2007 THESE

Présentée en vue de l’obtention du

Doctorat à Label Européen de l’Université Paul Sabatier (Toulouse III)

Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies Spécialité : Biologie Cellulaire

par

CHRISTEL VEROLLET

Rôle de la tubuline γ et des protéines associées dans l’organisation

et la dynamique des microtubules

Soutenue le 28 Septembre 2007

JURY

Président : Mr Jean-Edouard GAIRIN Professeur, UPS, Toulouse Rapporteur : Mme Isabelle VERNOS Professeur, Barcelone Rapporteur : Mr Helder MAIATO Professeur, Porto Examinateur : Mr Alain DEBEC Maitre de conférences, Paris Directeurs de thèse :Mme Brigitte Raynaud-Messina Chargé de recherche, CNRS, Toulouse Mr Michel Wright Directeur de recherche, CNRS, Toulouse

Centre de Recherche en Pharmacologie-Santé (CRPS) UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre Institut de Sciences et des Technologies du Médicament de Toulouse (ISTMT)

3, Rue des satellites BP 94244, 31432 TOULOUSE Cedex 4

A mon papa …

RESUME

Les microtubules sont des polymères dynamiques essentiels à la division cellulaire. Ils sont nucléés par la tubuline γ au niveau du centrosome. La tubuline γ intervient dans deux complexes majeurs, le γ-TuRC et le γ-TuSC. Le γ-TuRC est composé de plusieurs γ-TuSCs et d’au moins quatre autres protéines. Mon objectif est de déterminer les rôles respectifs des deux complexes dans l’assemblage des microtubules. La stratégie a consisté à inhiber chacune des protéines du γ-TuRC par RNAi dans les cellules de drosophile, et à analyser les conséquences sur l’organisation et la dynamique du cytosquelette microtubulaire.

Les protéines du γ-TuSC sont essentielles. Elles sont nécessaires à l’organisation d’un fuseau mitotique bipolaire fonctionnel et à la localisation de la tubuline γ au centrosome. Les protéines spécifiques du γ-TuRC ne sont pas essentielles mais le γ-TuRC est le complexe optimal pour la progression en mitose. En absence de γ-TuRC, j’ai mis en évidence un mode alternatif de recrutement de la tubuline γ aux pôles du fuseau sous la forme de γ-TuSC.En interphase, le γ-TuRC se localise le long des microtubules. Il stabilise leur extrémité plus des microtubules cytoplasmiques via la régulation du recrutement des complexes protéiques spécifiquement localisés à l’extrémité plus.

L’ensemble de mes résultats permettent de proposer que le γ-TuSC joue un rôle crucial dans la nucléation et l’organisation des microtubules tout au long du cycle cellulaire. Le γ-TuRC assurerait des fonctions non-centrosomales, comme la régulation de la dynamique des microtubules.

Mots clés : organisation et dynamique des microtubules, tubuline γ, γ-TuSCs et γ-TuRCs, drosophile

ABSTRACT

Microtubules are highly dynamic polymers playing essential roles in cell division. γ-Tubulin, a centrosomal protein, acts within two main complexes, γ-TuSC and γ-TuRC. γ-TuRC, formed of γ-TuSCs with at least four additional proteins, is involved in microtubule nucleation at the centrosome. Nevertheless, the role of γ-TuRC components are not well defined in metazoa. I used RNAi depletion in Drosophila S2 cells to study γ-tubulin and associated proteins functions in microtubule organization and dynamics.

γ-TuSC proteins are essential. They are necessary for γ-tubulin centrosomal recruitment and for mitotic spindle organization. γ-TuRC specific proteins are non essential. γ-TuRC is the optimal complex for a fully functional mitosis, but assembly of this large complex is not essential for γ-tubulin centrosomal localization and function, as γ-TuSC can be targeted directly to the centrosome. γ-TuSC participates in interphase microtubule overall organization whereas γ-TuRC is dispensable for this process. γ-TuRC localize along microtubules and stabilize their plus-ends via the control of +TIPs complexes composition.

To conclude, γ-TuSC play a crucial role in microtubule nucleation and organization all along the cell cycle, while γ-TuRC promotes non-centrosome microtubule functions as microtubule dynamic regulation.

Key-words : microtubule organization and dynamics, γ tubulin, γ-TuSCs and γ-TuRCs, drosophila

SOMMAIRE

INTRODUCTION………………………………………………………...…………………..1

I-Du cytosquelette microtubulaire à la tubuline γ……………………...………………..….3

1) Structure et dynamique des microtubules…………………………………………...…..…3

2) La mitose…………………………………………………………………………...………5

3) Centres organisateurs des microtubules ……………………………….…………...……...7

II-La tubuline γ …………………………………………………………………………….…9

1) Découverte et conservation de la tubuline γ……………………….……………………….9

2) Localisations de la tubuline γ…………………………………………………………......11

3) Fonctions de la tubuline γ…………………………………………………………………12

4) Régulation des fonctions de la tubuline γ………………………………………………...21

III-De la tubuline γ aux complexes d’organisation des microtubules………………....…23

1) Caractérisation des complexes de tubuline γ……………………………………………...23

2) Structure des γ-TuSCs et des γ-TuRCs………………………………………………...…26

3) Fonctions des protéines associées à la tubuline γ…………………………………………31

RESULTATS………………………………………………………...……………………....39

I-Etude d’une protéine du γ-TuSC, Dgrip84, au cours de la division cellulaire………...39

Voir Colombié et al., Mol. Biol. Cell., 2006.

II-Etude du rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en mitose……………………...…43

Voir Vérollet et al., J. Cell. Biol., 2006.

III-Etude du rôle des protéines du γ-TuRC en interphase………………………………..47

1) Rôle du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules en interphase………………...….48

2) Rôle du γ-TuRC dans la dynamique des microtubules en interphase…………………….49

Voir Vérollet et al., soumis, 2007.

IV-Etude de la régulation des protéines des complexes γ…………………………………53

1) Régulation des protéines du γ-TuSC……………………………………………………...53

2) Mécanismes de régulation des protéines du γ-TuSC…………………………………..…54

3) Régulation des protéines du γ-TuRC…………………………...……………………...…55

DISCUSSION ET PERSPECTIVES…………………………………………………….…57

I-Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules en interphase….………….57

II-Localisation de la tubuline γ sur les microtubules en interphase ………………..…....60

III-Rôle des γ-TuSCs et γ-TuRCs dans l’organisation des microtubules………..………63

1) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en interphase………………………………….……...64

2) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en mitose ………………………………………….…65

3) Co-régulation des protéines du γ-TuSC……………………...………………………...…73

IV-Perspectives…………………………………………………………………………..….74

1) Protéines impliquées dans la localisation de la tubuline γ sur les microtubules……….…74

2) Conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique des microtubules…………..….76

REFERENCES………………………………………………………………………………83

ANNEXES……………………………………………………………………………………95

Annexe 1 : Table des figures

Annexe 2 : Localisation de la tubuline γ et MTOCs

Annexe 3 : Fonctions des protéines des complexes de tubuline γ (littérature)

1

INTRODUCTION

Le cytosquelette microtubulaire est une structure dynamique impliquée dans le

transport intracellulaire, la formation des cils et flagelles mais aussi la mobilité cellulaire et

la division cellulaire. Par exemple, le fuseau mitotique permet l’alignement des

chromosomes sur la plaque centrale puis la répartition équitable du matériel génétique dans

les deux cellules filles. Des anomalies dans l’organisation du fuseau peuvent conduire à une

mauvaise ségrégation des chromosomes, générant de l’instabilité génétique qui peut être à

l’origine d’une transformation oncogénique de la cellule. Par conséquent, l’étude des

mécanismes et des molécules qui déterminent la nucléation, la dynamique et l’organisation

des microtubules est de première importance en biologie et s’inscrit également dans

l’équipe « pharmacologie et dynamique du cytosquelette microtubulaire » au sein du Centre

de Recherche en Pharmacologie~Santé (Unité Mixte de Recherche 2587 CNRS-Pierre

Fabre) à Toulouse. Les objectifs de l’unité portent sur la proposition de nouvelles cibles, de

nouveaux essais de criblage et la compréhension de nouveaux mécanismes d’action à partir

de la caractérisation et de l’analyse fonctionnelle de protéines impliquées dans la mitose.

Dans les cellules animales, le cytosquelette microtubulaire est organisé à partir du

centrosome où est recrutée la tubuline γ, une protéine essentielle pour la nucléation des

microtubules. La tubuline γ est présente dans le cytoplasme sous la forme de deux

complexes majeurs : un complexe de ~300KDa, le γ-TuSC (γ-Tubuline Small Complex),

composé de tubuline γ et de deux autres protéines et un complexe de ~2000KDa, le γ-

TuRC (γ-Tubuline Ring Complex), qui résulte de l’association de plusieurs γ-TuSCs avec

au moins quatre autres protéines.

Mon projet de thèse a porté sur le rôle de la tubuline γ et des protéines qui lui sont

associées dans l’organisation et la dynamique des microtubules au cours du cycle

2

cellulaire. Les deux complexes, γ-TuSC et γ-TuRC, sont bien caractérisés chez Drosophila

melanogaster qui constitue un organisme métazoaire particulièrement adapté aux études

fonctionnelles. L’inhibition de la synthèse des protéines par ARN interférent (RNAi) est

beaucoup plus efficace dans les cellules de drosophile que dans les cellules de mammifères

et cette analyse par RNAi peut être complétée par une approche in vivo grâce aux mutants

disponibles. La stratégie suivie a consisté à inhiber la synthèse de la tubuline γ et des

protéines qui lui sont associées par RNAi dans les cellules S2 de drosophile en culture, et

d’en analyser les conséquences sur le déroulement de la mitose, l’organisation du

cytosquelette microtubulaire et la dynamique des microtubules en interphase.

Dans l’introduction, je présenterai les différents facteurs qui régulent la fonction des

microtubules dans la cellule et je résumerai les travaux concernant la tubuline γ depuis sa

découverte en 1989. J’aborderai ensuite la caractérisation des complexes γ-TuSC et γ-

TuRC, puis les données fonctionnelles concernant les protéines associées à la tubuline γ.

3

I- Du cytosquelette microtubulaire à la tubuline γ

1) Structure et dynamique des microtubules

Les microtubules sont des cylindres creux de 25 nm de diamètre formés par

l’assemblage de 13 protofilaments. Les protofilaments sont constitués par une succession

linéaire d’hétérodimères de tubulines α et β. Ils sont disposés parallèlement et établissent

des contacts latéraux, légèrement décalés les uns des autres (Evans et al., 1985; Nogales et

al., 1999) (Figure 1A). Les sous-unités de tubulines α et β ont une masse de 50KDa et

présentent environ 50% d’identité au niveau de leur séquence en acides aminés.

L’assemblage des microtubules est un processus en deux étapes qui comprend une étape

limitante d’initiation, la nucléation, suivie d’une étape rapide d’élongation. L’addition et

l’élimination des hétérodimères se produit essentiellement aux extrémités des microtubules.

L’asymétrie et le mode d’assemblage des dimères de tubuline définissent la polarité des

microtubules ainsi que les propriétés de leurs extrémités. In vitro, les microtubules se

désassemblent environ 100 fois plus vite à partir de l’extrémité plus caractérisée par la

présence de tubuline β que de l’extrémité moins correspondant à la tubuline α (Nogales et

al., 1999). Cette dissymétrie d’assemblage permet un flux de sous-unités à l’intérieur du

microtubule appelé « treadmilling ».

Chaque monomère de tubuline possède un site de liaison pour une molécule de GTP

(Figure 1A). Le GTP lié au monomère de tubuline α est physiquement piégé à l’interface

du dimère, tandis que le GTP lié à la tubuline β échangeable et est hydrolysable en GDP

(Mitchison, 1993). L’extrémité plus des microtubules possède des sous-unités β porteuses

de GTP qui constituent une « coiffe » de tubuline GTP. Elle stabilise cette extrémité et

permet l’assemblage d’autres hétérodimères de tubulines. Lorsque la « coiffe » de tubuline

GTP disparaît par hydrolyse, le microtubule se désassemble très rapidement. Cette

hydrolyse est associée à un changement de conformation de la tubuline β qui induit la

dissociation des protofilaments appelée « peeling » du microtubule (Figure 1B) (Nogales

Tubuline α

Tubuline β

α

β

(−)

(+)

B C

Lumière

Microtubule (a) (b) (c) (d)

Protofilament

Polymérisation Dépolymérisation

Coiffe GTP

croissance rapide avec une coiffe GTP

perte accidentelle de la coiffe GTP CATASTROPHE

décroissance rapide

récupération d'une coiffe GTP SAUVETAGE

croissance rapide avec une coiffe GTP

Figure 1 : A. Structure d'un microtubule et de ses sous-unités. (a) La sous-unité de chaque proto-filament est un hétérodimère de tubuline, formé à partir d'une paire de monomères de tubuline α et β reliés par des liaisons non covalentes. Le GTP est montré en rouge. (b) Représentation schémati-que d'un hétérodimère et d'un protofilament. (c) Le microtubule est un tube creux rigide formé de 13 protofilaments alignés parallèlement. (d) Court segment de microtubule vu en microscopie électro-nique. (e) Photographie en microscopie électronique d'une coupe transversale d'un microtubule mon-trant un anneau de 13 protofilaments distincts. B-C. L'instabilité dynamique. B. Dans un microtu-bule, les protofilaments formés à partir de sous-unités contenant du GTP sont placés dans une conformation linéaire par de nombreuses liaisons latérales, donnant ainsi une "coiffe" stable de sous-unités contenant du GTP. La perte du GTP conduit à une rupture progressive du microtubule ou "peeling". Au dessus des schémas sont représentées les photographies en microscopie électronique correspondantes. C. A une certaine concentration de tubuline libre, une seule extrémité peut subir une transition entre l'état de croissance et de décroissance. Un microtubule en croissance présente des sous-unités pourvues de GTP à son extrémité qui forment une "coiffe". Si l'hydrolyse des nucléo-tides s'effectue plus rapidement que l'addition des sous-unités, cette coiffe est perdue, le microtubule commence à décroître, c'est le phénomène de catastrophe. Si des sous-unités contenant du GTP s'ajoutent en assez grand nombre pour reformer une "coiffe", alors le microtubule recommence à croître, c'est le sauvetage. Les boules vertes sont des tubulines-GDP alors que les carré verts sont des tubulines-GTP (Biologie de la cellule, 4ième édition, Alberts et al.).

(e)

A Hétérodimère

β

α

4

and Wang, 2006). Ainsi, les extrémités plus des microtubules oscillent en permanence entre

une période de croissance et une période de désassemblage. Ce phénomène est appelé

« instabilité dynamique » (Mitchison and Kirschner, 1984a). La décroissance rapide du

microtubule est qualifiée de catastrophe, tandis que la reprise de la croissance est appelée

sauvetage (Figure 1C) (Walker et al., 1988). Le « treadmilling » et l’ « instabilité

dynamique » confèrent aux microtubules un caractère très dynamique.

Ces deux mécanismes initialement caractérisés in vitro sont également observés in

vivo. Dans une cellule animale en interphase, les microtubules ont une organisation radiaire

avec les extrémités plus dynamiques, dirigées vers le cortex cellulaire, et les extrémités

moins ancrées au centrosome. Différents paramètres permettent de quantifier la dynamique

de l’extrémité plus des microtubules : les vitesses d’assemblage et de désassemblage, les

transitions entre les différents états dynamiques, en particulier les fréquences de catastrophe

et de sauvetage et le temps passé dans chacun de ces états (Cassimeris et al., 1988; Sammak

and Borisy, 1988). En supplément des phases d’assemblage/désassemblage, l’état de pause

a été défini comme la période pendant laquelle l’extrémité du microtubule reste stable

(Tran et al., 1997).

Dans la cellule, la dynamique de l’extrémité plus des microtubules est modifiée par

un ensemble de protéines qui les stabilisent ou les déstabilisent. Parmi elles, la stathmine

est une protéine cytoplasmique qui déstabilise les microtubules d’une part en séquestrant

les dimères de tubuline α/β et d’autre part, en s’associant à l’extrémité plus et en favorisant

l’activité GTPase de la tubuline β (Howell et al., 1999). La katanine est une enzyme à

activité ATPase qui fragmente les microtubules et les déstabilise en générant des extrémités

dépourvues d’une « coiffe » GTP (McNally and Vale, 1993 ; McNally et al., 2006; Roll-

Mecak and Vale, 2006). D’autres protéines, appelées MAPs (Microtubule Associated

Proteins), sont directement associées aux microtubules et interviennent dans la régulation

de leur dynamique. Initialement, les MAPs ont été isolées in vitro par co-purification avec

les tubulines α/β au cours de cycles répétés d’assemblage/désassemblage (Maiato et al.,

2004b). Parmi ces protéines, les MAPs telles que Tau ou MAP4 se lient à la surface des

microtubules et renforcent les liaisons entre les tubulines induisant la stabilisation des

microtubules (Heald and Nogales, 2002).

Figure 2 : La mitose. A-B. Le fuseau mitotique. A. Les trois classes de microtubules du fuseau mitotique : microtubules astraux, chevauchants (ou interpolaires) et kinétochoriens. Les extrémités moins des microtubules sont le plus souvent ancrées aux pôles du fuseau, alors que les extrémités plus s'en éloignent, soit vers les chromoso-mes pour les microtubules kinétochoriens, soit vers le cortex cellulaire. B. Les étapes de la mitose. Photographies de cellules épithéliales de cochon d'inde en mitose (LLC PK). Les chromosomes sont marqués en rouge (DAPI) et les microtubules en vert. En interphase, les microtubules de ces cellules ne sont pas organisés de façon radiaire, tout comme dans les cellules S2 de drosophile. En prophase, les chromosomes se condensent et il se forme deux asters de microtubules. Entre la prophase et la métaphase l'enveloppe nucléaire se rompt et permet aux microtubules d'intéragir avec les chromosomes. A la métaphase, la structure bipolaire du fuseau est en place et tous les chromosomes sont alignés sur la plaque équatoriale. En début d' anaphase A, les chromatides soeurs se séparent de façon synchrone, et les deux lots sont "tirés" par les microtubules kinétochoriens vers les pôles. A la fin de l'anaphase B, les deux pôles se sont complètement éloignés. En télophase puis cytocinèse, un fuseau central de microtubules se forme et l'invagina-tion entre les deux futures cellules a lieu pour permettre leur séparation (Laboratoire de Bill Earnshaw)..

A Kinétochore pole du fuseau

centrosome

microtubules microtubules kinétochoriens

microtubuleschevauchants

microtubulesastraux polaires

astraux équatoriaux

B

5

Caractérisées plus récemment, les « plus-end TrackIng Proteins » (+TIPs) se

localisent spécifiquement à l’extrémité plus des microtubules où elles régulent leur

dynamique. Cette classe comprend des protéines telles que les CLIPs (Cytoplasmic LInker

Proteins), les CLASPs (CLIP- ASsociated Proteins), APC (Adenomous Polyposis Coli) et

EB1 qui vont se lier à divers facteurs protéiques et agir sur des voies de signalisation

encore mal comprises (Galjart, 2005).

Les protéines de la famille KinI (superfamille des kinésines), comprenant MCAK

chez les mammifères ou KLP10A et KlP59C chez la drosophile, ne sont pas responsables

du transport des protéines et des organelles comme les autres kinésines « motrices» (Sharp

et al., 2000; Wittmann et al., 2001 ). Elles sont localisées à l’extrémité plus et déstabilisent

les microtubules en modifiant la conformation des dimères de tubulines α/β, induisant le

phénomène de « peeling ». Contrairement à la majorité des +TIPs qui stabilisent l’extrémité

plus des microtubules, la famille KinI fait partie des +TIPs qui induisent des catastrophes

(Howard and Hyman, 2007). En accord avec leur localisation, les +TIPs interviennent dans

le mouvement des chromosomes en mitose en régulant les interactions

microtubules/kinétochores (Maiato et al., 2004b). Elles contrôlent aussi les interactions

entre les microtubules et le cortex cellulaire à la fois en interphase et en mitose

(Lansbergen and Akhmanova, 2006).

La régulation de la dynamique des microtubules dépend de l’action coordonnée et de

l’interaction entre ces protéines qui ont des effets opposés ou synergiques.

2) La mitose

La dynamique des microtubules est régulée au cours du cycle cellulaire. En

prophase, la dynamique de l’extrémité plus des microtubules est augmentée (Cassimeris,

1999; Rusan et al., 2001). Dans des extraits mitotiques d’œufs de xénope, la fréquence de

catastrophes augmente globalement de 10 fois par rapport aux extraits interphasiques

(Belmont et al., 1990) et dans des cellules de mammifères, le pourcentage de temps que le

microtubule passe en pause passe de 73% en interphase à 11% en mitose (Rusan et al.,

2001). La dynamique élevée des microtubules mitotiques s’accompagne d’une

Figure 3 : Mécanismes de formation du fuseau mitotique. A. Cellules fixées avec les microtubules en vert et l'ADN en bleu. Pour passer de deux asters de microtubules émanant des pôles à un fuseau mitotique, il est nécessaire que des connections s'établissent avec les chromosomes. Pour celà, au moins deux méca-nismes se mettent en place. B. Modèle du "search and capture". Les chromoso-mes sont passifs (gris) et les microtubules (rouge) nucléés par le centrosome (centrioles en vert) vont capturer un kinétochore (1). Cela conduit à la biorienta-tion des chromatides soeurs d'un chromosome (2). C. Modèle de nucléation par la chromatine. Les fibres kinétochoriennes composées de plusieurs microtubu-les, sont formés au niveau des kinétochores. Le gradient de GTPase Ran (bleu) permet l'activation de protéines nécessaires à la formation de microtubules à proximité des kinétochores. Ces microtubules s'allongent jusqu'au pôles du fuseau ou jusqu'à un microtubule astral et sont incorporés dans le fuseau grâce à leur transport par la dynéine (3). (O'Connel et Khodjakov, 2007)

6

augmentation de la nucléation de nouveaux microtubules qui entraînent la réorganisation

du cytosquelette microtubulaire et l’établissement d’un fuseau bipolaire (Mitchison and

Salmon, 2001).

Pour former le fuseau métaphasique, les microtubules, émanant des deux pôles

capturent les chromosomes (« search and capture ») (Figures 2 et 3). La chromatine

intervient aussi dans la formation du fuseau (Heald et al., 1996; Karsenti and Vernos, 2001;

O'Connell and Khodjakov, 2007; Wadsworth and Khodjakov, 2004; Wilde and Zheng,

1999). La petite GTPase Ran et le facteur d’échange de guanine associé aux chromosomes

RCC1 créent un gradient favorable au relargage de TPX2. Cette protéine favorise la

nucléation des microtubules autour de billes de chromatine dans des extraits d’œufs de

xénope, et à proximité des chromosomes dans les cellules Hela (Gruss et al., 2001; Gruss et

al., 2002). Des protéines motrices telles que Eg5 et Klp1 vont permettre l’organisation et la

capture des petits microtubules ainsi formés au voisinage des kinétochores tandis que la

dynéine permet la focalisation des microtubules aux pôles du fuseau (Gruss and Vernos,

2004; Karsenti and Vernos, 2001) (Figure 3). Ce processus a été également caractérisé dans

les cellules S2 de drosophile (Maiato et al., 2004a). D’autres mécanismes indépendants des

pôles du fuseau et des chromosomes interviennent dans la formation du fuseau : la

nucléation de nouveaux microtubules à partir de ceux du fuseau et la « ré-utilisation » des

microtubules interphasiques (Mahoney et al., 2006).

Lors de la prométaphase, un point de contrôle est mis en place et reste activé tant

que les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque équatoriale (Logarinho

et al., 2004). L’anaphase ne se produit que lors de la désactivation du point de contrôle

mitotique. Au cours de l’anaphase A, les chromosomes se séparent et chaque chromatide

sœur migre vers les pôles. Deux phénomènes rentrent en jeu lors de cette ségrégation. Le

premier, appelé « flux » vers le pôle, consiste en la perte de sous-unités de tubuline à

l’extrémité moins et le second est l’activité « Pac-Man » qui permet le désassemblage des

microtubules à l’extrémité plus au niveau des kinétochores (Khodjakov and Kapoor, 2005;

Rogers et al., 2005). Au cours de l’anaphase B, les pôles s’éloignent. La division cellulaire

7

se termine par la formation du fuseau central en début de télophase, permettant la division

du cytoplasme ou cytocinèse qui génère les deux cellules filles (Figure 2B.).

3) Centres organisateurs des microtubules

In vivo, l’extrémité moins des microtubules, moins dynamique que l’extrémité plus,

est généralement attachée au niveau des centres organisateurs. Les Centres Organisateurs

des MicroTubules (MicroTubule Organizing Centers ou MTOCs) constituent des sites

d’ancrage et de nucléation des microtubules (Luders and Stearns, 2007). Le centrosome

constitue le MTOC majeur des cellules animales (Kirschner, 1986). Son nom lui a été

donné par T. Boveri, pour sa position centrale près du noyau (Wilson, 1925). Le

centrosome est composé de deux centrioles entourés de matériel péricentriolaire

(PeriCentriolar Material ou PCM) qui est un nuage de matériel amorphe dense aux

électrons en microscopie électronique (Figure 4). Le PCM est le site principal de nucléation

et d’organisation des microtubules (Mitchison and Kirschner, 1984b). Il n’est pas délimité

par une membrane, ce qui entraîne des difficultés pour définir sa morphologie et sa

composition protéique. L’analyse par spectrométrie de masse de centrosomes isolés de

cellules humaines a montré la présence de plus de 200 protéines dans le PCM (Andersen et

al., 2003). Dans les cellules en prolifération, les centrosomes se dupliquent une fois par

cycle. Au cours de la phase S, chaque centriole père initie la formation d’un centriole fils

dont la maturation est achevée en fin de phase G2. Chaque paire de centrioles est ensuite

ségrégée, de façon synchrone avec le matériel génétique, lors de la division cellulaire

(Doxsey, 2001).

Dans des organismes phylogénétiquement éloignés tels que les champignons et les

plantes, les MTOCs peuvent présenter des morphologies différentes. Chez les levures, le

MTOC principal est le Spindle Pole Body (SPB). Il assure les fonctions de nucléation et

d’organisation des microtubules. Chez Saccharomyces cerevisiae, le SPB constitué par une

structure trilaminaire insérée dans l’enveloppe nucléaire est le seul responsable de la

nucléation des microtubules (Figure 5A). Par contre, chez Schizosaccharomyces pombe,

Figure 4 : Le centrosome. (a) Représentation schématique simplifiée d'un centrosome de vertébré. Les deux centrioles (en vert foncé) sont perpendiculaires et mesurent, chez les mammifères, ~0,2 μm de diamètre et ~0,5 μm de long. Le matériel péricentriolaire (en mauve) s'accumule autour des deux centrioles. Dans la majorité des cellules animales, les centrioles sont formés de neuf triplets de microtubules. Chez la drosophile, les centrioles sont plus courts (~0,2 μm) que chez les vertébrés, et présentent des différences de structure au cours du dévelop-pement. Les microtubules sont nucléés à partir des complexes contenant la tubuline γ (en rose) dans le matériel péricentriolaire à proximité des centrioles. Les extrémités moins des microtubules sont ancrées au centrosome. (b) Micrographie électronique d'un centrosome dans une cellule de mammifère (Rieder et al., 2001). PCM : matériel péricentriolaire. Barre d'échelle, 0,2 μm.

(a) (b)

centriole

centriole PCM

matériel péricentriolaire

centrioles

microtubules

+

+

+

+

++

+

+

--

-- -

--

-COMPLEXES TUBULINE γ

8

deux autres MTOCs, les iMTOCs (MTOCs interphasiques) et les eMTOCs (MTOCs

équatoriaux), dont les structures sont mal connues, interviennent dans la nucléation des

microtubules (Figure 5B) (Sawin and Tran, 2006). Les microtubules dans les plantes

supérieures ne possèdent pas de MTOCs typiques avec un structure définie. Dans ces

organismes, en interphase, certains microtubules sont nucléés de façon radiaire à partir de

l’enveloppe nucléaire et d’autres au niveau de la zone corticale (Bartolini and Gundersen,

2006; Schmit, 2002). Récemment, il a été montré dans des cellules de tabac en culture et

chez Arabidopsis que les microtubules du réseau cortical sont assemblés à partir de

microtubules pré-existants (Murata and Hasebe, 2007; Murata et al., 2005).

Il existe également des sites non-centrosomaux d’organisation des microtubules dans

certains types de cellules différenciées. Dans les cellules musculaires, épithéliales,

neuronales et ciliées le centrosome existe mais cesse d’être le centre organisateur principal

(Figure 5C) (Bartolini and Gundersen, 2006). Par exemple dans les cellules musculaires, la

nucléation ne se fait plus via le centrosome mais majoritairement à partir de l’enveloppe

nucléaire (Bugnard et al., 2005; Tassin et al., 1985). D’autre part, dans des ovocytes de

souris ou de drosophile à certains stades du développement, les MTOCs sont totalement

dépourvus de centrioles (Gueth-Hallonet et al., 1993; Raff, 2004) mais génèrent des

microtubules capables de former un fuseau mitotique bipolaire. Il en est de même pour une

lignée de cellules de drosophile acentriolaires d’origine embryonnaire (Debec et al., 1995).

Quels que soient le type cellulaire et l’organisme, une caractéristique commune aux

MTOCs de différents types morphlogiques est la présence de tubuline γ [Voir ANNEXE

2 : Localisations de la tubuline γ et MTOCs].

Figure 5 : A. Le Spindle Pole Body (SPB). (a) Représentation schématique d'un SPB. Les complexes contenant la tubuline γ sont présents au niveau des plaques externes (en rouge) et internes (en rose). Les extrémités moins des microtubules sont ancrées au SPB. (b) Micrographie électronique d'une section de SPB. Pext : plaque externe, Pcent : plaque centrale, Pint : plaque interne. Barre d'échelle, 0,1 μm. (Adams et al., 2000).B. Organisation des microtubules chez S. pombe. Les microtubules sont verts, les MTOCs rouges et l'envel-lope nucléaire bleue. (a) En interphase, les iMTOCs ancrent l'extrémité moins des microtubules à l'enveloppe nucléaire ou au niveau de microtubules existants, parfois les iMTOCs peuvent être libres dans le cytoplasme. Les extrémités "plus" sont souvent vers le cortex de la cellule. (b) En mitose, les microtubules du fuseau à l'intérieur du noyau et les microtubules astraux à l'extérieur sont nucléés à partir du SPB. (c) A la fin de la mitose, les eMTOCs se forment dans la zone équatoriale et nucléent un nouveau réseau de microtubules (Sawin et Tran, 2006). C. Organisation non-centrosomale des microtubules. Représentation schématique de l'organisation des microtubules dans des systèmes où l'organisation est non-centrosomale : les cellules différenciées de type épithé-liales, neuronales et musculaires, les cellules de plante, et la levure S. Pombe (Bartolini et Gundersen, 2006).

A

(a) (b)

cellule épithéliale neurone plante supérieure

myotube S. Pombe

noyau

microtubules

centrioles

matériel péricentriolaire

protéines d’ancrage

SPBmatériel nucléant

B(a)

(b)

(c)

C

+

plaque externe

plaque interne

enveloppe nucléaire

plaque centrale

microtubules chromosomaux

microtubules polaires

microtubules cytoplasmiques

γ-TUBULIN COMPLEXES

γ-TUBULIN COMPLEXES

NOYAU

CYTOPLASME

++ +

+ +

microtubulesnucléaires

Pext

Pint

Pcent

+ +

9

II- La tubuline γ

1) Découverte et conservation de la tubuline γ

En 1989, un crible génétique chez Aspergillus nidulans destiné à rechercher des

gènes suppresseurs d’une mutation dans le gène benA de la tubuline β, qui conduit à une

hyperstabilisation des microtubules, a permis d’isoler le suppresseur mipA (microtubule

interacting protein) (Oakley and Oakley, 1989). Ce gène code une protéine de 454 acides

aminés appelée tubuline γ qui présente environ 30% d’identité en acides aminés avec les

tubulines α et β et qui constitue ainsi une troisième famille dans la superfamille des

tubulines. La détermination de la structure de la tubuline γ lié à un GTP non échangeable

avec une résolution de 2.7 Å en 2005 par Aldaz et al. a confirmé une structure similaire à

celle des tubulines α et β (Aldaz et al., 2005; Nogales et al., 1998). Les ADNc de ce gène

ont été clonés chez de nombreux eucaryotes. La tubuline γ est très conservée dans des

organismes évolutivement éloignés, tels que les plantes supérieures (Arabidopsis, maïs)

(Liu et al., 1994; Lopez et al., 1995), le champignon S. pombe (Horio et al., 1991), les

animaux (drosophile, xénope et homme) (Stearns et al., 1991; Zheng et al., 1991), mais

aussi les protistes comme Physarum, Trypanosoma ou Paramecium (Lajoie-Mazenc et al.,

1996; Liang et al., 1996; Scott et al., 1997). Les tubulines γ possèdent plus de 65%

d’identité en acides aminés entre elles (Joshi, 1994). Par exemple, la tubuline γ humaine

possède 78% d’identité avec la tubuline γ de drosophile et 98% avec celle du xénope

(Zheng et al., 1991). Cette conservation de séquence s’accompagne d’une conservation

fonctionnelle puisque l’expression de la tubuline γ humaine dans un mutant deleté pour la

tubuline γ chez S. pombe restaure le phénotype sauvage (Horio and Oakley, 1994). Deux

organismes ont des tubulines γ divergentes par rapport aux tubulines γ dites « classiques »

ou « conventionnelles », Caenorhabditis elegans et S. cerevisae (Tub4p). Leur tubuline γ

ne présentent respectivement que 40 et 36% d’identité avec les autres tubulines γ et

10

seulement 30% d’identité entre elles (Bobinnec et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995). Les

données concernant la fonction de ces deux tubulines dans l’organisation des microtubules

et leur localisation aux MTOCs suggèrent qu’elles appartiennent à la même famille.

Cependant, les mutations dans le gène TUB4 de S. cerevisiae ne sont pas complémentées

par les gènes de tubuline γ humaines ou de xénope. Ces divergences peuvent être dues à des

différences dans le nombre ou la nature de leurs partenaires protéiques.

Il existe aussi une hétérogénéités de tubulines γ au sein d’un même organisme dues à

l’existence de plusieurs gènes et aux modifications post-traductionnelles.

Chez Paramecium, Arabidopsis, la drosophile, la souris et l’homme, deux gènes

codant la tubuline γ ont été caractérisés (Liu et al., 1994; Ruiz et al., 1999; Wise and

Oakley, 1997; Yuba-Kubo et al., 2005 ; Zheng et al., 1991). Trois gènes codent la tubuline

γ chez le maïs (Lopez et al., 1995). Les différents gènes de tubuline γ au sein d’un

organisme présentent plus de 95% d’identité en acides aminés, excepté chez la drosophile

où les deux tubulines γ, γ23C et γ37CD, ne partagent que 83% d’identité (Raynaud-

Messina et al., 2001; Tavosanis et al., 1997; Wilson et al., 1997). Ces deux protéines ont un

profil d’expression différent au cours du développement. La tubuline γ23C est ubiquitaire

alors que la tubuline γ37CD est spécifiquement exprimée au cours de l’ovogenèse et dans

les embryons précoces (Tavosanis et al., 1997; Wilson et al., 1997). Dans les cellules S2 de

drosophile en culture, la tubuline γ37CD est très minoritaire et présente dans la fraction

centrosomale. Contrairement à la tubuline γ23C recrutée au centrosome en mitose, la

quantité de la tubuline γ37CD au centrosome ne varie pas au cours du cycle cellulaire

(Raynaud-Messina et al., 2001).

Des analyses par électrophorèse mono et bidimensionnelle à partir d’extraits de

cellules de mammifères ou de drosophile ont permis la détection de 6 à 8 polypeptides

correspondant à la tubuline γ suggérant l’existence de modifications post-traductionnelles

(Détraves et al., 1997; Lajoie-Mazenc et al., 1996). La tubuline γ est mono-ubiquitinylée

dans les cellules humaines et phosphorylée in vivo chez S. cerevisiae (Starita et al., 2004;

Vogel et al., 2001). Ces modifications post-traductionnelles de la tubuline γ suggèrent une

régulation de la fonction de cette protéine au cours du cycle cellulaire.

11

2) Localisations de la tubuline γ

La tubuline γ est une protéine majoritairement cytoplasmique qui ne correspond qu’à

0.01% des protéines solubles alors que les tubulines α et β représentent 1% des protéines

solubles. Dès 1990, Oakley et Oakley ont montré que la tubuline γ était localisée au SPB

pendant tout le cycle cellulaire chez Aspergillus (Oakley et al., 1990). Cette localisation a

été retrouvée dans l’ensemble des organismes eucaryotes ayant un MTOC bien défini

(Horio et al., 1991; Sobel and Snyder, 1995). Dans les cellules humaines, de souris, de

xénope et de drosophile, la tubuline γ est présente dans les PCMs (Joshi et al., 1992;

Raynaud-Messina et al., 2001; Stearns et al., 1991; Zheng et al., 1991). De plus, une

fraction mineure de la tubuline γ est associée aux centrioles (Fuller et al., 1995).

Des expériences de photo-blanchissement réalisées sur des lignées stables de

cellules épithéliales de rein de rat kangourou exprimant la tubuline γ en fusion avec la GFP

(Green Fluorescent Protein) ont mis en évidence deux populations centrosomales qui n’ont

pas le même taux d’échange avec la tubuline γ cytoplasmique. La population liée aux

centrioles pourrait correspondre à la population de tubuline γ la plus stable (Khodjakov and

Rieder, 1999). La quantité de tubuline γ présente au centrosome varie au cours du cycle

cellulaire : elle augmente en début de mitose, diminue dans les phases post-métaphasiques

pour atteindre le niveau basal de l’interphase. Le recrutement de la tubuline γ au

centrosome pendant la mitose est indépendant de microtubules (Khodjakov and Rieder,

1999; Lajoie-Mazenc et al., 1994; Marschall et al., 1996). Contrairement à la majorité des

cellules eucaryotes, la tubuline γ n’est pas détectée au niveau d’une structure centrosomale

dans les cellules S2 en interphase, malgré la présence de centrioles (Martinez-Campos et

al., 2004) (données non publiées) (Figure 6). Par contre, comme dans les autres cellules

animales, elle est recrutée aux pôles du fuseau en mitose quelque soit leur morphologie.

Elle se localise aux pôles des fuseaux acentriolaires d’ovocytes de souris en méiose II et

d’une lignée de cellules somatiques acentriolaires issue d’embryons de drosophile (Debec

et al., 1995; Gueth-Hallonet et al., 1993; Raff, 2004).

Figure 6 : Localisation de la tubuline γ au cours du cycle cellulaire dans les cellules S2 de Droso-phile en culture. Les cellules ont été étalées sur des lamelles de verre traitées avec de la concanava-line A, puis fixées et immunomarquées. Les microtubules sont marqués en rouge, la tubuline γ en vert (anticorps polyclonal de lapin R62 dirigé contre la tubuline de drosophile) et l'ADN en bleu (DAPI). Dans ce type cellulaire, la tubuline γ est répartie dans tout le cytoplasme en interphase. Elle est locali-sée aux centrosomes en fin de G2, et aux pôles du fuseau tout au long de la mitose. La tubuline γ est aussi présente le long des microtubules du fuseau et au niveau du fuseau central en fin de mitose. Photos prises au laboratoire avec un microscope Olympus couplé au sytème Deltavision RT. Barre d'échelle, 5 μm.

interphase fin de phase G2 prophase

métaphase début d’anaphase fin d’anaphase

tubuline γ, MTs, DNA

tubuline γ

télo

phas

e

12

La tubuline γ est également détectée le long des microtubules. En mitose, elle est

localisée sur les microtubules du fuseau dans les cellules de mammifères, les cellules de

drosophile et chez les plantes supérieures (Drykova et al., 2003; Khodjakov and Rieder,

1999; Lajoie-Mazenc et al., 1994; Liu et al., 1993; Raynaud-Messina et al., 2001; Raynaud-

Messina et al., 2004 ), préférentiellement associée aux microtubules kinétochoriens

(Drykova et al., 2003; Lajoie-Mazenc et al., 1994). De plus, elle s’accumule aux extrémités

moins des microtubules du fuseau central dans la zone de séparation des deux cellules filles

en télophase (Julian et al., 1993) (Figure 6). En interphase, la tubuline γ se localise sur les

microtubules chez S. pombe et chez les plantes. En microscopie, la tubuline γ ou les

protéines qui lui sont associées sont observées à des sites de branchements des

microtubules qui pourraient correspondre à des MTOCs secondaires (c’est à dire des sites

de nucléation/ancrage des microtubules tels que les iMTOCs chez S. pombe) (Liu et al.,

1993; Murata et al., 2005; Sawin and Tran, 2006 ). De manière comparable, dans les

cellules épithéliales polarisées humaines, la tubuline γ se localise le long des microtubules

cytoplasmiques dans des zones sous-corticales (Meads and Schroer, 1995; Raynaud-

Messina and Merdes, 2007; Reilein et al., 2005).

Les localisations de la tubuline γ sur différents éléments du cytosquelette

microtubulaire suggèrent une diversité de fonctions. De plus, dans des cellules de

mammifères, elle a été détectée au niveau de l’appareil de Golgi et dans des foci nucléaires

(Lesca et al., 2005; Rios et al., 2004). Ces localisations subcellulaires de la tubuline γ mises

en évidence récemment suggèrent qu’elle pourrait avoir des rôles dans des processus

indépendants des microtubules.

3) Fonctions de la tubuline γ

La tubuline γ est une protéine essentielle à la viabilité. Les mutants nuls des gènes

de la tubuline γ chez les champignons (Aspergillus, S. pombe et S. cerevisiae) et chez la

souris ne sont pas viables (Horio et al., 1991; Oakley et al., 1990; Paluh et al., 2000; Sobel

13

and Snyder, 1995; Yuba-Kubo et al., 2005). Chez la drosophile qui possède deux tubulines

γ, les mutations du gène codant la protéine γ37CD ne sont pas létales mais entraînent la

stérilité des femelles (Schnorrer et al., 2002; Sunkel et al., 1995; Tavosanis and Gonzalez,

2003; Tavosanis et al., 1997). Au cours de l’ovogenèse, la localisation de déterminants

maternels est affectée dans le mutant de tubuline γ37CD, suggérant que la tubuline γ37CD

est impliquée dans l’organisation de sous-réseaux de microtubules (Schnorrer et al., 2002;

Tavosanis and Gonzalez, 2003). L’étude de la fonction de la tubuline γ37CD dans les

cellules S2, dans lesquelles cette protéine est minoritaire, s’est avérée impossible car sa

déplétion par RNAi est inefficace (Raynaud-Messina et al., 2001; Raynaud-Messina et al.,

2004). Au contraire, le gène γ23C auquel je m’intéresserai est essentiel (Sunkel et al.,

1995). La déplétion et la surexpression de la tubuline γ dans des lignées cellulaires

humaines ou des cellules de drosophile en culture sont létales (Joshi et al., 1992; Raynaud-

Messina et al., 2004; Shu and Joshi, 1995). De nombreux travaux réalisés sur la tubuline γ

ont permis d’aborder sa fonction. Elle est essentielle pour la nucléation et l’organisation des

microtubules, en particulier en mitose où une réorganisation complète des microtubules et

une nucléation de nouveaux microtubules est indispensable à la formation du fuseau.

• Rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules

La tubuline γ humaine traduite in vitro a la capacité de se lier avec l’extrémité moins

des microtubules. Elle co-sédimente avec les microtubules de façon proportionnelle au

nombre d’extrémités présentes (Li and Joshi, 1995). La localisation de la tubuline γ à

l’extrémité moins suggère une fonction de nucléation des microtubules. In vitro, les

tubulines α et β sont capables de s’assembler en microtubules, cependant la tubuline γ

monomérique, purifiée à partir de lysats de réticulocytes, favorise la nucléation en

diminuant le temps de latence et la concentration critique de tubulines α/β permettant

l’initiation de l’assemblage (Leguy et al., 2000). Le rôle de la tubuline γ dans la nucléation

des microtubules a également été démontré par deux essais de nucléation in vitro dans des

extraits d’œufs de xénope. Dans les embryons de xénope, les centrosomes dérivent des

centrioles apportés par les têtes de spermatozoïdes. Ces centrioles deviennent des

centrosomes fonctionnels permettant la formation d’asters de microtubules une fois que les

14

protéines maternelles présentes dans l’œuf, telle que la tubuline γ, sont recrutées. In vitro,

l’appauvrissement en tubuline γ par incubation des extraits avec des anticorps, empêche les

centrioles des spermatozoïdes démembranés de devenir des centrosomes fonctionnels pour

la nucléation (Félix et al., 1994; Stearns and Kirschner, 1994).

Des expériences comparables ont été réalisées sur des centrosomes isolés de

drosophile. Un traitement à l’iodure de potassium (KI) permet l’extraction de protéines du

PCM dont la tubuline γ et réduit l’activité de nucléation des microtubules. Après incubation

des centrosomes isolés traités au KI avec des extraits d’embryons, le recrutement de la

tubuline γ est restauré, ainsi que la capacité à nucléer les microtubules. Après

immunodéplétion des complexes contenant la tubuline γ, l’extrait n’est plus capable de

réactiver les centrosomes (Moritz et al., 1998). Ainsi, la formation d’un centrosome

fonctionnel pour la nucléation des microtubules nécessite la tubuline γ.

Le rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules a été confirmé par un

ensemble d’expériences in cellulo et in vivo.

Dans des cellules humaines ou de souris, la microinjection d’anticorps dirigés contre

la tubuline γ, après désassemblage des microtubules par le nocodazole ou par le froid,

réduit fortement la re-formation d’un réseau microtubulaire interphasique (Joshi et al.,

1992). Des cellules humaines microinjectées avec les mêmes anticorps avant et pendant la

mitose ne sont pas capables d’établir un fuseau fonctionnel (Joshi et al., 1992; Julian et al.,

1993). La tubuline γ est donc nécessaire à la nucléation des microtubules tout au long du

cycle cellulaire chez les mammifères. L’inhibition par RNAi de 98% du niveau

d’expression de la tubuline γ dans des embryons de Caenorhabditis elegans diminue la

densité des microtubules et la re-nucléation après désassemblage par le froid est fortement

ralentie (Hannak et al., 2002; Strome et al., 2001). Bien que l’assemblage spontané de

tubulines α/β puisse permettre la formation partielle d’un réseau microtubulaire, le

mécanisme dépendant de la tubuline γ au centrosome est cinétiquement et quantitativement

dominant (Raynaud-Messina et al., 2004; Strome et al., 2001).

De plus, la surexpression de la tubuline γ d’un facteur 100 dans les cellules animales

entraîne une augmentation du nombre de microtubules nucléés de manière ectopique (Shu

15

and Joshi, 1995). Dans 20% des cellules transfectées, la tubuline γ s’assemble en une

structure tubulaire de 50nm de diamètre résistante au désassemblage par le froid et le

nocodazole. Par contre, la surexpression de la protéine Tub4p d’un facteur 300 chez S.

cerevisiae n’affecte pas le nombre et l’organisation des microtubules (Marschall et al.,

1996). Cela peut s’expliquer par les divergences au niveau de la séquence en acides aminés

entre la tubuline γ humaine et celle de S. cerevisiae.

In vivo, dans la plupart des organismes étudiés, tels que les champignons

(Aspergillus, S. pombe et S. cerevisiae) ou la drosophile, la densité des microtubules est

réduite lorsque le niveau tubuline γ est diminué (Horio et al., 1991; Marschall et al., 1996;

Martin et al., 1997; Oakley et al., 1990; Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995), ce qui est

en accord avec un rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules in vivo.

La tubuline γ intervient aussi lors de la nucléation des microtubules à des sites non-

centrosomaux dans certaines organismes ou types cellulaires. Par exemple, une fraction de

tubuline γ se localise le long des microtubules cytoplasmiques chez S. pombe et des

microtubules du réseau sous-cortical dans les cellules végétales. Elle est observée au niveau

de branchements des microtubules et interviendrait dans la nucléation de nouveaux

microtubules (Janson et al., 2005; Murata and Hasebe, 2007; Murata et al., 2005; Sawin

and Tran, 2006). Contrairement aux cellules sauvages, dans des cellules S. pombe mutantes

pour la protéine mto1p associée à la tubuline γ, aucun nouveau microtubule cytoplasmique

n’est observé après le retrait du Méthyl-Benzidazole-Carbamate (MBC), une substance qui

désassemble les microtubules (Janson et al., 2005). Des membranes isolées de cellules de

tabac contenant les microtubules corticaux incubées avec des extraits cytosoliques

contenant la tubuline γ fixent celle-ci au niveau des microtubules et permet la nucléation de

nouveaux microtubules. L’immunodéplétion de la tubuline γ dans ces extraits inhibe

l’activité de nucléation de 4 fois (Murata et al., 2005). D’autre part, l’incubation

d’anticorps dirigés contre la tubuline γ ou ses partenaires avec des noyaux isolés de cellules

de tabac inhibe l’assemblage des microtubules au niveau de l’enveloppe nucléaire (Erhardt

et al., 2002).

16

Dans certaines cellules différenciées, la tubuline γ nuclée des microtubules à des

sites atypiques. Par exemple dans les myoblastes de souris en cours de différenciation, la

tubuline γ du centrosome se relocalise au niveau de l’enveloppe nucléaire. L’injection

d’anticorps dirigés contre la tubuline γ dans les myotubes (myoblastes différenciés) après

désassemblage des microtubules par le froid, affecte la re-nucléation à partir de l’enveloppe

nucléaire (Bugnard et al., 2005; Tassin et al., 1985).

• Rôle de la tubuline γ dans l’organisation du fuseau de division cellulaire

De nombreuses observations in vivo ont montré le rôle de la tubuline γ lors de la

formation du fuseau mitotique.

L’inhibition de la synthèse de la tubuline γ par RNAi dans des cellules de drosophile

et chez Caenorhabditis, ainsi que sa perte de fonction in vivo chez la drosophile, la souris et

les champignons (S. pombe, S. cerevisiae, Aspergillus) conduit à une augmentation de

l’index mitotique d’au moins 3 fois due à une accumulation des cellules en mitose

présentant des anomalies dans l’organisation des fuseaux (Horio et al., 1991; Martin et al.,

1997; Paluh et al., 2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Sobel and Snyder, 1995; Spang et

al., 1996; Strome et al., 2001; Sunkel et al., 1995; Yuba-Kubo et al., 2005). Dans les

cellules S2 de drosophile en culture pour lesquelles plus de 95% de la tubuline γ est

déplétée, 60% des fuseaux sont monopolaires. Les 40% restants sont des fuseaux bipolaires

allongés ou en forme de « tonneau » c’est à dire avec des pôles mal focalisés. Ces fuseaux

sont toujours dépourvus de microtubules astraux (Raynaud-Messina et al., 2004) (Figure 7).

L’absence ou le dysfonctionnement des microtubules interpolaires peut rendre compte de la

non séparation des pôles conduisant à des fuseaux monopolaires. Dans les cellules

accumulées en prométaphase/métaphase après déplétion de la tubuline γ et dans les

neuroblastes mutants, les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque

métaphasique. La présence aux kinétochores de marqueurs de l’activation du point de

contrôle, tel que BubR1, montre que le point de contrôle mitotique reste activé (Raynaud-

Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995). Chez Aspergillus et S. pombe, la perte de

fonction de la tubuline γ affecte également l’alignement et la ségrégation des chromosomes,

Figure 7 : Défauts d'organisation des fuseaux mitotiques observés après déplétion de la tubu-line γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. A. Cellules contrôles. B-D. Cellules traitées par RNAi contre la tubuline γ. A -C. Les microtubules sont marqués en rouge, la tubuline γ en vert et les chromosomes en bleu. Les fuseaux dans les cellules contrôles sont bipo-laires et possèdent des microtubules astraux (têtes de flèche blanches). La tubuline γ est présente aux pôles et sur les microtubules du fuseau. Après déplétion de la tubuline γ, les fuseaux sont mono-polaires (B) ou bipolaires avec des pôles non focalisés (C). Les microtubules astraux sont absents (C). D. Les cellules traitées s'accumulent en prométaphase avec un marquage fort du marqueur du point de contrôle mitotique BubR1. Les microtubules sont marqués en rouge et BuBR1 en vert (Raynaud et al., 2004).

BA

C D

17

suggérant que les microtubules kinétochoriens pourraient être affectés (Paluh et al., 2000;

Prigozhina et al., 2004; Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995).

Ces anomalies engendrent une mauvaise séparation des chromosomes, induisant de

l’aneuploïdie dans les différents mutants de tubuline γ (Horio et al., 1991; Marschall et al.,

1996; Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995).

Bien que les phénotypes mitotiques observés en absence de tubuline γ soient sévères,

des microtubules sont toujours présents, soit grâce à la présence d’une fraction résiduelle de

tubuline γ au centrosome, soit grâce à d’autres mécanismes de nucléation des microtubules

indépendants de la tubuline γ. Différents mécanismes d’assemblage des microtubules ont

été décrits [Voir I-3) et ANNEXE 2 : Localisations de la tubuline γ et MTOCs]. Cependant,

il n’est pas exclu que ces mécanismes nécessitent aussi la tubuline γ.

La déplétion par RNAi de la tubuline γ dans les cellules S2 de drosophile a permis

de mettre en évidence un nouveau mécanisme d’assemblage des microtubules via

l’élongation des microtubules centriolaires (Figure 8). Ce mécanisme pourrait être présent

dans des conditions normales et révélé en absence de tubuline γ (Raynaud-Messina et al.,

2004). L’incapacité du PCM à nucléer des microtubules et l’implication de ce mécanisme

alternatif d’assemblage unidirectionnel est en accord avec l’observation de fuseaux

monopolaires et l’absence de microtubules astraux. Une fraction plus stable de tubuline γ

localisée au centriole pourrait résister au traitement RNAi et être responsable de la

nucléation par élongation des microtubules centriolaires (Fuller et al., 1995; Khodjakov and

Rieder, 1999).

Mahoney et al. ont analysé en temps réel les mécanismes de nucléation à l’aide de

lignées de cellules de drosophile en culture exprimant la +TIP EB1 couplée à la GFP. La

déplétion par RNAi de la tubuline γ dans les cellules S2, qui affecte toutes les localisations

de la tubuline γ en mitose (pôles et microtubules du fuseau), diminue la densité

d’extrémités plus marquées par EB1-GFP de microtubules provenant des microtubules du

fuseau et de la chromatide (Mahoney et al., 2006). D’une part, ces expériences suggèrent

que la tubuline γ associée aux microtubules du fuseau pourrait permettre la nucléation de

Figure 8 : Elongation des microtubules centriolaires après déplétion de la tubuline γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. Photo de microscopie électronique des pôles de fuseaux monopolaires en absence de tubuline γ. Les têtes de flèche noires montrent l'élongation des microtubules à partir du centriole. Barre d'échelle, 0.2 μm (Raynaud et al., 2004).

18

microtubules. D’autre part, plusieurs autres expériences suggèrent un rôle de la tubuline γ

dans l’assemblage des microtubules à proximité des chromosomes. L’immunodéplétion de

la tubuline γ empêche la nucléation des microtubules via Ran et TPX2 dans des extraits

d’œufs de xénope et in vitro dans un essai d’assemblage à partir de tubuline α/β pure

(Groen et al., 2004; Wilde and Zheng, 1999). La tubuline γ et TPX2 co-précipitent et co-

localisent avec XRHAMM, une MAP nécessaire à la formation du fuseau à partir des

chromosomes (Groen et al., 2004). TPX2 pourrait activer la tubuline γ afin de nucléer les

microtubules. De plus, la déplétion de Nedd1, une protéine associée à la tubuline γ et

nécessaire à son recrutement au centrosome et le long des microtubules du fuseau dans des

cellules de mammifères, retarde la re-nucléation des microtubules après désassemblage au

froid non seulement à partir du centrosome mais aussi à partir de l’ADN (Haren et al.,

2006; Luders et al., 2006). La tubuline γ pourrait donc intervenir de manière directe ou

indirecte dans tous les mécanismes connus d’assemblage des microtubules pour la

formation du fuseau mitotique.

La fonction de la tubuline γ dans les phases post-métaphasiques est difficile à

analyser car sa déplétion entraîne des défauts qui activent le point de contrôle mitotique.

Elle n’a pu être analysée que dans les cellules de mammifères et in vivo chez la drosophile.

Dans les cellules humaines, l’injection d’anticorps contre la tubuline γ en anaphase ou la

déplétion partielle par injection d’ARN antisens, empêche la formation du fuseau central

entre les deux cellules filles (Julian et al., 1993; Shu et al., 1995). La tubuline γ localisée au

niveau du fuseau central pourrait participer à la nucléation ou à l’organisation des

microtubules nécessaires à la formation de cette structure. L’analyse des spermatocytes de

drosophile pour lesquels le point de contrôle mitotique est peu stringent a permis d’étudier

le rôle de la tubuline γ dans les phases post-métaphasiques in vivo. Dans les spermatocytes

des mutants de tubuline γ23C, le fuseau central en télophase est mal organisé, et la

cytocinèse est abortive ou très asymétrique (Sampaio et al., 2001). Ces défauts pourraient

résulter d’une implication directe de la tubuline γ dans le processus de cytocinèse mais

aussi d’anomalies plus précoces dans l’organisation du fuseau de division

19

• Rôle de la tubuline γ dans la maturation/duplication des centrosomes

Dans les cellules S2 de drosophile et in vivo dans les mutants drosophile, la tubuline

γ est essentielle pour la maturation du PCM en mitose (Raynaud-Messina et al., 2004;

Sunkel et al., 1995). La protéine CP190 est nucléaire en interphase. Elle se relocalise au

centrosome en mitose mais est absente des pôles des fuseaux dans des cellules

acentriolaires (Debec et al., 1995; Whitfield et al., 1988). Après déplétion de la tubuline γ

in vivo et in cellulo, CP190 est toujours recrutée aux pôles du fuseau mais le marquage est

anormal : 50% des fuseaux bipolaires sont marqués à un seul pôle et les fuseaux

monopolaires présentent un nombre variable de points CP190 allant jusqu’à 4. Comme

pour CP190, la forme, la taille et la symétrie du marquage centrosomine (Cnn), une autre

protéine recrutée aux pôles des fuseaux, sont anormales (Megraw et al., 1999) (Figure 9).

De plus, dans les neuroblastes de drosophile dont la tubuline γ est mutée ou dans les

cellules traitées par RNAi, un seul centriole ou plus de deux centrioles sont présents à un

même pôle en microscopie électronique (Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al.,

1995). Les centrioles sont plus courts que dans les cellules contrôles (Raynaud-Messina et

al., 2004). Ceci suggère un rôle de la tubuline γ dans la biogenèse, la séparation ou la

duplication des centrosomes.

Le rôle de la tubuline γ dans la duplication des centrioles a été bien caractérisé chez

Paramecium, un organisme caractérisé par un nombre très important de corps basaux

morphologiquement similaires aux centrioles. L’inactivation du gène codant la tubuline γ

induit un arrêt de la croissance cellulaire et un blocage de la duplication des corps basaux

(Ruiz et al., 1999). Ces données peuvent être mises en rapport avec la localisation de la

tubuline γ au niveau des centrioles et des corps basaux dans les cellules ciliées épithéliales

et chez Paramecium (Fuller et al., 1995; Muresan et al., 1993; Ruiz et al., 1999).

Enfin, chez Caenorhabditis, la tubuline γ joue non seulement un rôle dans la stabilité

des centrioles mais aussi dans l’assemblage du centriole fils lors de la duplication

(Dammermann et al., 2004).

Figure 9: Caractérisation des pôles avec différents marqueurs après déplétion de la tubuline γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. A. Fuseaux monopolaires. B. Fuseaux bipolaires anormaux. Les microtubules sont marqués en rouge, les chromosomes en bleu et les protéines du pôle en vert. Les marquages verts correspondent aux protéines Asp, CP190 et CNN. En absence de tubuline γ, le marquage Asp est diffus ou ponctué, le marquage CP190 est affaibli (par rapport aux contrôles non représentés) et le marquage CNN est asymétrique ou/et ponctué. Barre d'échelle, 5 μm (Raynaud et al., 2004).

BA

20

• Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules

In vitro, la tubuline γ monomérique ou sous forme de complexe se lie à l’extrémité

moins des microtubules et réduit la dynamique d’assemblage/réassemblage à cette

extrémité (Keating and Borisy, 2000; Leguy et al., 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and

Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). D’autres analyses suggèrent que la tubuline γ pourrait

réguler également la dynamique de l’extrémité plus des microtubules. In vivo, la perte de

fonction par mutation de la tubuline γ chez S. cerevisiae et S. pombe entraîne un

allongement des microtubules cytoplasmiques qui se courbent en arrivant au cortex

cellulaire (Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al.,

1996). En mitose dans des mutants S. pombe, les microtubules astraux sont anormalement

longs (Paluh et al., 2000). In vivo, des cellules de S. pombe exprimant la tubuline α couplée

à la GFP et mutantes pour la tubuline γ montrent des microtubules cytoplasmiques en

interphase et des microtubules astraux lors de la mitose moins dynamiques (Paluh et al.,

2000). Des études plus récentes chez S. cerevisiae montrent que la tubuline γ serait un

facteur de déstabilisation des extrémités plus des microtubules astraux en mitose (Cuschieri

et al., 2006). Dans des cellules mutantes pour la tubuline γ, les microtubules passent 3 fois

plus de temps en pause que dans des cellules sauvages. Ceci pourrait s’expliquer par la

présence d’une fraction de tubuline γ le long des microtubules, comme c’est le cas chez S.

pombe (Sawin and Tran, 2006).

• Rôle de la tubuline γ dans le point de contrôle mitotique

Des travaux montrent que la tubuline γ pourrait réguler le point de contrôle

mitotique indépendamment des microtubules. Chez Aspergillus, des cellules mutantes pour

la tubuline γ ne sont pas totalement bloquées en mitose, bien que l’organisation des fuseaux

soient anomale, et ce même lorsque les microtubules sont déassemblés par le MBC

(Prigozhina et al., 2004). De plus, l’expression d’un mutant de la tubuline γ humaine dans

des cellules de S. pombe dont le gène endogène est inactivé n’affecte pas le passage de la

mitose malgré la présence de fuseaux anormaux (Hendrickson et al., 2001).

21

4) Régulation des fonctions de la tubuline γ

L’existence de différents isotypes et de modifications post-traductionnelles de la

tubuline γ suggèrent une régulation des fonctions de la tubuline γ au cours du

développement et du cycle cellulaire.

Par exemple chez la drosophile, il existe deux gènes codant la tubuline γ. Le gène

γ23C est essentiel à la viabilité et à l’organisation d’un fuseau mitotique fonctionnel tandis

que le deuxième isotype de tubuline γ, la tubuline γ37CD, est non essentiel et son

expression est contrôlée au cours du développement. Les études au cours de l’ovogenèse

ont montré que les femelles mutantes pour la tubuline γ37CD sont stériles et qu’il n’existe

qu’une redondance partielle entre les deux isotypes à ce stade du développement

(Tavosanis and Gonzalez, 2003).

La migration de la tubuline γ sur gel 2D montre des spots différents dans la partie

soluble et dans la partie liée à la fraction du cytosquelette suggérant des modifications post-

traductionnelles différentes (Détraves et al., 1997; Lajoie-Mazenc, 1994; Moudjou et al.,

1996). La tubuline γ est phosphorylée in vivo (Vogel et al., 2001). Chez S. cerevisiae, elle

est phosphorylée pendant la phase G1 et déphosphorylée en mitose sur la tyrosine 445 dans

la région C-terminale de la protéine. Une délétion phospho-mimétique de ce résidu entraîne

une augmentation du nombre et de la stabilité des microtubules. Ainsi, la phosphorylation

régulerait la fonction de la tubuline γ dans la nucléation et/ou la dynamique des

microtubules. Cette tyrosine étant très conservée entre les organismes, cela pourrait

indiquer un mécanisme de régulation des fonctions de la tubuline γ très conservé au cours

de l’évolution (Vogel et al., 2001; Vogel and Snyder, 2000). D’autre part, la tubuline γ est

mono-ubiquitinylée sur les lysines 48 et 344 par le complexe BRCA1/BARD1 dans les

cellules de mammifères. Cette ubiquitination contrôlerait plutôt le rôle de la tubuline γ dans

la duplication des centrosomes en phase S (Starita et al., 2004).

22

Environ 80% de la tubuline γ totale existe sous forme soluble dans le cytoplasme et

sa sédimentation sur gradient de sucrose montre qu’elle n’est jamais monomérique mais

toujours dans des complexes multiprotéiques (Moudjou et al., 1996; Stearns and Kirschner,

1994; Zheng et al., 1995). La fonction de la tubuline γ pourrait donc être régulée par ses

différents partenaires et l’hétérogénéité des complexes dans lesquels elle se trouve.

23

III- De la tubuline γ aux complexes d’organisation des

microtubules

1) Caractérisation des complexes de tubuline γ

Le premier complexe de tubuline γ (γ-TuRC) a été isolé par immunoaffinité à partir

d’extraits de xénope (Zheng et al., 1995). Des complexes similaires ont été retrouvés dans

de nombreuses espèces. Une approche génétique chez S. cerevisiae a permis d’identifier les

premiers partenaires de la tubuline γ (Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997). Puis, des

approches essentiellement biochimiques ont mené à l’identification des protéines associées

à la tubuline γ chez les animaux. Les γ-TuRCs de drosophile sont les mieux caractérisés et

servent aujourd’hui de référence.

• γ-TuSCs et γ-TuRCs chez la drosophile

Dans le cytoplasme, la tubuline γ n’est pas détectée sous forme monomérique. Chez

la drosophile, elle se trouve sous la forme de deux complexes majeurs qui sont définis selon

leur coefficient de sédimentation en gradient de sucrose et leur composition protéique, le γ-

TuSC et le γ-TuRC (Figure 10). Le γ-TuSC possède un coefficient de sédimentation de 10S

et une masse d’environ 300KDa et le γ-TuRC est un complexe de 30S correspondant à une

masse d’environ 2200KDa. Des expériences biochimiques ont permis d’identifier les

protéines de ces complexes (Gunawardane et al., 2000; Gunawardane et al., 2003; Oegema

et al., 1999). L’approche a consisté à purifier les complexes par affinité avec des anticorps

dirigés contre la tubuline γ et à séparer les différentes protéines par électrophorèse sur gel

dénaturant. Les bandes ont été microséquencées ou utilisées pour produire des anticorps qui

ont permis de cribler des banques d’expression (Gunawardane et al., 2000; Oegema et al.,

1999). Le γ-TuSC est composé de deux molécules de tubuline γ associées à deux autres

protéines : Dgrip84 et Dgrip91. Le γ-TuRC contient plusieurs sous-unités de γ-TuSCs et au

moins 4 autres protéines caractérisées : Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD. Les

Dgrip163Dgrip128Dgrip91Dgrip84Dgrip75 + Dgp71WD

Tubuline γ

KDa205

112876956

38.5

5% 40%

Dgrip75, Dgrip128, Dgrip1

Dgp71WDγγ γγDgrip84, Dgrip91

Tubuline γ

Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163

Dgp71WD

Figure 10 : γ-TuSC et γ-TuRC chez la drosophile. A. Les γ-TuSCs et γ-TuRCs sont carac-tésirés par leur coefficient de sédimentation et leur composition protéique. Les complexes contenant la tubuline γ ont été immunopurifiés avec un anticorps dirigé spécifiquement contre la tubuline γ et fractionnés sur un gradient de sucrose (de 5 à 40%) dans 100mM de NaCl. 75μL de chaque fraction ont été analysés par SDS-PAGE et colorés au Bleu de Coomassie. (Oegema et al., 1999). Le γ-TuSC (10S) sédimente principalement dans les fractions 4 à 6, le γ-TuRC (30S) sédimente majoritairement dans les fractions 10 à 13. Au moins deux protéines sont détectables sous la bande correspondant à Dgrip84 (Dgrip75 et Dgp71WD). Les trois sous-unités du γ-TuSC, Dgrip84, Dgrip91 et la tubuline γ sont les plus abondantes dans le γ-TuRC. B. Modèle de représentation du γ-TuRC. Le complexe est représenté souvent dans cette forme en anneau au vu des expériences de microscopie électronique (Zheng et al., 1995). Ce modèle postule que 6 à 7 γ-TuSCs forment l'anneau et que les protéines Dgrip75, 128, 163 et Dgp71WD forment une coiffe.

24

trois protéines du γ-TuSC sont les protéines les plus abondantes dans le γ-TuRC (Figure

10).

Le γ-TuRC possède en microscopie électronique une forme en anneau qui lui

confère son nom de « ring complex » (Zheng et al., 1995).

• Identifications des protéines associées à la tubuline γ dans les autres

organismes (Figure 11)

Des complexes contenant la tubuline γ ont été caractérisés dans la plupart des

organismes (S. pombe, S. cerevisiae, plantes, xénope, mammifères). Les premières

protéines identifiées ont été Spc98 et Spc97 (pour Spindle pole components), les

homologues respectivement de Dgrip91 et Dgrip84 chez la levure S. cerevisiae. Le gène

SPC98 a été isolé par un crible d’interaction génétique avec le gène TUB4 de la tubuline γ

(Tub4p), et SPC97 par un crible d’interaction génétique avec SPC98 (Geissler et al., 1996;

Knop et al., 1997). Seul un complexe composé de Tub4p, Spc98 et Spc97 présentant les

caractéristiques du γ-TuSC a été mis en évidence chez S. cerevisiae.

Des analyses génétiques, par des cribles visant à rechercher des gènes qui altèrent la

polarité de croissance ou l’organisation des microtubules, ont permis l’identification de la

plupart des protéines associées à la tubuline γ chez S. pombe (Anders et al., 2006; Fujita et

al., 2002; Vardy and Toda, 2000). Certaines protéines sont très éloignées au niveau de leur

séquence primaire, en particulier mod21 qui présente moins de 20% de similarité avec

Dgrip128 de drosophile et GCP5 des mammifères (Anders et al., 2006).

Des expériences biochimiques similaires à celles réalisées chez la drosophile ou des

recherches d’homologies de séquences ont permis d’identifier la majorité des protéines

chez le xénope (Martin et al., 1998; Zhang et al., 2000), les mammifères (Fava et al., 1999;

Murphy et al., 2001; Murphy et al., 1998), les plantes supérieures (Arabidopsis), ainsi que

l’homologue de Dgrip75 chez S. Pombe (Venkatram et al., 2004) (Figure 11). Chez

Caenorhabditis, la seule séquence isolée, Cegrip-1, présente une grande divergence avec

les homologues Dgrip91 et GCP3 qui peut être corrélée avec la divergence existant entre la

tubuline γ de Caenorhabditis et celle des autres organismes. Cegrip-1 se localise au

Figure 11 : Protéines associées à la tubuline γ. Il existe une hétérogénéité dans la nomenclature utilisée pour les protéines associées à la tubuline γ. Le complexe γ-TuRC de drosophile est couramment utilisé comme référence car il est un des mieux caractérisés. Les complexes isolés d'embryons de drosophile (Oegema et al., 1999), d'oeufs de xénope (Zheng et al., 1995) et de cellules humaines (Murphy et al., 2001) forment des anneaux et sont appellés γ-TuRC pour "ring complex". Chez la drosophile et le xénope les noms sont Dgrip et Xgrip pour Drosophila et Xenopus suivi de leur poids moléculaire apparent ou calculé, sauf Dgp71WD qui n'appartient pas à la même famille. Chez les mammifères le nom vient de γ(G)-tubulin Complex Protein suivi d'un numéro dans l'ordre de leur identification. Pour les autres orga-nismes, le complexe est qualifié de γ-TuC. Tous les orthologues existent chez les plantes mais, mise à part AtSpc98p, leur interaction avec la tubuline γ n'a pas été démontrée (Εrhardt et al., 2002). Chez S. cerevisiae, Spc97 et Spc98 signi-fient Spindle Pole Body Component de masse moléculaire calculée 97 et 98 KDa. Chez S. pombe, les noms des protéi-nes viennent des cribles dans lesquels elles ont été découvertes (Vardy et Toda, 2000; Fujita et al., 2002; Anders et al., 2006). Pour Caenorhabditis, une seule protéine a été identifiée et la nomenclature est celle de la drosophile précédée de Ce pour l'espèce (Hannak, 2002). Les protéines du γ-TuSC sont en vert et les protéines du γ-TuRC en bleu (Wiese and Zheng, 2006).

Drosophile γ -TuSC γ -TuRC

Xénope γ-TuRC

Mammifères γ-TuRC

Plantes (Arabidopsis)

γ-TuC

S. Cerevisiae complexesTub4

S. Pombe γ-TuC

Caenorhabditis non

caractérisé

tubuline γ 23C tubuline γ 37CD tubuline γ

tubuline γ / GCP1

(2 gènes)tubuline γ (2 gènes)

Tub4p Tubg1/Gtb1 tbg-1

Dgrip84 Xgrip110 GCP2 AtSpc97p Spc97p Alp4

Dgrip91 Xgrip109 GCP3 AtSpc98p Spc98p Alp6

Dgrip75 Xgrip76 GCP4 AtGCP4 Gfh1p

Dgrip128 Xgrip133 GCP5 AtGCP5

Dgrip163 Xgrip210 GCP6 AtGCP6 Alp16

Dgp71WD X-Nedd1 GCP71WD/ Nedd1 At-Nedd1

(>5 isoformes)mod21

Ce-grip1

25

centrosome mais rien n’est connu sur l’existence d’un complexe contenant la tubuline γ

chez cet organisme (Hannak et al., 2002).

• Protéines à motifs « grip » et à motifs « WD »

Les comparaisons de séquences des protéines associées à la tubuline γ dans le γ-

TuRC ont permis de mettre en évidence des motifs communs appelés motifs « grip » (pour

gamma tubulin ring protein) qui définissent une nouvelle famille. L’alignement des

protéines « grip » de la drosophile (Figure 12), de Xgrip109 et 210 chez le xénope, des

GCP2 et GCP4 chez l’homme et des Spc97 et Spc98 chez S. cerevisiae a permis de

déterminer les séquences consensus de deux motifs communs constitués de résidus

hydrophobes, grip1 et grip2 d’environ 100 et 270 acides aminés respectivement

(Gunawardane et al., 2000; Wiese and Zheng, 2006). Chez la drosophile, parmi les cinq

protéines à motifs grip, seule Dgrip128 ne contient que le motif grip2 alors que toutes les

autres possèdent les deux motifs (Gunawardane et al., 2000). Chez cet organisme, l’identité

entre les différentes protéines de cette superfamille est relativement faible en dehors des

domaines « grip » : environ 20 à 30% sur la séquence complète. De plus, les homologues

d’une protéine dans des organismes différents présentent des conservations variables. Par

exemple, la protéine humaine GCP3 présente plus de 85% d’identité avec son orthologue

chez le xénope (Xgrip109) mais seulement 30% avec celui de la drosophile (Dgrip91). Par

contre, l’analyse des profils HCA (Hydrophobic Cluster Analysis) prédit des domaines

structuraux 2D (feuillets β et hélices α) très similaires entre les différentes protéines à

motifs grip chez la drosophile et l’homme (données non publiées, collaboration avec I.

Callebaud) (Callebaut et al., 2006). Les motifs grip retrouvés dans toutes les protéines

associées à la tubuline γ pourraient être des motifs d’interaction avec la tubuline γ.

Les recherches de séquence ont permis l’identification chez la drosophile de deux

protéines supplémentaires à motifs grip, Dgrip79 et Dgrip225. Les alignements de

séquence montrent que Dgrip79 est un membre de la famille proche de Dgrip84/CGP2

(Figure 12). La protéine Dgrip79 pourrait être une protéine qui migre au niveau de 75KDa

sur les gels colorés au Bleu de Coomassie (Figure 10) (Wiese and Zheng, 2006). Par contre,

aucune protéine ne migre au dessus de 163KDa. Dgrip225 doit être soit minoritaire dans les

Figure 12 : Alignement des séquences des protéines à motif grip. (a) La séquence complète montre deux régions en orange de très forte similarité qui ont été nommés grip1 et grip2 (La séquence de Dgrip163 a été tronquée à l'excep-tion des régions d'homologie avec les autres protéines). (b) Alignement de séquence pour le motif grip1. Dgrip128 est la seule protéine à ne pas posséder le motif grip1.(c) Alignement de séquence pour le motif grip2. Le code couleur représente les similarités entre acides aminés : bleu et vert = mauvais, jaune et orange clair = moyen et orange/rouge = bon (Wiese and Zheng, 2006).

a

b

c

26

embryons soit spécifique de certains stades du développement ou de tissus. Elle pourrait

aussi ne pas être associée à la tubuline γ.

Dgp71WD est la dernière protéine associée à la tubuline γ dans le γ-TuRC a avoir

été identifiée chez la drosophile. Elle ne possède pas de motif grip mais 5 répétitions d’un

motif structural de type « WD » dans sa partie N-terminale (Gunawardane et al., 2003). Les

motifs WD sont des séquences conservées d’environ 40 à 60 acides aminés qui se terminent

parfois par Tryptophane-Acide aspartique (WD) et qui peuvent être répétées dans la

séquence protéique de 4 à 16 fois (Smith et al., 1999). Des motifs WD sont présents dans

diverses protéines et ne sont pas associés à une fonction spécifique. La seule protéine à

motifs WD dont la structure cristallographique est connue est la sous-unité β des protéines

G. Cette structure a montré que les motifs WD confèrent aux protéines une forme en « β-

propeller » rigide qui leur permet de présenter trois surfaces d’interactions potentielles avec

d’autres protéines (Figure 13). Nedd1, l’orthologue de Dgp71WD chez les mammifères

possède 21% d’identité avec Dgp71WD, au delà des motifs WD (Gunawardane et al.,

2003). Les protéines Nedd1 et Dgp71WD pourraient avoir un rôle soit dans l’assemblage

du γ-TuRC, soit dans l’interaction avec des protéines activatrices ou des protéines

d’ancrage.

2) Structure des γ-TuSCs et des γ-TuRCs

• Structure et stœchiométrie des complexes de tubuline γ

Le γ-TuRC cytoplasmique purifié possède, en tomographie par microscopie

électronique et en cryomicroscopie électronique, une structure en anneau ouvert ou en

spirale dont une des faces est couverte par une « coiffe » (Moritz et al., 2000; Murphy et

al., 2001; Oegema et al., 1999; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). Ces anneaux

ont un diamètre d’environ 25 nm, ce qui correspond au diamètre des microtubules.

L’anneau de γ-TuRC comporte environ six répétitions en forme de U qui pourraient

correspondre à l’estimation du nombre de γ-TuSCs présents au sein du γ-TuRC, d’après les

Figure 13 : Les motifs "WD". A. Alignement des répétitions WD de Dgp71WD, de Nedd1 (homologue humain) et de la chaine 1 de la transducine β. La prédiction à partir de la struc-ture 3D connue de la transducine β et par profil HCA a permis d'indentifier les 5 motifs WD dans Dgp71WD et les 7 dans Nedd1. La position prédite des feuillets β (A, B, C et D) sont indiqués au dessus des alignements. Les acide aminés hydrophobes et aromatiques conservés sont surlignés en vert et orange, respectivement. Les autres acides aminés retrouvés dans des motifs WD sont en jaune ou rouge. B. Structure 3D prédictive des domaines WD de Nedd1. L'alignement permet de prédire une structure en β-propeller composée de 7 domaines (I-VII), chacun formé de 4 feuillets β (A-D) en architecture 3+1 (Haren et al., 2006). C. Représentation schématique de la forme en β-propeller que peuvent adopter les protéines à motifs WD. Elle permet la présentation de trois grandes surfaces d'intéractions possibles (noire, rose et grise) (Smith et al., 1999).

A

B

C

27

masses respectives des deux complexes et des protéines qui les composent (Moritz and

Agard, 2001; Moritz et al., 2000; Oegema et al., 1999). Dans ce modèle, l’anneau serait

composé de 6 γ-TuSCs et la « coiffe » composée des autres protéines associées à la

tubuline γ spécifiques du γ-TuRC (Moritz and Agard, 2001; Moritz et al., 2000; Murphy et

al., 2001; Oegema et al., 1999; Wiese and Zheng, 1999) (Figure 14).

La stœchiométrie du petit complexe, le γ-TuSC, a été bien étudiée et est maintenant

admise. Chez la drosophile et les levures S. pombe et S. cerevisiae, des approches

génétiques et biochimiques (immunoprécipitation, double hybride, co-expression dans

bacculovirus) ont montré que les trois protéines du γ-TuSC interagissent deux à deux

(Geissler et al., 1996; Gunawardane et al., 2000; Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000;

Vinh et al., 2002). La co-expression des trois protéines dans des cellules d’insecte permet

de purifier un complexe avec un coefficient de sédimentation identique au γ-TuSC

endogène (Gunawardane et al., 2000; Vinh et al., 2002). Enfin, les études par densitométrie

sur gel coloré au Bleu de Coomassie et les études par co-immunoprécipitation des protéines

en fusion avec des étiquettes ont permis de déterminer une stœchiométrie tubuline γ :

Dgrip84 : Dgrip91 de 2 : 1 : 1 dans le γ-TuSC (Knop et al., 1997; Murphy et al., 1998;

Oegema et al., 1999; Vinh et al., 2002). L’ensemble de ces données a permis d’élaborer une

organisation du γ-TuSC dans lequel deux hétérodimères composés de tubuline γ-Dgrip84 et

tubuline γ-Dgrip91 interagissent latéralement par l’intermédiaire d’interactions tubuline γ-

tubuline γ et Dgrip84-Dgrip91 (Figure 14).

Par contre, la stœchiométrie du γ-TuRC est encore imprécise. Des analyses

densitométriques montrent que les protéines spécifiques du γ-TuRC sont minoritaires dans

le complexe par rapport aux protéines du γ-TuSC. Le nombre et les interactions entre ces

protéines sont controversés (Fava et al., 1999; Fujita et al., 2002; Moritz and Agard, 2001;

Murphy et al., 2001; Oegema et al., 1999). Par exemple, l’homologue de Dgrip75 a été

estimé à 1 ou 2 exemplaires dans le γ-TuRC en fonction de l’organisme étudié (Fava et al.,

1999; Gunawardane et al., 2000). Lorsqu’elles sont co-exprimées dans le système

bacculovirus, la tubuline γ et Dgp71WD interagissent directement avec l’ensemble des

autres protéines du complexe, sauf Dgrip75 pour laquelle l’étude n’a pas été réalisée

Figure 14 : Structure et modèle du γ-TuRC. (a) Vue latérale d'un complexe γ-TuRC isolé d'embryons de drosophile, obtenu par tomographie en microscopie électronique. On observe une paroi de l'anneau (crochet) composé de sous unités en forme de U (pointillés bleus) et d'une coiffe (pointe de flèche). (b-c) Modèle structural du γ-TuRC représentant le coté ouvert de l'anneau (b) et la face opposée (c). Les sous-unités en U correspondraient aux γ−TuSCs (tubuline γ en rose et protéines associées dans le γ−TuSC en vert). Les protéines grip spécifi-ques du γ-TuRC (gris) formeraient la coiffe. (Moritz et Agard, 2001).

(a) (b) (c)

Dgrip84

Dgrip91

Tubuline γ

28

(Gunawardane et al., 2003). Ceci est en accord avec la structure prédite de Dgp71WD qui

lui confère des surfaces d’interaction protéine/protéine. De plus, le γ-TuSC purifié ne

s’auto-assemble pas en un complexe de la taille du γ-TuRC in vitro, suggérant un rôle des

protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’assemblage du complexe (Oegema et al., 1999).

Ces informations fragmentaires et l’absence de données concernant la structure des

protéines associées à la tubuline γ ne permettent pas de proposer un modèle d’organisation

du γ-TuRC.

• Modèle de nucléation des microtubules

In vitro, des extraits d’œufs de xénope ou d’embryons de drosophile déplétés en γ-

TuRCs possèdent une activité de nucléation des microtubules réduite (Félix et al., 1994;

Moritz et al., 1998; Stearns and Kirschner, 1994). Les γ-TuRCs purifiés sont capables de

nucléer les microtubules en dessous de la concentration critique de tubulines α/β (Zheng et

al., 1995). De plus, ils ont la capacité de s’associer à l’extrémité moins de microtubules

préexistants et de bloquer la dynamique d’assemblage/désassemblage à cette extrémité

(Keating and Borisy, 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al.,

1995). Le γ-TuSC, purifié à partir d’extraits d’embryons de drosophile ou reconstitué à

partir du système d’expression bacculovirus, favorise également la nucléation des

microtubules, mais moins efficacement que le γ-TuRC (Figure 15). Les γ-TuSCs peuvent

également s’associer avec l’extrémité moins des microtubules et diminuer leur dynamique

mais plus faiblement que les γ-TuRCs (Gunawardane et al., 2000; Oegema et al., 1999;

Vinh et al., 2002). In vitro, la tubuline γ monomérique possède les mêmes propriétés de

nucléation des microtubules que les γ-TuRCs et les γ-TuSCs (Leguy et al., 2000) mais cette

forme n’a jamais été détectée dans des extraits cellulaires.

En microscopie électronique, des structures en forme d’anneau contenant de la

tubuline γ sont observées au niveau du PCM des centrosomes isolés de drosophile et

disparaissent après nucléation des microtubules (Moritz et al., 1995a; Moritz et al., 1995b).

Ces structures pourraient correspondre à des γ-TuRCs recrutés au centrosome interagissant

avec l’extrémité moins des microtubules. En accord avec cette hypothèse, toutes les

Figure 15 : Comparaison de l'activité de nucléation des γ-TuSCs et des γ-TuRCs. A-B. Champs représentatifs des tests de nucléation des microtubules in vitro. C. Quantification de la nucléation. L'activité de nucléation des γ-TuRC est 80-100 fois plus importante que l'activité de nucléation spontanée par la tubuline en solution. Dans ces conditions, l'activité de nucléation du γ-TuSC est seulement 2 à 3 fois plus importante que l'activité de nucléation spontanée (B). (Oegema et al., 1999).

γ-TuRC

γ-TuRC

Nom

bre

de m

icro

tubu

les

B

A

C

γ-TuSC

γ-TuSCContrôle Contrôle

29

protéines du γ-TuRC sont localisées au centrosome (Fava et al., 1999; Gunawardane et al.,

2000; Gunawardane et al., 2003; Martin et al., 1998; Murphy et al., 2001; Murphy et al.,

1998; Oegema et al., 1999; Zhang et al., 2000). D’après ces données, le γ-TuRC pourrait

être le complexe nécessaire à la nucléation et la stabilisation des microtubules au niveau

des centrosomes.

Deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC ont été proposés

(Figure 16), le modèle du « moule » (Oakley, 1995; Zheng et al., 1995) et le modèle du

« protofilament » (Erickson, 2000; Erickson and Stoffler, 1996). Dans le premier cas,

l’anneau de γ-TuRC servirait de moule pour la nucléation des microtubules. Les tubulines γ

interagiraient latéralement entre elles et longitudinalement avec les dimères de tubulines

α/β à l’extrémité moins des microtubules. Dans le modèle « protofilament », l’anneau de

tubuline γ formerait un protofilament incurvé qui interagirait latéralement avec les

tubulines α/β, stabilisant une paire de protofilaments et conduisant à l’initiation de la

croissance du microtubule.

Aucune évidence expérimentale ne permet d’infirmer ou de confirmer ces modèles.

L’analyse par microscopie électronique de la localisation des protéines du γ-TuRC ou du γ-

TuRC complet par rapport à l’extrémité moins des microtubules serait en faveur du modèle

« moule » mais les résultats sont très contestables (Keating and Borisy, 2000; Moritz and

Agard, 2001; Moritz et al., 2000). Dans des extraits d’œufs de xénope, la tubuline γ se

localise à environ 4±10 nm de l’extrémité du microtubule alors que Xgrip109 (Dgrip91)

est détecté à 9±4 nm et Xgrip210 (Dgrip163) à 10±9 nm (Keating and Borisy, 2000 ; Zhang

et al., 2000). Dans des extraits d’embryons de drosophile, la visualisation de γ-TuRCs

purifiés en association avec des microtubules provenant d’extraits d’embryons, ainsi que la

reconstitution de l’extrémité moins de microtubules à partir de centrosomes intacts

montrent que le γ-TuRC apparaît comme une « coiffe » qui entoure l’extrémité du

microtubule sans s’étendre vers l’intérieur du microtubule (Moritz et al., 2000).

L’obtention récente de la structure de la tubuline γ humaine associée avec le GTP

par cristallisation et analyse aux rayons X n’a pas permis de vérifier un des deux modèles

de nucléation des microtubules. Cependant, il montre que les interactions entre les

Figure 16 : Les deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC. A. Dans le modèle du "moule", les sous-unités tubuline γ adjacentes font des contacts latéraux. B. Dans le modèle du "protofilament", les unités de tubuline γ font des contacts tête à queue. La poche à GTP de la tubuline γ est marquée en rouge.(Wiese et Zheng, 2006).

Modèle du "moule" Modèle du "protofilament"

30

tubulines γ dans le cristal présentent des similarités avec les interactions entre les tubulines

α et β voisines, non pas dans un protofilament, mais latéralement dans le microtubule

(Aldaz et al., 2005). Les tubulines γ sont donc capables de former des contacts latéraux

dans le complexe qui sont les interactions prédites dans le modèle du « moule » (Figure

16). Contrairement aux tubulines α/β, le rôle du GDP/GTP associé à la tubuline γ n’est pas

clairement défini. Dans le modèle « protofilament », l’hydrolyse du GTP pourrait permettre

l’assemblage des tubulines γ du protofilament initial. Dans le modèle « moule », le γ-TuRC

présente un anneau de tubulines γ avec un GTP accessible. L’hydrolyse du GTP pourrait

fournir l’énergie nécessaire aux interactions des tubulines α/β avec les tubulines γ (Figure

16). La seule donnée in vitro disponible qui montre que la tubuline γ dans le γ-TuSC se lie

préférentiellement à la forme non hydrolysable (GDP) ne permet pas de conclure (Oegema

et al., 1999).

La composition protéique des γ-TuRCs est similaire chez la drosophile, le xénope et

les mammifères. Chez S. cerevisiae, un complexe soluble de 22S est détecté sur gradient de

sucrose (Vinh et al., 2002), mais son contenu protéique reste inconnu. Chez cet organisme,

les protéines spécifiques du γ-TuRC n’existent pas ou sont peut être trop divergentes pour

être identifiées à partir de leur séquence primaire. Ceci ne permet pas d’expliquer une

conservation des mécanismes de nucléation au cours de l’évolution (Geissler et al., 1996;

Knop et al., 1997; Vinh et al., 2002). Il est possible que le petit complexe Tub4 d’environ

6S, équivalent au γ-TuSC, soit suffisant pour nucléer le faible nombre de microtubules

présents chez les levures, par rapport aux eucaryotes supérieurs. Cependant, cela est en

contradiction avec l’existence de complexes de grande taille chez S. pombe (Vardy and

Toda, 2000). Une autre hypothèse serait que plusieurs complexes Tub4 s’assemblent pour

former un plus gros complexe soit dans le cytoplasme soit au niveau du SPB.

31

3) Fonctions des protéines associées à la tubuline γ

[Voir ANNEXE 3] Les fonctions des protéines associées à la tubuline γ sont moins bien caractérisées

que celles de la tubuline γ. Les partenaires de la tubuline γ les mieux étudiés sont les

protéines du γ-TuSC. Le rôle de ces protéines a été analysé chez les levures S. pombe et S.

cerevisiae, par des études génétiques. Les pertes de fonction des gènes codant les

homologues de Dgrip84 et Dgrip91 sont létales chez les deux levures (Geissler et al., 1996;

Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004), comme c’est le cas pour

la tubuline γ. Une mutation du gène Dgrip91 chez la drosophile est également létale

(Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000).

Seules deux protéines spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgrip163, ont été

étudiées. Contrairement aux protéines du γ-TuSC, ces protéines ne sont pas essentielles à la

viabilité chez la levure S. pombe (Fujita et al., 2002; Venkatram et al., 2004). Une mutation

de Dgrip75 a été identifiée au cours d’un crible de mutagenèse pour isoler des gènes

affectant la polarité de l’ovocyte de drosophile (Schnorrer et al., 2002). Cette mutation

n’engendre pas de mortalité précoce mais les mutants présentent une stérilité femelle.

• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans l’assemblage des complexes

de tubuline γ.

In vitro, les γ-TuRCs peuvent être désassemblés en γ-TuSCs en présence de

concentrations élevées de sel puis réassemblés par élimination des sels. Dans des extraits de

xénope, l’immunodéplétion de Xgrip109, l’homologue de Dgrip91, bloque le réassemblage

du γ-TuRC après élimination des sels (Martin et al., 1998). Par contre in vivo chez S.

pombe, Alp4 (Dgrip84) n’est pas nécessaire à la détection sur gradient de sucrose d’un

complexe γ-TuC de 2000KDa (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000). Il existe donc

une contradiction pour le rôle des homologues de Dgrip84 et Dgrip91 dans l’assemblage

des complexes entre S. pombe et le xénope. La même contradiction a lieu pour les

homologues de Dgrip163 : Xgrip210 chez le xénope est essentielle à la formation d’un

complexe de grande taille in vitro (Figure 17) alors que Alp16 ne l’est pas chez S. pombe

Figure 17 : Xgrip210 (homologue de Dgrip163 chez le xénope) est nécessaire à l'assem-blage du γ-TuRC. Des extraits de xénope sont analysés sur gradient de sucrose 5 à 40%. Les fractions sont déposées sur un gel SDS/PAGE et immunoblotées avec des anticorps dirigés contre la tubuline γ, Xgrip109 et Xgrip210. Des extraits contrôles (a) ou immunodé-plétés avec des anticorps contre Xgrip210 (b) sont comparés (Zhang et al., 2000).

- Xgr

ip10

9 co

ntrô

les

a

b

32

(Fujita et al., 2002; Zhang et al., 2000). Ces différences peuvent être dues à la nature des

mutations chez S. pombe qui pourraient affecter la fonction de la protéine ciblée sans

affecter le domaine nécessaire aux interactions avec les autres composants des complexes.

D’autre part, la nature des complexes de 2000KDa chez S. pombe est encore mal définie et

il est possible que la fonction des protéines dans la formation des complexes tubuline γ soit

différente d’un organisme à l’autre.

• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la nucléation des

microtubules

La re-nucléation des microtubules après traitement par le froid est bloquée par la

présence d’anticorps dirigés contre GCP3 (Dgrip91) à la fois in vitro sur des centrosomes

isolés et dans des cellules Hela microinjectées (Tassin et al., 1998). L’orthologue humain

de Dgrip91 serait nécessaire à la nucléation des microtubules, ce qui est en accord avec son

rôle essentiel dans l’assemblage des complexes chez le xénope (Martin et al., 1998).

Des mutations des gènes codant les homologues de Dgrip91 chez les levures (S.

pombe et S. cerevisiae) et la drosophile et de Dgrip84 chez les levures entraînent une

diminution de la densité de microtubules, comparable avec la diminution de la densité

observée après mutation du gène codant la tubuline γ (Barbosa et al., 2000; Geissler et al.,

1996; Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Zimmerman and Chang, 2005). De plus,

dans les mutants des homologues de Dgrip84 et Dgrip91 chez S. pombe, les analyses en

microscopie électronique montrent qu’un des SPBs possède peu ou pas de microtubules

(Vardy and Toda, 2000). Comme la tubuline γ, les protéines du γ-TuSC sont impliquées

dans la nucléation des microtubules in vivo. In vitro, dans des essais de reconstitution de

centrosome à partir d’extraits de xénope, les homologues de Dgrip75 et Dgrip163 sont

également nécessaires à la formation d’asters de microtubules (Fava et al., 1999; Zhang et

al., 2000).

L’hypothèse la plus probable est que l’ensemble des protéines du γ-TuRC soit

nécessaire à la formation du complexe et à la nucléation des microtubules. Cependant,

certaines protéines associées à la tubuline γ pourraient avoir des rôles spécifiques.

33

• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans l’organisation des

microtubules

Le rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la nucléation suggère qu’elles

soient également impliquées dans l’organisation du fuseau de division.

Le rôle des protéines du γ-TuSC a été abordé lors de la mitose. La perte de fonction

des homologues de Dgrip84 et Dgrip91, chez les levures S. pombe et S. cerevisiae, et de

Dgrip91 chez la drosophile entraîne des anomalies dans la morphologie des fuseaux qui

sont similaires aux défauts induits par la déplétion de la tubuline γ. Les cellules ralentissent

en mitose. Les fuseaux, souvent monopolaires ou avec des pôles mal séparés, ne permettent

pas la ségrégation correcte des chromosomes (Barbosa et al., 2000; Geissler et al., 1996;

Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000). Chez le mutant Dgrip91 de drosophile, cela se

traduit par une augmentation de l’aneuploïdie dans les neuroblastes et les spermatocytes

(Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000). Comme pour la tubuline γ, les fuseaux

monopolaires pourraient traduire des défauts dans la fonctionnalité des microtubules

responsables de la séparation des pôles.

Ainsi, les trois protéines du γ-TuSC (tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91) jouent un rôle

majeur dans l’organisation d’un fuseau de division fonctionnel. Il convient d’analyser la

fonction de Dgrip84 afin de pouvoir comparer le rôle des 3 protéines du γ-TuSC dans un

même organisme métazoaire comme la drosophile.

Le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules

n’a été abordé que chez S. pombe où la fonction des protéines Gfh1p (Dgrip75) et Alp16

(Dgrip163) a été analysée. Les cellules mutantes pour Gfh1 (Dgrip75) présentent des

défauts de polarité de croissance mais l’organisation globale des fuseaux mitotiques est

normale. Seul un détachement des microtubules astraux est observé au niveau des SPBs au

cours de la mitose suggérant que Gfh1p est nécessaire à l’ancrage des microtubules astraux

(Venkatram et al., 2004). La surexpression des protéines Gfh1p (Dgrip75) ou Alp16

(Dgrip163) provoque des défauts d’organisation des fuseaux, comme des fuseaux

monopolaires, comparables à ceux induits par la perte de fonction des gènes codant les

protéines du γ-TuSC (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004).

34

Par contre, la perte de fonction de Alp16 (Dgrip163) n’entraîne aucun défaut en mitose

(Fujita et al., 2002).

Le rôle des protéines associées à la tubuline γ dans les étapes post-métaphasiques

chez un métazoaire n’a été abordé que pour Dgrip91 lors de la méiose male chez la

drosophile. Comme pour les mutants de tubuline γ, l’analyse des spermatocytes du mutant

Dgrip91 a mis en évidence un fuseau central mal organisé et une cytocinèse abortive ou

asymétrique (Barbosa et al., 2003). Dgrip91 pourrait donc intervenir lors des phases

tardives de la division cellulaire.

• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la maturation/duplication du

centrosome

Le recrutement de la tubuline γ aux pôles du fuseau est essentiel pour la formation

d’un fuseau mitotique fonctionnel. Les orthologues de Dgrip91 sont nécessaires à la

localisation de la tubuline γ au niveau des centrosomes reconstitués à partir du sperme et

d’extraits d’œufs des xénope in vitro, ainsi que chez la drosophile in vivo (Barbosa et al.,

2000; Martin et al., 1998; Vardy and Toda, 2000; Zhang et al., 2000). Chez S. pombe, Alp4

(Dgrip84) est aussi nécessaire à la localisation de la tubuline γ et de Alp6 (Dgrip91) au

SPB. Les deux protéines associées à la tubuline γ dans le γ-TuSC jouent un rôle dans le

recrutement ou l’ancrage de la tubuline γ aux MTOCs. Chez S. cerevisiae, les protéines à

domaine « coiled-coil » Spc110 et Spc72 sont respectivement impliquées dans l’ancrage

des γ-TuSCs aux plaques internes et externes du SPB (Knop et al., 1997; Knop and

Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). L’analyse des interactions de Spc97 et Spc98 avec

Spc110 et Spc72 montre que l’ancrage du γ-TuSC à la plaque externe dépend des deux

protéines Spc97 et Spc98, alors que l’ancrage du γ-TuSC à la plaque interne dépend

principalement de Spc98 (Nguyen et al., 1998). Ainsi, les deux protéines du γ-TuSC jouent

des rôles différents dans l’ancrage de la tubuline γ à la plaque interne chez S. cerevisiae.

CGNAP/Kendrine/péricentrine et CP309 seraient des homologues de Spc110 chez les

mammifères et la drosophile, respectivement. Ces protéines sont impliquées dans l’ancrage

35

de la tubuline γ via leurs interactions avec les protéines du γ-TuSC (Takahashi et al., 2002;

Zimmerman et al., 2004). Ces données confirment le rôle des deux protéines du γ-TuSC

dans l’ancrage de la tubuline γ au centrosome.

Chez la levure S. pombe, les protéines spécifiques du γ-TuRC sont recrutées

normalement dans les mutants Alp4 (Dgri84) et Alp6 (Dgrip91) (Vardy and Toda, 2000;

Venkatram et al., 2004). D’autre part, la perte de fonction des protéines spécifiques du γ-

TuRC, Alp16 (Dgrip163) et Gfh1p (Dgrip75), n’affecte ni le recrutement de la tubuline γ,

ni celui des protéines Alp4 (Dgrip84) et Alp6 (Dgrip91) au SPB, ni la formation d’un

complexe γ-TuC de grande taille (Venkatram et al., 2004). Chez S. pombe, au moins une

fraction d’un complexe contenant les trois protéines tubuline γ-Alp4-Alp6, équivalent au γ-

TuSC, pourrait donc être recrutée au centrosome indépendamment des autres protéines du

complexe. Ces données sont en désaccord avec un modèle de recrutement de la tubuline γ

exclusivement via le γ-TuRC pour la nucléation des microtubules. L’analyse de la fonction

des protéines spécifiques du γ-TuRC chez un métazoaire n’a pas été réalisée. Elle pourrait

permettre une meilleure compréhension des mécanismes de nucléation.

Dans les neuroblastes de drosophile, la perte de fonction de Dgrip91 affecte le

recrutement de protéines nécessaires à la maturation du PCM (Barbosa et al., 2003;

Barbosa et al., 2000). Comme dans le mutant drosophile de tubuline γ et dans les cellules

de drosophile en culture traitées par RNAi contre la tubuline γ, Cnn est détectée sous la

forme de points de taille et d’aspect irréguliers, suggérant une cohésion anormale du PCM.

De plus, le recrutement de CP190 est réduit (Barbosa et al., 2000). En microscopie

électronique, une distribution anormale des centrioles est observées aux pôles. Certains

pôles présentent plus de deux centrioles et d’autres n’en ont aucun. Ces phénotypes sont

identiques à ceux induits par la perte de fonction de la tubuline γ. Ils démontrent

l’implication de Dgrip91 dans la séparation ou la duplication des centrosomes. Les

centrioles observés dans les neuroblastes mutants sont plus courts suggérant que Dgrip91

pourrait être impliquée dans la maturation des centrioles, comme la tubuline γ.

Les données obtenues chez S. cerevisiae rendent plus complexes l’interprétation des

données obtenues chez la drosophile. Les analyses en microscopie électronique montrent

36

que la perte de fonction de SPC97 (Dgrip84) induit des défauts à la fois dans la duplication

et dans la séparation des SPBs alors que dans les mutants SPC98 (Dgrip84) ces structures

sont correctement dupliquées et capables de se séparer (Geissler et al., 1996; Knop et al.,

1997). Par conséquent, les deux protéines du γ-TuSC jouent des rôles différents dans la

duplication du SPB chez S. cerevisiae.

• Rôle des protéines associées à la tubuline γ au cours de l’ovogenèse

Chez les métazoaires, très peu de données sont disponibles concernant la fonction

des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules. Chez la

drosophile, seul le rôle de Dgrip75 a été étudié au cours de l’ovogenèse. Le mutant

Dgrip75 présente des défauts de localisation de l’ARN maternel bicoid qui est dépendante

des microtubules, alors que la localisation d’autres déterminants maternels n’est pas

affectée (Schnorrer et al., 2002). Dgrip75 serait impliquée dans la fonctionnalité de certains

réseaux de microtubules dans l’ovocyte. Ces résultats ainsi que les données chez la levure

S. pombe suggèrent que les protéines spécifiques du γ-TuRC ne sont pas nécessaires à

l’organisation globale du réseau microtubulaire mais paraissent plutôt impliquées dans

l’assemblage de sous réseaux.

• Rôle dans la dynamique des microtubules

In vitro, les γ-TuRC purifiés à partir d’extraits de xénope ou d’embryons de

drosophile se lient à l’extrémité moins des microtubules et réduisent sa dynamique

(Keating and Borisy, 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al.,

1995).

De manière comparable avec la tubuline γ, les protéines qui lui sont associées sont

impliquées dans la régulation de la dynamique des microtubules. L’analyse des mutants des

gènes codant les orthologues de Dgrip84, Dgrip91 et Dgrip163 chez les levures S. pombe et

S. cerevisiae a montré que les microtubules cytoplasmiques sont anormalement longs et

courbés, suggérant qu’ils sont stabilisés (Fujita et al., 2002; Geissler et al., 1996; Knop et

al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005).

Ces phénotypes sont comparables à ceux observés dans des mutants de la tubuline γ chez

37

ces deux levures (Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang

et al., 1996). De plus, des mutants Alp4 (Dgrip84), Alp6 (Dgrip91) et Alp16 (Dgrip163)

chez S. pombe montrent une hypersensibilité aux drogues déstabilisatrices des microtubules

(ThiaBendaZole ou TBZ) (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000; Zimmerman and

Chang, 2005). Chez S. pombe, l’utilisation de lignées exprimant une tubuline α-GFP

comportant une mutation dans le gène Alp4 (Dgrip84) montre un rôle de cette protéine dans

la dynamique de l’extrémité plus des microtubules en interphase. Les microtubules sont

plus longs et présentent une diminution des taux de catastrophes à l’extrémité plus par

rapport aux cellules sauvages. Ils se courbent au niveau du cortex suggérant qu’ils sont

stabilisés (Zimmerman and Chang, 2005).

Ces expériences suggèrent un rôle des γ-TuRCs dans la dynamique de l’extrémité

plus des microtubules chez la levure. Les protéines du γ-TuRCs seraient nécessaires à la

déstabilisation de l’extrémité plus des microtubules en interphase et en mitose. Des

expériences complémentaires sont nécessaires à la compréhension de ces mécanismes de

régulation de la dynamique, en particulier chez les animaux.

38

Au début de mon travail de thèse, la fonction des protéines associées à la tubuline γ

dans les complexes γ-TuSC et γ-TuRC était très mal connue. Les principales analyses

avaient été réalisées en mitose chez les levures S. pombe et S. cerevisiae, et uniquement

Dgrip91 et Dgrip75 (uniquement lors de l’ovogenèse) avaient été étudiées chez un

métazoaire, la drosophile (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Fujita et al., 2002;

Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Schnorrer et al., 2002; Vardy et al., 2002;

Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). La transposition des fonctions

caractérisées chez les levures aux métazoaires présente plusieurs difficultés. Le centrosome

et le SPB sont des structures morphologiquement différentes. D’autre part, les protéines

associées à la tubuline γ chez les levures présentent peu d’homologies avec les protéines

dans d’autres organismes, comme les mammifères. Enfin, la nature des complexes de

tubuline γ est différente entre les levures et les animaux, en particulier chez S. cerevisae où

seul un petit complexe est présent. Mon projet a été d’étudier la fonction relative des deux

complexes, le γ-TuSC et le γ-TuRC, chez les animaux. La stratégie adoptée consiste à

analyser les conséquences de la déplétion par RNAi de la tubuline γ et des protéines

associées (protéines du γ-TuSC et du γ-TuRC) sur l’organisation et la dynamique des

microtubules au cours du cycle cellulaire, dans les cellules de drosophile en culture.

Le travail que j’ai réalisé a consisté en l’étude du :

(1) rôle des protéines du γ-TuSC dans l’organisation des microtubules en mitose, en

particulier de Dgrip84 dont la fonction n’avait jamais été abordée chez les

métazoaires.

(2) rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules en

mitose.

(3) rôle du γ-TuSC et du γ-TuRC dans l’organisation et la dynamique des microtubules

en interphase.

(4) mode de régulation des protéines associées à la tubuline γ

39

RESULTATS

I- Etude du rôle d’une protéine du γ-TuSC, Dgrip84, au cours

de la division cellulaire

Voir Colombié et al., Mol. Biol. Cell., 2006.

Les données sur la fonction des protéines associées à la tubuline γ dans le γ-TuSC

sont limitées aux levures S. pombe et S. cerevisiae et à une seule protéine, Dgrip91, chez la

drosophile. Chez les deux levures, les deux protéines associées à la tubuline γ dans le γ-

TuSC sont essentielles à la viabilité (Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Vardy and

Toda, 2000). Chez la drosophile, Dgrip91 est également essentielle à la viabilité des

individus (Barbosa et al., 2000). Chez S. cerevisiae, la comparaison des fonctions de Spc97

(Dgrip84) et Spc98 (Dgrip91) a montré des divergences. En effet, elles jouent des rôles

différents dans la duplication du SPB et l’ancrage de la tubuline γ à la plaque interne du

SPB (Geissler et al., 1996; Knop and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). Afin de

comparer la fonction des protéines du γ-TuSC chez un métazoaire, nous avons entrepris

l’étude de la protéine Dgrip84 au cours de la division cellulaire chez la drosophile. Trois

mutants du gène Dgrip84 chez la drosophile ont été générés et caractérisés par N.

Colombié. La mutation la plus faible ne permet l’éclosion que de 50% des adultes, alors

que les deux autres mutants dont le mutant nul (R20) sont létaux précocement (stades

larvaires L1-L2) au cours du développement. Dgrip84 est donc une protéine essentielle

chez la drosophile (N. C.). Les neuroblastes sont les cellules de larves L3 en division les

plus accessibles à ce stade qui permettent de réaliser une étude de l’organisation des

fuseaux mitotiques in vivo en s’affranchissant de la contribution maternelle. Cependant, ces

cellules présentent des tailles hétérogènes et des figures mitotiques souvent asymétriques

avec des microtubules astraux difficiles à discerner. L’analyse des mutants pouvant

présenter quelques limites d’interprétation, j’ai réalisé une analyse complémentaire des

40

phénotypes mitotiques induits après inhibition de l’expression de la protéine Dgrip84 par

RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. L’analyse du réseau microtubulaire

peut être plus fine qu’in vivo et peut être complétée par des observations en microscopie

électronique.

Les mutations de Dgrip84 ainsi que le traitement RNAi entraînent une augmentation

de 2 à 3 fois de l’index mitotique avec une accumulation des cellules au stade

prométaphase/métaphase. Dans le mutant R20, les cellules présentent des chromosomes

hypercondensés et environ 25% d’aneuploïdie, avec un point de contrôle mitotique activé

(présence de BubR1 aux kinétochores). Cependant, le ralentissement en mitose est

étonnement modéré.

Nous avons voulu comprendre ce faible ralentissement en mitose en utilisant en tant

que contrôle un traitement à la colchicine qui augmente de 10 fois l’index mitotique dans

les cellules en culture. Lorsque ce traitement à la colchicine est précédé d’un traitement

RNAi contre Dgrip84, l’index mitotique augmente de seulement de 4,5 fois. Ces données

suggèrent un nouveau rôle de Dgrip84 dans la régulation du point de contrôle mitotique.

La déplétion de Dgrip84 après RNAi et dans les mutants entraîne la formation de

fuseaux majoritairement monopolaires ou bipolaires asymétriques mal focalisés. L’analyse

des cellules en culture a permis de mettre en évidence une absence de microtubules astraux

après traitement RNAi. In vivo et dans les cellules en culture, les autres protéines du γ-

TuSC, la tubuline γ et Dgrip91, ne sont plus détectables aux pôles des fuseaux, ainsi que le

long des microtubules du fuseau métaphasique ou au niveau du fuseau central en

cytocinèse.

La maturation des pôles est aussi affectée par l’absence de la protéine Dgrip84. Asp,

une protéine localisée à l’extrémité moins des microtubules en mitose (Riparbelli et al.,

2002; Wakefield et al., 2001), présente une localisation anormalement dispersée en accord

avec des défauts de focalisation des pôles. La protéine Cnn, qui est recrutée au centrosome

en mitose (Megraw et al., 1999), n’est parfois localisée qu’à un seul pôle du fuseau et sa

distribution est ponctuée, suggérant une distribution incorrecte des centrosomes. En

microscopie électronique, les cellules S2 traitées par RNAi présentent un nombre de

centrioles supérieur à 2 allant parfois jusqu’à 4 centrioles au même pôle. Le mécanisme de

41

nucléation des microtubules à partir des centrioles, et non plus à partir du PCM, révélé en

absence de tubuline γ (Raynaud-Messina et al., 2004), est également observé après

déplétion de Dgrip84. Afin de comprendre les défauts de ségrégation des chromosomes en

absence de Dgrip84, les cellules S2 ont été perméabilisées en présence de calcium afin de

conserver uniquement les microtubules kinétochoriens qui correspondent à des faisceaux de

microtubules plus stables que les autres microtubules du fuseau. Un marquage d’une

protéine des centromères (Cid) et des études en microscopie électronique ne permettent pas

de mettre en évidence des défauts dans les contacts microtubules/kinétochores. Cependant,

ces contacts ne seraient pas suffisants pour permettre une mitose fonctionnelle.

N. Colombié a montré que Dgrip84 intervient également lors de la division

méiotique mâle. Dans les spermatocytes des individus dépourvus de la protéine Dgrip84, le

fuseau central présente des défauts d’organisation et la cytocinèse est abortive ou

asymétrique.

En interphase, aucun défaut n’est observé dans les cellules S2 ou in vivo en absence

de Dgrip84. Par contre, des expériences de renucléation après désassemblage des

microtubules par le froid dans les cellules en culture montrent que la déplétion de Dgrip84

engendre une diminution du nombre de points de renucléation et les microtubules ainsi

nucléés semblent plus longs. Ces résultats suggèrent que Drip84 joue un rôle dans la

nucléation des microtubules interphasiques et qu’elle pourrait être impliquée dans la

dynamique du cytosquelette microtubulaire en interphase.

Nous avons caractérisé la fonction de la troisième et dernière protéine du γ-TuSC

lors de la division cellulaire chez un métazoaire. Les résultats montrent un rôle de Dgrip84

dans la maturation du centrosome en mitose et dans l’organisation d’un fuseau fonctionnel

à la fois en mitose et en méiose. Les phénotypes obtenus après déplétion de Dgrip84 sont

identiques à ceux obtenus après la perte de fonction des deux autres protéines du γ-TuSC :

la tubuline γ (Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995) et Dgrip91 (Barbosa et al.,

2003; Barbosa et al., 2000). Les trois protéines du γ-TuSC sont donc essentielles et non

redondantes. Ainsi, l’intégrité du complexe γ-TuSC serait nécessaire au recrutement de la

42

tubuline γ au centrosome et à sa fonction de nucléation et d’organisation des microtubules

au cours de la division cellulaire.

Molecular Biology of the CellVol. 17, 272–282, January 2006

The Drosophila �-Tubulin Small Complex SubunitDgrip84 Is Required for Structural and Functional Integrityof the Spindle Apparatus□D

Nathalie Colombie,* Christel Verollet,* Paula Sampaio,† Andre Moisand,‡Claudio Sunkel,†§ Henri-Marc Bourbon,� Michel Wright,* andBrigitte Raynaud-Messina*

*Centre de Recherche en Pharmacologie-Sante, Unite Mixte de Recherche 2587, Centre National de laRecherche Scientifique-Pierre Fabre, Institut de Sciences et Technologies du Medicament de Toulouse, 31400Toulouse, France; �Centre de Biologie du Developpement, Unite Mixte de Recherche 5547, Centre National dela Recherche Scientifique-Universite Paul Sabatier, Institut d’Exploration Fonctionnelle des Genomes, 31062Toulouse, France; †Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universitade do Porto, 4150-180 Porto, Portugal;§Instituto de Ciencias Biomedicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 4099-003 Porto, Portugal; and ‡Institutde Pharmacologie et de Biologie Structurale, Unite Mixte de Recherche 5089, 31077 Toulouse, France

Submitted August 4, 2005; Accepted October 5, 2005Monitoring Editor: Tim Stearns

�-Tubulin, a protein critical for microtubule assembly, functions within multiprotein complexes. However, little is knownabout the respective role of �-tubulin partners in metazoans. For the first time in a multicellular organism, we haveinvestigated the function of Dgrip84, the Drosophila orthologue of the Saccharomyces cerevisiae �-tubulin-associatedprotein Spc97p. Mutant analysis shows that Dgrip84 is essential for viability. Its depletion promotes a moderate increasein the mitotic index, correlated with the appearance of monopolar or unpolarized spindles, impairment of centrosomematuration, and increase of polyploid nuclei. This in vivo study is strengthened by an RNA interference approach incultured S2 cells. Electron microscopy analysis suggests that monopolar spindles might result from a failure of centrosomeseparation and an unusual microtubule assembly pathway via centriolar triplets. Moreover, we point to an involvementof Dgrip84 in the spindle checkpoint regulation and in the maintenance of interphase microtubule dynamics. Dgrip84 alsoseems essential for male meiosis, ensuring spindle bipolarity and correct completion of cytokinesis. These data sustainthat Dgrip84 is required in some aspects of microtubule dynamics and organization both in interphase and mitosis. Thenature of a minimal �-tubulin complex necessary for proper microtubule organization in the metazoans is discussed.

INTRODUCTION

The mechanisms of microtubule nucleation remain unclear,although it has been demonstrated that �-tubulin, a univer-sal component of the microtubule-organizing centers, playsan essential role in microtubule nucleation. The moleculardetails of this process are still poorly understood (Oakleyand Oakley, 1989; Oakley et al., 1990; Erickson and Stoffler,1996; Gunawardane et al., 2003). In vitro, �-tubulin mono-mers enhance the assembly of �/� heterodimers and blockthe minus ends of microtubules (Li and Joshi, 1995; Leguy etal., 2000). However, in vivo, �-tubulin does not seem to act asa monomer, but rather in a variety of protein complexes(Murphy et al., 1998; Oegema et al., 1999; Fujita et al., 2002).The simplest one called �-tubulin small complex (�-TuSC)has been well characterized in Saccharomyces cerevisiae (Knop

et al., 1997), Drosophila melanogaster (Oegema et al., 1999), andvertebrates (Murphy et al., 1998). It is formed by �-tubulinand two associated proteins in a 2:1:1 stoichiometry (Knopand Schiebel, 1997; Oegema et al., 1999; Murphy et al., 2001).This small complex is recruited at the inner and outer spin-dle plaques of S. cerevisiae spindle pole bodies (SPB) where itis responsible for microtubule nucleation (Knop andSchiebel, 1997, 1998; Pereira et al., 1998). Besides �-TuSC,other larger �-tubulin-containing complexes have been de-scribed (Zheng et al., 1995; Fujita et al., 2002). One termed�-tubulin ring complex (�-TuRC) has been characterized inmulticellular organisms such as D. melanogaster, Xenopuslaevis, and Homo sapiens (Zheng et al., 1995; Oegema et al.,1999; Murphy et al., 2001). It is assumed that the �-TuRCresults from the association of several �-TuSCs with at leastfour other proteins. Three of them show sequence homolo-gies (grip motifs) with the two �-tubulin-associated proteinsin the �-TuSC, whereas the fourth exhibits five WD repeats(Fava et al., 1999; Gunawardane et al., 2000; Moritz et al.,2000; Murphy et al., 2001; Gunawardane et al., 2003). Thefunction of �-tubulin has been studied extensively in severalorganisms and in cultured cells using antibody microinjec-tion, mutants or gene silencing (Oakley et al., 1990; Horio etal., 1991; Joshi et al., 1992; Sunkel et al., 1995; Marschall et al.,1996; Spang et al., 1996; Wilson and Borisy, 1998; Llamazares

This article was published online ahead of print in MBC in Press(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E05–08–0722)on October 19, 2005.□D The online version of this article contains supplemental materialat MBC Online (http://www.molbiolcell.org).

Address correspondence to: Brigitte Raynaud-Messina (brigitte.raynaud-messina@istmt.cnrs.fr).

272 © 2005 by The American Society for Cell Biology

et al., 1999; Ruiz et al., 1999; Bobinnec et al., 2000; Sampaio etal., 2001; Raynaud-Messina et al., 2004). For example, inDrosophila where two �-tubulin isotypes are expressed, ho-mozygous �-tub 23C mutants die during late larval stage,exhibiting atypical mitotic spindles and abnormal centroso-mal structures (Sunkel et al., 1995), whereas disruption of the�-tub 37CD gene results in abnormal female meiotic spindles(Tavosanis et al., 1997). However, our knowledge about thefunction of the �-tubulin-interacting proteins is limited. Therole of the two grip proteins associated with �-tubulin in the�-TuSC has been studied both in budding and fission yeasts(Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Nguyen et al., 1998;Vardy and Toda, 2000; Vardy et al., 2002). Deletions of eachof these genes (SPC97 and SPC98 in S. cerevisiae, Alp4 andAlp6 in Schizosaccharamyces pombe) are lethal; they inducemitotic defects and abnormal long cytoplasmic microtu-bules. However conditional mutants show phenotypic dif-ferences (Geissler et al., 1996; Marschall et al., 1996; Spang etal., 1996; Knop et al., 1997). In S. cerevisiae, Spc98p seemscritical for �-tubulin anchorage to the inner spindle plaquevia direct interaction with Spc110p (Nguyen et al., 1998),whereas Spc97p seems essential for a correct SPB duplica-tion and separation (Knop et al., 1997). In fission yeast, Alp4mutations compromise �-tubulin localization to the SPB, butthey do not affect the assembly of the large �-tubulin com-plex (Vardy and Toda, 2000). These studies reveal discrep-ancies about the role of the two grip motif �-TuSC subunits,in particular in the SPB duplication/separation process andin the �-tubulin anchorage. Moreover, these results obtainedin yeasts are difficult to transfer to metazoans for severalreasons. First, the morphology of the microtubule-organiz-ing centers is different. Second, the amino acid sequences ofthese proteins are poorly conserved because Spc97p and itsDrosophila orthologue (Dgrip84) exhibit only 10% identityand 22% similarity. Third, in contrast with S. cerevisiaewhere�-tubulin relocalizes to the SPB as �-TuSC, in multicellularorganisms, it is assumed that �-tubulin is recruited to thecentrosome as �-TuRC. In metazoans, the silencing of �-tu-bulin-associated proteins (Dgrip91, the Spc98p orthologue,and Dgrip75) has been performed essentially in Drosophilaand does not induce similar phenotypes (Barbosa et al., 2000;Schnorrer et al., 2002). Dgrip91 is an essential protein, re-quired for correct bipolar spindle assembly during mitosisand male meiosis (Barbosa et al., 2000, 2003). In contrast,Dgrip75, a protein restricted to the large �-tubulin complex,is essential for female fertility, but not for viability. Muta-tions in Dgrip75 prevent the correct localization of somemorphogenetic determinants during oogenesis, suggesting arole in the organization/dynamics of some subsets of micro-tubules (Schnorrer et al., 2002).In this study, we have performed a functional analysis of

Dgrip84 during mitosis and male meiosis using two inde-pendent strategies (mutant strains and RNA interference[RNAi] in cultured cells). We have also approached the roleof this �-TuSC protein in the organization of microtubulecytoplasmic arrays. Dgrip84, as �-tubulin and Dgrip91, isessential for viability attesting that none of these three pro-teins is fully redundant.

MATERIALS AND METHODS

Cell Culture and RNA-mediated InterferenceRNA interference treatments were performed in S2 cells (Schneider, 1972)according to Clemens et al. (2000). Cells were treated twice with RNAi againstDgrip84 at days 1 and 5, and harvested on day 7 for immunoblotting andimmunofluorescence staining. Dgrip84 double-strand RNA (dsRNA) corre-sponding to positions 1–756 relative to the start of translation was used.

Comparable results have been obtained with dsRNA corresponding to posi-tions 885-1580 (our unpublished data). These dsRNAwere generated from thecDNA clone LD12257 as described in Raynaud-Messina et al. (2004). For coldmicrotubule depolymerization, cells were maintained for 2 h in melting ice.For drug depolymerization, colchicine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wasadded to culture medium to a final concentration of 25 �M and then incu-bated for 16 h.

Fly Strains and Generation of the R20 DeletionStrains y1w1118 and w1118 were used as controls, whereas strains l(1)tPG36(PG36/FM7) and l(1)tPG66 (PG36/FM7), carrying P-element insertions (Bour-bon et al., 2002), were named PG36 and PG66, respectively. To recoverexcision alleles, the PG66 element was mobilized by generating dysgenicfemales carrying the P[ry�, �2-3]99B Sb chromosome (Robertson et al., 1988),crossing them with w� FM7 males, and recovering w� Sb� FM7 balancerfemales. Male lethal strains were kept. One among these new Dgrip84 mutantlines, named R20 (R20/FM7), carries a genomic deletion that has been char-acterized by PCR on single whole third instar (L3) extracts (Gloor et al., 1993).For this purpose, we used gene-specific primers complementary to sequences(available upon request) localized between 1 kb 5� of the translation startcodon and the translation stop codon. Moreover, each of the mutant chromo-some, PG36, PG66, and R20 has been balanced over FM7, P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP] (Casso et al., 2000). These strains were used to select the male mutantlarvae, which were not fluorescent under the stereomicroscope because theydid not possess the green fluorescent protein (GFP)-carrying balancer chro-mosome.

P-Element-mediated Germline Transformation and Testsfor Rescuing Dgrip84 LethalityThe cDNA clone RE10613 was sequenced using internal primers designedspecifically for that purpose. Compared with the genomic DNA sequenced bythe Berkeley Drosophila Genome Project, two point mutations were detected.Thus, the 4.7-kb NsiI/BglII fragment from RE10613 was subcloned into theLD12257 incomplete clone (digested by NsiI/BglII) to get a wild-type com-plete clone, termed RE84. A 2.7-kb EcoRI/XbaI fragment from the RE84 clonewas subcloned into the pUbHB1 vector (Calgaro et al., 2002) to yield thepUb84 construct. The 5.2-kb NotI/XmnI fragment from pUb84 was subclonedinto the NotI/StuI site of the transformation vector pCaSpeR (Thummel andPirrotta, 1992), to give rise to the final rescue construct, P[Ub84,w�]. W�

embryos were coinjected with P[Ub84,w�] and pUChs�2-3 (Mullins et al.,1989), by standard techniques (Rubin and Spradling, 1982). Emerging adultswere crossed individually to w� flies, and w� transformant progeny wasselected. More than 20 independent lines were recovered, chromosomal link-age was determined by crosses with a multiple balancer stock, and homozy-gous stocks were established. Three transformant lines carrying theP[Ub84,w�] construct on the second chromosome (lines 10, 12, and 17) weretested for rescuing the lethality of PG36, PG66, and R20 hemizygous males.Rescue was assessed by scoring for surviving male progeny with the geno-type w�, Dgrip84�/Y; P[Ub84,w�]/�.

AntibodiesThe mouse monoclonal antibodies T-5168 (Sigma-Aldrich) and 1501 (Chemi-con International, Temecula, CA) were used to stain for �-tubulin and actin,respectively. The following rabbit polyclonal antibodies were used: Rb3133against Asp (Saunders et al., 1997) and GM2 against Pav-KLP (Minestrini et al.,2003; gifts from Dr. Glover, University of Cambridge, Cambridge, UnitedKingdom), R19 against Cnn (Heuer et al., 1995; gift from Dr. Kaufman,Howard Hughes Medical Institute, Indiana University, Bloomington, IN), Cidagainst a H3-like protein used as a centromere identifier (Henikoff et al., 2000;gift from Dr. Henikoff, Howard Hughes Medical Institute, Seattle, WA),Rb666 against BubR1 (Logarinho et al., 2004), R62 against 23C �-tubulin(Raynaud-Messina et al., 2001), R522 against Dgrip84, and R7075 againstDgrip91. R522 was raised against the 15 carboxy-terminal amino acids ofDgrip84 and affinity purified on recombinant Dgrip84, produced in Esche-richia coli from the clone pRE84. Under the conditions used for Westernblotting of cultured S2 cells and L3 larval brain extracts, R522 antibodiesspecifically recognized a polypeptide with an apparent mass of 97 kDa. Thislabeling was abolished when antibodies were preincubated with the antigenicpeptide. R7075 was raised against the 414-917 amino acid region of Dgrip91.

Western BlottingProtein extracts from cultured S2 cells (Raynaud-Messina et al., 2001) andfrom total brains were subjected to Western blot analyses as described pre-viously. Total brain extracts were prepared from about 10 brains of eachgenotype, dissected in saline (0.7% NaCl), boiled for 3 min in 2� Laemmlisample buffer and diluted twice.

Cytological AnalysesThe percentages of the different mitotic phenotypes were determined withconfidence intervals calculated for a probability of 95%. For immunostaining,

Role of Dgrip84 during Cell Division

Vol. 17, January 2006 273

cultured S2 cells were fixed in DES culture medium (Invitrogen, CergyPontoise, France) containing 3.7% vol/vol paraformaldehyde (20 min forantibodies R62, R522, Rb666, and Rb3133; 2 min for antibodies Cid, R7075,and R19), permeabilized for 2 min in methanol (�20°C) (Raynaud-Messina etal., 2004), and then incubated with antibodies. For Cid staining, 1-min prein-cubation in DES medium containing 0.05% Triton X-100 and 0.1 mM CaCl2was performed. Mitotic indices were quantified after 4,6-diamidino-2-phe-nylindole (DAPI) staining and �-tubulin (or Centrosomin) immunofluores-cence analysis on fixed preparations or by mitotic spread of the whole cellularsuspension stained with DAPI. Immunostaining of semisquashed L3 larvalbrains was performed as described in Bonaccorsi et al. (2000). DAPI stainingof squashed L3 larval brains were made as described previously (Sunkel et al.,1995). Testes immunostaining was carried out as described in Pisano et al.(1993). For analysis of live testes by phase contrast microscopy, testes weredissected in 0.7% NaCl, transferred onto a clean slide in a drop of NaCl, andcut with tungsten needles near the apical tip to release the cysts through thetestes wall. The testes were gently squashed on the slide with a coverslip byapplying a small piece of blotting paper to one of the edges of the coverslip,while monitoring under a 40� phase contrast objective. Testes were obtainedfrom young dark pupae (PG36), young adults (PG36), or L3 larvae (PG66 andR20). For electron microscopy, cells were fixed and treated as described(Raynaud-Messina et al., 2004).

RESULTS

Characterization of Dgrip84 mutantsA screen carried out to generate recessive lethal P-elementinsertions within X-linked genes allowed the isolation of twoDgrip84 mutant alleles, PG66 and PG36 (Bourbon et al.,2002). These two insertions are located at positions�240 and�350 base pairs, respectively, from the translation initiationATG codon of the previously described Dgrip84 transcript(Oegema et al., 1999). To ensure that the lethality is due tothe insertion event, the PG66 element was remobilized, al-lowing the isolation of viable w� revertants, from which thew� transposon has been precisely excised. Among the gen-erated imprecise excisions of the P-element, we recovered anew lethal allele, R20, which bears a deletion covering alarge section of the coding sequence, including the initiationATG. Finally, three independent transgenic strains, express-ing the wild-type Dgrip84 protein under the control of theubiquitin-63E promoter (see Materials and Methods), are ableto complement the lethality induced by all three mutantalleles, demonstrating that Dgrip84 is essential for viability.Analysis of lethal phases indicates that R20 and PG66

mutants exhibit early lethality (Figure 1A), dying mainlyduring the first and second instars. In contrast, PG36 seems

to be semilethal (Figure 1A), allowing 50% of hemizygousmales to reach the adult stage after a 2-d delay. Thesemutant males show reduced viability (Figure 1A), are sterile,and exhibit abnormalities in the abdominal cuticle and thethoracic macrochaete pattern (our unpublished data), whichare common in mutations affecting mitosis. Together, theseobservations suggest an allelic series with the progressionPG36 � PG66 � R20.Dgrip84 protein level was determined for the different

alleles. Total protein extracts from wild-type L3 larval brainsas well as from hemizygous Dgrip84 mutant brains wereprobed with Dgrip84 antibodies (Figure 1B, top). Comparedwith the signal obtained in wild-type brain extracts, Dgrip84level is strongly reduced below the threshold of detection inthe three mutants. Immunofluorescence analysis shows thatin wild-type L3 larval brains Dgrip84 protein is undetectableduring interphase (our unpublished data) and is present atthe spindle poles throughout mitosis (Figure 1C). In con-trast, 99% of R20 mitotic cells are devoid of Dgrip84 signal(n � 468) (Figure 1C) consistently with the decrease ofDgrip84 levels on Western blots. Similar data were observedwith PG36 (our unpublished data). These results indicatethat Dgrip84 alleles are either null (R20) or severe hypomor-phic alleles (PG36 and PG66).

Dgrip84 Mutations Delay Progression through MitosisBecause �-tubulin complexes are necessary for cell division,mitotic phenotypes have been analyzed in L3 larval brains.For the three Dgrip84 mutants, the mitotic index is elevatedfour- to fivefold (Figure 2A), independently of the progres-sion of the allelic series. Cells accumulate in promet-aphases/metaphases, whereas the percentage of anaphases/telophases decreases (Figure 2B). In all prometaphase/metaphase mutant cells (98–100%, p � 95%), the mitoticcheckpoint is activated as evidenced by staining of kineto-chores with BubR1 antibodies (Figure 2B, inset). More thanhalf of the mutant cells exhibit overcondensed chromosomes(Figure 2C, b and c, and D), consistently with a delay in theprogression through prometaphase/metaphase stages. Mostof the mutant cells show disorganized metaphase plates(Figure 2C, c and d). The occurrence of 25% of cells withDNA content superior to 4N (Figure 2C, c and d, and E)

Figure 1. Characterization of Dgrip84 mu-tants. (A) The three Dgrip84 mutations inducedifferent patterns of lethality. One hundredfirst instars of each mutant genotype andwild-type (WT) were followed until adultstage. The percentage of live individuals—independently of the developmental stage—was determined. The PG66 and R20 allelesinduce an early lethality, whereas the PG36allele induces a belated lethality. (B) Dgrip84protein is not detectable in the brain of thethree mutants. Total protein extracts from L3larval brains (10 brains for each genotype)were submitted to Western blot analyses withaffinity-purified Dgrip84 antibodies (top). Ac-tin was used as an internal loading control(bottom). (C) Dgrip84 protein is recruited atthe centrosome during mitosis in wild-typelarval brains but was not detectable in larvalDgrip84 mutant neuroblasts. L3 larval brainswere probed with affinity-purified antibodies

against Dgrip84 protein (green). Wild-type neuroblasts showed Dgrip84 protein recruitment at the centrosome throughout mitosis, whereasDgrip84 is not detectable at the poles in R20 mutant neuroblasts at any mitotic stage. In all figures except Figure 6, the spindle is shown inred (anti-�-tubulin antibodies) and chromosomes in blue (DAPI staining). Bars, 5 �m.

N. Colombie et al.

Molecular Biology of the Cell274

suggests that these cells escaped the mitotic checkpoint with-out proper cytokinesis and progressed into a new cell cycle.The number of prometaphases/metaphases and the number offigures with overcondensed chromosomes are significantlylower (p � 95%) in PG36 (the weakest allele) than in R20 (thestrongest allele). Overall, these results suggest that Dgrip84 isrequired for cells to complete successfully mitosis.

Dgrip84 Mutant Cells Display Abnormal MicrotubuleOrganization in MitosisPrometaphase delays observed in theDgrip84mutants couldbe a consequence of defects in the mitotic apparatus. There-fore, we have studied the organization of the spindles in R20brains using microtubule staining. In comparison with wild-type brains, we observed a large frequency of cells (42%)with a monopolar or a highly abnormal microtubule orga-nization devoid of distinct polarity (Figure 3A; n � 1622).Conversely, there is a severe decrease in the frequency ofcells with normal bipolar spindles (Figure 3A; n � 1622). Alarge percentage (20%) of these bipolar spindles are asym-metrical as judged by microtubule density or/and polarfocalization. Mutant cells show abnormal distribution ofAbnormal spindle protein (Asp), a protein that accumulatesat the minus ends of microtubules (do Carmo Avides andGlover, 1999; Wakefield et al., 2001; Riparbelli et al., 2002). Inwild-type prometaphases, Asp occurs as a regular stainingon the side of the centrosome facing the spindle (Figure 3B,a). In R20 mutant brains, most cells with bipolar spindles(88%) show faint Asp signals at the poles (Figure 3B, b).Most monopolar spindles (60%) exhibit a single Asp dot atthe pole (Figure 3B, c), whereas the remaining shows abnor-mal Asp labeling at secondary sites. In cells devoid of mi-crotubule organization, Asp is detected but with an abnor-mal distribution (Figure 3B, d). In all cases, the signals seemweaker than in wild-type cells. These observations suggestthat Dgrip84 is necessary for proper organization of spindlemicrotubules.

Figure 3. Abnormal mitotic organization in R20 neuroblasts. (A)Percentage of bipolar spindles is decreased, whereas the percentage ofmonopolar and disorganized figures is increased. The percentage ofbipolar (BP), monopolar (MP), and disorganized (DIS) mitotic figureswas calculated using spindle labeling (�-tubulin antibodies) of nine L3larval brains for each genotype (WT, n � 910; and R20, n � 1622). (B)Mitotic cells exhibit Asp labeling at least at one pole. The Asp signal(green) is weaker in the mutant (b–d) than in the wild type (a). Mostbipolar (b; 97%), monopolar (c; 100%), and disorganized mitotic appa-ratus (d; 93%) exhibit a labeling with Asp antibodies (green). Disorga-nized microtubule figures exhibited two opposite dots (62%; d, arrow-heads), one dot (20%), or several dots (12%). Bars, 5 �m.

Figure 2. Mitotic phenotypes in Dgrip84mutants. Observations were made on L3 lar-val neuroblasts. (A) The mitotic index is in-creased in the three mutants. The percentageof mitotic figures was recorded on five brainsfor each genotype. Confidence intervals (inparentheses) are calculated for a probabilityof 95%. (B) Mutant neuroblasts accumulate inprometaphases/metaphases. For each geno-type, the different mitotic stages were re-corded in 250 cells undergoing mitosis(graph). The inset shows two typical controland mutant prometaphase figures, exhibitingBubR1 (in green) localized at the kineto-chores. (C) Abnormal chromosomal plates areobserved in R20mutant neuroblasts. L3 larvalbrains were squashed and stained with DAPI.a, Wild-type metaphase plate showing eight(4N) normally condensed chromosomes; b,mutant cell showing eight overcondensedchromosomes; c, aneuploid mutant cell withovercondensed chromosomes; and d, hyper-ploid mutant cell showing 32 chromosomes(16N). (D and E) Percentage of overcon-densed chromosomal figures (D) and the per-centage of hyperploid metaphase cells (E) areincreased in the three mutants. Five brainswere scored for each genotype. Chromosomeovercondensation was analyzed in 300 mi-totic cells. Bars, 5 �m.

Role of Dgrip84 during Cell Division

Vol. 17, January 2006 275

Dgrip84 Mutant Cells Exhibit Abnormal CentrosomeMaturation�-Tubulin recruitment at the centrosome was analyzed inR20mitotic neuroblasts. Whereas �-tubulin is located at bothpoles of wild-type spindles, it is no longer detected at thepoles in mutant mitotic cells independently of their micro-tubule organization (Figure 4A). Defects at the spindle poleswere confirmed by centrosomin (Cnn) staining (Figure 4B).This centrosomal component, dispersed during interphase,is recruited to the pericentriolar matrix during mitosis (Liand Kaufman, 1996; Megraw et al., 1999). In wild-type neu-roblasts, spindle poles labeled with Cnn exhibit a sphericalsignal (Figure 4B, a) corresponding to functional centro-somes. In R20 mutant brains, one or two Cnn-containingbodies are detected in most mitotic cells (Figure 4B, b–d), incontrast to the complete absence of �-tubulin in these cells.Cnn-containing bodies show abnormal number, shape, orlocalization. Some cells contain only one dot, whereas othersexhibit two dots at the same pole (Figure 4B, c and d),suggesting that abnormalities in the duplication or/and inthe separation of centrosomes might have occurred. Among

these Cnn-containing bodies, a few have lost the sphericalshape and look large (Figure 4B, b, arrow) and/or irregular(Figure 4B, b, arrowhead). Cells with more than two dots arealso observed. Some of them exhibit a major fragmentedsignal or three to eight small Cnn bodies of various sizesdispersed within the mitotic apparatus, suggesting a frag-mentation of the pericentriolar material (our unpublisheddata). Hence, Dgrip84 is likely to be an essential element forthe correct maturation and organization of the pericentriolarmaterial during mitosis.

Mitotic Microtubule Organization after Depletion ofDgrip84 in Cultured S2 CellsIn Dgrip84 mutant strains, even when the maturation of thepericentriolar material is compromised, mitotic spindles, al-beit strongly abnormal, are present. To determine how thesespindles are generated, we carried out RNA-mediated inter-ference in cultured Drosophila S2 cells. Western blot analysisrevealed that Dgrip84 is undetectable after a 7-d treatment,whereas the level of actin is not altered.The mitotic index is increased (4% [3.4–4.6], n � 3771

compared with 1.2% [1–1.4], n � 10,020 in untreated cells).This mitotic arrest coincides with the maintenance of anactive mitotic checkpoint as judged by strong BubR1 signalsat kinetochores, whatever the spindle morphology (Supple-mental Figure A). Although both Dgrip84 mutation andRNAi treatment induce a significant mitotic accumulation,this increase is surprisingly moderate (3-fold). Three hy-potheses could explain this slight blockage: microtubuledefects after down-regulation of �-TuSC proteins are incom-petent to trigger an efficient spindle checkpoint; or theypromote another cell cycle checkpoint, preventing cells fromreaching mitosis; or the �-TuSC is involved in mitotic check-point regulation in a manner independent of microtubulenucleation and attachment functions. To discriminateamong these possibilities, we have determined mitotic indi-ces in Dgrip84-depleted cells exposed to a microtubule poi-son such as colchicine. We scored the mitotic index usingthree independent parameters: by monitoring chromosomecondensation on the whole cell population or on coverslip-fixed cells (data not shown) or by quantifying polar Cnnrecruitment (Table 1). Both criteria gave comparable results.Treatment with the anti-microtubule agent blocks cells inmitosis in an efficient manner (10-fold increase of the mi-totic index). Interestingly, this arrest is weakened when cellshave been previously submitted to Dgrip84 RNAi (only4-fold increase compared with control). Together with theincrease in aneuploidy in Dgrip84 mutants (see above), thesedata strongly suggest that Dgrip84 down-regulation induces

Figure 4. Abnormal centrosome organization in R20 mutants. (A)�-Tubulin is absent at the poles in mutant mitotic cells. Wild-typemitotic figures (a) show a �-tubulin signal (green) at both poles. Incontrast, in mutant brains, most mitotic cells are devoid of �-tubulinsignal, forming either bipolar spindles (BP, b), monopolar spindles(MP; c), or disorganized mitotic apparatus (DIS; d). A quantitativeview is underlying in the table. (B) Localization of Cnn is abnormalin Dgrip84 mutants. In wild type, the Cnn signal is detected as asingle dot at both poles in nearly all mitotic figures (a; table). Inmutant brains, the presence of two opposite Cnn dots (b) is ob-served only in a fraction of mitotic figures (table), whereas mitoticcells often exhibit one dot (c), two nonopposite dots (d), or morethan two dots. Besides these abnormalities, Cnn dots can be verylarge (b; arrow) or can exhibit an abnormal nonspherical shape (b;arrowhead). Bars, 5 �m.

Table 1. Quantification of mitotic indices after depletion of Dgrip84and/or colchicine treatment

% Cnn labeling

Control 2.5 (2–3)RNAi-Dgrip84 treated 6 (5–7)Control � colchicine 24 (20–28)RNAi-Dgrip84 treated � colchicine 10 (9–11)

Cells are treated twice with RNAi against Dgrip84, and 16 h beforeharvest they were exposed to 25 �M colchicine. Mitotic indices aredetermined after immunolabeling of the poles with Cnn whoserecruitment is insensitive to RNAi and colchicine treatments. Dataare representative of two independent experiments. n 100.

N. Colombie et al.

Molecular Biology of the Cell276

an untimely exit of mitosis. It could explain, at least par-tially, why RNAi-treated cells fail to arrest efficiently theirmitotic progression. Accordingly with the analyses done inS. pombe and Aspergillus nidulans (Vardy and Toda, 2000;Hendrickson et al., 2001; Prigozhina et al., 2004), we supportthe hypothesis of a role of Dgrip84 in spindle checkpointregulation.Dgrip84 RNAi treatment affected the overall mitotic orga-

nization (Table 2). A main characteristic is a great increase inthe percentage of monopolar spindles (Table 2 and Figure5B, c, f, and i). Although the relative number of bipolarspindles remains unchanged, most are asymmetrical andabnormally elongated (Figure 5B, b, e, and h), often com-posed of large microtubule bundles with unfocused poles(Figure 5B, b). Interestingly, in contrast to control promet-

aphases, Dgrip84-depleted mitotic cells lack astral microtu-bules (Figure 5B, a–c, insets). Immunofluorescence analysisconfirmed that Dgrip84 protein is substantially depletedfrom the mitotic poles and along spindle microtubules (Sup-plemental Figure B and Table 3). The two other componentsof the �-TuSCs (�-tubulin and Dgrip91) also fail to be re-cruited to the poles in 95% of prometaphase figures (Sup-plemental Figure B and Table 3). Moreover, �-tubulin stain-ing is no longer detectable along spindle microtubules andto the midbody (our unpublished data). Therefore, the phe-notypes resulting from the depletion of Dgrip84 in culturedS2 cells are in all respects similar to the phenotypes observedin Dgrip84 mutants.Because Dgrip84 depletion affects microtubule organiza-

tion rather than their formation, we have next determinedwhether the poles retain some capacity to assemble micro-tubules. RNAi-treated cells still show a polar localization ofCnn (Figure 5B, b and c, and Table 3), but its recruitment isabnormal. Most cells containing bipolar spindles show twoCnn-labeled poles but with an asymmetrical distribution.When only one pole is stained, Cnn could occur as a singledot (Figure 5B, b), but in most cases three to four dots areobserved (Figure 5B, c). The distribution pattern of Cnnmight suggest an abnormal number of centriolar structuresat the pole(s). Immunostaining for the Asp protein inDgrip84-depleted cells gives strong support for this inter-pretation. This microtubule minus end marker is still clus-tered around the pole(s) (Table 3) but mostly occurs as oneor multiple irregular structures (Figure 5B, e and f). Thissuggests that most of the microtubules retain their normalorientation but are organized from several microtubule nu-cleation centers. Electron microscopy (EM) analysis supports

Table 2. Quantification of mitotic progression after depletion ofDgrip84

Mitotic stages Control % Treated %

Prophases 15 (8–22) 7 (2–12)PrometaphasesNo polarity 1 (0–3) 10 (5–15)Monopolar spindles 1 (0–3) 24(16–32)Bipolar spindles 53(43–63) 54(45–63)

Late stages 30(21–39) 5 (1–9)

Mitotic stages were determined after chromosome staining (DAPI)and immunolabeling of microtubules (�-tubulin antibodies). Dataare representative of three independent experiments. n 100.

Figure 5. Characterization of microtubulearrays after Dgrip84 depletion in culturedcells. (A) Dgrip84 level is strongly reducedafter RNAi treatment. A total protein extract(50 �g) of control cells (C) or of cells subjectedto RNAi treatment (T) was analyzed by im-munoblotting using affinity-purified Dgrip84antibody and antibody directed against actin(internal loading control). (B and C) Dgrip84is essential for the correct bipolar organiza-tion of the spindle. (B) Immunofluorescenceanalyses. The staining in green corresponds tothe mitotic polar markers, Cnn (a–c) and Asp(d–f), or to the centromeric marker Cid (g–i).For a–c, white and black insets represent mi-crotubule staining at the poles. For Cid stain-ing, calcium pretreatment was performed toselectively disassemble astral microtubules.Bars, 5 �m; For e, f, and h, same bar than in i.(C) Electron microscopy characterization of amonopolar spindle. Microtubules emanatefrom the centriolar microtubule triplets (ar-rows) at a polar region defined by a cluster ofsupernumerary centrioles. In this section, onemicrotubule (arrowheads) extends all the wayfrom the centrioles to the kinetochore surface(Kt; surrounded in black) of the chromosome(Ch). Bar, 0.2 �m. (D) Dgrip84 is required forthe organization and the maintenance of thedynamics of interphase microtubules. Inter-phase microtubule array (�-tubulin immuno-staining) is monitored after cold microtubuledepolymerization (2 h at 4°C) followed by2-min incubation at 22°C in control (a) or inDgrip84-depleted cells (b). Bars, 5 �m.

Role of Dgrip84 during Cell Division

Vol. 17, January 2006 277

the view that at least some poles possess supernumerarycentrioles (Figure 5C). Interestingly, we could not clearlydetect microtubules radiating from pericentriolar material,but numerous microtubules occur in continuity with thecentriolar microtubule triplets (Figure 5C, arrows). There-fore, these abnormal centrosome-like structures retain somemicrotubule nucleation/organization capacity, but mostlikely through an atypical assembly pathway.Because Dgrip84 mutants show defects in prometaphase

chromosome congression, we have next determinedwhether spindle microtubules in Dgrip84-depleted cells areable to establish stable end-on interactions with kinetochoresusing Cid as a centromere marker (Henikoff et al., 2000).Before immunostaining, cells were preincubated with buffercontaining calcium, which selectively dissociates nonkinet-ochore microtubules (compare Figure 5B, a with g). In cellsshowing either mono- or bipolar spindles, most kineto-chores occur in the vicinity of microtubule bundles (Figure5B, h–i), suggesting that kinetochores specifically associatewith the plus ends of microtubule bundles. However, incontrast to control cells, in Dgrip84-depleted conditions,chromosomes are often found not aligned, closely posi-tioned to the poles or distributed along the spindle. Similarresults have been obtained after immunolabeling with theBubR1 marker (Supplemental Figure A). EM analysis furthersupports this result. In cells depleted for Dgrip84, bundles ofmicrotubules running from the spindle pole made contactwith individual chromosomes at the kinetochores (Figure5C). Within these kinetochore-fibers, some microtubulesseem to be elongated from centriolar triplets (Figure 5C,arrowheads). Even though the spindles are not fully func-tional, our results show that without detectable �-TuSCcomponents at the poles, the mitotic microtubules are stillable to establish an interaction with the kinetochores. How-ever, we cannot determine whether these microtubules areelongated at kinetochores (Maiato et al., 2004), whether ki-netochores capture microtubules abnormally assembled atcentrosomal level, or whether both mechanisms contributeto kinetochore fiber assembly.

Dgrip84–RNAi Treatment Induces Subtle Effects onInterphase Microtubule NetworkDepletion of Dgrip84 does not induce obvious cytoskeletaldefects during interphase. Microtubule arrays do not radiatefrom a unique site but is organized into a dense networkemerging from multiple points. EM analysis shows the pres-ence of centrosome-like structure, from which emerge orconverge none or very few microtubules (our unpublished

data). All the pericentriolar markers we tested (�-tubulin,Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, and Dgrip163) do notstain this structure (our unpublished data), suggesting acentrosome with little or none pericentriolar material. Theantibody against �37CD-tubulin, which exhibits biochemicalcharacteristics of a centriolar component, decorates a spot atthe periphery of the nuclear envelope only in late G2(Raynaud-Messina et al., 2004). Together, our results suggestthat interphase centrosomes are not fully competent formicrotubule organization in S2 cells. The same hypothesishas been drawn for interphase centrosomes in larval braincells (Martinez-Campos et al., 2004). The existence of variousfocalization points and the complexity of interphase cy-toskeleton organization could prevent the observation of aparticular phenotype after inhibition of Dgrip84. After colddisassembly, microtubule regrowth occurred from severalpoints without any preferential focalization, both in controland RNAi-treated cells (Figure 5D, a and b). However, adecrease in the number of regrowth points and the appear-ance of abnormally long cytoplasmic microtubules are no-ticed in Dgrip84-depleted cells (Figure 5D, b) compared withcontrol. This phenotype occurs from 1 min at 22°C andmaintained for longer regrowth times. These experimentspoint to a potential role of Dgrip84 in the organization andthe dynamics of the microtubules during interphase.

Dgrip84 Is Also Required for SpermatogenesisBesides its role during mitosis, Dgrip84 also seemed to berequired for spermatogenesis because the adult PG36 mu-tant males are sterile. Moreover, it is known that the spindleintegrity checkpoint is less stringent during meiotic divi-sions than during neuroblast mitosis (Giansanti et al., 2001).Therefore, this peculiarity has allowed us to gain someinformation on the evolution of mitotic figures in Dgrip84-silencing conditions. In wild-type, meiosis results in theformation of a cyst containing 64 spermatids. During the“onion stage,” each one consists of a single round phase-light haploid (N) nucleus associated with a phase-densespherical mitochondrial aggregate of similar size, called theNebenkern (Figure 6A, a). In adult mutant males, most ofthe scored cysts display only 16 spermatids, suggesting thatDgrip84 is necessary for the proper completion of the twomeiotic divisions. Moreover, almost all the spermatids showabnormalities in the number and/or size of Nebenkerns andnuclei. The most frequent abnormalities we noticed were 1)spermatids exhibiting a 1:1 ratio of nuclei to Nebenkern andnuclei with a size compatible with a tetraploid content (Fig-ure 6A, b); 2) spermatids showing many nuclei of the same

Table 3. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after depletion of Dgrip84 in cultured cells

Staining

Treated, %

Control, % Bipolar

One pole Both poles Monopolar One pole Both poles

Dgrip84 4 (1–7) 88 (82–94) 5(1–9) 4 (1–7) 6 (2–10)�-Tubulin 3 (0–6) 97(94–100) 0 0 10 (3–17)Dgrip91 7(2–12) 93 (88–98) 1(0–3) 2 (0–4) 0Asp 100 100 1 (0–2) 98(96–100)Cnn 5 (1–9) 95 (91–99) 100 35 (27–43) 65 (57–73)

Microtubules were stained with antibodies against �-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostainedwith antibodies against Dgrip84, �-tubulin, Dgrip91, Asp, or Cnn. n 100.

N. Colombie et al.

Molecular Biology of the Cell278

size or of various sizes but only one large Nebenkern (Figure6A, c); and 3) spermatids with many Nebenkerns and one orseveral nuclei. According to previous studies (Sunkel andGlover, 1988), these abnormalities could be the conse-quences of defects in mitochondria localization on the spin-dle, failure of cytokinesis, or defects in the fidelity of chro-mosome segregation and karyokinesis.To further investigate the organization of the microtubule

cytoskeleton in mutant meiosis, observations of live sper-matocytes by phase contrast microscopy and immunostain-ing of fixed preparations have been carried out. In wild-typeprimary spermatocytes, two asters are organized from theduplicated centrosomes and begin to separate at the onset ofmeiosis. In contrast, in mutant primary spermatocytes thesetwo microtubule asters are not clearly detectable. Very fewmutant meiotic cells seem to acquire a bipolar spindle orga-nization (Figure 6C, b, arrow). Most are highly abnormal.Some are devoid of any polarity (Figure 6C, b and c, arrow-heads); others exhibit monopolar-like structures, where mi-crotubules seemed to be organized mainly from one or two

close asters (Figure 6C, d, arrow, and D, c, white rectangles).Among monopolar-like figures, some exhibit microtubulesthat diverge in an umbrella shape (Figure 6C, d, arrow),whereas in others, microtubules converge to the apex of acone (Figure 6B, c, and C, c, arrows).In wild-type primary spermatocytes, the two centrioles of

each centrosome are always decorated by antibodies againstCnn (our unpublished data) (Li et al., 1998), even though atthis stage, only a small amount of pericentriolar material ispresent and closely associated to these structures (Martinez-Campos et al., 2004). As cells enter meiosis, Cnn is massivelyrecruited to the centrosome at the spindle poles of wild-typecells (Figure 6C, a). In mutant primary spermatocytes, Cnnstaining is faint but often occurs as more than four dots percell (our unpublished data), suggesting defects in centro-some segregation during the premeiotic mitosis. Duringmeiosis, Cnn antibodies stain zero to six dots per cell, al-though two (Figure 6C, b–d) or four dots are generallyobserved. In cells with a disorganized microtubule cytoskel-eton, these Cnn-containing bodies remained together or are

Figure 6. Meiotic phenotypes in PG36 mutants. (A and B) Onion stage spermatids (A, a–c) and spindle organization (B, a–c) are abnormalas viewed by phase contrast microscopy. (A, a) Wild type spermatids (nu, nucleus; nb, Nebenkern). (A, a and b) PG36 spermatids showabnormal phenotypes. (B, a and b) The dark band (pdm, phase dense material) outlining the equatorial region of the spindle corresponds toa system of parafusorial membranes and mitochondria that lines up along the nuclear membranes and microtubules. (B, a) Wild-typemetaphase. (B, b) Wild-type telophase. (B, c) Conical-shaped structure observed in mutant meiosis. (C) Organization of meiotic spindles andCnn localization are abnormal in PG36 mutants. Cnn is shown in red and microtubules in green. a, Wild-type bipolar spindles. b and c,arrowheads, Mutant disorganized figures. c, arrows, Mutant conical-shaped structures. d, arrow, Mutant umbrella-shaped structures. (D)Pav-KLP recruitment is abnormal. Pav-KLP (red) recruitment in the ring canals is shown by arrows (a–c, and f). Pav-KLP is recruited on thecentral spindle in wild-type anaphases and telophases (a and b, arrowheads). In mutant cells (c–f), Pav-KLP is not detectable at the putativeplus ends of microtubules in the umbrella-shaped structures (c, arrowhead), but it is recruited at the apex of the cones (f, arrowheads). d ande, To better visualize centrosomal Pav-KLP signal, the top- (d) and bottom (e)-selected regions of c have been 2.25-fold enlarged and signalenhanced. Bars, 10 �m.

Role of Dgrip84 during Cell Division

Vol. 17, January 2006 279

dispersed, whereas in most of the monopolar-like structures,they are located together at the asters. Moreover, the inten-sity of Cnn signals decreases in mutant meiotic cells. Thisobservation is consistent with the weak labeling of the cen-trioles in mutant primary spermatocytes and suggests thatCnn recruitment does not occur properly. To understandwhether mutant cells containing these monopolar-like mi-crotubule structures could evolve toward cytokinesis, wehave analyzed by immunostaining the recruitment of Pa-varotti-KLP (Pav-KLP), a kinesin-like protein related to themammalian MKLP-1, that is necessary for the completion ofcytokinesis (Adams et al., 1998) (Figure 6D). In wild-typemale meiosis, Pav-KLP localizes to the ring canals, remnantsof the contractile rings from earlier divisions, which occur assmall red rings or dots (Figure 6D, a and b, arrows). Itweakly labels the centrioles at the spindle poles. This proteinalso localizes to the central spindle in anaphase (Figure 6D,a, arrowhead) and concentrates in the midzone in telophase(Figure 6D, b, arrowhead). In mutant cells, the localization ofPav-KLP in the ring canals does not seem to be affected(Figure 6D, c and f, arrows), and its recruitment at thecentrosomes still occurs (Figure 6D, d and e). However,Pav-KLP dots often localize within the same aster (Figure6D, d and e) and an abnormal number of dots per cell can bedetected (our unpublished data). These results support thehypothesis that Dgrip84 is necessary for proper centrosomeseparation. In the umbrella-shaped microtubule structuresPav-KLP is never detected at the putative plus end of mi-crotubules (Figure 6D, c, arrowhead), whereas in cones Pav-KLP is associated with microtubules at the apex but never ina ring shape (Figure 6D, f, arrowheads). These observationssuggest that at least some of the abnormal meiotic spindlesin Dgrip84 mutant cells are able to recruit a cytokinesismarker but in a highly inappropriate way.

DISCUSSION

The function of the three constituents of the �-TuSC has beenexamined using genetic approaches only in unicellular or-ganisms. These analyses must be further investigated inanimals where �-tubulin is assumed to be recruited to thecentrosome as �-TuRC. Functional analysis of �-tubulin-associated proteins in metazoans has been mainly restrictedto Drosophila: Dgrip91, a �-TuSC protein, and Dgrip75, aprotein that specifically belongs to the large complex. Thestudy of Dgrip84, the third component of the small complexin D. melanogaster, completes the functional characterizationof the �-TuSC, allowing for the first time a comparison of thephenotypes resulting from the disruption of each �-TuSCcomponent in a same metazoan.Their depletion has no obvious effect on the cytoskeleton

organization during interphase. However, in Dgrip84- or�-tubulin-depleted cells, regrowth experiments allow theappearance of abnormally long and less numerous cytoplas-mic microtubules compared with control (this study; ourunpublished data). It could be indicative of a role of �-TuSCproteins in the assembly and the maintenance of the lengthof interphase microtubules. Long microtubules could alsoresult from an increase of the concentration of free tubulin inconsequence of low microtubule assembly. Similar pheno-types displaying long microtubules have been observed af-ter mutations in the �-tubulin encoding gene both in bud-ding yeast and A. nidulans and in �-TuSC components in S.pombe (Marschall et al., 1996; Spang et al., 1996; Vardy andToda, 2000; Jung et al., 2001). In S2 cells, this effect could behidden because of the density and the complexity of micro-tubule arrays. Whatever the outset of interphase microtu-

bules in Drosophila cells, functional �-TuSC seems requiredin some aspects of microtubule dynamics and organization.Disruption of each �-TuSC component promotes a mod-

erate increase of the mitotic index (Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004; this study). The arrest is weakcompared with the one induced after a microtubule poisontreatment. Moreover, Dgrip84–RNAi depletion previouslyto drug exposure reduces significantly the blockage extent,suggesting a deregulation of the spindle checkpoint or anactivation of another cell cycle checkpoint. Inactivation ofDrosophila �-tubulin, Dgrip84, or Dgrip91 results in largepolyploid nuclei (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000; thisstudy). This observation strengthens the idea that when the�-TuSC integrity is affected, cells could escape prematurelyfrom the mitotic checkpoint. These results are consistentwith several sets of data. Human �-tubulin mutants ex-pressed in S. pombe allow cytokinesis to proceed in spite ofspindle abnormalities (Hendrickson et al., 2001). Some allelesof the A. nidulans �-tubulin gene exhibit a slight delay inmitosis and could enter interphase without correct division,even after a microtubule-destabilizing treatment (Prigozhinaet al., 2004). In S. pombe, mutations in genes encoding �-tu-bulin interacting proteins bypass the spindle assemblycheckpoint and cause the untimely activation of the septa-tion initiation network (Vardy and Toda, 2000; Vardy et al.,2002). Together, these results suggest a role of the �-TuSC inthe mitotic checkpoint control.Mitotic figures of Dgrip84-depleted cells exhibit monopo-

lar morphology or microtubule arrays that fail to defineorientated polar structures and correct chromosome con-gression. This is also a characteristic feature of cells lackingDgrip91 or �-tubulin (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004). In monopolar spindles, Cnn-and Asp-labeling patterns are consistent with the presenceof supernumerary centrioles at the poles. Electron micros-copy analysis supports this view, suggesting that centro-somes fail to segregate. This abnormality has also beenobserved both in Dgrip91 mutant neuroblasts and after23C�-tubulin depletion in S2 cells (Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004). Moreover, Dgrip84 mutantspermatocytes exhibit monopolar structures. Similar figures,described in �-tub23C and Dgrip91 mutant spermatocytes(Sampaio et al., 2001; Barbosa et al., 2003), have been shownto be the consequence of the collapse of the two poles.Drosophila �-TuSC assembly seems necessary for the properseparation of the centrosomes. Similar observations wereobtained after �-tubulin depletion in Caenorhabditis elegans,where separated asters are reapproaching in late prophase(Strome et al., 2001). The simplest interpretation is that themicrotubule network involved in the maintenance of centro-some separation is defective either in its dynamics or itsdensity.Our studies emphasize that, after Dgrip84 depletion, some

assembly and organization of spindles still occur and pointto mechanisms of nucleation independent of �-tubulin com-plexes. Microtubule organization still takes place at thepoles. However, instead of emerging from pericentriolarmaterial, some microtubules occur in continuity with cent-riolar triplets. Although this mechanism is unlikely to bedominant in the wild-type spindle assembly, it could ac-count for the nucleation of some microtubules in Dgrip84-depleted cells that are characterized by anastral spindles.Some microtubules are able to establish contact with kinet-ochores showing that they retain some of their functionalproperties. Strong BubR1 signal in RNAi-treated cells isconsistent with kinetochore-microtubule occupancy but al-terations in microtubule tension (Logarinho et al., 2004).

N. Colombie et al.

Molecular Biology of the Cell280

Depletion of Dgrip84 prevents both �-tubulin andDgrip91 localization at the poles. Moreover, �-tubulin de-pletion impairs Dgrip84 and Dgrip91 mitotic recruitment(Raynaud-Messina et al., 2004; our unpublished data). There-fore, it is likely that �-TuSC components must be assembledin complexes before relocalization to the poles or that�-TuSC proteins are required for �-tubulin polar attachment.This view, supported by studies in S. cerevisiae (Nguyen etal., 1998), has been recently extended to mammalian cells:the �-TuRCs could be anchored to the centrosome via inter-actions of GCP2 (Dgrip84 orthologue) and GCP3 (Dgrip91orthologue) with the centrosomal proteins CG-NAP andpericentrin (Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004).In Drosophila, the calmodulin-binding protein CP309 hasbeen proposed to tether the �-TuRC to the centrosomethrough direct binding with �-TuSC components (Kawagu-chi and Zheng, 2004). So, the �-TuSC grip-motif proteinsseem essential, due to their critical role in the attachment of�-tubulin complexes to the pericentriolar matrix. In contrast,the proteins specific for the �-tubulin large complexes char-acterized so far, like Drosophila Dgrip75 and S. pombe Alp16p(Dgrip163 orthologue) or Gfh1p (Dgrip75 orthologue), arenot essential for cell viability (Fujita et al., 2002; Venkatram etal., 2004). It could be hypothesized that these �-tubulin part-ners play a role in the organization or in the dynamics of asubset of microtubules.Analysis of meiosis in mutant spermatocytes reveals that

Dgrip84, like Dgrip91 and �-tubulin (Sampaio et al., 2001;Barbosa et al., 2003), is required for completion of the twomeiotic divisions. In the absence of one of the �-TuSC com-ponents, abnormal mitotic spindles can evolve toward acentral spindle-like structure as viewed by the recruitmentof different markers (Polo Kinase, Klp3A [Sampaio et al.,2001], Asp [Barbosa et al., 2003], Pav-KLP [Barbosa et al.,2003]; this study). Nevertheless, these proteins exhibit ab-normal localization and cytokinesis is strongly asymmetricaland/or clearly abortive.In conclusion, we present the characterization of the third

and last component of a metazoan �-TuSC. Together withprevious studies, our data strongly suggest that the integrityof this complex must be maintained to ensure �-tubulinrecruitment, proper microtubule organization and an effi-cient mitotic checkpoint. In contrast, the depletion of�-TuRC-specific proteins does not impair viability and �-tu-bulin accumulation. We suggest that the �-TuSC could be auniversal and minimal subunit required for �-tubulin re-cruitment to the cytoskeleton structures and proper micro-tubule nucleation in eukaryotic cells.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Drs. D. Glover, T. Kaufman, and S. Henikoff for the gift of anti-bodies against Asp, Cnn, and Cid, respectively. We thank Dr. D. L. Cribbs forsupport and Dr. A. Merdes for critical comments on the manuscript. Thiswork was supported by a grant from the Association pour la Recherche sur leCancer and Feder Funds. N. C. is supported by the Ministere de la Rechercheand the Association pour la Recherche sur le Cancer.

REFERENCES

Adams, R. R., Tavares, A. A., Salzberg, A., Bellen, H. J., and Glover, D. M.(1998). pavarotti encodes a kinesin-like protein required to organize thecentral spindle and contractile ring for cytokinesis. Genes Dev. 12, 1483–1494.

Barbosa, V., Gatt, M., Rebollo, E., Gonzalez, C., and Glover, S. M. (2003).Drosophila dd4 mutants reveal that �TuRC is required to maintain juxtaposedhalf spindles in spermatocytes. J. Cell Sci. 116, 929–941.

Barbosa, V., Yamamoto, R. R., Henderson, D. S., and Glover, D. (2000).Mutation of a Drosophila � tubulin ring complex subunit encoded by discs

degenerate-4 differentially disrupts centrosomal protein localization. GenesDev. 14, 3126–3139.

Bobinnec, Y., Fukuda, M., and Nishida, E. (2000). Identification and charac-terization of Caenorhabditis elegans �-tubulin in dividing cells and differenti-ated tissues. J. Cell Sci. 113, 3747–3759.

Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., and Gatti, M. (2000). Spindle assembly inDrosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nat. Cell Biol. 2, 54–56.

Bourbon, H. M., et al. (2002). A P-insertion screen identifying novel X-linkedessential genes in Drosophila. Mech. Dev. 110, 71–83.

Calgaro, S., Boube, M., Cribbs, D. L., and Bourbon, H. M. (2002). The Dro-sophila gene taranis encodes a novel trithorax group member potentiallylinked to the cell cycle regulatory apparatus. Genetics 160, 547–560.

Casso, D., Ramirez-Weber, F., and Kornberg, T. B. (2000). GFP-tagged bal-ancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91, 451–454.

Clemens, J. C., Worby, C. A., Simonson-Leff, N., Muda, M., Maehama, T.,Hemmings, B. A., and Dixon, J. E. (2000). Use of double-stranded RNAinterference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6499–6503.

do Carmo Avides, M., and Glover, D. M. (1999). Abnormal spindle protein,Asp, and the integrity of mitotic centrosomal microtubule organizing centers.Science 283, 1733–1735.

Erickson, H. P., and Stoffler, D. (1996). Protofilaments and rings, two confor-mations of the tubulin family conserved from bacterial FtsZ to �/� and �tubulin. J. Cell Biol. 135, 5–8.

Fava, F., RaynaudMessina, B., Leung Tack, J., Mazzolini, L., Li, M., Guillemot,J. C., Cachot, D., Tollon, Y., Ferrara, P., and Wright, M. (1999). Human 76p: anew member of the �-tubulin-associated protein family. J. Cell Biol. 147,857–868.

Fujita, A., Vardy, L., Garcia, M. A., and Toda, T. (2002). A fourth componentof the fission yeast �-tubulin complex, Alp16, is required for cytoplasmicmicrotubule integrity and becomes indispensable when �-tubulin function iscompromised. Mol. Biol. Cell 13, 2360–2373.

Geissler, S., Pereira, G., Spang, A., Knop, M., Soues, S., Kilmartin, J., andSchiebel, E. (1996). The spindle pole body component Spc98p interacts withthe �-tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae at the sites of microtubuleattachment. EMBO J. 15, 3899–3911.

Giansanti, M. G., Bonaccorsi, S., Bucciarelli, E., and Gatti, M. (2001).Drosophilamale meiosis as a model system for the study of cytokinesis in animal cells.Cell Struct. Funct. 26, 609–617.

Gloor, G. B., Preston, C. R., Johnson-Schlitz, D. M., Nassif, N. A., Phillis, R. W.,Benz, W. K., Robertson, H. M., and Engels, W. R. (1993). Type I repressors ofP element mobility. Genetics 135, 81–95.

Gunawardane, R. N., Martin, O. C., Cao, K., Zhang, L., Dej, K., Iwamatu, A.,and Zheng, Y. (2000). Characterization and reconstitution of Drosophila �-tu-bulin ring complex subunits. J. Cell Biol. 151, 1513–1523.

Gunawardane, R. N., Martin, O. C., and Zheng, Y. (2003). Characterization ofa new �-TuRC subunit with WD repeats. Mol. Biol. Cell 14, 1017–1026.

Hendrickson, T. W., Yao, J., Bhadury, S., Corbett, A. H., and Joshi, H. C.(2001). Conditional mutations in �-tubulin reveal its involvement in chromo-some segregation and cytokinesis. Mol. Biol. Cell 12, 2469–2481.

Henikoff, S., Ahmad, K., Platero, J. S., and Van Steensel, B. (2000). Hetero-chromatic deposition of centromeric histone H3-like proteins. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97, 716–721.

Heuer, J. G., Li, K., and Kaufman, T. C. (1995). The Drosophila homeotic targetgene centrosomin (cnn) encodes a novel centrosomal protein with leucinezippers and maps to a genomic region required for midgut morphogenesis.Development 121, 3861–3876.

Horio, T., Uzawa, S., Jung, M. K., Oakley, B. R., Tanaka, K., and Yanagida, M.(1991). The fission yeast �-tubulin is essential for mitosis and is localized atmicrotubule organizing centers. J. Cell Sci. 99, 693–700.

Joshi, H. C., Palacios, M. J., McNamara, L., and Cleveland, D. W. (1992).�-Tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent micro-tubule nucleation. Nature 356, 80–83.

Jung, M. K., Prigozhina, N., Oakley, C. E., Nogales, E., and Oakley, B. R.(2001). Alanine-scanning mutagenesis of Aspergillus �-tubulin yields diverseand novel phenotypes. Mol. Biol. Cell 12, 2119–2136.

Kawaguchi, S., and Zheng, Y. (2004). Characterization of a Drosophila centro-some protein CP309 that shares homology with Kendrin and CG-NAP. Mol.Biol. Cell 15, 37–45.

Knop, M., Pereira, G., Geissler, S., Grein, K., and Schiebel, E. (1997). Thespindle pole body component Spc97p interacts with the �-tubulin of Saccha-

Role of Dgrip84 during Cell Division

Vol. 17, January 2006 281

romyces cerevisiae and functions in microtubule organization and spindle polebody duplication. EMBO J. 16, 1550–1564.

Knop, M., and Schiebel, E. (1997). Spc98p and Spc97p of the yeast �-tubulincomplex mediate binding to the spindle pole body via their interaction withSpc110p. EMBO J. 16, 6985–6995.

Knop, M., and Schiebel, E. (1998). Receptors determine the cellular localiza-tion of a �-tubulin complex and thereby the site of microtubule formation.EMBO J. 17, 3952–3967.

Leguy, R., Melki, R., Pantaloni, D., and Carlier, M. F. (2000). Monomeric�-tubulin nucleates microtubules. J. Biol. Chem. 275, 21975–21980.

Li, K., and Kaufman, T. C. (1996). The homeotic target gene centrosominencodes an essential centrosomal component. Cell 85, 585–596.

Li, K., Xu, E. Y., Cecil, J. K., Turner, F. R., Megraw, T. L., and Kaufman, T. C.(1998). Drosophila centrosomin protein is required for male meiosis and as-sembly of the flagellar axoneme. J. Cell Biol. 141, 455–467.

Li, Q., and Joshi, H. C. (1995). �-tubulin is a minus end-specific microtubulebinding protein. J. Cell Biol. 131, 207–214.

Llamazares, S., Tavosanis, G., and Gonzalez, C. (1999). Cytological charac-terisation of the mutant phenotypes produced during early embryogenesis bynull and loss-of-function alleles of the �Tub37C gene in Drosophila. J. Cell Sci.112, 659–667.

Logarinho, E., Bousbaa, H., Dias, J. M., Lopes, C., Amorim, I., Antunes-Martins, A., and Sunkel, C. E. (2004). Different spindle checkpoint proteinsmonitor microtubule attachment and tension at kinetochores in Drosophilacells. J. Cell Sci. 117, 1757–1771.

Maiato, H., Rieder, C. L., and Khodjakov, A. (2004). Kinetochore-drivenformation of kinetochore fibers contributes to spindle assembly during animalmitosis. J. Cell Biol. 167, 831–840.

Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., and Stearns, T. (1996). Analysis ofTub4p, a yeast �-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizingcenter function. J. Cell Biol. 134, 443–454.

Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., and Raff, J. W. (2004).The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function,but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673–683.

Megraw, T. L., Li, K., Kao, L. R., and Kaufman, T. C. (1999). The centrosominprotein is required for centrosome assembly and function during cleavage inDrosophila. Development 126, 2829–2839.

Minestrini, G., Harley, A. S., and Glover, D. M. (2003). Localization of Pa-varotti-KLP in living Drosophila embryos suggests roles in reorganizing thecortical cytoskeleton during the mitotic cycle. Mol. Biol. Cell 14, 4028–4038.

Moritz, M., Braunfeld, M. B., Guenebaut, V., Heuser, J., and Agard, D. A.(2000). Structure of the �-tubulin ring complex: a template for microtubulenucleation. Nature 2, 365–370.

Mullins, M. C., Rio, D. C., and Rubin, G. M. (1989). cis-acting DNA sequencerequirements for P-element transposition. Genes Dev. 3, 729–738.

Murphy, S. M., Preble, A. M., Patel, U. K., O’Connel, K. L., Dias, D. P., Moritz,M., Agard, D., Stults, J. T., and Stearns, T. (2001). GCP5 and GCP 6, two newmembers of the human �-tubulin complex. Mol. Biol. Cell 12, 3340–3352.

Murphy, S. M., Urbani, L., and Stearns, T. (1998). The mammalian �-tubulincomplex contains homologues of the yeast spindle pole body componentsSpc97p and Spc98p. J. Cell Biol. 141, 663–674.

Nguyen, T., Vinh, D.B.N., Crawford, D. K., and Davis, T. N. (1998). A geneticanalysis of interactions with Spc110p reveals distinct functions of Spc97p andSpc98p, components of the yeast �-tubulin complex. Mol. Biol. Cell 9, 2201–2216.

Oakley, B. R., Oakley, C. E., Yoon, Y. S., and Jung, M. K. (1990). �-Tubulin isa component of the spindle pole body that is essential for microtubulefunction in Aspergillus nidulans. Cell 61, 1289–1301.

Oakley, C. E., and Oakley, B. R. (1989). Identification of �-tubulin, a newmember of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillusnidulans. Nature 338, 662–664.

Oegema, K., Wiese, C., Martin, O. C., Milligan, R. A., Iwamatsu, E., Mitchison,T. J., and Zheng, Y. (1999). Characterization of two related Drosophila �-tubu-lin complexes that differ in their ability to nucleate microtubules. J. Cell Biol.144, 721–733.

Pereira, G., Knop, M., and Schiebel, E. (1998). Spc98p directs the yeast �-tu-bulin complex into the nucleus and is subject to cell cycle-dependent phos-phorylation on the nuclear side of the spindle pole body. Mol. Biol. Cell 9,775–793.

Pisano, C., Bonaccorsi, S., and Gatti, M. (1993). The kl-3 loop of the Ychromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics133, 569–579.

Prigozhina, N. L., Oakley, C. E., Lewis, A. M., Nayak, T., Osmani, S. A., andOakley, B. R. (2004). �-Tubulin plays an essential role in the coordination ofmitotic events. Mol. Biol. Cell 15, 1374–1386.

Raynaud-Messina, B., Debec, A., Tollon, Y., Gares, M., and Wright, M. (2001).Differential properties of the two Drosophila �-tubulin isotypes. Eur. J. CellBiol. 80, 643–649.

Raynaud-Messina, B., Mazzolini, L., Moisand, A., Cirinesi, A. M., and Wright,M. (2004). Elongation of centriolar microtubule triplets contributes to theformation of the mitotic spindle in �-tubulin-depleted cells. J. Cell Sci. 117,5497–5507.

Riparbelli, M. G., Callaini, G., Glover, D. M., and Avides, M.D.C. (2002). Arequirement for the abnormal spindle protein to organise microtubules of thecentral spindle for cytokinesis in Drosophila. J. Cell Sci. 115, 913–922.

Robertson, H. M., Preston, C. R., Phillis, R. W., Johnson-Schlitz, D. M., Benz,W. K., and Engels, W. R. (1988). A stable genomic source of P elementtransposase in Drosophila melanogaster. Genetics 118, 461–470.

Rubin, G. M., and Spradling, A. C. (1982). Genetic transformation of Drosoph-ila with transposable element vectors. Science 218, 348–353.

Ruiz, F., Beisson, J., Rossier, J., and Dupuis-Williams, P. (1999). Basal bodyduplication in Paramecium requires �-tubulin. Curr. Biol. 9, 43–46.

Sampaio, P., Rebello, E., Varmark, H., Sunkel, C. E., and Gonzalez, C. (2001).Organized microtubule arrays in �-tubulin-depleted Drosophila spermato-cytes. Curr. Biol. 11, 1788–1793.

Saunders, R.D.C., Avides, M. C., Howard, T., Gonzalez, C., and Glover, D. M.(1997). The Drosophila gene abnormal spindle encodes a novel microtubule-associated protein that associates with the polar regions of the mitotic spindle.J. Cell Biol. 137, 881–890.

Schneider, I. (1972). Cell lines derived from late embryonic stages of Drosoph-ila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353–365.

Spang, A., Geissler, S., Grein, K., and Schiebel, E. (1996). �-Tubulin-like Tub4pof Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substruc-tures that organize microtubules and is required for mitotic spindle forma-tion. J. Cell Biol. 134, 429–441.

Strome, S., Powers, J., Dunn, M., Reese, K., Malone, C. J., White, J., Seydoux,G., and Saxton, W. (2001). Spindle dynamics and the role of �-tubulin in earlyCaenorhabditis elegans embryos. Mol. Biol. Cell 12, 1751–1764.

Sunkel, C. E., and Glover, D. M. (1988). polo, a mitotic mutant of Drosophiladisplaying abnormal spindle poles. J. Cell Sci. 89, 25–38.

Sunkel, C. E., Gomes, R., Sampaio, P., Perdigao, J., and Gonzalez, C. (1995).�-tubulin is required for the structure and function of the microtubule orga-nizing centre in Drosophila neuroblasts. EMBO J. 14, 28–36.

Takahashi, M., Yamagiwa, A., Nishimura, T., Mukai, H., and Ono, Y. (2002).Centrosomal proteins CG-NAP and kendrin provide microtubule nucleationsites by anchoring �-tubulin ring complex. Mol. Biol. Cell 13, 3235–3245.

Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., and Gonzalez, C. (1997). Es-sential role for �-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosoph-ila. EMBO J. 16, 1809–1819.

Thummel, C. S., and Pirrotta, V. (1992). New pCaSpeR P element vectors.Drosoph. Inf. Serv. 71, 150.

Vardy, L., Fujita, A., and Toda, T. (2002). The �-tubulin complex protein Alp4provides a link between the metaphase checkpoint and cytokinesis in fissionyeast. Genes Cells 7, 365–373.

Vardy, L., and Toda, T. (2000). The fission yeast �-tubulin complex is requiredin G1 phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBOJ. 19, 6098–6111.

Venkatram, S., Tasto, J. J., Feoktistova, A., Jennings, J. L., Link, A. J., andGould, K. L. (2004). Identification and characterization of two novel proteinsaffecting fission yeast �-tubulin complex function. Mol. Biol. Cell 15, 2287–2301.

Wakefield, J. G., Bonaccorsi, S., and Gatti, M. (2001). The Drosophila proteinAsp is involved in microtubule organization during spindle formation andcytokinesis. J. Cell Biol. 153, 637–647.

Wilson, P. G., and Borisy, G. G. (1998). Maternally expressed gTub37CD inDrosophila is differentially required for female meiosis and embryonic mitosis.Dev. Biol. 199, 273–290.

Zheng, Y., Wong, M. L., Alberts, B., and Mitchison, T. (1995). Nucleation ofmicrotubule assembly by a �-tubulin-containing ring complex. Nature 378,578–583.

Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., and Doxsey, S. J. (2004). Mitosis-specific anchoring of �-tubulin complexes by pericentrin controls spindleorganization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell 15, 3642–3657.

N. Colombie et al.

Molecular Biology of the Cell282

43

II- Etude du rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en

mitose

Voir Vérollet et al., J. Cell. Biol., 2006.

Alors que la tubuline γ et les protéines qui lui sont associées dans le γ-TuSC sont des

protéines essentielles et nécessaires à la fonctionnalité du fuseau de division, très peu de

données sont disponibles sur le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans

l’organisation du fuseau mitotique chez les métazoaires. Selon les modèles de nucléation

des microtubules [Voir INTRODUCTION III-2)], l’assemblage du γ-TuRC serait

nécessaire au recrutement et à la fonction de la tubuline γ au centrosome en mitose. Dans ce

cas, la déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC devrait engendrer les mêmes

anomalies mitotiques que la déplétion de la tubuline γ. Contrairement aux mutants des

protéines du γ-TuSC, les mutants des homologues de Dgrip75 et Dgrip163 chez la levure S.

pombe et le mutant Dgrip75 chez la drosophile sont viables (Fujita et al., 2002; Schnorrer

et al., 2002; Venkatram et al., 2004), ce qui est en désaccord avec les modèles de

nucléation par le γ-TuRC. Afin de préciser le rôle des quatre protéines spécifiques du γ-

TuRC en mitose, l’expression de ces protéines a été inhibée, soit par RNAi dans les cellules

en culture, soit par mutation ( N. Colombié et T. Daubon).

• Perte de fonction des protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC

Tout d’abord, les conséquences de la déplétion par RNAi de Dgrip75, une protéine à

motifs grip spécifique du γ-TuRC, sur l’assemblage du complexe et l’organisation des

microtubules en mitose ont été analysées. Dans les cellules traitées, seul un complexe

contenant la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 est détecté sur gradient de sucrose, suggérant

qu’il ne reste que des γ-TuSCs. Ainsi, Dgrip75 est essentielle à la formation ou à la stabilité

du complexe γ-TuRC. En absence de γ-TuRC, l’index mitotique augmente de l’ordre de 3

fois et les cellules s’accumulent en prométaphase avec un point de contrôle mitotique

activé (présence de BubR1 aux kinétochores). Les figures mitotiques dans les cellules

traitées par RNAi présentent des fuseaux bipolaires anormalement allongés avec des

44

chromosomes mal alignés et 16% des fuseaux sont monopolaires. Cependant, les défauts

engendrés sont moins sévères que ceux induits par la déplétion d’une protéine du γ-TuSC

car les fuseaux sont majoritairement bipolaires avec des pôles correctement focalisés

montrant des microtubules astraux. Contrairement au modèle admis, la tubuline γ et ses

partenaires dans le γ-TuSC (Dgrip84 et Dgrip91), sont recrutés aux pôles de plus de 95%

des fuseaux qu’ils soient bipolaires ou monopolaires. Par contre, la tubuline γ n’est plus

présente sur les microtubules du fuseau et sur le fuseau central de cytocinèse. Ainsi,

l’assemblage d’un γ-TuRC n’est pas nécessaire au recrutement de la tubuline γ aux pôles

des fuseaux. La tubuline γ pourrait être recrutée sous forme de γ-TuSCs. Par contre,

l’intégrité du γ-TuRC est indispensable pour les autres localisations mitotiques de la

tubuline γ : microtubules du fuseau métaphasique et du fuseau central en fin de télophase.

Dans les cellules traitées par RNAi, le recrutement aux pôles du fuseau des autres

protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC est fortement diminué. Parmi les protéines

spécifiques du γ-TuRC, seule Dgp71WD est présente aux pôles de tous les fuseaux mais

l’intensité du signal est réduite.

Des résultats similaires ont été obtenus in vivo (N. Colombié). Contrairement aux

mutants des gènes codant les protéines du γ-TuSC, un mutant nul Dgrip75 est viable

(Schnorrer et al., 2002). Dans ce mutant, les neuroblastes de larves L3 s’accumulent en

mitose (index mitotique augmenté de 4 fois) avec des chromosomes hypercondensés mais

très peu d’aneuploïdie est observée. Le recrutement des protéines du γ-TuSC n’est pas

affecté dans les neuroblastes du mutant Dgrip75. Contrairement aux résultats obtenus dans

les cellules en culture, les neuroblastes de ce mutant ne présentent pas de défaut visible

dans la morphologie des fuseaux mitotiques. Dgrip75 ne serait donc pas nécessaire au

recrutement du γ-TuSC in vivo.

Afin de savoir si les phénotypes induits par la déplétion de Dgrip75 sont spécifiques

de cette protéine, j’ai analysé les conséquences de la déplétion par RNAi des deux autres

protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC (Dgrip128 et Dgrip163), dans les cellules en

culture. Les phénotypes induits par l’inhibition de chacune des protéines du γ-TuRC à

motifs grip sont identiques (index mitotique augmenté, diminution des γ-TuRCs

45

cytoplasmiques, anomalies de la morphologie des fuseaux, recrutement des protéines du γ-

TuSC aux pôles). En conclusion, les trois protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC

sont nécessaires à l’assemblage du γ-TuRC. Aucune de ces protéines n’est essentielle pour

le recrutement de la tubuline γ et de ses protéines associées dans le γ-TuSC au centrosome.

• Perte de fonction de Dgp71WD

Dgp71WD est la dernière protéine spécifique du γ-TuRC à avoir été découverte. Elle

ne possède pas de motif grip mais appartient à une autre famille structurale (Gunawardane

et al., 2003; Haren et al., 2006; Luders et al., 2006). Contrairement à l’inhibition par RNAi

de l’expression des protéines à motifs grip, celle de Dgp71WD n’a pas d’effet sur le

maintien de l’assemblage d’un complexe 30S observé sur gradient de sucrose. Les

protéines spécifiques du γ-TuRC peuvent avoir des rôles différents dans l’assemblage des

complexes au niveau du cytoplasme. Les phénotypes induits par la déplétion de Dgp71WD

montrent des similitudes avec ceux induits en absence de Dgrip75, 128 et 163 : l’index

mitotique est augmenté de 3 fois par rapport aux cellules contrôles et les fuseaux mitotiques

sont anormaux. Les protéines du γ-TuSC sont recrutées aux pôles des fuseaux. Par contre,

les protéines spécifiques du γ-TuRC à motifs grip sont également détectables aux pôles.

Dgp71WD n’est donc nécessaire ni à l’assemblage du γ-TuRC ni à son recrutement.

T. Daubon a analysé un mutant obtenu par insertion d’un élément P dans la partie 5’

non traduite du gène codant Dgp71WD (GenExel, Inc.), qui est au moins un hypomorphe

fort. Ce mutant est viable mais les adultes meurent prématurément et les femelles sont

stériles. 30% des fuseaux des neuroblastes mutants sont monopolaires et le mutant présente

12% d’aneuploïdie par rapport à 1% dans les sauvages. Ces résultats montrent que, en

absence de Dgp71WD, les fuseaux ne sont pas totalement fonctionnels. Ils sont cohérents

avec les résultats obtenus dans les cellules en culture.

• Perte de fonction simultanée des quatre protéines spécifiques du γ-TuRC

Pour s’assurer d’être dans des conditions où le γ-TuRC ne peut pas s’assembler, les

protéines spécifiques du γ-TuRC ont été déplétées simultanément par RNAi. La co-

déplétion de Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD est efficace et induit une

46

augmentation de 4 fois de l’index mitotique, 70% de fuseaux monopolaires et l’apparition

de grosses cellules polyploïdes. Ces phénotypes sont plus sévères que ceux obtenus après

simple déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC. Les trois protéines du γ-TuSC sont

recrutées aux pôles des fuseaux mais sont absentes le long des microtubules. Ces résultats

confirment que, en absence de γ-TuRC, les γ-TuSCs sont recrutés aux pôles des fuseaux

mitotiques. Par contre, le recrutement des γ-TuSCs au centrosome est affaibli dans ces

conditions et n’est pas suffisant pour que la mitose soit fonctionnelle.

L’ensemble de ces résultats permet de conclure que le γ-TuRC est le complexe

optimal pour la progression en mitose. Toutefois, le γ-TuRC n’est pas indispensable au

recrutement et à la fonction de la tubuline γ au centrosome chez la drosophile. En absence

de γ-TuRC, le γ-TuSC peut être recruté aux pôles des fuseaux en mitose et nucléer des

microtubules. Ce mode de recrutement de la tubuline γ pourrait avoir lieu dans des

conditions physiologiques. Ceci remet en question les modèles établis pour la nucléation

des microtubules au centrosome via le γ-TuRC exclusivement. Par contre, le γ-TuRC est

nécessaire pour la localisation de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau en métaphase

et du fuseau central en cytocinèse, suggérant que le γ-TuRC pourrait être impliqué dans

des fonctions non-centrosomales de la tubuline γ.

THEJOURNALOFCELLBIOLOGY

JCB: ARTICLE

© The Rockefeller University Press $8.00The Journal of Cell Biology, Vol. 172, No. 4, February 13, 2006 517–528http://www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.200511071 JCB 517

Introduction

In metazoans, the centrosome organizes the microtubule cyto-

skeleton. The molecular mechanisms responsible for the initia-

tion and the regulation of microtubule assembly remain unclear,

although γ-tubulin appears critical to these processes. In addi-

tion to a centrosomal fraction, γ-tubulin is present in cytosolic

high-order protein structures (Akashi et al., 1997; Murphy et al.,

1998; Oegema et al., 1999; Fujita et al., 2002). In Drosophila melanogaster, two main complexes have been characterized.

The simplest ones, called γ-tubulin small complexes (γ-TuSCs),

are salt-stable tetramers of ~10S that are composed of two

γ-tubulin molecules and two associated proteins, Dgrip84 and

Dgrip91 (Oegema et al., 1999). They represent the basic com-

ponents of the larger complexes, the γ-tubulin ring complexes

(γ-TuRCs). γ-TuRCs, whose sedimentation coeffi cients range

from 25 to 35S, contain at least four other proteins (Dgrip75,

Correspondence to Brigitte Raynaud-Messina: brigitte.raynaud-messina@istmt.cnrs.frAbbreviations used in this paper: Cnn, centrosomin; dsRNA, double-stranded RNA; γ-TuRC, γ-tubulin ring complex; γ-TuSC, γ-tubulin small complex; P95, probability of 95%; RNAi, RNA interference.The online version of this article contains supplemental material.

Correspondence to Brigitte Raynaud-Messina: brigitte.raynaud-messina@istmt.cnrs.frAbbreviations used in this paper: Cnn, centrosomin; dsRNA, double-stranded RNA; γ-TuRC, γ-tubulin ring complex; γ-TuSC, γ-tubulin small complex; P95, probability of 95%; RNAi, RNA interference.The online version of this article contains supplemental material.

Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) in addition to the γ-TuSC

subunits, in a yet unknown stoichiometry. Dgrip75, Dgrip128,

and Dgrip163 exhibit sequence homologies called grip motifs,

with the two γ-tubulin–associated proteins of the γ-TuSC (Fava

et al., 1999; Gunawardane et al., 2000; Murphy et al., 2001). In

contrast, Dgp71WD does not posses any grip motifs, but con-

tains seven WD (tryptophan–aspartic acid) repeats (Haren et al.,

2006). In vitro, this protein directly interacts with the grip motif

containing γ-TuRC subunits, suggesting that it may play a scaf-

folding role in γ-TuRC organization (Gunawardane et al.,

2003). Current models suggest that γ-TuRCs that have been

previously assembled in the cytoplasm are recruited to the cen-

trosomes, where they play a role in microtubule nucleation and

stabilization (Stearns and Kirschner, 1994; Zheng et al., 1995;

Fava et al., 1999; Zhang et al., 2000).

The functions of γ-tubulin and its associated proteins in

the γ-TuSC have been extensively studied. Deletion of either

corresponding gene is lethal, resulting in an accumulation of

cells in mitosis. This is usually correlated with the appearance

of strong mitotic defects such as monopolar structures or bipo-

lar spindles exhibiting unfocused poles, impairment of pole

<doi>10.1083/jcb.200511071</doi><aid>200511071</aid>Drosophila melanogaster γ-TuRC is dispensable for targeting γ-tubulin to the centrosome and microtubule nucleation

Christel Vérollet,1 Nathalie Colombié,1 Thomas Daubon,1 Henri-Marc Bourbon,2 Michel Wright,1 and Brigitte Raynaud-Messina1

1Centre de Recherche en Pharmacologie, Santé, UMR 2587, Centre National de la Recherche Scientifi que-Pierre Fabre, Institut de Sciences et Technologies du Médicament de Toulouse, 31432 Toulouse, Cedex 4, France

2Centre de Biologie du Développement, UMR 5547, Centre National de la Recherche Scientifi que-Université Paul Sabatier, IFR109, 31062 Toulouse, Cedex 4, France

In metazoans, γ-tubulin acts within two main com-plexes, γ-tubulin small complexes (γ-TuSCs) and γ- tubulin ring complexes (γ-TuRCs). In higher eukaryotes, it is

assumed that microtubule nucleation at the centrosome depends on γ-TuRCs, but the role of γ-TuRC components remains undefi ned.

For the fi rst time, we analyzed the function of all four γ-TuRC–specifi c subunits in Drosophila melanogaster: Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. Grip-motif proteins, but not Dgp71WD, appear to be required for γ-TuRC assembly. Individual depletion of γ-TuRC com-

ponents, in cultured cells and in vivo, induces mitotic delay and abnormal spindles. Surprisingly, γ-TuSCs are recruited to the centrosomes. These defects are less severe than those resulting from the inhibition of γ-TuSC compo-nents and do not appear critical for viability. Simultane-ous cosilencing of all γ-TuRC proteins leads to stronger phenotypes and partial recruitment of γ-TuSC. In conclu-sion, γ-TuRCs are required for assembly of fully functional spindles, but we suggest that γ-TuSC could be targeted to the centrosomes, which is where basic microtubule assem-bly activities are maintained.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1Supplemental Material can be found at:

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 518

maturation, and increase in aneuploidy (Oakley et al., 1990;

Sunkel et al., 1995; Geissler et al., 1996; Spang et al., 1996;

Knop et al., 1997; Barbosa et al., 2000; Paluh et al., 2000; Vardy

and Toda, 2000; Hannak et al., 2002; Colombie et al., 2006).

In contrast, our knowledge about the function of γ-TuRC– specifi c

components is limited. In D. melanogaster, Dgrip75 is essential

for fertility, but not for viability. Dgrip75 loss-of-function

mutants specifi cally affect localization of the maternal determi-

nant bicoid during oogenesis, suggesting a role in the organiza-

tion or in the dynamics of a subset of microtubules (Schnorrer

et al., 2002). In Schizosaccharomyces pombe, mutants in

Gfh1 (a Dgrip75 orthologue) and in Alp16 (a Dgrip163 ortho-

logue) exhibit defects associated with altered microtubule func-

tion, but without any effect on cell viability (Fujita et al., 2002;

Venkatram et al., 2004). Current models cannot explain these

data. Instead, they raise questions not only about the redun-

dancy or the specifi city of the γ-TuRC–specifi c proteins but

also about the respective functions of γ-TuSCs and γ-TuRCs. In

this work, we have tested whether γ-tubulin is only recruited to

the centrosome in the form of γ-TuRCs or if γ-TuSCs can be

recruited and subsequently matured into functional γ-tubulin

complexes by attracting additional components. To this aim, we

have developed two strategies: (1) RNA interference (RNAi) in

cultured cells involving individual or concomitant depletion of

γ-TuRC components, and (2) genetic analyses by taking advan-

tage of the availability of mutant strains (Dgrip75, Dgrip163,

and Dgp71WD). We demonstrate that the γ-TuRC–specifi c sub-

units display functional specifi cities and that the γ-TuSCs could

be targeted to the centrosome where basic microtubule assem-

bly functions are maintained.

Results

RNAi-directed depletion of Dgrip75 impairs

cytosolic 𝛄-TuRC assembly or stability

First, we characterized the consequences of the depletion of a

γ-TuRC–specifi c protein on the assembly of cytosolic γ-tubulin

complexes. Cultured D. melanogaster S2 cells were treated by

RNAi to deplete Dgrip75, a grip protein specifi cally present in

the γ-TuRC (Fava et al., 1999). The treatment led to a strong

decrease of the protein level (Fig. 1 A; >95% of the control

level, as judged by Western blot analysis). This effect was spe-

cifi c, as determined by examining the amount of the three

γ-TuSC proteins (γ-tubulin, Dgrip84, and Dgrip91) and actin

(Fig. 1, A and D). Immunofl uorescence analysis of control cells

showed that although Dgrip75 was undetectable at the inter-

phase centrosome, it localized to the poles at the onset of

mitosis, where it was maintained throughout cell division

Figure 1. Characterization of Dgrip75 depletion by RNAi. (A) Analysis of protein depletion by Western blot. Total protein extracts of control or treated cells (Dgrip75RNAi) were analyzed using Dgrip75 affi nity–purifi ed antibodies and antibodies against Dgrip84, γ-tubulin, or actin (internal loading control). (B) Analysis of protein depletion by immunofl uorescence. a and b, microtubules; c and d, Dgrip75 signal. A quantitative view is shown in Table I. (C) Analysis of γ-tubulin complexes after Dgrip75 depletion. Total protein extracts prepared from control or treated cells (Dgrip75RNAi) were centrifuged in a su-crose gradient. Soluble fractions were analyzed by immuno-blotting against γ-TuRC components. (D) Recruitment of γ-TuSC components into the cytoskeletal fraction after Dgrip75 deple-tion. Total protein extracts (T) of control or treated cells (Dgrip75RNAi) were centrifuged for 10 min at 10,000 g. Then, the supernatants (S) and the pellets (P) were analyzed by immunoblotting with antibodies against Dgrip91, Dgrip84, γ-tubulin, and Dgrip75. Bar, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 519

(Fig. 1 B, c). In marked contrast, the protein was absent from

the mitotic centrosomes in Dgrip75-depleted cells, consistent

with Western blot quantifi cation (Fig. 1 B, d; and Table I).

When extracts from treated cells were submitted to sucrose gra-

dient sedimentation, γ-TuRCs were severely reduced, as indi-

cated by immunoblotting of soluble fractions with antibodies

against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip128, and Dgrip163

(Fig. 1 C). The main remaining complexes appeared to be

γ-TuSCs, as judged by their protein content and their sedimen-

tation coeffi cient. In addition, the total level, as well as the solu-

ble and cytoskeletal fractions of the three γ-TuSC proteins, are

unchanged in control and Dgrip75-depleted cells (Fig. 1 D),

suggesting a redistribution of these proteins in the different

complexes rather than a change in quantity. In contrast, after

Dgrip75-RNAi treatment, we noticed a decrease in the total

level of the two other grip-motif proteins of the γ-TuRC,

Dgrip128 and Dgrip163. The remaining Dgrip128 protein was

distributed on the gradient in the form of heterogeneous and un-

characterized complexes with apparent masses equal or slightly

higher than the mass of the γ-TuSC. Dgrip163 protein migrated

mainly in light fractions (<10S). One hypothesis could be that

this protein was present as a monomeric or dimeric form. Thus,

Dgrip75 appears to be required for effi cient assembly or stabil-

ity of cytoplasmic γ-TuRCs.

Impairment of 𝛄-TuRC assembly induces

moderate mitotic defects, but does not

preclude 𝛄-TuSC centrosomal recruitment

We next investigated whether Dgrip75 depletion, and thus the

subsequent decrease of γ-TuRCs, affected mitotic progression.

The mitotic index was signifi cantly increased by �2.6-fold

(2.9%; n = 4,766; probability of 95% [P95] = 2.5–3.3 in treated

cells, compared with 1.1%; n = 9,235; P95 = 0.9–1.3 in

control cells). This mitotic accumulation coincided with the

maintenance of an active mitotic checkpoint, as judged by a

strong BubR1 signal at kinetochores (not depicted), which was

indicative of a transient block in prometaphase. α-Tubulin

immunostaining analysis confi rmed an accumulation of cells in

premetaphase stages (increased 1.8-fold in frequency), whereas

postmetaphase fi gures exhibited a 2.6-fold decrease relative to

controls (Table II). Aberrant mitotic fi gures were observed,

mainly monopolar spindles and bipolar spindles that were either

elongated or with lagging chromosomes (Fig. 2 and Table II).

Approximately one third of prometaphases and metaphases

were still organized as bipolar structures, albeit with a longer

interpolar distance (average increase of 50%; 7.9 ± 0.9 in

treated cells vs. 5.3 ± 0.7 in controls) and a poor microtubule

density. However, treated bipolar spindles exhibited astral mi-

crotubules (Fig. 2 A, d, h, and l). Their poles were normally

focused, consistent with polar localization of Asp (Fig. 2 B, a),

a marker of the spindle microtubules minus ends (Wakefi eld

et al., 2001). They seemed to properly separate their centro-

some, as 97% (n = 112; P95 = 92–99) exhibited centrosomin

(Cnn) labeling at both poles (Fig. 2 B, b; Megraw et al., 1999).

Surprisingly, in Dgrip75-depleted cells, γ-tubulin was still re-

cruited to the poles at all stages of mitosis (Fig. 2 A, a–d; and

Table I). The maximal fl uorescence values raised by γ-tubulin

antibodies at the two poles of symmetrical spindles did not differ

between Dgrip75-treated and control cells (Fig. 2 C). The two

γ-tubulin partners in the γ-TuSC, Dgrip84, and Dgrip91 were

also targeted to the poles in an effi cient manner (Fig. 2 A, e–l;

and Table I). At the same time, pole localization of γ-TuRC–

specifi c proteins (Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) was

signifi cantly inhibited, but not completely abolished (Fig. 2 D

and Table I). The reductions in Dgrip128 or Dgrip163 stainings

(Fig. 2 D, a–f, Table I) may result, at least partly, in the overall

decrease in the levels of these proteins after Dgrip75 depletion.

Dgp71WD staining was present, but reduced in intensity in

most of the cases (Fig. 2 D, g–i, insets). To illustrate these

changes, we performed double-labeling immunofl uorescence on

cells depleted of Dgrip75, showing colocalization of γ- tubulin

with γ-TuSC–associated proteins (Dgrip84 or Dgrip91) or

with Dgp71WD, whereas the γ-TuRC proteins Dgrip128 or

Dgrip163 were no longer detectable (Fig. S1, available at http://

www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1). The local-

ization of γ-tubulin along spindle microtubules, observed in

97% (n = 138; P95 = 93–99) of control cells, was detected in

Table I. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after Dgrip75 depletion in cultured cells

Staining Control Dgrip75RNAi

Bipolar Monopolar

% % %

γ-Tubulin 100 (n = 100) 100 (n = 124) 95 (n = 66)Dgrip84 99 (n = 186) 98 (n = 170) 98 (n = 50)Dgrip91 91 (n = 103) 100 (n = 55) 100 (n = 48)Dgrip75 100 (n = 95) 6 (n = 70) 0 (n = 52)Dgrip128 78 (n = 71) 3 (n = 93) ndDgrip163 98 (n = 132) 24 (n = 119) ndDgp71WD 95 (n = 109) 100 (n = 65) 100 (n = 43)

Microtubules were stained with antibodies against α-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For a correct interpretation, we need to keep in mind a decrease in the total amount of Dgrip128 and Dgrip163 in Dgrip75-depleted cells. n, number of prometaphases/metaphases analyzed. nd, not determined.

Table II. Distribution of the different mitotic stages after Dgrip75 depletion in cultured cells

Mitotic fi gures Controln = 100

Dgrip75RNAi

n = 244

% %

Unfocuseda 21 ± 8b 24 ± 6Prometaphases/metaphases Symmetrical bipolar 28 ± 9 20 ± 5 Abnormal bipolar 4 ± 4 22 ± 6 Monopolar 0 16 ± 4Postmetaphase stages 47 ± 10 18 ± 4

Mitotic stages were determined after chromosome staining (DAPI) and immuno-labeling of microtubules (α-tubulin antibodies). n, number of mitotic spindles analyzed. These results are representative of three independent experiments.aSpindles with no evident polarity, which represent mainly prophase stages or highly abnormal spindles.bConfi dence intervals calculated for P95.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 520

only 10% (n = 146; P95 = 5–15) of the depleted cells (Fig.

2 A, a–d). Similarly, the two γ-TuSC proteins, Dgrip84 and

Dgrip91, were no longer detected along spindle microtubules

(Fig. 2 A, e–l). Moreover, staining of γ-TuSC proteins at the

midbody was impaired in treated cells (not depicted). Hence,

the assembly of cytoplasmic γ-TuRCs does not appear as a pre-

requisite for centrosomal recruitment of the γ-TuSCs, but seems

essential for its localization along spindle microtubules and at

the midbody.

Dgrip75 loss-of-function mutant is delayed

in mitosis, but still recruits 𝛄-tubulin

to the centrosome

To examine the functional signifi cance of Dgrip75 in vivo, we

took advantage of the availability of the mutant allele 175–14

(Dgrip75175), which was either a null or a strong allele (Schnorrer

et al., 2002). Dgrip75175 mutant was viable, although adults of

both sexes exhibited a slight increase in lethality some days

after hatching. Moreover, they showed abnormalities in the

abdominal cuticle segmentation and the thoracic macrochaete

pattern (unpublished data), which were common in mutations

affecting mitosis. Finally, mutant females were sterile because

of a failure to undergo normal oogenesis.

Although Dgrip75 did not appear essential for viability,

the phenotypes observed after RNAi treatment of cultured cells

prompted us to study the mitotic processes in mutant L3 larval

brains. Western blot analysis showed that Dgrip75 levels were

reduced below the threshold of detection in Dgrip75175 brain ex-

tracts (Fig. 3 A). The mitotic index was elevated approximately

three-to fourfold (2.5%; n = 12,410; P95 = 2.2–2.8) com-

pared with wild-type cells (0.7%; n = 16,134; P95 = 0.6–0.8).

Mutant cells accumulated in prometaphase stages, whereas post-

metaphase fi gures were reduced (unpublished data). More than

half of the mutant cells exhibited overcondensed chromosomes

Figure 2. Immunofl uorescence analysis of phenotypes induced by Dgrip75 depletion in S2 cells. (A) Localization of γ-TuSC components in mitotic cells. Control or Dgrip75-treated cells (Dgrip75RNAi) were analyzed by staining with antibodies against γ-tubulin (a and c), Dgrip84 (e and g), and Dgrip91 (i and k). Merge (b, d, f, h, j, and l): blue, chromosomes; red, microtu-bules; green, γ-TuSC components. (B) Spindle pole focusing and localization of centrosomal markers. Dgrip75-depleted cells were stained with antibodies against Asp (a, green) or Cnn (b, green). Red, α-tubulin; blue, chromosomes. (C) Quantifi cation of polar γ-tubulin by immuno-fl uorescence. The maximal signal obtained after γ-tubulin staining was scored on each pole of bipolar spindles for control (closed bars) and Dgrip75-depleted cells (open bars). Correlations of 0.73 (n = 67; P95 = 0.62–0.84) and 0.72 (n = 69; P95 = 0.61–0.83), respectively, were observed between the maxi-mal fl uorescence measured at the two poles of control or treated cells. (D) Localization of γ-TuRC–specifi c components (Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) in mitotic cells. Blue, chromosomes; red, microtubules; green, γ-TuRC–specifi c components. Insets represent a hemispindle stained with antibodies against Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For A and D, a quantitative view is shown in Table I. Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 521

(60%; n = 186; P95 = 53–67) compared with wild type (2%;

n = 211; P95 = 0–4; Fig. 3 B). These results were consistent

with prolonged prometaphase and metaphase stages. However,

only very few mutant cells showed an aneuploid phenotype (6%;

n = 112; P95 = 3–9) compared with wild type (1%; n = 116;

P95 = 0–3), and this low frequency was consistent with Dgrip75175

adult viability.

Transient prometaphase delays observed in the Dgrip75

mutant could be a consequence of defects in the mitotic

apparatus. Nevertheless, immunofl uorescence analysis revealed

neither a clear difference in spindle morphology nor a sig-

nifi cant decrease of cells stained positively for γ-tubulin or

Dgrip84 (Fig. 3 C). Given the limitations of immunofl uores-

cence in neuroblasts, we cannot exclude defects in micro tubule

organization, such as changes in microtubule density or inter-

polar distance.

These data suggest that in Dgrip75175 brains, most of the

cells complete cell division even though mitosis might be

slowed down, consistent with our observations in RNAi-treated

cultured cells. γ-TuSC components are still recruited to the cen-

trosomes and most of the mitotic apparatus are able to ensure

correct chromosome segregation.

Removal of Dgrip128 or Dgrip163

is not essential for centrosomal

𝛄-TuSC recruitment

To evaluate whether the phenotypes induced by Dgrip75 deple-

tion were specifi c of this grip-motif protein, we performed an

RNAi treatment against Dgrip128 or Dgrip163, the two other

grip-motif γ-TuRC–specifi c components. Depletion was effi -

cient in either case: after Dgrip128 RNAi, no poles (n = 142)

were labeled, and after Dgrip163 RNAi, <4% of the poles

(n = 150) were labeled with respective Dgrip128 and Dgrip163

antibodies (Fig. 4 A). Western blot analysis confi rmed this view

(not depicted). Sucrose gradient analysis of extracts depleted

for Dgrip128 or Dgrip163 showed a marked decrease in γ-TuRC

content (Fig. 4 B). These experiments show that these proteins,

like Dgrip75, appear involved in the assembly or stability of

γ-TuRCs. Moreover, silencing of either protein led to accumu-

lation of cells in mitosis (approximately three- to fourfold),

which resulted from a higher frequency of prometaphases con-

comitant with a decrease in postmetaphase stages (Fig. 4 C).

Mitotic phenotypes were mainly characterized by elongated bi-

polar spindles and less frequently by monopolar structures.

γ-Tubulin (Fig. 4 D) as well as Dgrip84 and Dgrip91 (not de-

picted) were effi ciently recruited to the centrosomes, even in

mitotic cells that exhibited severe phenotypes (i.e., monopolar

spindles). However, γ-tubulin labeling along spindle micro-

tubules was no longer observed (Fig. 4 D). It was striking that

these phenotypes were similar to the defects obtained after de-

pletion of Dgrip75.

Furthermore, we next performed an in vivo study using

a Dgrip163 P insertion mutant (Dgrip163GE27087) in which the

P transposable element was inserted into exon 4 (out of 5) between

codons 822 and 823. This mutant behaved genetically as a null

or strong allele (unpublished data). Dgrip163 mutants exhibited

reduced viability. The emerging homozygous or hemizygous

Dgrip163GE27087 adults displayed abdominal abnormalities, and

mutant females were sterile. Altogether, these studies reveal

that inhibition of each individual grip-motif protein specifi c of

the γ-TuRC leads to similar phenotypes in cultured cells and

in vivo.

Dgp71WD is neither essential for

𝛄-TuRC assembly nor for its recruitment

to the centrosome

In contrast to the other proteins specifi c of the γ-TuRCs,

Dgp71WD does not belong to the same structural family

(Gunawardane et al., 2003). RNAi treatment induced a strong

inhibition, as judged by Western blot analysis (Fig. 5 A).

In agreement with this quantifi cation, Dgp71WD centrosomal

Figure 3. In vivo phenotypes observed in Dgrip75 mutant brains. (A) Characterization of Dgrip75 depletion by Western blot. Total protein extracts from wild-type (WT) or Dgrip75 mutant (Dgrip75−/−) L3 larval brains were analyzed with affi nity-purifi ed Dgrip75 antibodies. Actin was used as an internal loading control. (B) Analysis of chromosomal fi gures. Wild-type or mutant L3 larval brains were stained with DAPI. Five brains were scored for each genotype. (C) Immunofl uorescence analysis of the mitotic fi gures in Dgrip75 mutant neuroblasts. Green, spindle; blue, chro-mosomes; red, γ-tubulin (a and b) and Dgrip84 (c and d). Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 522

recruitment was severely impaired in treated cells (1%; n = 385;

P95 = 0–2) compared with control cells (95%; n = 296;

P95 = 93–97; Fig. 5 B). In treated cells, we noticed the system-

atic loss of Dgp71WD staining on other mitotic structures, such

as spindle microtubules (Fig. 5 B, inset) and midbodies (not

depicted). As Dgp71WD contains WD repeats and interacts

in vitro with the four grip-motif subunits Dgrip84, Dgrip91,

Dgrip128, and Dgrip163 (Gunawardane et al., 2003), it might

play a role as a scaffold for cytosolic γ-TuRC assembly. When

control extracts were subjected to sucrose gradient sedimenta-

tion, this protein appeared not only as part of γ-TuRCs but also

of smaller uncharacterized complexes (Fig. 5 C). In Dgp71WD-

depleted conditions (Fig. 5 C), no signifi cant modifi cation in the

quantity of �30S complexes is observed, as judged by γ- tubulin

or Dgrip75 labeling. This result suggests that Dgp71WD, in

contrast to Dgrip75, appears to be dispensable for the assembly

or the stability of large γ-tubulin complexes. However, we can-

not exclude the possibility that the assembly of these complexes

is mediated by residual amounts of Dgp71WD.

Studies of the mitotic phenotypes observed after Dgp71WD

down-regulation revealed similarities to the defects recorded

after the removal of Dgrip75, Dgrip128, or Dgrip163; an

increase of the mitotic index (2.7%; n = 7,970; P95 = 2.3–3.1)

compared with control cells (0.9%; n = 19,650; P95 = 0.8–1);

and an accumulation of cells in the prometaphase and meta-

phase stages (Fig. S2 A, available at http://www.jcb.org/cgi/

content/full/jcb.200511071/DC1). Dgp71WD-depleted cells

showed defects in spindle morphology, such as bipolar spindles

with unfocused poles or monopolar structures (Fig. 5, B and D;

and Fig. S2 B) with unseparated poles, as determined by

Cnn staining (not depicted). γ-TuSC components (γ-tubulin,

Dgrip84, and Dgrip91), as well as γ-TuRC–specifi c subunits

(Dgrip75 and Dgrip163), were still targeted to the mitotic cen-

trosomes, but often the stainings were weak (Fig. 5 D and Fig.

S2 C). These proteins were no longer detected at the spindles.

These results suggest that Dgp71WD is dispensable for γ-TuRC

assembly and recruitment, but is required for the effi cient func-

tion of this complex.

Figure 4. Phenotypes observed in Dgrip128- or Dgrip163-depleted cells. For morphological phenotype analyses, cells were immuno-stained against microtubules (red) and chromo-somes (blue). (A) Analysis of Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) depletions. Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) are shown in green. Insets repre-sent a hemispindle stained with antibodies against Dgrip128 and Dgrip163. (B) Pattern of γ-tubulin cytosolic complexes after Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) depletions. Soluble frac-tions from a sucrose gradient were analyzed by immunoblotting against γ-tubulin. (C) Distri-bution of cells in the different stages of mitosis after depletion of Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b). The different mitotic stages were scored over >100 cells undergoing mitosis. Error bars represent the confi dence interval calcu-lated for P95. (D) Analysis of localization of γ-tubulin in mitotic cells. γ-Tubulin is stained in green in merge (a–c) and in white in a’–c’. More than 97% of Dgrip128- (a) or Dgrip163-depleted (c) cells showed γ-tubulin at the poles (scored on >100 cells in the prometaphase/metaphase stages). Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 523

A genetic approach was performed to test this hypo-

thesis in vivo. We used a mutant strain that carried a P element

insertion (GE30807) in the 5′ untranslated mRNA region at

position 49 from the translation initiator ATG. As shown by

Western blot, the level of Dgp71WD was strongly reduced in

a mutant larval brain extract compared with a wild-type ex-

tract (Fig. 6 A). An immunofl uorescence analysis performed

in larval brains sustained that Dgp71WD was no longer detect-

able in mutants (n = 120), whereas 96% of wild-type poles

(n = 110; P95 = 92–100) exhibited a clear staining (Fig.

6 B). These results indicate that Dgp71WDGE30807 is at least a

strong allele. This was confi rmed by analysis of hemizygous

fl ies, using a chromosomal defi ciency that covers Dgp71WD.

Most of the homozygous or hemizygous mutants reached the

adult stage. However, they showed a shorter life, morphologi-

cal abnormalities, and female sterility. Mitotic phenotypes had

been analyzed in L3 larval brains confi rming RNAi-mediated

phenotypes. We observed a fourfold increase in the mitotic in-

dex, an accumulation in prometaphase stages associated with

a signifi cant hypercondensation of chromosomes and a high

incidence of disorganized or monopolar spindles (Fig. S3,

available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/

DC1). However, γ-tubulin is detected at all the centrosomes of

Dgp71WDGE30807 neuroblasts (n = 130; Fig. 6 C). Moreover,

mutant neuroblasts exhibited an increase in aneuploidy (12%;

n = 139; P95 = 7–17) versus wild-type brains (1%; n = 125;

P95 = 0–5), suggesting that spindles without Dgp71WD were

not fully functional.

𝛄-TuSC components are targeted

to the poles even after cosilencing

of the four 𝛄-TuRC subunits

Whatever their role in the assembly and recruitment of cytosolic

γ-tubulin complexes, the inhibition of each individual γ-TuRC

subunit allowed effi cient γ-TuSC anchoring to the centrosomes.

It was possible that some grip-motif proteins were in part re-

dundant and could complement each other to some extent.

Alternatively, the residual γ-TuRC–specifi c proteins could ac-

count for the formation of a γ-TuRC–like structure that was un-

stable in the cytoplasm, but stabilized upon assembly with the

pericentriolar matrix. Hence, we performed cosilencing of the

four proteins Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD.

The levels of the four proteins were dramatically reduced as

judged by Western blot (Fig. 7 A) and immunofl uorescence an-

alyses (Fig. 7 B and Table III). The mitotic index was increased

in treated cells (3.9%; n = 2,552; P95 = 3.4–4.4) compared

with control cells (1.1%; n = 8,567; P95 = 0.8–1.4). Most of

the mitotic structures consisted of monopolar prometaphases/

metaphases (70%; n = 80; P95 = 60–80) compared with con-

trol cells (1%; n = 104; P95 = 0–3; Fig. 7, B and C). A striking

feature of this treatment was the signifi cant accumulation of

polyploid cells and the appearance of very large interphase cells

Figure 5. Phenotypes induced by Dgp71WD depletion in cells. (A) Analysis of Dgp71WD depletion by Western blot. Total protein extracts of control or of treated cells (Dgp71WDRNAi) were analyzed using antibodies against Dgp71WD or actin (internal loading control). (B) Analysis of the protein depletion by immuno-fl uorescence. Control (a) or Dgp71WD-treated cells (b) were analyzed by staining with an-tibodies against Dgp71WD (insets). Merge: blue, chromosomes; red, microtubules; green, Dgp71WD. (C) Pattern of γ-tubulin cytosolic complexes after Dgp71WD depletion. Soluble fractions from a 5–40% sucrose gradient were analyzed by immunoblotting against γ-tubulin, Dgrip75, or Dgp71WD. (D) Localization of γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, and Dgrip163 in mitotic Dgp71WD-depleted cells. γ-TuRC components are shown in green (a–e) or in white (a’–e’). For D, a quantitative view is shown in Fig. S2 C, available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1. Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 524

(9%; n = 281; P95 = 5–12), which appeared to account for

only 0.6% of control interphase cells (n = 320; P95 = 0–1.4)

(Fig. 7 D, left arrowhead). Most of the poles exhibited γ- tubulin,

Dgrip84, and Dgrip91 stainings (Fig. 7 C and Table III), but at

reduced intensities. Spindle labeling was no longer detectable

(Fig. 7 C). These parameters showed that codepletion of these

proteins induced more severe phenotypes than after any indi-

vidual down-regulation. This result was supported by the

synthetic lethality observed when the Dgp71WDGE30807- and

Dgrip163GE27087-viable alleles were combined in the same geno-

type (unpublished data). Altogether, these data confi rm that the

γ-TuSC assembled in the cytoplasm can, at least to some extent,

be directly targeted to the poles.

Discussion

The molecular mechanisms responsible for γ-tubulin recruit-

ment to nucleation centers and microtubule nucleation itself re-

main poorly understood. Several models have been proposed,

and all imply that the cytosolic assembly of γ-TuRCs is a criti-

cal step for γ-tubulin targeting to the centrosome. For the fi rst

time, we analyzed the function of all four γ-TuRC–specifi c sub-

units during mitosis, using either RNAi treatment in cultured

cells or genetic analyses in D. melanogaster.

𝛄-TuRC–specifi c proteins play a distinct

role in 𝛄-TuRC assembly

Individual depletion of Dgrip75, Dgrip128, or Dgrip163 in-

duced a strong decrease in cytoplasmic γ-TuRCs in cultured S2

cells. This is consistent with previous data obtained in vitro

showing that immunodepletion of Xgrip210, the Xenopus laevis

orthologue of Dgrip163, blocks the reassembly of purifi ed and

salt-treated γ-TuRCs (Zhang et al., 2000). In contrast to the

strong decrease of γ-TuRCs observed after the depletion of

grip-motif proteins, the down-regulation of Dgp71WD did not

produce a signifi cant effect on the ratio and the sedimentation

coeffi cients of the γ-tubulin complexes. However, we cannot

exclude the possibility that residual amounts of this protein are

suffi cient to maintain the overall structure of these complexes.

Dgp71WD is probably associated with the γ- TuRCs at a low

stoichiometry, explaining why no change in the sedimentation

coeffi cient could be detected after its depletion. Our data sug-

gest that although the grip-motif proteins are essential for the

assembly and stability of γ-TuRCs, Dgp71WD appears dis-

pensable for these processes.

The complete 𝛄-TuRC is necessary for an

effi cient progression through mitosis

In Dgp71WD-depleted cells, we observed no obvious effect on

the level of cytosolic γ-TuRCs and on the recruitment of the

different γ-TuRC components to the mitotic centrosomes, sug-

gesting that γ-TuRCs depleted of Dgp71WD had not completely

lost their ability to be targeted to the poles. However, γ-tubulin

localization along spindle microtubules was impaired and mo-

nopolar fi gures with poorly separated poles appeared with a

high occurrence. These monopolar phenotypes are similar to

those observed after depletion of Nedd1, the human Dgp71WD

orthologue (Haren et al., 2006). The mitotic defects could result

from a partial functionality of the γ-tubulin complexes recruited

to the centrosomes or from modifi cation in the properties of

microtubule arrays that were no longer decorated by γ-tubulin.

Thus, it appears that the complete γ-TuRC is required for nor-

mal mitotic progression.

𝛄-TuRC assembly is not a prerequisite

for the centrosomal targeting of 𝛄-tubulin

If one assumes that γ-tubulin is recruited to the centrosome in

the form of γ-TuRCs, depletion of γ-TuRCs and γ-tubulin

would be expected to lead to similar phenotypes. In fact, deple-

tion of grip-motif components of the γ-TuRCs, such as Dgrip75,

did not fully mimic the effects of depletion of γ-TuSC subunits

on mitotic progress (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000;

Paluh et al., 2000; Vardy and Toda, 2000; Fujita et al., 2002;

Venkatram et al., 2004; Colombie et al., 2006). Less severe de-

fects were observed as indicated by the lower occurrence of mo-

nopolar spindles, the effi cient distribution of centrosomes to the

two poles, the maintenance of bipolar spindles with astral mi-

crotubules and focused poles. These phenotypes had been con-

fi rmed in vivo, using mutant larval neuroblasts. These moderate

defects were consistent with the viability of Dgrip75 mutants

and the weak percentage of aneuploidy. Surprisingly, despite

a signifi cant reduction of the cytosolic pool of γ-TuRCs, the

Figure 6. In vivo phenotypes observed in Dgp71WD mutant brains. (A) Analysis of Dgp71WD depletion in mutant brains by Western blot. Wild-type or Dgp71WD mutant (Dgp71WD−/−) brains were analyzed with Dgp71WD antibodies or actin (internal loading control). (B) Organization of spindles in mutant neuroblasts. (C) Localization of γ-tubulin to the spindle poles of mutant neuroblasts. green, microtubules; blue, chromosomes; red, Dgp71WD (B) or γ-tubulin (C). Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 525

tethering of the three γ-TuSC proteins to the centrosomes was

not impaired, as judged by immunofl uorescence analyses both

in mutant neuroblasts and in cultured cells. Similar phenotypes

were observed after individual silencing of the two other grip-

motif proteins, Dgrip128 and Dgrip163. It was noteworthy that

after an RNAi treatment against any one of the three grip-motif

proteins specifi c of the γ-TuRCs, a decrease in the level of the

two others was noticed (unpublished data), suggesting some co-

regulation between this set of proteins. Altogether, these results

show that the complete γ-TuRC is not a prerequisite for the cen-

trosomal accumulation of γ-TuSC proteins.

𝛄-Tubulin can be recruited

to the centrosomes as 𝛄-TuSC

Because γ-tubulin could be recruited to the centrosomes

independently of the γ-TuRCs, we wanted to characterize the

complex that mediates its targeting. Sucrose gradient and im-

munofl uorescence analyses after depletion of individual

γ-TuRC components strongly suggest that γ-tubulin is recruited

to the centrosomes as γ-TuSC. Codepletion of the four γ-TuRC–

specifi c proteins still allowed the polar accumulation of the

γ-TuSC components in most of the cells. This latter experiment

supports the hypothesis that the γ-TuSC is a vector competent

for targeting γ-tubulin to the centrosome. However, as RNAi

treatments do not completely remove all protein, it is possible

that the residual γ-TuRC–specifi c proteins participate in the

formation of a γ-TuRC–like structure that is unstable in the cyto-

plasm, but stabilized upon assembly within the pericentriolar

matrix. The idea that γ-TuSC could be recruited to the poles is

consistent with data reported in Saccharomyces cerevisiae, in

which no orthologues of the γ-TuRC–specifi c proteins have

been reported. In this organism, the main interactions of γ-tubulin

with the microtubule-organizing centers are mediated by the

two γ-tubulin–associated proteins in the γ-TuSC (Knop and

Schiebel, 1997, 1998; Nguyen et al., 1998; Vinh et al., 2002).

Similarly, in mammals, the γ-TuRCs can be tethered to the cen-

trosomes via interactions of the orthologues of Dgrip84 and

Dgrip91 with the centrosomal anchoring proteins kendrin and

centrosome- and Golgi-localized protein kinase N–associated

protein (Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004).

In D. melanogaster, the calmodulin-binding protein CP309 has

been proposed to anchor γ-TuRCs to the centrosome by direct

binding to the γ-TuSC (Kawaguchi and Zheng, 2004). However,

γ-tubulin recruitment to the centrosomes is probably a complex

process, as additional proteins, including ninein (Delgehyr

et al., 2005) and centrosomin (Terada et al., 2003), provide al-

ternative sites for γ-tubulin anchorage. Although evidence sug-

gests that γ-tubulin can be targeted to the centrosomes in the

form of γ-TuSCs, we cannot rule out that in D. melanogaster

other proteins at low abundance, previously uncharacterized

proteins such as the Dgrip79 and Dgrip223 identifi ed by in

silico analyses, or different combinations of known γ-tubulin

Figure 7. Phenotypes observed after cosilencing of all four specifi c components of the 𝛄-TuRC. (A) Analysis of the codepletion by Western blot. Total proteins extracts of control or cosilenced cells were analyzed using antibodies against Dgrip163, Dgrip128, Dgrip75, Dgp71WD, or γ-tubulin (internal loading control). (B) Analysis of the codepletion by immunofl uorescence. (C) Localization of γ-TuSC components in mitotically treated cells. Insets rep-resent a hemispindle stained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, and Dgrip91. (D) Interphasic pheno-type observed after cosilencing. The left arrowhead indi-cates a large polyploid cell, whereas the right one shows a normal sized interphase cell. (B–D) Blue, chromosomes; red, microtubules; green, γ-TuRC components (B) or γ-TuSC components (C). For B and C, a quantitative view is shown in Table III. Bars, 5 μm.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 526

partners could be involved in this recruitment (Gunawardane

et al., 2003). Moreover, after concomitant depletion of all

γ-TuRC–specifi c proteins, spindles were nonfunctional and the

amount of γ-TuSC recruited to the mitotic centrosomes was

reduced. Because of the observation that the small complexes

are less active than γ-TuRCs in promoting nucleation (Oegema

et al., 1999; Gunawardane et al., 2000), we propose that the de-

crease in the amount of γ-TuSCs under a threshold can be criti-

cal for spindle functionality.

Interestingly, the transient association of γ-tubulin to the

spindle, as well as to the midbody (Julian et al., 1993; Lajoie-

Mazenc et al., 1994; Khodjakov and Rieder, 1999; Raynaud-

Messina et al., 2001, 2004), was no longer detectable after

individual or concomitant RNAi treatment against Dgrip75,

Dgrip128, Dgrip163, and/or Dgp71WD. Hence, mitotic γ-tubulin

localization to structures outside the pericentriolar material re-

quires the fully assembled γ-TuRCs, and Dgp71WD could play

an active role in this process. The absence of γ-tubulin recruit-

ment along the spindle microtubules and at the midbody can

also be explained by distinct properties of docking proteins at

centrosomes and at noncentrosomal sites. Actually, novel pro-

teins in charge of the recruitment of γ-tubulin complexes along

spindle microtubules have recently been identifi ed in fi ssion

yeast (Sawin et al., 2004; Janson et al., 2005).

Poles lacking complete 𝛄-TuRC fulfi ll basic

microtubule organization

In contrast with the impairment of microtubule assembly from

the pericentriolar material after removal of γ-TuSC components

(Barbosa et al., 2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Colombie

et al., 2006), the pericentriolar material appears to remain active

as a microtubule-nucleating center after down-regulation of

specifi c γ-TuRC proteins, as shown by the presence of astral

microtubules identifi ed both by immunofl uorescence and elec-

tron microscopy (unpublished data). Moreover, microtubules

containing 13 protofi laments were still nucleated, challenging

the “template model” (Fig. S4, available at http://www.jcb.org/

cgi/content/full/jcb.200511071/DC1; Moritz and Agard, 2001).

This indicates that preassembly of cytosolic γ-TuRCs does

not seem required for the formation of canonical microtubules.

It is not excluded that a ringlike structure could be assembled

from γ-TuSCs alone or in combination with small amounts of

γ-TuRC–specifi c proteins at the pericentriolar level, although

the purifi ed γ-TuSC does not assemble into larger structures

in vitro (Oegema et al., 1999). In that case, such ringlike com-

plexes would exhibit stoichiometries and protein compositions

different from γ-TuRCs.

Our observations could reconcile the fi ndings of micro-

tubule nucleation in animal cells and in S. cerevisiae. Moreover,

after depletion of γ-TuRC–specifi c components, recruitment of

γ-TuSC appeared suffi cient, in most of the cases, to control the

formation of spindles competent for chromosome segregation.

However, mitotic processes were partly disrupted in cells lack-

ing γ-TuRCs, leading to a transient prometaphase accumulation

and a poor density of spindle microtubules. Several possibilities

could account for these defects, such as a lower effi ciency of

γ-TuSCs compared with γ-TuRCs in microtubule nucleation

(Oegema et al., 1999; Gunawardane et al., 2000), the presence

of distinct binding sites for γ-TuSCs and γ-TuRCs, or the loss

of γ-TuRC recruitment along spindle microtubules, which

would affect the organization or the dynamics of specifi c

microtubule arrays.

Collectively, our results strongly suggest that the assem-

bly of γ-TuRCs is not essential for γ-tubulin–dependent micro-

tubule nucleation at the centrosome, but instead is required for

other, noncentrosomal localization of γ-tubulin. In D. melano-gaster, γ-TuRCs may target a fully organized “nucleation ma-

chinery” to the sites of nucleation; γ-TuSC would act as a

functional unit, whereas γ-TuRC–specifi c proteins would rather

play a more refi ned role in regulating or optimizing of micro-

tubule arrays during mitosis. γ-Tubulin can be targeted to the

poles by the direct docking of γ-TuSCs that exert basic nucle-

ation activity (Fig. 8). This γ-TuSC recruitment could be a

“salvage pathway,” involved only when the dominant microtubule

Figure 8. Model for 𝛄-tubulin recruitment during mitosis in D. melanogaster. γ-Tubulin is targeted to the centrosome as γ-TuRC, but it appears that γ- tubulin complexes that are different from γ-TuRC, probably γ-TuSC, could be directly addressed to the poles.

Table III. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after cosilencing of Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD in cultured cells

Staining Control Cosilencing

Bipolar Monopolar

% % %γ-Tubulin 100 (n = 22) 100 (n = 88) 100 (n = 102)Dgrip84 98 ± 4a 99 ± 3 100 (n = 76)Dgrip91 98 ± 4 100 (n = 112) 98 ± 4Dgrip75 90 ± 6 14 ± 6 0 (n = 70)Dgrip128 88 ± 6 2 ± 2 0 (n = 62)Dgrip163 94 ± 5 0 (n = 61) 0 (n = 50)Dgp71WD 95 ± 2 0 (n = 45) 4 ± 6

Microtubules were stained with antibodies against α-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For a correct interpretation, we need to keep in mind a decrease in the total amount of γTuRC–specifi c components in-depleted cells. n, number of prometaphases/metaphases analyzed.aConfi dence intervals calculated for P95.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 527

assembly mechanism mediated by γ-TuRCs is impaired or as a

physiological pathway acting in parallel to γ-TuRC nucleation

activity. Altogether, our data should prompt the reexamination

of the current nucleation models.

Materials and methods

Cell culture and RNA-mediated interferenceRNAi was performed in S2 D. melanogaster cells (Schneider, 1972) ac-cording to Clemens et al., (2000). Cells were treated twice with RNAi at days one and fi ve and harvested on day seven for immunoblottting and immunofl uorescence staining. To perform cosilencing, cells were incubated in the same way, with the four double-stranded RNAs (dsRNAs) against Dgrip75, Dgrip128, and Dgrip163, and Dgp71WD together (20 mM each). The dsRNAs used correspond to positions 717–1,577, relative to start of translation, for Dgrip75 (cDNA clone LD 19773); 157–918, relative to the start position for Dgrip128 (clone GH 21414); 141–846, relative to the start position for Dgrip163 (clone RE 43571); and 145–849, relative to the start position for Dgp71WD (clone RE59956). These dsRNAs were generated from the cDNA plasmid clones as described in Raynaud-Messina et al. (2004).

Fly strainsStrains y1w118 or w118 were used as control strains, and mutant strains Dgrip75175 (Schnorrer et al., 2002), Dgrip163GE27087, and Dgp71WDGE30807 (GenExel, Inc.) were used for the study. Each mutant chromosome had been balanced over CyO, P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP]or TM3,Sb,P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP] (Casso et al., 2000). The GFP-balanced strains were used to select the homozygous mutant larvae. Viability of 100 selected larvae was studied during 28 d. The defi ciencies Df(2L)Exel7071 and Df(3L)Exel6115 uncovering Dgp71WD or Dgrip163, respectively, were used to produce hemizygous fl ies. Note that Dgp71WD is referred as Dgrip71 in the Fly-base database (http://fl ybase.bio.indiana.edu).

AntibodiesThe mouse monoclonal antibodies T-5168, GTU88 (Sigma-Aldrich), and 1501 (CHEMICON International, Inc.) were used to stain α-tubulin, γ-tubulin, and actin, respectively. The following rabbit antibodies were raised: R62 specifi cally directed against D. melanogaster 23C γ-tubulin (Raynaud- Messina et al., 2004); R403 against the COOH-terminal peptide of Dgrip91 (-C R L D F N E Y Y K K R D T N L S K ) for Western blot and R7075 against the recombinant COOH-terminal Dgrip91 (415–917 aa) for immuno-fl uorescence (Colombie et al., 2006); and R367 against the recombinant full-length Dgrip84. R300 was raised against recombinant full-length Dgrip75 and affi nity purifi ed on recombinant Dgrip75, which is produced in Escherichia coli, R267 was raised against the recombinant COOH- terminal Dgp71WD (486–647 aa), and R360 against the recombinant COOH- terminal Dgrip163 (1150–1352 aa) was used for Western blot. For γ-tubulin detection, we used GTU88 for Western blot analysis and R62 for immunofl uorescence experiments, except for double labeling, where mono-clonal GTU88 antibody was used instead of polyclonal R62 antibody.

We also used Rb666 against BubR1 (Logarinho et al., 2004; gift from C. Sunkel, Universidad do Porto, Porto, Portugal), Rb3133 against Asp (Saunders et al., 1997; gift from D. Glover, University of Cambridge, Cambridge, UK), R19 against Cnn (Heuer et al., 1995; gift from T.C. Kaufman, Howard Hughes Institute, Indiana University, Bloomington, IN), and antibodies against Dgrip128 and Dgrip163 (Gunawardane et al., 2000; gift from Y. Zheng, Howard Hughes Institute, Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD).

Sucrose gradients5–40% sucrose gradient was prepared as described previously (Oegema et al., 1999). Cell extracts (500 μg of protein) were overlaid onto the gra-dient and centrifuged for 4 h and 30 min at 4°C in a swinging rotor (SW55.1; Beckman Coulter) at 45,000 rpm (average 150,000 g). 10 0.5-ml fractions were collected and 250 μl of each fraction were precipitated with cold methanol (−20°C). The nine fractions corresponding to the solu-ble part of the extracts were analyzed by immunoblotting. The calibration of the gradient was determined by running in parallel 0–3-h D. melanogaster embryonic extracts that contain γ-TuSCs and γ-TuRCs.

Western blottingProtein extracts from cultured cells (Raynaud-Messina et al., 2004) and from total larval brains (Colombie et al., 2006) were prepared and sub-

jected to Western blot analyses (7.5% polyacrylamide gel and SDS [Sigma-Aldrich]). Apparent masses were determined by comparison with the SDS-PAGE molecular weight standards (broad range), which were ob-tained from Bio-Rad Laboratories.

Cytological analysis and microscopy techniquesFor immunostaining, S2 cultured cells and semisquashed L3 larval brains were fi xed and permeabilized as previously described (Colombie et al., 2006). DAPI staining of squashed third instar larvae was performed as described previously (Sunkel et al., 1995). For detection, secondary anti-bodies conjugated to Alexa Fluor 488 or 568 (Invitrogen) were used. Fluorescence microscopy was performed on a microscope (Axiovert; Carl Zeiss MicroImaging, Inc) equipped with a Z-motor, using 100×, 1.4 NA, objectives. Z-series images were acquired with a camera and software (Axiocam MRm and Axiovision; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.). S2 cell or brain images were subsequently deconvolved using Axiovision, and Z-planes were projected onto a single view. The percentages of the different mitotic phenotypes were determined with confi dence intervals calculated for a P95. Usually, image processing and quantifi cation of fl uorescence were done using Photoshop (Adobe). For quantifi cation of polar γ-tubulin by im-munofl uorescence, we measured the maximal signal obtained after γ-tubulin staining. The signal of the camera was proportional to the fl uorescence in-tensity, and the background and the maximal fl uorescence values were ad-justed to 0 and 25, respectively (Lajoie-Mazenc et al., 1994).

Online supplemental materialFig. S1 shows colabeling of γ-tubulin with associated proteins in Dgrip75-depleted cells. Fig. S2 shows phenotypes observed after Dgp71WD deple-tion in S2 cells. Fig. S3 shows mitotic phenotypes in the Dgp71WD mutant. Fig. S4 shows the number of microtubule protofi laments in mitotic cells after Dgrip75 RNAi treatment. Online supplemental material is available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1.

We thank Dr. Y. Zheng for the gift of Dgrip128 and Dgrip163 antibodies, Dr. D. Glover for Asp antibodies, and Dr. T.C. Kaufman for Cnn antibodies. We would particularly like to thank A. Merdes and J-E. Gairin for their critical comments.

This work was supported by Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC; grant 4720XP0230F), Fonds Européen de Développement Régional, Action Concertée Incitative (grant 04 5 566), Centre National de la Recher-che Scientifi que (CNRS), and Pierre Fabre funds. C. Verollet was supported by the CNRS and the Laboratoires Pierre Fabre, and N. Colombié was supported by the Ministère de la Recherche and the ARC.

Submitted: 17 November 2005Accepted: 18 January 2006

References

Akashi, T., Y. Yoon, and B.R. Oakley. 1997. Characterization of gamma- tubulin complexes in Aspergillus nidulans and detection of putative gamma- tubulin interacting proteins. Cell Motil. Cytoskeleton. 37:149–158.

Barbosa, V., R.R. Yamamoto, D.S. Henderson, and D. Glover. 2000. Mutation of a Drosophila gamma tubulin ring complex subunit encoded by discs degenerate-4 differentially disrupts centrosomal protein localization. Genes Dev. 14:3126–3139.

Casso, D., F. Ramirez-Weber, and T.B. Kornberg. 2000. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91:451–454.

Clemens, J.C., C.A. Worby, N. Simonson-Leff, M. Muda, T. Maehama, B.A. Hemmings, and J.E. Dixon. 2000. Use of double-stranded RNA inter-ference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6499–6503.

Colombie, N., C. Verollet, P. Sampaio, A. Moisand, C. Sunkel, H.M. Bourbon, M. Wright, and B. Raynaud-Messina. 2006. The Drosophila {gamma}-tubulin small complex subunit Dgrip84 is required for structural and func-tional integrity of the spindle apparatus. Mol. Biol. Cell. 17:272–282.

Delgehyr, N., J. Sillibourne, and M. Bornens. 2005. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J. Cell Sci. 118:1565–1575.

Fava, F., B. Raynaud Messina, J. Leung Tack, L. Mazzolini, M. Li, J.C. Guillemot, D. Cachot, Y. Tollon, P. Ferrara, and M. Wright. 1999. Human 76p: a new member of the γ-tubulin–associated protein family. J. Cell Biol. 147:857–868.

Fujita, A., L. Vardy, M.A. Garcia, and T. Toda. 2002. A fourth component of the fi ssion yeast γ-tubulin complex, Alp16, is required for cytoplasmic

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 528

microtubule integrity and becomes indispensable when γ-tubulin func-tion is compromised. Mol. Biol. Cell. 13:2360–2373.

Geissler, S., G. Pereira, A. Spang, M. Knop, S. Soues, J. Kilmartin, and E. Schiebel. 1996. The spindle pole body component Spc98p interacts with the gamma-tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae at the sites of microtubule attachment. EMBO J. 15:3899–3911.

Gunawardane, R.N., O.C. Martin, K. Cao, L. Zhang, K. Dej, A. Iwamatu, and Y. Zheng. 2000. Characterization and reconstitution of Drosophila γ-tubulin ring complex subunits. J. Cell Biol. 151:1513–1523.

Gunawardane, R.N., O.C. Martin, and Y. Zheng. 2003. Characterization of a new gammaTuRC subunit with WD repeats. Mol. Biol. Cell. 14:1017–1026.

Hannak, E., K. Oegema, M. Kirkham, P. Gonczy, B. Habermann, and A.A. Hyman. 2002. The kinetically dominant assembly pathway for centro-somal asters in Caenorhabditis elegans is γ-tubulin dependent. J. Cell Biol. 157:591–602.

Haren, L., M.-H. Remy, I. Bazin, I. Callebaut, M. Wright, and A. Merdes. 2006. NEDD1-dependent recruitment of the γ-tubulin ring complex to the centrosome is necessary for centriole duplication and spindle assembly. J. Cell Biol.172:505–515.

Heuer, J.G., K. Li, and T.C. Kaufman. 1995. The Drosophila homeotic target gene centrosomin (cnn) encodes a novel centrosomal protein with leucine zippers and maps to a genomic region required for midgut morphogenesis. Development. 121:3861–3876.

Janson, M.E., T.G. Setty, A. Paoletti, and P.T. Tran. 2005. Effi cient formation of bipolar microtubule bundles requires microtubule-bound γ-tubulin complexes. J. Cell Biol. 169:297–308.

Julian, M., Y. Tollon, I. Lajoie-Mazenc, A. Moisand, H. Mazarguil, A. Puget, and M. Wright. 1993. Gamma-tubulin participates in the formation of the mid-body during cytokinesis in mammalian cells. J. Cell Sci. 105:145–156.

Kawaguchi, S., and Y. Zheng. 2004. Characterization of a Drosophila centro-some protein CP309 that shares homology with Kendrin and CG-NAP. Mol. Biol. Cell. 15:37–45.

Khodjakov, A., and C.L. Rieder. 1999. The sudden recruitment of γ-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J. Cell Biol. 146:585–596.

Knop, M., and E. Schiebel. 1997. Spc98p and Spc97p of the yeast gamma- tubulin complex mediate binding to the spindle pole body via their inter-action with Spc110p. EMBO J. 16:6985–6995.

Knop, M., and E. Schiebel. 1998. Receptors determine the cellular localization of a gamma-tubulin complex and thereby the site of microtubule formation. EMBO J. 17:3952–3967.

Knop, M., G. Pereira, S. Geissler, K. Grein, and E. Schiebel. 1997. The spindle pole body component Spc97p interacts with the γ-tubulin of Saccharomyces cerevisiae and functions in microtubule organization and spindle pole body duplication. EMBO J. 16:1550–1564.

Lajoie-Mazenc, I., Y. Tollon, C. Détraves, M. Julian, A. Moisand, C. Gueth-Hallonet, A. Debec, I. Salles-Passador, A. Puget, H. Mazarguil, et al. 1994. Recruitment of antigenic gamma-tubulin during mitosis in ani-mal cells: presence of gamma-tubulin in the mitotic spindle. J. Cell Sci. 107:2825–2837.

Logarinho, E., H. Bousbaa, J.M. Dias, C. Lopes, I. Amorim, A. Antunes-Martins, and C.E. Sunkel. 2004. Different spindle checkpoint proteins monitor microtubule attachment and tension at kinetochores in Drosophila cells. J. Cell Sci. 117:1757–1771.

Megraw, T.L., K. Li, L.R. Kao, and T.C. Kaufman. 1999. The centrosomin pro-tein is required for centrosome assembly and function during cleavage in Drosophila. Development. 126:2829–2839.

Moritz, M., and D.A. Agard. 2001. Gamma-tubulin complexes and microtubule nucleation. Curr. Opin. Struct. Biol. 11:174–181.

Murphy, S.M., L. Urbani, and T. Stearns. 1998. The mammalian γ-tubulin com-plex contains homologues of the yeast spindle pole body components Spc97p and Spc98p. J. Cell Biol. 141:663–674.

Murphy, S.M., A.M. Preble, U.K. Patel, K.L. O’Connel, D.P. Dias, M. Moritz, D. Agard, J.T. Stults, and T. Stearns. 2001. GCP5 and GCP6: two new mem-bers of the human γ-tubulin complex. Mol. Biol. Cell. 12:3340–3352.

Nguyen, T., D.B.N. Vinh, D.K. Crawford, and T.N. Davis. 1998. A genetic analy-sis of interactions with Spc110p reveals distinct functions of Spc97p and Spc98p, components of the yeast gamma-tubulin complex. Mol. Biol. Cell. 9:2201–2216.

Oakley, B.R., C.E. Oakley, Y. Yoon, and M.K. Jung. 1990. Gamma-tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule func-tion in Aspergillus nidulans. Cell. 61:1289–1301.

Oegema, K., C. Wiese, O.C. Martin, R.A. Milligan, E. Iwamatsu, T.J. Mitchison, and Y. Zheng. 1999. Characterization of two related Drosophila γ- tubulin complexes that differ in their ability to nucleate microtubules. J. Cell Biol. 144:721–733.

Paluh, J.L., E. Nogales, B.R. Oakley, K. McDonald, A.L. Pidoux, and W.Z. Cande. 2000. A mutation in gamma-tubulin alters microtubule dynamics and organization and is synthetically lethal with the kinesin-like protein pkl1p. Mol. Biol. Cell. 11:1225–1239.

Raynaud-Messina, B., A. Debec, Y. Tollon, M. Garès, and M. Wright. 2001. Differential properties of the two Drosophila γ-tubulin isotypes. Eur. J. Cell Biol. 80:643–649.

Raynaud-Messina, B., L. Mazzolini, A. Moisand, A.M. Cirinesi, and M. Wright. 2004. Elongation of centriolar microtubule triplets contributes to the for-mation of the mitotic spindle in gamma-tubulin-depleted cells. J. Cell Sci. 117:5497–5507.

Saunders, R.D.C., M.C. Avides, T. Howard, C. Gonzalez, and D.M. Glover. 1997. The Drosophila gene abnormal spindle encodes a novel microtubule-associated protein that associates with the polar regions of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 137:881–890.

Sawin, K.E., P.C. Lourenco, and H.A. Snaith. 2004. Microtubule nucleation at non-spindle pole body microtubule-organizing centers requires fi ssion yeast centrosomin-related protein mod20p. Curr. Biol. 14:763–775.

Schneider, I. 1972. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353–365.

Schnorrer, F., S. Luschnig, I. Koch, and C. Nüsslein-Volhard. 2002. γ-Tubulin 37C and γ-tubulin ring complex protein 75 are essential for bicoid RNA localization during Drosophila oogenesis. Dev. Cell. 3:685–695.

Spang, A., S. Geissler, K. Grein, and E. Schiebel. 1996. γ-Tubulin–like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body sub-structures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J. Cell Biol. 134:429–441.

Stearns, T., and M. Kirschner. 1994. In vitro reconstitution of centrosome assem-bly and function: the central role of γ-tubulin. Cell. 76:623–637.

Sunkel, C.E., R. Gomes, P. Sampaio, J. Perdigao, and C. Gonzalez. 1995. Gamma-tubulin is required for the structure and function of the microtu-bule organizing centre in Drosophila neuroblasts. EMBO J. 14:28–36.

Takahashi, M., A. Yamagiwa, T. Nishimura, H. Mukai, and Y. Ono. 2002. Centrosomal proteins CG-NAP and kendrin provide microtubule nucle-ation sites by anchoring gamma-tubulin ring complex. Mol. Biol. Cell. 13:3235–3245.

Terada, Y., Y. Uetake, and R. Kuriyama. 2003. Interaction of Aurora-A and cen-trosomin at the microtubule-nucleating site in Drosophila and mamma-lian cells. J. Cell Biol. 162:757–763.

Vardy, L., and T. Toda. 2000. The fi ssion yeast γ-tubulin complex is required in G1 phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBO J. 19:6098–6111.

Venkatram, S., J.J. Tasto, A. Feoktistova, J.L. Jennings, A.J. Link, and K.L. Gould. 2004. Identifi cation and characterization of two novel proteins affecting fi ssion yeast gamma-tubulin complex function. Mol. Biol. Cell. 15:2287–2301.

Vinh, D.B.N., J.W. Kern, W.O. Hancock, J. Howard, and T.N. Davis. 2002. Reconstitution and characterization of budding yeast γ-tubulin complex. Mol. Biol. Cell. 13:1144–1157.

Wakefi eld, J.G., S. Bonaccorsi, and M. Gatti. 2001. The Drosophila protein asp is involved in microtubule organization during spindle formation and cytokinesis. J. Cell Biol. 153:637–648.

Zhang, L., T.J. Keating, A. Wilde, G.G. Borisy, and Y. Zheng. 2000. The role of Xgrip210 in γ-tubulin ring complex assembly and centrosome recruitment. J. Cell Biol. 151:1525–1535.

Zheng, Y., M.L. Wong, B. Alberts, and T. Mitchison. 1995. Nucleation of mi-crotubule assembly by a γ-tubulin-containing ring complex. Nature. 378:578–583.

Zimmerman, W.C., J. Sillibourne, J. Rosa, and S.J. Doxsey. 2004. Mitosis- specifi c anchoring of γtubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15:3642–3657.

on Novem

ber 3, 2006 w

ww

.jcb.orgD

ownloaded from

47

III- Etude du rôle des protéines du γ-TuRC en interphase

Le rôle des protéines des complexes γ a majoritairement été abordé lors de la mitose,

stade du cycle cellulaire où a lieu une réorganisation complète du cytosquelette

microtubulaire. Peu d’études ont permis de caractériser un rôle de la tubuline γ et des

protéines associées en interphase.

Dans les cellules de mammifères, la fonction de nucléation des microtubules par la

tubuline γ en interphase a seulement été montrée par deux expériences de re-nucléation

après traitement par le froid (Joshi et al., 1992 ; Luders et al., 2006). La microinjection

d’anticorps dirigés contre GCP3, une protéine associée à la tubuline γ dans le γ-TuSC,

ralentit aussi la re-nucléation des microtubules dans les cellules Hela en interphase (Tassin

et al., 1998). Chez les levures, les protéines des complexes de tubuline γ régulent la

nucléation et la dynamique globale des microtubules (Fujita et al., 2002; Geissler et al.,

1996; Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Spang et al., 1996; Vardy and Toda, 2000;

Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). La perte de fonction par mutation

de Alp4, l’homologue de Dgrip84 chez S. pombe, entraîne une stabilisation de l’extrémité

plus des microtubules interphasiques (Zimmerman and Chang, 2005).

J’ai caractérisé le rôle de la tubuline γ et des protéines associées en interphase, dans

l’organisation et la dynamique des microtubules, en inhibant leur expression par RNAi

dans les cellules S2 en culture. L’utilisation d’une lignée de cellules S2 qui expriment de

manière stable la tubuline α-GFP nous a permis d’analyser en temps réel d’une part la

recroissance des microtubules après désassemblage par le froid et d’autre part la dynamique

des microtubules individuels.

tubuline γ

Actine

Contrô

le

RNAi 4

jours

Contrô

le

RNAi 7jou

rs

RNAi 5jou

rs

76 91 94% de déplétion

A

C

B

anormalnormal

ba

tubuline γ, MTs, ADN

RNAi tubuline γ Contrôle

d ba c

tubuline γ

D

RN

Aitu

bulin

e γ

Con

trôl

e

0 min

6-8 min 10-15 min 40-50 min

a ed

fe

b

h j

c

g

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

9

8

51

91

92

90

49

% de cellules

10

Contrô

le

RNAi 4 jo

urs

RNAi 7

jour

sRNAi 5

jour

s

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-40

Nb

de M

Ts p

ar c

ellu

le

40-50 min

ContrôleRNAi tubuline γ 7 jours

Figure 18 : Organisation et re-croissance des microtubules après déplétion de la tubuline γ (7 jours). A-B. Déplétion de la tubuline γ évaluée par Western Blot (A) et immunofluoresence (B). A. Des extraits de cellules S2 tubuline α-GFP sont analysés en utilisant des anticorps contre la tubuline γ (R62) et l'actine comme contrôle de charge. Les microtubules sont marqués en vert (GFP), l'ADN en bleu et la tubuline γ en rouge (R62).C. Organisation des microtubules après déplétion de la tubuline γ. Les microtubules peuvent s'étendre vers la périphérie (a-vert) ou s'enrouler autour du noyau (b-rose). Le graphique à droite montre l'analyse quantitative des deux phénotypes. D. Re-croissance des microtubules après traitement par le froid. Les cellules sont incubées 40 minutes à 4°C et la re-croissance des microtubules à 25°C est suivie pendant 50 minutes. L'analyse quantitative est représentée dans le graphe en dessous. Les lignes blanches sont les contours des cellules obtenus par microscopie en DIC. Echelle, 5 μM.

48

1) Rôle du γ-TuRC dans la nucléation et l’organisation des

microtubules en interphase

Les expériences d’immunofluorescence sur les cellules S2 fixées sur lame de verre

n’ont pas permis d’analyser l’organisation des microtubules en interphase (Colombie et al.,

2006). Le revêtement des lamelles par la concanavaline A permet une meilleure adhérence

des cellules et donc une meilleure visualisation du réseau microtubulaire interphasique

(Figure 18Ca) (Rogers et al., 2002).

Dans les cellules S2 exprimant la tubuline α-GFP, un traitement par RNAi de 4 ou 5

jours contre la tubuline γ induit une forte diminution du niveau de la protéine en Western

Blot et en immunofluorescence (Figure 18A-B). Dans ces conditions, l’organisation des

microtubules interphasiques n’est pas affectée. Comme dans les cellules contrôles, les

microtubules issus de point multiples autour du noyau ont leurs extrémités plus dirigées

vers la périphérie de la cellule (Figure 18Ca). Par contre, après un traitement de 7 jours

correspondant à un double traitement RNAi (inhibition de plus de 90% du niveau

d’expression de la tubuline γ), 50% des cellules présentent un réseau de microtubules

désorganisé. Les microtubules ne s’étendent plus avec leur extrémité plus vers le cortex

mais se courbent et s’enroulent autour du noyau (Figure 18Cb, phénotype « anormal »).

Après désassemblage des microtubules par le froid, nous avons suivi l’apparition des

microtubules nouvellement nucléés dans une zone sous-corticale de 7 μm après retour à

température ambiante. Certains microtubules atteignent cette zone sous-corticale en 4-6

minutes après le changement de température dans les cellules contrôles. Le nombre de

microtubules atteignant la zone définie augmente linéairement au cours des 50 minutes

suivantes. Dans les cellules traitées de manière prolongée (7 jours) par un RNAi, 10 à 15

minutes sont nécessaires pour voir apparaître les premiers microtubules dans la même zone

sous-corticale. L’absence de tubuline γ induit donc un retard de recroissance des

microtubules d’environ 10 minutes (Figure 18D). Ce retard peut être le reflet d’un retard de

renucléation des microtubules mais aussi de défauts de réorganisation ou de dynamique des

microtubules.

c

c

RN

Ai D

grip

75

0 min

6-8 min 10-15 min 40-50 min

Con

trôl

e

A

9 1 51 53 9 3 9 1 6 0 56

9 4 9 4 7 7 9 4 0 4 4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Contrôle

RNAi tub γ

RNAi Dgrip84

RNAi Dgrip75

% d

e ce

llule

s

anormal

normal

RNAi Dgp71WD

RNAitubγ+Dgrip75

B

a dca b

ef g hf

0

10

20

30

40

50

60

70

RNAi Dgrip75

Control

0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-40 40-50 min

RNAi Dgrip84

Nb

de M

Ts p

ar c

ellu

le

RNAitubγ+Dgp71WD

RNAi Dgp71WD

Figure 19 : L'organisation et la re-croissance des microtubules dépend du γ-TuSC. A. Organisation des microtubules après déplétion à 7 jours des com-posants du γ-TuRC. Le graphique montre l'analyse quantitative des deux phéno-types ("normal" et "anormal"). B. Re-croissance des microtubules après déplé-tion à 7 jours des composants du γ-TuRC. La re-croissance des microtubules est suivie. L'analyse quantitative est représentée dans le graphe en dessous. (voir Figure 18 pour la légende) Les lignes blanches sont les contours des cellules obte-nus par microscopie en DIC. Echelle, 5 μM.

49

Pour déterminer quelles sont les protéines du γ-TuRC nécessaires à l’organisation

des microtubules en interphase, j’ai analysé les phénotypes à long terme induits par la

déplétion de Dgrip84, un partenaire de la tubuline γ dans le γ-TuSC, et de deux protéines

spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgp71WD. L’analyse directe de la fluorescence montre

que la déplétion de Dgrip84 entraîne des défauts d’organisation des microtubules similaires

à ceux induits par la déplétion de la tubuline γ (Figure 19A). Par contre, la déplétion de

Dgrip75 ou de Dgp71WD n’a aucun effet sur l’organisation globale des microtubules

(Figure 19A). Nous avons également vérifié que la déplétion par RNAi d’une des protéines

spécifiques du γ-TuRC et de la tubuline γ simultanément n’entraîne pas de phénotypes plus

forts que la simple déplétion de la tubuline γ (Figure 19A). Cette analyse a été complétée

par les expériences de recroissance des microtubules. Le traitement par RNAi contre

Dgrip84 provoque un retard de recroissance comparable à celui décrit après déplétion de la

tubuline γ. Au contraire, les cinétiques de recroissance ne sont pas affectées par l’absence

de Dgrip75 ou de Dgp71WD (Figure 19B).

De manière cohérente avec ce qui a été précédemment montré en mitose, le γ-TuSC

serait le complexe minimum nécessaire pour la nucléation et l’organisation des

microtubules en interphase.

2) Rôle du γ-TuRC dans la dynamique des microtubules en

interphase

Voir Vérollet et al., soumis , 2007

• Dynamique des microtubules en interphase en absence des protéines du γ-

TuRC

La lignée S2 exprimant la tubuline α en fusion avec la GFP cultivée sur

concanavaline A a permis d’analyser le rôle des protéines du γ-TuRC dans la dynamique de

l’extrémité plus des microtubules à la périphérie cellulaire. Après traitement par RNAi

50

contre la tubuline γ pendant 5 jours, le niveau de la protéine est réduit d’au moins 80% sans

affecter l’organisation globale ou la nucléation des microtubules (Figure 18A et C). J’ai

réalisé des films d’environ 3 minutes avec des prises toutes les 2 secondes, pour des

cellules contrôles et traitées par RNAi. L’analyse de ces films a permis de définir deux

classes de microtubules selon leur comportement près du cortex cellulaire : les

microtubules pouvant être suivis pendant les 3 minutes dans la zone sous-corticale de 6 μm

ont été qualifié de microtubules « stables », alors que les microtubules qui apparaissent ou

disparaissent de cette zone pendant la durée du film ont été appelé « instables ». Seulement

20% des microtubules sont « instables » dans les cellules contrôles, par contre, après

traitement par RNAi durant 5 jours contre la tubuline γ, plus de 75% des microtubules sont

« instables ». La mesure des paramètres dynamiques montre que le paramètre le plus

affecté par l’absence de la tubuline γ est le temps passé en pause par les microtubules. Il est

diminué de moitié dans les cellules traitées. De plus, la fréquence des phénomènes de

catastrophes est augmentée de 2 fois de manière significative. L’observation d’anomalies

de fluorescence dans les microtubules-GFP (« zones noires ») et leur suivi en temps réel a

permis de démontrer que l’extrémité affectée est principalement l’extrémité plus.

Ces résultats mettent en évidence un nouveau rôle de la tubuline γ dans la régulation

de la dynamique des microtubules dans des cellules animales, en tant que protéine

stabilisatrice de l’extrémité plus.

La déplétion de Dgrip84, une protéine du γ-TuSC ou des protéines spécifiques du γ-

TuRC entraîne un augmentation de la proportion de microtubules « instables » et les effets

sur les paramètre dynamiques sont comparables à la déplétion de la tubuline γ. La tubuline

γ contrôlerait donc la dynamique de l’extrémité plus des microtubules sous la forme de γ-

TuRC.

• Analyse de la localisation des protéines du γ-TuRC en interphase

La tubuline γ se localise à l’extrémité moins des microtubules et la stabilise (Wiese,

2000). Son nouveau rôle dans la régulation de la dynamique de l’extrémité plus a mené à

l’analyse fine de sa localisation en interphase. La majeure fraction de tubuline γ est soluble

51

dans le cytoplasme (Moudjou et al., 1996). Après élimination de la tubuline γ

cytoplasmique par perméabilisation des cellules avant fixation, j’ai montré qu’une fraction

de tubuline γ se localise le long des microtubules avec un marquage discontinu allant

jusqu’à l’extrémité plus. Ce marquage disparaît après traitement par RNAi contre la

tubuline γ. Il a été confirmé dans les cellules S2R+, un autre type de cellules de drosophile,

qui favorise la détection de la tubuline γ grâce à leur facilité à s’étaler naturellement et à

former des prolongements. Pour s’assurer que cette localisation n’était pas induite de

manière artificielle par la pré-perméabilisation, deux autres méthodes de fixation ont été

utilisées (MeOH et paraformaldéhyde). Le marquage de la tubuline γ le long des

microtubules disparaît après déassemblage des microtubules par le froid mais pas après

traitement à la latrunculine, qui déassemble le cytosquelette d’actine, indiquant que cette

localisation est spécifique aux microtubules. Cette localisation est dépendante de

l’assemblage du γ-TuRC puisque (1) Dgrip84 et Dgp71WD se localisent également sur les

microtubules cytoplasmiques et (2) la tubuline γ n’est plus recrutée sur les microtubules

après désassemblage du complexe par des traitement RNAi contre Dgrip75 ou Dgp71WD.

Dgp71WD n’est pas essentielle pour l’assemblage d’un complexe de grande taille sur

gradient de sucrose (Vérollet, 2006 ; Haren, 2006 ; Luders, 2006), par contre, elle est

indispensable pour la localisation de la tubuline γ sur les microtubules cytoplasmiques.

• Analyse des +TIPs impliquées dans la régulation de la dynamique des

microtubules par le γ-TuRC

Le γ-TuRC pourrait réguler la dynamique des microtubules indirectement en

affectant la fonction de protéines qui régulent l’extrémité plus des microtubules. Chez les

levures, la régulation de la dynamique des microtubules par les complexes de tubuline γ

met en jeu des +TIPs, telles que Tip1, une protéine de la famille CLIP chez S. pombe ou

Bim1 l’homologue de EB1 chez S. cerevisiae (Cuschieri et al., 2006; Zimmerman and

Chang, 2005). Le passage des +TIPs au centrosome pourrait être essentiel pour leur

fonction à l’extrémité plus (Cuschieri et al., 2006; Sawin and Tran, 2006). Afin de tester

notre hypothèse, nous avons analysé l’implication potentielle des +TIPs dans

l’augmentation de la dynamique des microtubules en absence de tubuline γ. Parmi les

52

+TIPs, les protéines de la famille CLASP stabilisent les microtubules interphasiques dans

divers organismes en générant des pauses (Mimori-Kiyosue et al., 2005; Sousa et al.,

2007). Ses rôles dans la dynamique des microtubules étant similaires à ceux de la tubuline

γ, je me suis tout d’abord intéressé à la seule CLASP identifiée chez la drosophile,

Mast/Orbit (Maiato et al., 2002). Comme précédemment décrit, la déplétion de Mast par

RNAi induit une augmentation du nombre de microtubules « instables » et une diminution

des temps en pause (Sousa et al., 2007). Ces effets sont identiques à ceux obtenus après

déplétion de la tubuline γ et ne sont pas amplifiés par la déplétion simultanée de Mast et de

la tubuline γ. Ces observations suggèrent que la tubuline γ et Mast pourraient être

impliquées dans un même mécanisme de régulation de la dynamique des microtubules.

Cependant, les localisations de Mast au centrosome en mitose et à l’extrémité plus des

microtubules ne sont pas affectées dans les cellules traitées par RNAi contre la tubuline γ.

Dans les cellules de mammifères, les CLASPs stabilisent les microtubules cytoplasmiques

via leur interaction avec EB1 (Mimori-Kiyosue et al., 2005). Cette dernière agit comme un

facteur déstabilisateur des microtubules dans les cellules S2 en diminuant les temps de

pause des microtubules en interphase (Rogers et al., 2002). Après co-déplétion de la

tubuline γ avec EB1, les microtubules présentent des paramètres dynamiques similaires aux

cellules contrôles. La déplétion de EB1 restaure donc les phénotypes induits par la

déplétion de la tubuline γ. D’autre part, après traitement par RNAi contre la tubuline γ,

Dgrip84 ou Dgrip75, EB1 s’accumule d’une manière anormale à l’extrémité plus des

microtubules contrairement à Mast dont la quantité à l’extrémité plus reste constante. Cette

accumulation d’une protéine déstabilisatrice est en accord avec l’augmentation de la

dynamique de l’extrémité plus des microtubules en absence de γ-TuRC.

En conclusion, ces résultats ont révélé un nouveau rôle pour la tubuline γ dans la

stabilisation de l’extrémité plus des microtubules en interphase, dépendant du γ-TuRC. Il

peut être corrélé à la localisation du γ-TuRC le long et à l’extrémité plus des microtubules.

Le γ-TuRC pourrait réguler la dynamique des microtubules et les interactions entre les

microtubules et le cortex en contrôlant la quantité de la +TIP EB1 par rapport à Mast/Orbit

à l’extrémité plus.

A novel role of the �-tubulin complex as a microtubule plus-end stabilizing factor in

Drosophila cells

Christel Vérollet1, Aureliana Sousa2, Paula Sampaio2, Michel Wright1, Andreas Merdes1

Claudio E. Sunkel2, 3and Brigitte Raynaud-Messina1 #.

1Centre de Recherche en Pharmacologie~Santé, UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre, ISTMT, 3,

rue des Satellites BP 94244, 31432 Toulouse Cedex 4, France. 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, Rua do Campo

Alegre 823, 4150-180 Porto, Portugal.3ICBAS-Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto, Porto,

Portugal

# to whom correspondence should be addressed

email : brigitte.raynaud-messina@istmt.cnrs.fr

Fax : +33-5-34321350

Phone : +33-5-34321359

Running head: Role of γ-TuRC in microtubule plus-end dynamics.

Key-words: γ-tubulin, γ-TuRC, interphase, microtubule, Drosophila.

Summary

Microtubules are highly dynamic heteropolymers of α and β-tubulin involved in

many cellular processes. Nucleation of microtubules is supported by γ-tubulin[1, 2]. �-

Tubulin acts within two major complexes: the γ-Tubulin Ring Complex (γ-TuRC) and

its core subunit, the γ-Tubulin Small Complex (γ-TuSC)[3]. Proteins of the γ-TuSC are

highly conserved in all eukaryotes, and are essential for viability and assembly of

functional mitotic spindles[4-9] acting as the hub complex for microtubule nucleation

and organization. In contrast, γ-TuRC-specific components are non-essential but

required for efficient mitotic progression[10-14] and organization of cell type-specific

microtubule networks[15]. However, the specific functions of the γ-TuRC remain poorly

understood, especially during interphase. Using Drosophila cells, we show that the γ-

TuRC plays a role in microtubule dynamics acting as an anti-pause factor at the plus-

ends. Consistent with these data, we demonstrate that a fraction of γ-TuRCs localizes

along interphase microtubules and at their plus tips. Altered microtubule behavior after

γ-TuRC depletion correlates with an abnormal localization of the plus-end-tracking

protein, EB1.

We propose a novel role of γ-tubulin complexes in regulating microtubule

dynamics, by controlling the balanced activities of plus-end tracking proteins and thus

in this way the connections between microtubules and cortex.

Results and Discussion

Plus-end microtubule dynamic behavior is enhanced in γ-tubulin-depleted cells

To address the role of γ-tubulin during interphase, we performed a time-lapse

microscopy analysis in S2 Drosophila cells stably expressing GFP-α-tubulin. RNAi treatment

for four to five days against 23Cγ-tubulin, the major isotype expressed in these cells, induced

a significant decrease of the protein level (supplemental-figureA-B). This depletion prevented

the accumulation of γ-tubulin at the poles and along spindle microtubules (MT) during

mitosis[16]. Moreover, γ-tubulin during interphase was no longer detectable in RNAi-treated

cells (supplemental-figureB). Live analysis of control and γ-tubulin-depleted cells (movie1)

revealed that MTs could be classified into two classes dependent on their behavior near the

cell cortex: MTs followed during the whole duration of the movie in the sub-cortical area

(6μm) were defined as “stable MTs” while MTs which appeared or disappeared from this area

during the period of recording were defined as “dynamic MTs” (Fig. 1A-B). In control cells,

most MTs were rather stable (91%) but depletion of γ-tubulin resulted in a significant

decrease of stable MTs (53%) after 4 days of RNAi treatment reaching 25% after 5 days (Fig.

1B). To further explore the role of γ-tubulin on the behavior of MTs, we analyzed the

parameters of dynamic instability. In control cells, MTs alternated between growth and

shrinkage states, with characteristics consistent with published data in S2 cells[17, 18] (Fig.

1C). However, after depletion of γ-tubulin, both MT growth and especially shrinkage rates

were higher than in control cells (Fig 1C, left). The most striking difference was observed in

the times spent in the different states. After knock-down of γ-tubulin, MTs that reached the

periphery spent significantly less time in the pause state (20%) compared to controls (48%)

(Fig 1C, right). The analysis of the transitions between the three states showed a significant

increase in the frequencies of catastrophe while rescues were not noticeably affected (Fig.

1D). These quantitative changes reflect the most representative phenotype observed in which

half of the MTs were growing, reached the cell cortex area and, instead of pausing, started

rapid depolymerization and disappeared in the cell center. These results demonstrate that γ-

tubulin acts as a stabilizing factor in MT dynamics. The behavior of short free MTs, probably

resulting from severing activity, is consistent with this interpretation. In control cells, the

length of these short MTs was maintained or even elongated whereas in γ-tubulin treated

cells, after alternate phases of growing and shortening, these free MTs disappeared (movie2).

To determine whether the increased MT dynamics observed after γ-tubulin-depletion

were indeed due to altered plus-end dynamics rather than resulting from translocation and

movement of entire microtubules, we examined individual MT lattice at higher magnification,

showing uneven incorporation of GFP-α-tubulin in the form of ‘speckles’. In γ-tubulin

depleted cells, both speckle and plus-end displacements were tracked for 10 individual MTs

(Fig. 1E). While speckle positions oscillated around a constant arbitrary value, the MT plus-

end was growing (pink) or shortening (green) (movie3) suggesting that γ-tubulin plays a

specific role upon the dynamics of MT plus-ends.

Role of γ-tubulin on MT dynamics is dependent on γ-TuRC integrity.

We next investigated which γ-tubulin complex was necessary to regulate interphase

MT dynamics. In Drosophila, the γ-TuSC is composed of γ-tubulin and of the proteins

Dgrip84 and Dgrip91, in a 2/1/1 stoechiometry while the γ-TuRC result from the association

of multiple γ-TuSCs with at least three additional grip-motif-proteins (Dgrip75, Dgrip128 and

Dgrip163) and a WD-motif-protein (Dgp71WD)[3]. Grip-proteins appear to constitute the

core of the large complex, while Dgp71WD seems essential for the targeting or/and the

functionality of this complex[12, 19, 20]. We performed RNAi treatment against one partner

of γ-tubulin in the γ-TuSC (Dgrip84) or two representative proteins specific of the γ-TuRC

(Dgrip75 and Dgp71WD). Down-regulations were efficient, as verified by Western blot and

immunofluorescence analyses (not shown, [12]). After depletion of either γ-TuSC or γ-TuRC

specific subunits, the proportion of dynamic MTs increased significantly (Fig. 2A) and the

effects upon different dynamic parameters were identical to those obtained after depletion of

γ-tubulin alone (Fig. 2B-C). Disruption of the γ-TuRC produced a shift from the pause state

mainly towards the shrinkage state, giving rise to an increase in a dynamic MT subpopulation

(Fig. 2A-C). Hence, the role of γ-tubulin as a MT stabilizing factor appears to be mediated

through the complete γ-TuRC structure. Previous studies, conducted in fungi, have already

suggested that γ-tubulin and its associated proteins play an essential role in the regulation of

MT dynamics. γ-Tubulin was first characterized in Aspergillus nidulans as an extragenic

suppressor of a β-tubulin mutation, inducing MT hyperstabilization[4]. Moreover, mutants of

γ-TuRC genes in budding and fission yeasts showed abnormal MT length in interphase[6, 9,

10, 13] and several of these mutants in S. pombe were hypersensitive to MT-destabilizing

agents[13]. The first direct indications for a role of γ-tubulin complexes in MT dynamics were

obtained from experiments in fission yeast where mutations of the Dgrip84 orthologue Alp4

or overexpression of its C-terminal domain strongly affected dynamic behavior of MTs[21,

22]. In these studies, MTs were found to exhibit continuous growth, with less frequent

catastrophe events, suggesting that γ-tubulin complexes act as MT-destabilizing factors.

Different explanations could account for the discrepancy between the results obtained in yeast

and in Drosophila cells. First, wild-type fission yeast contains only 3-5 MT bundles in

interphase, and this number drops to 1-2 in Alp4 mutants. This results in an increase of the

soluble pool of α/β-tubulin that can indirectly affect the dynamics of the MTs. In contrast, in

Drosophila cells, we do not notice any significant change in soluble tubulin levels after γ-

tubulin depletion (not shown). A second reason could be the difference in the behavior of the

cortical MTs between the two organisms. In fission yeast, when growing interphase MTs

contact cell tips, they undergo catastrophe and shrink back to the nucleus[23]. In contrast in

Drosophila cells, a fraction of MTs is stabilized after contact with the cell cortex. Thus, MT

interactions with the cell cortex can affect MT dynamic behavior differently, depending on

the organism and on the localization of the cell contact. However, these apparently conflicting

results are nevertheless consistent with the proposal that γ-tubulin is involved in the control of

MT-cortex interactions via its function on MT dynamics.

γ-Tubulin is localized along cytoplasmic MTs in the form of γ-TuRCs.

The role of γ-tubulin in the regulation of MT plus-end dynamics in interphase appears

unexpected, as γ-tubulin has been described to localize to the centrosome and to bind MT

minus-ends[1, 2, 4]. Therefore, we further investigated the localization of γ-tubulin. To

improve detection of γ-tubulin, we reduced the large soluble cytoplasmic pool[16, 24] by

permeabilizing S2 cells before formaldehyde fixation (Fig. 3A). In contrast to many

mammalian cell lines, no accumulation of γ-tubulin was detected to the interphase centrosome

in Drosophila cells. This is consistent with the observation that MTs in these cells are

organized randomly in the cytoplasm, without any dominant organization center[8]. Detailed

analysis of the peripheral region of the cells showed that most of the insoluble γ-tubulin

localized along cytoplasmic MTs and in some cases near the plus-ends (Fig. 3A, white

arrowheads). To ensure that γ-tubulin localization along MTs was not artificially induced

during the preparation procedure, we applied different fixation methods, using cold methanol

or paraformaldehyde in S2 cells (not shown) as well as in SR2+ cells (Fig. 3B). The detection

of γ-tubulin was facilitated in SR2+ cells because of their natural ability to spread and form

extensions[25] (Fig. 3B-C). In these cells, γ-tubulin was clearly detected along the MTs,

including the distal ends (Fig. 3B-C, white arrowheads). γ-Tubulin labeling along MTs was

obtained using another independent antibody (supplemental-figureCa). This staining

disappeared after cold-induced MT depolymerization (supplemental-figureD). However, it

was resistant to treatment by latrunculin, indicating that the cytoplasmic localization of γ-

tubulin was independent of polymerized actin (not shown). Moreover, γ-tubulin RNAi

treatment abolished the cytoplasmic immunofluorescence signal (Fig. 3Cc-d compared to

control 3Ca-b), confirming the specificity of the staining. Antibodies directed against the γ-

tubulin associated proteins, Dgrip84 or Dgp71WD, also decorated interphase MTs

(supplemental-figureCb-c). These immunostainings strongly suggested that γ-tubulin

localized along MTs as the complete γ-TuRCs. In Dgrip75- or Dgp71WD-RNAi treated cells,

γ-tubulin staining along cytoplasmic MTs was strongly reduced (Fig. 3Ce-f and g-h, 3D for

quantification). Depletion of either protein did not affect the total amount of γ-tubulin but

modified the composition of the complexes involving γ-tubulin. Previous studies have shown

that γ-tubulin is mainly found in the form of γ-TuSCs after Dgrip75 treatment, and in the form

of γ-TuRC-like structures after Dgp71WD treatment[12]. Altogether, these results suggest

that the full γ-TuRC is necessary to insure recruitment of γ-tubulin along the MT lattice and at

the MT tips in interphase. This is the first report of γ-tubulin localization on interphase MTs

in animals. Other examples for localization of γ-tubulin along MTs include fission yeast and

higher plants in interphase, and animal and plant cells during mitosis. In fission yeast and

higher plants, interphase MTs are arranged in non-centrosomal arrays[26, 27], and γ-tubulin

complexes associated with MTs have been proposed to act as secondary MT organization

centers[28]. Similar principles may govern non-radial MT organization in cultured

Drosophila cells, because a few MT-bound γ-TuRCs could correspond to sites of MT

branching (Fig. 3A, red arrowhead). During mitosis in animal and plant cells, a part of γ-

tubulin localizes on the surface of spindle MTs with a preferential distribution along

kinetochore MTs[26, 29, 30]. Even though the significance of this localization is not entirely

understood, it may imply a role of γ-tubulin in stabilizing a subset of spindle MTs, such as the

kinetochore fibers known to have increased stability[29]. This idea is consistent with the

increased dynamics of interphase MTs after γ-tubulin depletion in S2 cells (this study).

γ-tubulin-dependent control of EB1 localization to MT tips is necessary to maintain

regular MT dynamics.

Because γ-tubulin both localizes along MTs and influences their dynamics in the form

of γ-TuRCs, one attractive possibility would be that the fraction of γ-TuRCs linked to MTs

participates in the regulation of plus-end MT dynamics. γ-TuRCs could act either directly, as

stabilizing microtubule-associated proteins, or indirectly, affecting the function of

microtubule-bound factors such as plus-end tracking proteins (+TIPs) as previously suggested

in yeast[21, 31]. To explore the second hypothesis, we analysed the potential involvement of

these proteins in the regulation of MT dynamics after γ-tubulin depletion. Among the +TIPs,

the Mast/Orbit/CLASP family was shown to be required for the stability of interphase MTs in

different organisms, by promoting pauses and restricting MT dynamics at the cell cortex[17,

32]. Because of the similarities between the roles of this protein family and γ-tubulin on MT

dynamic behavior, we analyzed whether Mast/Orbit, the single CLASP homologue identified

in Drosophila, was involved in mediating γ-tubulin dependent defects. Mast RNAi led to a

potent depletion of Mast protein level (supplemental-figureE-F). Consistent with previous

data[17], this treatment induced a decrease in MT density (supplemental-figureF), an increase

in the number of dynamic MTs (Fig. 4A), and a significant reduction of time spent in pause

(Fig. 4B). The extent of these effects was comparable to those described after depletion of γ-

tubulin or after co-silencing of γ-tubulin and Mast (Fig. 4A-B). The lack of additive effects

suggests that these two proteins act in a common pathway in regulating MT dynamics.

However, the localization of Mast at the growing MT plus-ends did not appear affected after

γ-tubulin depletion (Fig. 4C).

As CLASPs have an important role in the regulation of interphase MTs through their

interaction with EB1[32], we then analyzed the role of EB1 in γ-tubulin-dependent effects on

MT dynamics. In S2 cells, EB1 acts as a MT destabilization factor during interphase [18].

EB1 depletion was monitored by Western blot and immunofluorescence (supplemental-

figureG-H). As previously described[18], depleting EB1 for four days did not alter MT

organization (not shown). However, this treatment induced a stabilization of MTs as judged

by a significant decrease in the number of dynamic MTs, and prolonged time spent in pause

(Fig. 4D-E). Interestingly, after co-depletion of γ-tubulin and EB1, we found that MTs

exhibited dynamic properties that were similar to those of control cells (Fig. 4D-E).

Accordingly, EB1-depletion restores MT dynamics effects induced by γ-tubulin depletion. To

further explore how EB1 down-regulation could compensate MT instability caused by γ-

tubulin depletion, we analyzed the localization of EB1 in cells depleted of γ-tubulin. Although

γ-tubulin RNAi treatment did not affect the pool of EB1 (supplemental-figureG), it caused

abnormal accumulation of this destabilization factor at the MT plus-ends (Fig. 4F). While

control MTs exhibited an average of 2 dots of EB1 at their plus-ends, most of γ-tubulin

depleted MTs displayed more than 4 dots. Similar EB1 accumulation was observed after

individual depletion of Dgrip75 or Dgp71WD (not shown).

Taken together, these data suggest that γ-TuRCs regulate the dynamics of interphase

MTs at the cell cortex at least by controlling the balance between Mast-EB1 at MT plus-ends.

We propose that in wild-type cells, the balance of Mast-EB1 promotes MT local rescue at the

cell cortex by favoring Mast-dependent MT stabilizing activity. However, in γ-tubulin

depleted cells, EB1 recruitment is enhanced at the plus-ends while Mast signal remains

unchanged; therefore the ratio Mast/EB1 would now favor EB1-dependent MT destabilizing

activity. This could explain the increase in MT dynamics after γ-tubulin depletion. This model

is in agreement with the mechanism suggested in Hela cells in which MT dynamics at the cell

cortex can be regulated by CLASP, possibly through the association with EB1[32]. This

model may be an oversimplification as many additional +TIPs could interact and participate

in this mechanism.

Whereas the essential role of γ-TuSC proteins in MT nucleation is well established, the

function of γ-TuRC-specific proteins only starts to be unveiled. During mitosis in Drosophila

cells, γ-TuSCs appear sufficient for pole-dependent MT nucleation and organization, while γ-

TuRCs increase the efficiency of bipolar spindle formation[12]. Moreover, the grip-specific

components of the TuRC are not essential for viability of flies. At least two of them, Dgrip75

and Dgrip128, are required for the formation of distinct sets of MTs during germline

development[11]. Consistent with these studies in Drosophila, mutants in the genes encoding

the S. pombe orthologues of γ-TuRC-specific components are viable[10, 13, 14]. Altogether,

we propose that the γ-TuSCs function as the core units insuring MT nucleation, while the γ-

TuRCs may regulate specific processes such as mitotic progression, organization of cell-type-

specific MT networks or MT/cortex interactions through their role in MT dynamics.

Experimental procedures

Cell culture and RNA-mediated interference

Drosophila Schneider S2 cells, stably transfected with a plasmid encoding GFP-α-tubulin[18]

were used. RNA interference was performed as described[12]. The dsRNAs against

Mast/Orbit (CG32435) and EB1 (CG3265) were generated from the library of Drosophila

cDNA Openbiosystem[33]. For γ-tubulin depletion, live microscopy experiments were done 4

and 5 days after the addition of dsRNA for a kinetic analysis.

Western blotting and Cytological analysis

Protein extracts from cultured cells were prepared and subjected to Western blot analyses as

described[16]. For immunostaining, S2 and S2 GFP-α-tubulin cells were cultured on 0.5

mg/mL concanavalin A-coated coverslips for at least 2h. Cells were fixed with pre-cooled –

20°C methanol for 10 min and then immunostained[12]. To detect γ-tubulin, Dgrip84 and

Dgp71WD along MTs, S2 and S2R+ cells[25] were permeabilized 1 min in PEM ( 100mM

PIPES, 1 mM EGTA, 2mM MgCl2, pH 6.8) containing 0.5% v/v Triton X-100 and then fixed

in PEM containing 1% dimethyl sulfoxyde and 3.7% v/v paraformaldehyde[16] before

immunostaining. Fluorescence microscopy was performed with Deltavision RT equipment on

an Olympus IX71 microscope, using a 100x 1.4 NA objective. Images were obtained with a

CoolSnap camera, subsequently de-convolved, and optical sections were projected onto a

single view. Images were edited using Adobe Photoshop. Quantification of γ-tubulin

localization was performed using a home-made macro-command in Visilog 6.4 software.

The mouse monoclonal antibodies T-5168, GTU88 (Sigma-Aldrich) and 1501 (Chemicon

International, Temecula, CA) were used to stain α-tubulin, γ-tubulin and actin, respectively.

The following rabbit antibodies were used: R62 against Drosophila 23C γ-tubulin[16]; R367

against Dgrip84 and R267 against Dgp71WD[12]. The rabbit antibodies Rb276 against Mast

and the rabbit antibodies against EB1 (gift from Dr. Rogers, University of North Carolina,

USA) were used.

Live imaging of MTs

Drosophila S2 GFP-α-tubulin cells were grown in an aluminium culture chamber with

concanavalin A-coated coverslips for at least 2h before observation. Images were acquired at

2 s-intervals for 200 s and time-lapse movies were obtained with a Zeiss Axiovert microscope

using a 63x /1.4 NA objective and an AxioCam MRm camera/Axiovision software (Carl

Zeiss, Germany). MT plus-ends were tracked using ImageJ software and the results were

transferred into Excel spreadsheet (Microsoft). Pauses were defined as events lasting >2s in

which no statistically significant growth or shrinkage occurred. Catastrophes were defined as

transitions to shrinkage after a pause or a growth, and rescues as transitions to growth after a

pause or a shortening. Statistical analysis was performed using SPSS software as described

[17]. Means are significantly different for p<0.05 meaning a 95% confidence level. Only MTs

with plus-ends clearly resolved near the periphery of the cell were selected for analysis. In

each condition, at least 150 MTs were counted to define the “stable” or “dynamic” MT

population and 30 MTs for the calculation of dynamic parameters. For speckles experiments,

time-lapse images were acquired with Deltavision RT.

Acknowledgements. We thank Drs S. Rogers, R. Vale (University of California, San

Francisco), and H. Ohkura (University of Edinburgh) for the donation of GFP-tubulin cells

and antibodies. We thank J. Coppin and D. Rebérioux for help with computer analysis, and

Drs S. Carreno and J.E. Gairin for critical comments. This work was funded by grants from

“Association pour la Recherche sur le Cancer” (4720XP0230F), Centre National de la

Recherche Scientifique, and Pierre Fabre Laboratories, contributing support for research

expenses and salaries, and support for equipment by the Fonds Européen de Développement

Economique Régional and Action Concertée Incitative (04 5 566).

Figure legends

Figure 1: γ-Tubulin down-regulation enhances MT plus-end dynamics. A-B.

Observation of MT behavior by time-lapse microscopy and quantitative analysis. (A)

Left panel: Low magnification of a control GFP-α-tubulin cell: MTs that can be followed

during the entire length of the movie are called “stable MTs” (pink dot) while MTs that

appear or disappear during the movie are called “dynamic MTs” (green dot). Right panels:

High magnification of the two marked MTs showing their behavior over time. Bars, 5 μm. (B)

Proportion of stable (pink) and dynamic (green) MTs was quantified in control and γ-tubulin-

depleted cells after 4 or 5 days of RNAi treatment. The number of dynamic MTs significantly

increases after γ-tubulin depletion. Bars indicate ± standard deviation. This experiment is

representative of four independent experiments. See Supplemental-movie1. C-D. Dynamic

parameters. The life history of at least 30 individual MTs per condition was analyzed to

determine all the parameters that define MT dynamics in control GFP-α-tubulin cells (white),

and in cells depleted of γ-tubulin for 4 days (grey) or 5 days (green). (C) The strong decrease

of the time spent in pause indicates that MT dynamics are enhanced after γ-tubulin depletion.

Bars indicate ± standard deviation. (D) Likewise catastrophe frequencies significantly

increase in cells depleted of γ-tubulin for 5 days (red, P95%). E. MT plus-end dynamics.

High magnification after deconvolution of a growing MT (pink) and a shortening MT (green)

followed during 63s. White arrowheads indicate sites of uneven GFP-tubulin incorporation

into the MT walls (speckles). The graphs on the right indicate the position of the indicated

speckle (grey graph) and of the plus-end (colored graph) of the MT in μm. See Supplemental-

movie3 for the growing MT.

Figure 2: MT plus-end dynamics are enhanced in Dgrip84-, Dgrip75- or Dgp71WD-

depleted cells. A. Quantitative analysis of MT behavior. Graphs depicting the percentage

of stable (pink) and dynamic MTs (green) in S2 GFP-α-tubulin cells following 5 days of

RNAi treatments against γ-TuRC components as indicated (legend in Fig. 1B). B. Dynamic

parameters. Graphs depicting dynamic parameters of MTs in RNAi-treated GFP-α-tubulin

cells (grey: Dgrip84-RNAi, black: Dgrip75-RNAi and green: Dgp71WD-RNAi) and in

control cells (white) (legend in Fig. 1C). This experiment is representative of three

independent experiments. (C) Catastrophe frequencies significantly increase in cells depleted

of Dgrip84, Dgrip75 or Dgp71WD for 5 days (red, P95%).

Figure 3: γ-Tubulin localizes along interphase MTs and at the plus-ends. A-B.

Localization of γ-tubulin after two different immunofluorescence procedures in S2 and

S2R+ cells. (A) S2 cells permeabilized before fixation as in[16]. (B) S2R+ cells

permeabilized after fixation. (a) γ-Tubulin staining (R62 antibody). (b) Merge: MTs are

shown in red, γ-tubulin in green and chromosomes in blue. The insets are highly magnified in

the right and in the bottom panels. White arrowheads show dots of γ-tubulin along and at the

MT plus-ends, and red arrowhead shows γ-tubulin at a branched MT structure. C-D.

Localization of γ-tubulin after depletion of γ-TuRC in S2R+ cells pre-permeabilized

prior to fixation. (C) Cells treated with RNAi against γ-tubulin (c, d), Dgrip75 (e, f) and

Dgp71WD (g, h) show a decrease in γ-tubulin staining along cytoplasmic MTs. Merge (b, d, f,

h) : as in A. and B. (D) The number of γ-tubulin dots (in pink) on MT surface (limited by grey

lines) in control (a) and Dgrip75-depleted cells (b) is quantified automatically using Visilog®.

Graph ± standard deviation (10 cells per condition). Horizontal bars, 5 μm.

Figure 4: γ-Tubulin-dependent MT dynamics are regulated via plus-end tracking

proteins Mast and EB1. A-C. γ-Tubulin and Mast act in a common pathway. A.

Percentage of stable and dynamic MTs after depletion of Mast and γ-tubulin. B.

Dynamic parameters. Legend as in Fig. 1. Co-silencing of γ-tubulin and Mast induces an

increase in the number of dynamic MTs and a decrease in time spent in pause in a similar

manner as individual depletion of γ-tubulin or Mast. C. Localization of Mast in control (a)

and γ-tubulin-depleted cells (c). No obvious difference of Mast localization is observed in

S2 GFP-α-tubulin cells. D-F. γ-Tubulin depletion induces an accumulation of EB1 at MT

plus-ends. D. Percentage of stable and dynamic MTs after depletion of EB1 and γ-

tubulin. E. Dynamic parameters. Legend as in Fig. 1. EB1 depletion compensates the

phenotype induced by depletion of γ-tubulin. F. Localization of EB1 in control (a) and γ-

tubulin-depleted cells (c). EB1 accumulates at the MT plus-ends of γ-tubulin depleted S2

GFP-α-tubulin cells. The insets are highly magnified and white arrowheads show EB1

staining at the MT plus-ends. C and F. Control cells and cells treated with RNAi against γ-

tubulin for 5 days were stained with antibody against Mast or EB1 (a, c). Merge (b, d):

chromosomes are shown in blue, MTs in green (GFP) and Mast/EB1 in red. For quantification

of Mast or EB1-staining at MT plus-ends (tables), the number of Mast or EB1-dots within

2μm from the MT plus-extremity was counted for at least 200 MTs per condition. Bars, 5 μm.

Online supplemental material

Suplemental-movie1 : γ-Tubulin down-regulation enhances MT plus-end dynamics.

Movie showing the dynamics of MT plus-ends in a control cell (control-left) and after γ-

tubulin depletion (treated-right) in S2 GFP-α-tubulin cells (related to Fig. 1A-D).

Suplemental-movie2 : γ-Tubulin down-regulation destabilizes short MTs. Movie showing

the dynamic of a short MT in a control cell (control-left) and after γ-tubulin depletion

(treated-right) in S2 GFP-α-tubulin cells.

Suplemental-movie3 : MT plus-end dynamics are affected after γ-tubulin depletion.

Movie showing the dynamics of the plus-end and a speckle on a same growing MT after γ-

tubulin depletion in S2 GFP-α-tubulin cells (related to Fig. 1E).

All movies are 2 s-intervals for 200 s. Color dots show MT plus-ends or speckles tracked

using ImageJ software.

Suplemental-figure : A-B. γ-Tubulin depletion is efficient in S2 GFP-α-tubulin cells. A.

Western blot analysis of γ-tubulin depletion. Total protein extracts of control or treated (γ-

tubRNAi) S2 cells expressing GFP-α-tubulin were analyzed using antibodies against γ-tubulin

(R62) and actin (internal loading control). B. Immunofluorescence analysis of γ-tubulin

depletion. GFP-α-tubulin cells after four days of control and γ-tubulinRNAi treatment were

stained with antibody against γ-tubulin (a, c) and DAPI. Merge (b, d) : chromosomes are

shown in blue, MTs in green (GFP) and γ-tubulin in red. C. γ-TuRC components localize

along interphase MTs and at the plus-ends. S2R+ cells permeabilized prior to fixation were

stained in green using the monoclonal antibody GTU88 against γ-tubulin (a), the rabbit

antibody against Dgrip84 (b) and the rabbit antibody against Dgp71WD (c). Merge: MTs are

shown in red and chromosomes in blue. High magnification of an area of the cell is shown on

right panels. D. γ-Tubulin localization on MTs is affected after cold treatment. S2R+ cells

permeabilized prior to fixation were stained in green using the rabbit antibody R62 against γ-

tubulin. High magnification of half of the cell is shown on the bottom panels. Merge: MTs

are shown in red and chromosomes in blue. (a) control cells and (b) cold-treated cells for 40

min (including permeabilization) before fixation. E-H. Mast and EB1 depletion is efficient

after 4 days of RNAi treatment. E and G. Western blot analyses. F and H.

Immunofluorescence analyses. Control and treated S2 GFP-α-tubulin cells were stained

with antibody against Mast or EB1 (a, c) and DAPI. Merge (b, d) : chromosomes are shown

in blue, MTs in green (GFP) and Mast/EB1 in red. Bars, 5 μm.

References

1. Wiese, C., and Zheng, Y. (2000). A new function for the γ-tubulin ring complex as a microtubule minus-end cap. Nature 2, 358-364.

2. Zheng, Y., Wong, M.L., Alberts, B., and Mitchison, T. (1995). Nucleation of microtubule assembly by a γ-tubulin-containing ring complex. Nature 378, 578-583.

3. Wiese, C., and Zheng, Y. (2006). Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci 119, 4143-4153.

4. Oakley, C.E., and Oakley, B.R. (1989). Identification of γ-tubulin, a new member of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillus nidulans. Nature 338,662-664.

5. Sunkel, C.E., Gomes, R., Sampaio, P., Perdigao, J., and Gonzalez, C. (1995). Gamma-tubulin is required for the structure and function of the microtubule organizing centre in Drosophila neuroblasts. Embo J 14, 28-36.

6. Knop, M., Pereira, G., Geissler, S., Grein, K., and Schiebel, E. (1997). The spindle pole body component Spc97p interacts with the γ−tubulin of Saccharomycescerevisiae and functions in microtubule organization and spindle pole body duplication. Embo J. 16, 1550-1564.

7. Barbosa, V., Yamamoto, R.R., Henderson, D.S., and Glover, D. (2000). Mutation of a Drosophila gamma tubulin ring complex subunit encoded by discs degenerate-4 differentially disrupts centrosomal protein localization. Genes & Development 14,3126-3139.

8. Colombie, N., Verollet, C., Sampaio, P., Moisand, A., Sunkel, C., Bourbon, H.M., Wright, M., and Raynaud-Messina, B. (2006). The Drosophila gamma-tubulin small complex subunit Dgrip84 is required for structural and functional integrity of the spindle apparatus. Mol Biol Cell 17, 272-282.

9. Vardy, L., and Toda, T. (2000). The fission yeast γ-tubulin complex is required in G1 phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBO J 19, 6098-6111.

10. Venkatram, S., Tasto, J.J., Feoktistova, A., Jennings, J.L., Link, A.J., and Gould, K.L. (2004). Identification and characterization of two novel proteins affecting fission yeast gamma-tubulin complex function. Mol Biol Cell 15, 2287-2301.

11. Vogt, N., Koch, I., Schwarz, H., Schnorrer, F., and Nusslein-Volhard, C. (2006). The gammaTuRC components Grip75 and Grip128 have an essential microtubule-anchoring function in the Drosophila germline. Development 133, 3963-3972.

12. Verollet, C., Colombie, N., Daubon, T., Bourbon, H.M., Wright, M., and Raynaud-Messina, B. (2006). Drosophila melanogaster gamma-TuRC is dispensable for targeting gamma-tubulin to the centrosome and microtubule nucleation. J Cell Biol 172, 517-528.

13. Fujita, A., Vardy, L., Garcia, M.A., and Toda, T. (2002). A fourth component of the fission yeast γ−tubulin complex, Alp16, is required for cytoplasmic microtubule integrity and becomes indispensable when γ−tubulin function is compromised. Molecular Biology Cell 13, 2360-2373.

14. Anders, A., Lourenco, P.C., and Sawin, K.E. (2006). Noncore components of the fission yeast gamma-tubulin complex. Mol Biol Cell 17, 5075-5093.

15. Schnorrer, F., Luschnig, S., Koch, I., and Nüsslein-Volhard, C. (2002). γ−tubulin 37C and γ−tubulin ring complex protein 75 are essential for bicoid RNA localization during Drosophila oogenesis. Developmental Cell 3, 685-695.

16. Raynaud-Messina, B., Mazzolini, L., Moisand, A., Cirinesi, A.M., and Wright, M. (2004). Elongation of centriolar microtubule triplets contributes to the formation of the mitotic spindle in gamma-tubulin-depleted cells. J Cell Sci 117, 5497-5507.

17. Sousa, A., Reis, R., Sampaio, P., and Sunkel, C. (2007). The Drosophila CLASP homologue, Mast/Orbit regulates the dynamic behaviour of interphase microtubules by promoting the pause state. Cell Motil. Cytos. in press.

18. Rogers, S.L., Rogers, G.C., Sharp, D.J., and Vale, R.D. (2002). Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol 158, 873-884.

19. Luders, J., Patel, U.K., and Stearns, T. (2006). GCP-WD is a gamma-tubulin targeting factor required for centrosomal and chromatin-mediated microtubule nucleation. Nat Cell Biol 8, 137-147.

20. Haren, L., Remy, M.-H., Bazin, I., Callebaut, I., Wright, M., and Merdes, A. (2006). NEDD1-dependent recruitment of the -tubulin ring complex to the centrosome is necessary for centriole duplication and spindle assembly. J Cell Biol 172, 505-515.

21. Zimmerman, S., and Chang, F. (2005). Effects of {gamma}-tubulin complex proteins on microtubule nucleation and catastrophe in fission yeast. Mol Biol Cell 16, 2719-2733.

22. Masuda, H., Miyamoto, R., Haraguchi, T., and Hiraoka, Y. (2006). The carboxy-terminus of Alp4 alters microtubule dynamics to induce oscillatory nuclear movement led by the spindle pole body in Schizosaccharomyces pombe. Genes Cells 11, 337-352.

23. Tran, P.T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., and Chang, F. (2001). A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol 153,397-411.

24. Moudjou, M., Bordes, N., Paintrand, M., and Bornens, M. (1996). Gamma-tubulin in mammalian cells: the centrosomal and the cytosolic forms. J Cell Science 109, 875-887.

25. Yanagawa, S., Lee, J.S., and Ishimoto, A. (1998). Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. J Biol Chem 273, 32353-32359.

26. Murata, T., Sonobe, S., Baskin, T.I., Hyodo, S., Hasezawa, S., Nagata, T., Horio, T., and Hasebe, M. (2005). Microtubule-dependent microtubule nucleation based on recruitment of gamma-tubulin in higher plants. Nat Cell Biol 7, 961-968.

27. Janson, M.E., Setty, T.G., Paoletti, A., and Tran, P.T. (2005). Efficient formation of bipolar microtubule bundles requires microtubule-bound gamma-tubulin complexes. J Cell Biol 169, 297-308.

28. Luders, J., and Stearns, T. (2007). Microtubule-organizing centres: a re-evaluation. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 161-167.

29. Lajoie-Mazenc, I., Tollon, Y., Détraves, C., Julian, M., Moisand, A., Gueth-Hallonet, C., Debec, A., Salles-Passador, I., Puget, A., Mazarguil, H., Raynaud-Messina, B., and Wright, M. (1994). Recruitment of antigenic gamma-tubulin during mitosis in animal cells : presence of gamma-tubulin in the mitotic spindle. J Cell Science 107, 2825-2837.

30. Mahoney, N.M., Goshima, G., Douglass, A.D., and Vale, R.D. (2006). Making microtubules and mitotic spindles in cells without functional centrosomes. Curr Biol 16, 564-569.

31. Cuschieri, L., Miller, R., and Vogel, J. (2006). Gamma-tubulin is required for proper recruitment and assembly of Kar9-Bim1 complexes in budding yeast. Mol Biol Cell 17, 4420-4434.

32. Mimori-Kiyosue, Y., Grigoriev, I., Lansbergen, G., Sasaki, H., Matsui, C., Severin, F., Galjart, N., Grosveld, F., Vorobjev, I., Tsukita, S., and Akhmanova, A. (2005). CLASP1 and CLASP2 bind to EB1 and regulate microtubule plus-end dynamics at the cell cortex. J Cell Biol 168, 141-153.

33. Foley, E., and O'Farrell, P.H. (2004). Functional dissection of an innate immune response by a genome-wide RNAi screen. PLoS Biol 2, E203.

c

C

dynamic MTs stable MTs

0 20 40 60 80

γ-tubulin RNAi 4 days

γ-tubulin RNAi 5 days

Control

100 (%)

0

2

4

6

Control γ-tubulin RNAi 4 days γ-tubulin RNAi 5 days

8

27

36 37

0

10

20

30

40

50

25

43 44

1921

48

Growth rate

Shrinkage rate time in shortening

μm/min %

time in growth

A

Vérollet et al.-Fig1

0s 18s 36s 54s 72s 90s

108s 126s 144s 162s 180s 200 s

time in pause

D

γ-tubulin RNAi 5 days

γ-tubulin RNAi 4 days

catastrophe rescue

8.1 8.9

9.5

15.7

7.9

7.4Transition frequencies (events/s X100)

0s 7s 14s 21s 28s 35s 42s 49s 56s 63s

grow

ing

MT

shor

teni

ng M

T

012

3456

(μm)

-10

1

2

3

4

5

(μm)

(s)10 20 30 40 50 60

B

E

Control

A

c

Vérollet et al.-Fig2

B

Dgrip84 RNAi

Control

Dgrip75 RNAi

Dgp71WD RNAi

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100(%)

stable MTs

m/min

Control Dgrip84 RNAi Dgrip75 RNAi

27

36 38

0

10

20

30

40

50

25

46 45

1818

48%

Dgp71WD RNAi

0

2

4

6

8μ

Growth rate Shrinkage rate

36

46

17

time in shortening

time in growth

time in pause

Dgrip84 RNAi

catastrophe rescue8.1 8.9

10.5 7.6

Dgrip75 RNAi

Dgp71WD RNAi

7.7

6.8

13.1

10.6

Transition frequencies (events/s X100)

C

dynamic MTs

Control

Vérollet et al.-Fig3

C

A

D

B

γ-tu

bulin

RN

Ai

Dgr

ip75

RN

Ai

Con

trol

Dgp

71W

D R

NA

i

γ-tubulin, MTs, DNA γ-tubulin S2R+ permeabilized before fixation

ba dc

fe hg

0

2

4

6

8

10

12

Control RNAi Dgrip75

γ-tu

bulin

dot

s/μm

2

S2R+ permeabilized after fixation γ-tubulin γ-tubulin, MTs,

ba

Control Dgrip75RNAi

ba

γ-tubulin, MTs, γ-tubulin S2 permeabilized before fixation

a b

DNADNA

Vérollet et al.-Fig4

lstab e MTsγ-tub RNAi

Control

Mast RNAi γ-tub + Mast RNAi

100 (%)

0 20 40 60 80

A

B Control Mast RNAi

0

10

20

30

40

50 47

22 22

41

% 49

25

γ-tub RNAi γ-tub + Mast RNAi

3029 31 29 29

46

time in shortening

time in growth

time in pause

% 677 0

100 (%)

0 20 40 60 80

γ-tub RNAi

EB1 RNAi γ-tub +

EB1 RNAi

Controllstab e MTs

D

36

γ-tubRNAi(% of MTs)

Control(% of MTs)

0 dot1-3 dots

>4 dots

5

59

40 0 dot

1-3 dots >4 dots

4

56

F C

Con

trol

γ-tu

bulin

RN

Ai a b

dc

Mast, MTs, DNA Mast

Control EB1 RNAi

0

10

20

30

40

50 46

17

40

21

43

28

γ-tub RNAi γ-tub + EB1 RNAi

2730

33

16

32

60

E

time in shortening

time in growth

time in pause

b

c d

a

EB1, MTs, DNA EB1

γ-tu

bulin

RN

Ai

Con

trol

76

γ-tubRNAi(% of MTs)

Control(% of MTs)

0 dot1-3 dots

>4 dots

9

17

17 0 dot

1-3 dots >4 dots

3

80

dynamic MTs dynamic MTs

Verollet et al. Supplemental-figure

E

γ-tubulinActin

Contro

l

γ-tub

RNAi

Mas

t RNAi

γ-tub

+

Mast R

NAi

Mast

γ-tubulin

Actin

Contro

l

γ-tub

RNAi

EB1 R

NAi

γ-tub

+

EB1 RNAi

EB1

Mast RNAiControl

a b c d

EB1RNAiControl

F

a b c d

Mast, MTs, DNA Mast

EB1, MTs, DNA EB1

d bc

G H

A B

γ-tubulin

Actin

Contro

l

γ-tub

RNAi 4

d

γ-tub

RNAi 5

d

76 91% of depletion

γ-tubulin, MTs, DNA

γ-tubulin RNAi

a

γ-tubulin

Control

a b c d

γ-tubulin, MTs, DNA Dgrip84, MTs, DNA Dgp71WD, MTs, DNA

a b c

S2R+ permeabilized before fixation

D

C

S2R+ permeabilized before fixation COLD TREATMENT

S2R+ permeabilized before fixation CONTROL

a b

γ-tubulin, MTs, DNA γ-tubulin, MTs, DNA

53

IV- Etude de la régulation des protéines des complexes γ

Les études fonctionnelles ont permis de révéler des rôles différents pour les γ-TuSCs

et les γ-TuRCs. En particulier, le γ-TuSC serait le complexe essentiel pour les fonctions de

nucléation et d’organisation des microtubules de la tubuline γ. La déplétion de chacune des

protéines du γ-TuSC engendre des phénotypes identiques chez la drosophile, suggérant que

le γ-TuSC n’est plus fonctionnel. En mitose, elle empêche le recrutement des deux autres

partenaires aux pôles des fuseaux (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Colombie et

al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004; Sampaio et al., 2001; Sunkel et al., 1995),

suggérant que le γ-TuSC ne serait plus assemblé si le niveau d’expression d’une des trois

protéines est affecté. Il est également possible d’imaginer la formation de complexes

incomplets non fonctionnels ou une co-régulation des protéines.

1) Régulation des protéines du γ-TuSC

Pour tester l’hypothèse d’une co-régulation, le niveau global des protéines du γ-

TuSC a été analysé par Western Blot après inhibition par RNAi de la tubuline γ et des

protéines associées. Un double traitement de 7 jours par RNAi contre chacune des trois

protéines du γ-TuSC induit l’inhibition de leur niveau d’expression d’au moins 90%

(figure 20A). La déplétion par RNAi d’une des protéines entraîne la diminution du niveau

des deux autres protéines du complexe d’environ 85%. Ce résultat démontre une co-

régulation du niveau global des trois protéines du γ-TuSC dans les cellules de drosophile.

Les traitements par RNAi contre Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD sont

efficaces après 7 jours (Vérollet et al., 2006) (Figure 21). La déplétion de chacune des

protéines spécifiques du γ-TuRC, ainsi que l’inhibition simultanée de leur expression, n’a

aucun effet sur le niveau global des protéines du γ-TuSC (Figure 20A, co-silencing). Ces

γ-tubulin

Actin

Dgrip84

Dgrip91

Control

γ-Tubulin

RNAi

Dgrip84 RNAi

Dgrip91 RNAi

Dgrip75 RNAi

Dgrip12

8 RNAi

Dgrip16

3 RNAi

Dgp71WD RNAi

Control

Control

Co-silen

cing

WT

Dgrip84-/-

Dgrip75

-/-

Dgp71WD

-/-

γ-tubulinActin

Dgrip84

Actin

GCP2

γ-tubulin

Control

siRNAγ-T

ubulin

A

CB

siRNA G

CP4

Control

Control

γ-Tubulin

RNAi

γ-tubulin

Dgrip84

Dgrip163

D

Figure 20 : Régulation des protéines du γ-TuSC. A-C. Analyse en Western Blot. A. Des extraits totaux de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi (7 jours) ont été révélées en utilisant des anticorps de lapin contre la tubuline γ de drosophile (R62), Dgrip84 (R367), Dgrip91 (R403) et un anticorps monoclonal de souris contre l'actine, servant de contrôle de charge. Le co-silencing correspond à la co-déplétion par RNAi des 4 protéines spécifiques du γ-TuRC. Les protéines du γ-TuSC sont co-régulées indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC. B. Des extraits de cerveaux de larves L3 sauvages (WT) et mutantes Dgrip84, Dgrip91 et Dgp71WD ont été analysées. Les mêmes anticorps que pour A. ont été utilisés. La co-régulation de la tubuline γ et de Dgrip84 est confirmée in vivo indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgp71WD. C. Des estraits de cellules Hela contrôles et transfectées avec des siRNAs contre la tubuline γ et GCP4 (Dgrip75) ont été analysés et révélés par un anticorps monoclonal de souris contre la tubuline γ (GTU88) et un anticorps lapin dirigé contre GCP2; un anticorps monoclonal de souris contre l'actine servant de contrôle de charge. D. Analyse par RT-PCR. Des extraits d'ARN ont été obtenus par extraction au Trizol à partir de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi contre la tubuline γ. Le niveau des ARNm a été analysé par RT-PCR en utilisant des oligonucléotides spécifiques de chacune des séquences des gènes de la tubuline γ, de Dgrip84 et de Dgrip163 dans la partie N-terminale (taille autour de 700bp).

54

données montrent que la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 associées dans le γ-TuSC sont co-

régulées indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC.

In vivo, le niveau de la tubuline γ a été analysé dans des extraits de cerveaux de

larves de drosophile au stade L3, sauvages et mutantes pour Dgrip84 (mutant nul R20),

Dgrip75 ou Dgp71WD (Colombie et al., 2006 ; Schnorrer et al., 2002; Vérollet et al.,

2006). Dans ces trois mutants, la protéine mutée n’est plus détectable. Dans le mutant

Dgrip84, la tubuline γ n’est pas détectée, alors que le niveau d’expression de Dgrip84 et de

la tubuline γ n’est pas altéré dans les mutants Dgrip75 ou Dgp71WD (Figure 20B). La

tubuline γ et Dgrip84 sont donc co-régulées in vivo chez la drosophile. Ainsi, la co-

régulation des trois protéines du γ-TuSC mise en évidence dans les cellules S2 de

drosophile en culture serait retrouvée in vivo.

Afin de déterminer si cette co-régulation est présente chez les mammifères, nous

avons adopté une approche comparable dans les cellules Hela. La tubuline γ et GCP4

(Dgrip75) ont été déplétées par double transfection de siRNAs (C. Boby). La déplétion de

la tubuline γ et de GCP4 est efficace dans les cellules Hela, comme le montre l’analyse en

Western Blot (figure 20C et donnée non montrée). La protéine GCP2 (Dgrip84) n’est plus

détectable en absence de tubuline γ. Par contre, son niveau d’expression n’est pas affecté en

absence de GCP4 (Dgrip75) (Figure 20C). Ces résultats permettent d’élargir aux

mammifères l’existence d’une co-régulation des protéines du γ-TuSC.

2) Mécanismes de régulation des protéines du γ-TuSC

La régulation du niveau de protéines peut avoir lieu au niveau de la traduction, de la

transcription et/ou de la stabilité des ARNm mais aussi au niveau de la stabilité des

protéines. Les mécanismes de régulation des tubulines α/β ont été étudiés. La quantité de

ces protéines dans la cellule est strictement contrôlée par une auto-régulation du « pool »

soluble. Les dimères de tubuline α/β en excès sont capables de se fixer sur un site

55

régulateur de l’ARNm codant la tubuline β et d’induire sa dégradation (Cleveland, 1983a;

Cleveland, 1981; Patcher et al., 1987).

Nous avons donc analysé par RT-PCR le niveau des ARNms codant la tubuline

γ et deux protéines associées, Dgrip84 et Dgrip163 (N. Roullet). Les ARNms des cellules

S2 de drosophile contrôles ou traitées par RNAi contre la tubuline γ ont été extraits au

Trizol® et des oligonucléotides spécifiques de la tubuline γ, Dgrip84 ou Dgrip163 ont été

utilisés. La quantité d’ARNm codant la tubuline γ diminue dans les cellules traitées par

RNAi contre la tubuline γ par rapport aux contrôles, validant l’efficacité du RNAi dans ces

cellules. Par contre, ni le niveau des ARNm codant Dgrip84 (protéine du γ-TuSC), ni celui

des ARNm codant Dgrip163 (protéine spécifique du γ-TuRC), ne sont affectés dans les

cellules déplétées en tubuline γ (Figure 20D).

Ces expériences montrent que la co-régulation des protéines du γ-TuSC n’est

contrôlée ni au niveau transcriptionnel, ni au niveau de la stabilité des ARNm. Divers

mécanismes de régulation pourraient intervenir pour contrôler le niveau des trois protéines

du γ-TuSC mais l’hypothèse la plus simple est que l’assemblage du complexe soit

nécessaire à la stabilité des protéines qui le composent.

3) Régulation des protéines spécifiques du γ-TuRC

Le niveau des protéines spécifiques du γ-TuRC a été analysé par Western Blot dans

les cellules S2 après déplétion par RNAi pendant 7 jours de chacune des protéines des

complexes tubuline γ (Figure 21). La déplétion d’une protéine du γ-TuSC ou des protéines

grip spécifiques du γ-TuRC diminue d’environ 50% le niveau d’expression des autres

protéines grip du complexe et de la tubuline γ, suggérant une co-régulation des protéines du

γ-TuRC (Figure 21). Cet effet est reproductible mais modéré. Un co-régulation entre la

tubuline γ et toutes les autres protéines grip du γ-TuRC existe mais elle est moins stringente

que celle qui existe entre les trois protéines du γ-TuSC.

Dgrip75

Actin

Dgrip128

Dgrip163

Control

γ-Tubulin

RNAi

Dgrip84 RNAi

Dgrip91 RNAi

Dgrip75 RNAi

Dgrip12

8 RNAi

Dgrip16

3 RNAi

Dgp71WD RNAi

Control

Dgp71WD

Figure 21 : Analyse de la régulation des protéines du γ-TuRC par Western Blot. Des extraits totaux de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi (7 jours) ont été révélées en utilisant des anticorps de lapin contre Dgrip75 (R300), Dgrip128 (laboratoire de Y. Zheng), Dgrip163 (R360) et Dgp71WD (R267); un anticorps monoclonal de souris contre l'actine, servant de contrôle de charge. Une régula-tion partielle et assez complexe des protéines du γ-TuRC a été mise en évidence.

56

Par contre, la déplétion de Dgp71WD n’a aucun effet évident sur le niveau de

Dgrip163 ou de Dgrip75 (Figure 21). Dgp71WD n’étant pas essentielle à la formation du γ-

TuRC, il peut exister un γ-TuRC cytoplasmique dépourvu de Dgp71WD (Haren et al.,

2006; Luders et al., 2006; Vérollet et al., 2006 ). Ces données pourraient expliquer que

Dgp71WD se comporte différemment vis à vis de la régulation des protéines du γ-TuRC.

57

DISCUSSION/PERSPECTIVES

La tubuline γ est une protéine essentielle qui joue un rôle clé dans la nucléation et

l’organisation des microtubules. En mitose, elle est nécessaire à l’organisation du fuseau.

Elle se trouve au sein de deux complexes majeurs chez les eucaryotes supérieurs, le γ-

TuRC et une de ses sous-unités le γ-TuSC. Mon but était d’étudier la fonction de la

tubuline γ et de ses partenaires dans les γ-TuSCs et les γ-TuRCs. Pour cela, j’ai analysé les

conséquences de leur déplétion par RNAi dans les cellules de drosophile en culture

(cellules S2), sur l’organisation et la dynamique des microtubules au cours du cycle

cellulaire.

Nos travaux ont permis de mettre en évidence un nouveau rôle de la tubuline γ dans

la régulation de la dynamique des microtubules en interphase, ainsi qu’une nouvelle

localisation de la tubuline γ sur les microtubules cytoplasmiques dans des cellules animales.

L’analyse fonctionnelle des partenaires de la tubuline γ m’a permis de déterminer sous

quelle forme, γ-TuSC ou γ-TuRC, la tubuline γ exerce ses différentes fonctions. Mes

résultats montrent que les protéines du γ-TuSC sont essentielles à la viabilité et nécessaires

à l’organisation des microtubules tout au long du cycle cellulaire. Le γ-TuRC permet la

stabilisation des microtubules interphasiques et l’optimisation de la progression en mitose.

I- Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules en

interphase

Pour la première fois dans des cellules animales, nous avons analysé l’effet de la

déplétion de la tubuline γ sur la dynamique des microtubules en interphase, en utilisant des

cellules S2 dans lesquelles la tubuline α est en fusion avec la GFP. Ces cellules sont

58

cultivées sur concanavaline A pour favoriser l’étalement et permettre une bonne

visualisation des microtubules. Seules les zones périphériques du cytoplasme présentant

une densité réduite de microtubules peuvent être analysées. Le traitement des cellules par

RNAi contre la tubuline γ induit une augmentation du nombre de microtubules « instables »

c’est à dire des microtubules qui ne peuvent pas être suivis dans une zone sous-corticale de

6μm tout au long de la durée d’observation des cellules. Ces microtubules passent deux fois

moins de temps dans un état de pause que les microtubules des cellules contrôles. Ils se

déassemblent rapidement et fréquemment à l’extrémité plus (augmentation des vitesses de

déassemblage et des fréquences de catastrophe) et perdent le contact avec le cortex

cellulaire. Nos résultats, après déplétion par RNAi des partenaires de la tubuline γ, ont

montré que la tubuline γ stabilise les microtubules sous la forme de γ-TuRC.

Le γ-TuRC se lie à l’extrémité moins des microtubules où il favorise la nucléation et

permet la stabilisation de cette extrémité (Keating and Borisy, 2000; Leguy et al., 2000;

Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). Après 5 jours de

traitement RNAi contre la tubuline γ ou Dgrip75, le rapport entre le « pool » de tubuline

α/β soluble et insoluble est inchangé suggérant que dans ces conditions l’effet de

l’inactivation du γ-TuRC sur la nucléation des microtubules est minoritaire. On ne peut pas

exclure un changement faible en faveur d’un augmentation du pool soluble de tubuline γ dû

à des défauts dans la nucléation. Dans ce cas, cela devrait minimiser l’effet de la tubuline γ

en tant que facteur de stabilisation des microtubules. Une étude récente chez S. pombe a

également montré un rôle des γ-TuCs dans l’ancrage des microtubules au SPB

indépendamment de sa fonction de nucléation (Toya et al., 2007). Nous avons vérifié en

suivant des anomalies de fluorescence dans les microtubules-GFP (« zones noires ») que la

dynamique des microtubules était principalement affectée à l’extrémité plus. Ce résultat a

permis d’exclure la possibilité d’un effet indirect de la tubuline γ sur la dynamique de

l’extrémité plus des microtubules qui serait dû à ses rôles dans la nucléation, la stabilisation

ou l’ancrage de l’extrémité moins. Ces données montrent une nouvelle fonction du γ-TuRC

dans la stabilisation de l’extrémité plus des microtubules interphasiques dans les cellules de

drosophile.

59

Chez les levures, des expériences suggéraient déjà une fonction des protéines des

complexes de tubuline γ dans la régulation de la dynamique des microtubules. Initialement,

la tubuline γ a été découverte chez Aspergillus dans un crible destiné à rechercher des gènes

suppresseurs d’une mutation dans le gène codant la tubuline β, qui conduit à une

hyperstabilisation des microtubules (Oakley and Oakley, 1989). Dans des mutants pour les

protéines des complexes de tubuline γ chez S. pombe et S. cerevisiae, les microtubules sont

plus longs et courbés, suggérant qu’ils sont hyperstabilisés (Fujita et al., 2002; Marschall et

al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al., 1996; Vardy and Toda,

2000; Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). Plus récemment, des

expériences en temps réel ont montré que la mutation de Alp4 (Dgrip84) ou la

surexpression de son domaine C-terminal induit une diminution des taux de catastrophe à

l’extrémité plus des microtubules interphasiques, qui continuent de croître jusqu’au cortex

où ils se courbent (Masuda et al., 2006a; Masuda et al., 2006b; Zimmerman and Chang,

2005). Nos données sont en contradiction avec le rôle des complexes de tubuline γ dans la

déstabilisation des microtubules chez la levure, mais les cellules de drosophile et la levure

S. pombe sont difficilement comparables. La levure S. pombe possède un nombre inférieur

de microtubules (4-5 faisceaux de microtubules cytoplasmiques) par rapport aux eucaryotes

supérieurs. Ce nombre diminuant de moitié dans le mutant Alp4 suite aux défauts générés

dans le processus de nucléation, la quantité de tubuline α/β soluble disponible pour

l’assemblage à l’extrémité plus est fortement augmentée. Ceci peut expliquer la diminution

du taux de catastrophes dans ce mutant. Dans les cellules de drosophile, ce changement

dans le rapport tubuline libre/tubuline assemblée n’a pas lieu après déplétion de la tubuline

γ. D’autre part, le comportement des microtubules pris en compte dans ces deux études est

différent. Les microtubules qui atteignent le cortex dans les cellules de drosophile semblent

stabilisés alors que chez S. pombe, ils sont l’objet de phénomènes de catastrophes afin de

positionner correctement le noyau (Tran et al., 2001).

Nous avons analysé l’implication potentielle de deux +TIPs, Mast/Orbit et EB1,

dans la stabilisation des microtubules interphasiques par la tubuline γ. Chez la drosophile,

ces deux protéines ont des rôles opposés concernant la dynamique des microtubules

interphasiques : Mast stabilise l’extrémité plus des microtubules en favorisant les pauses

60

alors que EB1 les déstabilise principalement en diminuant les pauses et favorisant les

catastrophes (Rogers et al., 2002; Sousa et al., 2007). Les effets de la déplétion de Mast

sont identiques à ceux obtenus après déplétion de la tubuline γ. Ils ne sont pas amplifiés

après déplétion simultanée des deux protéines, suggérant que les deux protéines agissent

dans une même voie de signalisation. A l’inverse, la déplétion par RNAi de EB1 induit une

augmentation des temps de pause qui est reversée par la déplétion simultanée de EB1 et de

la tubuline γ. Après déplétion de la tubuline γ, nous observons une accumulation de EB1 à

l’extrémité plus des microtubules, sans modification de la localisation de Mast. Le ratio

Mast/EB1 à l’extrémité plus est perturbé en faveur de EB1, ce qui favoriserait la

déstabilisation des microtubules en induisant des catastrophes. Par conséquent, les

microtubules seraient plus dynamiques et leur interaction avec le cortex serait perturbée.

Un modèle comparable a été proposé dans les cellules de mammifères. Dans les cellules

Hela en interphase, le complexe CLASP (homologue humain de Mast)/EB1 contrôle les

interactions entre les extrémités plus des microtubules et l’actine au niveau du cortex

(Lansbergen and Akhmanova, 2006; Mimori-Kiyosue et al., 2005; Tsvetkov et al., 2007).

Ce modèle élémentaire est peut être plus complexe car d’autres +TIPs agissant de manière

coordonnée ou opposée peuvent être impliquées [Voir INTRODUCTION I-1)].

II- Localisation de la tubuline γ sur les microtubules en

interphase

En interphase, j’ai montré qu’une fraction minoritaire de la tubuline γ se localise de

façon ponctuée le long des microtubules jusqu’à l’extrémité plus. Dans les cellules de

drosophile comme dans les cellules de mammifères, au moins 80% de la tubuline γ totale

est soluble (Moudjou et al., 1996 ; Raynaud-Messina et al., 2001). L’élimination de

ce « pool » de tubuline γ cytoplasmique favorise la mise en évidence de sa localisation sur

les microtubules. Diverses expériences ont permis de contrôler que ce marquage le long des

microtubules est spécifique. Deux types cellulaires de drosophile et deux anticorps

61

différents dirigés contre la tubuline γ ont été testés. Comme la méthode de perméabilisation

avant la fixation que nous avons utilisée peut induire des relocalisations artéfactuelles, nous

avons reproduit les résultats avec deux méthodes de fixation différentes sans

perméabilisation préalable. De plus, nous avons vérifié que la méthode utilisée pour

favoriser la visualisation de la tubuline γ sur les microtubules n’induit pas une

relocalisation systématique de gros complexes protéiques solubles sur le cytosquelette.

Après traitement par RNAi contre une protéine spécifique du γ-TuRC, le niveau global de

tubuline γ n’est pas affecté mais la composition des complexes cytosoliques présents

contenant de la tubuline γ est différente. Après déplétion de Dgrip75 et Dgp71WD, les

complexes sont respectivement des γ-TuSCs et des complexes de coefficient de

sédimentation 30S (Vérollet et al., 2006). Dans ces deux conditions expérimentales, la

tubuline γ n’est plus localisée le long des microtubules interphasiques. De plus, la

localisation sur les microtubules de deux partenaires de la tubuline γ dans le γ-TuRC, dont

Dgp71WD, montrent que la tubuline γ doit être sous forme de γ-TuRCs complets pour

s’associer avec les microtubules interphasiques.

L’utilisation d’une lignée de cellules exprimant de façon transitoire une tubuline γ

couplée à la GFP permettrait peut être de s’affranchir complètement des méthodes de

fixation.

Aucune donnée ne nous permet de conclure sur le rôle de la tubuline γ sous forme de

γ-TuRC sur les microtubules en interphase dans les cellules de drosophile. D’après les

données publiées, deux fonctions sont envisageables : un rôle de nucléation de nouveaux

microtubules ou de stabilisation des microtubules.

La tubuline γ et les protéines associées colocalisent avec les microtubules

interphasiques chez la levure S. pombe (au niveau des iMTOCs), mais aussi dans les

cellules épithéliales polarisées et dans les cellules de plantes supérieures sur les

microtubules corticaux. Dans ces trois exemples, elle se trouve à des sites de jonction de

microtubules et permettrait la nucléation de nouveaux microtubules à des sites non-

centrosomaux (Bartolini and Gundersen, 2006; Janson et al., 2005; Murata and Hasebe,

2007; Murata et al., 2005; Reilein et al., 2005) (Voir ANNEXE 2). Ce phénomène pourrait

62

avoir lieu dans les cellules de drosophile où les microtubules interphasiques ne sont pas

organisés de façon radiaire à partir d’un point unique et où le centrosome ne semble pas

être fonctionnel pour la nucléation des microtubules (Raff, 2004). En effet, la tubuline γ

décore certaines intersections de microtubules (cette étude). Chez la drosophile, cette

organisation non-centrosomale pourrait exiger des centres de nucléation secondaires, par

exemple localisés sur le long des microtubules. Il ne m’a pas été possible de mettre en

évidence la présence de tubuline γ sur les microtubules interphasiques dans les cellules

Hela. Dans des cellules de mammifères, parmi les 20% de tubuline γ soluble, la proportion

de tubuline γ au centrosome est largement majoritaire (Moudjou et al., 1996). La

localisation de la tubuline γ sur les microtubules interphasiques est peut être minoritaire ou

inexistante dans des cellules avec un centrosome fonctionnel contenant de la tubuline γ et

présentant une organisation radiaire des microtubules. Il serait intéressant d’analyser la

localisation de la tubuline γ dans des cellules différenciées comme les neurones ou les

myotubes qui présentent une organisation non-centrosomale des microtubules.

La fonction de la tubuline γ dans la stabilisation des extrémités plus des

microtubules en interphase et sa localisation le long des microtubules est dépendante de

l’association de la tubuline γ en γ-TuRC. Une possibilité est que la tubuline γ, sous forme

de γ-TuRC, agissent en tant que MAP stabilisatrice. Dans les cellules végétales et animales

en mitose, la tubuline γ est associée aux microtubules kinétochoriens qui sont très stables et

résistants (Drykova et al., 2003; Ehrhardt and Shaw, 2006; Lajoie-Mazenc et al., 1994)

(cette étude). Les premières interprétations de cette localisation ont été de proposer un rôle

stabilisateur de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau. Des expériences plus récentes

confirment cette idée dans des cellules de mammifères et de drosophile. L’absence de la

tubuline γ ou de protéines nécessaires à son ancrage spécifiquement sur les microtubules du

fuseau induit une diminution de la densité des microtubules du fuseau sans effet sur

l’activité de nucléation associée aux pôles (Goshima et al., 2007; Luders et al., 2006). Nous

avons observé un phénotype comparable après déplétion d’une protéine spécifique du γ-

TuRC telle que Dgrip75, qui induit une perte de la tubuline γ sur le fuseau (Vérollet et al.,

2006).

63

Une fonction de stabilisation des microtubules par les complexes de tubuline γ avait

déjà été proposée. En microscopie électronique, les cellules présentent des centrioles plus

courts après perte de fonction de la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 chez la drosophile et

Caenorhabditis (Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Dammermann et al., 2004;

Raynaud-Messina et al., 2004). Ces résultats suggèrent que le γ-TuRC pourrait être

impliqué dans la formation, l’élongation ou le maintien de la longueur des centrioles. La

fraction de tubuline γ présente au cœur des centrioles permettrait la stabilisation des

microtubules centriolaires (Fuller et al., 1995).

III- Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs dans la nucléation et

l’organisation des microtubules

La tubuline γ est une protéine essentielle dans tous les organismes (Horio et al.,

1991; Oakley and Oakley, 1989; Sobel and Snyder, 1995; Sunkel et al., 1995; Yuba-Kubo

et al., 2005). Chez la drosophile, Dgrip91 est essentielle (Barbosa et al., 2003; Barbosa et

al., 2000). Nous avons montré que la perte de fonction de Dgrip84 est létale chez la

drosophile (Colombie et al., 2006). Ainsi, comme chez les levures (Geissler et al., 1996;

Knop et al., 1997; Knop and Schiebel, 1997; Vardy and Toda, 2000), les trois protéines du

γ-TuSC, tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91, sont essentielles à la viabilité chez la drosophile.

Les mutants des protéines spécifiques du γ-TuRC (Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et

Dgp71WD) atteignent le stade adulte mais présentent pour la plupart une stérilité male

et/ou femelle (Schnorrer et al., 2002; Vérollet et al., 2006; Vogt et al., 2006). Lors de

l’ovogénèse, Dgrip75 et Dgrip128, sont nécessaires à la localisation de certains

déterminants maternels suggérant un rôle dans la formation de sous-réseaux de

microtubules mais non dans l’organisation globale des microtubules (Schnorrer et al., 2002;

Vogt et al., 2006). En complément de ces données chez la drosophile, des mutations dans

les gènes codant pour les homologues de Dgrip75, 128, et 163 chez S. pombe montrent

64

également que ces gènes ne sont pas essentiels pour la viabilité (Anders et al., 2006; Fujita

et al., 2002; Venkatram et al., 2004).

En conclusion, les protéines du γ-TuSC sont essentielles alors que les protéines

spécifiques du γ-TuRC ne le sont pas.

1) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en interphase

Dans les cellules S2 cultivées sur concanavaline A, la déplétion prolongée par RNAi

de la tubuline γ induit un réarrangement des microtubules interphasiques. Contrairement

aux microtubules des cellules contrôles qui sont en contact avec le cortex cellulaire, la

majorité des microtubules des cellules traitées s’enroulent autour du noyau et très peu

atteignent le cortex. Ce phénotype peut être le reflet de défauts dans la nucléation et/ou la

dynamique des microtubules.

In vitro, la tubuline γ est un élément essentiel pour la nucléation des microtubules

(Félix et al., 1994; Leguy et al., 2000; Moritz et al., 1998; Stearns and Kirschner, 1994;

Zheng et al., 1995). Le rôle de tubuline γ dans la nucléation des microtubules

interphasiques est difficile à étudier in vivo. Dans tous les organismes étudiés, les mutants

de la tubuline γ présentent une diminution de la densité de microtubules (Horio et al., 1991;

Marschall et al., 1996; Martin et al., 1997; Oakley et al., 1990; Oakley and Oakley, 1989;

Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995). Deux expériences montrent directement des défauts

de cinétique de renucléation en absence de tubuline γ (injection d’anticorps et RNAi) dans

des cellules de mammifères après traitement au nocodazole ou au froid (Joshi et al., 1992;

Luders et al., 2006). Les expériences de renucléation sont difficiles à interpréter car le

retard est de l’ordre d’une minute. Les cellules de drosophile exprimant la tubuline α-GFP

ne permettent pas de quantifier directement la capacité de re-nucléation après traitement au

froid car celle ci a lieu à partir de points multiples dans le cytoplasme. C’est pourquoi nous

avons suivi la cinétique de re-croissance des microtubules par analyse du nombre de

microtubules atteignant la zone sous-corticale après retour à température ambiante. Dans

les cellules déplétées en tubuline γ un retard de re-croissance des microtubules d’environ 10

65

minutes est observé. Ce retard peut être dû à une cinétique plus lente de ré-assemblage des

microtubules en absence de tubuline γ ou à une modification de la dynamique des

microtubules. En interphase, la tubuline γ, qui joue donc un rôle dans la dynamique et la

nucléation des microtubules, est essentielle pour une organisation correcte des

microtubules. L’utilisation d’une lignée S2 exprimant la +TIP EB1-GFP, qui ne se localise

que sur les extrémité plus croissantes, pourrait permettre de quantifier plus précisément

l’activité de nucléation et donc de discriminer entre les conséquences de l’absence de la

tubuline γ sur la nucléation et la dynamique des microtubules.

Les phénotypes observés après déplétion prolongée par RNAi de Dgrip84 en

interphase sont similaires à ceux obtenus après déplétion de la tubuline γ. Par contre, la

déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC, qui modifie la dynamique des

microtubules, n’a aucun effet sur leur organisation globale et leur recroissance après

traitement au froid. La modification de la dynamique n’est donc pas suffisante pour induire

des défauts dans l’organisation globale des microtubules. Un exemple similaire est observé

dans les cellules de drosophile en culture après traitement par RNAi contre EB1. La

déplétion de cette +TIP entraîne des défauts de dynamique des microtubules sans affecter

de manière globale le réseau (Rogers et al., 2002).

Nos résultats suggèrent que la tubuline γ participe à l’organisation des microtubules

interphasiques sous la forme de γ-TuSC et que le γ-TuRC ne serait pas essentiel dans ce

processus.

2) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en mitose

La tubuline γ est essentielle à la formation d’un fuseau mitotique bipolaire

fonctionnel (Horio et al., 1991; Marschall et al., 1996; Martin et al., 1997; Paluh et al.,

2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al., 1996; Strome et

al., 2001; Sunkel et al., 1995). Nous avons étudié le rôle de Dgrip84 dans l’organisation du

fuseau mitotique chez la drosophile. Cela a permis de comparer les phénotypes induits par

la déplétion des trois protéines du γ-TuSC (tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91) dans un même

66

organisme métazoaire (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Raynaud-Messina et al.,

2004; Sampaio et al., 2001; Sunkel et al., 1995). Puis, nous avons analysé, pour la première

fois dans des cellules animales, le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en mitose.

• Le TuSC est essentiel pour l’organisation d’un fuseau bipolaire fonctionnel

La déplétion de Dgrip84 par RNAi dans les cellules S2 provoque un ralentissement

en prométaphase corrélé à des défauts dans l’organisation des fuseaux (fuseaux

majoritairement monopolaires) et une mauvaise séparation des chromosomes. En accord

avec ces observations dans les cellules en culture, le mutant drosophile Dgrip84 présente

25% d’aneuploïdie (Colombie et al., 2006). Chez la drosophile, l’analyse des pôles en

microscopie électronique dans les cellules en mitose après déplétion de Dgrip84, de

Dgrip91 ou de la tubuline γ montre la présence de plus de deux centrioles au même pôle

(Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). Ceci suggère

une mauvaise séparation ou duplication des centrosomes. Des défauts de séparation des

pôles, conduisant à des fuseaux monopolaires, pourraient être dû à des défauts dans la

nucléation ou la dynamique des microtubules interpolaires, comme cela a été suggéré chez

Caenorhabditis ou S. cerevisiae (Knop et al., 1997; Marschall et al., 1996; Strome et al.,

2001). Chez la drosophile, les protéines du γ-TuSCs pourraient aussi être impliquées dans

la duplication des centrioles, comme c’est le cas pour la tubuline γ chez Ceanorabditis et

Paramecium ainsi que pour Spc97 (Dgrip84) chez S. cerevisiae (Dammermann et al., 2004;

Knop et al., 1997; Ruiz et al., 1999). Cependant, il est difficile de certifier le nombre de

centrioles du fait de la limite de la technique de microscopie électronique qui ne permet pas

une exploration exhaustive des cellules.

Les défauts en mitose sont identiques lorsque l’expression d’une des trois protéines

du γ-TuSC (Dgrip84, Dgrip91 et la tubuline γ) est inhibée dans les cellules de drosophile en

culture ou in vivo (Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al.,

2004; Sunkel et al., 1995 ). L’ensemble de ces données démontre que les trois protéines du

γ-TuSC ne sont pas redondantes et sont nécessaires à l’organisation d’un fuseau bipolaire

fonctionnel.

67

Curieusement, les microtubules persistent en absence de tubuline γ. Pourtant, la

tubuline γ interviendrait dans les autres mécanismes d’assemblage du fuseau indépendants

du centrosome [Voir INTRODUCTION II-3)-p16]. La fraction restante de tubuline γ après

traitement RNAi pourrait être suffisante pour générer des microtubules. Les études en

microscopie électronique ont montré que les cellules de drosophile déplétées en Dgrip84 ou

en tubuline γ sont capables d’assembler des microtubules, non plus à partir du PCM, mais

par élongation des microtubules centriolaires (Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et

al., 2004). Ces microtubules forment des faisceaux mono-orientés qui peuvent expliquer

d’une part la formation de fuseaux monopolaires et d’autre part l’absence de microtubules

astraux dans les cellules dépourvues en protéines du γ-TuSC (Barbosa et al., 2000;

Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). Ce mode d’assemblage pourrait

constituer un mécanisme alternatif mis en place lorsque la tubuline γ est absente.

Cependant, la présence d’une fraction minoritaire mais très stable de tubuline γ au niveau

des centrioles suggère qu’elle pourrait intervenir dans l’élongation des microtubules

centriolaires dans des conditions normales (Fuller et al., 1995; Khodjakov and Rieder,

1999).

• Les protéines du γ-TuRC ne sont pas essentielles pour une mitose

fonctionnelle et présentent des spécificités fonctionnelles

La perte de fonction par RNAi d’une protéine spécifique du γ-TuRC dans les

cellules de drosophile, comme par exemple Dgrip75, induit une accumulation des cellules

en prométaphase mais les défauts d’organisation des fuseaux sont moins sévères qu’après

déplétion des protéines du γ-TuSC (Vérollet et al., 2006). Les fuseaux monopolaires sont

moins fréquents et on peut observer des fuseaux bipolaires présentant des pôles

normalement focalisés et des microtubules astraux. Cependant, les fuseaux bipolaires

présentent une distance interpolaire plus grande et une densité de microtubules plus faible.

Aucune anomalie détectable dans l’organisation du cytosquelette microtubulaire en mitose

des neuroblastes de mutant Dgrip75. Ceci peut s’expliquer par la difficulté à définir la

morphologie exacte des fuseaux dans les neuroblastes au sein du cerveau ou par une perte

de fonction partielle dans le mutant.

68

Les mutants des gènes codant les protéines spécifiques du γ-TuRC présentent peu ou

pas d’aneuploïdie, suggérant que les mitoses sont fonctionnelles (Vérollet et al., 2006). Ces

résultats sont en accord avec la viabilité de ces mutants (Schnorrer et al., 2002; Vérollet et

al., 2006; Vogt et al., 2006). Par contre, ils ne sont pas en accord avec le mode de

recrutement de la tubuline γ via le γ-TuRC au centrosome (Fava et al., 1999; Stearns and

Kirschner, 1994; Zhang et al., 2000; Zheng et al., 1995). Dans un tel modèle, les

phénotypes induits par la déplétion de chaque composant du γ-TuRC auraient du être

similaires.

Les protéines spécifiques du γ-TuRC présentent des spécificités quant à leur rôle

dans l’assemblage des complexes γ (Vérollet et al., 2006). Contrairement aux protéines à

motifs grip, la protéine Dgp71WD n’est pas nécessaire à l’assemblage d’un complexe dont

le coefficient de sédimentation est comparable à celui du γ-TuRC. Le γ-TuRC étant défini

notamment par sa composition protéique, ces complexes 30S assemblés dans le cytosol ne

sont pas des γ-TuRCs. Toutes les autres protéines à motifs grip étant présentes dans ces

complexes, ils pourraient correspondre à des complexes de composition similaire aux γ-

TuRCs mais dépourvus de Dgp71WD. Après déplétion de Dgp71WD par RNAi et dans le

mutant, la tubuline γ ainsi que les protéines qui lui sont associées dans le γ-TuRC sont

recrutées aux pôles des fuseaux. (Vérollet et al., 2006). Cependant, ces fuseaux sont

majoritairement monopolaires suggérant que les complexes recrutés ne sont pas

fonctionnels. Des fuseaux monopolaires sont aussi obtenus dans les cellules de mammifères

transfectées avec des siRNAs contre Nedd1, l’homologue humain de Dgp71WD (Haren et

al., 2006; Luders et al., 2006). La caractérisation fonctionnelle de Nedd1, l’homologue de

Dgp71WD chez les mammifères, a montré que Nedd1 est nécessaire à la localisation de la

tubuline γ au centrosome et le long des microtubules du fuseau (Haren et al., 2006; Luders

et al., 2006). Ces données sont en contradiction avec les données obtenues chez la

drosophile (Vérollet et al., 2006). La faible homologie entre les protéines associées à la

tubuline γ pourrait être à l’origine des différences fonctionnelles dans des organismes

différents.

69

• Modèle de recrutement de la tubuline γ au centrosome via le γ-TuSC

La déplétion d’un des composants du γ-TuSC empêche le recrutement des deux

autres aux pôles, sur les microtubules du fuseau et au fuseau central en fin de mitose

(Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). La présence

des trois protéines du γ-TuSC et leur assemblage en complexe est donc nécessaire pour le

recrutement de la tubuline γ à ces différentes localisations en mitose. Par contre, après

déplétion par RNAi de chaque protéine à motifs grip spécifiques du γ-TuRC dans les

cellules S2, la tubuline γ et les deux protéines qui lui sont associées dans le γ-TuSC sont

recrutées aux pôles en mitose (Vérollet et al., 2006). Ces résultats ont été retrouvés in vivo

par l’analyse des mutants Dgrip75 et Dgp71WD. Ils sont aussi en accord avec les données

chez la levure S. pombe. Dans cet organisme, les mutations de Gfh1p (Dgrip75), Alp16

(Dgrip163) et mod21 (Dgrip128) entraînent des défauts mineurs dans l’organisation des

fuseaux et les protéines du γ-TuSC sont correctement recrutées au SPB (Anders et al.,

2006; Fujita et al., 2002; Venkatram et al., 2004). L’assemblage des γ-TuRCs dans le

cytoplasme n’est donc pas indispensable pour le recrutement de la tubuline γ au

centrosome. Des expériences complémentaires de déplétion simultanées des quatre

protéines spécifiques du γ-TuRC ont permis de renforcer le fait que la tubuline γ peut être

recrutée aux pôles sous forme de γ-TuSCs (Vérollet et al., 2006) (Figure 22). Cette idée est

en accord avec les données chez la levure S. cerevisiae où seul un complexe de petite taille

contenant les trois homologues des protéines du γ-TuSC existe (Knop et al., 1997 ; Knop

and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998; Vinh et al., 2002). Le modèle de recrutement de la

tubuline γ en absence de γ-TuRC, via le γ-TuSC, pourrait être une voie physiologique de

recrutement de la tubuline γ. Il est aussi concevable que les modes de recrutement soient

plus complexes. Deux autres protéines à motifs grip, appelées Dgrip79 et 223 (Wiese and

Zheng, 2006), sont présentes dans le génome de la drosophile mais rien n’est connu. Ces

deux protéines ou d’autres partenaires non identifiés de la tubuline γ pourraient aussi

participer à la formation et au recrutement des complexes de tubuline γ au centrosome.

Les deux protéines grip du γ-TuSC pourraient être directement impliquées dans le

recrutement ou/et l’ancrage de la tubuline γ au niveau des MTOCs. Ceci est cohérent avec

les données biochimiques et génétiques qui ont montré que ces protéines interagissent avec

γ-TuSC

γ-TuRC

matériel péricentriolaire centrioles

MICROTUBULES DU FUSEAU MITOTIQUE CENTROSOME = PÔLES DU FUSEAU MITOTIQUE

Figure 22 : Mécanismes de recrutement de la tubuline γ en mitose dans les cellules de drosophile. Le γ-TuSC s'associe à au moins 4 autres protéines pour former le γ-TuRC dans le cytoplasme, puis le γ-TuRC est récruté au centrosome en début de mitose pour nucléer des microtubules (flèches noires). En absence de γ-TuRC, nous avons montré que le γ-TuSC pouvait être recruté au centrosome (fléche rose) et nucléer partiellement des microtubules. Par contre, le recrutement de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau se fait via le γ-TuRC exclusivement (flèche mauve).

70

des composants du SPB et du PCM. Les protéines Spc110 et Spc72 qui sont nécessaires à

l’ancrage des complexes de tubuline γ au SPB chez S. cerevisiae interagissent

génétiquement avec Spc98 (Dgrip91) (Knop and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). Les

homologues de Spc110 chez les mammifères seraient CG-NAP (centrosome and Golgi

localized PKN-associated protein) et la kendrine/péricentrine. Ces protéines sont

essentielles à la localisation de la tubuline γ au centrosome en mitose et interagissent

spécifiquement avec GCP2 (Dgrip84) et GCP3 (Dgrip91) (Kawaguchi and Zheng, 2004;

Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004). Chez la drosophile, l’orthologue de ces

protéines, CP309/D-PLP (Drosophila-pericentrine like protein) interagit également avec le

γ-TuSC et est nécessaire à la localisation de la tubuline γ aux pôles des fuseaux

(Kawaguchi and Zheng, 2004; Martinez-Campos et al., 2004). Il pourrait exister une

certaine conservation entre les protéines d’ancrage des complexes tubuline γ chez les

levures et les animaux malgré les différences concernant la structure des complexes. Il est

aussi probable que de nombreuses protéines non identifiées participent au recrutement de la

tubuline γ au centrosome et forment une « plate-forme » d’ancrage.

Chez la drosophile, nous proposons que le γ-TuSC peut être recruté au centrosome

en début de mitose, indépendamment du γ-TuRC, et permet la nucléation de microtubules

nécessaires à la formation d’un fuseau bipolaire fonctionnel pour la ségrégation des

chromosomes. La présence de microtubules astraux après perte de fonction des protéines

spécifiques du γ-TuRC suggère que le PCM reste actif pour la nucléation. Dans ces

conditions, les microtubules assemblés possèdent une structure « normale » à 13

protofilaments en microscopie électronique (Vérollet et al., 2006). Cette observation peut

paraître en contradiction avec le modèle de nucléation proposé par Oakley dans lequel

l’anneau de tubuline γ formé par le γ-TuRC servirait de moule pour la nucléation des

microtubules à 13 protofilaments (Oakley, 1995). Il est possible d’imaginer que plusieurs

γ-TuSCs puissent s’assembler au niveau du PCM pour former une structure en anneau

comparable au γ-TuRC. Cependant, le γ-TuSC n’est pas capable de former un complexe

multimérique in vitro (Oegema et al., 1999). Cette hypothèse nécessiterait donc la présence

d’autres protéines du PCM. Par exemple, les deux protéines grip non caractérisées, Dgrip79

71

et Dgrip225 pourraient participer à la formation d’un complexe en forme d’anneau. Il n’est

toutefois pas possible d’exclure totalement que, dans nos conditions de déplétion, la

fraction restante de protéines spécifiques du γ-TuRC soit suffisante pour former des γ-

TuRCs.

• le γ-TuRC est le complexe optimal pour le déroulement de la mitose

La co-déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC engendre une diminution de la

quantité de γ-TuSCs recrutés aux pôles, la formation de fuseaux monopolaires et une forte

polyploïdie (Vérollet et al., 2006). Dans ces conditions, la quantité de γ-TuSCs aux pôles

est diminuée. Il est possible que les fuseaux ne soient fonctionnels que si le niveau de γ-

TuSCs aux pôles dépasse un « seuil critique ».

In vitro, le γ-TuSC favorise l’assemblage des microtubules et stabilise l’extrémité

moins mais de manière moins efficace que le γ-TuRC (Oegema et al., 1999).

L’accumulation des cellules en mitose, en absence de γ-TuRC, peut donc s’expliquer par

une cinétique plus lente de nucléation des microtubules nécessaires à la formation du

fuseau.

La déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC par RNAi dans les cellules de

drosophile n’empêche pas le recrutement de la tubuline γ aux pôles mais le marquage le

long des microtubules du fuseau n’est plus détectable (Vérollet et al., 2006). La localisation

de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau est donc dépendant de l’assemblage en γ-

TuRC. D’après les expériences de Mahoney et al. dans les cellules S2, la déplétion par

RNAi de la tubuline γ réduit le nombre de microtubules provenant de façon aléatoire de

points à l’intérieur fuseau. L’absence de tubuline γ le long des microtubules du fuseau

pourrait diminuer le nombre de microtubules nucléés et/ou affecter leur fonctionnalité

(Mahoney et al., 2006). De plus, le γ-TuRC est nécessaire pour réguler la dynamique des

microtubules en interphase (cette étude). Des défauts de dynamique de certains

microtubules en mitose pourraient expliquer le retard dans la formation des fuseaux après

déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC.

72

En fin de mitose, le γ-TuRC serait nécessaire pour le déroulement correct de la

cytocinèse. Les analyses des spermatocytes du mutant Dgrip84 a mis en évidence que

Drip84, comme la tubuline γ et Dgrip91, est nécessaire pour l’accomplissement des deux

divisions méiotiques (Barbosa et al., 2003; Colombie et al., 2006; Sampaio et al., 2001).

Des résultats similaires ont été obtenus dans des mutants Dgrip75 et Dgrip128 (Vogt et al.,

2006). Dans ces mutants, la cytocinèse est très asymétrique voir abortive. Les défauts post-

métaphasiques peuvent être observés du fait de la faible stringence du point de contrôle

dans les spermatocytes. Il est tout de même difficile de conclure sur un rôle direct des

protéines du γ-TuRC en fin de mitose car cela peut être la conséquence de défauts dans

l’organisation et la fonction du fuseau au cours de étapes précédentes. Certaines données

sont en faveur d’un rôle du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules du fuseau central.

La tubuline γ est présente sous forme de γ-TuRC au niveau du fuseau central dans les

cellules animales (Julian et al., 1993; Raynaud-Messina et al., 2004; Vérollet et al., 2006).

De plus, des expériences d’injection d’anticorps contre la tubuline γ en anaphase empêche

la formation du fuseau central dans les cellules de mammifères (Julian et al., 1993).

En conclusion, le γ-TuSC serait l’unité minimale pour assurer une ségrégation

correcte des chromosomes lors de la mitose et une organisation normale des microtubules

en interphase. Le γ-TuRC n’est pas indispensable pour le recrutement des γ-TuSCs aux

pôles du fuseau mitotique. Son assemblage permet la localisation de la tubuline γ le long

des microtubules du fuseau et l’optimisation de la progression en mitose. Il favorise aussi la

localisation de la tubuline le long des microtubules cytoplasmiques et stabilise les deux

extrémités des microtubules.

73

3) Co-régulation des protéines du γ-TuSC

Le niveau d’expression des trois protéines du γ-TuSC est co-régulé (données non

publiées), ce qui explique les fortes similitudes entre les phénotypes obtenus après leur

perte de fonction. Cette régulation croisée des protéines du γ-TuSC a lieu aussi bien dans

les cellules de drosophile et humaines qu’ in vivo chez la drosophile. Elle est indépendante

des protéines spécifiques du γ-TuRC. Le niveau de tubuline γ n’étant pas affecté dans des

mutants Alp4 (Dgrip84) chez S. pombe, une telle co-régulation n’aurait pas lieu dans tous

les organismes(Vardy and Toda, 2000). Cependant, il serait nécessaire d’analyser le niveau

de Alp6 (Dgrip91) dans ce mutant pour conclure.

La tubuline γ monomérique est capable d’assembler des microtubules in vitro

(Leguy et al., 2000) et sa surexpression dans les cellules de mammifères induit une

nucléation ectopique (Shu and Joshi, 1995). De plus, l’inhibition de l’expression de la

tubuline γ induit des défauts de nucléation. Le contrôle du niveau de tubuline γ et des

protéines du γ-TuSC dans la cellules pourrait permettre de réguler l’activité de nucléation

des microtubules.

Nous avons montré que la régulation des protéines du γ-TuSC n’est pas dépendante

du niveau des ARNm comme cela avait déjà été décrit pour les tubulines α/β (Cleveland,

1983a; Cleveland, 1983b; Patcher et al., 1987). L’hypothèse la plus probable est que

l’assemblage du γ-TuSC soit nécessaire à la stabilité des protéines qui le composent. Afin

de valider cette hypothèse, il serait nécessaire de comparer la demi-vie des protéines du γ-

TuSC dans des cellules contrôles ou après déplétion d’un des composants du γ-TuSC.

Certaines données suggèrent que le protéasome pourrait réguler le niveau de tubuline γ au

centrosome. Des expériences dans les cellules de mammifères ont montré que la tubuline γ

s’accumule au centrosome en présence d’inhibiteurs du protéasome (Fabunmi et al., 2000).

D’autre part, le protéasome joue un rôle dans la maturation du PCM et la tubuline γ

humaine peut être ubiquitinylée au centrosome par le complexe BRCA1/BARD1 (Starita et

al., 2004). Il serait donc judicieux d’analyser l’effet d’inhibiteurs du protéasome, tel que

l’époxomycine ou le MG115, combinés à des traitements RNAi contre la tubuline γ ou à sa

surexpression, sur le niveau de ces partenaires dans le γ-TuSC.

74

IV- Perspectives

1) Protéines impliquées dans la localisation de la tubuline γ

sur les microtubules

Dans les cellules de drosophile en mitose, la tubuline γ est recrutée au centrosome et

se localise le long des microtubules du fuseau, en particulier sur les microtubules

kinétochoriens. En interphase, elle est très majoritairement cytoplasmique et une fraction

est présente le long des microtubules jusqu’à leur extrémité plus. Nous avons montré que la

localisation de la tubuline γ le long des microtubules, en interphase et en mitose, est

dépendante de son assemblage en γ-TuRC (cette étude). Par contre, cet assemblage n’est

pas nécessaire à sa localisation centrosomale en mitose. Ces données suggèrent que les

protéines responsables de ces diverses localisations peuvent être de nature différente. Le γ-

TuRC peut être soit transporté sur les microtubules par des protéines motrices, soit ancré ou

« capturé » par des protéines d’ancrage sur les microtubules (Figure 23).

L’ efficacité du RNAi dans les cellules de drosophile en culture peut nous permettre

d’identifier des protéines nécessaires à la localisation de la tubuline γ sur les microtubules

interphasiques. L’expérience consiste à analyser si la déplétion (4, 5 et double RNAi à 7

jours) de protéines candidates empêche la présence de tubuline γ sur les microtubules en

immunofluorescence dans des cellules S2R+ (perméabilisées ou non avant fixation).

• Identification des protéines nécessaires à l’ancrage des γ-TuRCs sur les

microtubules en interphase

Chez S. pombe, deux protéines d’ancrage des complexes de tubuline γ ont été

identifiées récemment, mto1 et mto2 (Carazo-Salas and Nurse, 2006; Janson et al., 2005;

Samejima et al., 2005; Sawin et al., 2004) [Voir ANNEXE 2 : Localisations de la tubuline γ

et MTOCs]. L’homologue de mto1 chez la drosophile serait Cnn. Aucun homologue n’a été

γ-TuRC

Figure 23 : Identification des protéines de transport ou d'ancrage de la tubuline γ (sous forme de γ-TuRC) sur les microtubules en interphase.

protéine

d'ancrage?protéines motrices?

γ-TuRC

75

identifié pour mto2. Dans les cellules de drosophile en mitose, la Cnn permettrait l’ancrage

de la tubuline γ spécifiquement au centrosome (Terada et al., 2003). Un traitement RNAi

contre la Cnn conserve uniquement la localisation de la tubuline γ sur les microtubules du

fuseau (Goshima et al., 2007; Mahoney et al., 2006; Muller et al., 2006; Terada et al.,

2003). En interphase, Cnn est dispersée dans le cytoplasme des cellules S2 et n’est pas

associée aux microtubules (données non publiées). Pour ces raisons, il est peu probable que

Cnn exerce des fonctions similaires à mto1 chez la drosophile.

Un « crible RNAi » sur le génome complet de la drosophile basé sur la recherche de

nouveaux gènes nécessaires à l’assemblage du fuseau, a permis de mettre en évidence 4

nouvelles protéines, Dgt3-6, spécifiquement nécessaires à la localisation de la tubuline γ le

long des microtubules du fuseau (Goshima et al., 2007). La déplétion par RNAi de ces

protéines induit des phénotypes comparables à ceux obtenus après déplétion de Dgrip75,

Dgrip128 et Dgrip163. Ces protéines en fusion avec la GFP se localisent uniformément sur

les microtubules du fuseau et le marquage disparaît après désassemblage des microtubules.

La forme étiquetée de ces protéines ne localise pas sur les microtubules en interphase. Il est

nécessaire d’analyser plus en détail la localisation de ces nouvelles protéines en interphase

en utilisant des anticorps. D’une part, la GFP peut empêcher certaines localisations et

d’autre part, Dgt3-6 peuvent être, comme la tubuline γ, très majoritairement

cytoplasmiques.

Les premières études seront réalisées après RNAi contre les protéines Dgt3 à Dgt6

qui pourraient être de bons candidats au vu de leur rôle spécifique dans le recrutement de la

tubuline γ le long des microtubules en mitose. Dans un deuxième temps, l’effet de

l’inhibition de deux protéines responsables de l’ancrage de la tubuline γ au centrosome sera

analysée (CP309/D-PLP et Cnn).

• Identification des protéines motrices nécessaires au transport des γ-TuRCs

sur les microtubules en interphase

In vitro dans des extraits de xénope, la tubuline γ-GFP surexprimée est capable de se

déplacer le long des microtubules de manière dynéine dépendante pour atteindre le centre

76

des asters (Kotani and Yamashita, 2005). A l’inverse, il est possible d’imaginer le transport

de la tubuline γ du centrosome vers l’extrémité plus des microtubules par des kinésines.

Un « crible RNAi » ciblé sur les 26 protéines motrices chez la drosophile (25

kinésines et la dynéine) (Goshima and Vale, 2003) permettront d’identifier celle(s) qui

pourraient être responsable(s) du transport de la tubuline γ le long des microtubules.

Lors de la cytocinèse, les protéines indispensables au recrutement de la tubuline γ

sur le fuseau central ne sont pas connues. Par une approche comparable, nous pourrons

rechercher les protéines impliquées dans la localisation non centrosomale de la tubuline γ

au niveau du fuseau central.

2) Conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique

des microtubules

Mes travaux ont permis la mise en évidence d’une nouvelle fonction de la tubuline γ

dans la stabilisation des microtubules en interphase. Cette fonction est exercée par la

tubuline γ sous forme de γ-TuRCs. Elle met en jeu la régulation de protéines de l’extrémité

plus des microtubules et par conséquent, elle contrôle les contacts entre les microtubules et

le cortex cellulaire (cette étude). De nombreuses fonctions cellulaires telles que la

migration et la division sont contrôlées par la dynamique des microtubules. Nous allons

nous intéresser aux conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique des

microtubules en particulier lors de la mitose et dans le dialogue entre les microtubules et

l’actine en interphase nécessaire à la migration cellulaire.

• Projet 1 : Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules au cours

de la division cellulaire

Le γ-TuRC permet l’optimisation de la progression en mitose et stabilise les

microtubules en interphase. Il pourrait réguler la dynamique de certains microtubules du

fuseau mitotique. De manière schématique, trois sous-types de microtubules dans le fuseau

77

participent à la progression dans les différentes étapes de la mitose : (1) Les microtubules

interpolaires ou chevauchants permettent la séparation des pôles en début de mitose puis

l’éloignement des pôles lors de l’anaphase B ainsi que la formation du fuseau central, (2)

Les microtubules astraux polaires contrôlent le positionnement et la taille du fuseau, les

microtubules astraux équatoriaux sont responsables en partie de l’invagination du cortex en

début de cytocinèse (Glotzer, 2004) et (3) Les microtubules kinétochoriens capturent les

chromosomes, les alignent en métaphase et les séparent de manière coordonnée en

anaphase A (Figure 24).

Lors de la déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC, comme Dgrip75, les

phénotypes obtenus peuvent être réinterprétés en prenant en compte le rôle du γ-TuRC dans

la dynamique des microtubules (Vérollet et al., 2006). La dynamique des trois sous-types

de microtubules du fuseau peut être affectée. Certains fuseaux sont monopolaires suggérant

une mauvaise séparation des pôles en prophase et donc une dynamique des microtubules

interpolaires affectée. Les fuseaux bipolaires sont anormalement allongés mais possèdent

des microtubules astraux. La dynamique et/ou l’interaction avec le cortex des microtubules

astraux peut être altérée. D’autre part, la présence de la protéine BubR1 aux kinétochores

dans les cellules bloquées en prométaphase suggère que la tension exercée entre les

microtubules et les kinétochores est anormale, même s’ils semblent attachés (Colombie et

al., 2006; Logarinho et al., 2004). Des études complémentaires dans les cellules S2 ont

montré que le γ-TuRC interagit avec les protéines BubR1 et Cdc20 et joue un rôle dans la

régulation du point de contrôle mitotique indépendant du centrosome (Muller et al., 2006).

Sachant qu’un seul microtubule non attaché au kinétochore suffit pour activer le point de

contrôle en mitose, il est possible que le rôle du γ-TuRC dans ce processus soit indirect.

L’activation du point de contrôle peut aussi provenir de perturbations de la dynamique des

microtubules kinétochoriens qui modifieraient les forces exercées entre ces microtubules et

les kinétochores (Taylor et al., 2007; Weaver and Cleveland, 2007). La présence de γ-

TuRC sur les microtubules kinétochoriens est en accord avec cette idée (Lajoie-Mazenc et

al., 1994). L’absence de la tubuline γ sur les microtubules kinétochoriens dans les cellules

déplétées en protéines spécifiques du γ-TuRC pourrait augmenter la dynamique de ces

microtubules comme en interphase (cette étude).

PROPHASE PROMETAPHASE

METAPHASE

ANAPHASE- DEBUT DE CYTOCINESE

TELOPHASE- CYTOCINESE CYTOCINESE TARDIVE

centrosome/pôles noyau

chromosome kinétochores/centromère (Cid)

microtubules interpolaires

fibres kinétochoriennes microtubules astraux polaires

microtubules astraux équatoriaux

fuseau central midbody

Figure 24 : Dynamique des microtubules en mitose. A. Photographies de cellules épithéliales de cochon d'inde en mitose (LLC PK). Les chromosomes sont marqués en rouge (DAPI) et les microtubules en vert. B. Schéma des différentes étapes de la mitose et types de microtubules impliqués : les microtubules interpolaires permettent la séparation des pôles en prophase; les microtubules kinétochoriens capturent, alignent et séparent les chromosomes; les microtubules astraux polaires position-nent le fuseau; les microtubules astraux équatoriaux et le fuseau central guident l'invagination du cortex lors de la cytocinèse.

BA

78

- Identification des sous-populations de microtubules en mitose décorées par la

tubuline γ.

En immunofluorescence et en microscopie électronique, la tubuline γ est localisée

préférentiellement sur les fibres kinétochoriennes (Lajoie-Mazenc et al., 1994) qui assurent

l’attache aux chromosomes. Ces fibres constituées de 15 à 30 microtubules peuvent

permettre une meilleure visualisation de la tubuline γ le long des faisceaux de microtubules,

en comparaison avec des microtubules individuels. Cependant, il est possible que la

tubuline γ soit présente en faible quantité sur l’ensemble ou des sous-types de microtubules.

Nous analyserons la localisation de la tubuline γ sur les microtubules en mitose par

différentes méthodes de fixation, dans différents types cellulaires de drosophile et en

utilisant une lignée exprimant la tubuline γ-GFP. Des premières expériences ont permis de

mettre en évidence une fraction de la tubuline γ sur les microtubules astraux dans certaines

conditions (données non publiées).

- Etude du déroulement de la mitose en temps réel

Grâce à la lignée de cellules S2 exprimant la tubuline α-GFP cultivées sur lames de

verre, nous pourrons analyser le déroulement de la mitose en absence d’une protéine

spécifique du γ-TuRC telle que Dgrip75, afin de visualiser les anomalies en mitose

spécifiquement dues à des défauts de dynamique des microtubules. Une première étude

sera effectuée sur des temps longs (12h avec prise de photos toutes les 15 minutes) pour

optimiser le nombre de mitoses analysables. Nous pourrons mesurer certains paramètres :

la durée globale de la mitose, la rotation des fuseaux, les anomalies du cortex au niveau du

sillon de cytocinèse. Dans un deuxième temps des films plus courts (2h avec prise de

photos toutes les 5 minutes) permettront d’affiner les résultats, en particulier, nous pourrons

préciser les anomalies des fuseaux et analyser quelles phases de la mitose sont

préférentiellement ralenties.

- Etude de la dynamique des microtubules en temps réel

Les défauts mis en évidence nous permettront de proposer quel sous-type de

microtubules mitotiques pourrait présenter une modification de dynamique. Des défauts de

79

taille, de rotation ou de symétrie des fuseaux peuvent être la conséquence d’une altération

de la dynamique des microtubules astraux polaires. Des défauts de « timing » ou de

mauvais placement du sillon de clivage pourraient être dus à une altération des

microtubules astraux équatoriaux. Des retards de la mitose peuvent également être dus à

une altération de la dynamique des microtubules kinétochoriens.

Des premières expériences sur concanavaline A ont montré que nous sommes

capables de suivre la dynamique de certains microtubules individuels (prise de photos

toutes les 0.5 s) : les microtubules astraux au niveau des pôles en métaphase et les

microtubules équatoriaux en anaphase qui vont au contact du cortex à l’équateur de la

cellule. Dans des cellules contrôles, ces derniers sont stabilisés lorsqu’ils atteignent le

cortex pour permettre la contraction du cortex. Nous mesurerons les paramètres

dynamiques de ces microtubules individuels dans des cellules contrôles et traitées par

RNAi contre Dgrip75.

Cid est une protéine présente aux kinétochores tout le long de la mitose (Henikoff et

al., 2000). Une analyse indirecte de la dynamique des microtubules kinétochoriens sera

possible grâce à des expériences en temps réel sur des lignées S2 tubuline-GFP/Cid-RFP

(en construction dans le laboratoire de S. Carreno) après traitement par RNAi contre

Dgrip75. Nous pourrons mesurer les durées de capture des microtubules, d’alignement et

de séparation des chromosomes en réalisant des films très courts (100s avec prise de photos

toutes les 1 à 2 secondes). Cette étude peut être complétée par une analyse directe de la

dynamique des fibres kinétochoriennes. En effet, la visualisation des microtubules

kinétochoriens peut être améliorée lorsque les cellules S2 sont placées sous une couche

d’agarose (Maiato et al., 2004a). Des expériences de coupure ou de photoblanchiment de

courtes régions des fibres kinétochoriens dans le fuseau seront utilisées pour analyser les

effets de la déplétion des protéines du γTuRC sur la dynamique des microtubules

kinétochoriens.

• Projet 2 : Rôle de la dynamique des microtubules contrôlée par les γ-TuRCs

dans la formation du lamellipode en interphase

La migration cellulaire est un mécanisme en plusieurs étapes impliquant la

polarisation de la cellule avec la formation d’un lamellipode qui définira le bord avant, sa

80

contraction, sa propulsion et le relâchement des points d’adhésion du bord arrière (Ridley et

al., 2003; Wehrle-Haller and Imhof, 2003). L’actine est l’élément clé dans l’ensemble de

ces processus, mais les différentes étapes de la migration requièrent également un dialogue

entre l’actine et le cytosquelette microtubulaire. Des expériences dans des fibroblastes ont

montré que la dynamique, et non pas la densité, des microtubules est importante pour la

vitesse de migration. Des « poisons » des microtubules à faible concentration, qui

n’affectent que la dynamique, réduisent jusqu’à 60% le taux de locomotion des fibroblastes

(Honore et al., 2005).

Les γ-TuRCs étant impliqués dans la régulation de la dynamique des microtubules

en interphase, nous testerons le rôle de la tubuline γ et des protéines associées dans le

dialogue entre les microtubules et l’actine dans des cellules S2. Nous nous placerons dans

des conditions où seule la dynamique des microtubules est affectée (RNAi Dgrip75) pour

analyser la formation du lamellipode.

Les cellules S2 sur concanavaline A s’étalent et forment un lamellipode symétrique

qui est capable de se contracter (Rogers et al., 2003). Des doubles marquages

microtubule/actine permettront de vérifier le nombre de microtubules qui atteignent le

lamellipode dans des cellules traitées par RNAi contre Dgrip75. La formation de ce

lamellipode étant nécessaire pour la migration, la morphologie et l’épaisseur du

lamellipode seront analysées. Les lignées S2 exprimant de façon stable l’actine-GFP de S.

Rogers pourront être utilisées, ainsi que des lignées tubuline-GFP/actine-RFP (Red

Fluorescent Protein) en construction dans l’équipe de S. Carréno (communication

personnelle). Les expériences en temps réel offrent la possibilité d’analyser si les

contractions de l’actine du lamellipode sont perturbées dans les cellules traitées. Parmi les

90 protéines en liaison avec l’actine analysées par RNAi par S. Rogers pour leur rôle dans

la formation du lamellipode (Rogers et al., 2003), la localisation de celles qui induisent des

phénotypes comparables après déplétion à ceux induits par la déplétion de Dgrip75 sera

étudiée.

Nous avons montré que la tubuline γ régule la localisation de la +TIP EB1. Les

conséquences de cette régulation sur les protéines associées à EB1 pourront être étudiées,

en particulier les protéines qui sont impliquées dans le dialogue microtubule/actine, comme

81

les spectraplakines ou directement des activateurs de l’actine. Dans les cellules S2,

RhoGEF2, qui active des GTPasess de la famille Rho et contrôle donc le cytosquelette

d’actine, interagit avec l’extrémité plus des microtubules par l’intermédiaire de EB1

(Rogers et al., 2004). EB1 interagit aussi directement avec Shot, la seule spectraplakine ou

MACF (microtubule actin cross-linking factors) qui existe chez la drosophile (Slep et al.,

2005). Les première études pourront consister à évaluer la localisation de RhoGEF2 et Shot

en absence de γ-TuRC. Ces derniers pourraient réguler RhoGEF2 à l’extrémité plus des

microtubules mais aussi lors de son passage par le centrosome (Rogers et al., 2004).

A plus long terme, le rôle de la stabilisation des microtubules par la tubuline γ sera

évalué dans le processus de migration. En collaboration avec le laboratoire de S. Carréno,

la mise au point d’un test de migration à travers une membrane semi-perméable dans des

conditions invasives et non invasives sur cellules de drosophile sera réalisée. Les résultats

les plus significatifs seront ensuite explorés et développés dans des modèles de cellules

humaines. Les cellules endothéliales HMEC-1 exprimant la tubuline α-GFP de façon

transitoire pourront être utilisées car elles permettent une analyse aisée de la dynamique des

microtubules individuels (Pourroy et al., 2006). Nous confirmerons, dans des cellules

endothéliales humaines, le rôle stabilisateur de l’extrémité plus des microtubules par la

tubuline γ à l’aide de siRNAs dirigés contre la tubuline γ dont l’efficacité a été démontrée

au laboratoire dans des cellules Hela. Les cellules HMEC-1 sont utilisées dans des tests de

migration (Pourroy et al., 2006). D. Rebérioux (Laboratoires Pierre Fabre) met en place une

automatisation du suivi des cellules en mouvement que nous pourrons utiliser avec les

HMEC-1 déplétées en tubuline γ ou protéines associées.

82

L’ensemble de ces travaux permettront de progresser dans la compréhension des

fonctions de la tubuline γ et des protéines associées dans les γ-TuRCs au cours de différents

processus dépendants des microtubules, en particulier la division cellulaire et la migration

cellulaire. Cependant, la détermination de la structure et de la stœchiométrie du γ-TuRC

ainsi que les interactions entre les protéines qui le composent restent des questions

essentielles auxquelles il sera nécessaire de répondre dans l’avenir.

D’autre part, le rôle de la tubuline γ dans la régulation de la dynamique des microtubules

ainsi que d’autres études montrent que la fonction de cette est protéines est plus complexe

et quelle est impliquée dans des processus indépendants du centrosome. Il a par exemple

été montré que la tubuline γ interagit avec des protéines impliquées dans la réparation de

l’ADN comme Rad51 ou BRCA1 dans des cellules de mammifères (Lesca et al., 2005;

Starita et al., 2004).

Dans le contexte de la recherche de nouvelles cibles et de nouveaux essais de

criblage en pharmacologie anticancéreuse, l’intérêt potentiel de protéines impliquées dans

la mitose et plus spécifiquement dans la régulation de la dynamique des microtubules est un

point à développer. Pour cela, les études sur les protéines du γ-TuRC menées chez la

drosophile devront donc être validées dans des cellules humaines. L’objectif étant

d’approfondir les conséquences de la modification de la dynamique des microtubules sur la

division cellulaire, la polarité et la migration cellulaire, étapes critiques dans les processus

de prolifération et d’invasion tumorale. La similarité dans la composition des complexes et

la fonction des protéines qui les constituent entre la drosophile et l’homme permettront,

dans un premier temps, de déterminer quelles sont les protéines du γ-TuRC les plus

pertinentes à caractériser fonctionnellement dans les cellules humaines, puis, d’orienter la

sélection des protéines-candidates pour des essais pharmacologiques.

83

REFERENCES

Aldaz, H., L.M. Rice, T. Stearns, and D.A. Agard. 2005. Insights into microtubule nucleation from the crystal structure of human gamma-tubulin. Nature. 435:523-7.

Anders, A., P.C. Lourenco, and K.E. Sawin. 2006. Noncore components of the fission yeast gamma-tubulin complex. Mol Biol Cell. 17:5075-93.

Andersen, J.S., C.J. Wikinson, T. Mayor, P. Mortensen, E.A. Nigg, and M. Mann. 2003. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426:570-574.

Barbosa, V., M. Gatt, E. Rebollo, C. Gonzalez, and S.M. Glover. 2003. Drosophila dd4mutants reveal that γTuRC is required to maintain juxtposed half spindles in spermatocytes. J Cell Science. 116:929-941.

Barbosa, V., R.R. Yamamoto, D.S. Henderson, and D. Glover. 2000. Mutation of a Drosophila gamma tubulin ring complex subunit encoded by discs degenerate-4 differentially disrupts centrosomal protein localization. Genes & Development.14:3126-3139.

Bartolini, F., and G.G. Gundersen. 2006. Generation of noncentrosomal microtubule arrays. J Cell Sci. 119:4155-63.

Belmont, L.D., A.A. Hyman, K.E. Sawin, and T.J. Mitchison. 1990. Real-timevisualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62:579-89.

Bobinnec, Y., M. Fukuda, and E. Nishida. 2000. Identification and characterization of Caenorhabditis elegans γ−tubulin in dividing cells and differentiated tissues. J. Cell Science. 113:3747-3759.

Bugnard, E., K.J. Zaal, and E. Ralston. 2005. Reorganization of microtubule nucleation during muscle differentiation. Cell Motil Cytoskeleton. 60:1-13.

Callebaut, I., F. Dulin, O. Bertrand, P. Ripoche, I. Mouro, Y. Colin, J.P. Mornon, and J.P. Cartron. 2006. Hydrophobic cluster analysis and modeling of the human Rh protein three-dimensional structures. Transfus Clin Biol. 13:70-84.

Carazo-Salas, R.E., and P. Nurse. 2006. Self-organization of interphase microtubule arrays in fission yeast. Nat Cell Biol. 8:1102-7.

Cassimeris, L. 1999. Accessory protein regulation of microtubule dynamics throughout the cell cycle. Curr Opin Cell Biol. 11:134-41.

Cassimeris, L., N.K. Pryer, and E.D. Salmon. 1988. Real-time observations of microtubule dynamic instability in living cells. J Cell Biol. 107:2223-31.

Cleveland, D.W.H.J.C. 1983a. Is apparent autoregulatory control of tubulin synthesis non transcriptionally regulated? J. Cell Biol. 97:913-924.

Cleveland, D. 1981. Unpolymerized tubulin modulates the level of tubulin mRNAs. Cell.25:537-546.

Cleveland, D. 1983b. Elevation of tubulin levels by microinjection suppresses new tubulin synthesis. Nature. 305:738-740.

Colombie, N., C. Verollet, P. Sampaio, A. Moisand, C. Sunkel, H.M. Bourbon, M. Wright, and B. Raynaud-Messina. 2006. The Drosophila gamma-tubulin small complex subunit Dgrip84 is required for structural and functional integrity of the spindle apparatus. Mol Biol Cell. 17:272-82.

84

Cuschieri, L., R. Miller, and J. Vogel. 2006. Gamma-tubulin is required for proper recruitment and assembly of Kar9-Bim1 complexes in budding yeast. Mol Biol Cell.17:4420-34.

Dammermann, A., T. Muller-Reichert, L. Pelletier, B. Habermann, A. Desai, and K. Oegema. 2004. Centriole assembly requires both centriolar and pericentriolar material proteins. Dev Cell. 7:815-29.

Debec, A., C. Détraves, C. Montmory, G. Géraud, and M. Wright. 1995. Polar organization of gamma-tubulin in acentriolar mitotic spindles of Drosophila melanogaster cells. J Cell Science. 108:2645-2653.

Détraves, C., H. Mazarguil, I. Lajoie-Mazenc, M. Julian, B. Raynaud-Messina, and M. Wright. 1997. Protein complexes containing gamma-tubulin are present in mammalian brain microtubule protein preparations. Cell Motility Cytoskeleton.36:179-189.

Doxsey, S. 2001. Re-evaluating centrosome function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2:688-98. Drykova, D., V. Cenklova, V. Sulimenko, J. Volc, P. Draber, and P. Binarova. 2003.

Plant gamma-tubulin interacts with alphabeta-tubulin dimers and forms membrane-associated complexes. Plant Cell. 15:465-80.

Ehrhardt, D.W., and S.L. Shaw. 2006. Microtubule dynamics and organization in the plant cortical array. Annu Rev Plant Biol. 57:859-75.

Erhardt, M., V. Stoppin-Mellet, S. Campagne, J. Canaday, J. Mutterer, T. Fabian, M. Sauter, T. Muller, C. Peter, A.M. Lambert, and A.C. Schmit. 2002. The plant Spc98p homologue colocalizes with gamma-tubulin at microtubule nucleation sites and is required for microtubule nucleation. J Cell Sci. 115:2423-31.

Erickson, H.P. 2000. Gamma-tubulin nucleation: template or protofilament? Nat Cell Biol.2:E93-6.

Erickson, H.P., and D. Stoffler. 1996. Protofilaments and rings, two conformations of the tubulin family conserved from bacterial FtsZ to alpha/beta and gamma tubulin. J.Cell Biology. 135:5-8.

Evans, L., M. T, and K. M. 1985. Influence of the centrosome on the structure of nucleated microtubules. J. Cell Biol. 100:1185-1191.

Fabunmi, R.P., W.C. Wigley, P.J. Thomas, and G.N. DeMartino. 2000. Activity and regulation of the centrosome-associated proteasome. J Biol Chem. 275:409-13.

Fava, F., B. Raynaud Messina, J. Leung Tack, L. Mazzolini, M. Li, J.C. Guillemot, D. Cachot, Y. Tollon, P. Ferrara, and M. Wright. 1999. Human 76p: A new member of the gamma-tubulin-associated protein family. Journal of Cell Biology. 147:857-868.

Félix, M.A., C. Antony, M. Wright, and B. Maro. 1994. Centrosome assembly in vitro:role of gamma-tubulin recruitment in Xenopus sperm aster formation. J Cell Biology. 124:19-31.

Fujita, A., L. Vardy, M.A. Garcia, and T. Toda. 2002. A fourth component of the fission yeast γ−tubulin complex, Alp16, is required for cytoplasmic microtubule integrity and becomes indispensable when γ−tubulin function is compromised. MolecularBiology Cell. 13:2360-2373.

Fuller, S.D., B.E. Gowen, S. Reinsch, A. Sawyer, R. Wepf, and E. Karsenti. 1995. Thecore of the mammalian centriole contains gamma-tubulin. Current Biology. 5:1384-1393.

85

Galjart, N. 2005. CLIPs and CLASPs and cellular dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol.6:487-98.

Geissler, S., G. Pereira, A. Spang, M. Knop, S. Soues, J. Kilmartin, and E. Schiebel. 1996. The spindle pole body component Spc98p interacts with the gamma-tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae at the sites of microtubule attachment. Embo J. 15:3899-911.

Glotzer, M. 2004. Cleavage furrow positioning. J Cell Biol. 164:347-51. Goshima, G., and R.D. Vale. 2003. The roles of microtubule-based motor proteins in

mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol.162:1003-16.

Goshima, G., R. Wollman, S.S. Goodwin, N. Zhang, J.M. Scholey, R.D. Vale, and N. Stuurman. 2007. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316:417-21.

Groen, A.C., L.A. Cameron, M. Coughlin, D.T. Miyamoto, T.J. Mitchison, and R. Ohi. 2004. XRHAMM functions in ran-dependent microtubule nucleation and pole formation during anastral spindle assembly. Curr Biol. 14:1801-11.

Gruss, O.J., R.E. Carazo-Salas, C.A. Schatz, G. Guarguaglini, J. Kast, M. Wilm, N. Le Bot, I. Vernos, E. Karsenti, and I.W. Mattaj. 2001. Ran induces spindle assembly by reversing the inhibitory effect of importin alpha on TPX2 activity. Cell.104:83-93.

Gruss, O.J., and I. Vernos. 2004. The mechanism of spindle assembly: functions of Ran and its target TPX2. J Cell Biol. 166:949-55.

Gruss, O.J., M. Wittmann, H. Yokoyama, R. Pepperkok, T. Kufer, H. Sillje, E. Karsenti, I.W. Mattaj, and I. Vernos. 2002. Chromosome-induced microtubule assembly mediated by TPX2 is required for spindle formation in HeLa cells. NatCell Biol. 4:871-9.

Gueth-Hallonet, C., C. Antony, J. Aghion, A. Santa-Maria, I. Lajoie-Mazenc, M. Wright, and B. Maro. 1993. Gamma-tubulin is present in acentriolar MTOCs during early mouse development. J Cell Science. 105:157-166.

Gunawardane, R.N., O.C. Martin, K. Cao, L. Zhang, K. Dej, A. Iwamatu, and Y. Zheng. 2000. Characterization and reconstitution of Drosophila γ−Tubulin Ring Complex subunits. J Cell Biology. 151:1513-1523.

Gunawardane, R.N., O.C. Martin, and Y. Zheng. 2003. Characterization of a new gammaTuRC subunit with WD repeats. Mol Biol Cell. 14:1017-26.

Hannak, E., K. Oegema, M. Kirkham, P. Gonczy, B. Habermann, and A.A. Hyman. 2002. The kinetically dominant assembly pathway for centrosomal asters in Caenorhabditis elegans is gamma-tubulin dependent. J Cell Biol. 157:591-602.

Haren, L., M.-H. Remy, I. Bazin, I. Callebaut, M. Wright, and A. Merdes. 2006. NEDD1-dependent recruitment of the -tubulin ring complex to the centrosome is necessary for centriole duplication and spindle assembly. J Cell Biol. 172:505-515.

Heald, R., and E. Nogales. 2002. Microtubule dynamics. J Cell Sci. 115:3-4. Heald, R., R. Tournebize, T. Blank, R. Sandaltzopoulos, P. Becker, A. Hyman, and E.

Karsenti. 1996. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382:420-5.

86

Hendrickson, T.W., J. Yao, S. Bhadury, A.H. Corbett, and H.C. Joshi. 2001. Conditional mutations in gamma-tubulin reveal its involvement in chromosome segregation and cytokinesis. Mol Biol Cell. 12:2469-81.

Henikoff, S., K. Ahmad, j.S. Platero, and B. Van Steensel. 2000. Heterochromaticdeposition of centromeric histone H3-like proteins. Proc. Nat. Acad. Sc. 97:716-721.

Honore, S., E. Pasquier, and D. Braguer. 2005. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell Mol Life Sci. 62:3039-56.

Horio, T., and B.R. Oakley. 1994. Human γ-tubulin functions in fission yeast. J. Cell Biology. 126:1465-1473.

Horio, T., S. Uzawa, M.K. Jung, B.R. Oakley, K. Tanaka, and M. Yanagida. 1991. Thefission yeast gamma-tubulin is essential for mitosis and is localized at microtubule organizing centers. J Cell Science. 99:693-700.

Howard, J., and A.A. Hyman. 2007. Microtubule polymerases and depolymerases. CurrOpin Cell Biol. 19:31-5.

Howell, B., N. Larsson, M. Gullberg, and L. Cassimeris. 1999. Dissociation of the tubulin-sequestering and microtubule catastrophe-promoting activities of oncoprotein 18/stathmin. Mol Biol Cell. 10:105-18.

Janson, M.E., T.G. Setty, A. Paoletti, and P.T. Tran. 2005. Efficient formation of bipolar microtubule bundles requires microtubule-bound gamma-tubulin complexes. J Cell Biol. 169:297-308.

Joshi, H.C. 1994. Microtubule organizing centers and gamma-tubulin. Curr Opin Cell Biol. 6:54-62.

Joshi, H.C., M.J. Palacios, L. McNamara, and D.W. Cleveland. 1992. Gamma-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation. Nature. 356:80-3.

Julian, M., Y. Tollon, I. Lajoie-Mazenc, A. Moisand, H. Mazarguil, A. Puget, and M. Wright. 1993. Gamma-tubulin participates in the formation of the midbody during cytokinesis in mammalian cells. J Cell Science. 105:145-156.

Karsenti, E., and I. Vernos. 2001. The mitotic spindle: a self-made machine. Science.294:543-7.

Kawaguchi, S., and Y. Zheng. 2004. Characterization of a Drosophila centrosome protein CP309 that shares homology with Kendrin and CG-NAP. Mol Biol Cell. 15:37-45.

Keating, T.J., and G.G. Borisy. 2000. Immunostructural evidence for the template mechanism of microtubule nucleation. Nature. 2:352-357.

Khodjakov, A., and T. Kapoor. 2005. Microtubule flux: what is it good for? Curr Biol.15:R966-8.

Khodjakov, A., and C.L. Rieder. 1999. The sudden recruitment of gamma-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J Cell Biol. 146:585-596.

Kirschner, M.M.T. 1986. Beyond self-assembly :from microtubules to morphogenesis. Cell. 45:329-342.

Knop, M., G. Pereira, S. Geissler, K. Grein, and E. Schiebel. 1997. The spindle pole body component Spc97p interacts with the γ−tubulin of Saccharomyces cerevisiae and functions in microtubule organization and spindle pole body duplication. Embo J. 16:1550-1564.

87

Knop, M., and E. Schiebel. 1997. Spc98p and Spc97p of the yeast gamma-tubulin complex mediate binding to the spindle pole body via their interaction with Spc110p. Embo J. 16:6985-6995.

Kotani, T., and M. Yamashita. 2005. Overexpression of truncated gamma-tubulins disrupts mitotic aster formation in Xenopus oocyte extracts. Biochem J. 389:611-7.

Lajoie-Mazenc, I. 1994. Etude de la tubuline gamma: mise en évidence de deux formes aux propriétés biochimiques différentes chez le myxomycète Physarum polycephalum". PhD, Univer. P. Sabatier, Toulouse, France.

Lajoie-Mazenc, I., C. Détraves, V. Rotaru, M. Garès, Y. Tollon, C. Jean, M. Julian, M. Wright, and B. Raynaud-Messina. 1996. A single gamma-tubulin gene and mRNA, but two gamma-tubulin polypeptides differing by their binding to the spindle pole organizing centres. J Cell Science. 109:2483-2492.

Lajoie-Mazenc, I., Y. Tollon, C. Détraves, M. Julian, A. Moisand, C. Gueth-Hallonet, A. Debec, I. Salles-Passador, A. Puget, H. Mazarguil, B. Raynaud-Messina, and M. Wright. 1994. Recruitment of antigenic gamma-tubulin during mitosis in animal cells : presence of gamma-tubulin in the mitotic spindle. J Cell Science. 107:2825-2837.

Lansbergen, G., and A. Akhmanova. 2006. Microtubule plus end: a hub of cellular activities. Traffic. 7:499-507.

Leguy, R., R. Melki, D. Pantaloni, and M.F. Carlier. 2000. Monomeric gamma-tubulin nucleates microtubules. Journal of Biological Chemistry. 275:21975-21980.

Lesca, C., M. Germanier, B. Raynaud-Messina, C. Pichereaux, C. Etievant, S. Emond, O. Burlet-Schiltz, B. Monsarrat, M. Wright, and M. Defais. 2005. DNA damage induce gamma-tubulin-RAD51 nuclear complexes in mammalian cells. Oncogene.

Li, Q., and H.C. Joshi. 1995. gamma-tubulin is a minus end-specific microtubule binding protein. J Cell Biol. 131:207-14.

Liang, A., F. Ruiz, K. Heckmann, C. Klotz, Y. Tollon, J. Beisson, and M. Wright. 1996. Gamma-tubulin is permanently associated with basal bodies in Ciliates. European J Cell Biology. 70:331-338.

Liu, B., H.C. Joshi, T.J. Wilson, C.D. Silflow, B.A. Palevitz, and D.P. Snustad. 1994. Gamma-tubulin in Arabidopsis: gene sequence, immunoblot, And immunofluorescence studies. Plant Cell. 6:303-314.

Liu, B., J. Marc, H.C. Joshi, and B.A. Palevitz. 1993. A gamma-tubulin-related protein associated with the microtubule arrays of higher plants in a cell cycle-dependent manner. J Cell Science. 104:1217-1228.

Logarinho, E., H. Bousbaa, J.M. Dias, C. Lopes, I. Amorim, A. Antunes-Martins, and C.E. Sunkel. 2004. Different spindle checkpoint proteins monitor microtubule attachment and tension at kinetochores in Drosophila cells. J Cell Sci. 117:1757-71.

Lopez, I., S. Khan, M. Sevik, W.Z. Cande, and P.J. Hussey. 1995. Isolation of a full-length cDNA encoding Zea mays gamma-tubulin. Plant Physiology.107:309-310.

Luders, J., U.K. Patel, and T. Stearns. 2006. GCP-WD is a gamma-tubulin targeting factor required for centrosomal and chromatin-mediated microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 8:137-47.

Luders, J., and T. Stearns. 2007. Microtubule-organizing centres: a re-evaluation. Nat Rev Mol Cell Biol. 8:161-7.

88

Mahoney, N.M., G. Goshima, A.D. Douglass, and R.D. Vale. 2006. Makingmicrotubules and mitotic spindles in cells without functional centrosomes. CurrBiol. 16:564-9.

Maiato, H., C.L. Rieder, and A. Khodjakov. 2004a. Kinetochore-driven formation of kinetochore fibers contributes to spindle assembly during animal mitosis. J Cell Biol. 167:831-40.

Maiato, H., P. Sampaio, C.L. Lemos, J. Findlay, M. Carmena, W.C. Earnshaw, and C.E. Sunkel. 2002. MAST/Orbit has a role in microtubule-kinetochore attachment and is essential for chromosome alignment and maintenance of spindle bipolarity. JCell Biol. 157:749-60.

Maiato, H., P. Sampaio, and C.E. Sunkel. 2004b. Microtubule-associated proteins and their essential roles during mitosis. Int Rev Cytol. 241:53-153.

Marschall, L.G., R.L. Jeng, J. Mulholland, and T. Stearns. 1996. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134:443-54.

Martin, M.A., S.A. Osmani, and B.R. Oakley. 1997. The role of gamma-tubulin in mitotic spindle formation and cell cycle progression in Aspergillus nidulans. J Cell Sci. 110 ( Pt 5):623-33.

Martin, O.C., R.N. Gunawardane, A. Iwamatsu, and Y. Zheng. 1998. Xgrip109: a γ−tubulin-associated protein with an essential role in γ−tubulin ring complex (γ−TuRC) assembly and centrosome function. J Cell Biology. 141:675-687.

Martinez-Campos, M., R. Basto, J. Baker, M. Kernan, and J.W. Raff. 2004. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J Cell Biol. 165:673-83.

Masuda, H., R. Miyamoto, T. Haraguchi, and Y. Hiraoka. 2006a. The carboxy-terminus of Alp4 alters microtubule dynamics to induce oscillatory nuclear movement led by the spindle pole body in Schizosaccharomyces pombe. GenesCells. 11:337-52.

Masuda, H., T. Toda, R. Miyamoto, T. Haraguchi, and Y. Hiraoka. 2006b. Modulationof Alp4 function in Schizosaccharomyces pombe induces novel phenotypes that imply distinct functions for nuclear and cytoplasmic gamma-tubulin complexes. Genes Cells. 11:319-36.

McNally, F.J., and R.D. Vale. 1993. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75:419-29.

McNally, K., A. Audhya, K. Oegema, and F.J. McNally. 2006. Katanin controls mitotic and meiotic spindle length. J Cell Biol. 175:881-91.

Meads, T., and T. Schroer. 1995. Polarity and nucleation of microtubules in polarized epithelial cells. Cell Motility Cytoskeleton. 32:273-288.

Megraw, T.L., K. Li, L.R. Kao, and T.C. Kaufman. 1999. The centrosomin protein is required for centrosome assembly and function during cleavage in Drosophila. Development. 126:2829-39.

Mimori-Kiyosue, Y., I. Grigoriev, G. Lansbergen, H. Sasaki, C. Matsui, F. Severin, N. Galjart, F. Grosveld, I. Vorobjev, S. Tsukita, and A. Akhmanova. 2005. CLASP1 and CLASP2 bind to EB1 and regulate microtubule plus-end dynamics at the cell cortex. J Cell Biol. 168:141-53.

89

Mitchison, T., and M. Kirschner. 1984a. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312:237-42.

Mitchison, T., and M. Kirschner. 1984b. Microtubule assembly nucleated by isolated centrosomes. Nature. 312:232-7.

Mitchison, T.J. 1993. Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science. 261:1044-1047.

Mitchison, T.J., and E.D. Salmon. 2001. Mitosis: a history of division. Nat Cell Biol.3:E17-21.

Moritz, M., and D.A. Agard. 2001. gamma-Tubulin complexes and microtubule nucleation. Curr Opin Struct Biol. 11:174-81.

Moritz, M., M.B. Braunfeld, V. Guénebaut, J. Heuser, and D.A. Agard. 2000. Structure of the γ-tubulin ring complex: a template for microtubule nucleation. Nature. 2:365-370.

Moritz, M., M.B. Braunfeld, J.W. Sedat, B. Alberts, and D.A. Agard. 1995a. Microtubule nucleation by γ-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature.378:638-640.

Moritz, M., M.B. Braunnfeld, J.C. Fung, J.W. Sedat , B.M. Alberts, and D.A. Agard. 1995b. Three-dimensional structural characterization of centrosomes from early Drosophila embryos. J Cell Biology. 130:1149-1159.

Moritz, M., Y.X. Zheng, B.M. Alberts, and K. Oegema. 1998. Recruitment of the gamma-tubulin ring complex to Drosophila salt-stripped centrosome scaffolds. J Cell Biol. 142:775-786.

Moudjou, M., N. Bordes, M. Paintrand, and M. Bornens. 1996. Gamma-tubulin in mammalian cells: the centrosomal and the cytosolic forms. J Cell Science. 109:875-887.

Muller, H., M.L. Fogeron, V. Lehmann, H. Lehrach, and B.M. Lange. 2006. Acentrosome-independent role for gamma-TuRC proteins in the spindle assembly checkpoint. Science. 314:654-7.

Murata, T., and M. Hasebe. 2007. Microtubule-dependent microtubule nucleation in plant cells. J Plant Res. 120:73-8.

Murata, T., S. Sonobe, T.I. Baskin, S. Hyodo, S. Hasezawa, T. Nagata, T. Horio, and M. Hasebe. 2005. Microtubule-dependent microtubule nucleation based on recruitment of gamma-tubulin in higher plants. Nat Cell Biol. 7:961-8.

Muresan, V., H.C. Joshi, and J.C. Besharse. 1993. Gamma-tubulin in differentiated cell types: localization in the vicinity of basal bodies in retinal photoreceptors and ciliated epithelia. J Cell Sci. 104 ( Pt 4):1229-37.

Murphy, S.M., A.M. Preble, U.K. Patel, K.L. O'Connel, D.P. Dias, M. Moritz, D. Agard, J.T. Stults, and T. Stearns. 2001. GCP5 and GCP6: two new members of the human γ−tubulin complex. Molecular Biology Cell. 12:3340-3352.

Murphy, S.M., L. Urbani, and T. Stearns. 1998. The mammalian γ−tubulin complex contains homologues of the yeast spindle pole body components Spc97p and Spc98p. J. Cell Biology. 141:663-674.

Nguyen, T., D.B.N. Vinh, D.K. Crawford, and T.N. Davis. 1998. A genetic analysis of interactions with Spc110p reveals distinct functions of Spc97p and Spc98p, components of the yeast gamma-tubulin complex. Molecular Biology of the Cell.9:2201-2216.

90

Nogales, E., and H.W. Wang. 2006. Structural intermediates in microtubule assembly and disassembly: how and why? Curr Opin Cell Biol. 18:179-84.

Nogales, E., M. Whittaker, R.A. Milligan, and K.H. Downing. 1999. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96:79-88.

Nogales, E., S.G. Wolf, and K.H. Downing. 1998. Structure of the alpha beta tubulin dimer by electron crystallography. Nature. 391:199-203.

Oakley, B.R. 1995. A nice ring to the centrosome. Nature. 378:555-556.Oakley, B.R., C.E. Oakley, Y. Yoon, and M.K. Jung. 1990. Gamma-tubulin is a

component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans. Cell. 61:1289-301.

Oakley, C.E., and B.R. Oakley. 1989. Identification of γ-tubulin, a new member of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillus nidulans. Nature.338:662-664.

O'Connell, C.B., and A.L. Khodjakov. 2007. Cooperative mechanisms of mitotic spindle formation. J Cell Sci. 120:1717-22.

Oegema, K., C. Wiese, O.C. Martin, R.A. Milligan, E. Iwamatsu, T.J. Mitchison, and Y. Zheng. 1999. Characterization of two related Drosophila γ−tubulin complexes that differ in their ability to nucleate microtubules. J Cell Biology. 144:721-733.

Paluh, J.L., E. Nogales, B.R. Oakley, K. McDonald, A.L. Pidoux, and W.Z. Cande. 2000. A mutation in gamma-tubulin alters microtubule dynamics and organization and is synthetically lethal with the kinesin-like protein pkl1p. Mol Biol Cell.11:1225-39.

Patcher, J.S., T.J. Yen, and D.W. Cleveland. 1987. Autoregulation of tubulin expression is achieved through specific degradation of polysomal tubulin mRNAs. Cell.51:283-292.

Pourroy, B., S. Honore, E. Pasquier, V. Bourgarel-Rey, A. Kruczynski, C. Briand, and D. Braguer. 2006. Antiangiogenic concentrations of vinflunine increase the interphase microtubule dynamics and decrease the motility of endothelial cells. Cancer Res. 66:3256-63.

Prigozhina, N.L., C.E. Oakley, A.M. Lewis, T. Nayak, S.A. Osmani, and B.R. Oakley. 2004. Gamma-tubulin plays an essential role in the coordination of mitotic events. Mol Biol Cell. 15:1374-86.

Raff, J.W. 2004. Centrosomes in a Developing Organism: Lessons from Drosophila.Centrosome in Development and Disease, Editor Nigg, E.A.:251-278.

Raynaud-Messina, B., A. Debec, Y. Tollon, M. Garès, and M. Wright. 2001. Differential properties of the two Drosophila γ-tubulin isotypes. European Journal Cell Biology. 80:643-649.

Raynaud-Messina, B., L. Mazzolini, A. Moisand, A.M. Cirinesi, and M. Wright. 2004. Elongation of centriolar microtubule triplets contributes to the formation of the mitotic spindle in gamma-tubulin-depleted cells. J Cell Sci. 117:5497-507.

Raynaud-Messina, B., and A. Merdes. 2007. Gamma-tubulin complexes and microtubule organization. Curr Opin Cell Biol. 19:24-30.

Reilein, A., S. Yamada, and W.J. Nelson. 2005. Self-organization of an acentrosomal microtubule network at the basal cortex of polarized epithelial cells. J Cell Biol.171:845-55.

91

Ridley, A.J., M.A. Schwartz, K. Burridge, R.A. Firtel, M.H. Ginsberg, G. Borisy, J.T. Parsons, and A.R. Horwitz. 2003. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302:1704-9.

Rios, R.M., A. Sanchis, A.M. Tassin, C. Fedriani, and M. Bornens. 2004. GMAP-210recruits gamma-tubulin complexes to cis-Golgi membranes and is required for Golgi ribbon formation. Cell. 118:323-35.

Riparbelli, M.G., G. Callaini, D.M. Glover, and M.D.C. Avides. 2002. A requirement for the abnormal spindle protein to organise microtubules of the central spindle for cytokinesis in Drosophila. J Cell Sciences. 115:913-922.

Rogers, G.C., S.L. Rogers, and D.J. Sharp. 2005. Spindle microtubules in flux. J Cell Sci. 118:1105-16.

Rogers, S.L., G.C. Rogers, D.J. Sharp, and R.D. Vale. 2002. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. JCell Biol. 158:873-84.

Rogers, S.L., U. Wiedemann, U. Hacker, C. Turck, and R.D. Vale. 2004. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. CurrBiol. 14:1827-33.

Rogers, S.L., U. Wiedemann, N. Stuurman, and R.D. Vale. 2003. Molecularrequirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. J Cell Biol.162:1079-88.

Roll-Mecak, A., and R.D. Vale. 2006. Making more microtubules by severing: a common theme of noncentrosomal microtubule arrays? J Cell Biol. 175:849-51.

Ruiz, F., J. Beisson, J. Rossier, and P. Dupuis-Williams. 1999. Basal body duplication in Paramecium requires γ−tubulin. Current Biology. 9:43-46.

Rusan, N.M., C.J. Fagerstrom, A.M. Yvon, and P. Wadsworth. 2001. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Mol Biol Cell. 12:971-80.

Samejima, I., P.C. Lourenco, H.A. Snaith, and K.E. Sawin. 2005. Fission yeast mto2p regulates microtubule nucleation by the centrosomin-related protein mto1p. Mol Biol Cell. 16:3040-51.

Sammak, P.J., and G.G. Borisy. 1988. Direct observation of microtubule dynamics in living cells. Nature. 332:724-6.

Sampaio, P., E. Rebollo, H. Varmark, C.E. Sunkel, and C. Gonzalez. 2001. Organized microtubule arrays in gamma-tubulin-depleted Drosophila spermatocytes. Curr Biol.11:1788-93.

Sawin, K.E., P.C. Lourenco, and H.A. Snaith. 2004. Microtubule nucleation at non-spindle pole body microtubule-organizing centers requires fission yeast centrosomin-related protein mod20p. Curr Biol. 14:763-75.

Sawin, K.E., and P.T. Tran. 2006. Cytoplasmic microtubule organization in fission yeast. Yeast. 23:1001-14.

Schmit, A.C. 2002. Acentrosomal microtubule nucleation in higher plants. Int Rev Cytol.220:257-89.

Schnorrer, F., S. Luschnig, I. Koch, and C. Nüsslein-Volhard. 2002. γ−Tubulin 37C and γ−tubulin ring complex protein 75 are essential for bicoid RNA localization during Drosophila oogenesis. Developmental Cell. 3:685-695.

92

Scott, V., T. Sherwin, and K. Gull. 1997. Gamma-tubulin in trypanosomes: molecular characterisation and localisation to multiple and diverse microtubule organising centres. J Cell Science. 110:157-168.

Sharp, D.J., G.C. Rogers, and J.M. Scholey. 2000. Microtubule motors in mitosis. Nature. 407:41-7.

Shu, H.B., and H.C. Joshi. 1995. Gamma-tubulin can both nucleate microtubule assembly and self-assemble into novel tubular structures in mammalian cells. J Cell Biol.130:1137-47.

Shu, H.B., Z. Li, M.J. Palacios, Q. Li, and H.C. Joshi. 1995. A transient association of gamma-tubulin at the midbody is required for the completion of cytokinesis during the mammalian cell division. J Cell Sci. 108 ( Pt 9):2955-62.

Slep, K.C., S.L. Rogers, S.L. Elliott, H. Ohkura, P.A. Kolodziej, and R.D. Vale. 2005. Structural determinants for EB1-mediated recruitment of APC and spectraplakins to the microtubule plus end. J Cell Biol. 168:587-98.

Smith, T.F., C. Gaitatzes, K. Saxena, and E.j. Neer. 1999. The WD reapeat. A common architecture for diverse function. TIBs. 24:181-185.

Sobel, S.G., and M. Snyder. 1995. A highly divergent γ-tubulin gene is essential for cell growth and proper microtubule organization in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biology. 131:1775-1788.

Sousa, A., R. Reis, P. Sampaio, and C. Sunkel. 2007. The Drosophila CLASP homologue, Mast/Orbit regulates the dynamic behaviour of interphase microtubules by promoting the pause state. Cell Motil. Cytos. in press.

Spang, A., S. Geissler, K. Grein, and E. Schiebel. 1996. Gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol.134:429-41.

Starita, L.M., Y. Machida, S. Sankaran, J.E. Elias, K. Griffin, B.P. Schlegel, S.P. Gygi, and J.D. Parvin. 2004. BRCA1-dependent ubiquitination of gamma-tubulin regulates centrosome number. Mol Cell Biol. 24:8457-66.

Stearns, T., L. Evans, and M. Kirschner. 1991. Gamma-tubulin is a highly conserved component of the centrosome. Cell. 65:825-836.

Stearns, T., and M. Kirschner. 1994. In vitro reconstitution of centrosome assembly and function : the central role of γ-tubulin. Cell. 76:623-637.

Strome, S., J. Powers, M. Dunn, K. Reese, C.J. Malone, J. White, G. Seydoux, and W. Saxton. 2001. Spindle dynamics and the role of gamma-tubulin in early Caenorhabditis elegans embryos. Mol Biol Cell. 12:1751-64.

Sunkel, C.E., R. Gomes, P. Sampaio, J. Perdigao, and C. Gonzalez. 1995. Gamma-tubulin is required for the structure and function of the microtubule organizing centre in Drosophila neuroblasts. Embo J. 14:28-36.

Takahashi, M., A. Yamagiwa, T. Nishimura, H. Mukai, and Y. Ono. 2002. Centrosomal proteins CG-NAP and kendrin provide microtubule nucleation sites by anchoring gamma-tubulin ring complex. Mol Biol Cell. 13:3235-45.

Tassin, A.M., M. B., and B. M. 1985. Fate of microtubule-organizing centers during myogenesis in vitro. J. Cell Biol. 100:35-46.

93

Tassin, A.M., C. Celati, M. Moudjou, and M. Bornens. 1998. Characterization of the human homolog of the yeast Spc98p and its association with γ−tubulin. J. Cell Biology. 141:689-701.

Tavosanis, G., and C. Gonzalez. 2003. Gamma-Tubulin function during female germ-cell development and oogenesis in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:10263-8.

Tavosanis, G., S. Llamazares, G. Goulielmos, and C. Gonzalez. 1997. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. Embo J.16:1809-19.

Taylor, S.S., K.G. Hardwick, K.E. Sawin, S. Biggins, S. Piatti, A. Khodjakov, C.L. Rieder, E.D. Salmon, and A. Musacchio. 2007. Comment on "A centrosome-independent role for gamma-TuRC proteins in the spindle assembly checkpoint". Science. 316:982; author reply 982.

Terada, Y., Y. Uetake, and R. Kuriyama. 2003. Interaction of Aurora-A and centrosomin at the microtubule-nucleating site in Drosophila and mammalian cells. J Cell Biol.162:757-63.

Toya, M., M. Sato, U. Haselmann, K. Asakawa, D. Brunner, C. Antony, and T. Toda. 2007. Gamma-tubulin complex-mediated anchoring of spindle microtubules to spindle-pole bodies requires Msd1 in fission yeast. Nat Cell Biol. 9:646-53.

Tran, P.T., L. Marsh, V. Doye, S. Inoue, and F. Chang. 2001. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153:397-411.

Tran, P.T., R.A. Walker, and E.D. Salmon. 1997. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J Cell Biol. 138:105-17.

Tsvetkov, A.S., A. Samsonov, A. Akhmanova, N. Galjart, and S.V. Popov. 2007. Microtubule-binding proteins CLASP1 and CLASP2 interact with actin filaments. Cell Motil Cytoskeleton.

Vardy, L., A. Fujita, and T. Toda. 2002. The γ-tubulin complex protein Alp4 provides a link between the metaphase checkpoint and cytokinesis in fission yeast. Genes Cells.7:365-373.

Vardy, L., and T. Toda. 2000. The fission yeast γ-tubulin complex is required in G1 phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBO J. 19:6098-6111.

Venkatram, S., J.J. Tasto, A. Feoktistova, J.L. Jennings, A.J. Link, and K.L. Gould. 2004. Identification and characterization of two novel proteins affecting fission yeast gamma-tubulin complex function. Mol Biol Cell. 15:2287-301.

Vérollet, C., N. Colombie, T. Daubon, H.M. Bourbon, M. Wright, and B. Raynaud-Messina. 2006. Drosophila melanogaster gamma-TuRC is dispensable for targeting gamma-tubulin to the centrosome and microtubule nucleation. J Cell Biol. 172:517-28.

Vinh, D.B.N., J.W. Kern, W.O. Hancock, J. Howard, and T.N. Davis. 2002. Reconstitution and characterization of budding yeast γ−tubulin complex. Molecular Biology Cell. 13:1144-1157.

Vogel, J., B. Drapkin, J. Oomen, D. Beach, K. Bloom, and M. Snyder. 2001. Phosphorylation of gamma-tubulin regulates microtubule organization in budding yeast. Dev Cell. 1:621-31.

Vogel, J., and M. Snyder. 2000. The carboxy terminus of Tub4p is required for gamma-tubulin function in budding yeast. J Cell Sci. 113 Pt 21:3871-82.

94

Vogt, N., I. Koch, H. Schwarz, F. Schnorrer, and C. Nusslein-Volhard. 2006. The gammaTuRC components Grip75 and Grip128 have an essential microtubule-anchoring function in the Drosophila germline. Development. 133:3963-72.

Wadsworth, P., and A. Khodjakov. 2004. E pluribus unum: towards a universal mechanism for spindle assembly. Trends Cell Biol. 14:413-9.

Wakefield, J.G., S. Bonaccorsi, and M. Gatti. 2001. The drosophila protein asp is involved in microtubule organization during spindle formation and cytokinesis. JCell Biol. 153:637-48.

Walker, R.A., E.T. O'Brien, N.K. Pryer, M.F. Soboeiro, W.A. Voter, H.P. Erickson, and E.D. Salmon. 1988. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol.107:1437-48.

Weaver, B.A., and D.W. Cleveland. 2007. Comment on "A centrosome-independent role for gamma-TuRC proteins in the spindle assembly checkpoint". Science. 316:982; author reply 982.

Wehrle-Haller, B., and B.A. Imhof. 2003. Actin, microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int J Biochem Cell Biol. 35:39-50.

Whitfield, W.G.F., S.E. Millar, H. Saumweber, M. Frasch, and D.M. Glover. 1988. Cloning of a gene encoding an antigen associated with centrosome in Drosophila. J. Cell Science. 89:467-480.

Wiese, C., and Y. Zheng. 1999. Gamma-tubulin complexes and their interaction with microtubule- organizing centers. Curr Opin Struct Biol. 9:250-9.

Wiese, C., and Y. Zheng. 2000. A new function for the γ-tubulin ring complex as a microtubule minus-end cap. Nature. 2:358-364.

Wiese, C., and Y. Zheng. 2006. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. JCell Sci. 119:4143-53.

Wilde, A., and Y. Zheng. 1999. Stimulation of microtubule aster formation and spindle assembly by the small GTPase Ran. Science. 284:1359-62.

Wilson, E.B. 1925. The cell in development and heredity. 3nd Edition. Mac Millan, New York.

Wilson, P.G., Y. Zheng, C.E. Oakley, B.R. Oakley, G.G. Borisy, and M.T. Fuller. 1997. Differential expression of two gamma-tubulin isoforms during gametogenesis and development in Drosophila. Dev Biol. 184:207-21.

Wise, D.O., and B.R. Oakley. 1997. Expression patterns of two gamma-tubulin genes inHomo sapiens. Molecular Biology of the Cell (37th American Society of Cell Biology, Washington DC, december 13-17, 1997). 8:260.

Wittmann, T., A. Hyman, and A. Desai. 2001. The spindle: a dynamic assembly pf microtubules and motors. Nature Cell Biology. 3:E28-34.

Yuba-Kubo, A., A. Kubo, M. Hata, and S. Tsukita. 2005. Gene knockout analysis of two gamma-tubulin isoforms in mice. Dev Biol. 282:361-73.

Zhang, L., T.J. Keating, A. Wilde, G.G. Borisy, and Y. Zheng. 2000. The role of Xgrip210 in γ−tubulin ring complex assembly and centrosome recruitment. J Cell Biology. 151:1525-1535.

Zheng, Y., M.L. Wong, B. Alberts, and T. Mitchison. 1995. Nucleation of microtubule assembly by a γ-tubulin-containing ring complex. Nature. 378:578-583.

95

Zheng, Y.X., M.K. Jung, and B.R. Oakley. 1991. Gamma-tubulin is present in Drosophila melanogaster and Homo sapiens and is associated with the centrosome. Cell. 65:817-823.

Zimmerman, S., and F. Chang. 2005. Effects of {gamma}-tubulin complex proteins on microtubule nucleation and catastrophe in fission yeast. Mol Biol Cell. 16:2719-33.

Zimmerman, W.C., J. Sillibourne, J. Rosa, and S.J. Doxsey. 2004. Mitosis-specific Anchoring of γ−Tubulin Complexes by Pericentrin Controls Spindle Organization and Mitotic Entry. Mol Biol Cell. 15:3642-3657.

ANNEXE 1 :Table des figures

Les figures sont en vis à vis des pages indiquées

Figure 1 : Structure d’un microtubule et de ses sous-unités………………..………….3

Figure 2 : La mitose………………………………………………………………...….4

Figure 3 : Mécanismes de formation d’un fuseau bipolaire………………………..….5

Figure 4 : Le centrosome……………………………………………………...……….6

Figure 5 : Le SPB et l’organisation des microtubules non-centrosomale ………...….7

Figure 6 : Localisations de la tubuline γ dans les cellules S2…………………….….10

Figure 7 : Organisation des fuseaux en absence de tubuline γ (cellules S2)……...….15

Figure 8 : Elongation des microtubules centriolaires en absence de tubuline γ ….….16

Figure 9 : Caractérisation des pôles en absence de tubuline γ (cellules S2)………….18

Figure 10 : γ-TuSCs et γ-TuRCs chez la drosophile…………………………………22

Figure 11 : Protéines associées à la tubuline γ dans divers organismes…………..….23

Figure 12 : Alignement des séquences (motifs grip)…………………………..…….24

Figure 13 : Les motifs « WD »……………………………………………………….25

Figure 14 : Structure et modèle du γ-TuRC………………………………………….26

Figure 15 : Activité de nucléation des γ-TuSCs et des γ-TuRCs…………………….27

Figure 16 : Les deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC…...….28

Figure 17 : Xgrip210 (Dgrip163) est nécessaire à l’assemblage du γ-TuRC………...30

Figure 18 : Organisation et re-croissance des microtubules en absence de tubuline γ.46

Figure 19 : L’organisation et la re-croissance des microtubules dépend du γ-TuSC...47

Figure 20 : Régulation des protéines du γ-TuSC……………………………………..52

Figure 21 : Régulation des protéines du γ-TuRC …………………………………....53

Figure 22 : Mécanismes de recrutement de la tubuline γ en mitose………………….67

Figure 23 : Protéines d’ancrage ou de transport de la tubuline γ sur les microtubules72

Figure 24 : Dynamique des microtubules en mitose……………………………...….75

AN

NEXE 2 : Localsiations de la tubuline γ et M

TOC

s

Interphase/M

itoseN

ucléation des M

Ts Présence de tubuline γ

Corrélation

Protéines d'ancrage/m

écanismes

Références principales

cellules somatiques

PCM

I+MO

UI

OU

IO

UI

H : N

edd1, C

GN

AP

/Kendrine/péricentrine

Droso : C

P309, D

-PLP

, Cnn

Haren et al., 2006; Luders et al., 2006; Takahashi et al.,

2002; Zimm

erman et al., 2004; K

awaguchi et al., 2004;

Martinez-C

ampos et al., 2004; Terada et al., 2003

Centrioles

MO

UI

OU

IO

UI

Ninéine

Delgehyre et al., 2005

MTs du fuseau m

étaphasiqueM

OU

IO

UI

NO

Nnucléation + capture des M

Ts H

: Nedd1 P

Lajoie-Mazenc et al., 1994; M

ahoney et al., 2006; Luders et al., 2006

MTs du fuseau central (cytokinèse)

M_

OU

I_

_P

iehl et al., 2004

Chrom

osomes

MO

UI

--O

UI

Gradient de R

anGTP+capture

par dynéineW

ilde et Zheng., 1999; Karsenti et V

ernos., 2001

Appareil de golgi

IN

ON

OU

I_

GM

AP

-210R

ios et al., 2004

Foci nucléairesI

NO

NO

UI

__

Lesca et al., 2004

plantesM

Ts du fuseau mitotique

MO

UI

Liu et al., 1993; Hoffm

an et al.,1994; Mahoney et al., 2006

Phragm

oplaste (fuseau central cytokinèse)

M_

OU

I_

_H

offman et al.,1994

MTs de la zone apicale

IO

UI

OU

IO

UI

capture des MTs

Murata et al., 2005

S, cerevisiaeS

PB

I+MO

UI

OU

IO

UI

Spc110

Nguyen ert al,, 1998

S, pombe

SP

BI+M

OU

IO

UI

OU

Ipcp1/m

to1V

enkatram et al., 2004; Flory et al., 2002

eMTO

Cs

MO

UI

OU

IO

UI

_S

awin, 2006

iMTO

Cs surface nucléaire

IO

UI

OU

IO

UI

mto1/m

to2S

awin et al., 2004; Janson et al., 2005; S

amejim

a et al., 2005

iMTO

Cs cytoplasm

iquesI

OU

IO

UI

OU

Im

to1/mto2 + capture des M

TsS

awin et al., 2004; Janson et al., 2005; S

amejim

a et al., 2005

cellules différenciéesE

nvelope nucléaire (musculaires)

IO

UI

OU

ITassin et al., 1985; B

ugnard et al., 2005M

Ts de la zone apicale (épithéliales)

IO

UI

OU

IO

UI

Ninéine+capture des M

TsM

ogensen et al., 2000; Reinlein et al., 2005

Corps basaux (cilliées)

IO

UI?

Ninéine

Hagiw

ara et al., 2000C

ellules neuronalesI

NO

NN

ON

capture des MTs

Baas et al., 1992; Y

u et al., 1993

Gruss et al., 2002; G

russ et Vernos., 2004

___

OU

I_ _

OU

I?

pro

téine essen

tielleN

ucléatio

n d

es M

Ts in

vitro

N

ucléatio

n d

es M

Ts in

viv

o

Nécessaire à

l'assemb

lage d

es co

mp

lexes O

rgan

isation

des fu

seaux

Matu

ration

des

MT

OC

sC

heckp

oin

tD

ynam

iqu

e des

MT

s

dro

sop

hile

Tubulin

e γ

OU

I Sunke

l et a

l,, 1995

Sunke

l et a

l,, 1995

Rayn

aud e

t al,, 2

004; S

unke

l et a

l,, 1995

cytokin

èse : Ju

lian e

t al,, 1

993;

Sam

paio

et a

l,, 2001

Rayn

aud e

t al,, 2

004

Mulle

r et a

l,, 2006

Dgrip

84

OU

I Colo

mbié

et a

l,, 2006

Colo

mbié

et a

l,, 2006

Colo

mbié

et a

l,, 2006

Colo

mbié

et a

l,, 2006

Colo

mbie

et a

l,, 2006

Colo

mbié

et a

l,, 2006

Dgrip

91

OU

I Barb

osa

et a

l,, 2000

Barb

osa

et a

l,, 2000

Barb

osa

et a

l,, 2000

cytokin

èse : Barb

osa

et a

l,, 2003

Barb

osa

et a

l,, 2000

Mulle

r et a

l,, 2006

Dgrip

75

NO

N V

éro

llet e

t al,, 2

006;

Vogt e

t al,, 2

006

OU

I Véro

llet e

t al,, 2

006

Véro

llet e

t al,, 2

006

Véro

llet e

t al,, 2

006

Mulle

r et a

l,, 2006

Sch

norre

r et a

l,, 2002;

Dgrip

128

NO

N V

éro

llet e

t al,, 2

006

Vogt e

t al,, 2

006

OU

I Véro

llet e

t al,, 2

006

Mulle

r et a

l,, 2006

Dgrip

163

NO

N V

éro

llet e

t al,, 2

006

Vogt e

t al,, 2

006

OU

I Véro

llet e

t al,, 2

006

Mulle

r et a

l,, 2006

Dgp71W

DN

ON

Véro

llet e

t al,, 2

006

NO

N V

éro

llet e

t al,, 2

006

Mulle

r et a

l,, 2006

mam

mifères

Tubulin

e γ

OU

I Yuba-K

ubo e

t al,,

2005

Leguy e

t al,, 2

000

Li e

t Josh

i,, 1995

GC

P3

Tassin

et a

l,, 1998

OU

I Tassin

et a

l,, 1998

GC

P4

Fava

et a

l,, 1999

Nedd1

NO

N H

are

n e

t al,, 2

006;

Luders e

t al,, 2

006

Hare

n e

t al,, 2

006; L

uders e

t al,,

2006

Hare

n e

t al,, 2

006;

Luders e

t al,, 2

006

S, cerevisiae

Tubulin

e γ

OU

I Sobel e

t al,, 1

995

Marsh

all e

t al,, 1

996; S

pang

et a

l,, 1996

Marsh

all e

t al,, 1

996;

Spang e

t al,, 1

996

Sobel e

t al,, 1

995 ; M

arsh

all e

t al,,

1996; S

pang e

t al,, 1

996

Marsh

all e

t al,, 1

996;

Spang e

t al,, 1

996

Sobel e

t al,, 1

995 ;

Marsh

all e

t al,, 1

996;

Spang e

t al,, 1

996

Cusch

ieri e

t al,, 2

006

S, p

om

be

Tubulin

e γ

O

UI

Horio

et a

l,, 1991

Horio

et a

l,, 1991

Horio

et a

l,, 1991

Hendrickso

n e

t al

2001

Alp

4O

UI V

ard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

NO

N V

ard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,,

2002

Vard

y et T

oda,, 2

000;

Zim

merm

an e

t al,, 2

005;

Masu

da e

t al,, 2

006

Alp

6O

UI V

ard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,, 2

000

Vard

y et T

oda,,

2002

Vard

y et T

oda,, 2

000

Gfh

1p

NO

N V

enka

tram

et a

l,, 2004

NO

N V

enka

tram

et a

l,, 2004

Venka

tram

et a

l,, 2004

Venka

tram

et

al,, 2

004

Venka

tram

et a

l,, 2004

mod21

NO

N A

nders e

t al,, 2

006

NO

N A

nders e

t al,, 2

006

Anders e

t al,, 2

006

NO

N A

nders e

t al,,

2006

Alp

16

NO

N F

ujita

et a

l,, 2002

NO

N F

ujita

et a

l,, 2002

Fujita

et a

l,, 2002

NO

N F

ujita

et a

l,, 2002

Fujita

et a

l,, 2002

NO

N

NO

N

NO

N

NO

N

plan

tesT

ubuline γE

rhardt et al,, 2002A

tSpc98p

Erhardt et al,, 2002

C, e

leg

an

s

Tubulin

e γ

Stro

me e

t al,, 2

001;

Hannak e

t al,, 2

002

Stro

me e

t al,, 2

001

Hannak e

t al,, 2

002;

Dam

merm

an e

t al,,

2004

Ce

-grip

1H

annak e

t al,, 2

002

Tubulin

e γ

OU

I Palu

h e

t al,, 2

000;

Martin

et a

l,, 1997

Oakle

y et a

l,, 1990;

Martin

et a

l,, 1997

Palu

h e

t al,, 2

000; M

artin

et a

l,, 1997

Prig

ozin

a e

t al,,

2004

Palu

h e

t al,, 2

000

''''''

''''''

AN

NEXE 3 : Fonctions des protéines des com

plexes de tubuline γ (littérature)

OU

I

OU

I

OU

I

A, n

idu

lan

s