ALIMENTATION

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ENVIRONNEMENT

Activité antivirale des protéines de lactosérum estérifiées.

Jean-Marc Chobert et Thomas Haertlé

INRA BIA-FIPL, Nantes, France

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ENVIRONNEMENT

Le laitde vache

Lait écrémé

Caséines Lactosérum

pH=4,6centrifugation

caséine αs1

caséine βcaséine κcaséine αs2

β-lactoglobulineα-lactalbumine

…

Protéines

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La β-lactoglobuline, protéine majeure du lactosérum, est une protéine globulaire, résistante à la protéolyse par la pepsine

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Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline

Masse du monomère : 18,4 kDa, 8 feuillets, β tonneau, 1 hélice α, 5 cystéines – 2 ponts SS, fixation de molécules hydrophobes, dimérique au pH du lait (6,8)

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Dans leurs structures primaires, les protéines du lait renferment de nombreux peptides actifs, libérés par protéolyse

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Quelques exemples de peptides bio-actifs issus des protéines laitières.

Peptides Protéines de départ Type de bio-activité

Casomorphines caséines α et β Agoniste opioïde

α-lactorphine α-lactalbumine Agoniste opioïde

β-lactorphine β-lactoglobuline Agoniste opioïde

Lactoferroxines Lactoferrine Antagoniste opioïde

Casoxines caséine κ Antagoniste opioïde

Casokinines caséines αs1 et β Anti-hypertension

Casoplatelines caséine κ Anti-hypertension

Caséinomacropeptide caséine κ Anti-thrombique

Immunopeptides caséines α et β Immunostimulant

Lactoferricine Lactoferrine Transport de minéraux

Phosphopeptides caséines α et β Transport de minéraux

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Trouver des moyens de rendre la BLG hydrolysable par la pepsine afin de produire des peptides présentant une activité biologique

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Réaction d’estérification

R-COOH + EtOH / MetOH RCOOEt/Met

HCl

Protéines amphiphiles

Protéines « basifiées »

Interactions avec des charges négatives

Interactions avec des acides nucléiques

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De simples modifications des protéines laitières α-lactalbumine et/ou β-lactoglobuline génèrent à peu de frais des protéines

chargées positivement.

+ CH3OH ou CH3CH20HRouge - Charges négativesBleu - Charges positives

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Isoélectrofocalisation3.503.75

4.55

5.20

5.85

6.55

6.85

7.358.158.458.65

9.30

1 2 3 4 5 6 7 8

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ENVIRONNEMENT

Hydrolyse pepsique de la BLG en milieu hydro-éthanolique

0%

20%

25%

30%

35%

40%

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ENVIRONNEMENT

Diversified and amplified peptide libraries produced by combination of chemical modifications and proteolysis.

"Procédé d'obtention de populations peptidiques nouvelles. Produits obtenus." Jean-Marc Chobert, Loïc Briand et Thomas Haertlé, French Patent N° 93 15764. P.C.T.World extension N° 94 01500.

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Influence de la concentration en 100% Met-BLG

(1: 180 µM; 2: 240 µM)

dans le milieu d’incubation sur son activitéantivirale envers le phage bIL67 (105 pfu/mL), par rapport à un contrôle réaliséen absence de protéine (C).

1 2

C

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0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

0.1 MOI, 2 days0.01 MOI, 3 days1.0 MOI, 1 day1.0 MOI, 2 days

Figure 1

Ant

ivir

al a

ctiv

ity (%

)

Concentration of 100% Met-BLG (µg mL-1)

A

Concentration of esterified whey proteins (µg mL-1)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Ant

ivir

al a

ctiv

ity (%

)

0

20

40

60

80

100

68% Met-ALA100% Met-BLG

B

A

Poliovirus

Coxsackie virus

(A): activité antivirale de 68% Met-ALA ( ) et de 100% Met-BLG ( ) contre le poliovirus type 1 (1.0 MOI) inoculé dans des cellules Vero, après 48 h d’incubation à 37°C.

(B): activité antivirale de 100% Met-BLG contre le virus Coxsackie B6 après incubation à 37°C en présence de 5% CO2pendant 24 h ( : 1.0 MOI), 48 h ( : 0.1 MOI; : 1.0 MOI), et 72 h ( : 0.01 MOI).

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0

20

40

60

80A

Protein concentration (µg/ml)

0 25 50 75 100 125

Ant

ivira

l act

ivity

(%)

0

20

40

60

80B

Cyt

otox

icity

(%)

0

20

40

60

80C

Protein concentration (µg/ml)

0 25 50 75 100 125

0

20

40

60

80D

60% Met-ALA and its peptic peptides 100% Met-BLG and its peptic peptides

Ant

ivira

l act

ivity

(%)

Cyt

otox

icity

(%)

Activité antivirale de 60% Met-ALA (A) et après son hydrolyse pepsique de 10 h (B), 100% Met-BLG (C) et après son hydrolyse pepsique de 10 h (D) contre HSV-1 [( ) 100% CPE, ( ) 50% CPE] inoculé dans des cellules Vero, après 72 h d’incubation à 37°C. ( ): cytotoxicité

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Inhibition de la réplication de différents virusBactériophage M13. Spécifique d’E. coli. Comparaison

avec les effets des histones et du lysozyme

Bactériophages de lactocoques. Comparaison avec les effets des histones, du lysozyme et des polylysines

Virus Herpes simplex de type 1

Poliovirus (enterovirus)

Cytomégalovirus

Comparaison avec acyclovir et L-polylysines (5-14 kDa)

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ENVIRONNEMENT

M. Sitohy ; S. Billaudel ; T. Haertlé ; J.-M. Chobert. Antiviral activity of esterified α-lactalbumin and β-lactoglobulin against herpes simplex virus type 1. Comparison with the effect of acyclovir and L-polylysines. J. Agric. Food Chem. 2007, 55 (24) DOI: 10.1021/jf0724421 .

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; M. Nowoczin ; B. Besse ; S. Billaudel ; T. Haertlé. The effect of bovine whey proteins on the ability of poliovirus and Coxsackie virus to infect Vero cells cultures. Int. Dairy J. (accepté).

J.M. Chobert; M. Sitohy; S. Billaudel; M. Dalgalarrondo; T. Haertlé. Anti-cytomegaloviral activity of esterified milk proteins and L-polylysines. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007, 13, 255-258.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; U. Karwowska ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Inhibition of bacteriophage M13 replication with esterified milk proteins. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 3800-3806.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Esterified whey proteins can protect Lactococcus lactis against bacteriophage infection. Comparison with the effect of native basic proteins, and L-polylysines. J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 3727-3734.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.-C. Gaudin ; T. Renac ; T. Haertlé. When positively charged milk proteins can bind to DNA. J. Food Biochem., 2002, 26, 511-532.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Schmidt ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Interactions between esterified whey proteins (α-lactalbumin and ß-lactoglobulin) and DNA studied by differential spectroscopy. J. Prot. Chem., 2001, 20, 633-640.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.C. Gaudin ; T. Haertlé. Esterified milk proteins inhibit DNA replication. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 29, 259-266.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of the formation of complexes between DNA and esterified dairy proteins. Int. Dairy J., 2001, 11, 873-883.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Susceptibility to trypsinolysis of esterified milk proteins. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 28, 263-271.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; T. Haertlé. Factors influencing pepsinolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- ester derivatives of ß-lactoglobulin. J. FoodBiochem., 2001, 25, 181-198.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Improvement of solubility and of emulsifying properties of milk proteins at acid pHs by esterification. Nahrung-Food, 2001, 45, 87-93.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Peptic hydrolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- esters of ß-casein and α-lactalbumin. Milchwissenschaft, 2001, 56, 303-307.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Simplified short-time method for the esterification of milk proteins. Milchwissenschaft, 2001, 56, 127-131.

M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of factors influencing protein esterification using ß-lactoglobulin as a model. J. Food Biochem., 2000, 24, 381-398.

J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Composition pour l’inactivation de particules virales, et applications d’une telle composition. Demande de Brevet Français déposée le 5 Juin 2003, sous le n° 03/06786. Demande Internationale PCT déposée le 7 juin 2004.

J.-M. Chobert ; L. Briand ; T. Haertlé. Procédé d'obtention de produits peptidiques et produits obtenus. Demande de Brevet Français déposée le 23 Décembre 1993, n°93/15764, délivrée le 8 Mars 1996, n° 2 714.390. Demande Internationale PCT déposée le 20 Décembre 1994, n° 94/01500, délivrée le 27 janvier 1999.

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De simples modifications des protéines lactosériques peuvent conduire, à faible coût, à la production de librairies amplifiées et diversifiées de peptides amphiphiles.

Ces protéines peuvent servir comme agents de neutralisation virale (virucides).

Certaines formes de bêta-lactoglobulines modifiées sont actives contre HSV, Polio, hCMV, bactériophages, etc« Inactivation of viral particles. » Jean-Marc Chobert and Thomas Haertlé. French

Patent N° FR-03 06786, world extension applied for.

ConclusionsConclusions

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Mahmoud SitohyZagazig University, Faculty of Agriculture, Biochemistry Department, Zagazig, Egypt

Urszula Karwowska, Anna Gozdzicka-Jozefiak A.Mickiewicz University, Zaklad Wirusologii Molekularnej, Poznan, Poland

Sylviane Billaudel Université de Nantes, UFR des Sciences Pharmaceutiques, Bactériologie-Virologie, Nantes, France

Christophe Chevalier et Bernard Delmas INRA, VIM, Équipe Virus InfluenzaJouy-en-Josas, France

CollaborationsCollaborations

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Soutiens obtenus

Partenariat Hubert Curien ‘Imhotep’ France-Égypte « Propriétés antivirales et hypoallergéniques des protéines laitières modifiées »

Département CEPIA

Région Pays de la Loire; valorisation. « Développement d’une famille de protéines et peptides antiviraux »