.6.2.1 Preparaça o de ce lulas competentes de Pichia pastoris

As células de P. pastoris foram plaqueadas em meio YPD ágar (peptona 2%, extrato

de levedura 1%, glicose 2%, ágar 1,5%) por 3 dias a 30ºC, para recuperação. Após esse período,

uma colônia isolada foi pré-inoculada em 10 mL de meio YPD (peptona 2%, extrato de levedura

1%, glicose 2%) em erlenmeyer de 125 mL e incubadas a 30ºC por 18 h sob agitação de 200

rpm. Após este período, 100 μL do pré-inóculo foi adicionado a 200 mL de meio YPD em

erlenmeyer de 1 L e incubado sob as mesmas condições do pré-inóculo até atingir uma DO600

entre 1,3 a 1,5. As células foram então coletadas por centrifugação a 1.500 g por 5 min a 4ºC e

ressuspendidas em 125 mL de água destilada estéril gelada. Em seguida, foram submetidas à

centrifugação nas mesmas condições anteriores e ressuspensas em 125 mL de água destilada

estéril gelada. Posteriormente, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em 10 mL de

sorbitol 1 M gelado, e novamente centrifugadas e ressuspendidas em 1 mL de sorbitol 1 M

gelado para um volume final de aproximadamente 1,5 mL. As células competentes foram

utilizadas imediatamente na transformação.

Figura 19. Esquema de digestão da construção para controle negativo pPIC9 vazio. A: Digestão de

linearização com a enzima de restrição Sal I. B: Vetor pPIC9 vazio digerido com a enzima

de restrição Bgl II.

4.6.2.2 Transformaça o das ce lulas de P. pastoris

pPIC9

~8 kb

A

B

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Duas linhagens de P. pastoris foram escolhidas para o desenvolvimento do trabalho:

GS115 (his4) e SMD1168 (pep4Δ e his4). Foram usadas ao todo quatro estratégias (Fig. 8) para

obtenção dos transformantes: GS115 Mut+ e MutS, e SMD1168 Mut+ e MutS.

Os cassetes construídos foram introduzidos nas células de P. pastoris utilizando o

protocolo de eletroporação. Uma quantidade de 10-20 µg de DNA foi misturada em 80 µL de

células em suspensão, seguindo-se uma incubação em gelo por 5 minutos. As células foram

transferidas para uma cubeta de 0,2 cm (Biorad), e submetidas à eletroporação (Gene Pulser

Xcell – Biorad®). Posteriormente, 1 mL de sorbitol 1 M gelado foi adicionado na cubeta para

a ressuspensão das células, e esse volume foi transferido para um tubo tipo falcon de 15 mL e

incubado a 30º C por 2 horas sob agitação de 180 rpm. Após esse período, 200-600 µL foram

plaqueados em meio MD, sem histidina, para a seleção dos transformantes. As células foram

mantidas por 3 dias a 4º C.

Figura 20. Esquema representativo das estratégias para a obtenção de diferentes transformantes.

4.7 SELEÇÃO DOS TRANSFORMANTES CONTENDO O CASSETE pPIC9-expb11

Após o crescimento dos transformantes, os mesmos foram estricados, de acordo

com o manual Pichia Expression Kit (Invitrogen), em placas contando de 1 a 52 transformantes,

antes da seleção do transformante positivo (Fig. 9).

Para confirmar a integração do cassete de expressão no genoma da levedura, foi

realizado uma PCR com DNA genômico extraído dos transformantes crescidos nas placas de

MD (YNB 1,34%, Biotina 4.10-5, glicose 2%).

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4.7.1 Extração de DNA genômico da levedura P. pastoris

Foram escolhidas 10 colônias de cada estratégia para a análise. Após 3 dias de

crescimento, a colônia foi ressuspendida em 100 µL de tampão STES (0,2 M Tris-HCl pH 7,6,

0,5 M cloreto de sódio, 0,1% SDS, 0,01 M EDTA), 1 µL de RNAase A (10 mg/mL – Thermo

Scientific®). Depois foram adicionados 40 µL de tampão TE (0,1 M Tris-HCl pH 7,6, 0,01 M

EDTA pH 8) pH 7,6 e um volume de 50 µL de glass beads. As células foram lisadas em vortéx

por 1min. Posteriormente foi adicionado 120 µL de solução fenol:clorofórmio (1:1) e a

suspensão foi submetida ao vortéx por mais 1 minuto. O material foi centrifugado em rotação

máxima por 5 min à temperatura ambiente. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo, ao

qual foram adicionados três volumes de etanol absoluto e 10% de acetato de sódio 3 M pH 5,2.

Em seguida, a mistura foi centrifugada a 10.000 rpm a 4º C por 15 min. O precipitado foi lavado

com 200 µL de etanol 70%. O DNA foi centrifugado a 10.000 rpm a 4ºC por 5 minutos. O

sobrenadante foi removido, e após o precipitado estar seco, o DNA foi ressuspendido em 50 µL

de água ultrapura. Um volume de 1 µL do preparado foi usado na reação de PCR com Multiplex

PCR Kit (Quiagen®), utilizando-se os oligonucleotídeos EXPB11F3 e EXPB11R4. O programa

para a amplificação do produto de PCR foi o seguinte: etapa de desnaturação inicial e ativação

da HotStarTaq DNA Polymerase 15min a 95º C, seguidos de 40 ciclos de 30 s a 94º C, 45 s a

57º C, 1min e 30 s a 72 ºC, e extensão final com 30min a 60ºC e 15 min a 4ºC.

Figura 21. Placa de contagem dos transformantes.

4.7.2 Análise dos transformantes por produção da proteína recombinante (EXPB11r)

em frasco

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Das colônias analisadas por PCR, apenas as estratégias GS115-BglII e GS115-SalI

foram analisadas em produção em frasco de 250 mL. Quatro transformantes positivos para a

construção pPIC9-expb11 e 1 controle negativo (P. pastoris transformada com cassete pPIC9

vazio) de cada estratégia foram escolhidas para a análise.

A produção foi feita conforme o protocolo Pichia Expression Kit (Invitrogen) em

25 mL de meio meio BMGY-U (Buffered Minimal Glycerol with Urea)(Uréia 1,34%, peptona

2%, extrato de levedura 1%, biotina 4,10-5%, glicerol 10%, tampão fosfato de sódio 1 M pH 6).

As células foram incubadas a 28º C com agitação a 200 rpm. Após as 24 horas de crescimento,

as células foram lavadas duas vezes em água destilada estéril, e então coletadas por

centrifugação 1.500xg por 10 minutos e ressuspendidas em meio de indução BMMY-U

(Buffered Minimal Methanol with Urea) (Uréia 1,34%, peptona 2%, extrato de levedura 1%,

biotina 4,10-5%, metanol 20%, tampão fosfato de sódio 1 M pH 6) com OD600 inicial de 5. A

cada 24 horas, era adicionada a concentração final de 1% de metanol em cada frasco para

contínua indução do promotor AOX1 e alíquotas do meio de cultura eram retiradas. Estas

alíquotas foram utilizadas para o acompanhamento da curva de crescimento das células,

detecção da concentração de proteínas totais do sobrenadante de cultura por ensaio de Bradford,

e para análise do perfil de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE.

4.7.3 Ensaio de Swelling com o sobrenadante de cultura para a verificação de atividade

funcional de expansina EXPB11r

Para a análise da atividade funcional de EXPB11r, os sobrenadantes de cultura da

produção dos transformantes foram analisados conforme descrito por Kim et al. (2009). O

sobrenadante dos oito transformantes e de seus respectivos controles negativos foram incubados

em tiras de papel de filtro, e após o período de incubação foi realizado ensaio de atividade de

FPase com um mix de celulases produzidas pelo fungo Humicola grisea var. thermoidea.

Seis discos de papel de filtro de 6 mm de diâmetro (nº 1, 2,5 mg - Whatman) foram

utilizados como substrato nesse ensaio de atividade funcional. Para os tubos testes, o substrato

foi incubado em 500 µL de sobrenadante de cultura e 500 µL de Tampão McIlvaine pH 7. Dois

tubos controles negativos foram ensaiados. Para o tubo controle negativo 1 da reação, o

substrato foi incubado em 10 µL de solução de Soro Albumina Bovina (1 mg/mL) e 990 µL de

Tampão McIlvaine pH 7. Para o tubo controle negativo 2 da reação, o substrato foi incubado

em 1000 µL de Tampão McIlvaine pH 7(Quadro 1). Os ensaios foram realizados em duplicata,

na seguinte condição de incubação: 30ºC, por 96 horas, sob agitação de 190 rpm.

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Quadro 1. Esquema para o ensaio de atividade funcional de EXPB11 recombinante

Tubo Quant. de Substrato Quantidade de Proteína Quantidade de Tampão

Teste 6 discos (2,5 mg) 500 µL de sobrenadante 500 µL Tampão McIlvaine pH 7,0

Controle

negativo 1

6 discos (2,5 mg) 10 µL de BSA (1

mg/mL)

990 µL Tampão McIlvaine pH 7,0

Controle

negativo 2

6 discos (2,5 mg) - 1000 µL Tampão McIlvaine pH 7,0

4.7.3.1 Ensaio de atividade de FPase

Após o período de incubação, o sobrenadante de cultura, supostamente contendo a

proteína EXPB11r, foi descartado. Os discos de papel de filtro foram então incubados com 250

µL de mix de celulase de H. grisea var. thermoidea e 250 µL de tampão Citrato de Sódio 50

mM pH 4,8 por 1 hora. Posteriormente, 500 µL do volume foram transferidos para um novo

tubo e tratados com 500 µL de DNS (0,75% ADNS, hidróxido de sódio 1,4%, tartarato de sódio

e potássio 21,6%, fenol 0,54%, metabissulfito de sódio 0,58%)(Miller, 1959), a 100º C por 5

min, seguidos de resfriamento em gelo por 5 min (Quadro 2).

Quadro 2. Esquema para o ensaio de FPase.

Componente Tubo Teste Tubo Branco do Teste Tubo Branco do Aparelho

Enzima 250 µL 250 µL (após a incubação

por 1 hora)

-

Tampão 250 µL 250 µL 500 µL

Substrato 6 discos (2,5 mg) 6 discos (2,5 mg) -

4.8 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE expb11

4.8.1 Extração de RNA da levedura P. pastoris

Para verificar a expressão do gene de expb11 sob condições de indução em metanol,

um transformante da estratégia GS115:BglII foi escolhido. Para essa análise, foi feita a coleta

das células do transformante positivo, em diferentes tempos de cultivo sob indução por metanol:

do transformante controle negativo (P. pastoris transformada com pPIC9 vazio), e de P. pastoris

GS115 selvagem (sem ser transformada). Os tempos de coleta foram: 0 h (promotor AOX1

ainda não induzido), 14 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, totalizando 6 pontos de coleta. Cada ponto

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foi produzido em frascos diferentes, e ao término de cada um, as células foram centrifugadas

(3000 g, por 5 min, temperatura ambiente) e lavadas em água destilada estéril, e posteriormente

ressuspendidas em volume de 2 mL água ultrapura, e imediatamente armazenadas em papel

alumínio, foram etiquetadas e congeladas imediatamente em nitrogênio líquido, sendo

estocadas a - 80ºC até o momento da extração.

As células foram maceradas em cadinhos fornados previamente a 180ºC,

transferidas para um tubo RNAse free contendo 1 mL de glass beads e 2 mL de Trizol, e agitadas

em vórtex. As células foram incubadas à temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente, 200

µL de clorofórmio RNAse free foi adicionado ao tubo e homogeneizado por inversão de tubo.

A mistura foi incubada por 5 min em gelo. Após esse período de incubação, o material foi

centrifugado à velocidade máxima por 10 min. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo

RNAse free, no qual foram adicionados 500 µL de Isopropanol “RNAse free” para cada 1 mL

de Trizol utilizado. A mistura foi homogeneizada por inversão de tubo e incubada a temperatura

ambiente por 10 min. Em seguida, a mistura foi aliquotada em tubos eppendorfs de 2 mL e

centrifugados a 16.000 g por 15 min, a 4ºC. O RNA foi lavado com etanol 75% e centrifugado

a 10.000 g por 10 min, a 4º C, e seco por 20 min. O RNA dissolvido em água ultrapura contendo

DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) foi avaliado quanto a integridade em eletroforese em gel de

agarose 1%. O RNA foi estocado a - 80º C até o momento do uso.

4.8.2 Síntese de cDNA total

Para a síntese de cDNA total, todos os RNAs dos pontos coletados foram submetidos a

reação com transcriptase reversa. Na síntese de cDNA, 5 µg de RNA previamente tratado com

DNAse e 1 µL de Oligo(dT) (10 µM) foram incubados a 65º C por 5 min, seguido de

resfriamento no gelo. Após esse período, foram adicionados 4 μL do tampão de reação 5x, 1 μL

do inibidor de RNase (20 U/μL), 2 μL mix dNTP (10 mM), 1 μL transcriptase reversa RevertAid

M-MuLV (200 U/μL) e água ultrapura contendo DEPC para um volume final de 21 μL. A reação

se processou por 60 min a 45° C, e foi encerrada resfriando o tubo a 4° C por 20 min. A primeira

fita do cDNA foi utilizada em PCR normal com diversas combinações de oligonucleotídeos

específicos para expb11 e os oligonucleotídeos desenhados para qPCR do gene de expressão

constitutiva Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) de P. pastoris (qGAPDH-

F: CGGTGTTTTCACCACTTTGGA e qGAPDH-R: CAACGAACATTGGAGCATCCT).

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4. 9 SEQUENCIAMENTO DO GENE E cDNA DE EXPB11

As amostras do fragmento genômico expb11 utilizada para o sequenciamento foram

amplificadas pelo kit de PCR Multiplex PCR Kit (Qiagen®). Para a reação de amplificação do

gene expb11, foram utilizados os oligonucleotídeos EXPB11F1 e EXPB11R4. Para a reação de

sequenciamento também foram usados a combinação de oligonucleotídeos internos EXPB11-

2F e EXPB11-2R (Fig. 21).

Figura 22. Ilustração do anelamento da combinação de oligonucleotídeos EXPB11F1/EXPB11R4 e

EXPB11-2FS/EXPB11-2RATpara as reações de sequenciamento da versão genômica do

gene expb11.

A versão cDNA de expb11 sequenciada foi obtida pela amplificação por PCR com as

construções pGEMT-expb11 e pPIC9-expb11. A PCR foi realizada utilizando-se o Multiples

PCR Kit (Qiagen®) com a combinação de oligonucleotídeos EXPB11F3 e EXPB11AR4. Para

as reações de sequenciamento também foram utilizados os oligonucleotídeos EXPB11-2F e

EXPB11-2R, os oligonucleotídeos do vetor pGEM-T Easy SP6 e T7, e os oligonucleotídeos do

vetor pPIC9 5’AOX1 e 3’ AOX1 (Fig. 22 e Quadro 3).

Quadro 3. Oligonucleotídeos usados nas reações de sequenciamento das construções vetores e expb11

Oligonucleotídeos Sequência (5’-3’) Par

T7 TAATACGACTCACTATAGGG T7/SP6

SP6 ATTTAGGTGACACTATAG T7/SP6

5’AOX’ GACTGGTTCCAATTGACAAG 5’AOX’/3’AOX1

3’AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC 5’AOX1/3’AOX1

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4.9.1 Reações de sequenciamento

Para o sequenciamento dos fragmentos de expb11, foram utilizados 1 µL (~300 ng) de

DNA plasmidial, 1 µL (~40 ng) de produto de PCR, 1 µL de primer (2,5 µM), 2 µL de

SaveMoney, 1 µL de BigDye e 5,5 µL de água MiliQ. O sequenciamento foi realizado com o

kit de sequenciamento BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Kit (Thermo Scientific). O programa

para a reação de sequenciamento foi o seguinte: desnaturação inicial a 94º C por 5 min, trinta

ciclos de 10 s a 96º C, 5 s a 5º C, 4 min a 60º C, finalizando a 4º C. As reações foram mantidas

a 4º C até o momento da precipitação.

Figura 23. Ilustração do anelamento dos oligonucleotídeos para sequenciamento da versão cDNA do gene expb11.

A: Combinação de oligonucleotídeos para amplificar os produtos de PCR. B: Dupla de oligonucleotídeos

utilizados para a amplificação da construção pGEMT-expb11.

4.9.2 Precipitação de reação de sequenciamento

Após a reação de sequenciamento, foram adicionados 40 µL de isopropanol 65%

(Merck), seguindo-se agitação em vórtex. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por

20 min. Em seguida, a placa foi centrifugada em velocidade máxima por 45 min. Após a retirada

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do isopropanol, foram adicionados 250 µL de etanol 60%, seguindo-se centrifugação a

velocidade máxima por 10 min. Posteriormente todo o volume de etanol foi retirado e as

amostras foram secas a 90ºC por 2 min, e resfriadas à temperatura ambiente. Após a secagem

das amostras, as mesmas foram ressuspendidas em 10 µL de formamida Hi-Di e desnaturadas

por 5 min a 95ºC. Após a desnaturação, as amostras foram resfriadas em banho de gelo, e

mantidas a 4ºC. As amostras do gene e do cDNA de expb11 foram sequenciadas em um

sequenciador automático de 8 capilares ABI3500 (Applied Biosystems), no Laboratório de

Genética e Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás (UFG).

4.9.3 Análises das sequências obtidas por bioinformática

Os eletroferogramas resultantes do sequenciamento foram visualizados no

programa Bioedit e analisados no programa Eletropherogram quality analysis. As sequências

obtidas foram analisadas, avaliadas quanto à qualidade e submetidas à clusterização por meio

das ferramentas phred, cross-match e CAP3, disponíveis na página

http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/.

4.9.4 Análise da sequência de aminoácidos

A obtenção da sequência de aminoácidos foi predita na plataforma Translate Tool

(http://web.expasy.org/translate/). A sequência foi analisada quanto ao perfil de glicosilação na

plataforma NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) e NetOGlyc 4.0

Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) para predizer os potenciais sítios de N-

glicosilação e O-glicosilação, respectivamente. A massa molecular e ponto isoelétrico foram

estimados pela plataforma ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/). Os domínios

conservados foram determinados pela plataforma ProDom disponível em

http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/form.php. A estrutura tridimensional foi predita

através da plataforma SwissModel (https://swissmodel.expasy.org/).

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5.1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE Β-EXPANSINAS DE CANA-DE-AÇÚCAR

Em um trabalho realizado por Sampedro e Cosgrove (2005), sequências de

aminoácidos de expansinas de Arabidopsis thaliana e Oriza sativa foram classificadas como α-

expansinas, β-expansinas, expansinas-like-A e expansinas-like-B. Em nosso grupo de pesquisa,

Siqueira et al. (2014), utilizando as sequências de referência de Sampedro e Cosgrove (2005),

classificaram sequências de expansinas de milho e sorgo previamente publicadas. Das

sequências de milho, 28 foram identificadas como α-expansina, 49 como β-expansina e 4 como

do tipo expansinas-like. Das sequências de sorgo, 40 foram identificadas como α-expansinas e

36 como β-expansina. A Figura 23 apresenta o dendograma produzido por Siqueira et al. (2014).

A sequência inicial do gene de expansina expb11 de cana-de-açúcar foi obtida a

partir da análise de sequências de expansinas presentes no banco de dados do SUCEST (Vettore

et al., 2001). As sequências de expansinas de cana-de-açúcar foram alinhadas com sequências

de aminoácidos de expansinas de sorgo utilizando o algoritmo tBlastX – NCBI

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), permitindo a identificação de 227 ESTs, as quais foram

agrupadas formando 30 contigs e 92 singletons. Estas 122 sequências foram então classificadas

com base nas suas relações filogenéticas nas diferentes classes de expansinas (α, β, like-A e like

B).

Entre os contigs e singletons identificados, 51 sequências foram identificadas como

α-expansinas e 52 foram como β-expansina. Como já descrito anteriormente, devido ao

interesse nas β-expansinas, por possuirem maior especificidade por hemiceluloses de gramíneas

especificadamente por arabinoxilanas (Sampedro et al., 2015), as sequências correspondentes

a essa classe foram selecionadas. As 52 sequências correspondentes a β-expansinas foram

alinhadas entre si, e as sequências com grande identidade foram separadas em grupos. Foram

obtidas 26 sequências consenso que foram traduzidas utilizando a plataforma MEGA4 (Tamura

et al., 2007). As 26 sequências de aminoácidos geradas foram alinhadas com as sequências de

aminoácidos de expansinas de Arabidopsis thaliana, arroz e sorgo para a classificação das

sequências de cana-de-açúcar dentro das categorias de β-expansina (β-I ou β-II). As sequências

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

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de cana-de-açúcar e de sorgo que não se agruparam nas categorias β-I ou β-II, foram indicados

como β-n. A Figura 24 mostra o dendograma resultante da comparação das expansinas de cana-

de-açúcar com as de Arabidopsis, milho, arroz e sorgo.

A partir dos alinhamentos das ESTs de cana-de-açúcar, foram escolhidas duas

sequências de cada grupo na tentativa de isolar cada uma delas a partir do genoma de cana-de-

açúcar por PCR e fazer a clonagem e expressão desses genes em sistemas heterólogos. Dentre

as sequências escolhidas, foi selecionada a sequência correspondente ao contig 11 (como

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Figura 24. Dendrograma representativo das relações filogenéticas entre expansinas. Expansinas de

milho (verde) e sorgo (vermelho) com base na classificação das sequências de arabidopsis

(azul) e arroz (preto) do trabalho de Sampedro e Cosgrove (2005). As sequências foram

alinhadas e o dendrograma gerado por neighbor-joining utilizando-se o ClustalX (Siqueira

et al., 2014).

indicado pela seta na Figura 24) para o prosseguimento do presente trabalho, pois foi a única

sequência de cDNA que foi amplificada. Após a identificação dessa sequência in silico, foi

possível o desenho dos oligonucleotídeos que foram utilizados para amplificação do fragmento

genômico e do cDNA correspondente.

5.2 ISOLAMENTO DO GENE expb11

No presente trabalho, tanto o gene, em sua versão genômica, quanto o cDNA de

expb11, correspondentes ao contig 11, foram isolados por PCR e sequenciados. O par de

oligonucleotídeos utilizados para a amplificação do DNA genômico (EXPB11F1 e EXPB11R4)

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Figura 25. Dendrograma de classificação das sequências de expansinas de cana-de-açúcar (verde) e

sorgo (vermelho) com base nas sequências deAarabidopsis (azul) e arroz (preto). As

sequências foram alinhadas e o dendrograma gerado por neighbor-joining utilizando o

ClustalX (Siqueira et al., 2014). A seta preta indica o contig escolhido para a realização do

presente trabalho.

inicia a amplificação na região da sequência do peptídeo sinal e termina na região do códon

deparada. Foi obtido um fragmento de aproximadamente 1300 pb (Fig. 25).

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Figura 26. Perfil eletroforético dos produtos de PCR amplificados a partir DNA genômico da variedade

de cana-de-açúcar RB867515, com os oligonnucleotídeos EXPB11F1 e EXPB11R4. M: Marcador

molecular GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder. Poços 1 a 6: Fragmentos genômicos correspondentes ao

contig 11. Poço 8: DNA genômico total.

Fragmentos de cDNA foram obtidos utilizando-se o par de oligonucleotídeos

EXPB11F3 e EXPB11R4. A Figura 26 nos permite verificar um fragmento de aproximadamente

700 pb, indicando que o RNA expb11 foi expresso nas estruturas colmo e folha de cana-de-

açúcar.

Noleto (2014), analisou dois genes de β-expansina por qPCR Real Time, sendo um

desses gene expb11. No trabalho, foi possível observar que houve a expressão de expb11 em

todas as estruturas analisadas (colmo, folha, gema, raiz, folha e plântula), entretanto foi

observada variação no nível de expressão em cada estrutura. Como exposto no trabalho, a

expressão gênica relativa de expb11 apresentou maiores níveis em estruturas como raiz quando

comparados a outras estruturas como colmo.

Figura 27. Amplificação do cDNA expb11 de cana-de-açúcar. A: Reação de PCR com o cDNA obtido

(M: Marcador Molecular GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder. Poço 1: Fragmento de

cDNA expb11 proveniente do RNA total de colmo. B: Fragmento reamplificado a partir

A B M 1 M 1 2

M 1 2 3 4 5 6 7 8

5000 pb

1500 pb

500 pb

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do produtor de PCR obtido pela reação com transcriptase reversa. Poço 1: fragmento

genômico de expb11. Poço 2: fragmento de cDNA de expb11.

5.3 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pGEMT-EXPB11

Após a amplificação do cDNA correspondente a expb11, esse fragmento foi clonado

no vetor pGEM T Easy (Promega®), gerando a construção representada na Figura 15. Para

confirmar a clonagem, foi realizada a PCR de 11 colônias escolhidas com os oligonucleotídeos

específicos para o gene de expansina EXPB11F3 e EXPB11R4. Na Figura 27, pode ser

observado que das 11 colônias selecionadas, 10 possuíam o plasmídeo.

Figura 28. PCR de colônia com as células transformadas com o vetor pGEMT-expb11. Poço 1:

Marcador Molecular GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder. Poços 2 a 11: colônias obtidas

após a transformação de células de E.coli com vetor.

Dos dez clones analisados por PCR de colônia, três foram escolhidos para

realização da extração do DNA plasmidial. Esses plasmídeos foram digeridos com as enzimas

de restrição EcoRI e NotI para a liberação do fragmento expb11. As digestões para os três

transformantes deram resultados positivos, apresentando um fragmento maior (~3000pb)

correspondente ao vetor pGEM T Easy, e um fragmento menor (~700 pb) correspondente ao

cDNA expb11(Fig. 28).

5.4 CLONAGEM DO GENE EXPB11 EM P. pastoris

5.4.1 Construção do vetor de expressão pPIC9-expb11

A digestão do plasmídeo pGEMT-expb11 com as enzimas EcoRI e NotI permitiu a

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

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Figura 29. Análise dos transformantes da construção pGEMT-expb11por digestão com EcoRI e NotI.

A: Digestão do vetor pGEMT-expb11 dos transformantes positivos na PCR de colônia (M:

Marcador Molecular GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder. Poços 1,3 e 5: Digestão do

vetor pGEMT-expb11 com EcoRI e NotI. Poços 2,4,6: vetor pGEM-expb11

intacto).

liberação de expb11 contendo extremidade coesivas para a clonagem no vetor pPIC9. O vetor

pPIC9 também foi digerido com mesmas enzimas. A construção pPIC9-expb11, representada

na Figura 16, foi usada para transformar células de E. coli. Os clones foram analisados por PCR

de colônia com os oligonucleotídeos EXPB11F3 e EXPB11R4. Pode-se observar na Figura 29

a amplificação de um fragmento de aproximadamente 700 pb correspondente ao cDNA expb11,

indicando que das 10 colônias analisadas por PCR apenas 4 mostraram perfil positivo.

Figura 30. PCR de colônia para transformantes com vetor pPIC9-expb11. Poço 1: Marcador Molecular

GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder. Poços 2 a 11: colônias obtidas após transformação de

E. coli com vetor, em que apenas quatro transformantes apresentaram resultado positivo.

Dos quatros transformantes obtidos, apenas um foi escolhido para seguir com a

digestão para a transformação da levedura P. pastoris. Foi realizada a extração do DNA

M 1 2 3 4 5 6

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

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plasmidial do clone selecionado e sua completa digestão com a enzimas de restrição SalI e

BglII. É sabido que a enzima SalI apenas lineariza o vetor na região da ORF de HIS4, e esse

estratégia possibilita gerar transformantes com fenótipos Mut+ como representado pela Figura

17.A. Assim, o vetor ao ser digerido com SalI apresentou um tamanho esperado de

aproximadamente 8.7 Kb (8 Kb correspondente ao vetor pPIC9 e 700 pb de expb11), como

pode ser observado na Figura 30.

Figura 31. Construção dos cassetes de expressão: estratégias com intenção de gerar fenótipos Mut+ e

MutS. M: Marcador molecular GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder ; Poço 1: Plasmídeo

pPIC9-expb11 digerido com BglII; Poço 2: Plasmídeo pPIC9-expb11 digerido com SalI;

Poço 3: Plasmídeo pPIC9-expb11 intacto.

A segunda estratégia foi a digestão do pPIC9-expb11 com a enzima de restrição

BglII, representada na Figura 17.B, a qual cliva o vetor em dois locais, antes da região

promotora de 5’AOX1 e após a região 3’AOX1, liberando dois fragmentos: um com 6.3 Kb,

porção maior contendo a sequência do cassete a ser integrado no genoma da levedura, e outro

de aproximadamente 2.4 Kb, porção menor contendo as partes funcionais para a bactéria (Fig.

30). Essa estratégia possibilita a geração de transformante com fenótipo MutS.

O plasmídeo pPIC9-expb11 foi digerido nas duas estratégias, e o fragmento

correspondente ao cassete de expressão foi eluído do gel e introduzido nas células competentes

de P. pastoris nas linhagens GS115 e SMD1168 por eletroporação. As colônias crescidas em

meio seletivo e repicadas em placas de contagem (Fig 31). Foram recuperadas 40 colônias de

cada estratégia para a linhagem SMD1168 (SMD1168-Mut+ e SMD1168-Muts; Fig. 31B), 20

colônias para transformação de GS115- Mut+, 24 colônias para GS115- Muts (Fig. 31A).

M 1 2 3

5 Kb

1.5 Kb

500 pb

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Figura 32. Transformantes recuperados da transformação da levedura P. pastoris com o cassete de

expressão pPIC9-expb11. A: transformantes recuperados da estratégia GS115 Mut+

(superior) e Muts (inferior). B: transformantes da linhagem SMD1168 Mut+ (superior) e Muts

(inferior).

Para confirmação da integração do cassete de expressão no genoma dos

transformantes, foi realizada a extração do DNA genômico de 12 transformantes (3

transformantes de cada estratégia), e em sequência uma PCR usando o par de oligonucleotídeos

específicos para o gene expb11 EXPB11F3 e EXPB11R4 (Tabela 1). Na Figura 32 podemos

observar a amplificação de um fragmento de 700 pb correspondente ao cDNA/expb11 a partir

do DNA dos clones das quatro construções.

Figura 33. Amlificação por PCR do cDNA expb11 a partir do DNA total dos transformantes de P.

pastoris. M: Marcador molecular GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder ; Poços 1 a 3: GS115

MutS; Poço 4 a 6: Gs115 Mut+; Poços 7 a 9: SMD1168 MutS; Poços: 10 a 12: SMD1168

Mut+; Poço 13: Controle positivo - pPIC9-expb1.

5 Kb

1..5 Kb

500 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

A B

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5.5 SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DO GENE

5.5.1 Análise do gene expb11

Para a obtenção da sequência de cDNA e do gene de expb11, primeiramente, foi

feita a análise separada dos eletroferogramas correspondentes ao fragmento genômico e dos

eletroferogramas correspondentes ao cDNA. Foram gerados dois arquivos, cada um relativo à

sua amostra. Após obter os arquivos em formato fasta, todas as sequências codificadoras foram

lidas pela plataforma ClustalX com a intenção de fazer o alinhamento dessas sequências e

verificar se elas possuíam a mesma sequência. Para verificar se as sequências obtidas pelo

sequenciamento eram parecidas ou idênticas à sequência do Contig 11 gerada pelo SUCEST,

as três sequências foram alinhadas. A partir desse alinhamento (Anexo A) foi possível

identificar que as sequências dispunham os mesmos nucleotídeos, com poucas variações, o que

permitiu a identificação do peptídeo sinal, códon de iniciação (ATG), códon de terminação

(TAG) e também o reconhecimento dos íntrons.

O fragmento de expb11 genômico sequenciado deu origem a uma sequência de

1367 pb (Fig. 33A). Para verificar com qual gene já depositado em banco de dados expb11

possuía maior similaridade, a sequência de expb11 foi submetida à análise pela ferramenta

blastn. Foi verificado que a versão genômica de expb11 possui similaridade com o gene de

sorgo (número de acesso CM000760.1 no GenBank) com 95% de similaridade. Com o objetivo

de identificar a quantidade de íntrons, as sequências de expb11 (versão genômica e cDNA) e as

sequências de sorgo (versão genômica e cDNA) foram alinhadas no software SnapGene® (Fig.

33B). Como demonstrado na Figura 33, expb11 possui a mesma quantidade de íntrons que

sorgo, e que estes íntrons possuem o mesmo perfil.

5.5.2 Análise da sequência de cDNA de expb11

A sequência completa para o cDNA de expb11, de 776 pb, está representada na

Figura 34. Como foi dito na estratégia de clonagem no vetor pPIC9, a sequência de cDNA

expb11 foi clonada sem o seu peptídeo sinal. A razão pela qual a sequência foi clonada sem seu

próprio peptídeo sinal é que a estratégia de se usar o vetor de expressão pPIC9 permite a

utilização do peptídeo sinal do vetor, conhecido como fator α. Esse fator α é uma sequência da

levedura Saccharomyces cerevisiae, que ao ser fusionada ao gene de interesse e ambos

integrados no genoma de P. pastoris direcionará a proteína recombinante através da via de

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Figura 34. Análise da sequência de nucleotídeo do gene expb11. A: sequência de nucleotídeo

correspondente ao gene expb11, destacando-se em cinza as regiões identificadas como

íntrons, e em vermelho os códons de iniciação e terminação. B: Representação do

alinhamento entre as sequências de expb11 com as sequências da versão genômica

(Sbexpb) e cDNA de sorgo (Sbexpb). Nas regiões longas e claras observa-se as

regiões de íntron. Os pontos brancos nas sequências de sorgo indicam as bases

nitrogenadas que não se alinharam à sequência de cana-de-açúcar, ou seja, são as

variações de nucleotídeos que podem existir entre as duas espécies.

secreção para o meio extracelular (Ahmad et al., 2014).

Para determinar a região correspondente ao peptídeo sinal de expb11, a sequência

do gene expb11 foi alinhada com a sequência do cDNA expb11 na plataforma ClustalX. Com o

alinhamento, foi possível encontrar a sequência do peptídeo sinal (Fig. 34.A) e verificar a

sequência completa do cDNA (Fig. 34.B).

5.2.3 Análise in sílico da proteína EXPB11

Após a montagem da sequência de expb11 cDNA, a mesma foi traduzida em

sequências de aminoácidos, para confirmar se essa sequência poderia dar origem a uma proteína

A

expb11 cDNA

expb11 genômico

Sbexpb genômico

Sbexpb cDNA

B

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Figura 35. Análise da sequência de nucleotídeos do cDNA expb11 e determinação da região do peptídeo

sinal. A: Alinhamento das sequências versão genômica e cDNA na plataforma ClustalX mostrando

a sequência nucleotídica do peptídeo sinal de expb11. B: Sequência do cDNA, destacando-se

em cinza a região que ao ser traduzida corresponderá a sequência do peptídeo sinal de

EXPB11 e em vermelho os códons de iniciação e terminação da ORF.

funcional. Através da plataforma Translate Tools (Expasy), foi observado que a cDNA expb11

codifica uma proteína com 266 aminoácidos. Foi realizado na plataforma SignalP 4.1 a análise

para a determinação da sequência do peptídeo sinal. Foi observado que os 25 primeiros

aminoácidos correspondem à sequência do peptídeo sinal (Fig. 35), corroborando com dados

encontrados por Wu et al. (2001), que analisou α e β-expansinas de milho e verificou que o

comprimento médio do peptídeo sinal de expansinas é 24 aminoácidos.

Figura 36. Sequência de aminoácidos da proteína EXPB11 gerados pela plataforma Translate Tools

(Expasy). Parte destacada em cinza corresponde a sequência de aminoácidos do peptídeo

sinal de EXPB11, em vermelho o aminoácido metionina, que inicia o processo de tradução,

e asterisco representando o momento de parada da tradução.

Foi feito a análise para verificar qual seria o peso molecular e o ponto isoelétrico

A

B

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teórico que EXPB11 putativa poderia apresentar in vitro e/ou in vivo. Fazendo uso da plataforma

ProtParam (EXPASY), os parâmetros físicos e químicos foram computados para a sequência

de aminoácidos contento o peptídeo sinal, e para a sequência sem o peptídeo sinal. O peso

molecular estimado para a proteína EXPB11, sem seu peptídeo sinal foi de 26,4 kDa. O ponto

isoelétrico teórico para EXPB11 foi de 4,88.

β-expansinas são proteínas que apresentam características do grupo I de

alergênicos, e como discutido por Andersson e Lidhom (2003), muitas sequências de cDNAs

de diferentes espécies já foram traduzidas in sílico e alguns extratos de alergênicos de vegetais

foram isolados e caracterizados, e essas proteínas preditas e detectadas por Western Blot

apresentaram em média 240 aminoácidos, quando excluída a sequência referente ao peptídeo

sinal, com peso molecular por volta de 26 kDa (Tabela 1).

Para verificar similaridades com outras expansinas, a sequência de aminoácidos de

EXPB11 foi analisada pelo algoritmo blastP, que permitiu verificar que a sequência de EXPB11

possui 97% de similaridade com uma expansina hipotética de sorgo e 93% com expansinas de

milho (Tabela 4). Pela análise feita no blastP, foi possível detectar dois domínios putativos da

sequência de EXPB11, como mostra a Figura 36A, um domínio do módulo de ligação a celulose

(CBM) e um domínio correspondente ao grupo 1 de alergênicos.

Tabela 3. Dados de proteínas do tipo alergênicos vegetais clonados, isolados e/ou caracterizados

(Andersson & Lidhom, 2003 modificado). Espécie Nome

comum

Designação

do

alergênico

P.M. kDa

(calc.)

pI

(calc.)

Função ou

similaridade

Clonado Número de

acesso

Referência

1 Oryza

sativa

Arroz Ory s 1 26.3 8.58 Β-expansina Sim AAA86533 Xu et al.

(1995)

2 Cynodon

dactylon

Bermuda

grass

Cyn d 1 26.8 8.56 Β-expansina Sim O04701 Matthiesen et

al. (1991)

3 Carya

illioinensis

Noz pecã Car i 4 33 6.2 - Sim - Sharma et

al., (2011)

4 Zea mays Milho Zea m 1 28 9.04 Β-expansina Sim AY104999 Li et al.

(2003)

5 Hordem

Vulgare

Cevada Hor v 9 30.1 9.11 - Sim AAB41585 Astwood &

Hill (1996)

6 Lolium

perene

Gazão Lol p 1 26.1 5.40 Β-expansina Sim P14946 Cottam et al.

(1986)

7 Triticum

aestivum

Trigo Tri a Bd

27k

22.8 6.40 - Não - Kimoto et al.

(2009)

8 Anacardium

occidentale

noz Ana o 3 12.5 - - Sim - Robotham et

al. (2004)

9 Phaseolus

mungo

Vigna

mungo

28 - - Não - Kumari et al.

(2012)

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Tabela 4. Expansinas com alta identidade com expb11

Espécie Total Score Query Cover E value Ident. Nº Acesso

Sorghum bicolor 539 100% 0.0 97% XP_002464945.1

Zea mays 515 99% 0.0 93% DAA46272.1

Zea mays 514 99% 0.0 93% NP_001105643.1

Setaria italica 509 98% 0.0 93% XP_004983688.1

Para confirmar a detecção feita pelo blastP, foi realizada a análise pela plataforma

ProDom (EXPASY), que permitiu comparar a sequência de EXPB11 com as sequências de

outras expansinas já depositadas no banco de dados. O resultado gerado confirmou a existência

dos dois domínios, sendo um reconhecido como domínio CBM de expansina (característico da

família do grupo 1 de alergênicos) e o segundo correspondente ao domínio de endoglucanase

da família 45, similar ao domínio de uma β-expansina de milho (ZmEXPB10) e de uma de arroz

(OsEXPB11). Segundo a análise gerada pelo ProDom, o domínio relativo a GH45 tem início

no aminoácido 39 e finaliza no aminoácido 166, contendo 127 aminoácidos. O segundo

domínio, relativo ao CBM, tem início no aminoácido 168 finalizando no aminoácido 261, com

93 aminoácidos (Fig. 36B).

Outra característica analisada para a sequência de EXPB11 é a presença de sítios de

N ou O glicosilação, pois esta classe de proteínas, o grupo 1 de alergênicos, em diversos

trabalhos têm sido citadas como proteínas glicosiladas, principalmente na região N-terminal

do polipeptídeo (Andersson e Lidhom, 2003). Alergênicos são geralmente proteínas exógenas

(antígenos) que quando detectadas pelo organismo hospedeiro ativa uma resposta imune,

culminando na produção de anticorpos como as imunoglobulinas E (IgE). Isso acontece, porque

anticorpos produzidos pela resposta imune possuem receptores para essas glicoproteínas (Al-

Ghouleh et al., 2012). As β-expansinas da década de 1990 foram identificadas como proteínas

pertencentes a esse grupo de alergênicos e encontradas em extrato de pólen sugerindo que essas

proteínas auxiliam na formação do tubo polínico, facilitando a penetração do grão de polén pelo

estigma da flor levando ao sucesso reprodutivo (Valdivia et al., 2007).

Para analisar a presença de sítios de N e O glicosilação, a sequência de EXPB11 foi

submetida à análise na plataforma NetNGlyc 1.0 SEVER e NetOGlyc 4.0 SERVER (Center for

Biological Sequence Analysis). Em eucariotos, a sequência para os sítios de N-glicosilação é

definida pela sequência consenso N-X-S/T, sendo que X pode ser qualquer aminoácido com

exceção da prolina (Strasser, 2016). Foi verificado que existem dois sítios de N-glicosilação na

sequência de EXPB11, sendo o primeiro composto pelo conjunto de resíduos de aminoácidos

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Figura 37. Análise dos domínios de EXPB11 pelo blastP e ProDom. A: Domínios conservados

detectados pela plataforma blastP. B: Esquema representando quais são os domínios que

constituem EXPB11. Em cinza a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal. Em vermelho

destaca-se a sequência de aminoácidos relativos ao domínio da família GH45 e em verde a

sequência de aminoácidos para o domínio de CDB.

NAS (asparagina, alanina e serina) com potencial de 64% de ser N-glicosilada, na região

anterior ao domínio de GH45, e o segundo sítio composto por NES (asparagina, ácido glutâmico

e serina) com potencial de 41% de glicosilação, presente na região do domínio de CBM (Fig.

37).

Figura 38. Representação dos sítios de N-glicolisação nas sequência de aminoácidos de EXPB11. Os

dois sítios de N-glicosilação: o primeiro (NAS) com potencial de 64% para ser glicosilado e

o segundo (NES) com potencial de 41%, no domínio correspondente a CBM

Para a análise de O-glicosilação, foi verificado (dado não mostrado) que existe um

provável sítio no resíduo de aminoácido T (Treonina). Segundo estudos realizados até o

momento sobre O-glicosilação em proteínas de plantas, proteínas de parede celular vegetal O-

glicosiladas são pertencentes a uma superfamília de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina

(Nguema-Ona et al., 2015; Strasser, 2016; Taylor et al., 2012).

A

B

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Um modelo tridimensional da estrutura para EXPB11 foi construído usando a

ferramenta SwissModel (EXPASY: https://swissmodel.expasy.org/) que cria o modelo baseado

em similaridades com outras proteínas já depositadas no Protein Data Bank (PDB). A

visualização e edição do modelo foi realizada na plataforma UCSF Chimera (Pettersen et al.,

2004). Com a predição da estrutura tridimensional de EXPB11, foi realizada utilizando-se como

proteína modelo uma β-expansina de milho (Zea mays), contendo 60,44 % de similaridade

(Yennawar et al., 2006). Com esse modelo foi possível verificar os domínios de EXPB11: o

CBM, parte superior da Figura 38, e o domínio GH45, parte inferior.

5.6 ANÁLISE DA PRODUÇÃO EM FRASCO DE EXPB11 RECOMBINANTE

A levedura metilotrófica P. pastoril tem se tornado um sistema substancial para

biotecnologia, especialmente para produção de proteínas heterólogas. Existem diversos

trabalhos já descritos para expressão heteróloga de genes de plantas em P. pastoris, como as

invertases, que são enzimas capazes de hidrolisar a sacarose em frutose e glicose (XU et al.,

2015; ZHANG et al., 2014), inibidores de protease (Fischer et al., 2015) e peroxidase (Näätsaari

et al., 2014).

Figura 39. Modelo tridimensional para EXPB11. Domínio GH45 (parte superior) corresponde ao

domínio da família GH45, porém sem o sítio ativo para essa classe de enzima. Domínio

CDB (parte inferior) e o asterisco vermelho representando a região do sítio de glicosilação

NES.

*

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Diversos trabalhos com invertases foram realizados a partir do isolamento do gene

por extração de RNA total, síntese de cDNA e clonagem nos vetores de clonagem e expressão

sem a necessidade de otimização de códons, e obtiveram bons resultados na avaliação da

enzima recombinante(Fischer et al., 2015; Huang et al., 2003; Xu et al., 2015; Zhang et al.,

2014). Devido a esse fator, o gene foi clonado sem a otimização do codon usage para P. pastoris.

Para a avaliação dos transformantes, foram escolhidos 4 clones de cada estratégia para

a linhagem GS115 (GS115: BglII e GS115: SalI) e seus respectivos controles negativos

(levedura transformada com o vetor pPIC9 vazio). Como pode ser observado na Figura 39, foi

analisada a cinética de produção da proteína recombinante pelos transformantes nos tempos de

24 h até 96 h. É possível observar que existe diferença no perfil de proteínas secretadas pelos

transformantes de EXPB11r em relação ao perfil de proteínas secretadas pelo seu controle

negativo, entretanto não foi possível visualizar uma banda com massa molecular

correspondente a EXPB11.

Figura 40. Análise do perfil de proteínas secretadas pelos transformantes EXPB11r da linhagem GS115

sob indução do promotor AOX por metanol 1% M: Marcador de Massa Molecular, Unstained

Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) A, B e C: Transformante GS115: BglII. D, E

e F: transformantes GS115: SalI. A: perfil proteico do transformante 1 (poços 1 a 4) e do

controle negativo (poços 5 a 8) de 24 h às 96 h de indução dos promotores AOX. B: perfil

proteico dos transformante 2 (poços 1 a 4) e transformante 3 (poços 5 a 8) de 24 h a 96 h. C:

perfil proteico do transformante 4. D: perfil de proteínas do transformante 1 (poços 1 a 4) e

do controle negativo (poços 5 a 8) de 24 h às 96 h de indução dos promotores AOX. E: perfil

de proteínas do transformante 2 (poços 1 a 4), transformante 3 (poços 6 a 9) de 24 h às 96 h

e controle negativo (poço 5). F: perfil de proteínas do transformante 4 24 h às 96 h (poços 1

a 4) e controle negativo 96 h (poço 5).

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5.7 ANÁLISE DA ATIVIDADE FUNCIONAL DE EXPB11R POR ENSAIO DE

SWELLING E FPASE.

Para verificar se algum transformante foi capaz de produzir a proteína

recombinante, foi realizado um teste de atividade funcional de expansina para os transformantes

GS115-Muts. Após o período de incubação dos discos de papel de filtro com o sobrenadante de

cultura, não foi se observar uma diferença visual entre os testes e os controles negativos.

Nenhum disco mostrou fibras expandidas (Fig. 40 A), como foi observado no trabalho de Liu

et al. (2014; Fig. 40 B). Esses autores analisaram a atividade funcional de expansina

recombinantes de tomate em ensaios de papel de filtro em pH 4,8 e não pH 7,0 como foi feito

para EXPB11r. Porém diversos trabalhos realizados com expansinas bacterianas mostraram que

a eficiência do domínio de ligação a celulose ocorre na faixa de pH 7, como foi mostrado por

Georgelis et al. (2012), Tovar-Herrera et al. (2015) e Lee et al. (2013) que fizeram o ensaio de

ligação do domínio de ligação a celulose (CBM) com os pH 7,5, 7,4 e 7,0 respectivamente.

Figura 41. Papel de filtro incubado com a expansina recombinante. Papel de filtro incubando com

sobrenadante de 96h dos transformantes 1, 2, 3 e 4 (G1B, G2B, G3B e G4B) e transformante

controle negativo (C-GB) de P. pastoris transformada com cDNA expb11.

O ensaio de swelling sob papel de filtro também não apresentou um resultado que

evidenciasse uma ação de expansão do papel de filtro para que assim fosse facilitada a ação das

celulases sob a fibra de celulose. O que foi possível observar é que a incubação do papel de

filtro por 96 h diminuiu a liberação de açúcar redutor, como pode ser notado na Figura 41, em

que a atividade de celulases sob papel de filtro não incubado previamente pode liberar até 5

vezes mais açúcares redutores que os ensaios que tiveram o papel de filtro previamente

incubado com o sobrenadante de cultura, com BSA e somente tampão. Porém podemos

G1B G2B G3B G4B C-GB C- BSA C- TP

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Figura 42. Ensaio de celulase total sob papel de filtro para os transformantes GS115-BglII. G1B, G2B,

G3B e G4B: transformantes 1, 2 3 e 4 obtidos pela estratégia de transformação GS115-BglII.

C-GB: GS115 transformada com vetor pPIC9 sem inserto. C-BSA: controle negativo com

solução de BSA (1µg/µL). C-Tp: controle negativo só com tampão de reação. C+ reação:

reação de celulase total sem incubação prévia de papel de filtro por 1h.

perceber que as amostras C-BSA e C-TP liberaram mais açúcares redutores que as amostras dos

transformantes (Clones 1 ‘G1B’, 2 ‘G2B’, 3 ‘G3B’ e 4 ‘G4B’) e o controle negativo de

transformação (C-GB). A causa desse resultado pode estar relacionada ao fato de que no

sobrenadante de cultura dos transformantes existem diversas proteínas sendo secretadas pela

levedura, e com o tempo de incubação por 96 h, algumas dessas proteínas podem ter se ligado

ao papel de filtro, dificultando a ação das celulases no momento da reação enzimática.

Em teste de sinergismo de expansinas recombinantes com celulases comerciais

feitos por Liu et al. (2014), Kim et al. (2009) e Wang et al. (2015) foi percebido que quando a

concentração de expansina estava em níveis saturados, verificava-se um resultado negativo de

sinergismo, ou seja, a liberação de açúcares redutores totais após a hidrólise enzimática de

celulase era bem menor do que nas reações de hidrólise com baixa concentração de expansina.

Esse resultado negativo comumente ocorria devido à competição pelos sítios de ligação das

expansinas e das celulases ao substrato.

5.8 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE expb11 EM Pichia pastoris

Por não ter detectado atividade funcional nos testes de Swelling e sinergismo com

celulases, foi proposto um experimento para análise da expressão de RNA expb11 pela levedura

no momento de indução. O vetor de expressão em P. pastoris realizado neste trabalho prevê que

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

G1B G2B G3B G4B C-GB C-BSA C-TP C+reação

Co

nce

ntr

ação

de

açú

care

s re

du

tore

s to

tais

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a expressão do gene expb11 é controlada pelo promotor do gene AOX1, um promotor forte que

é induzido na presença de metanol no meio de cultura. Como já observado em diversos

trabalhos, muitas proteínas recombinantes com aplicações biotecnológicas foram produzidas

por esse processo de indução como por exemplo endoxilanases (Carvalho, 2008; Yin et al.,

2013; Zhao et al., 2015) e celulases (Akbarzadeh et al., 2014; Jiménez et al., 2014; Oliveira,

2007), invertases (Huang et al., 2003; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2014) e mesmo as

expansinas (Liu et al., 2014; Wang et al., 2014; Tovar-Herreira et al., 2015).

Para a extração do RNA total de Pichia pastoris, o transformante 1 da estratégia

GS115-Muts (G1B) foi escolhido para as análises de expressão. Os perfis eletroforético das

amostras de RNA total obtidas em diferentes tempos de incubação são apresentadas na Figura

42.

Figura 43. Análise dos RNAs extraídos dos pontos de 0 h a 24 h do transformante Gs115-BglII e

controle negativo em gel de agarose 1%. A: Perfil dos RNAs extraídos do transformante 1

em duplicata 0 h (1 e 2), 14 h (3 e 4), 24 h (5 e 6), 48 h (7 e 8), 72 h (9 e 10) e 96 h (11 e 12).

B: Perfil dos RNAs extraídos do controle negativo em duplicata 0 h (1 e 2), 14 h (3 e 4), 24

h (5 e 6), 48 h (7 e 8), 72 h (9 e 10) e 96 h (11 e 12).

Nas reações de PCR foi observado que um par de oligonucleotídeos específicos

para expb11 (EXPB11-2F e EXPB11-2R) apresentou inespecificidade, pois pode-se verificar

que esse par anelou em algum gene do cDNA do controle negativo (P. pastoris transformada

com pPIC9 sem inserto), como indica a seta branca na Figura 43. Não foram obtidos produtos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

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de PCR visualizáveis com o par de oligonucleotídeos EXPB11-1F/EXPB11-1R nas amostras

de cDNA do transformante e do controle negativo, embora o fragmento tenha sido amplificado

no controle positivo (plasmídeo pPIC9-expb11). A PCR realizada com o par de

oligonucleotídeos desenhados para amplificação do produto do gene gapbh amplificou o

fragmento do tamanho esperado em todas as amostras, como indicado pelas setas vermelhas na

Figura 43. Não foi possível detectar amplicons com os oligonucleotídeos utilizados referentes

ao cDNA do gene expb11, o que sugere que o clone selecionado não expressou o gene de

interesse.

Figura 44. Análise dos eletroforética em gel de agarose 1% da PCR com oligonucleotídeos específicos

de expansinas e oligonucleotídeos para o gene gapdh. A: PCR usando cDNAs do controle

negativo como molde. cDNA total 0 h (1 a 3), cDNA total 14 h (4 a 6), cDNA total 24 h (7 a

9), controle positivo (plasmídeo pPIC9-expb11) (10 a 12). Ordem dos oligonucleotídeos:

EXPB11-1F/EXPB11-1R (seta laranja), EXPB11-2F/EXPB11-2R (seta branca), GAPDH-

F/GAPBH-R (seta vermelha).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B

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Com os resultados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que:

I. A sequência completa do gene expb11 de cana-de-açúcar, em suas versões genômica e

de cDNA, foi obtida. Com base na sequência obtida, foram preditos dois domínios, um

similar ao da família GH45, e outro similar ao módulo de ligação ao carboidrato (CBM).

As análises in silico sugerem que a proteína EXPB11 possui peso molecular predito de

26,4 kDa, pI igual a 4,88 e contém dois sítios de glicosilação.

II. Não foi possível se detectar a expressão do gene expb11 na levedura P. pastoris. Estudos

posteriores utilizando modificações no codon usage devem esclarecer os motivos deste

achado.

6 CONCLUSÃO

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Anexo A. Alinhamento do gene e cDNA expb11 e Contig 11 na plataforma

ClustalX ............................................................... 93

ANEXO

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93

Anexo A. Alinhamento do gene e cDNA expb11 e Contig 11 na plataforma

ClustalX

10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ATGGCCACCTTCTCCTCCACGGTAGTTGCACTTGGTGCGCTCATCTTCTTCCTCCTTGCA

Contig_c11_gen_codante ----CCACCTTCTCCTCCACGGTAGTTGCACTTGGTGCGCTCATCTTCTTCCTCCTTGCA

Clustal Consensus

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------TGTGAATTCGCTAGACCGGTGAGCTTTAACGCTTCCGACTTCACCGCCGATCCC

C11_SUCEST_sorgo ACGTGTAGCTCATGCGCTAGACCGGTGAGCTTTAACGCTTCCGACTTCACCGCCGATCCC

Contig_c11_gen_codante ACGTGTAGCTCATGCGCTAGACCGGTGAGCTTTAACGCTTCCGACTTCACCGCCGATCCC

Clustal Consensus * ** **********************************************

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GACTGGGAGGCTGCCAGGGCCACCTGGTACGGTGCGCCCACCGGCGCCGGCCCTGATGAC

C11_SUCEST_sorgo GACTGGGAGGCTGCCAGGGCCACCTGGTACGGTGCGCCCACCGGCGCCGGCCCTGATGAC

Contig_c11_gen_codante GACTGGGAGGCTGCCAGGGCCACCTGGTACGGTGCGCCCACCGGCGCCGGCCCTGATGAC

Clustal Consensus ************************************************************

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GACGGT------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo GACGGT------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante GACGGTACGTCGTATACATGAACGCCGGTGCATGCATGGTCTCATCTCATTGTGCATGCA

Clustal Consensus ******

250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ------------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante GATGCAGCGCACAGCGTTGTTTTGAACCGAGTCTCTGAACTACAGTGCGCCGCCGTGCGC

Clustal Consensus

310 320 330 340 350 360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ---------------------------GGCGCCTGTGGATTCAAGAACGTGAACCTGCCG

C11_SUCEST_sorgo ---------------------------GGCGCCTGTGGATTCAAGAACGTGAACCTGCCG

Contig_c11_gen_codante CATCAATTGTTTGTTTTGCATGCAGGTGGCGCCTGTGGATTCAAGAACGTGAACCTGCCG

Clustal Consensus *********************************

370 380 390 400 410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante CCGTTCTCGGCAATGACATCGTGCGGCAACGAGCCCCTGTTCAAGGACGGCAAGGGCTGC

C11_SUCEST_sorgo CCGTTCTCGGCAATGACATCGTGCGGCAACGAGCCCCTGTTCAAGGACGGCAAGGGCTGC

Contig_c11_gen_codante CCGTTCTTGGCAATGACATTGGGCGGCAACGAGCCCCTGTTCAAGGACGGCAAGGGCTGC

Clustal Consensus ******* *********** * **************************************

430 440 450 460 470 480

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GGCTCCTGCTACCAG---------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo GGCTCCTGCTACCAG---------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante GGCTCCTGCTACCAGGTTGGTCAGACGAAGATCCTTGGTGCCTGCCTTTGATGGAGACGG

Clustal Consensus ***************

490 500 510 520 530 540

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante -----------------------------------------------------------A

C11_SUCEST_sorgo -----------------------------------------------------------A

Contig_c11_gen_codante AAAGCTGGAGCATAGTTTTGACTTTTGAGTAACCAACTCCGTTTTACTTTCTTTTCCAGA

Clustal Consensus *

550 560 570 580 590 600

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94

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante TACGATGCACAAACAACGATGCCTGCTCGGGCAACCCAGAGACGGTGATCATCACTGACA

C11_SUCEST_sorgo TACGATGCACAAACAACGATGCCTGCTCGGGCAACCCAGAGACGGTGATCATCACTGACA

Contig_c11_gen_codante TACGATGCACAAACAACGATGCCTGCTCGGGCAACCCAAAGACGGTGATCATCACTGACA

Clustal Consensus ************************************** *********************

610 620 630 640 650 660

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante TGAACTACTACCCGGTGGCCAAGTACCACTTCGACCTCAGCGGCACGGCGTTCGGCGCCA

C11_SUCEST_sorgo TGAACTACTACCCGGTGGCCAAGTACCACTTCGACCTCAGCGGCACGGCGTTCGGCGCCA

Contig_c11_gen_codante TGAACTACTACCCGGTGGCCAAGTACCACTTCTACCTCAGCGGCACGGCGTTCGGCGCCA

Clustal Consensus ******************************** ***************************

670 680 690 700 710 720

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante TGGCCAAGCCCGGCCGCAGCGACGAGCTCCGCCGCGCCGGCATCATCGACATCCAGTTCA

C11_SUCEST_sorgo TGGCCAAGCCCGGCCGCAGCGACGAGCTCCGCCGCGCCGGCATCATCGACATCCAGTTCA

Contig_c11_gen_codante TGGCCAAGCCCGGCCGCAGCGACGAGCTCCGCCGCGCCGGCATCATCGACATCCAGTTCA

Clustal Consensus ************************************************************

730 740 750 760 770 780

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante AGAGG-------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo AGAGG-------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante AGAGGTGGGTAACACGCACCCCTCCTTGCACAGAAACACCACGCACAGACGACCGGCTGA

Clustal Consensus *****

790 800 810 820 830 840

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ------------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante TCATCAGCCCCTGGACCTACGCCAACAGAATCATATCTCGAGACCGTCTAGCTACTCTAT

Clustal Consensus

850 860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ------------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante TTGCCGTGGAGCCCTTGTACTTTTGCTCAACCAACTCTAACGAGAACGACCGGTTTAACT

Clustal Consensus

910 920 930 940 950 960

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ------------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante CGGCCCCAGGCATGCAGATTCAATTCGCACATCCGCTTTACAATTTGGCGTTTGCGTGGG

Clustal Consensus

970 980 990 1000 1010 1020

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ------------------------------------------------------------

C11_SUCEST_sorgo ------------------------------------------------------------

Contig_c11_gen_codante TGTCTGCCTGTGGACAATGCAGTGTTATGAAGCTCTTGCCTAATCCAAGCATATCACATG

Clustal Consensus

1030 1040 1050 1060 1070 1080

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante ---------------------GTGCCCTGCAACTACCCCGGGCAGAAGGTGACTTTCCAC

C11_SUCEST_sorgo ---------------------GTGCCCTGCAACTACCCCGGGCAGAAGGTGACTTTCCAC

Contig_c11_gen_codante GCTTGTTCATTCCTGTATAGGGTGCCCTGCAACTACCCCGGGCAGAAGGTGACTTTCCAC

Clustal Consensus ***************************************

1090 1100 1110 1120 1130 1140

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GTGGAGGAGGGCTCCAACCCCGTCTACTTCGCGGTGCTCGTCGAGTTCGAAGACGGCGAC

C11_SUCEST_sorgo GTGGAGGAGGGCTCCAACCCCGTCTACTTCGCGGTGCTCGTCGAGTTCGAAGACGGCGAC

Contig_c11_gen_codante GTGGAGGAGGGCTCCAACCCCGTCTACTTCGCGGTGCTCGTCGAGTTCGAAGACGGCGAC

Clustal Consensus ************************************************************

1150 1160 1170 1180 1190 1200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GGCGACGCGGTGCAGGTGGACCTCATGGAGGCCAACTCCGGGTCGTGGACGCCGATGCGC

C11_SUCEST_sorgo GGCGACGCGGTGCAGGTGGACCTCATGGAGGCCAACTCCGGGTCGTGGACGCCGATGCGC

Contig_c11_gen_codante GGCGACGCGGTGCAGGTGGACCTCATGGAGGCCAACTCCGGGTCGTGGACGCCGATGCGC

Clustal Consensus ************************************************************

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95

1210 1220 1230 1240 1250 1260

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante GAGTCCTGGGGATCCATCTGGAGGCTCGACTCCGGCCACCGCCTCACCGCGCCGTTCTCC

C11_SUCEST_sorgo GAGTCCTGGGGATCCATCTGGAGGCTGGACTCCGGCCACCGCCTCACCGCGCCGTTCTCC

Contig_c11_gen_codante GAGTCCTGGGGATCCATCTGGAGGGTGGACTCCGGCCACCGCCTCACCGCGCCGTTCTCC

Clustal Consensus ************************ * *********************************

1270 1280 1290 1300 1310 1320

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Contig_C11_cdna_codante CTGCGCATCACCAACGAGTCCGGCAAGACGCTGGTGGCTAACCAAGTCATCCCGGCCAAC

C11_SUCEST_sorgo CTTCGCATCACCAACGAGTCCGGGAAGACGCTGGTGGCGAACCAAGTCATCCCGGCCAAC

Contig_c11_gen_codante CTTCGCAGGACCAACGAGTCCGGCAAGACGCTGGTGGCGAACCAAGTC-TCCCGGCCAAC

Clustal Consensus ** **** ************** ************** ********* ***********

1330 1340 1350 1360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

Contig_C11_cdna_codante T-GGGTGCCCAACACCTACTACCGTTCCATCGTCCAGTATTAGGCGG

C11_SUCEST_sorgo T-GGGTGCCCAACACCTACTACCGTTCCATCGTCCAGTATTAG----

Contig_c11_gen_codante TCGGGTGCCC-------------------------------------

Clustal Consensus * ********