4/14/2016

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ & ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ: ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Άσκηση 2:

«Προσδιορισμός θέσεων πρωτεϊνικής σύνδεσης »

ΛΑΜΠΡΙΝΗ ΛΑΠΡΙΤΣΙΟΥ Α.Μ. 1006622 (Παλαιός ΑΜ: 322640) ΟΜΑΔΑ Α3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Στην παρούσα εργαστηριακή άσκηση πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των θέσεων πρωτεϊνικής σύνδεσης με τη χρήση της in vitro τεχνικής της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης (HPLC). Μας δόθηκαν οι πειραματικές μετρήσεις από το εργαστήριο ώστε να υπολογιστούν οι κινητικές παράμετροι: σταθερά συνάφειας Ka και αριθμός θέσεων σύνδεσης n. Ως δραστική ουσία χρησιμοποιήθηκε η καρβεντιλόλη, ενώ ως πρωτεΐνη η ανθρώπινη αλβουμίνη.

Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επεξεργασία των πειραματικών μετρήσεων είναι ka = 82192 και n = 0.92. Επομένως, το συμπέρασμα που προκύπτει είναι ότι υπάρχει πιθανά μόνο μία θέση σύνδεσης στην αλβουμίνη για τη καρβεντιλόλη.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η κινητική της σύνδεσης φαρμάκου-πρωτεΐνης για μία πρωτεΐνη για μία θέση σύνδεσης μπορεί να περιγραφεί από το νόμο κίνησης των μαζών δηλαδή :

[P] + [D] ↔ [PD]

Όπου[P], είναι η πρωτεΐνη, [D] το φάρμακο και [PD] το σύμπλοκο φαρμάκου –πρωτεΐνης.

Από την παραπάνω σχέση, προκύπτει μία σταθερά Κα που ονομάζεται σταθερά συνάφειας και ισούται με

Κα=[PD ]

[P ]∗[ D ] . (1)

Για τη μελέτη της σύνδεσης του φαρμάκου με τις πρωτεΐνες χρησιμοποιείται ο λόγος r όπου

r=αριθμός μορίων συνδεδεμένουφαρμάκουαριθμός μορίων πρωτεϊνης άρα r=

[PD ][ PD ]+[ P] . (2)

Αν λύσουμε τη σχέση (1) ως προς το [PD] και το αντικαταστήσουμε στη σχέση (2), τότε η (2) γίνεται ως εξής :

r= Kα [ P ] [D ](Kα [ P ] [D ])+[P]

↔ r= Kα [D ]Kα [ D ]+1 (3) .

H σχέση (3) περιγράφει την απλούστερη περίπτωση, όπου ένα μόριο φαρμάκου συνδέεται με ένα μόριο πρωτεΐνης, με μία θέση σύνδεσης για κάθε μόριο. Στην περίπτωση που υπάρχουν n όμοιες και ανεξάρτητες θέσεις σύνδεσης για κάθε μόριο πρωτεΐνης, τότε χρησιμοποιούμε την παρακάτω σχέση :

r= nKα [D ]Kα [ D ]+1 (4).

Οι σταθερές συνάφειας και οι θέσεις σύνδεσης μπορούν να υπολογισθούν ,όταν η συγκέντρωση της πρωτεΐνης είναι γνωστή ,με τους δύο παρακάτω τρόπους :

Εξίσωση διπλής αναστροφής : Προκύπτει με αναστροφή της σχέσης (4) οπότε και προκύπτει

1r=1+Kα [D ]nKα [D ]

↔ 1r = 1nKα [D ]

+ 1n

Όπου το γράφημα του 1/r ως προς το 1/[D] που καλείται διπλό γράφημα αναστροφής, δίνει ευθεία γραμμή με κλίση ίση με 1/nKa και τεταγμένη ίση με 1/n.

Εξίσωση Scatchard: Προκύπτει με αναδιάταξη της ίδιας σχέσης κι έχει τη μορφή :

r[ D ]

=nΚα−rK α

Όπου το γράφημα r/[D] ως προς το r δίνει ευθεία γραμμή με

κλίση ίση με -Ka και τεταγμένη ίση με nKa. Από ορισμένα δεδομένα σύνδεσης φαρμάκου και πρωτεΐνης, είναι πιθανό στο γράφημα Scatchard να προκύψει καμπύλη γραμμή. Η καμπύλη αυτή μπορεί να θεωρηθεί το άθροισμα δύο ευθειών οι οποίες συγκεντρωτικά σχηματίζουν την καμπύλη.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Υλικά και συσκευές: Υγρός Χρωματογράφος Υψηλής Πίεσης (HPLC)

Δραστική ουσία: καρβεντιλόλη

Πρωτεΐνες : Ανθρώπινη αλβουμίνη

Πειραματική πορεία

Πραγματοποιήθηκε μία in vitro μελέτη πρωτεϊνικής σύνδεσης από τους υπεύθυνους του εργαστηρίου, όπου χρησιμοποιήθηκε ολική συγκέντρωση ανθρώπινης αλβουμίνης P alb=10-4 M και η δραστική ουσία καρβεντιλόλη και προέκυψαν τα παρακάτω δεδομένα:

Df(104M): 0.3 0.6 0.7 1.28

Db(104M): 2 3 3.3 5.9

Πίνακας 1: Όπου Df και Db η συγκέντρωση του ελεύθερου και δεσμευμένου φαρμάκου, αντίστοιχα.

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ -ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Εξίσωση Scatchard

Προκειμένου να κατασκευαστεί η γραφική παράσταση της εξίσωσης Scatchard είναι απαραίτητος ο υπολογισμός των μεγεθών r, r/[D].Τα απαιτούμενα μεγέθη υπολογίζονται ως εξής :

r1 = [PD¿¿b1][PDb1 ]+[P]

¿ =Db1

Db1+Palb = 2∗10−4

2∗10−4+10−4= 23= 0.667

r 1Df 1

= 0.6670.3∗10−4= 2.22*104

Ομοίως, πραγματοποιήθηκαν υπολογισμοί για τις υπόλοιπες τιμές, οι οποίες και παρουσιάζονται στο παρακάτω πίνακα.

Πίνακας 2: Παρατίθενται οι τιμές των μεγεθών r/Df και r.

r1 0.667 r1/Df1 22222

r2 0.750 r2/Df2 12500

r3 0.767 r3/Df3 10963

r4 0.855 r4/Df4 6680

Αφού υπολογίσθηκαν οι τιμές r/Df και r, κατασκευάζεται η γραφική παράσταση της μεταβολής του όρου r/Df έναντι του όρου r.

0.650 0.700 0.750 0.800 0.850 0.9000

5000

10000

15000

20000

25000

f(x) = − 82191.9740803302 x + 75540.5540560973R² = 0.93510485597755

r

r/Df

Γράφημα 1: Γραφική παράσταση της μεταβολής του όρου r/Df έναντι του όρου r.

Σύμφωνα, λοιπόν, με τη σχέση Scatchart :

r/([D])= nKa-rKa.

Συγκρίνοντας με την εξίσωσή μας τα δεδομένα, θα ισχύει ότι:

n*ka= 75541, Kα=82192 άρα n = 0.92

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Το συμπέρασμα που βγάζουμε, λοιπόν, είναι ότι υπάρχει πιθανά μόνο μία θέση σύνδεσης στην αλβουμίνη για τη καρβεντιλόλη καθώς n=0,92.