Peptides et Protéines

I. Introduction

Association monomères d’AA : petit nombre : peptide / grand nombre = protéines

Nombreuses fonctions biologiques :

o Enzymes : anabolisme / catabolisme / site catalytique (kinase, décarboxylase)

(synthèse) (dégradation) (galactosidase)

o Transport : solubilisat° / protect° (transferrine = fer / céruléoplasmine = cuivre)

o Energie : protéines à versant nutritionnel (albumine)

o Contraction : génération mouvement / modification de forme

(cellule : actine, tubuline / cytosquelette)

Tissu (complexe tertiaire : troponine I, T, C tropomyosine / cœur muscles)

Troponine Ic et Tc sont des isoformes cardiaques

o Structure : soutien architecture tissulaire

tendons, cartilage : Collagène

Cheveux, ongles : kératine

o Défense : Lutte contre agression d’autres espèces (ImmunoGlobuline G, M, A)

Phénomène allergique (Ig E)

Reco spé épitope (← permet de diff soi du non-soi) (Ag) par Ac

o Régulateur de l’expression génique : facteur de transcription

o Signalisation : Hormones, neurotransmetteurs, cytokines

Signal lipidique : traverse la membrane, fixe un récepteur nucléaire

Signal peptidique / protéique : récepteur membranaire qui va transmettre via

des second messagers, une réponse cellulaire

o Stockage : ferritine (cellulaire)

Quatre types de Structure :

o IR : séquence d’AA sur une même chaine peptidique / protéique

o IIR : arrangement spatial (3D) d’une partie de la séquence en AA sur une même

chaine peptidique / protéique. Lui assurant une meilleure stabilité.

o IIIR : arrangement des éléments de structure IIR entre eux sur une chaine peptidique

/ protéique

o IVR : disposition entre les différentes chaines IIIR d’une protéine

x 110

Deux types de protéines :

Rapport axial : + 𝑔𝑟𝑎𝑛𝑑 𝑎𝑥𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒

+ 𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡

o Globulaire : forme compacte / particules de forme sphérique en solution

Sphéroprotéines (albumine) / rapport axial (RA) < 10

o Fibreuse (fibrillaire) : Protéine à rapports axiaux élevés / scléroprotéines

(protéine de structure / kératine) / RA > 10

o Membranaire (Mb) : 1 ou plrs domaines Trans-Mb

Dénomination :

o Selon le nombre d’AA : 2 – 20 = oligopeptide / 20 – 100 = polypeptide

> 100 = Protéine

o 1 seule chaine (sous-unité) = mono-unitaire

Plusieurs chaines (sous unité) = multi-unitaire

o Contient uniquement des AA : simples = holo-peptide / protéine

D’autres groupements : conjuguées (hétéroprotéines) avec grpt prosthétique (non protéiq)

Lipides / lipoprotéines

Glucides / glycoprotéines

Ions / métalloprotéines

Taille et poids moléculaire variable :

~ 104 AA (cytochrome C humain) à 4536 AA (Apo B humain)

PM 13’000 PM 513’000

A. Définition / Nomenclature de la Structure IR

Applicable peptides / protéines

Définition : ordre d’enchainement / séquence des AA dans la molécule peptidique ou

protéique en application directe du code génétique

1er AA : Fonction amine non engagée / partie NH2 terminale : NTER

Dernier AA : Fonction carboxylique non engagée / COOH terminale : CTER

Lecture : NTER → CTER

Colinéarité entre séquence nucléotidique et séquence AA

o Partie NH2 avec extrémité 5’

Liaison entre AA : liaison peptidique / squelette molécule

B. Liaison Peptidique

Définition : Combinaison entre groupement carboxylique d’un AA(n) et groupement amine

d’un AA suivant AA(n+1) avec expulsion d’une molécule d’eau.

Liaison pseudo-peptidique (iso-peptidique) au sein du Glutathion

Liaison amide, mais pas carbone α du Glutarate.

→ Une liaison peptidique vraie et une pseudo

Deux propriétés importantes d’une liaison peptidique :

o Lorsque l’on stimule cette liaison avec une lumière IR, elle absorbe.

o Un peptide / protéine soumis à de l’IR (1600-1700 cm-1) il absorbe ++

o On peut donc mesurer la teneur en protéines / peptides avec l’absorbance (dès qu’il y

a une liaison amide). Car plus la concentrat° est forte, plus l’absorbance est grande.

Squelette de Protéine : liaison peptidique

Propriétés Physico-Chimiques : groupement R des AA

R avec encombrement stérique : R de part et d’autre du squelette : isomérie TRANS.

Propriétés de la liaison peptidique :

o Covalente

o Forme mésomérique / pseudo-ionisation / résonnance entre liaison simple et

double

Alternance simple / double liaison

→ liaison peptidique + grande qu’une double liaison, mais + petite qu’une simple

o Il existe une structure autour de la liaison peptidique

Assez rigide, on peut l’afficher dans un plan : structure plane

Stable

Destruction par hydrolyse : ébullition en solution aqueuse

Acide / Base forte

Enzymatique : protéase / peptidase

C. Principes d’étude de la Structure IR

Multi Étapes :

Étape 1 : Obtention de protéines par séquençage

→ Quantité suffisante

Purification : concentrer + enlever les molécules non protéiques

Dialyse / Lyophilisation / Ultrafiltration

Séparation / Isolement :

o Chromatographie sur colonne (C L H P)

Gel filtration / Exclusion : Poids Moléculaire → sépare peptide / protéine

Echangeuse d’ions : Charge + ou –

Affinité : Ac-Ag / Enzyme-substrat → greffer sur la colonne, pour retenir

o Précipitation : sulfate d’ammonium / sulfate de sodium

o Électrophorèse : monodimensionnelle : gel d’agarose : électrophorèse des protéines

SDS (dodécyl sulfate de sodium → protéine -)

PAGE (Electrophorèse en gel de poly acrylamide = P.M.)

Bidimensionnelle : Selon Charge puis Poids Moléculaire

o Ultracentrifugation : constante de sédimentation (Svedberg)

Obtention d’une Protéine recombinante : ADNc → Protéines (produite par bactéries)

Étape 2 : Protéine à 1 ou plusieurs chaines

Principe : identification des groupes terminaux NH2 et COOH

1 chaine A : 1 groupement aminé / 1 groupement carboxylique

2 chaines A et B avec AA terminaux différents :

2 groupements aminés / 2 groupements carboxyliques

Identification du NH2-term

Chlorure de dansyle :

Protéine non réutilisable

N-term AA dansylé : fluorescence jaune (chromatographie / quantification)

1 fluoro 2,4 dinitrobenzène : réaction de Sanger

Protéine non réutilisable

N-term AA-DNP (dinitrophényl Amino Acide) analysé et quantifier par Chromatographie

Méthode enzymatique : exopeptidase

Agissent aux extrémités des peptides : aminopeptidase (N-term) et carboxypeptidase (C-term)

Endopeptidase = agit au sein de la protéine

Leucine aminopeptidase (enlève N-term AA sauf si proline)

Aminopeptidase M : toutes les N-term AA

(Chimique) Phényl-Isothiocynate (PITC) : réaction d’Edman (séquençage)

PITC + Protéine acide fort anhydre (acide trifluoro-acétique)

Milieu alcalin extraction solvant organique / traitement acide

N-term AA-PTH (Phényl-Thio-Hydantoïne)

Analyse HPLC / Chromatographie Gaz/Liquide

Intérêt : pas de dégradation protéique / réutilisation possible = séquençage possible

Identification du COOH-term

Méthode enzymatique : exopeptidase

2 à profil non restrictif :

Carboxypeptidase C et Y

2 à profil restrictif :

Carboxypeptidase A : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn = Arg / Lys

B : inactive si AAn-1 = Proline et si AAn ≠ Arg / Lys

Étape 3 : Nécessaire seulement si plusieurs chaines → Séparation

Coupure Pont disulfure :

Séparation des sous-unités (chaines) liées par liaison disulfure

Disparition de conformation native de protéine

o Oxydation par Acide Performique :

Cystine (S-S) → Acide Cystéique (CH2-SO3H)

Réaction avec méthionine → méthionine sulfone

Destruction noyau indole du Tryptophane

o Réduction par 2 mercapto-éthanol ou dithiothréitol (dithioréythritol : réactif de Cleland)

Stabilisation de S-S en SH isolés par acétylation (iodo –acétate) [= stabilisation groupements SH]

Coupure autres liaisons :

Dénaturation par urée + chaleur / guanidium / dodécylsulfate de Sodium (SDS)

Isolation selon la masse : SDS-PAGE

Chromato gel filtration / exclusion

Étape 4 : Composition en AA

Hydrolyse

o Acide : HCl 6N / 100-120°C / 10-100h / sous vide / contre oxydation AA

o Basique : NaOH 2-4N / 4-8h / Température Ambiante

o Enzymatique : mélange endo et exopeptidase

Pronase : ensemble protéases de Streptomyces griseus

< 1% du poids de la Prot à cliver, sinon elle s’auto détruit : contamination

Analyse en AA

o Dérivation : 1fluoro 2,4 dinitro-benzène

Chlorure de dansyle

Phényl-isothiocyanate

o-phtalaldéhyde + 2 mercapto-éthanol

o Séparation : chromatographie HPLC ou échangeuse d’ions

Pic : temps d’élution (identité en AA) et volume pic : quantité en AA.

Étape 5 : Séquence en AA

Directe si < 100 AA, technique d’Edman (bloquée par glycosylation / acétylation)

On enlève via enz les sucres, acétyl …

Après hydrolyse : si > 100 AA

Fragmentation avec différents type de coupure dont on connait le site.

Séquençage des fragments obtenus

Analyse informatique : croisement des différentes séquences obtenues

o Hydrolyse Chimique :

Bromure de Cyanogène (NCBr)

HCl 0-1N / Acide Formique 70%

Rupture spécifique CTER du résidu méthionine (Met – AA)

Hydroxylamine (Asn – Gly)

o Hydrolyse enzymatique : Endopeptidase (origine pancréas / bactérie)

(AAn-1)NH2-CO-N-C(AAn)

Chymotrypsine : coupure si AAn-1 = hydrophobe encombrant (Phe, Trp, Tyr)

Et AAn = Leu, Phe, Trp, Tyr

Trypsine : coupure si AAn-1 = Arg / Lysine

Et AAn ≠ Pro

Pepsine : coupure si AAn-1 différent de Proline

Et AAn = Leu, Phe, Trp, tyr

Clostripaïne : coupure sur Arg

Lys-Endopeptidase : (achromobacter) sur Lys / y compris Lys-Pro

Regroupement

Combinaison de différentes hydrolyses et différentes séquences informatiques

# Nouvelles technique d’étude de la séquence primaire

Protéomique / Peptidomique

(Electro Bi-dim + analyse par spectro. Masse)

MALDI (Matrix – Assisted laser desorption ionisation) TOF (time of fly)

1- L’échantillon de protéine cristallisé dans une matrice est ionisé par un laser

2- Un champ électrique accélère les ions

3- Les ions les plus légers arrivent en premiers sur le détecteur

Le temps de vol (TOF) dans le champ électrique est une mesure de la masse (masse/charge)

Protéolyse de la protéine par la Trypsine → mélange de peptides

Analyse en SM Maldi-Tof

Carte peptidique massique

Comparaison à un profil dans les bases de données

Protéine identifiée par le cadre peptidique

Carte peptidique / Finger Print

Hydrolysat protéique entre protéine connue et inconnue (proximité des protéines)

Peptide → migration et séparation par :

- Electrophorèse ; SDS PAGE

- Chromato sur papier / silice

Mise en évidence des peptides différents entre les deux protéines

Séquençage des peptides différents

Application du Finger Print : Drépanocytose (anémie falciforme + Thrombose)

o Recherche des AA différents dans hémoglobine anormale

Globules rouges (Erythrocytes) :

- Hb normale majoritaire : HbA (α2β2)

- Hb anormale : HbS solubilité réduite en absence d’oxygène

(drépanocytose) Précipitation dans GR

Destruction + rapide du GR (anémie)

Coupure HbS et HbA en 28 peptides via Trypsine

Séparation Electrophorèse SDS / Chromato descendante sur papier

Identification de la place des fragments par ninhydrine (chauffage 80°C)

Peptides même position Composition en AA identique

Peptides position différente Composition en AA différente

1 peptide différent sur 28, séquençage du peptide :

HbA : Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys

NTER CTER

HbS : Val – His – Leu – Thr – Pro – Val – Glu – Lys

Mutation du 6e codon GTC (Val) remplace un GAG (Glu) au sein de la chaîne

→ Interactions hydrophobes entre Val de β et Phe 85 ou Leu 88 de l’autre chaine β

Lorsqu’il n’y a pas d’O2, cette interaction réduit la solubilité de la désoxyHbS

→ Obstruction des Capillaires et formation de Thromboses

D. Intérêt de la Connaissance d’une Structure IR

Caractéristique structurale commune : appartenance à une famille

Lien fort entre structure IR et IIIR

Orientation des fonctions et de la localisation des protéines :

o Présence de séquence signal NTER

Permet le contrôle de l’export protéique

Permet l’adressage intercellulaire

Notion de protéines homologues : liées d’un point de vue de l’évolution

o Présence même séquence AA à un endroit défini : résidus invariants

o Présence séquence différente en AA à un endroit défini : résidus variable

Permet d’étudier le taxonomie (lien entre différentes espèces)

+ AA proches, plus espèces proches

AA complètement différents + propriétés fonctionnelles différentes : non conservatrice

AA différents sont de même type + fonctions identiques : substitution conservatrice

II. Structure tridimensionnelle des Protéines

A. Structure IIR

Orientation spatiale entre 2 AA adjacents au sein d’un peptide / protéine

1) Principes

Effet mésomérique de la liaison peptidique :

o CO-NH dans un plan rigide avec O et N en TRANS sur le Carbone

o Squelette protéique : succession de groupes peptidiques au sein de

plans rigides liés entre eux

Rotation au niveau des autres liaisons :

Degré de liberté entre Cu → C : angle de torsion de liaison ψ

N → Cα : angle de torsion de liaison Φ

Ψ et Φ : peuvent prendre toutes les valeurs entre -180° et +180°, mais, valeur prohibée par

encombrement stérique

Vont définir une configuration à énergie minimale (représentation de Ramachandran)

2) Différents types de Structure IIR

Présence simultanée au sein d’une même séquence d’AA

Hélice alpha (α) :

Disposition + simple d’une chaine polypeptidique (α-Kératine Pauling et Carey en 1951)

Définition : squelette polypeptidique enroulé autour d’un axe longitudinal avec groupement

R des AA à l’extérieur du squelette hélicoïdal (aspect tire-bouchon)

Pour les AA de type L :

o Pas droit

o Tour de l’hélice : 5,6 Å

o 3,6 AA par tour

o Cœur compact (liaison hydrophobe)

o Ψ : -45° à -50° et Φ : -60°

o Stabilisation par liaison H : entre CO du résidu n et NH et du résidu (n + 4)

o Hélice moyenne : environ 12 à 13 résidus : 18 Å

Hélice II (la + compacte : 4,4 AA / tour) – (la + étirée : 3 AA / tour)

Brin et Feuillet β :

Définition : squelette à structure étirée en zig-zag avec des groupements R dans des

directions opposées à l’axe principal du zig-zag. C’est un structure périodique de deux AA.

Ψ : +90° et Φ : -120°

Distance : entre 2 structures de 2 AA : 3,5 Å

entre 2 groupements identiques sur un même brin : 7 Å

Stabilisation par liaisons H

Brin : impossibilité de rester isolé car non stabilisé des liaison H internes, se stabilise

via assemblage des Brins β en Feuillet β

2 types selon orientation des chaines interagissant :

Feuillet Béta parallèle ou antiparallèle (brins β dans un sens opposé → + stable)

Coude / Courbure β (font souvent le lien entre deux Brins β)

Boucle

3) Exemple de Structure IIR

Collagène : environ 30 variétés (osef) / 25% masse totale protéique extracellulaire

Formé d’hélice α à pas gauche → 3 chaines de 350 AA

Super hélice à pas droit : fibrillaire de 300nm de long / 1,5 nm de diamètre / 1050 AA

(Tropocollagène)

12 à 14% de 3, 4 ou 5 OH-Proline (interactions avec eau en périphérie)

Transformation Proline → OH-Proline (Proline hydroxylase)

Nécessite Vit C / si absence : fragilité du collagène → scorbut

Problèmes avec les ongles, cheveux, dents qui tombent …

Réticulation (resserré en interne) du collagène (pontage entre triple hélice) :

Concerne les résidus de Lysine

Intervention de Lysyl-Oxydase (LO)

LO

1 chaine Lys 1 chaine allysine pontage allysine

1 chaine Lys 1 chaine allysine aldolique aldol

Réact° entre Lys CTER d’une triple hélice et Lys NTER d’une autre triple hélice

Origine insolubilité aqueuse / 50nm de ø

(pas de dispersions, mais interactions)

Déficit de fonctionnement de lysyloxydase (LO) : Collagène + Elastine

Anomalie génétique : Syndrome d’Ehlers-Danlos

Hyper extensibilité des Articulations / de la Peau

Ostéolathyrisme :

Ingestion de graines de pois sucré (Lathyrus Odoratus)

Présence de β-aminoproprionitrile : inhibiteur LO

→ anomalies os, articulation, vaisseaux sanguins

B. Structure IIIR

1) Généralités

Association des éléments de structure IIaire

Prise en compte de l’ensemble des AA et non pas des AA adjacents (Iaires)

Mise en évidence expérimentale : diffraction rayons X

RMN multidimensionnelle

Destruction structure IIIaire : dénaturation

Irréversible (+++) / réversible (+)

Par : chaleur : cassure des interactions faibles (albumine, blanc d’œuf, …)

pH extrême : modif électrostatiques → Répulsion des AA entre eux

phénol, alcool, acétone, urée, guanidium ou détergents = rupture des liaisons

hydrophobes

Renaturation : reprise structure IIIR

Possible (preuve expérimentale sur la Ribonucléase in vitro)

In vivo : spontané

Intervention protéines aidant la protéine à se replier correctement

Protéines Chaperonnes / Chaperonines

Membre de la famille des HSP

Protéines présentes lors de la synthèse protéique pour éviter l’agrégation

non spécifique / repliement inadéquat

2) Différents types de structure IIIR

# MOTIF : Structure Super Secondaire

Groupement d’éléments structuraux IIaires formant un ensemble stable

Simple : βαβ : 2 feuillets β séparés par une hélice α

Complexe : 4 résidus de Cystéine ou deux de Cystéine + 2 Histidine sur un Zinc

(retrouvé dans les facteurs de transcription : LXR, récepteur nucléaire qui interagit

avec le promoteur du gène dont il régule la transcription en repérant une zone cible

LXRE)

# DOMAINE :

Unité structurelle indépendante dans une protéine isolable ayant des caractéristiques proches

d’une petite protéine globulaire

Regroupant 1 à plusieurs motifs (identiques ou différents)

Taille : 40 – 400 AA

1 Domaine : souvent codé par un exon

1 Protéine peut contenir plusieurs domaines différents

1 Domaine doté d’une fonction spé biologique dans la protéine

Ex : Récepteur Nucléaire aux Rétinoïdes (RAR)

NTER CTER

A/B C D E/F

Domaine de transcription

ligand indépendant (AF1)

Domaine de transcription

ligand indépendant (AF2)

Domaine fixation ADN (2 feuillets β, 1 hélice α

de 10 AA contact grand sillon ADN)

2 doigts de Zinc

Fixation hélice

Structure tertiaire et pathologie : le prion

Encéphalopathie spongiforme : Tremblante du Mouton (scrapie)

Encéphalopathie spongiforme bovine (ESB)

Kuru (homme)

Maladie de Creutzfeldt Jacob (homme)

>> démence, coma, décès

Maladie de Creutzfeld Jacob : Protéine prion PrP

Forme héréditaire

Forme Transmissible ATNC (Agent Transmissible Non Conventionnel) par

alimentation, greffe tissu contaminé, chirurgie touchant des patients atteints…

Découvert en 1996

PrPc (cellular) : protéine normale Facilement soluble

Facilement dégradée (protéase)

Forme d’hélice α et de boucle

PrPsc (scrapie) : protéine anormale insoluble / non dégradée (protéase)

Formée feuillet β

Dépôt intracérébrale : mort cellulaire neuronale

Maladie de Creutzfeld Jacob : Protéine prion PRP

Héréditaire : Anomalie dans séquence AA (20 mutations)

Moins stable donc se met en conformation feuillet β

Mise en conformation PrPsc

Mauvais repliement → Dépôt Amyloïde (dépôt Prot insolubles ds tissus)

Transmissible : Apport PrPsc

Même séquence Iaire en AA

Transformation des PrPc en PrPsc

(hélice α en feuillet β)

Formation de dépôts amyloïdes

Mort Cellulaire

Neurodégénération

Début de signes Cliniques (→ mort)

C. Structure Quaternaire

Applicable quand protéine composée de plusieurs chaines et sous-unités identiques ou

différentes

Définition : niveau d’organisation, de différentes sous-unités entre elles

Stabilisation des différentes sous-unités : liaison H +++

Pont disulfure (parfois)

Protéine formée : - de nombre pair ou impair de sous-unités

- de sous-unités identiques : protéine oligomérique

→ Chaque sous-unité identique est appelée Protomère

Ex : Hémoglobine α2β2 : Oligomère à 2 Protomères

2 types de fonctionnement des sous-unités entre elles :

Indépendantes

Coopératives : activité d’une sous-unité dépendant d’une autre

- Positive : Fixation d’un ligand sur une sous-unité

Fixation du ligand favorisée sur les autres-sous unités

- Négative : Fixation d’un ligand sur une sous-unité

Fixation du ligand inhibée sur les autres-sous unités

- Allostérique : Capacité des sous-unités de bouger les unes par rapport aux autres

et/ou de changer de conformation spatiale

o Mineure : hémoglobine : capable de prendre des conformations différentes

(réversibles et voisines) en fonction de la fixation ou non de l’oxygène

o Majeure : régulation enzymatique

Protéine Kinase A : 2 sous unités régulatrices ® sensibles à AMPc

(PKA) 2 sous unités catalytiques ©

Fixation AMPc sur sous unité R → libération des sous-unités C

Enzyme inactive vers active → Phosphorylation protéines cibles (Ser, Thr, Tyr)

Complexe supramoléculaire : association de plusieurs protéines formées de plusieurs sous-

unités

Ex : Kératine → Macrofibrille → Cheveu

Hélice α → Super-hélice → Protofilament → Microfibrille → cheveu