3

2 Tinjauan Pustaka

2.1 Pati Kentang

Secara umum pati tersusun dari dua tipe polimer D-glukosa, yaitu amilosa dan amilopektin.

Pada amilosa ikatan glikosidik yang terbentuk berupa ikatan -1,4-glikosidik, sedangkan

terdapat dua ikatan glikosidik (-1,4-glikosidik dan -1,6-glikosidik). Amilopektin penyusun

pati relatif bervariasi. Hal ini disebabkan oleh jumlah rantai cabang penyusunnya. Ada tiga

jenis rantai cabang, yang sering dikenal dengan istilah rantai A, B dan C. Ketiga rantai

tersebut dibedakan berdasarkan posisi percabangan. Rantai cabang paling luar dari struktur

amilopektin disebut rantai A. Rantai B merupakan rantai cabang dari amilopektin yang

masih terdapat percabangan, sedangkan rantai C merupakan rantai pokok dari semua

percabangan. Pada rantai C terdapat gugus gula pereduksi. Perbandingan jumlah rantai A dan

B menunjukkan derajat percabangan [Buleon et al., 1998].

Pada pati kentang Solanum tuberosum L mengandung gugus fosfat melalui ikatan kovalen

dengan amilopektin. Interaksi kovalen dari gugus fosfat yang ada dalam pati kentang sangat

bervariasi. Hampir 60-70% gugus fosfat membentuk ikatan kovalen dengan atom C6 dari

residu glukosa. Interaksi kovalen tersebut juga dapat terjadi pada atom C3 dari residu

glukosa sebanyak 30-40%. Selain itu, dimungkinkan pula terdapat interaksi kovalen gugus

fosfat dengan atom C2 sebanyak 1% [Wischmann et al., 1999]. Butir pati kentang terdiri dari

18-21% amilosa dengan bentuk oval. Komponen amilosa dan amilopektin pada pati kentang

membentuk pola B-pattern [Buleon et al., 1998].

4

Gambar 2. 1 Pola difraksi sinar X butir pati kompleks amilosa

Berdasarkan Gambar 2. 1, dapat dilihat bahwa terdapat pola yang berbeda untuk masing-

masing tipe. Garis-garis hitam yang melintang menujukkan komponen amilosa, sedangkan

daerah putih di dalam lingkaran menunjukkan komponen amilopektin [Robyt, 1998].

2.2 Metabolisme Pati pada Tumbuhan

Pati merupakan salah satu cadangan makanan pada tumbuhan yang digunakan untuk

respirasi di waktu gelap. Pati dihasilkan melalui proses fotosintesis, yaitu proses pengubahan

energi sinar matahari menjadi energi kimia. Proses ini terjadi pada bagian tumbuhan yang

mengandung klorofil. Bagian tumbuhan ini sering dikenal dengan istilah plastida. Pati yang

sering ditemukan pada amiloplas berbentuk butir pati yang tidak larut dalam air. Amiloplas

sering terdapat pada umbi, biji dan akar tanaman sebagai tempat penyimpanan cadangan

makanan yang lain. Ukuran dan bentuk butir pati pada masing-masing tanaman memiliki

sifat dan karakter yang khas.

Dalam jalur metabolisme, biosintesis pati terjadi melalui serangkaian reaksi enzimatis. Pada

Gambar 2.2, glukosa yang diperoleh dari respirasi mengalami fosforilasi menjadi Glukosa-6-

fosfat, G6P dengan bantuan heksokinase. Fosforilasi tersebut melibatkan pengubahan

molekul ATP menjadi ADP. Selanjutnya G6P diubah menjadi Glukosa-1-fosfat, G1P dengan

bantuan fosfoglukomutase. G1P mengalami reaksi pirofosforilasi membentuk ADP-Glukosa,

ADP-G dengan bantuan ADP-glukosa fosforilase. Pada reaksi pembentukan ADP-G

melibatkan molekul ATP. Reaksi dilanjutkan dengan pembentukan ikatan -1,4-glukan

5

dengan bantuan pati sintase. Biosintesis pati diakhiri dengan penggabungan glukan melalui

pembentukan percabangan dengan bantuan enzim pencabangan [Buleon et al., 1998].

Gambar 2. 2 Skema biosintesis pati

G6P (Glukosa 6 fosfat), G1P (Glukosa 1 fosfat), ADP-G (Adenosin difosfat-glukosa),

ATP (Adenosin trifosfat), ADP (Adenosin difosfat), Pi (fosfat anorganik).

(1) fosfoglukomutase; (2) ADPglukosa pirofosforilase; (3) pati sintase; (4) enzim

pencabangan; (5) pati fosforilase; (6) amilase; (7) heksokinase

Degradasi pati umumnya melibatkan molekul air, sehingga sering dikenal dengan hidrolisis

pati. Pada proses hidrolisis pati, reaksi terbagi menjadi dua tahap, yaitu reaksi enzimatis dan

non-enzimatis. Tahap awal yang dilakukan adalah gelatinisasi butir pati yang merupakan

reaksi non-enzimatis. Proses ini dilakukan dengan cara pemanasan suspensi pati pada 105

oC. Gelatinisasi bertujuan untuk membuka butir pati, sehingga diperoleh molekul amilosa

dan amilopektin yang terpisah secara acak dalam larutan. Tahap berikutnya merupakan

tahap reaksi enzimatis. Reaksi enzimatis ini terdiri dari dua proses, yaitu likuefaksi dan

sakarifikasi.

Likuefaksi merupakan proses degradasi amilosa dan amilopektin menjadi molekul yang

lebih sederhana dengan bantuan -amilase. Likuefaksi diikuti dengan sakarifikasi, yaitu

degradasi oligosakarida menjadi glukosa dengan bantuan glukoamilase. Sakarifikasi dapat

dilakukan pada suhu 50-60 oC. Secara keseluruhan, degradasi pati memerlukan energi yang

tinggi [Goyal et al., 2005].

5

G6P G

ATP ADP

ATP

ATP

PPi

ADP-G

-1,4 Gn+1

-1,4 Gn

Pati

+ Pi

+ H2O 1

2

3

7

4

6

6

2.3 -Amilase

-Amilase termasuk dalam kategori enzim hidrolase. Enzim ini membantu dalam proses

hidrolisis. -Amilase merupakan enzim yang dapat mendegradasi pati, yaitu dengan

memutus ikatan -1,4-glikosidik yang terdapat pada pati. Secara garis besar keluarga amilase

terbagi menjadi dua kelas, yaitu: endoamilase dan eksoamilase. Endoamilase memutus

ikatan -1,4-glikosidik bagian dalam amilosa dan amilopektin dengan produk oligosakarida

berbagai ukuran dengan konfigurasi , sedangkan eksoamilase memutus ikatan -1,4-

glikosidik dari ujung pereduksi pati dengan produk hanya glukosa atau maltosa. -Amilase

sendiri termasuk dalam kelas endoamilase.

Gambar 2. 3 Stereokimia dari struktur -amilase

Berdasarkan Gambar 2. 3, struktur -amilase tersusun dari tiga domain, yaitu domain A,

domain B dan domain C. Domain A merupakan domain katalitik yang mempunyai struktur

( /)8-barel, domain B berperan dalam folding protein (terdapat tiga ion Ca2+

), sedangkan

domain C tersusun dari 5-strand antiparalel -sheet yang fungsinya belum diketahui secara

pasti.

Pada beberapa mikroorganisme ditemukan enzim amilase yang dapat memutus ikatan -1,6-

glikosidik pada amilopektin. Enzim tersebut antara lain pululanase dan isoamilase.

Pululanase merupakan enzim amilase yang diteliti pada Aspergillus aerogenes. Enzim

tersebut dapat memutus ikatan -1,6-glikosidik pada pululan (poli--1,6-glikosidik). Selain

pululanase, enzim lain yang dapat memutus ikatan -1,6-glikosidik adalah isoamilase.

Isoamilase diteliti pada Pseudomonas amyloderamosa dan sering disebut sebagai

debranching enzyme, enzim yang dapat memutus -1,6-glikosidik amilopektin dengan

produk polisakarida rantai lurus.

7

2.4 Mekanisme Katalitik

Reaksi katalitik -amilase terjadi melalui mekanisme alpha retaining double displacement.

Pada mekanisme ini melibatkan beberapa residu katalitik pada sisi aktif, yaitu residu asam

glutamat (Glu) yang berperan sebagai katalis asam/basa serta residu asam aspartat (Asp)

yang berperan sebagai nukleofil.

Gambar 2. 4 Mekanisme katalitik -amilase

Substrat terikat pada daerah yang disebut subsite. Reaksi katalitik terjadi pada substrat yang

berada pada subsite 1 dan -1. Mekanisme alpha retaining double displacement terjadi secara

bertahap. Tahap pertama dimulai dengan pengikatan substrat pada sisi aktif. Pada tahap ini

terjadi penyerahan proton dari residu asam glutamat (Glu) kepada atom oksigen dari substrat

yang berikatan glikosidik pada subsite -1 dan 1. Residu asam aspartat (Asp) bertindak

sebagai nukleofil yang menyerang atom C1 dari substrat pada subsite -1 dan membentuk ion

oksokarbonium.

Reaksi tersebut diikuti dengan pembentukan intermediet kovalen. Glukosa yang terprotonasi

terlepas dari sisi aktif dan menyerang ikatan kovalen yang terbentuk antara glukosa pada

subsite -1. Residu asam glutamat yang bertindak sebagai katalis basa dapat menarik proton

dari molekul air. Oksigen dari air akan menggantikan ikatan oksokarbonium antarmolekul

glukosa pada subsite -1 dan residu aspartat membentuk ikatan glikosida baru antara subsite -

1 dan 1.

8

Pada TAKA-amilase A, residu Glu230

tidak terionisasi membentuk ikatan hidrogen dengan

proton residu Asp297 sebelum mengikat substrat. Residu Asp206

memicu pembentukan

intermediet ion karbonium. Ionisasi residu Glu230

menghasilkan gaya tolakan elektrostatik

antara residu Glu230

dengan Asp297

. Selanjutnya molekul air melakukan penyerangan

nukelofilik. Hal ini mengakibatkan melemahnya gaya tolakan antara dua residu (terbentuk

ikatan hidrogen antara dua sisi katalitik). Glu230

mengabstraksi ion hidroksi yang teraktivasi.

Ion hidroksi ini menyerang ion intermediet untuk mengakhiri reaksi.

2.5 Bakteri Laut Penghasil -Amilase

Laut merupakan suatu ekosistem yang terdiri dari makroorganisme dan mikroorganisme.

Baik makroorganisme maupun mikroorganisme laut mampu menghasilkan enzim-enzim

tertentu yang digunakan untuk proses metabolisme. Bakteri laut yang bersifat aerob mampu

menghasilkan amilase, deoksiribonuklease, lipase, dan protease. Ada juga bakteri laut yang

diketahui mampu menghasilkan enzim alginat liase, glukanase, kitinase, glutaminase dan

DNA polimerase [Chandrasekaran, 1997].

Banyak penemuan bakteri laut yang menunjukkan adanya kemampuan mendegradasi pati.

Ada tujuh isolat yang diperoleh dari usus abalon, Haliotis discus hannai. Dari ketujuh isolat

tersebut, terdapat tiga isolat yang menunjukkan adanya aktivitas -amilase. Ketiga isolat

tersebut diidentifikasi sebagai Vibrio alginolyticus V447, Vibrio harveyi NCIMB 1280T, dan

Vibrio splendidus biovar I HUPF 91 17T [Sawabe et al., 1998]. Selain itu, isolat bakteri laut

yang mampu mendegradasi pati adalah Shewanella sp. Dari dua belas isolat dari genus

Shewanella diperoleh tiga isolat bakteri yang mempunyai aktivitas -amilase, yaitu

Shewanella collweliana, Shewanella woodyi, dan Shewanella japonica. Shewanella

japonica juga diduga mempunyai kemampuan untuk melakukan proses fermentasi terhadap

D-glukosa [Satomi et al., 2003].

2.6 -Amilase Pendegradasi Pati Kentang

Belum banyak penemuan -amilase yang mempunyai aktivitas pendegradasi pati kentang.

Pada umumnya, -amilase pendegradasi pati kentang diperoleh dari pati kentang itu sendiri.

Namun, akhir-akhir ini ditemukan bakteri yang mampu mendegradasi butir pati kentang.

Salah satu bakteri yang mempunyai kemampuan tersebut adalah Bacillus subtilis 65.

9

-Amilase dari B. subtilis 65 mempunyai aktivitas pendegradasi butir pati kentang.

Degradasi -amilase dari B. subtilis 65 mempunyai pola tertentu. -Amilase dari B.subtilis

65 mendegradasi G4, G5, G6 menjadi G1, G2 dan G3. G3 yang terbentuk dapat terdegradasi

menjadi G1. Namun pada inkubasi 48 jam, G3 yang terbentuk tidak bisa terdegradasi lagi

[Hayashida et al., 1988].

2.7 Danau Kakaban

Danau Kakaban merupakan laguna dari sebuah atol yang terbentuk dari pengangkatan

terumbu karang sekelilingnya ke atas permukaan air laut sebagai akibat adanya aktivitas

tektonik, sehingga sebagian air laut terperangkap di dalamnya. Lima kilometer persegi air

laut terperangkap di dalam pematang dengan ketinggian 50 m. Dengan demikian, Danau

Kakaban merupakan danau air laut. Danau ini terletak di Pulau Kakaban, yang termasuk

dalam Kepulauan Derawan, Kabupaten Berau, Kalimantan Timur [http://www.terangi.or.id].

Gambar 2. 5 Peta lokasi Danau Kakaban

Di kawasan Danau Kakaban ini terdapat beberapa spesies ubur-ubur, antara lain Aurelia

aurita, berbadan bening mirip piring kaca; Tripedalia cystophora, ubur-ubur seukuran ujung

jari telunjuk; serta Martigias papua, ubur-ubur yang menyerupai bola lampu pijar berwarna

biru kecoklatan. Selain itu, terdapat juga spesies ubur-ubur Cassiopeia ornate. Ubur-ubur

jenis ini berenang terbalik dengan tentakel menghadap ke atas. Perilaku itu merupakan

bentuk adaptasi akibat keterbatasan makanan di danau, sehingga membuat ubur-ubur itu

melakukan simbiosis mutualisme dengan alga hijau, zooxanthellae. Alga tersebut

memerlukan bantuan sinar matahari untuk menghasilkan makanan

[http://www.terangi.or.id].

10

2.8 Penapisan Aktivitas -Amilase

Penapisan aktivitas -amilase merupakan proses pemilahan/ penyaringan beberapa bakteri

yang mempunyai aktivitas amilolitik. Dalam proses ini, beberapa bakteri tersebut

ditumbuhkan pada media yang mengandung pati (amilosa dan amilopektin). Untuk

penapisan aktivitas amilolitik dapat digunakan beberapa teknik, seperti teknik pembentukan

kompleks pati-iodin, teknik degradasi pati-remazol brilliant blue serta teknik degradasi red

amylopectine.

2.8.1 Teknik pembentukan kompleks pati-iodin

Penapisan aktivitas -amilase dengan teknik pembentukan kompleks pati-iodin didasarkan

pada penentuan aktivitas -amilase dengan metode Fuwa. Uji positif ditandai dengan

terbentuknya daerah terang dengan latar biru/ungu di sekitar kultur (pada media

pertumbuhan yang mengandung pati) setelah penambahan larutan KI/I2.

Gambar 2. 6 Struktur pati-iodin

Warna biru/ungu tersebut merupakan warna dari kompleks pati-iodin. Iodin dan pati akan

saling berinteraksi, iodin tersebut terperangkap dalam struktur pati (Gambar 2.6). Pada

akhirnya terjadi kompleks pati-iodin tersebut yang berwarna. Reaksi tersebut merupakan

reaksi yang bersifat spesifik terhadap pati. Dengan demikian, uji tersebut dapat digunakan

sebagai analisis pati dalam sampel baik kualitatif maupun kuantitatif.

11

Keberadaan -amilase akan mendegradasi pati menjadi glukosa, sehingga warna biru/ungu

yang terbentuk akan semakin hilang (muncul daerah terang). Aktivitas -amilase dapat

diperiksa dengan hilangnya warna biru/ungu (muncul daerah terang) pada medium

pertumbuhan setelah penambahan iodin.

2.8.2 Teknik degradasi pati-remazol brilliant blue

Teknik ini tidak jauh berbeda dengan teknik pembentukan kompleks pati-KI/I2. Dalam

penggunaannya, teknik ini sangat efektif untuk penapisan aktivitas -amilase. Media

pertumbuhan yang digunakan mengandung remazol brilliant blue yang membentuk

kompleks dengan pati.

Gambar 2.7 Struktur pati-remazol brilliant blue

Berdasarkan Gambar 2.7, kompleks pati-remazol brilliant blue terjadi melalui interaksi

antara gugus atom O pada posisi kedua dari glukosa (dalam pati) dengan atom C pada

remazol brilliant blue. Kompleks yang terbentuk tersusun dari polimer glukosa dan remazol

brilliant blue dengan perbandingan glukosa:remazol brilliant blue adalah m:n, dengan m

lebih kecil dari n.

Indikasi adanya aktivitas -amilase ditandai adanya warna terang dengan latar biru di sekitar

kultur bakteri. Warna terang tersebut merupakan hasil degradasi kompleks pati-remazol

brilliant blue. Adanya aktivitas -amilase menyebabkan kompleks pati-remazol brilliant

blue menjadi rusak. Hal ini terjadi karena kompleks pati-remazol brilliant blue hanya terjadi

ketika terdapat pati dalam media. Jika konsentrasi pati berkurang (degradasi pati akibat

adanya aktivitas amilase), kompleks tersebut akan berkurang juga. Hal ini menyebabkan

terbentuknya warna terang di sekitar kultur bakteri. Teknik penapisan aktivitas enzim dengan

cara pewarnaan substrat telah banyak dilakukan. Red amylose, blue xylan serta orange HE-

cellulose merupakan contoh senyawa yang digunakan untuk penapisan aktivitas amilase,

12

xilanase dan selulase. Adanya aktivitas positif ditunjukkan dengan munculnya daerah terang

di sekitar kultur bakteri [Ten et al., 2004].

2.8.3 Teknik degradasi red amylopectine

Teknik penapisan dengan red amylopectine pada dasarnya sama seperti teknik degradasi

kompleks pati-remazol brilliant blue, amylose blue, red xylan serta orange HE-cellulose. Hal

yang berbeda dari teknik ini adalah pemakaian amilopektin untuk pembentukan kompleks

red amylopectine. Pada teknik ini substrat yang dipakai hanya amilopektin (dalam media

pertumbuhan). Amilopektin sebagai substrat yang terikat dengan cibacron brilliant red 3b-a.

Adanya aktivitas amilase ditunjukkan dengan adanya warna terang di sekitar kultur bakteri

dengan latar warna merah. Struktur dari cibacron brilliant red 3b-a dapat dilihat pada

Gambar 2. 8.

Gambar 2. 8 Struktur cibacron brilliant red 3b-a

Teknik degradasi red amylopectine dapat digunakan untuk uji aktivitas -amilase secara

kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Panjang gelombang maksimal (max.) red

amylopectine adalah 517 nm. Dengan demikian, pengukuran aktivitas -amilase dengan red

amylopectine dapat dilakukan pada 517 [OMahony, 2002].

2.9 Aktivitas -Amilase

Aktivitas -amilase dapat ditentukan dengan beberapa metode. Aktivitas -amilase pada

masing-masing metode dilihat dari sudut pandang yang berbeda. Adapun beberapa metode

untuk menentukan aktivitas -amilase antara lain, metode Fuwa dan metode DNS

13

2.9.1 Metode Fuwa

Metode ini didasarkan pada pembentukan kompleks antara sisa pati yang tak terdegradasi

dengan iodin. Dalam suatu larutan, adanya pati dapat diperiksa dengan munculnya warna

biru/ungu setelah penambahan iodin. Kompleks pati-iodin yang terbentuk masing-masing

jenis pati berbeda satu sama lain. Hal ini dipengaruhi oleh jumlah residu glukosa (monomer)

penyusun pati tersebut [Robyt, 1998].

2.9.2 Metode DNS

Uji aktivitas -amilase dengan asam dinitro salisilat (DNS) didasarkan pada prinsip reaksi

reduksi-oksidasi. Hidrolisis pati menghasilkan molekul oligosakarida dan monosakarida

yang mempunyai ujung gugus pereduksi. Ujung gugus pereduksi tersebut mempu mereduksi

asam dinitro salisilat yang berwarna kuning menjadi spesi tereduksinya yang berwarna

jingga. Perubahan warna tersebut dapat ditentukan dengan analisis spektrometri.

Adanya aktivitas -amilase menghasilkan molekul oligosakarida dan monosakarida yang

mempunyai gugus pereduksi. Dengan demikian, jumlah ujung gugus pereduksi dalam

larutan bertambah. Adanya penambahan jumlah ujung pereduksi ini akan mempengaruhi

perubahan warna pada uji DNS. Pada uji DNS ini, larutan pati diinkubasi dengan -amilase

pada suhu optimumnya. Sebagai kontrol, -amilase diinaktivasi terlebih dulu dengan

penambahan asam. Aktivitas -amilase pada uji DNS ini ditentukan dengan membandingkan

nilai absorbansi sampel dengan kontrol. Struktur dari asam dinitro salisilat dapat dilihat pada

Gambar 2. 9.

Gambar 2. 9 Struktur DNS

14

Adanya aktivitas -amilase ditunjukan dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi

jingga. Hal ini disebabkan oleh reduksi gugus nitro (-NO2) menjadi amina (-NH2) oleh ujung

gula pereduksi hasil degradasi pati oleh -amilase. Pada pengujian aktivitas -amilase

dengan metode DNS ditentukan dengan spektrometri pada panjang gelombang 500 nm.

2012-12-19T09:43:27+0700ITB Digital Library