ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGArepository.unair.ac.id/55612/14/PPDS. IKA. 17-16 Pra...

ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I PADA VENTRIKEL KANAN

TIKUS MODEL HIPERTENSI ARTERI PULMONAL YANG MENDAPAT

EKSTRAK BUAH DELIMA

Penelitian Karya Ilmiah Akhir

Untuk Memenuhi Persyaratan Dalam Menyelesaikan

Program Pendidikan Dokter Spesialis I

Ilmu Kesehatan Anak

Oleh:

Ilham Bondan Pramudiawan, dr.

Pembimbing:

Prof. Dr.Teddy Ontoseno, dr., SpA (K), SpJP, FIHA

Dr. Mahrus A Rahman, dr., SpA (K)

I Ketut Alit Utamayasa, dr., SpA(K)

Taufiq Hidayat, dr., SpA

Budiono, dr., M. Kes

DEPARTEMEN/SMF ILMU KESEHATAN ANAK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

RSUD DR. SOETOMO SURABAYA

2016


i KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

KATA PENGANTAR

Pasien penyakit jantung bawaan (PJB) idealnya mendapatkan terapi

definitif sejak dini. Namun di negara kita hal ini sering tertunda akibat

keterbatasan sarana dan prasarana. Penyakit jantung bawaan pirau kiri ke kanan

yang tidak terkoreksi dapat berkembang menjadi hipertensi arteri pulmonal (HAP)

progresif, menyebabkan fibrosis ventrikel kanan dan berujung gagal jantung serta

kematian. Terapi medikamentosa selama menunggu terapi definitif diperlukan

untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas.

Transforming Growth Factor - merupakan sitokin profibrogenik utama

dan akumulasi kolagen terutama kolagen tipe I pada matriks ekstraseluler

merupakan definisi dari fibrosis. Peningkatan jumlah sel yang mengekspresi

TGF- dan kolagen tipe I dapat digunakan sebagai penanda progresifitas fibrosis

akibat HAP. Ekstrak buah delima memiliki kelebihan dibanding terapi HAP

konvensional, yakni memiliki titik kerja yang lebih banyak dan tanpa efek

samping. Penurunan jumlah sel yang mengekspresi TGF- dan kolagen tipe I

pada tikus model HAP yang mendapat ekstrak buah delima (EBD) dapat

mencerminkan adanya hambatan terhadap proses fibrosis.

Hasil penelitian ini nantinya dapat dipertimbangkan sebagai dasar

pemberian EBD pada anak dengan PJB pirau kiri ke kanan yang memiliki

kecenderungan menjadi HAP. Hal ini diharapkan dapat memperlambat

progresifitas HAP, menurunkan morbiditas dan mortalitas terkait PJB.

Dengan mengucapkan rasa syukur, sebagai pemula dalam bidang ini, kami

menyadari adanya kekurangan dalam karya ilmiah akhir ini. Kami menerima

secara terbuka setiap saran, asupan, kritik, dan bimbingan demi perbaikan

penulisan penelitian ini. Akhir kata, semoga penelitian karya ilmiah akhir ini

dapat memberikan manfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan dan memberikan

masukan bagi kita semua. Aamiin.

Surabaya, Agustus 2016

Penulis


ii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahi robbil´alamin, dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat

Allah SWT, atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga saya dapat

menyelesaikan laporan penelitian karya ilmiah akhir ini sebagai salah satu

persyaratan untuk mendapatkan gelar dokter spesialis anak. Salam dan sholawat

kami ucapkan kepada Rasulullah Muhammad SAW selaku panutan kami.

Pada kesempatan kali ini perkenankanlah saya dengan segala kerendahan

hati menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus dan penghargaan yang

setinggi-tingginya kepada yang terhormat Prof. DR.Teddy Ontoseno, dr., SpA

(K), SpJP, FIHA; I Ketut Alit Utamayasa, dr., SpA(K); Taufiq Hidayat, dr.,

SpA, selaku pembimbing dan Dr. Mahrus A Rahman, dr., SpA (K), selaku

pembimbing sekaligus Ketua Program Studi, dan mantan Koordinator Litbang

Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak FK UNAIR/RSUD Dr.Soetomo yang

telah memberikan ide, saran, arahan, serta bimbingan sejak awal penelitian,

penyusunan kerangka konsep, hingga pada penyelesaian karya ilmiah akhir ini.

Rasa hormat dan terima kasih yang sebesar-besarnya jugasaya ucapkan

kepada yang terhormat :

Prof. Dr. Soetojo, dr., SpU (K) dan Prof. Dr. Agung Pranoto, dr.,

SpPD (K) selaku Dekan dan mantan Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Airlanga.

Harsono, dr., dan H. Dodo Anondo, dr., MPH, selaku Direktur dan

mantan Direktur RSUD Dr. Soetomo Surabaya

iii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


M Faizi, dr., SpA (K) dan Sjamsul Arief, dr.,SpA (K), MARS selaku

Kepala dan mantan Kepala Departemen Ilmu Kesehatan Anak FK

UNAIR/RSUD Dr. Soetomo yang telah berkenan memberi kesempatan

kepada saya untuk memperdalam pengetahuan di bidang Ilmu

Kesehatan Anak serta atas bimbingan dan arahannya selama saya

mengikuti pendidikan keahlian.

Dr. I Dewa Gede Ugrasena, dr., SpA (K) selaku mantan Ketua

Program Studi. Juga kepada Dwiyanti Puspitasari, dr., SpA (K),

DTMH, MCMTM dan Siti Nurul Hidayati, dr. M. Kes., SpA (K)

selaku Sekretaris dan mantan Sekretaris Program Studi, atas segala

bimbingan, dorongan, dan petunjuk yang senantiasa diberikan kepada

saya selama mengikuti pendidikan keahlian.

Dr. Irwanto, dr., SpA(K) selaku Koordinator Litbang

Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak FK UNAIR/RSUD Dr.Soetomo

sekaligus penguji atas segala arahan, bimbingan, dan kesempatan yang

diberikan kepada saya sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.

Prof.Dr. Subijanto M.S , dr., SpA(K); Prof. Ariyanto

Harsono, dr., SpA(K); M Faizi, dr., SpA(K); Retno Asih, dr.,

SpA(K); selaku tim penguji atas asupan konstruktif yang sangat

berharga untuk perbaikan karya ilmiah akhir ini.

Budiono, dr., M. Kes selaku konsultan biostatistik dari fakultas

Kesehatan Masyarakat UNAIR atas segala pengarahan dan bimbingan,

iv ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


khususnya dalam hal metodologi penelitian dan analisis hasil penelitian

ini.

Wibi Riawan, Drs., SSi selaku staf dan karyawan Laboratorium

Biomedik Fakultas Brawijaya Malang.

Seluruh staf dan karyawan Departemen Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Airlanga/RSUD Dr. Soetomo Surabaya.

Seluruh staf pengajar Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak RSUD

Dr. Soetomo Surabaya yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu atas

bimbingan, dorongan, dan nasehat yang telah saya terima selama saya

mengenyam pendidikan keahlian.

Rekan-rekan satu tim penelitian: Agus Sunandar, dr., Rafiqa Rais

Akbar, dr., Gina Nur Djalilah, dr., Citra Ganesha Putri, dr., yang

telah sukarela dalam suka dan duka bersama-sama ngopeni, meramut,

memberi perlakuan hingga membunuh tikus-tikus coba. Semoga

kematian mereka tidak sia-sia ...

Rekan-rekan seangkatan, teman seperjuangan sejak MKDU : Rina

Pandjaitan, dr., SpA, Putu Dian Saraswati, dr., SpA, Berlian

Beatrix, dr., SpA, Shinta Kamaya, dr.,SpA, Hakimah Maimunah,

dr., SpA, Natalia Kristanti, dr., Heru Setiawan, dr., Siti Nurazizah,

dr., Septria Erlitarini, dr., Devi Emawanti, dr., Kristina Natalia

Marbun, dr., Luty Dyah Prahmani, dr. Semoga persahabatan ini

berlangsung terus dan senantiasa membawa kebaikan.

v ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


Seluruh teman sejawat PPDS I Departemen/SMF Ilmu Kesehatan

Anak FK UNAIR/RSUD Dr. Soetomo Surabaya yang dengan peranya

masing-masing telah banyak membantu kelancaran tugas, memberi

semangat dan asupan serta mewarnai hari hari saya selama mengikuti

pendidikan keahlian ini.

Seluruh paramedis di IRNA dan IRJ serta IRD Anak RSUD Dr.

Soetomo Surabaya yang telah membantu saya selama masa pendidikan

ini.

Seluruh pasien yang pernah saya rawat selama masa pendidikan di

RSUD Dr. Soetomo Surabaya, RSUD Balong Jember, RSUD SOE Nusa

Tenggara Timur, RSAL Ramelan Surabaya yang merupakan guru saya

yang sejati dalam menyelesaikan studi spesialis anak.

Saya ucapkan terima kasih dan syukur Alhamdulillah memiliki

keluarga yang begitu luar biasa, yang selalu mendukung dan

memberikana semangat serta kesempatan kepada saya untuk

mewujudkan cita-cita saya. Saya sampaikan rasa hormat, rasa sayang,

dan terima kasih kepada:

Orang tua saya H. Ario Rishandoko, SH dan Hj. Sri Gunarti, Dra.,

yang telah mendidik, membimbing, mengayomi, mendoakan, memberi

dukungan cinta, kasih sayang serta dorongan semangat agar dapat

menyelesaikan pendidikan keahlian ini.

Kepada mertua saya: H. Rosyidi Hanafi, Ir., dan Hj. Agustina atas

segala doa restu dalam menyelesaikan pendidikan keahlian ini.

vi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


Istri dan anak-anak tercinta, Rosa Afriani, dr. SpAn., Anindya Aulia

Ilham, Allysha Aulia Ilham atas segala cinta kasih dan kasih sayang

selama ini. Senyum, tawa canda, dan peluk kalian adalah obat yang

mampu menghilangkan lelah jiwa raga.

Adik kandung saya: Anisa Dian Ariyani, SE., Nurul tria Indriani,

SE., atas segala kebersamaan, serta doa restunya. Melihat anak-anak

kita... serasa baru kemarin kita seusia mereka.

Terima kasih kepada semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu

persatu, yang telah memberi dukungan dan bantuan baik moril maupun

materiil hingga selesainya penyusunan karya ilmiah akhir ini.

Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi kita semua dan memberi

sumbangan bagi ilmu kedokteran. Semoga Allah SWT senantiasa memberi

rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Aamiin

Penulis


vii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ..................................................................................... i

UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... ii

Daftar Isi .......................................................................................................... vii

Daftar Tabel ..................................................................................................... xii

Daftar Gambar ................................................................................................. xiii

Daftar Lampiran .............................................................................................. xiv

Daftar Singkatan .............................................................................................. xv

Abstrak ............................................................................................................. xviii

Ringkasan ........................................................................................................ xx

BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ...................................................................................... 5

1.3 Tujuan Penelitian ....................................................................................... 5

1.3.1 Tujuan Umum ......................................................................................... 5

1.3.2 Tujuan Khusus ........................................................................................ 5

1.4 Manfaat Penelitian ..................................................................................... 6

1.4.1 Manfaat Teori ......................................................................................... 6

1.4.2 Manfaat Praktis ....................................................................................... 6

BAB II TINJAUAN KEPUSTAKAAN ........................................................ 7

2.1 Definisi dan Klasifikasi Hipertensi Arteri Pulmonal ................................. 7

2.1.1 Definisi ................................................................................................... 7

viii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


2.1.2 Klasifikasi dan Derajat Hipertensi Arteri Pulmonal ............................... 8

2.2 Efek Hipertensi Arteri Pulmonal pada Jantung ......................................... 10

2.2.1 Ventrikel Kanan Normal ........................................................................ 10

2.2.2 Matriks Ekstraseluler Normal pada Otot Jantung ................................... 13

2.2.3 Ventrikel Kanan pada Hipertensi Arteri Pulmonal ................................. 14

2.2.4 Fibrosis Otot Jantung pada Hipertensi Arteri Pulmonal ......................... 17

2.2.4.1 Pengaruh Stimulus Hemodinamik dan Sistem Renin-Angiotensin

dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung .....................................................

19

2.2.4.2 Peran Inflamasi dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 21

2.2.4.2.1 Peran TGF-βs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 21

2.2.4.2.2 Peran PDGFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 23

2.2.4.2.3 Peran IFN dan TFNs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung... 24

2.2.4.2.4. Peran ILs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung .................... 25

2.2.4.2.5 Peran Makrofag dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ........... 26

2.2.4.3 Peran Spesies Oksigen Reaktif dalam Pembentukan Fibrosis Otot

Jantung ............................................................................................................

27

2.2.4.4 Peran Kolagen dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ................. 29

2.2.4.5 Peran Kolagenase dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ........... 31

2.3 Terapi Hipertensi Arteri Pulmonal dan Fibrosis otot Jantung ................... 33

2.3.1 Calcium Channel Blocker ....................................................................... 33

2.3.2 Analog Prostasiklin ................................................................................. 35

2.3.3 Antagonis Endothelin ............................................................................. 36

2.3.4 Penghambat Phospodiesterase-5 ............................................................. 37

ix ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


2.3.5 Ekstrak Buah Delima Sebagai Terapi Alternatif .................................... 37

2.4 Tikus sebagai Hewan Model Hipertensi Arteri Pulmonal ......................... 43

2.5 Monokrotalin sebagai Obat Pembuatan Hewan Model Hipertensi Arteri

Pulmonal ..........................................................................................................

45

2.6. Kerangka Teori ......................................................................................... 46

2.6.1 Penjelasan Kerangka Teori .................................................................... 47

BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS

PENELITIAN ................................................................................................

49

3.1 Kerangka Konsep....................................................................................... 49

3.2 Penjelasan Kerangka Konsep..................................................................... 50

3.3 Hipotesis Penelitian ................................................................................... 51

BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................... 52

4.1 Desain Penelitian ....................................................................................... 52

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................... 54

4.2.1 Tempat Penelitian ................................................................................... 54

4.2.2 Waktu Penelitian ..................................................................................... 54

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian ................................................................. 55

4.3.1 Populasi................................................................................................... 55

4.3.2 Sampel Penelitian ................................................................................... 55

4.3.3 Penghitungan Besar Sampel ................................................................... 56

4.4 Variabel Penelitian .................................................................................... 57

4.4.1 Variabel Bebas ........................................................................................ 57

4.4.2 Variabel Tergantung ............................................................................... 57

x ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


4.4.3 Variabel Antara ....................................................................................... 57

4.4.4 Variabel Kendali ..................................................................................... 57

4.5 Definisi Operasional .................................................................................. 57

4.6 Bahan dan Alat Penelitian ......................................................................... 60

4.6.1 Bahan Penelitian ..................................................................................... 60

4.6.1.1 Ekstrak Buah Delima ........................................................................... 60

4.6.1.2 Bahan Pembuatan Hewan Model ........................................................ 60

4.6.1.3 Bahan Pemeriksaan Laboratorium ....................................................... 60

4.6.2 Alat Penelitian......................................................................................... 61

4.6.2.1 Alat untuk Pembuatan Hewan Model .................................................. 61

4.6.2.2 Alat Untuk Perlakuan Hewan Model ................................................... 61

4.6.2.3 Alat Untuk Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis dan Pemeriksaan

Laboratorium....................................................................................................

61

4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ........................................ 62

4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data............................................................ 63

4.9 Alur Penelitian ........................................................................................... 65

4.10 Pelaksanaan Penelitian ........................................................................... 66

4.10.1 Persiapan Penelitian............................................................................... 66

4.10.2 Pembuatan Hewan Model HAP ............................................................ 68

4.10.3 Perlakuan Terhadap Hewan Coba ........................................................ 68

4.10.4 Pengambilan Jaringan Jantung ........................................................... 69

4.10.5 Perlakuan Terhadap Sampel ................................................................ 69

xi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


BAB V HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS ........................................ 73

5.1 Karakteristik Subjek Penelitian ................................................................. 73

5.2 Gambaran Histopatologi Otot Jantung Ventrikel Kanan ........................... 77

5.2.1 Ekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I .................................................... 77

5.3 Analisis Hasil Penelitian ............................................................................ 79

5.3.1 Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I ................ 79

BAB VI PEMBAHASAN .............................................................................. 83

6.1 Karakteristik Tikus Model Hipertensi Arteri Pulmonal ............................ 83

6.2 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung

Ventrikel Kanan ...............................................................................................

86

6.3 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot

Jantung Ventrikel Kanan .................................................................................

90

BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 95

KEPUSTAKAAN ........................................................................................... 96

LAMPIRAN ................................................................................................... 116


xii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Skema 10 Kategori Dasar Hipertensi Arteri Pulmonal pada Anak ... 8

Tabel 2. Derajat Hipertensi Pulmonal ............................................................. 9

Tabel 3. Tipe Kolagen ..................................................................................... 30

Tabel 4. Kandungan Fitokimia Tanaman Buah Delima .................................

Tabel 5. Kandungan Nutrisi Tanaman Buah Delima ......................................

39

40

Tabel 6. Berat Badan Tikus Model ................................................................. 74

Tabel 7. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis ................ 77

Tabel 8. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis (mPAP =Mean Artery Preasure) 76

Tabel 9. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I

pada Tikus Model HAP....................................................................................

80


xiii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Potongan Melintang Ventrikel Normal ......................................... 10

Gambar 2. Pembuluh Darah Jantung .............................................................. 11

Gambar 3. Tampak Dalam Suplai Darah Ventrikel Kanan ............................. 12

Gambar 4. Perkembangan Hipertensi Arteri Pulmonal ................................... 16

Gambar 5. Efek Selular TGF-Β Pada Fibrosis Otot Jantung ......................... 23

Gambar 6. Hubungan Antara Fibrosis, Inflamasi , Dinding Pembuluh Darah,

dan Hipertrofi Otot Jantung..............................................................................

27

Gambar 7. Jalur Regulasi Fibrosis Otot Jantung Terkait Angiotensin dan

Stres Oksidatif ...............................................................................................

29

Gambar 8. Efek Bioaktif Kandungan Buah Delima ........................................ 38

Gambar 9. Kapasitas Antioksidan Jus Buah Delima dibandingkan Wine, Teh

Hijau, dan Ekstrak Kulit Delima .....................................................................

42

Gambar 10. Bagan Rancangan Penelitian ....................................................... 52

Gambar 11. Alur Penelitian ............................................................................. 65

Gambar 12. Berat Badan Tikus Model ........................................................... 73

Gambar 13. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis ........... 75

Gambar 14. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis .............................................. 78

Gambar 15. Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung Tikus Model....................... 79

Gambar 16. Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot Jantung Tikus Model............ 80

Gambar 17. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen

tipe I .................................................................................................................

81


xiv KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Pemberian Wewenang Penelitian ...................................... 109

Lampiran 2. Surat Keterangan Kelaikan Etik Penelitian .................................

Lampiran 3. Sertifikat Ekstrak Buah Delima ..................................................

110

111

Lampiran 4. Hasil Pengolahan Data ................................................................ 114

Lampiran 5. Gambar Tikus Sprague Dawley .................................................. 127

Lampiran 6. Gambar Alat Monitor Dash 5000 ................................................ 128


xv KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

DAFTAR SINGKATAN

AA : Asam Arakidonat

AE : Asam Ellagic

ABTS : 2,2’-Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline)-6-Sulfonic Acid

ACE : Angiotensin Converting Enzyme

APC : Antigen Presenting Cells

ASC : Apoptosis Associated Speck-Like Protein

AV : Atrio Ventricular

cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate

CMR : Cardiac Magnetic Resonance

COX-2 : Cyclooxygenase-2

CTGF : Connective Tissue Growth Factor

DAP : Duktus Arteriosus Persisten

DMDP : Dimethyl-p-Phenylenediamine

DPPH : α-α Diphenyl-β-Pycrylhydrazyl

DSV : Defek Septum Ventrikel

EBD : Ekstrak Buah Delima

ERK : Extracellular-Signal-Regulated Kinases

FDA : Food and Drugs Administration

FGF : Fibroblast GrowthFfactor

FRAP : Ferric Reducing Ability of Plasma

GPI : Glycosylphophatidylinositol

xvi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


HAP : Hipertensi Arteri Pulmonal

IFN : Interferon

IL : Interleukin

LDL : Low-Density Lipoprotein

LOX : Lipoxygenase

LV : Left Ventricle

MAP : Mean Artery Pressure

MCP-1 : Monocyte Chemoattractant Protein -1

MCTP : Monocrotaline Pyrrole

MHC : Major Histocompatibility Complex

MMP-1 : Matrix Metalloproteinase-1

mPAP : Mean Pulmonary Arterial Pressure

MT-MMP : Membran Type MMP

NADPH : Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen

NK : Natural Killer

NLR : NOD Like Receptor

NLRP3 : NOD-Like Receptor Family, Pyrin Domain Containing 3

NO : Nitric Oxide

NOS : Nitric Oxide Synthase

OF-1 : Oncins Frans -1

PDGF AA : Platelet Derived Growth Factor AA

PDGF BB : Platelet Derived Growth Factor BB

PG : Prostatglandin

xvii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


PGI2 : Prostasiklin

PGD2 : Prostatglandin D2

PGF2α ; Prostatglandin F2α

PJB : Penyakit Jantung Bawaan

RA : Renin Angiotensin

RV : Right Ventricle

SERTs : Serotonin Reuptake Transporter SMAD : Mothers Against Decapentaplegic Homolog

SMAD2 : Mothers Against Decapentaplegic Homolog 2

SOR : Spesies Oksigen Reaktif

SRAA : Sistem Renin-Angiotensin-Aldosteron

TGF-β1 : Transforming Growth Factor Beta 1

TIMP-1 : Tissue Inhibitor Matrix Metalloprotease-1

TNF : Tumor Necrosing Factor

TVP : Tahanan Vaskuler Paru

TXA2 : Tromboxane A2

Vka : Ventrikel kanan

Vki : Ventrikel kiri

α-SMA : α-Smooth Muscle Actin

5-HT : 5-hydroxytryptamine



EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I PADA VENTRIKEL KANAN TIKUS MODEL HIPERTENSI ARTERI PULMONAL YANG MENDAPAT EKSTRAK BUAH DELIMA

Ilham Bondan Pramudiawan, Taufiq Hidayat1, I Ketut Alit Utamayasa1,

Mahrus A Rahman1, Teddy Ontoseno1, Budiono2

1Divisi Kardiologi Departemen Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas Kedokteran,

2Fakultas Ilmu Kesehatan Masyarakat Universitas Airlangga/RSUD dr. Soetomo

Surabaya

ABSTRAK

Latar Belakang: Hipertensi arteri pulmonal (HAP) terkait penyakit jantung bawaan sering berkembang menjadi progresif dan menyebabkan fibrosis otot jantung yang berujung gagal jantung dan kematian. Terapi definitif terhadap defek anatomis seringkali tertunda akibat keterbatasan sarana dan prasarana. Terapi medikamentosa diperlukan untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas selama menunggu terapi definitif. Ekstrak buah delima (EBD) memiliki aktifitas antifibrotik melalui mekanisme anti inflamasi, ACE inhibitor, dan antioksidan. Efek antifibrotik ini dapat dievaluasi melalui penurunan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Tujuan: Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal. Metode: Penelitian randomized post-test only control group ini dilakukan terhadap 24 tikus jantan Sprague Dawley yang diinduksi HAP menggunakan monokrotalin 60 mg/kg berat badan. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan dievaluasi pada minggu ke 2 dan ke 4. Seluruh subjek diikutkan dalam analisis, termasuk tikus yang mati selama penelitian. Hasil: Dua tikus kontrol mati pada hari ke 7 dan ke 11 penelitian. Tidak didapatkan perbedaan rerata berat badan antar kelompok. Tikus yang mendapat EBD memiliki rerata tekanan arteri pulmonalis lebih rendah dibanding kontrol. Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok perlakuan 2 dan 4 minggu lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol. Tidak didapatkan perbedaan bermakna rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok perlakuan 2 minggu dan 4 minggu. Kesimpulan: Pemberian ekstrak buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal. Kata Kunci: Hipertensi Arteri Pulmonal, Tikus Model HAP, Ekstrak Buah Delima, TGF-β1, Kolagen Tipe I, Ventrikel Kanan.



TGF-β1 AND COLLAGEN TYPE I EXPRESSION ON RIGHT VENTRICLE PULMONARY ARTERIAL HYPERTENSION

RAT MODEL RECEIVING POMEGRANATE EXTRACT

Ilham Bondan Pramudiawan, Taufiq Hidayat1, I Ketut Alit Utamayasa1, Mahrus A Rahman1, Teddy Ontoseno1, Budiono2

1Cardiology Division Department of Child Health, Medical School,

2Faculty of public Health Airlangga University/RSUD dr. Soetomo

Surabaya

ABSTRACT

Background: Congenital heart disease’s related pulmonary arterial hypertension (PAH) frequently develop into progressive, causing myocardial fibrosis and ending with heart failure and death. Definitive theraphy on anatomical deffect often delayed due to facilities and infrastructure. Medical theraphy is needed to decrease morbidity and mortality during awaiting definitive theraphy. Pomegranate extract has antifibrotic activity through antiinflamation, ACE inhibitor, and antioxidant mechanism. The antifibrotic effect can be evaluated by the decreasement of cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium. Purpose: Proving that pomegranate extract decrease cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium pulmonary arterial hypertension rat models. Metode: This randomized post-test only control group carried out on 24 monocrotaline induced male Sprague Dawley rats. The monocrotaline dose is 60 mg/kg body weight. The amount of cells expressing TGF-β1 and collagen tipe I on right ventricle myocardium evaluated on week 2 and week 4. All subjects included in analysis, including the death rats. Result: Two control rats died on day 7 dan day 11. There are no differnce on body weight among groups. Rats receiving pomegranate extract having a lower mean pulmonary arterial pressure than control groups. Mean of cells expressing TGF-β1 and collagen tipe I on right ventricle myocardium lower than control groups. There are no significant difference on cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium between 2 weeks treatment group and 4 weeks treatment group. Conclussion: Pomegranate extract decrease cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium on pulmonary arterial hypertension rat models. Keyword: Pulmonary Arterial Hypertension, PAH rat model, Pomegranate extract, TGF-β1, Collagen Tipe I, Right Ventricle.


xx KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

RINGKASAN

Hipertensi arteri pulmonal yang progresif sebagian besar terkait penyakit

jantung bawaan. Koreksi terhadap defek anatomis merupakan terapi definitif,

namun seringkali tertunda akibat keterbatasan sarana dan prasarana. Hipertensi

arteri pulmonal yang progresif dapat meyebabkan terjadinya fibrosis ventrikel

kanan yang dapat berujung gagal jantung dan kematian. Terapi medikamentosa

diperlukan untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas. Terapi yang ada saat ini

tidak ada yang bersifat menyembuhkan dan memiliki efek samping yang banyak.

Ekstrak buah delima (EBD) memiliki mampu menurunkan rerata tekanan arteri

pulmonalis dan memiliki aktifitas antifibrotik melalui mekanisme anti inflamasi,

ACE inhibitor, dan antioksidan. Ekstrak buah delima juga terbukti aman

dikonsumsi dalam dosis besar dan dalam jangka waktu lama.

Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa pemberian ekstrak

buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan

kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.

Penelitian laboratoris eksperimental ini menggunakan rancangan randomized

post-test control group dengan 24 tikus putih jantan strain Sprague Dawley

berumur 3 bulan yang diinjeksi monokrotalin dengan dosis 60 mg/kg berat badan

secara subkutan sebagai subjek penelitian. Subjek terbagi menjadi 4 kelompok

yakni kelompok tikus yang mendapat ekstrak buah delima dan carboxy methyl

cellulose (CMC) selama 2 minggu (E1) dan 4 minggu (E2), serta kelompok

kontrol tikus yang hanya mendapat CMC selama 2 minggu (K1) dan 4 minggu

xxi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

xxi KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

(K2). Berat badan, rerata tekanan arteri pulmonalis, dan rerata jumlah sel yang

mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan dievaluasi pada

minggu ke 2 dan ke 4. Semua subjek diikutsertakan dalam analisis, termasuk tikus

yang mati saat penelitian.

Dua ekor tikus didapatkan mati yakni masing masing pada hari ke 7 dan

ke 11. Kedua tikus itu masing masing merupakan kelompok K1 dan K2. Tidak

didapatkan perbedaan bermakna pada rerata berat badan antar kelompok pada saat

awal penelitian maupun akhir penelitian. Rerata tekanan arteri pulmonalis diukur

menggunakan monitor DASH 5000 dengan sebelumnya dilakukan anestesi

menggunakan ketamine 0,5 mg/kg dan midazolam 0,5mg/kg intramuskuler pada

paha,serta intubasi. Pengambilan organ jantung dilakukan setelah dilakukan

terminasi dengan tehnik eksanguinasi. Sampel organ kemudian dikirim ke bagian

patologi anatomi untuk dibuat blok jaringan dan slide dan seterusnya dikirim ke

Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Brawijaya Malang untuk evaluasi

jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan.

Hasil penelitian menunjukkan tidak adanya perbedaan bermakna pada

berat badan tikus model antar kelompok baik pada awal maupun akhir penelitian.

Rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok kontrol (K1 dan K2) lebih tinggi

dibanding elompok yang mendapatkan EBD (E1 dan E2). Kelompok K2 memiliki

rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I lebih tinggi dari

pada kelompok K1 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang

mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2 lebih rendah

daripada Kelompok K1 dan K2 dan bermakna secara statistik. Tidak didapatkan

xxii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

xxii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

perbedaan bermakna secara statistik rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-

β1dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2.

Efektifitas EBD dalam menurunkan kadar TGF-β1 dan kolagen tipe I pada

2 minggu dan 4 minggu ini menunjukkan bahwa EBD dapat menghambat proses

awal fibrogenesis sekaligus meningkatkan resolusi fibrosis. Dalam praktek klinis

ini berarti bahwa EBD diharapkan dapat mencegah fibrosis dan mengurangi

derajat fibrosis yang sudah terjadi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi

pertimbangan penggunaan EBD sebagai terapi tambahan, mendampingi terapi

baku yang sudah ada sehingga dapat menurunkan morbiditas dan mortalitas

terkait HAP.


1 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Hipertensi arteri pulmonal (HAP) merupakan suatu kondisi peningkatan

rerata tekanan arteri pulmonal saat istirahat melebihi 25 mmHg. (Wardle dan

Tulloh, 2012). Kondisi ini terjadi akibat remodeling arteri pulmonal berupa

hilangnya sel endotel arteri pulmonalis serta peningkatan aktivitas jalur

proliferatif dan apoptosis, penebalan sel otot polos, peningkatan pertumbuhan sel

endotel dan perubahan homeostasis bahan vasoaktif yang berakibat vasokonstriksi

arteri pulmonalis (Humbert dkk., 2004). Hipertensi arteri pulmonal juga

menyebabkan remodeling otot jantung terutama ventrikel kanan (Vka) berupa

hipertrofi miosit, aktivasi dan hiperplasia fibroblast serta deposisi kolagen

ekstraseluler yang disebut sebagai fibrosis. Fibrosis miokardium menyebabkan

kekakuan miokardium sehingga mengganggu fungsi sistol dan diastol yang dapat

memicu gagal jantung dan kematian (Nicoletti dan Michel, 1999; Fan dkk., 2012).

Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) dan kolagen tipe I merupakan penanda

penting dalam proses remodeling fibrosis miokardium sehingga evaluasi kadar

TGF-β1 dan kolagen tipe I dapat dijadikan dasar petunjuk terjadinya proses

fibrosis miokardium (Lez dkk., 2004; Fan dkk., 2012). Terapi HAP

menitikberatkan pada vasodilatasi arteri pulmonalis. Terapi ini meliputi calcium

channel blocker, prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat

posphodiesterase 5 (Raja dan Raja, 2011). Terapi tersebut tidak ada yang bersifat

2 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA


menyembuhkan, dan memiliki efek samping yang cukup banyak sehingga

pencarian strategi terapi baru terus dilakukan (Ghofrani dkk., 2009; Duarte dkk.,

2013). Pengembangan strategi baru ini lebih ditujukan untuk mencegah perubahan

seluler dan molekuler secara lebih dini dengan efek samping seminimal mungkin

(Durmowicz dkk., 1993).

Insiden HAP di Belanda mencapai 63,7 kasus per seribu anak (Ivy dkk.,

2013; Loon dkk., 2011). Etiologi HAP pada anak bervariasi, 57% merupakan

idiopatik dan herediter, 36% merupakan HAP dapatan terkait penyakit jantung

bawaan (PJB), dan 7% merupakan HAP terkait kelainan saluran pernapasan dan

sebab lain seperti tromboembolik (Berger dkk., 2012). Diperkirakan di seluruh

dunia terdapat 600.000 bayi lahir setiap tahun dengan PJB dan 50% atau lebih

akan meninggal karena infeksi dan gagal jantung (Adatia dkk., 2010). Tujuh

puluh lima persen HAP yang progresif merupakan HAP terkait PJB (Levy dkk.,

2013). Hipertensi arteri pulmonal dapat ditemukan pada anak dengan PJB non

sianotik dengan pirau kiri ke kanan seperti defek septum ventrikel (DSV), duktus

arteriosus persisten (DAP) dan defek septum atrium (DSA) yang tidak terkoreksi

(Loon dkk., 2009). Delapan puluh persen populasi PJB tinggal di negara

berkembang, dan diperkirakan hanya 2-15% pasien yang mendapat penanganan

kuratif. Sebagian besar pasien dengan pirau kiri ke kanan yang besar akan

mengalami HAP stadium lanjut dan ireversibel pada usia 1 tahun pertama. Dua

puluh persen anak dengan PJB non sianotik tidak dapat dioperasi karena

mengalami HAP stadium lanjut (Loon dkk., 2009). Angka rerata kesintasan HAP

pada anak yang tidak mendapat terapi lebih rendah dibanding pada dewasa yakni



0,8 dibanding 2,8 tahun (D'Alonzo dkk., 1991). Sedangkan angka kesintasan 5

tahun HAP pada anak yang mendapat terapi dapat mencapai 74 6% (Barst dkk.,

2012). Di Indonesia, sarana dan prasarana masih sangat terbatas, tindakan kuratif

terhadap defek anatomis seringkali tertunda. Pada beberapa kasus bahkan tidak

lagi operabel karena pasien sudah jatuh ke kondisi yang lebih berat karena telah

terjadi HAP stadium lanjut yang menyebabkan remodeling miokardium dan

berujung kegagalan jantung. Untuk itu upaya perlambatan progresifitas HAP

secara medikamentosa selama menunggu terapi definitif sangat diperlukan untuk

menurunkan morbiditas dan mortalitas.

Terapi alternatif bahan alami telah menjadi trending topic dalam penanganan

penyakit kronis, termasuk HAP. Salah satu terapi menggunakan bahan alami

yakni menggunakan ekstrak buah delima (EBD). Dibandingkan dengan calcium

channel blocker, prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat

phospodiesterase yang masing-masing memiliki titik terapi yang berbeda, ekstrak

buah delima memiliki beberapa kelebihan. Ekstrak buah delima memiliki potensi

menghambat sel kanker dengan menginduksi apoptosis. Ekstrak buah delima juga

memiliki efek anti bakteri, anti virus, antioksidan, anti tumor, efek ekstrogenik,

efektif dalam mengurangi risiko penyakit jantung, termasuk low-density

lipoprotein (LDL) oksidasi, memulihkan pengerasan pada dinding arteri,

mengurangi tekanan darah sistolik dengan menghambat serum angiotensin–

converting enzyme (ACE) (Ignarro dkk., 2007; Jurenka, 2008; Kholifah, 2010;

Haber dkk., 2011). Kandungan dalam EBD juga dapat berfungsi sebagai anti

proliferasi dan anti inflamasi pada penyakit kardiovaskular, serta anti fibrotik hati



pada tikus model (Seeram dkk., 2005; Yuniarti dkk., 2013; Javanmard dan Rafiee,

2015; Haber dkk., 2011). Terapi obat–obatan yang mempengaruhi penanda

inflamasi dan proliferasi seperti TGF-β, endotelin-1, Connective Tissue Growth

Factor (CTGF), angiotensin II dan Platelet derived growth factors (PDGF) telah

dimengerti sebagai anti fibrotik (Leask, 2010). Selain itu pada studi yang telah

dilakukan, buah delima dikatakan tidak memili efek samping sehingga aman

digunakan sebagai terapi alternatif (Vidal dkk., 2003; Jurenka, 2008). Oleh

karena itu penelitian ini dilakukan untuk melihat efektifitas ekstrak buah delima

terhadap proses fibrosis akibat HAP khususnya pada miokardium Vka.

Penelitian ini tergolong invasif oleh karenanya diperlukan hewan mdel

sebagai subjek penelitian. Hewan model yang paling sering digunakan secara luas

untuk memelajari HAP yakni tikus yang diinduksi hipoksia kronis dan tikus yang

diinduksi monokrotalin (Kolettis dkk., 2007) Penelitian ini menggunakan tikus

yang diinduksi monokrotalin sebagai model hipertensi arteri pulmonal. Cara ini

dianggap lebih mudah dibandingkan membuat hipoksia menggunakan ruangan

hipobarik (Voelkel dan Tuder, 2000).



1.2 Rumusan Masalah

a. Apakah pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi

TGF-β1 pada ventrikel kanan tikus model hipertensi ateri pulmonal.

b. Apakah pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi

kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Membuktikan bahwa fibrosis ventrikel kanan akibat HAP dapat dihambat

dengan pemberian ekstrak buah delima.

1.3.2 Tujuan Khusus

a. Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima dapat

menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada ventrikel kanan

tikus model hipertensi ateri pulmonal.

b. Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima menurunkan

jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model

hipertensi arteri pulmonal.



1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Teori

Memperoleh bukti bahwa ekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada

ventrikel kanan akibat HAP dapat dihambat dengan pemberian ekstrak

buah delima.

1.4.2 Manfaat Praktis

Memberikan sumbangan pustaka tentang efek pemberian ekstrak buah

delima terhadap TGF-β1 dan kolagen tipe I pada otot jantung hewan

model HAP.



BAB II

TINJAUAN KEPUSTAKAAN

2.1 Definisi dan Klasifikasi Hipertensi Arteri Pulmonal

2.1.1 Definisi

Hipertensi arteri pulmonal didefinisikan sebagai rerata tekanan arteri

pulmonal (pPA) saat istirahat melebihi 25 mmHg (Wardle dan Tulloh, 2012).

Definisi konvensional dari HAP grup 1 Dana Classification mencantumkan

systemic mean artery pressure (MAP) melebihi 25 mmHg. Meskipun batas nilai

tahanan vaskuler paru tidak termasuk dalam definisi HAP dewasa, inklusi

tahanan vaskuler paru (TVP) > 3 Wood units x m2 penting dimasukkan pada HAP

anak dengan kelainan jantung kongenital. Anak dengan defek septum ventrikel

(DSV) memiliki tekanan arteri pulmonal yang tinggi dengan aliran yang

bervariasi (Takatsuki dan Dunbar, 2013). Pada anak dengan sirkulasi biventrikuler

definisi HAP sama dengan definisi konvensional. Klasifikasi Panama

menyertakan anak dengan single ventricle dan cavopulmonary anastomosis. Pada

kasus tersebut terjadi peningkatan TVP anastomosis cavopulmonary tanpa

peningkatan tekanan arteri melebihi 25 mm Hg dan pada kasus ini tekanan arteri

melebihi 20 mm Hg sudah membahayakan pasien. Pada kasus tersebut HAP

didefinisikan jika indeks TVP > 3 wood unit x m2 atau gradien transpulmonal > 6

mm Hg. Hipertensi arteri pulmonal juga terlihat dari laju regurgitan melalui katup

trikuspid melebihi 2,8 m/det pada ekokardiografi Doppler. Pada pediatri MAP

bisa mencapai 50 mmHg dan hal ini normal. Oleh karena itu HAP juga dikenali



jika rasio tekanan sistolik arteri pulmonal dibanding tekanan sistolik sistemik

melebihi 0,5 (Takatsuki dan Dunbar, 2013).

2.1.2 Klasifikasi dan Derajat Hipertensi Arteri Pulmonal

Klasifikasi HAP terbaru dikembangkan oleh Pediatric Taskforce of the

Pulmonary Vascular Research Institute pada tahun 2011 di Panama. Klasifikasi

ini mengenali konsep kontribusi kelainan pertumbuhan paru dan perkembangan

HAP pada anak dan menggarisbawahi penyebab multifaktorial seperti kelainan

jantung bawaan, kelainan kromosom, aspirasi kronis,dan kontribusi prenatal

terhadap penyakit paru postnatal. Pada klasifikasi ini HAP terbagi menjadi 10

kategori dari neonatus sampai dewasa. Klasifikasi ini menyediakan klasifikasi

yang lebih komprehensif dari hampir semua penyebab HAP pada anak (Cerro

dkk., 2011).

Tabel 1. Skema 10 Kategori Dasar Hipertensi Arteri Pulmonal pada Anak

Kategori Deskripsi 1 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal prenatal atau perkembangan 2 Maladaptasi vaskuler pulmonal perinatal 3 Penyakit kardiovaskuler pediatrik 4 Bronchopulmonary displasia 5 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal pediatrik terisolasi 6 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal multifaktorial pada sindroma malformasi

kongenital 7 Penyakit paru pediatrik 8 Penyakit tromboembolik pediatrik 9 Paparan hipoksik hiperbarik pediatrik 10 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal pediatrik berhubungan dengan kelainan

sistem lainya Sumber : Cerro M, Abman S, Diaz G, Freudenthal A, Freudenthal F, dan Harikrishnan, 2011. A Consensus Approach to the Classification of Pediatric Pulmonary Hypertensive Vascular Disease: Report from the Pvri Pediatric Taskforce, Panama 2011. Pulm Cir., 1, 286-98.



Derajat keparahan HAP ditinjau dari keterbatasan aktivitas terkait gejala

kegagalan sirkulasi. New York Heart Association dan World Health Organization

masing-masing menetapkan 4 derajat keparahan seperti pada tabel di bawah ini.

Tabel 2. Derajat Hipertensi Pulmonal

A. Klasifikasi Fungsional New York Heart Association

Kelas 1. Tanpa gejala saat aktivitas sehari hari

Kelas 2. Gejala muncul saat aktivitas sehari – hari.

Kelas 3. Gejala muncul dengan aktivitas yang lebih ringan dari aktivitas sehari – hari. Aktivitas tampak jelas terbatas

Kelas 4. Gejala muncul dengan aktivitas apapun bahkan saat istirahat B. Klasifikasi World Health Organization

Kelas I. Pasien dengan hipertensi pulmonal namun tanpa keterbatasan aktivitas. Aktivitas sehari hari tidak menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.

Kelas II. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan sedikit keterbatasan aktivitas. Mereka merasa nyaman saat istirahat. Aktivitas sehari hari menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.

Kelas III. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan keterbatasan aktivitas yang nyata. Mereka merasa nyaman saat istirahat. Aktivitas lebih ringan daripada aktivitas sehari hari menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.

Kelas IV. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan ketidak mampuan untuk melakukan aktivitas apapun . Pasien ini menunjukkan gejala gagal jantung kanan. Sesak maupun kelelahan dapat muncul saat istirahat. Rasa ketidaknyamanan bertambah dengan aktivitas apapun.

Sumber : Lewis, dan Rubin, 2004. Diagnosis and Management of Pulmonary Arterial Hypertension: Accp Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest, 126, 7S–10S.

2.2 Efek Hipertensi Arteri Pulmonal pada Jantung

2.2.1 Ventrikel Kanan Normal

Ventrikel kanan memompa darah dengan stroke volume yang sama dengan

ventrikel kiri, namun dengan upaya 25% lebih rendah dikarenakan rendahnya



tahanan vaskuler paru. Ini sebabnya dinding otot ventrikel kanan lebih tipis

dibanding ventrikel kiri (Vki) (Franco, 2012; Voelkel dkk., 2006).

Gambar 1. Potongan Melintang Ventrikel Normal. RV : Right Ventricle (Ventrikel kanan), LV : Left Ventricle (Ventrikle kiri). Pada potongan melintang, ventrikel kiri tampak elips sedangkan ventrikel kanan tampak menyerupai bulan sabit.

Sumber : Chin K, Hs N, Kim, dan Rubin L, 2005. The Right Ventricle in Pulmonary Hypertension. Coron Artery Dis, 16, 13–18.

Karakteristik kontraksi ventrikel kanan tergantung pada kondisi loading.

Pemendekan longitudinal saat kontraksi lebih berperan dibanding pemendekan

sirkumferensial (aksis pendek). Ventrikel kanan berkaitan dengan ventrikel kiri

melalui septum, serat epikardial yang melingkari keduanya, dan berbagi ruang

perikardial, Baik septum maupun dinding bebas masing-masing berkontribusi

sama terhadap kontraksi (Franco, 2012; Voelkel dkk., 2006).

Suplai darah ventrikel kanan terutama berasal dari arteri koroner kanan,

dan menerima aliran darah dalam jumlah sama pada sistol maupun diastol. Arteri

koroner anterior kiri desenden mensuplai 2/3 bagian septum anterior, dan arteri

desenden posterior mensuplai 1/3 inferoposterior (Chin dkk., 2005).



Gambar 2. Pembuluh Darah Jantung. 1. Aorta asendens, 2. Bulbus aorta, 3. Aurikula kanan, 4. Arteri koronaria kanan, 5. Atrium kanan, 6. Sulkus koronarius, 7. Ventrikel kanan, 8. Aurikula kiri, 9. Trunkus pulmonalis, 10. Ramus sirkumfleksus arteri koroner, 11. Arteri koronaria kiri, 12. Ramus diagonalis arteri koroner kiri. 13. Vena kardiaka magna, 14. Arteri interventrikularis anterior, 15. Sulkus interventrikularis anterior, 16. Ventrikel kiri, 17. Apeks kordis, 18. Vena lupmonalis kanan, 19. Atrium kiri, 20. Vena pulmonalis kiri, 21. Vena oblikua atrium kiri, 22. Sinus koronarius, 23. Vena kardiaka magna, 24. Sulkus koronarius, 25. Vena posterior ventrikel kiri, 26. Vena kardiaka media, 27. Arteri pulmonalis kiri, 28. Vena cava inferior, 29. Atrium kanan, 30. Ramus interventrikularis posterior arteri koronaria kanan, 31. Sulkus interventrikularis posterior, 32. Vena cava superior , 33. Ramus marginalis kanan arteri koronaria kanan, 34. Ramus nodi sinuatrialis arteri koroner kanan, 35. Vena kardiaka minimi, 36. Vena kardiaka parva. Sumber : Rohen J, Yokochi C, dan Lutjen-Drecol E 2010. Atlas Anatomi Manusia, Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran EGC, 262.



Gambar 3. Tampak Dalam Suplai Darah Ventrikel Kanan. RCA : Right coronary artery, RM : Right marginal branch, PD : Posterior descending coronary artery, LMA : Left main coronary artery, LAD : Left anterior descending coronary artery, LCX : Left circumflex coronary artery, OM : Obtuse marginal of the circumflex coronary artery, D : Diagonal branch of the left anterior descending coronary artery, LAD : Left anterior : Descending coronary artery, RV : Right ventricle, AS : Antero septal, A : Anterior, AL : Antero lateral, PL : Postero lateral, P : posterior, PS : Postero septal. Tampak bahwa sebagian besar ventrikel kanan di suplai oleh arteri koroner kanan dan cabangnya. Arteri koroner anterior kiri desenden mensuplai 2/3 bagian septum anterior, dan arteri desenden posterior mensuplai 1/3 inferoposterior. Sumber : Malouf J, Edwards W, Tajik A, dan Seward J 2011. Functional Anatomy of the Heart dalam: Fuster, V., Walsh, R., dan Harrington, R. (eds.) Hurt's the Heart. 13 ed. New York: Mc Graw Hill Medical, 88.

Perubahan kecil pada tekanan di dalam pleura mengakibatkan peningkatan

signifikan venous return dan preload Vka. Hal ini mengakibatkan septum

terdorong ke arah Vki saat diastol. Volume akhir diastolik dari Vki tetap ataupun

berkurang. Peningkatan tekanan pengisian ini berhubungan dengan penurunan

perubahan volume yang disebabkan kemampuan distensi Vki. Oleh karena itu

interaksi diastolik selalu ada, dan interaksi ini cukup besar pengaruhnya pada

patofisiologi (Voelkel dkk., 2006).



2.2.2. Matriks Ekstraseluler Normal Pada Otot Jantung

Pada jantung mamalia dewasa miosit ventrikel tersusun berlapis-lapis oleh

pasangan kardiomiosit. Lapisan yang saling berdekatan dipisahkan oleh celah.

Arsitektur laminar miokardium tampak sebagai jaringan protein matriks

ekstraselular yang rumit, terdiri terutama kolagen fibril. Berdasarkan karakteristik

morfologi, jaringan matriks jantung dapat dibagi lagi menjadi tiga konstituen:

epi- , peri-, dan endomisium. Epimisium ini terletak di permukaan endokardial

dan epikardial memberikan dukungan untuk endotel dan sel mesotelial.

Perimisium mengelilingi serat otot, dan helai perimisial menghubungkan

kelompok serat otot. Endomisium muncul dari perimisium dan mengelilingi serat

otot individu. Penopang endomisial mengikat serat otot bersama-sama dan

berfungsi untuk microvasculature nutrisi mereka dan sebagai tempat koneksi ke

protein sitoskeletal kardiomiosit melintasi membran plasma. Jaringan matriks

jantung berbasis kolagen berfungsi sebagai scaffold komponen seluler dan juga

penting untuk transmisi kekuatan kontraktil. Sekitar 85% dari total kolagen

miokard adalah tipe I, terutama terkait dengan serat tebal yang memberi kekuatan

menarik. Kolagen tipe III mewakili 11% dari total protein kolagen dalam jantung,

biasanya membentuk serat tipis, dan mempertahankan elastisitas jaringan matriks.

Selain kolagen, matriks ekstraselular jantung juga mengandung glikosaminoglikan

(seperti Hyaluronan), glikoprotein, dan proteoglikan. Tempat penyimpanan utama

faktor pertumbuhan laten dan protease juga terdapat dalam matriks ekstraselular

jantung. Jejas menyebabkan faktor pertumbuhan ini aktif dan memicu respons

fibrosis (Kong dkk., 2014).



Fibroblast jantung berada pada endomisial dan merupakan jumlah sel

yang banyak pada otot jantung mamalia. Pada jantung yang sedang berkembang,

fibroblast meregulasi proliferasi kardiomiosit melalui jalur fibronektin. Pada otot

jantung dewasa muda, fibroblast jantung tidak berperan signifikan terhadap

aktifitas proliferasi (Kong dkk., 2014).

Pembuluh darah juga banyak terdapat di intersisium otot jantung.

Sedangkan sel mast dan makrofag terdapat dalam jumlah yang kecil (Kong dkk.,

2014).

2.2.3 Ventrikel Kanan pada Hipertensi Arteri Pulmonal

Hipertensi arteri pulmonal ditandai dengan tingginya tahanan vaskuler

paru dan remodeling vaskuler yang menyebabkan peningkatan afterload Vka dan

gagal jantung kanan (Galie` dkk., 2009). Pada keadaan normal, Vka dapat

mengatasi peningkatan tahanan vaskuler paru. Ventrikel kanan yang normal

tanpa hipertrofi tidak dapat menyebabkan tekanan sistolik arteri pulmonal

melebihi 50 sampai 60 mmHg atau tekanan rata-rata melebihi 40 mmHg. Oleh

karenanya Vka harus hipertrofi untuk dapat mengatasi HAP (Franco, 2012).

Hipertrofi dinyatakan sebagai ketebalan dinding Vka melebihi 7 mm atau massa

Vka melebihi 56 g (Marrone dkk., 2010).

Respons adaptasi inisial hipertrofi miokard meliputi respons maladaptif

dan disfungsi kontraktil yang progresif. Ventrikel kanan menampung darah lebih

untuk kompensasi preload dan mempertahankan stroke volume disamping

pengurangan fraksi pemendekan. Hal ini menyebabkan dilatasi ruang jantung

ventrikel kanan (Franco, 2012). Lemahnya kontraktilitas yang terus berlanjut



dapat menyebabkan gagal jantung kanan yang ditandai dengan peningkatan

tekanan pengisian, disfungsi diastolik, berkurangnya cardiac output, dan semakin

beratnya regurgitasi trikuspid karena dilatasi anular dan jeleknya leaflet

coaptation (Voelkel dkk., 2006). Peningkatan TVP menyebabkan dilatasi arteri

pulmonalis yang progresif. Pembesaran arteri pulmonalis ada HAP biasanya

simetris. Diameter arteri pulmonalis melebihi 40 mm dapat menyebabkan

kompresi arteri koroner utama kiri. Kompresi arteri koroner kanan oleh hipertrofi

miokard juga penyebab lain dari iskemia, yang berhubungan langsung dengan

masa Vka (Franco, 2012).

Dissinkroni ventrikular juga ditemukan pada gagal jantung yang dipicu

HAP (Marrone dkk., 2010). Dissinkroni interventrikular mekanis dapat dikenali

secara klinis dari bulging paradoksal septum ke Vki. Hal ini berhubungan dengan

fungsi sistolik Vka. Dancing septum dan bowing ventrikel ke kiri (D-shaped Vki)

menunjukkan semakin jeleknya prognosis HAP (Franco, 2012). Onset relaksasi

yang terlambat pada Vka relatif dengan Vki disebut dissinkroni dan ini

menyebabkan gangguan sistolik Vki melalui bulging septum (Marcus dkk., 2008).

Keterlambatan pencapaian puncak pemendekan dinding bebas Vka relatif

terhadap Vki dapat dilihat dengan cardiac magnetic resonance (CMR) (Marcus

dkk., 2008). Ventrikel kanan terus berkontraksi sampai hampir 100 milidetik

setelah akhir dari sistolik Vki sampai awal waktu pengisian Vki. Ketidakefisienan

sistol Vka ini mempengaruhi pengisian Vki dengan menggeser septum ke arah

kiri. Perubahan volume Vki dengan bowing dari septum ke kiri mengganggu



pengisian dari Vki dengan mencegah masuknya aliran mitral yang seharusnya

pada saat itu dan berakibat rendahnya cardiac output. (Franco, 2012)

Gambar 4. Perkembangan Hipertensi Arteri Pulmonal. Ventrikel kanan ditandai oleh bentuk bulan sabit dan memiliki diameter yang lebih kecil dibanding Vki. Pada HAP, terjadi peningkatan volume end-systolic dan hipertrofi Vka. Kemudian terjadi perubahan konformasi dari Vka normal menjadi spheric (berbentuk bola) dengan area yang lebih besar disbanding Vki. Bentuk Vka yang lebih spheric menghasilkan fungsi septal yang abnormal dan juga berpengaruh pada performa.

Sumber : Franco V, 2012. Right Ventricular Remodeling in Pulmonary Hypertension. Heart Failure Clin ,8, 403–12.

Meskipun dalam 2 dekade terakhir terdapat kemajuan dalam pemahaman

patologi penyakit vaskular paru dan percobaan terapeutik klinis HAP, namun

ventrikel kanan masih sedikit dipelajari. Mekanisme spesifik yang mendasari

gagal Vka akibat HAP masih belum jelas (Voelkel dkk., 2006). Beberapa hal

yang masih belum jelas antara lain mengapa pada beberapa pasien berkembang

menjadi iskemia miokardial Vka, adanya disfungsi sel endotelial mikrovaskuler,

maupun mekanisme perbaikan Vka yang dilatasi end-staged setelah transplantasi

(Franco, 2012; Ritchie dkk., 1993).



2.2.4 Fibrosis Otot Jantung pada Hipertensi Arteri Pulmonal

Jaringan jantung disusun oleh komponen seluler dan ekstraseluler.

Kompartemen seluler utama yakni kardiomiosit yang bertanggung jawab pada

kontraktilitas jantung. Kompartemen ekstraseluler meliputi sel endotelial kapiler,

fibroblast, sel monositik dan sel-sel pembuluh darah dari arteri dan vena koroner.

Fibroblast mensintesis komponen matriks ekstraseluler utama yakni kolagen I dan

II. Gangguan regulasi dari seintesis dan atau degradasi matriks seluler dapat

menyebabkan disfungsi jantung dan gagal jantung (Nicoletti dan Michel, 1999).

Fibrosis didefinisikan sebagai peningkatan konsentrasi kolagen pada organ

dan terutama didominasi oleh kolagen I dan III (Lez dkk., 2004). Fibrosis

merupakan respons patofisiologis dari jaringan akibat jejas kronis. Remodeling

jaringan merupakan mekanisme protektif untuk menghadapi stres dan jejas

dengan tujuan untuk memelihara integritas fungsional organ dan sistem. Namun

deregulasi dari proses penyemuhan dan berlanjutnya paparan terhadap jejas kronis

menyebabkan fibrosis jaringan, penumpukan matriks ekstraseluler, pembentukan

scar, dan gagal organ (Kisseleva dan Brenner, 2008; Fan dkk., 2012).

Pada remodeling miokard akibat volume overload seperti pada hipertensi

arteri pulmonal terjadi hipertrofi miosit, aktivasi dan hiperplasia fibroblast serta

deposisi kolagen ekstraseluler, terutama kolagen tipe I (Nicoletti dan Michel,

1999). Selama kondisi ini matriks ekstraseluler berekspansi karena reaktif dan

reparatif fibrosis (Brilla dan Weber, 1992). Kolagen I dan III awalnya

berakumulasi di sekitar arteri koroner dan fibrosis meluas diantara kardiomiosit.

Proses ini dikenal sebagai reaktif fibrosis perivaskuler dan intersisial (Nicoletti



dan Michel, 1999; Kai dkk., 2005). Penebalan matriks ekstraseluler ini

menurunkan suplai energi sementara otot jantung bekerja lebih berat untuk

melawan hipertensi. Ketidakseimbangan suplai dan kebutuhan ini menyebabkan

kematian sel baik melalui nekrosis maupun apoptosis. Fibroblast di sekitar sel

yang mati akan mensintesis matriks baru untuk mengganti sel yang mati dan

membentuk mikroscar maupun scar tergantung ukuranya. Proses ini disebut

fibrosis reparatif (Nicoletti dan Michel, 1999). Remodeling matriks ekstraselular

merupakan komponen kunci. Gangguan struktur matriks ekstraselular

menyebabkan gangguan hubungan sel miokardial dan pembuluh darah sehingga

mempengaruhi integritas struktural dan fungsi jantung. Ekses produksi dan

akumulasi matriks ekstraselular terutama kolagen disebut fibrosis dan hal ini

meningkatkan kekakuan miokardium serta menghalangi kontraksi dan relaksasi

ventrikel. Hal ini menyebabkan gangguan fungsi sistol dan diastol yang memicu

gagal jantung dan kematian (Fan dkk., 2012). Penumpukan kolagen terutama

kolagen tipe I pada matriks ekstraselular menandai adanya proses fibrosis (Lez

dkk., 2004). Proses ini didahului dengan produksi kolagen berlebihan akibat

aktivasi dan proliferasi miofibroblast. Deferensiasi fibroblast menjadi

miofibroblast dipromotori oleh TGF-β (Fan dkk., 2012). Transforming Growth

Factor -β1 (TGF-β1) merupakan isoform utama dalam proses fibrosis (Border

dan Noble, 1994). Transforming growth factor -β1 dan kolagen tipe I merupakan

penanda penting dalam proses remodeling ventrikel kanan. Evaluasi kadar TGF-

β1 dan kolagen tipe I dapat dijadikan dasar petunjuk terjadinya proses fibrosis di

jaringan.



Terdapat tiga mekanisme awal yang mempengaruhi terjadinya fibrosis

kardiak pada hipertensi arteri pulmonal (Nicoletti dan Michel, 1999) :

1. Stimulus hemodinamik

2. Sistem Renin-angiotensin-aldosteron

3. Inflamasi

2.2.4.1 Pengaruh Stimulus Hemodinamik dan Sistem Renin-Angiotensin

dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Hipertensi arteri pulmonal memiliki karekter remodeling pembuluh darah

yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri pulmonal dan

jantung kanan. Sebagai konsekuensinya pasien dengan HAP sering memiliki

cardiac output yang rendah (Handoko dkk., 2010). Pada keadaan ini sistem renin-

angiotensin-aldosteron (SRAA) dan sistem saraf simpatis menjadi aktif untuk

mempertahankan tekanan darah (Man dkk., 2012; Pacurari dkk., 2014). Selain itu,

volume overload pada ventrikel kanan secara langsung menyebabkan makrofag

dan fibroblast yang berinfiltrasi di jantung memproduksi renin dan angiotensin-

converting enzyme (ACE) secara lokal yang merupakan stimulan yang poten

untuk fibroblast baik secara langsung maupun melalui efek perantara TGF-β1

(Kong dkk., 2014).

Renin adalah sebuah enzim proteolitik yang aktif yang awalnya disintesis

sebagai bentuk prephorohormon inaktif (prorenin) (Pimenta dan Oparil, 2009).

Reseptor pro renin berada pada sel mesangeal, otak, jantung, hati, pankreas,

ginjal, paru, otot rangka, plasenta, retina, pembuluh darah, dan kardiomiosit

(Campbell, 2008). Pada bentuk aktifnya, renin akan mengkatalisa pembentukan



angiotensinogen menjadi angiotensin I. Selanjutnya angiotensin I akan diubah

menjadi angiotensin II oleh ACE (Pimenta dan Oparil, 2009). Angiotensin II

diproduksi oleh makrofag dan fibroblast yang teraktivasi dan akan

menginduksi aktifitas Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen (NADPH)

oksidase, menstimulasi TGF-β1 dan memicu proliferasi fibroblast dan

deferensiasi menjadi collagen – secreting myofibroblasts (Rosenkranz, 2004;

Wynn, 2008). Angiotensin II juga meningkatkan sinyal TGF-β1 dengan

meningkatkan kadar mothers against decapentaplegic homolog 2 (SMAD2) dan

memperbesar translokasi dari SMAD3 terfosforilasi (Wynn, 2008). Transforming

growth factor -β1 kemudian akan memperbesar produksi kolagen intersisial,

fibronektin, dan proteoglikan oleh miofibroblast kardiak (Tomasek dkk., 2002).

Transforming growth factor -β1 juga menstimulasi produksinya sendiri di

miofibroblast, dan dengan demikian menetapkan siklus autokrin dari diferensiasi

dan aktvasinya. Studi menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari TGF-β1 pada

tikus dapat memicu terjadinya hipertrofi yang mempunyai ciri fibrosis intersisial

dan hipertrofi miosit jantung (Rosenkranz dkk., 2002).

Aldosterone berperan dalam pembentukan fibrosis ventrikel kanan dengan

memicu efek pro inflamasi pada sel vaskuler sehingga menghasilkan sitokin dan

kemokin. Aldosteron juga mengendalikan makrofag menjadi fenotip fibrogenik,

dan juga mengaktifkan sinyal fibrogenik pada kardiomiosit. Aldosteron juga

memiliki efek langsung terhadap aktivasi dan proliferasi fibroblast (Kong dkk.,

2014).



2.2.4.2 Peran Inflamasi dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Reaksi Inflamasi terbukti terjadi pada jantung yang mengalami overload

(Nicoletti dkk., 1996 ). Dalam proses inflamasi ini makrofag dan sel T

mengeluarkan sitokin–sitokin yang dapat beraksi pada sel otot jantung.

Metabolisme dan proliferasi fibroblast serta miosit seperti pada perubahan

matriks ekstraseluler merupakan target dari molekul-molekul ini. Namun sitokin

ini juga memperkuat atau menghambat respons inflamasi melalui feedback

melalui agen kemoatraktif maupun agen anti inflamasi. Sitokin-sitokin tersebut

antara lain TGF-βs, PDGFs, Tumor Necrosing Factors (TNFs), Interferones

(IFNs), Interleukins (ILs) .(Nicoletti dan Michel, 1999)

2.2.4.2.1 Peran TGF-βs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Transforming growth factor β merupakan suatu agen profibrotik juga

mediator imunomodulasi (Nicoletti dan Michel, 1999; Blanchette dkk., 1997;

Zhao dkk., 2008 ). Transforming growth factor β terdiri dari 5 molekul yakni

TGF-β1 sampai TGF-β5 membentuk dimer 25 kilodalton (kDa). Molekul-molekul

ini dilepaskan dalam bentuk inaktif laten. Pada matriks ekstraseluler ia berikatan

dengan dekorin. Ia harus dipecah untuk menjadi bentuk yang aktif (Nicoletti dan

Michel, 1999). TGF-β juga meregulasi sendiri ekspresi converting enzyme-nya

yakni furin (Blanchette dkk., 1997).

Transforming growth factor β dapat disintesis oleh otot polos, makrofag,

limfosit B dan T. Pada neonatus dan orang dewasa TGF-βs disintesis di

kardiomiosit dan memiliki aksi autokrin dan parakrin (Nicoletti dan Michel,



1999). Pada kasus hipertrofi otot jantung karena stenosis aorta, terbukti juga

bahwa TGF-βs juga dipengaruhi kadar peningkatanya oleh fibroblast.

Transforming growth factor-β dapat menghambat respons proliferatif

koloni yang dipengaruhi faktor stimulus sel hematopoitik. Namun TGF-βs juga

mempunyai efek inhibisi terhadap proliferasi sel B dan T dan menurunkan

immunoglobulin M dan G oleh limfosit B yang teraktivasi. Efek hambatan pada

sel T adalah pada autokrin maupun parakrin. Transforming growth factor β

menghambat respons proliferatif dan diferensiasi sel imunokompeten (Nicoletti

dan Michel, 1999; Zhao dkk., 2008 ). Beberapa studi menunjukkan bahwa TGF-

βs memiliki efek proinflamasi dan kemoatraktif terutama terhadap monosit.

Transforming growth factor β dapat menginduksi produksi IL-1, PDGFs, FGFs,

dan TNFs melalui monosit. Transforming growth factor β juga dapat menginduksi

matriks ekstraseluler dan menurunkan aktifitas enzim protease, menstimulasi

ekspresi fibronektin dan kolagen (Ignotzand dan Massague, 1986; Nicoletti dan

Michel, 1999). Transforming growth factor β juga menginduksi sintesis inhibitor

jaringan terhadap metaloprotease prokolagenase (Nicoletti dan Michel, 1999;

Edwards dkk., 1987). Transforming growth factor β merupakan isoform paling

penting dalam proses pembentukan fibrosis (Border dan Noble, 1994).



Gambar 5. Efek Selular TGF-Β Pada Fibrosis Otot Jantung. Transforming growth factor β dapat menstimulasi hipertrofi kardiomiosit, memproduksi mediator fibrogenik, aktivasi dan proliferasi fibroblast, serta mengaktifkan makrofag dan limfosit. Sumber : Kong P, Christia P, G N, dan Frangogiannis, 2014. The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis. Cell. Mol. Life Sci, 71, 549–74. 2.2.4.2.2 Peran PDGFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Platelet derived grow factors merupakan protein sebesar 30 kDa yang

pertama dimurnikan dari platelet α-granules. Platelet derived grow factors

tersusun dari 2 subunit, A dan B, membentuk homodimer atau heterodimer : AA,

BB atau AB. Ia disintesis oleh fibroblast, sel endotelial, otot polos pembuluh

darah, dan makrofag. Fungsi utamanya yakni untuk menstimulasi proliferasi sel

dan migrasi. Efek dari faktor pertumbuhan ini masih sedikit dipelajari. Platelet

derived grow factor-BB merubah profil limfokin yang dihasilkan oleh sel T yang

teraktivasi . Platelet derived grow factor-BB dapat menginduksi fibroblast dan

mitosis miosit dan PDGF-AA merupakan mitogen poten terhadap fibroblast

jantung. (Nicoletti dan Michel, 1999).



2.2.4.2.3 Peran IFN dan TNFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Interferon merupakan sitokin pleiotropic yang memiliki aktivitas sebagai

anti virus dan anti tumor, menghambat proliferasi sel, stimulasi ekspresi antigen

membran (reseptor untuk immunoglobulin, Major Histocompatibility Complex

(MHC)), dan menstimulasi fungsi sitotoksik dari makrofag dan limfosit.

Interferon terdiri dari 4 anggota yakni tipe I diwakili oleh IFN-α, -β,-ω, dan tipe II

oleh IFN-γ. Interferon -β diproduksi oleh fibroblast, sedang IFN- α dan IFN -ω

oleh limfosit. Interferon - α juga disintesis oleh monosit (Nicoletti dan Michel,

1999). Interferon -γ juga berfungsi untuk menurunkan sintesis matriks

ekstraseluler dan meningkatkan sintesis metalloproteinase pada fibroblast manusia

(Clark dkk., 1989; Sciavolinol dkk., 1994; Nicoletti dan Michel, 1999).

Tumor Necrosing Factors (TNFs) terdiri dari 2 yakni TNF-α dan TNF-β

(limfotoksin). Tumor Necrosing Factor-α diproduksi oleh sel radang, fibroblast,

sel otot polos dan sel endotelial. Faktor ini disebut faktor proinflamasi dan dapat

menginduksi beberapa mediator seperti IL-1, IL-6, MCP-1, PDGF, TGF–β, dan

Nitric Oxide Synthase (NOS). Pada fibroblast, TNFs dapat menginduksi

kolagenase dan menurunkan produksi kolagen dan fibronektin. Tumor Necrosing

Factors dapat menginduksi produksi Nitric Oxide (NO) dan ekspresi MHC klas I

yang pada akhirnya akan menurunkan permeabilitas endotel (Nicoletti dan

Michel, 1999).

Pada kondisi gagal jantung TNFs terkspresi sebagai respons terhadap

overload hemodinamik. Tumor Necrosing Factors dapat memicu respons

pertumbuhan hipertrofi pada miosit jantung (Yokoyama dkk., 1997). Tumor



Necrosing Factors juga dapat menginduksi infiltrasi sel imun ke miokardium

selama hipertensi dikarenakan TNFs merupakan stimulator sistem imun yang

poten (Nicoletti dan Michel, 1999). Tumor Necrosing Factors juga menginduksi

apoptosis kardiomiosit. Hal ini diduga sebagai sebab anti TNF antibodi

meningkatkan pemulihan miokard setelah iskemia dan reperfusi (Gurevitch dkk.,

1997).

2.2.4.2.4 Peran ILs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Interleukin -1 merupakan sitokin yang memiliki ciri khusus yakni

disimpan di dalam sel. Sel inflamasi dan fibroblast memiliki kapasitas untuk

memproduksi IL-I. Beberapa faktor yang dapat menstimulasi produksi IL-1 yakni

IFNs, TNFs, IL-2, komponen komplemen, MHC klas I dan IL-1 itu sendiri.

Interleukin -1 dapat mengatur respons imun spesifik dan dapat menginduksi atau

menghambat replikasi sel. Pada beberapa proses fibrosis, IL-1 diproduksi secara

berlebihan (Nicoletti dan Michel, 1999).

Interleukin -6 merupakan glikoprotein sebesar 26 kDa yang disekresi oleh

sel yang teraktivasi seperti makrofag, limfosit T dan B, natural killer cell (NK

cell), fibroblast, sel endotelial, dan otot polos pembuluh darah. Pelepasan IL-6

dipengaruhi oleh sitokin lain seperti IL-1 atau TNFs. Interleukin -6 dapat beraksi

pada sel yang berbeda. Contohnya yakni IL-6 meningkatkan sintesis

imunoglobulin dari sel B teraktivasi. Interleukin -6 dapat mengaktivasi fibroblast

dan menginduksi hipertrofi otot polos pembuluh darah (Nicoletti dan Michel,

1999). Interleukin -6 juga menstimulasi sintesis PDGF pada otot polos pembuluh

darah. Pada makrofag, sintesis IL-6 dihambat oleh TGF-βs, IL-4 dan IL-10. Kadar



IL-6 meningkat selama infeksi, infark miokard dan pembedahan. Peningkatan

kadar TNF dan IL-6 telah terbukti berhubungan dengan gagal jantung

(MacGowan dkk., 1997; Nicoletti dan Michel, 1999).

2.2.4.2.5 Peran Makrofag dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Pada proses fibrosis otot jantung terjadi infiltrasi sel-sel radang

yang spesifik terhadap antigen. Makrofag yang merupakan antigen presenting

cells (APC) mengekspresi molekul MHC klas II pada area perivaskuler. Molekul

ini terekspresi apabila sebuah antigen diproses. Peptida di dalam antigen dipilih

dan komplek MHC klas II dipresentasikan di permukaan APC. Kompleks ini

kemudian dikenali oleh sel T. Setelah pengenalan, sel T akan berplofireasi dan

memproduksi sitokin, dan mempunyai potensi untuk terjadi fibrogenesis

(Nicoletti dan Michel, 1999).



Gambar 6. Hubungan Antara Fibrosis, Inflamasi , Dinding Pembuluh Darah, dan Hipertrofi Otot Jantung. Anak panah menandakan efek positif sitokin - sitokin utama yang berpengaruh terhadap fibrosis dan inflamasi dan sel - sel yang berpotensi dan garis berakhir dengan tanda minus menunjukkan efek negatif. Sel inflamasi memiliki potensi untuk meregulasi sel residen. Sel residen juga tidak tinggal diam, mereka juga berkomunikasi dengan sel inflamasi dan mengirim sinyal untuk menarik sel inflamasi ke jantung sebagai respons terhadap stres hemodinamik, hormon dan peptida-peptida. Sumber : Nicoletti A, dan Michel J-B, 1999. Cardiac Fibrosis and Inflamation: Interaction with Hemodynamic and Hormonal Factors. Cardiovasc Research, 41, 532-43.

2.2.4.3 Peran Spesies Oksigen Reaktif dalam Pembentukan Fibrosis Otot

Jantung

Selain ketiga mekanisme awal diatas, stres oksidatif juga terlibat dalam

patogenesis fibrosis jantung melalui aksi langsung dan melalui keterlibatan

sitokin dan sinyal faktor pertumbuhan. Spesies oksigen reaktif (SOR) juga

merupakan mediator kunci efek induksi sitokin dan angiotensin-II pada fibroblast

(Cheng dkk., 2003; Kong dkk., 2014). Pada tikus dewasa, produksi kolagen yang

dstimulasi angiotensin II dimediasi melalui generasi SOR (Kong dkk., 2014).

Pada penelitian menggunakan tikus yang diberikan infus angiotensin II, penanda

berperannya superoksidan dalam pembentukan fibrosis jantung yakni dengan



ditemukanya gp91phox (suatu subunit NADPH oksidase) pada ruang perivaskuler

secara mikroskopik pada jejas/fibrosis ventrikel. Hal ini menunjukkan bahwa

SOR diregulasi di jantung. Produksi angiotensin II juga meningkat di daerah

jantung yang mengalami fibrosis, membuktikan bahwa angiotensin II juga

berperan dalam stres oksidatif jantung. Angiotensin II terbukti menstimulasi

NADPH oksidase (Zhao dkk., 2008 ). Sebaliknya SOR akan mengaktifkan sistem

renin angiotensin aldosterone (Tanaka dan Shimizu, 2012). Efek dari angiotensin

tergantung pada SOR. Angiotensin II mengaktifkan down stream kinase sensitif

SOR yang sangat penting dalam mediasi remodeling fibrosis jantung (Ohtsu dkk.,

2005; Kong dkk., 2014). Spesies oksigen reaktif langsung mengatur kuantitas dan

kualitas matriks ekstraselular interstitial dengan memodulasi ekspresi protein

matriks dan metabolisme, baik berupa efek matrix-preserving maupun matrix-

degrading. Peningkatan stres oksidatif mengaktifkan matriks metalloproteinase

(MMPs) dan mengurangi sintesis kolagen fibril di fibroblast jantung (Siwk dkk.,

2001; Kong dkk., 2014). Transforming growth factors -β juga diaktifkan oleh

SOR dan dapat meningkatkan deposisi matriks ekstraselular dalam interstitium

jantung.(Zhao dkk., 2008 )



Gambar 7. Jalur Regulasi Fibrosis Otot Jantung Terkait Angiotensin dan Stres Oksidatif . Peningkatan sirkulasi angiotensin II memicu terjadinya stres oksidatif. Stres oksidatif akan meningkatkan sintesis TGF-β1 sehingga memicu proliferasi miofibroblast sintesis kolagen dan menurunkan menghambat degradasi kolagen sehingga terjadi penumpukan kolagen yang disebut sebagai keadaan fibrosis otot jantung.

Sumber : Zhao W, Zhao T, Chen Y, Ahokas R, dan Sun Y, 2008 Oxidative Stress Mediates Cardiac Fibrosis by Enhancing Transforming Growth Factor-Beta1 in Hypertensive Rats. Mol Cell Biochem 317, 43–50. 2.2.4.4 Peran Kolagen dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Kolagen merupakan jaringan penghubung (connective tissue) yang

bertanggung-jawab pada struktur dan fungsi miokard. Pada otot jantung, kolagen

disintesis oleh fibroblast yang teraktivasi menjadi secreting myofibroblast (Fan

dkk., 2012). Sintesis kolagen berkurang seiring bertambahnya umur (Raghu dkk.,

1989). Terdapat 3 kelompok besar kolagen yakni fibrillar collagens, fibril-

associated collagens, dan sheet-forming collagens yang masing masing memiliki

fitur struktural dan jaringan representatif sendiri seperti tampak pada gambar 8

(Kuhn, 1987). Pada proses fibrosis ventrikel kanan akibat HAP terjadi

penumpukan kolagen terutama kolagen tipe I dan III dan hal ini meningkatkan



kekakuan miokardium serta menghalangi kontraksi dan relaksasi ventrikel. Hal ini

menyebabkan gangguan fungsi sistol dan diastol yang memicu gagal jantung dan

kematian (Fan dkk., 2012)

Tabel 3. Tipe Kolagen

Terdapat 3 kelompok besar kolagen. Kolagen tipe I dan III merupakan fibrilar kolagen dan banyak ditemukan pada matriks ekstraseluler otot jantung yang mengalami fibrosis. Sumber : K Kuhn, 1987, in R Mayne and R Burgeson, eds., Structure and Function of Collagen Types, Academic Press, 2; M van der Rest and R Garrone, 1991, FASEB J 5:2814.

Tipe Komposisi Molekul Fitur Struktural Jaringan Representatif

Fibrilar Collagens I [α1(I)]2[α2(I)] 300-nm-long fibrils Kulit,tendon, tulang,

ligamen, dentin, jaringan interstitial

II [α1(II)]3 300-nm-long fibrils Kartilage, vitreous humor

III [α1(III)]3 300-nm-long fibrils; sering bersama tipe I

Kulit, otot, pembuluh darah

V [α1(V)]3 390-nm-long fibrils with globular N-terminal domain; sering bersama tipe I

Sama dengan tipe I ; juga pada kultur sel, jaringan fetus

Fibril-Associated Collagens VI [α1(VI)][α2(VI)] Asosiasi Lateral dengan tipe I ;

periodic globular domains Kebanyakan jaringan interstitial

IX [α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)]

Asosiasi Lateral dengan tipe II; N-terminal lobular domain; bound glycosaminoglycan

Cartilage, vitreous humor

Sheet-Forming Collagens IV [α1(IV)]2[α2(IV)] Two-dimensional network Lamina basalis

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/mcb/A7315/def-item/A7459/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/mcb/A7315/def-item/A7459/



2.2.4.5 Peran Kolagenase dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung

Pembentukan fibrosis melibatkan dua proses penting yakni sintesis dan

degradasi matriks ekstraseluler. Pada keadaan normal terjadi keseimbangan antara

keduanya, dan pada keadaan abnormal terjadi ketidakseimbagan sehingga

menghasilkan penumpukan matriks ekstraseluler yang disebut fibrosis. Kedua

proses tersebut melibatkan kolagenase yakni MMPs dan tissue inhibitor of

metalloproteinase (TIMPs) sebagai inhibitornya (Fan dkk., 2012). Matriks

metalloprotease juga disebut matriksin, merupakan proteinase utama dalam

degradasi matriks ekstraseluler (Nagase dkk., 2006). Terdapat 5 golongan besar

MMPs, yaitu (Nagase dkk., 2006) :

1. Kolagenase ; Terdiri dari kolagenase intersisial atau kolagenase 1

(MMP-1), kolagenase netrofil atau kolagenase 2 (MMP-8), kolagenase

3 (MMP-13), kolagenase 4 atau xenopus MMP-18). Kolagenase

memecah kolagen intersisial I, II, dan III menjadi ¾ dan ¼ bagian

namun mereka dapat mencerna molekul matriks ekstraseluler lain dan

protein yang larut.

2. Gelatinase ; Terdiri dari gelatinase A (MMP-2) dan gelatinase B

(MMP-9). Ia mencerna gelatin dengan bantuan fibronektin tipe II yang

terikat gelatin atau kolagen

3. Stromelisin ; Stromelisin 1 (MMP-3), stromelisin 2 (MMP-10).

Fungsinya hampir sama dengan kolagenase namun tidak memecah

kolagen intersisial.



4. Matrilisin ; Matrilisin 1 (MMP-7), matrilisin 2 (MMP-26), Stromelisin

3 (MMP-11). Matrilisin 1 disintesis di sel epitel dan disekresi melalui

apexnya. Matrilisin 2 diekspresi pada sel normal seperti endometium

dan beberapa karsinoma.

5. Membran-type MMPs ;

a. Tipe transmembran ; MT1-MMP (MMP-14), MT2-MMP

(MMP-15), MT3-MMP (MMP-16), MT5-MMP (MMP-24).

Semua selain MMP-17 dapat mengaktivasi proMMP-2, dan

MMP-14 memiliki aktifitas kolegenolitik terhadap kolagen I,

II, dan III.

b. GPI (glycosylphophatidylinositol) –anchored ; MT4-MMP

(MMP17), MT6-MMP (MMP-25)

6. Lainya ; Machrophage etalase (MMP-12, MMP-19), Enamelisin

(MMP-20, MMP-21), CA-MMP (MMP-23, MMP-27), Epilisin

(MMP-28). Machrophage etalase mencerna elastin. Enamelistin

mencerna amelogenin, dan epilisin terekspresi pada paru, plasenta,

jantung, saluran gastrointestinal, dan testis.

Tissue inhibitor of metalloproteinase merupakan kelompok protein

sekretori yang mampu menghambat aktifitas MMPs melalui ikatan kovalen pada

ruang ekstraseluler. Terdapat 4 sub famili yang telah diidentifikasi pada

vertebrata, yakni TIMP-1, -2, -3, dan -4. Protein ini diekspresikan oleh berbagai



jaringan pengaturannya terjadi saat terjadi proses fibrosis dan remodeling jaringan

(Iradale, 2001).

2.3 Terapi Hipertensi Arteri Pulmonal dan Fibrosis Otot Jantung

Terapi farmakologis HAP saat ini mentargetkan jalur prostasiklin,

endotelin, dan phosphodiesterase-5. Titik akhir kelas terapi ini adalah vasodilatasi

arteri pulmonalis (Raja dan Raja, 2011). Obat golongan ini meliputi Calcium

channel blocker (CCB), prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat

posphodesterase 5. Semua terapi ini memiliki efek vasodilatasi arteri pulmonal.

Calcium chanel blocker juga memiliki efek antiproliferatif (Chin dan Rubin,

2008). Studi 30 tahun terakhir menunjukkan bahwa peningkatan sirkulasi hormon

angiotensin II dan endotelin-1 , serta sitokin fibrogenik seperti TGF-β, faktor

pertumbuhan jaringan CTGF dan PDGF merupakan kunci menuju fibrosis.

Hormon dan sitokin ini mengaktifkan sel mesenkimal fibroblast pada jaringan.

Fibroblast yang aktif dinamakan miofibroblast karena mengekspresikan protein

kontraktil α-smooth muscle actin (α-SMA). Hambatan terhadap kinerja hormon

dan sitokin tersebut menjadi kunci hambatan berkembangnya fibrosis jaringan

(Leask, 2010).

2.3.1 Calcium Channel Blocker

Calcium channel blocker merupakan terapi pilihan pada HAP yang

respons terhadap vasodilator. Pada pasien dengan tekanan arteri pulmonal lebih

dari 40 mmHg tidak dipertimbangkan sebagai terapi jangka panjang meski

didapatkan penurunan tekanan arteri pulmonal sekitar 20% karena seringnya

terjadi kegagalan terapi (Chin dan Rubin, 2008).



Calcium channel blocker menurunkan kejadian fibrosis otot jantung terkait

hambatannya terhadap masuknya Ca2+ melalui kanal kalsium tipe L yang sensitif

voltase menuju fibroblast dan memodulasi sintesis kolagen (Sandmann dkk.,

2001). Calcium channel blocker juga memodulasi efek faktor mitogenik seperti

endotelin dan aldosterone pada fibroblast yang berakhir pada berkurangnya

produksi kolagen I dan II (Sandmann dkk., 2001) Pelepasan angiotensin II juga

diregulasi oleh mekanisme kanal kalsium tipe T (Nuisson dkk., 1995) Hal ini

menjelaskan bahwa hambatan fibrosis perivaskuler oleh CCB dijelaskan melalui

pencegahan angiotensin II atau proliferasi yang diinduksi endotelin. Hambatan

terhadap kinerja hormon dan sitokin tersebut menjadi kunci hambatan

berkembangnya fibrosis jaringan (Sandmann dkk., 2001).

Efek samping CCB meliputi vasodilatasi, inotropik negatif, gangguan

konduksi, gangguan gastrointestinal, gangguan metabolik, dan interaksi obat.

Gejala vasodilatasi umumnya yakni pusing, palpitasi, edema perifer, sering

muncul pada penggunaan nifedipine. Efek Inotropik negatif berturut-turut mulai

yang terbesar adalah pada penggunaan verapamil, diltiazem, dan nifedipine. Obat

obat ini juga kontraindikasi pada penyakit dengan AV blok derajat II dan III,

sindroma sick sinus, dan gagal jantung yang berat. Verapamil dan diltiazem

memiliki efek signifikan pada sistem konduksi jantung. Mual dan konstipasi

sering ditemukan pada penggunaan verapamil. Ketiga obat tersebut pada dosis

tiinggi dapat menghambat pelepasan insulin (Russell, 1988).



2.3.2 Analog Prostasiklin

Prostasiklin merupakan produk dari asam arakidonat yang mempromotori

vasodilatasi dan menghambat proliferasi vaskuler dan agregasi platelet (Chin dan

Rubin, 2008). Pasien HAP mengalami kekurangan produksi prostasiklin (PGI2)

(Christman dkk., 1992). Epoprosterenol merupakan sintetik prostasiklin yang

pertama disetujui Food and Drug Administration. Epoprosterenol merupakan

terapi pilihan pada pasien yang membutuhkan peningkatan kapasitas latihan,

hemodinamik, dan kualitas hidup dan meningkatkan angka kesintasan pada

sebuah studi (Barst dkk., 1996). Analog prostasiklin tersedia dalam bentuk

intravena, inhalasi,dan oral (Chin dan Rubin, 2008).

Pada studi in vitro, analog prostasiklin menunjukkan supresi ekspresi

kolagen pada fibroblast jantung (Yu dkk., 1997). Pada penelitian menggunakan

tikus model defisit reseptor prostasiklin, fibrosis jantung akibat overload juga

meningkat akibat tidak adanya sinyal reseptor prostasiklin (Francois dkk., 2005).

Pada fibroblast kulit, aktivasi reseptor prostasiklin menghambat ekspresi kolagen

dengan berfungsi sebagai antagonis TGF-β yang terinduksi extracellular signal–

regulated kinase (ERK) (Stratton dkk., 2002). Namun mekanisme pastinya pada

fibroblast jantung masih belum jelas (Chan dkk., 2010)

Efek samping prostasiklin terutama terkait efek vasodilatasi seperti

hipotensi, nyeri kepala, mual, flushing, dan pusing. Obat golongan ini juga dapat

menyebabkan trombositopenia (Duarte dkk., 2013).



2.3.3 Antagonis Endotelin

Endotelin-1 merupakan vasokonstriktor dan mitogen pada vaskuler paru

dan sistemik (Chin dan Rubin, 2008). Endotelin meningkatkan sintesis kolagen I

dan III serta fibronektin (Rizvi dkk., 1996; Marini dkk., 1996). Endotelin juga

menginduksi ekspresi faktor pertumbuhan jaringan (Shi-wen dkk., 2004).

Meskipun diproduksi secara lokal , kadar endotelin-1 sistemik meningkat pada

HAP dan berkorelasi dengan derajat keparahan (Giaid dkk., 1993). Dua antagonis

endotelin yaitu bonsetan dan ambrisentan telah disetujui oleh FDA di Amerika

Serikat, sedangkan sitaxsentan telah disetujui di Eropa. Bonsetan memblok

reseptor endotelin-A dan B, sedang sitaxetan dan ambrisentan spesifik untuk

endotelin-A. Ketiganya tersedia dalam bentuk oral (Chin dan Rubin, 2008).

Bonsetan menurunkan sintesis kolagen I dan III, meningkakan supresi

kolagenase dan menghambat deposisi matriks ekstraseluler (Shi-wen dkk., 2001).

Bonsetan menunjukkan efek anti fibrosis pada beberapa model fibrosis jantung

(Clozel dan Salloukh, 2005).

Efek samping bonsetan antara lain nyeri kepala, flushing, edema periferal,

hidung buntu, sinusitis, dan peningkatan enzim hati. Efek lebih serius meliputi

anemia, gagal jantung, kelainan janin dan hepatotoksisitas. Bonsetan dan

ambrisetan termasuk dalam obat kategori X untuk ibu hamil menurut FDA

(Duarte dkk., 2013).



2.3.4 Penghambat Phospodisterase-5

Sildenafil merupakan penghambat phospodiesterase-5 yang dapat

meningkatkan produksi NO dengan cara memecah second messenger dari NO

yakni cyclic guanosine monophosphate (cGMP), menyebabkan vasodilatasi

pulmoner dan hambatan pertumbuhan sel (Chin dan Rubin, 2008; Gong dkk.,

2014). Sebuah studi menunjukkan bahwa penggunaan sildenafil dapat

menghambat hipertrofi dan gagal jantung, serta mencegah fibrosis jantung pada

tikus yang diinduksi transverse aortic constriction (Gong dkk., 2014).

Efek samping yang paling sering penggunaan obat ini antara lain sakit

kepala, dispepsia, flushing, gangguan penglihatan dan hidung buntu. Efek sering

yang lebih berat namun jarang terjadi yakni penyakit vaskular retina, infark

miokard dan neuropati optik iskemik nonarteritik (Duarte dkk., 2013).

2.3.5 Ekstrak Buah Delima Sebagai Terapi Alternatif

Buah delima atau pomegranate (Punica granatum L, Punicaceae) adalah

jenis buah yang berasal dari persia dan dapat tumbuh dan dikonsumsi di seluruh

dunia dan banyak digunakan dalam bidang kesehatan (Haber dkk., 2011).

Ketertarikan terhadap buah delima ini sehubungan dengan manfaatnya dalam

pencegahan kanker prostat, mencegah oksidasi LDL, high density lipoprotein

(HDL),dan kolestrol, penurunan tekanan darah , artritis, anemia, diare, inflamasi,

penyakit ginekologis, perkembangan arterosklerosis, stimulasi fungsi sel –T, dan

produksi sitokin, penyakit Alzeimer, dan peningkatan kualitas sperma. Efek

manfaat ini terkait banyaknya kandungan fitokimia dalam buah delima. Senyawa

fitokimia ini terutama merupakan campuran senyawa fenolik seperti polifenol



tanin yang mengandung gula dan antosianin, termasuk ellagitannin, antosianin

dan polofenol lain yang mudah dihidrolisa (Akpinar-Bayizit dkk., 2012). Toklu

dan kawan-kawan membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima memberi

perlindungan terhadap fibrosis hati pada tikus yang diinduksi obstruksi kandung

empedu (Toklu dkk., 2007). Hemmati dan kawan-kawan menemukan bahwa

pemberian ekstrak buah delima dapat mencegah akumulasi kolagen pada paru

tikus model fibrosis paru (Hemmati dkk., 2013).

Gambar 8. Efek Bioaktif Kandungan Buah Delima. Kandungan fitokimia buah delima memiliki efek membersihkan radikal bebas dengan menghambat enzim oksidan dan menginduksi enzim antioksidan. Ia juga memiliki efek anti inflamasi yakni dengan menghambat Cyclooxygenase-2 (COX-2) dan Lipoxygenase (LOX). Ia juga memiliki efek perlindungan stres oksidatif dan aterogenesis dengan menginduksi aktivitas paraoxonase 1 dan 2. Ia juga memiliki efek anti proliferasi yakni dengan menurunkan p21 dan p27 yang berujung pada penurunan cyclins dan cyclins kinase. Ia juga memilik efek antikarsinogenik dengan menginaktivasi faktor NF-Bsehingga menurunkan invasi, angiogenesis dan metastasis, menurunkan sitokrom P450 dengan mengaktivasi prokarsinogen dan menghambat inisiasi tumor, hambatan terhadap zat mirip enzim carbonic anhydrase dan ornithin dekarboksilase yang aktif pada pertumbuhan sel kanker.

Sumber : Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. In: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72



Tanaman delima mengandung alkaloid, mannite, asam ellagic dan asam

galat. Kulit kayu dan kulit buahnya mengandung tanin. Kandungan parapolifenol

dalam buah delima diyakini memberikan aktivitas antioksidan dan melindungi

LDL terhadap oksidasi yang dimediasi sel langsung dengan interaksi dengan

lipoprotein dan secara tidak langsung oleh akumulasi dalam makrofag arteri. Kulit

buah bagian dalam dan luar mengandung lebih banyak polifenol dibanding biji.

Jus delima komersial telah ditemukan memiliki kandungan kulit dan efek

antioksidan yang lebih kuat dibanding jus olahan tangan. Selain itu jus delima

memiliki efek antihipertensi dengan mengurangi aktivitas angiotensin-converting

enzyme (Haber dkk., 2011).

Tabel 4. Kandungan Fitokimia Tanaman Buah Delima

Komponen Tanaman Kandungan

Jus buah delima Anthocyanins; glukosa;asam ascorbat, elemen mineral ; asam amino , ; phenol seperti : Asam ellagic,asam galat,asam kaffeik, katechin, epigallocatechin gallate (EGCG), quercetin, rutin.

Minyak biji delima Asam Punicic; Asam ellagic ; Asam lemak; sterol

Kulit buah delima Komponen Phenolik seperti : punicalagins, asam galat,catechin, EGCG, quercetin, rutin, anthocyanidins, flavonoid lainya

Daun buah delima Ellagitannins (punicalin and punicafolin); flavonol seperti luteolin dan apgenin

Bunga buah delima Asam Gallat, triterpenoid seperti ursolic,maslinic dan asam asiatik

Kulit kayu dan akar buah delima Ellagitannins; alkaloid piperidine Sumber : Jurenka J, 2008. Therapeutic Applications of Pomegranate (Punica Granatum L.):A Review. Altern Med Rev, 13, 129-44.



Tabel 5. Kandungan Nutrisi Tanaman Buah Delima

Kandungan

Moisture 72.6-86.4%

Lemak 0.05-1.6%

Elemen mineral 0.01-0.9%

Serat 0.36-0.73%

Karbohidrat 15.4-19.6%

Kalsium 3.0-12.0 mg

Fosfor 8.0-37.0 mg

Besi 0.3-1.2 mg

Sodium 3.0 mg

Magnesium 9.0 mg

Asam askorbat (Vitamin C) 4.0-14.0 mg

Thiamin (Vitamin B1) 0.01 mg

Riboflavin (Vitamin B2) 0.012-0.03 mg

Niasin 0.18-0.3 mg

Sumber : Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. In: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72.

Sebuah studi pada orang sehat 20-30 tahun yang diberi 50 ml jus

pomegranate (setara 1,5 mmol polifenol) setiap hari selama 2 minggu

menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan dan kenaikan serum paraoxonase

signifikan yakni 9% (p<0,05) dan (p<0,01). Aviram dkk juga mengevaluasi efek

pomegranate pada ketebalan intima media, tekanan darah, dan oksidasi LDL pada

pasien atheroskelrosis selama 3 tahun. Pada tahun pertama didapatkan penurunan

35% dari ketebalan intima dan peningkatan 9% pada plasebo (p<0,01), penurunan

tekanan darah sistolik sebesar 12% sedang pada plasebo tidak didapatkan



perubahan (p<0,01), dan konsentrasi antibodi anti LDL teroksidasi turun 19%

pada grup pomegranat pada 3 bulan (p<0,01) (Aviram dkk., 2004 ).

Sitokin proinflamasi interleukin-1beta (IL-1β) terlibat dalam proses

berlangsungnya HAP. Inflamasome NLRP3 yang terdiri dari protein NLR

NLRP3, adaptor ASC, dan pro-caspase 1, merupakan pusat aktivasi IL-1β dan

memainkan peran kunci dalam imunitas bawaan dan cedera paru (Dolinay dkk.,

2012; Tang dkk., 2015; Jianbo dkk., 2013). Generasi spesies oksigen reaktif

(SOR) adalah elemen sentral mengatur aktivasi NLRP3 (Martinon, 2010 ;

Tschopp dan Schroder, 2010 ). Beberapa studi melibatkan stres oksidatif (SO)

dalam pengembangan HAP (Suzuki dkk., 2013; Villegas dkk., 2013; Afolayan

dkk., 2012). Stres oksidatif dikaitkan dengan perubahan dalam SOR dan jalur

sinyal nitrat oksida. Disregulasi keseimbangan oksidan / antioksidan mengganggu

tonus pembuluh darah dan berkontribusi terhadap aktivasi patologis jalur anti

apoptosis dan mitogenik, yang menyebabkan proliferasi sel dan obliterasi

pembuluh darah (Tabima dkk., 2012) Intervensi antioksidan menunjukkan efek

protektif dalam eksperimen HAP (Villegas dkk., 2013). Namun, mekanisme yang

mendasari tidak sepenuhnya dipahami. Sebagai polifenol yang aktivitas biologi

senyawa, asam ellagic (AE) memiliki beberapa aktifitas biologis seperti sebagai

pembersih radikal (Xu dkk., 2003), antioksidan dan anti proliferasi (Tang dkk.,

2015).



Gambar 9. Kapasitas Antioksidan Jus Buah Delima dibandingkan Wine, Teh Hijau, dan Ekstrak Kulit Delima. Evaluasi menggunakan metode ABTS (2,2’-Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline)-6-Sulfonic Acid, DPPH (α,α-Diphenyl-β-Pycrylhydrazyl, FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma), DMDP (Dimethyl-p-Phenylenediamine). Nilai Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) , dan Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC) kandungan antioksidan Jus delima lebih tinggi dibandingkan wine.

Sumber : Gil M, Tomas-Barberan F, Hess-Pierce B, Holcroft D, dan Kedar A, 2000. Antioxidant Activity of Pomegranate Juice and Its Relationship with Phenolic Composition and Processing. J Agric Food Chem, 10, 4581–9.

Asam ellagic dapat memperbaiki hemodinamik, hipertrofi ventrikel kanan,

dan remodeling pembuluh darah paru pada tikus yang diinduksi monokrotalin.

Monokrotalin dapat merangsang terjadinya stres oksidatif, aktfnya jalur sinyal

NLRP3 dan meningkatnya aktifitas inflamasi di paru dan serum. Patofisiologi

perbaikan dengan AE berhubungan dengan downregulation dari jalur NLRP3



(Tang dkk., 2015). Asam ellagic juga memiliki efek sebagai penghambat ACE

yang berperan dalam hambatan konversi angiotensin I menjadi angiotesin II pada

jalur RAA (Haber dkk., 2011). Efek antioksidan, anti proliferasi anti inflamasi

dan penghambat ACE yang dimiliki senyawa aktif dalam buah delima inilah yang

akan dicoba dimanfaatkan untuk terapi alternatif HAP.

Beberapa studi studi tentang penggunaan komponen yang berbeda dari

buah delima tidak menunjukkan efek samping pada dosis yang diberikan. Studi

histopatologis dari kedua jenis kelamin tikus Oncins Frans -1 (OF-1)

membuktikan efek non toksik antioksidan polifenol punicalagin. Penelitian pada

binatang dengan dosis yang umum digunakan pada manusia tidak menunjukkan

efek toksik (Cerda dkk., 2003). Pada studi terhadap 86 orang yang menerima 1420

mg/hari tablet EBD selama 28 hari menunjukkan tidak ada efek samping atau

perubahan pada urin dan darah (Vidal dkk., 2003; Jurenka, 2008). Hal ini

menunjukkan bahwa penggunaan EBD cukup aman dengan tidak ada efek

samping yang merugikan sehingga dapat digunakan sebagai terapi alternatif

HAP.

2.4 Tikus sebagai Hewan Model Hipertensi Arteri Pulmonal

Beberapa model binatang coba telah digunakan untuk mempelajari

mekanisme patobiologi dan strategi terapi hipertensi pulmonal antara lain babi,

primata, kelinci, tikus, (Roehl dkk., 2009; Kolettis dkk., 2007; Wang dkk., 2009;

George dkk., 2012). Tikus (Rattus Norvegicus) merupakan hewan model yang

paling sering digunakan. Keunggulan tikus dibanding binatang coba yang lain

yakni dalam harganya yang relatif lebih murah, dan mudah dikembang biakan.



Subjek penelitian ini menggunakan tikus Sprague Dawley, jenis outbred tikus

albino serbaguna yang digunakan secara luas dalam riset medis. Kelebihan tikus

strain ini yakni ketenangan dan kemudahan penanganannya. Tikus jenis ini

pertama kali dikembangkan oleh RW Dawley pada tahun 1925. Kemudian

dikembangkan oleh peternakan Sprague Dawley (kemudian menjadi perusahaan

Animal Sprague Dawley di Madison, Wisconsin. Fasilitas penangkaran dibeli

pertama kali oleh Gibco dan kemudian oleh Harlan (sekarang Harlan Sprague

Dawley) pada bulan januari 1980. Rerata ukuran berat lahir tikus ini adalah 10,5

gram. Berat badan dewasa adalah 250-300 gram bagi betina, dan 450-520 gram

untuk jantan. Kisaran usianya adalah 2,5 sampai 3,5 tahun. Tikus ini juga berguna

dalam penelitian pembedahan eksperimental, penelitian general, metabolisme,

nutrisi, neurologi, onkologi, farmakologi, fisiologi, ageing, teratologi, dan

toksikologi (Hamid, 2015).

Terdapat 2 cara yang lazim digunakan dalam pembuatan tikus model

hipertensi arteri pulmonal. Cara pertama yakni dengan membuat kondisi hipoksia

dengan menempatkan tikus pada ruang hipobarik. Cara kedua yakni dengan

penyuntikan monokrotalin (Voelkel dan Tuder, 2000; Gomez-Arroyo dkk., 2012).



2.5 Monokrotalin sebagai Obat Pembuatan Hewan Model Hipertensi Arteri

Pulmonal

Monokrotalin merupakan anggota dari 11 alkaloid pyrolizidin makrosiklik

yang dapat menyebabkan sindrom vaskular paru pada tikus dengan ciri-ciri

vaskulitis pulmonal proliferatif, hipertensi pulmonal dan kor pulmonale.

Monokrotalin telah banyak digunakan secara luas untuk mempelajari patogenesis

hipertensi pulmonal pada manusia, namun mekanisme toksisitasnya masih belum

jelas dan masih sedikit diteliti (Rabinovitch, 2005; Gomez-Arroyo dkk., 2012).

Beberapa hipotesis mekanisme diantaranya (Wilson dkk., 1992) :

1. Monokrotalin diaktivasi menjadi metabolit reaktif di hati.

2. Monokrotalin selektif untuk paru, tidak seperti alkaloid pyrolizidin lain

yang toksik untuk hati. Hal ini menunjukkan monokrotalin

metabolisme yang berbeda dari monokrotalin.

3. Metabolit yang diduga reaktif adalah dehydrogenation produk

dehidrogenasi monocrotaline pyrrole (MCTP).

4. Metabolisme monokrotalin yakni melalui konjugasi glutation yang

mewakili reaksi detoksifikasi.

5. Metabolit reaktif hepatik terakumulasi di sel darah merah, dan

distabilisasi selama transport ke paru.

6. Jejas pulmonal atau respons awal tergantung respons inflamasi yang

dipengaruhi kuat oleh aktivasi platelet.

7. Metabolit hepatik reaktif menyebabkan jejas endotelial non sitotoksik

namun ireversibel.



KERANGKA TEORI

2.6 Kerangka Teori

c

HAP

Volume overload Cardiac output ↓ Inflamasi

RAA system (active)

Angiotensinogen

Angiotensin I

Angiotensin II

NADPH oksidase

TGFβ1

Aktifasi &Proliferasi fibroblast miokardiak

Collagen secreting myofibroblast

↑kolagen intersisial

pe 1,Tipe 3)

Fibrosis Miokard

Hipertrofi miosit jantung

Sel T Makrofag

TGFβs

1 TNFs ILs IFNs

monosit

FGFs PDGFs

PDGF AA PDGF BB PDGF AB

Mitomiosis

Kolagenase

RA kardiak

↑ Produksi fibronektin ↑ Produksi proteoglikan

IL1 IL2 IL6 ↑ SMAD 2

↑ translokasi SMAD 3

terfosforilasi



2.6.1 Penjelasan Kerangka Teori

Pada HAP terjadi volume overload dan memiliki ciri remodeling

pembuluh darah yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri

pulmonal dan ventrikel kanan. Sebagai konsekwensi penderita sering mengalami

cardiac output yang rendah. Pada keadaan ini sistem RAA menjadi aktif untuk

mempertahankan tekanan darah. Renin akan mengkatalisa pembentukan

angiotensinogen menjadi angiotensin I, kemudian ACE akan mengubahnya

menjadi angiotensin II. Selanjutnya angiotensin II akan menginduksi NADPH

oksidase, menstimulasi TGFβ1 dan memicu proliferasi fibroblast dan deferensiasi

menjadi collagen-secreting myofibroblasts. Selanjutnya akan memperbesar

produksi kolagen intersisial (terutama kolagen tipe 1 dan 3), fibronektin, dan

proteoglikan oleh miofibroblast kardiak. Angiotensin II juga akan meningkatkan

sinyal TGFβ1 dengan meningkatkan kadar SMAD2 dan memperbesar translokasi

SMAD3 terfosforilasi.

Stres oksidatif dan inflamasi akan merangsang sel T dan makrofag untuk

memproduksi sitokin-sitokin diantaranya TGFβs, IFNs, TNFs,dan ILs. TGFβs

yang terdiri dari TGFβ1 sampai TGFβ5 memiliki efek kemoatraktif terhadap

monosit. Melalui monosit, TGFβs dapat menginduksi IL-1, PDGFs,FGFs dan

TNFs. PDGFs memiliki 3 bentuk yakni PDGF AA, PDGF BB dan PDGF AB.

PDGF AA dan BB akan menstimulasi proliferasi fibroblast miokardiak dengan

hasil akhir yakni peningkatan kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan.

PDGF BB juga memiliki aktifitas mitomiosis sehingga dapat memicu terjadinya

hipertrofi miosit otot jantung.



Monosit dan IFNs serta TNFs akan menginduksi ILs. IL-2 akan

menginduksi pelepasan IL-1 , dan IL-1 akan menginduksi pelepasan IL-6 untuk

selanjutnya mengaktifasi fibroblast yang pada akhirnya juga akan meningkatkan

produksi kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan. Hal ini akan

menyebabkan fibrosis intersisial miokard. Sebagai regulator, TFs akan

menginduksi enzim kolagenase (MMPs beserta inhibitornya) yang akan

menurunkan sistesis kolagen pada intersisial.



BAB III

KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep

HAP

Volume overload Cardiac output ↓

RA sistemik

Angiotensinogen

Angiotensin I

Angiotensin II

TGF-β1

Fibroblast

Aktivasi &Proliferasi

Collagen secreting myofibroblast

↑ kolagen tipe I

Inflamasi

Makrofag

Monosit

PDGF BB PDGF AA

RA kardiak Sel T

Fibrosis Miokard

Keterangan : = diteliti = tidak diteliti

EBD



3.2 Penjelasan Kerangka Konsep

Pada HAP terjadi volume overload dan memiliki ciri remodeling

pembuluh darah yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri

pulmonal dan ventrikel kanan. Volume overload pada ventrikel kanan secara

langsung menyebabkan makrofag dan fibroblast yang berinfiltrasi di jantung

memproduksi renin dan angiotensin-converting enzyme (ACE) secara lokal yang

merupakan stimulan yang poten untuk fibroblast baik secara langsung maupun

melalui efek perantara TGF-β. Pada stres kronis dimana volume overload terjadi

terus menerus, dan TVP tinggi, jantung akan kesulitan memompa darah ke

paru,mengakibatkan rendahnya pula pengisian ke atrium kiri selanjutnya ke

ventrikel kiri. Sebagai konsekwensi penderita sering mengalami cardiac output

yang rendah. Pada keadaan ini sistem RAA sistemik menjadi aktif untuk

mempertahankan tekanan darah. Renin akan mengkatalisa pembentukan

angiotensinogen menjadi angiotensin I, kemudian ACE akan mengubahnya

menjadi angiotensin II. Selanjutnya angiotensin II akan menginduksi NADPH

oksidase, menstimulasi TGF-β1 dan memicu proliferasi fibroblast dan

deferensiasi menjadi collagen-secreting miofibroblasts. Selanjutnya akan

memperbesar produksi kolagen intersisial (terutama kolagen tipe I).

Inflamasi juga akan merangsang sel T dan makrofag untuk memproduksi

sitokin-sitokin diantaranya TGF-β1 yang memiliki efek kemoatraktif terhadap

monosit. Melalui monosit, TGF-βs dapat menginduksi IL-1, PDGFs, FGFs dan

TNFs. PDGFs memiliki 3 bentuk yakni PDGF AA, PDGF BB dan PDGF AB.

PDGF AA dan BB akan menstimulasi proliferasi fibroblast miokardiak dengan



hasil akhir yakni peningkatan kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan.

PDGF BB juga memiliki aktifitas mitomiosis sehingga dapat memicu terjadinya

hipertrofi miosit otot jantung.

Ekstrak buah delima memiliki kandungan bahan aktif asam ellagic yang

memiliki efek anti inflamasi, anti proliferasi antioksidan. Asam ellagic dalam

ekstrak buah delima juga memiliki efek sebagai penghambat ACE . Pemberian

ekstrak buah delima pada kasus HAP diharapkan dapat menurunkan kejadian

fibrosis ventrikel kanan yang diamati dari penurunan jumal sel yang mengekspresi

TGF-β1 dan kolagen tipe I.

3.3 Hipotesis Penelitian

a. Pemberian EBD akan menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-

β1 pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal

b. Pemberian EBD akan menurunkan jumlah sel yang mengekspresi

kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal



BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain laboratoris eksperimental dengan

rancangan randomized post-test only control group. Dengan pertimbangan

kelompok penelitian berasal dari satu populasi, berumur dan berjenis kelamin

sama, serta berasal dari varian yang sama. Sampel dikelompokkan secara acak,

diberikan perlakuan bersama kelompok kontrol. Variabel diukur pada akhir

pengamatan selama kurun waktu tertentu. Pengelompokan sampel dilakukan

secara random seperti pada gambar di bawah ini.

Gambar 10. Bagan Rancangan Penelitian

S

Monokrotalin

RA

K2 O3

O1K1 2 Minggu

E1

E2 O4

O22 Minggu

4 Minggu

4 Minggu



Keterangan :

S : Sampel, tikus putih.

RA : Random Allocation.

CMC : Carboxy methyl cellulose

EBD : Ekstrak buah delima

K1 : Kelompok tikus model sebagai kelompok kontrol yang

hanya mendapatkan CMC selama 2 minggu.

K2 : Kelompok tikus model sebagai kelompok kontrol yang

hanya mendapatkan CMC selama 4 minggu

E1 : Kelompok tikus model HAP sebagai kelompok

eksperimen/perlakuan yang mendapatkan CMC dan ekstrak buah

delima selama 2 minggu.

E2 : Kelompok tikus model HAP sebagai kelompok

eksperimen/perlakuan yang mendapatkan CMC dan ekstrak buah

delima selama 4 minggu.

O1 : Observasi pada kelompok K1

O2 : Observasi pada kelompok E1

O3 : Observasi pada kelompok K2

O4 : Observasi pada kelompok E2

Monokrotalin diinjeksikan kepada tikus di kelompok K1, K2, E1 dan E2 untuk

menginduksi terjadinya hipertensi arteri pulmonal. Ekstrak buah delima diberikan

pada kelompok E1 dan E2. Pada kelompok kontrol dan perlakuan, semua



mendapatkan CMC. Pengamatan luaran dilakukan pada hari ke-14 pada kelompok

K1 dan E1 serta pada hari ke-28 pada kelompok K2 dan E2.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

4.2.1 Tempat Penelitian

1. Inkubasi dan perlakuan tikus dilakukan pada laboratorium Biokimia Fakultas

Kedokteran Universitas Airlangga.

2. Pembuatan slide dan pemulasan Hematoxilen-Eosin dan pengecatan Trichrome

Masson dilakukan pada Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga.

3. Pemulasan Imunohistokimia dan digital imaging dilakukan pada

Laboratorium Biokimia-Biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya.

4.2.2 Waktu penelitian

Penelitian akan dilaksanakan sesuai dengan jadwal sebagai berikut:

Kegiatan Bulan ke-

1 2 3 4 5 6 7

1. Perbaikan proposal √

2. Pemesanan bahan penelitian √ √

3. Penelitian √

4. Penyusunan laporan penelitian √ √

5. Presentasi hasil penelitian √



4.3 Populasi dan sampel penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain

Sprague Dewley berkelamin jantan berumur 3 bulan dengan berat badan 300-500

gram. Usia tikus 3 bulan setara dengan usia manusia 7,5 tahun (Andreollo dkk.,

2012). Pemilihan usia tikus 3 bulan berdasarkan pertimbangan bahwa :

1. Tikus masih dalam kategori anak bila dikonversikan pada usia

manusia.

2. Tikus cukup besar sehingga lebih memudahkan proses pengukuran

tekanan areri pulmonalis.

3. Memiliki daya tahan / survival yang cukup baik sehingga tidak mati

sebelum masa perlakuan selesai.

Tikus didapatkan di Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan, Universitas

Gajah Mada, Yogyakarta. Tikus dipelihara dan diadaptasi di Laboratorium

Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya.

4.3.2 Sampel Penelitian

Sampel pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain

Sprague Dewley jantan berumur 3 bulan dengan berat badan 300-500 gram yang

telah disapih dari induknya dan diadaptasi sejak 1 minggu sebelum dilakukan

randomisasi. Model tikus yang digunakan adalah tikus yang diperkirakan

mengalami hipertensi arteri pulmonal setelah mendapat suntikan monokrotalin

pada tikus kelompok K1, K2, E1 dan E2.



4.3.3 Penghitungan Besar Sampel

Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan atau replikasi dengan

menggunakan rumus Steel R & Tavia,1980, Higgins & Kleinbaum 1987 sebagai

berikut :

Keterangan :

n : Replikasi

Zα : 1,645 (Bila α = 0,05)

Zβ : 0,842 (Bila β = 0,20)

σ : Simpangan baku kelompok kontrol (6,78)

d : Selisih nilai rerata kolagen kelompok kontrol dan perlakuan

(20,16 – 8,93) (Lopez-Reyes dkk., 2008).

f : Jumlah hewan coba yang drop out sebesar 20%

Berdasarkan hasil penghitungan, jumlah replikasi untuk setiap kelompok

perlakuan minimal 5 ekor. Bila diperhitungkan dengan faktor koreksi maka

jumlah replikasi untuk masing-masing kelompok perlakuan adalah 6 ekor tikus

1

1 - f x

2σ2(Z1-α/2 + Z1-β)2

d2 n ≥



putih. Bila terdapat 4 kelompok perlakuan, maka dibutuhkan sebanyak 24 ekor

tikus putih.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Pemberian ekstrak buah delima

4.4.2 Variabel Tergantung

Hambatan terjadinya fibrosis ventrikel kanan

4.4.3 Variabel Antara

1. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1

2. Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I

4.4.4 Variabel Kendali

1. Jenis kelamin, strain dan umur

2. Tatalaksana pemeliharaan

3. Metode dan alat pemeriksaan

4. Dosis dan cara pemberian perlakuan

4.5 Definisi Operasional :

1. Tikus putih adalah tikus putih jenis Sprague Dawley jenis kelamin

jantan, berumur sekitar 3 bulan dengan berat badan 300 – 500 gram yang

diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan Universitas Gajah Mada,

Yogyakarta.



2. Hewan model adalah tikus putih yang telah di induksi

monokrotalin.

3. Monokrotalin adalah suatu alkaloid pyrrolizidine berasal dari

Crotalaria spectabilis. Monokrotalin dapat menyebabkan sindrom vaskular paru

pada tikus yang ditandai dengan terjadinya proliferasi vaskulitis paru, hipertensi

arteri paru dan kor pulmonal. Dosis yang diperlukan untuk membuat tikus model

HAP yakni 60 mg/kg disuntik secara subkutan, (Miyauchi dkk., 1993; Kay dkk.,

1982). Berdasarkan penelitian pendahuluan, HAP mulai terjadi setelah hari ke 3

pemberian monokrotalin.

4. Ekstrak buah delima adalah hasil ekstraksi seluruh bagian buah

delima (Punica granatum L) dalam bentuk serbuk dan telah terstandarisasi

mengandung 40% ellagic acid. Dosis ekstrak buah delima adalah jumlah ekstrak

buah delima yang diberikan kepada subjek penelitian, yaitu sebesar 150 mg/kg

BB/hari sesuai dengan dosis AE sebesar 60 mg/kg BB/po/hari (Devipriya dkk.,

2007).

5. Lama pemberian ekstrak buah delima adalah lamanya waktu

pemberian ekstrak buah delima pada hewan model , yaitu selama 2 dan 4 minggu.

Pemberian ekstrak buah delima dilakukan 3 hari setelah tikus disuntik

monokrotalin subkutan.

6. Ekspresi TGF-β1 adalah penilaian positif pemeriksaan preparat

menggunakan teknik imunohistokimia antibodi monoklonal anti TGF-β1.

Penilaian dilakukan secara kuantitatif visual dengan mikroskop cahaya dengan

pembesaran 400 kali terhadap sel penyusun otot jantung ventrikel kanan yang



mengekspresikan TGF-β1. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang

imunoreaktif yang terwarnai coklat pada membran sel atau sitoplasma. Jumlah

seluruh sel imunoreaktif dimasukkan sebagai data. Skala data untuk TGF-β1

adalah ratio. Evaluasi ekspresi TGF-β1 dilakukan oleh tenaga terlatih di

Laboratorium Biologi Molekuler, Universitas Brawijaya

7. Ekspresi Kolagen tipe I adalah penilaian positif pemeriksaan

preparat dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal anti

kolagen tipe I. Penilaian dilakukan secara kuantitatif visual dengan mikroskop

cahaya dengan pembesaran 400 kali terhadap sel fibroblast yang yang

mengekspresikan kolagen tipe I. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang

imunoreaktif yang terwarnai coklat pada membran sel atau sitoplasma. Jumlah

seluruh sel imunoreaktif dimasukkan sebagai data. Hasil dinyatakan positif

apabila terdapat warna coklat pada sitoplasma sel otot ventrikel kanan. Evaluasi

ekspresi kolagen tipe I dilakukan oleh tenaga terlatih di Laboratorium Biologi

Molekuler, Universitas Brawijaya, Malang.

8. Hambatan fibrosis ventrikel kanan adalah hambatan terjadinya

fibrosis ventrikel kanan tikus model HAP yang ditandai dengan menurunnya TGF

–β1 sebagai sitokin profibrogenik utama, dan kolagen tipe I sebagai komponen

utama penyusun jaringan fibrotik pada matriks ekstraseluler.



4.6 Bahan dan Alat Penelitian

4.6.1 Bahan Penelitian

4.6.1.1 Ekstrak Buah Delima

Ekstrak buah delima pada penelitian ini adalah Ekstrak buah delima yang

terstandar dengan kandungan ellagic acid 40 % . Ekstrak buah delima diproduksi

oleh Xi’an Biof Bio-Technology Co., Ltd. (Room 1-1111, High-tech Venture

Park, No. 69 Jinye Road, Gaoxin Distric of Xi’an, People Republic of China).

4.6.1.2 Bahan Pembuatan Hewan Model

Bahan penelitian yang diperlukan dalam penelitian ini adalah tikus putih

Sprague Dawley, kandang yang memenuhi standar (1 kandang untuk 1 tikus),

pakan dan air minum standar, obat untuk pembiusan yaitu ketalar, diazepam, obat

untuk desinfeksi yaitu alkohol 70%, betadine solution. Obat untuk membuat

hipertensi arteri pulmonalis pada hewan model yang digunakan dalam penelitian

ini adalah: monokrotalin dari Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd No.11

Building, No.388 Rongtaidadao CNSTP Wenjiang Zone, Chengdu, Sichuan,

611130 China.

4.6.1.3 Bahan Pemeriksaan Laboratorium

Bahan yang digunakan dalam penlitian ini adalah: monokrotalin, ddH2O,

NaCl (Merck) untuk menginduksi HAP pada hewan model. Bahan untuk

pembuatan preparat pada penelitian ini yang nantinya akan diperiksa dengan

teknik imunohistokimia adalah jaringan otot jantung ventrikel kanan, antibodi

monoklonal terhadap TGF-β1 dan antibodi spesifik terhadap kolagen tipe I,



hematoksilin eosin, aseton, xylol, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80%,

alkohol 70%, aquadestilata, phosphate buffer saline (PBS), streptavidin biotin

peroxidase, H2O2 0,5%, tripsin 3% dan substrat.

4.6.2 Alat Penelitian

4.6.2.1 Alat untuk Pembuatan Hewan Model

Meja operasi, spuit 3 ml.

4.6.2.2 Alat untuk Perlakuan Hewan Model

Alat yang digunakan untuk perlakuan terhadap hewan model yakni alat

untuk memasukkan bahan yaitu sonde lambung no 10 F, spuit 10 cc, dan mortar

untuk mencampur bahan serta air steril, tabung ukur (10, 50 100 dan 1000 mL).

4.6.2.3 Alat Untuk Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis dan

Pemeriksaan Laboratorium

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: hand-scoon steril,

masker, spuit disposibel 1 cc (tuberculin), 5 cc, 10 cc merk Syringe, pipet plastik

sekali pakai, alat bedah minor,spreader kecil, kassa steril, intravenous catheter

16G,20G, selang oksigen, tabung oksigen beserta manometernya, 1 set monitor

merk DASH 5000, timbangan digital merk OHAUS (AR 140), mikropipet (1-

10µL, 20-100µL, 200-1000µL, 50-5000µL), hood steril, sentrifugasi dingin 4oC,

sentifugasi biasa, tabung 1,5 mL. Alat yang diperlukan untuk mengamati ekspresi

TGF-β1 dan ekspresi kolagen tipe 1 adalah gelas objek, mikropipet, inkubator dan

mikroskop cahaya Sony Nex7 digital imaging for mikroskop, mikrometer objektif,

mikrometer okuler.



4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data

Data hasil penelitian yang dikumpulkan merupakan data primer. Penelitian

dilakukan di laboratorium yang standar, mempunyai peralatan lengkap dan

pengalaman yang memadai dalam pembuatan dan pemeliharaan hewan coba agar

reliabilitas dan validitas hasil terjamin.

Reliabilitas dan validitas penelitian akan dicapai melalui langkah-langkah

sebagai berikut:

1. Peneliti menggunakan tenaga peneliti atau tenaga laboratorium

yang sama untuk menjamin reliabilitas pada evaluasi obyek pengamatan yang

sama.

2. Dipilih alat dan bahan uji yang mempunyai sensitivitas dan

spesifitas yang tinggi, konsisten dan dapat dipertanggungjawabkan untuk

menjamin validitas pada penilaian variabel penelitian,

3. Peneliti mengelola, mengawasi dan memantau berbagai tahap

pelaksanaan penelitian meliputi pengadaan hewan coba, perlakuan pada hewan

coba, penilaian gejala, pengambilan spesimen, pengadaan bahan, pemakaian dan

pemeliharaan bahan dan alat, pemeriksaan spesimen dan pengumpulan data

penelitian.

4. Penelitian ini adalah bagian dari penelitian utama oleh Rahman

yang berjudul “Mekanisme Kerja Buah Delima Dalam Menghambat Fibrosis

Tunika Adventisia Arteri Pilmonalis Melalui Ekspresi TGF –β1, Rasio MMP-

1/TIMP-1, Kolagen Tipe I dan Tebal Fibrosis Pada Tikus Sprague Dawley Yang

Mengalami Hipertensi Arteri Pulmonalis”. Penelitian dilaksanakan setelah



proposal penelitian utama telah mendapatkan kelayakan etik dari komisi etik

penelitian.

4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data

Pengumpulan data dilakukan dalam lingkungan yang terkontrol dan

terkendali dengan pertimbangan semua kondisi diusahakan sama dan dapat

dikendalikan. Urutan analisis data:

a. Uji Normalitas menggunakan Saphiro Wilk pertama kali dilakukan

untuk menguji bahwa variabel yang diperiksa dalam penelitian ini

berdistribusi normal.

b. Apabila data berdistribusi normal maka dilanjutkan dengan Uji

Levene untuk menguji homogenitas

c. Apabila data berdistribusi normal dan homogen, maka akan

diteruskan dengan Uji Analisis of Varians (ANOVA). Uji ini

digunakan untuk melihat adakah perbedaan rerata Ekspresi TGF-β1

maupun Kolagen tipe I pada keseluruhan kelompok.

d. Uji Komparasi Ganda atau Least Significans Difference (LSD)

dilakukan setelah ANOVA. Uji ini digunakan untuk

membandingkan rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I

pada antara kelompok satu dengan kelompok yang lain

e. Apabila pada uji normalitas data berdistribusi tidak normal, maka

dilanjutkan d engan Uji Kruskal Wallis untuk melihat adakah

perbedaan rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I pada

keseluruhan kelompok.



f. Uji Mann Whitney selanjutnya digunakan untuk membandingkan

rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I pada antara

kelompok satu dengan kelompok yang lain.

Tingkat kemaknaan uji statistik yang dipergunakan dalam penelitian ini sebesar

0,05. Data yang telah dikumpulkan diolah secara manual dan menggunakan

perangkat lunak program komputer.



4.9 Alur Penelitian

Gambar 11. Alur Penelitian

Terminasi

Pengukuran tekanan arteri pulmonalis pada

minggu ke 2

Injeksi monokrotalin

Tikus putih Sprague Dawley

Analisis Data

Evaluasi Ekspresi TGF-β1, Kolagen tipe I

Pembuatan Slide

Pengambilan organ

Randomisasi

Kelompok K1

Kelompok E1

Kelompok K2

Kelompok E2

Pengukuran tekanan arteri pulmonalis pada

minggu ke 4



4.10 Pelaksanaan Penelitian

4.10.1 Persiapan Penelitian

a. Ekstrak buah delima terstandar mengandung 40% asam ellagic

Standarisasi Ekstrak Buah Delima

Ekstrak buah delima terstandart yang mengandung 40 % ellagic acid

diproduksi oleh Xi’an Biof Bio-Technology Co., Ltd. (Room 1-1111, High-tech

Venture Park, No. 69 Jinye Road, Gaoxin Distric of Xi’an, People Republic of

China).

Persiapan Sediaan Uji

Ekstrak buah delima terstandar yang akan diberikan pada hewan coba

disuspensikan dengan sodium carboxy methyl cellulose (CMC) 0,3% di dalam

mortar agar homogenitas larutan terjaga. Sediaan selalu dibuat baru sebelum

diberikan. Pembuatan sodium CMC 0,3% dilakukan dengan cara menaburkan

sodium CMC sebanyak 0,3 gram dalam aquades panas 100 ml dan diaduk dengan

bantuan magnet stirrer sampai larut.

Berdasarkan dosis EA sebesar 60 mg/kgBB/po/hari (Devipriya dkk., 2007),

maka dosis ekstrak buah delima terstandart yang mengandung 40% EA adalah :

40/100 = 60/a

40a = 6000

a = 150 mg/kgBB/po/hari



Pembuatan sediaan untuk 12 ekor tikus yang mendapatkan perlakuan

ekstrak buah delima, dibuat sediaan baru setiap hari dengan cara sebagai berikut :

sebanyak 300 mg ekstrak buah delima disuspensikan dalam sodium CMC 0,3%

sebanyak 20 ml, sehingga diperoleh kadar ekstrak 15 mg/ml. Untuk tikus dengan

berat badan 300 gram, dengan dosis ekstrak 150 mg/kg BB, diperlukan 45 mg

ekstrak atau 3 ml suspensi ekstrak buah delima terstandart. Pemberian sodium

CMC dilakukan dengan volume yang sama. Volume pemberian = berat badan

tikus/1000 x dosis ekstrak

b. Persiapan Hewan Coba

Tikus putih sebagai hewan coba diadaptasikan selama 1 minggu,

diperlakukan dan dibagi berdasarkan kelompoknya seperti yang tertera dalam

rancangan percobaan. Dalam penelitian ini terdapat 4 kelompok perlakuan yang

masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus.

4.10.2 Pembuatan Hewan Model HAP

Pada penelitian ini digunakan 24 ekor tikus putih Sprague Dawley jantan,

berumur sekitar 3 bulan yang memiliki berat antara 300-500 gram. Tikus- tikus

tersebut disiapkan sebagai hewan model hipertensi arteri pulmonalis dengan

diberikan suntikan larutan monorotalin subkutan 60 mg/kg berat badan

(Biopurify Chengdu China).



4.10.3 Perlakuan Terhadap Hewan Coba

a. Pemberian CMC dan EBD

Hewan coba dikelompokkan secara random ke dalam 2 kelompok

perlakuan yaitu 12 ekor tikus kelompok kontrol (CMC) dan 12 ekor tikus

kelompok eksktrak buah delima (CMC+EBD). Masing-masing kelompok diberi

perlakuan setelah 3x24 jam suntikan monokrotalin kemudian diamati setelah 2

minggu dan 4 minggu. Semua tikus diberi anestesi ketamin 50 mg/kg dan

dormicum 0,5 mg/kg subkutan sebelum pengukuran tekanan arteri pulmonalis dan

kemudian dikorbankan dengan melakukan exanguinasi.

a. Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis

Pengukuran tekanan arteri pulmonalis dilakukan setelah 14 hari dan 28 hari

penyuntikan monokrotalin subkutan pada masing-masing kelompok. Langkah

pertama yakni pembiusan tikus model menggunakan ketamin dosis 0,5 mg/kg BB

dan midazolam 0,5 mg/kg BB secara intramuskular pada otot paha. Kemudian

peneliti melakukan intubasi dengan kateter intravena nomor 16 dengan cara

trakeostomi, kemudian dihubungkan dengan threeway dan selang oksigen aliran

0,5 liter/menit dan diberikan tekanan positif periodik. Selanjutnya dilakukan

torakotomi lateral kiri setinggi sela iga 3-4,diperlebar dengan spreader,tampak

jantung. IV catheter 20G ditusukkan ke jantung setinggi jalan keluar ventrikel

kanan dibawah katup arteri pulmonalis,dimasukkan sampai arteri pulmonalis

utama. Selanjutnya dihubungkan dengan selang monitor pengukur tekanan Dash

5000. Pada layar monitor akan tampak gelombang tekanan arteri pulmonalis fase



sistolik dan diastolik. Pencatatan tekanan arteri pulmonalis dilakukan minimal 3

kali, dipilih gambaran tekanan terbaik dan dihitung reratanya.

4.10.4 Pengambilan Jaringan Jantung

Pengambilan jaringan jantung dilakukan setelah hewan coba dieutanasia

dengan eksanguinasi. Organ jantung dibersihkan dari sisa darah,

ditimbang,kemudian dimasukkan ke dalam wadah berisi formalin buffered 10%.

Jaringan jantung disiapkan sebagai bahan pemeriksaan terhadap eksprpesi, TGF-

β1 dan kolagen tipe I dengan teknik imunohistokimia.

4.10.5 Perlakuan Terhadap Sampel

Jantung tikus putih difiksasi untuk pemeriksaan histologi dengan

memasukkan formalin buffered 10% (pH 7,2) dengan tekanan konstan kemudian

diligasi dan dibiarkan 1 jam untuk mempertahankan inflasi. Kemudian jantung

dieksisi dan difiksasi lagi dengan formalin buffered netral 10% selama 24 jam.

a. Pembuatan Sediaan Histologi Ventrikel Kanan

Pembuatan sediaan histologi jaringan jantung menurut teknik pembuatan

sediaan. Jantung yang telah direndam dalam buffer formalin 10 % selama 24 jam,

dipotong-potong dengan tebal kira-kira 0,5 mm. Potongan-potongan tersebut

dimasukkan ke dalam kantong strimin. Untuk identitas sampel, masing-masing

kantong diberi nomor sampel, tanggal dan lain-lain. Masing-masing kantong

selanjutnya dimasukkan kedalam larutan berikut secara berurutan dan dalam

waktu yang sudah ditentukan. Proses ini meliputi tahap dehidrasi, clearing,

impregnasi dan embedding.



Pada tahap dehidrasi, potongan organ jantung dimasukkan ke dalam alkohol

70% selama 1 jam, kemudian dipindah ke dalam alkohol 80 % selama 1 jam,

selanjutnya dimasukkan ke dalam alkohol 95% selama 2 jam, lalu dimasukkan ke

dalam alkohol 95% selama 1 jam, dan untuk 3 jam berikutnya masing masing

dimasukkan ke dalam alkohol 100% selama @1 jam.

Pada proses clearing, potongan organ jantung yang sudah melewati proses

dehidrasi dimasukkan ke dalam cairan xylol selama 1 jam, kemudian diulang lagi

dimasukkan xylol selama 1 jam, lalu dimasukkan ke dalam xylol lagi selama 2

jam.

Pada proses impregnasi, potongan organ jantung yang sudah melewati

proses clearing dimasukan ke dalam parafin (56-58oC) selama 2 jam. Proses ini

diulang hingga 3 kali.

Proses terakhir yakni embedding. Pada proses ini potongan organ jantung

diblok ke dalam parafin dan dibiarkan sampai dingin. Dipotong dengan ketebalan

5 µm dengan mikrotom, kemudian dimasukkan ke dalam waterbath 50°C dan

ditempelkan pada gelas objek. Selanjutnya dipanaskan lagi untuk mencairkan

parafin, kemudian dilakukan pewarnaan.

b. Pembuatan Preparat Imunohistokimia

Untuk pembuatan preparat dengan metode imunohistokimia, jaringan

jantung difiksasi dengan buffer formalin 10% selama 24 jam. Selanjutnya jaringan

dipotong dan dilakukan embeding dengan parafin untuk selanjutnya dipotong

dengan ketebalan 5 µm dan difiksasi pada gelas objek sebagai slides.

K1 E1 K2 E2



Teknik pewarnaan imunohistokimia yang digunakan adalah teknik biotin

streptavidin dengan langkah-langkah sebagai berikut :

1. Dewax slide dalam xilol dan alkohol absolut selama 5 menit

2. Mencuci dengan air mengalir

3. Menempatkan slides dalam phosphate buffer saline (PBS) dan

meletakkannya dalam waterbath pada suhu 37ºC selama 5 menit.

4. Slides diletakkan pada protease 0,01% dalam PBS pada suhu 37ºC.

5. Memindahkan slides secepatnya ke dalam air dingin.

6. Mencuci slides sebanyak 2 kali dengan PBS selama 5 menit.

7. Menginkubasi jaringan dengan H2O2 0,5% 100 µl selama 5 menit.

8. Menandai lokasi jaringan pada preparat dan mencucinya dengan PBS

selama 5 menit.

9. Menginkubasi jaringan dengan antibodi primer terhadap TGF-β1, dan

kolagen tipe I selama 10 menit.

10. Mencuci jaringan dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit.

11. Menambahkan biotinylated link (anti mouse horseradish peroxidase

lebelled) selama 10 menit.


13. Menginkubasi jaringan dengan streptavidin horseradish peroxidase selama

10 menit.


15. Menambahkan 1 tetes deaminobenzydine (DAB) yang mengandung

kromogen dalam 2 ml substrat. Meneteskan campuran tersebut pada



jaringan dan membiarkannya selama 5 menit, kemudian mencucinya

dengan distiled water selama 5 menit.

16. Mewarnai jaringan dengan Mayer’s haematoxylin selama 2 – 5 menit.

17. Mencuci jaringan dengan air mengalir.

18. Menutup jaringan dengan kaca penutup (deck glass) dan dilem.

19. Ekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I yang positif akan terlihat berwarna

coklat di bawah mikroskop cahaya.

20. Dari setiap pelaksanaan pewarnaan dibuat kontrol positif dan negatif.



BAB V

HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS

5.1 Karakteristik Subjek Penelitian

Dua ekor tikus didapatkan mati pada hari pengamatan ke 7 dan ke 11 dan

keduanya termasuk kelompok kontrol pengamatan masing masing 2 minggu dan 4

minggu. Organ jantung kedua tikus tersebut tetap diambil dan diamati. Berat

badan tikus ditimbang saaat awal sebelum perlakuan dan berat akhir ditimbang

pada akhir pengamatan 2 dan 4 minggu.

Gambar 12. Berat Badan Tikus Model. Penurunan berat badan lebih terlihat pada kelompok yang dilakukan terminasi pada minggu ke 4.

K 1

K 2

E 1

E 2

Waktu Pengukuran

BB awal BB akhir

Ber

at B

adan

(g)



Tabel 6. Berat Badan Tikus Model

Kelompok BB Awal BB Akhir

P Mean ± SD (Min-Maks)

Mean ± SD (Min-Maks)

K 1 303.83 ± 37.46 (265-355)

294.00 ± 39.81 (236-351)

0.457

E 1 312.50 ± 62.40 (262-433)

318.50 ± 66.46 (254-311)

0.172

K 2 319.00 ± 26.57 (285-351)

294.40 ± 53.23 (220-357)

0.453

E 2 300.33 ± 18.55 (280-327)

275.33 ± 33.57 (220-311)

0.064

P 0.663 0.531

Penurunan berat badan terlihat pada kelompok yang dilakukan terminasi

pada minggu ke 4 namun tidak berbeda bermakna secara statistik. Tidak

didapatkan perbedaan berat badan bermakna antara kelompok K1, E1, K2,

maupun E2 pada awal maupun akhir penelitian, dan juga tidak didapatkan

perbedaan bermakna antara berat badan awal dengan akhir pada tiap-tiap

kelompok.

Pengukuran tekanan arteri pulmonalis dilakukan seperti cara yang telah

dijelaskan pada metode penelitian. Rerata tekanan sistolik dan diastolik arteri

pulmonalis pada kelompok tikus model yang mendapat terapi EBD lebih rendah

dibandingkan rerata tekanan sistolik dan diastolik arteri pulmonalis kelompok

tikus model kontrol dan berbeda bermakna (p = 0,002), baik pada pengamatan 2

minggu maupun pada pengamatan 4 minggu, begitu pula rerata tekanan arteri

pulmonalisnya (MAP = Mean Arterial Pressure), seperti yang tertera pada tabel

dan gambar berikut.



Tabel 7. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis

Kelompok

TD sistolik TD diastolik Mean ± SD (Min-Maks)

Mean ± SD (Min-Maks)

K 1 66,64 ± 11,07a

(45,9 - 79,1) 37,90 ± 4,26a

(30,9 - 42,8)

E 1 41,47 ± 13,47b (20,5 - 57,4)

20,62 ± 7,25b

(10,7 - 32,6)

K 2 65,03 ± 5,50a (59,5 - 71,4)

37,28 ± 7,99a

(26,9 - 44,1)

E 2 44,73 ± 12,66b

(26,0 - 60,6) 26,28 ± 9,15b

(13,7 - 38,2)

p 0,002 0,002 Keterangan : absuperscript yang berbeda menunjukkan ada perbedaan bermakna antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Rerata tekanan sistolik dan diastolik antara kelompok E1 dan E2 lebih

rendah daripada kelompok kontrol K1 dan K2. Tidak didapatkan perbedaan

bermakna rerata tekanan sistolik dan diastolik antar kelompok kontrol K1 dengan

K2 dan antar kelompok perlakuan E1 dengan E2.

Gambar 13. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis. Rerata tekanan arteri pulmonalis tikus model yang mendapat ekstrak buah delima lebih rendah dibandingkan kontrol.

Kelompok

Tek

anan

Dar

ah (m

mH

g)

K1 E1 K2 E2



Tabel 8. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis (mPAP =Mean Artery Preasure)

Kelompok

mPAP Mean ± SD (Min-Maks)

K 1 47,8 ± 5,58a

(39,03 - 53,63)

E 1 27,57 ± 9,17b (13,97 - 40,87)

K 2 46,53 ± 5,53a (40,50 - 53,20)

E 2 32,43 ± 9,64b

(20,47 - 41,67)

p 0,0001 Keterangan: * signifikan pada α=0,05absuperscript yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Rerata tekanan arteri pulmonalis antara kelompok E1 dan E2 lebih rendah

daripada kelompok kontrol K1 dan K2. Tidak didapatkan perbedaan bermakna

rerata tekanan arteri pulmonalis antar kelompok kontrol K1 dengan K2 dan antar

kelompok perlakuan E1 dengan E2.

Gambar 14. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis. Rerata tekanan arteri pulmonalis tikus model yang mendapat ekstrak buah delima lebih rendah dibandingkan kontrol

0

10

20

30

40

50

60

K1 E1 K2 E2

mPAP

Kelompok

Tek

anan

Dar

ah (m

mH

g)



Rerata tekanan arteri pulmonalis (Mean Pulmonary Arterial Pressure =

mPAP) dihitung dengan rumus 1x tekanan sistolik + 2x tekanan diastolik, di bagi

3. Rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok yang mendapat EBD yakni E1 dan

E2 lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol K1 dan K2 dan lebih kecil

dibandingkan tikus model HAP pada penelitian Shen tahun 2011. Tikus Sprague

Dawley memiliki rerata tekanan arteri pulmonalis 22.6 ± 2.4 mmHg pada keadaan

normal, dan meningkat menjadi 40.4 ± 5.0 mmHg pada saat terjadi HAP akibat

monokrotalin (Shen dkk., 2011).

5.2 Gambaran Histopatologi Otot Jantung Ventrikel Kanan

5.2.1 Ekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I

Teknik imunohistokimia digunakan untuk memeriksa ekspresi TGF-β1

dan kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Identifikasi ekspresi TGF-β1

dan kolagen tipe I bertujuan untuk mengamati proses inflamasi yang disertai

fibrogenesis pada jaringan otot jantung ventrikel kanan pada kelompok kontrol

maupun perlakuan.

Gambaran imunohistokimia menunjukkan sel yang mengekspresikan

protein yang diperiksa berwarna coklat, sedangkan sel yang tidak

mengekspresikan protein yang diperiksa tidak berwarna coklat (transparan).

Warna coklat disebabkan karena reaksi protein yang diperiksa dengan antibodi

spesifiknya. Perhitungan sel dilakukan pada 10 lapang pandang besar preparat

dengan menggunakan pembesaran 400x dan disajikan reratanya. Hasil

pemeriksaan preparat dengan teknik imunohistokimia menunjukkan bahwa pada



hewan model HAP yang mendapat ekstrak buah delima memiliki ekspresi TGF-

β1 dan kolagen tipe I yang lebih sedikit dibandingkan kelompok kontrol.

Gambar 15. Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung Tikus Model. Masing–masing merupakan kelompok K1 (A), E1 (B), K2 (C), dan E2 (D) pada pembesaran 400x. Anak panah menunjukkan sel yang mengekspresi TGF-β1 pada otot jantung ventrikel kanan. Ekspresi kuat terjadi pada kelompok K1 dan K2 dan terlihat lebih sedikit pada kelompok yang mendapat ekstrak buah delima E1 dan E2.

D

B

C

A A



Gambar 16. Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot Jantung Tikus Model. Masing-masing merupakan kelompok K1 (A), E1 (B), K2 (C), dan E2 (D) pada pembesaran 400x. Anak panah menunjukkan sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Ekspresi kuat terjadi pada kelompok K1 dan K2 dan terlihat lebih sedikit pada kelompok yang mendapat ekstrak buah delima E1 dan E2.

5.3 Analisis Hasil Penelitian

5.3.1 Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I

Uji normalitas data jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen

tipe I pada setiap kelompok dengan menggunakan Saphiro-Wilk menunjukkan

bahwa data yang diperoleh berdistribusi normal. Kemudian dilanjutkan dengan uji

homogenitas Levene dan hasilnya menunjukkan bahwa data homogen. Karena

data berdistribusi normal dan homogen, selanjutnya dilakukan uji ANOVA dan

LSD.

A

D

B

C



Tabel 9. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I pada Tikus Model HAP

Kelompok

TGF-β1 Kolagen tipe I Mean ± SD (Min-Maks) Mean ± SD (Min-Maks)

K 1 9,17 ± 0,53a

(8,64 – 9,7) 10,83 ± 0,477a

(10,353 – 11,307)

E 1 6,33 ± 0,422b (5,908 – 6,752)

8,00 ± 0,447b

(7,553 – 8,447)

K 2 12,83 ± 1,302c (11,528 – 14,132)

14,17 ± 0,910c

(13,26 – 15,08)

E 2 6,33 ± 1,085b

(5,245 – 7,415) 6,67 ± 0,615b

(6,055 – 7,285)

p <0,0001 <0,0001 Keterangan : abcsuperscript yang berbeda menunjukkan ada perbedaan bermakna antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Kelompok K2 memiliki rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan

kolagen tipe I lebih tinggi dari pada kelompok K1 dan bermakna secara statistik.

Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok

E1 dan E2 lebih rendah daripada Kelompok K1 dan K2 dan bermakna secara

statistik. Tidak didapatkan perbedaan bermakna secara statistik rerata jumlah sel

yang mengekspresi TGF-β1dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2.



Gambar 17. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I. Kelompok yang mendapat ekstrak buah delima memiliki rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I lebih rendah dibanding kontrol.

a. Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1

Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dari pada kelompok K2

lebih tinggi dibanding kelompok K1 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah

sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok E1 lebih sedikit dibandingkan

kelompok K1 serta K2 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang

mengekspresi TGF-β1 pada kelompok E2 lebih sedikit dibanding kelompok K1

serta K2 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang mengekspresi

TGF-β1 pada kelompok E1 tidak berbeda bermakna dengan kelompok E2. Rerata

jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok K1,E1,K2,dan E2 tampak

pada tabel 9 dan gambar 17.

02468

10121416

K1 E1 K2 E2

TGF-β1

Kolagentipe I

Kelompok

Jum

lah

Sel



b. Jumlah Sel yang Mengekspresi Kolagen Tipe I

Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E1

lebih sedikit dibandingkan kelompok K1 serta K2 dan berbeda bermakna secara

statistik. Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E2

lebih sedikit dibanding kelompok K1 serta K2 dan bermakna secara statistik.

Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E1 tidak

berbeda bermakna dengan kelompok E2. Rerata jumlah sel yang mengekspresi

kolagen tipe I pada kelompok K1,E1,K2,dan E2 tampak pada tabel 9 dan gambar

17.



BAB VI

PEMBAHASAN

6.1 Karakteristik Tikus Model Hipertensi Arteri Pulmonal

Berat badan tikus kontrol menurun pada pengamatan 2 minggu dan 4

minggu namun tidak berbeda bermakna secara statistik. Berat badan tikus yang

mendapat perlakuan EBD tampak meningkat pada pengamatan 2 minggu dan

tampak menurun pada pengamatan 4 minggu namun tidak bermakna secara

statistik. Penurunan berat badan pada kelompok kontrol maupun perlakuan 4

minggu ini diperkirakan akibat tikus mengalami distres akibat kondisi HAP

progresif yang terjadi akibat penyuntikan monokrotalin sehingga mempengaruhi

nafsu makan dan asupan nutrisi ke jaringan. Tikus kontrol tampak lebih lemah,

dan napas lebih cepat, sedangkan tikus yang mendapat EBD tampak relatif lebih

sehat.

Pemilihan waktu evaluasi dan terminasi tikus coba dilakukan pada minggu

ke 2 dan minggu ke 4 berdasarkan (Gomez-Arroyo dkk., 2012; Lai dkk., 1991):

1. Pada penelitian pendahuluan didapatkan HAP sudah terjadi pada hari ke 3

setelah penyuntikan monokrotalin.

2. Peningkatan tahanan paru dan peningkatan ketebalan dinding alveoli

terjadi pada 1 minggu setelah penyuntikan monokrotalin.

3. Hipertrofi ventrikel kanan terjadi setelah minggu ke 3 penyuntikan

monokrotalin



4. Tidak ada perubahan yang bermakna pada tekanan arteri pulmonalis,

ketebalan dinding arteri pulmonalis dan hipertrofi ventrikel kanan setelah

minggu ke empat pemberian monokrotalin.

Sehingga 2 minggu dapat mewakili proses awal fibrogenesis dan 4 minggu

mewakili proses degradasi fibrosis.

Hasil uji rerata tekanan arteri pulmonalis pada ke empat kelompok

menunjukkan rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok yang mendapat EBD

yakni E1 dan E2 lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol K1 dan K2 dan

lebih rendah dibandingkan tikus model HAP. Hal ini menunjukkan pemberian

EBD dapat menghambat progresifitas HAP. Hal ini sesuai dengan penelitian oleh

Hanif di India pada tikus model HAP yang diinduksi monokrotalin bahwa pada

tikus yang diberi EBD memiliki tekanan arteri pulmonalis yang lebih rendah

dibandingkan kontrol (Hanif dan Dikshit, 2010).

Pada HAP terjadi perubahan pada pembuluh darah arteri pulmonalis yakni

hipertrofi medial, proliferasi dan fibrosis intima, trombosis in situ dan penebalan

adventitia (Okada dkk., 1998; Shen dkk., 2011). Kandungan bahan aktif asam

ellagic pada ekstrak buah delima memiliki kemampuan menghambat COX

(Corbett dkk., 2010). Hambatan pada COX menyebabkan hambatan rilis serotonin

(5-HT = 5-hydroxytryptamine). Serotonin menstimulasi proliferasi sel otot polos

arteri pulmonal, vasokonstriksi arteri pulmonal, dan mikrotrombosis lokal melalui

reseptor 5-HT dan serotonin reuptake transporter (SERT ) (Shen dkk., 2011).

Hambatan pada serotonin berarti hambatan proliferasi sel otot polos arteri

pulmonal, vasokonstriksi arteri pulmonal dan mikrotrombosis yang akhirnya



dapat menurunkan tekanan arteri pulmonalis. Hal ini juga didukung penelitian

Hironakaa dan Guignabert bahwa hambatan pada 5-HT dan SERTs dapat

menghambat perkembangan HAP pada tikus model monokrotalin (Hironakaa

dkk., 2003 ; Guignabert dkk., 2005).

Pada HAP terjadi peningkatan ekspresi ACE pada endotel dan neointima

dibanding pada tikus normal (Okada dkk., 1998). Ekstrak buah delima memiliki

efek hambatan pada ACE, menurunkan kadar angiotensin II dan menurunkan

tekanan darah pada tikus model hipertensi (Aviram dan Dornfeld, 2001). Mohan

menemukan bahwa jus buah delima mampu menurunkan kadar angiotensin II

pada tikus Wistar model diabetes (Mohan dkk., 2010). Penelitian Waghulde

mendapatkan hasil bahwa buah delima menurunkan kadar angiotensin II pada

tikus Wistar model hipertensi (Waghulde dkk., 2010). Hambatan terhadap ACE

dapat menghambat hipertrofi medial dan pembentukan neointima sehingga dapat

menurunkan tekanan arteripulmonal (Okada dkk., 1998). Mekanisme pasti cara

kerja buah delima menurunkan kadar angiotensin II masih belum jelas. Penurunan

tersebut diduga merupakan efek antioksidan pada tanin dari buah delima (Gil

dkk., 2000; Aviram dan Dornfeld, 2001).

Pada tikus yang mengalami HAP terjadi peningkatan stres oksidatif dan

peningkatan regulasi sistem enzim oksidase kritikal. Vaskular oksidase seperti

xantin oksidase, NADPH oksidase dan pembentukan SOR di mitokondria

mengatur tonus pembuluh darah, proliferasi intima maladaptatif, proliferasi otot

polos serta memodulasi adaptasi ventrikelkanan terhadap stres akibat peningkatan

afterload yang kronis (Suzuki dkk., 2013). Studi menunjukkan bahwa NADPH



oksidase memiliki peran penting dalam vasokokonstriksi dan aspek remodeling

pada HAP (Norton dkk., 2013; Wedgwood dkk., 2013). Ekstrak buah delima

memiliki kadar antioksidan yang tinggi melebihi teh dan minuman anggur (Gil

dkk., 2000). Intervensi antioksidan menunjukkan efek protektif dalam eksperimen

HAP (Villegas dkk., 2013). Kandungan efek anti radikal bebas dan antioksidan

polifenol yang tinggi pada EBD terutama asam ellagic ini dapat menghambat

aktifitas NADPH oksidase sehingga menghambat vasokonstriksi pembuluh darah

arteri pulmonalis dan menjaga stabilitas tekanan darah arteri pulmonalis (Lee

dkk., 2010)(Xu dkk., 2003; Tang dkk., 2015).

6.2 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung

Ventrikel Kanan

Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih banyak jumlah

sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok kontrol 4 minggu (K2) dibanding

kelompok kontrol 2 minggu (K1) yang berbeda bermakna secara statistik, dan

didapatkan lebih sedikit jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok

yang mendapatkan EBD (E1,E2) dibandingkan kontrol (K1,K2) yang berbeda

bermakna secara statistik, namun tidak didapatkan perbedaan bermakna antara

jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok EBD 2 minggu (E1) dan 4

minggu (E2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa :

1. Pemberian monokrotalin pada tikus coba menyebabkan peningkatan TGF-

β1 pada otot jantung.

2. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada tikus model HAP meningkat

seiring dengan waktu, menunjukkan bahwa HAP bersifat progresif.



3. Pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-

β1.

4. Pemberian EBD selama 2 minggu tidak berbeda bermakna dengan

pemberian EBD 4 minggu. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EBD

dapat menghambat progresifitas HAP, namun masih diperlukan waktu

penelitian yang lebih panjang untuk mengevaluasi efektifitas penggunaan

jangka panjang EBD terhadap progresifitas HAP.

Transforming Growth Factor – β1 telah diketahui memiliki peran dalam

pembentukan HAP. Berkembangnya HAP dipengaruhi oleh ketidakseimbangan

sinyal TGF-β1 pada sel pembuluh darah paru. Kadar TGF-β1 terbukti meningkat

pada HAP (Zaiman dkk., 2008). Transforming Growth Factor – β1 merupakan

sitokin profibrogenik utama dan ekspresi TGF-β1 berlebih berhubungan dengan

progresifitas fibrosis (Wei dkk., 2015).

Fibrosis disebabkan oleh serangkaian peristiwa yang dipicu oleh jejas

kronis, meliputi:

1. Kerusakan epitel / endotel

2. Rilis TGF-β1

3. Rekrutmen sel inflamasi

4. Induksi spesies oksigen reaktif

5. Aktivasi sel penghasil kolagen

6. Aktivasi matriks fibroblast

7. Reversal fibrosis



Kesemua diatas memiliki peran penting dalam pembentukan fibrosis, namun rilis

TGF-β1 merupakan peristiwa kunci dalam patofisiologi fibrosis (Kisseleva dan

Brenner, 2008).

Ekstrak buah delima menghambat fibrosis melalui jalur regulasi sitokin

dengan aktivitas antioksidan, menurunkan kadar TGF-β1 dan menghambat

sintesis kolagen (Wei dkk., 2015). Hambatan sinyal TGF-β1 oleh EBD dapat

dijadikan penanda hambatan terjadinya fibrosis ventrikel kanan akibat HAP. Pada

penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih sedikit jumlah sel yang

mengekspresi TGF-β1 pada ventrikel kanan tikus model HAP yang mendapat

EBD dibandingkan kontrol. Penurunan kadar TGF-β1 oleh EBD juga ditemukan

oleh Wei dan Yuniarti (Wei dkk., 2015; Yuniarti, 2012). Penelitian Saputro

menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β1 pada tikus model luka bakar yang

mendapat EBD (Saputro, 2013). Asam ellagic dan antocyanin merupakan

polifenol terbanyak dalam buah delima (Colombo dkk., 2013). Kandungan asam

ellagic dalam ekstrak buah delima menghambat sinyal TGF-β1 melalui jalur

inflamasi dan jalur angiotensin. Pada jejas jaringan yang timbul pada HAP akibat

monokrotalin maupun shear stress akan memicu inflamasi melalui kaskade

pemecahan asam arakidonat dari membran fosfolipid oleh enzim fosfolipase A2.

Asam arakidonat kemudian diubah oleh enzim cyclooxygenase melalui reaksi

oksidasi untuk memproduksi prostatglandin (Corbett dkk., 2010). Prostatglandin

dan tromboxane A2 (TXA2) keduanya disebut prostanoid dan dibentuk saat asam

arakidonat (AA) dilepaskan oleh pospolipase dan dimetabolisme oleh

prostatglanin G/H sintetase dan COX. Terdapat 4 prostatglandin bioaktif penting



yakni prostatglanin (PG) E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostatglandin D2

(PGD2), dan prostatglandin F2α (PGF2α) yang kadarnya meningkat drastis pada

inflamasi sebelum rekruitmen lekosit dan infiltrasi sel imun. (Ricciotti dan

FitzGerald, 2011). Kadar PGE2 yang tinggi memicu sekresi TGF-β1 dan sintesis

reseptor TGF-β1 lebih banyak (Ramirez-Yanez dkk., 2006). Asam ellagic

menghambat inflamasi melalui hambatan pada COX-2 (Corbett dkk., 2010).

Dengan demikian hambatan pada COX oleh EBD dapat menghambat produksi

PGE2 sehingga menghambat sekresi TGF-β1.

Ekstrak buah delima juga menghambat ekspresi TGF-β1 melalui

hambatan pada jalur angiotensin. Pada HAP, volume overload dan menurunnya

cardiac output akan memicu aktifnya RA kardiak maupun sistemik (Handoko

dkk., 2010; Man dkk., 2012; Pacurari dkk., 2014; Kong dkk., 2014). Tujuh dari 10

penelitian pada pasien hipertensi menunjukkan penurunan serum ACE sebesar

36% setelah 2 minggu mengkonsumsi jus delima (Aviram dan Dornfeld, 2001).

Komponen sistem renin angiotensin yang meliputi angiotensinogen, prorenin,

renin, ACE, dan reseptor angiotensin tidak hanya berada pada sirkulasi namun

juga berada pada jaringan seperti jantung, ginjal dan otak (Bader dkk., 2001).

Efek angiotensin diketahui dimediasi oleh produksi SOR (Touyz, 2005).

Angiotensin II menstimulasi aktivitas NADPH oksidase meningkatkan ekspresi

subunit NADPH oksidase, dan menginduksi produksi SOR pada sel endotelial,

fibroblast adventitia, dan arteri intak, namun sebaliknya SOR akan mengaktifkan

sistem RAA (Chamseddine dan Miller, 2003; Zhao dkk., 2008 ; Tanaka dan

Shimizu, 2012). Spesies oksigen reaktif yang terdiri dari superoksid anion



superoksid (O2-), hydroxyl radicals (·OH), dan peroxy radicals (ROO·)

merupakan mediator kunci efek induksi sitokin dan angiotensin-II pada fibroblast

(Cheng dkk., 2003; Kong dkk., 2014; Touyz, 2005). Spesies oksigen reaktif akan

mengaktifkan TGF-β1 dan meningkatkan deposisi matriks ekstraseluler dan

intersisium jantung. Transforming growth factor -β1 yang aktif ini juga akan

meningkatkan produksi TGF-β1 itu sendiri di miofibroblast sehingga kadar TGF-

β1 semakin meningkat (Zhao dkk., 2008 ).

6.3 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot

Jantung Ventrikel Kanan

Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih banyak jumlah

sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok kontrol 4 minggu (K2)

dibanding kelompok kontrol 2 minggu (K1) yang berbeda bermakna secara

statistik, dan didapatkan lebih sedikit jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe

I pada kelompok yang mendapatkan ekstrak buah delima dibandingkan kontrol

yang berbeda bermakna secara statistik, namun tidak didapatkan perbedaan

bermakna antara jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok

EBD 2 minggu (E1) dan 4 minggu (E2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa :

1. Pemberian monokrotalin pada tikus coba menyebabkan peningkatan

kolagen tipe I pada otot jantung.

2. Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada tikus model HAP

meningkat seiring dengan waktu, menunjukkan HAP bersifat progresif.

3. Pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi kolagen

tipe I.



4. Pemberian EBD selama 2 minggu tidak berbeda bermakna dengan

pemberian EBD 4 minggu . Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EBD

dapat menghambat progresifitas HAP, namun masih diperlukan waktu

penelitian yang lebih panjang untuk mengevaluasi efektifitas penggunaan

jangka panjang EBD terhadap progresifitas HAP.

Fibrosis didefinisikan sebagai peningkatan konsentrasi kolagen pada organ

dan terutama didominasi oleh kolagen tipe I (Lez dkk., 2004; Nicoletti dan

Michel, 1999). Peningkatan kadar kolagen tipe I dalam matriks ekstraselurer dapat

diketahui melalui jumlah sel yang mengekspresikanya. Cara lain yang dapat

dilakukan untuk mengukur kadar kolagen yakni dengan pengukuran kadar serum

Carboxy-terminal propeptide of procollagen type I (PIP) yakni penanda sintesis

kolagen tipe I dan pengukuran kadar serum carboxy-terminal telopeptide of

collagen type I (CITP). Peningkatan kadar kolagen tipe I ini sebagai akibat

meningkatnya sintesis dan berkurangnya degradasi (Liu dkk., 2015). Hasil

penelitian ini menunjukkan hasil yang serupa dengan penelitian Yuniarti yang

mendapatkan hasil penurunan ekspresi kolagen tipe I pada tikus model fibrosis

hati yang mendapat EBD (Yuniarti, 2012). Penelitian ini juga mendapat hasil

yang serupa dengan penelitian oleh Saputro yang mendapatkan hasil penurunan

ekspresi kolagen tipe I pada tikus model luka bakar yang mendapat terapi EBD

(Saputro, 2013). Hasil penelitian ini juga selaras dengan penelitian Rahman yang

mendapatkan hasil penurunan jumlah sel yang megekspresi kolagen tipe I pada

pembuluh darah paru tikus model HAP yang diinduksi monokrotalin yang

mendapat EBD (Rahman, 2016). Efek penurunan kadar kolagen tipe I ini terkait



dengan bahan aktif asam ellagic dan polifenol yang terkandung dalam EBD

seperti juga terbukti pada penelitian Bae mampu menurunkan kadar kolagen tipe I

pada kulit yang terpapar inflamasi oleh ultraviolet-B (Bae dkk., 2010).

Penurunan kadar kolagen tipe I pada tikus coba model HAP yang

mendapat EBD ini terkait dengan menurunnya kadar TGF-β1, yakni dengan

berkurangnya jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 maka akan lebih sedikit pula

jumlah fibroblast yang mengalami aktivasi dan proliferasi menjadi collagen

secreting myofibroblast dengan hasil akhir penumpukan kolagen terutama kolagen

tipe I dan III pada matriks ekstraseluler otot jantung. Terdapat korelasi positif

antara TGF-β1 dan kolagen tipe I yakni semakin tinggi kadar TGF-β1 maka akan

semakin tinggi pula kadar kolagen tipe I (Yuniarti, 2012). Hal ini juga selaras

dengan penelitian Wei dkk bahwa EBD mempunyai kemampuan menurunkan

kadar TGF-β1 dan menghambat sintesis kolagen fibrosis hati yg diinduksi CCl4

(Wei dkk., 2015).

Ekstrak buah delima juga menghambat aktifitas IL-1 sehingga terjadi

hambatan pula dalam pengaktifan IL-6 dan lebih lanjut akan menghambat

stimulus terhadap aktivasi dan proliferasi fibroblast (Zarfeshany dkk., 2014).

Ekstrak buah delima memiliki kemampuan untuk menurunkan ekspresi IL-6 pada

hewan model fibrosis hati, penyakit periodontal, dan pada penderita adjunctive

periodontal (Yuniarti, 2012; Jurenka, 2008; Satravaha dkk., 2005).

Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I juga dipengaruhi oleh

aktivitas kolagenase seperti matrix metalloprotease (MMPs) terutama MMP-1 dan

tissue inhibitor matrix metalloprotease (TIMPs) terutama TIMP-1. Matrix



metalloprotease disebut juga matriksin bertanggung jawab terhadap degradasi

matriks ekstraseluler. Manusia memiliki 23 gen matriksin (Nagase dkk., 2006).

Matrix metalloprotease-1 bertanggung jawab terhadap degradasi kolagen tipe I.

Aktivitas matriksin sangat rendah pada jaringan normal, namun meningkat oleh

stimulus sitokin inflamasi, faktor pertumbuhan, hormon, dan interaksi antar sel

matriks (Nagase dan Woessner, 1999). Aktifitas MMP juga dihambat oleh TIMP

namun disisi lain TIMP juga menginduksi fibroblast untuk memproduksi MMP.

Tissue inhibitor matrix metalloprotease terdiri dari 4 homolog yakni TIMP-1

sampai TIMP-4. Keseimbangan MMP-1 – TIMP-1 menjadi penentu

terakumulasinya kolagen tipe I pada matriks ekstraseluler (Nagase dkk., 2006).

Pada penelitian in vitro, EBD meningkatkan ekspresi MMP pada sel kondrosit

manusia melalui hambatan pada Mitogen-activated Protein kinase dan Nuclear

Factor-kappa B (Ahmed dkk., 2005). Pada penetitian fibrosis hati dengan

menggunakan tikus model yang dilakukan ligasi saluran empedu, proses

fibrogenesis masih ditemukan pada hari 21-28 (Tag dkk., 2015). Penelitian

Yuniarti tahun 2012 menunjukkan bahwa pemberian EBD pada tikus model

fibrosis hati menyebabkan penurunan ekspresi MMP-1 pada hari ke 21

dibandingkan kontrol. Yuniarti mengemukakan bahwa menurunnya kadar MMP-1

ini dikarenakan EBD dapat menghambat IL-6 yang berperan dalam aktivasi

hepatic stellate cells untuk mengaktifkan sitokin proinflamasi dan profibrogenik

untuk fibrogenesis (Yuniarti, 2012). Sehingga lebih lanjut dapat disimpulkan

bahwa EBD dapat menghambat fibrogenesis. Aktivitas MMP-1 mengalami

peningkatan pada saat terjadi resolusi fibrosis dan membuktikan bahwa aktivitas



kolagenase memiliki peran penting pada proses degradasi matriks ekstraseluler.

Aktifitas MMP-1 dihambat oleh TIMPs selama proses fibrogenesis (Iradale,

2001). Pada penelitian Rahman didapatkan peningkatan rasio ekspresi MMP-

1/TIMP-1 pada tikus model HAP pada minggu ke 2 dan ke 4 (Rahman, 2016).

Efektifitas EBD dalam menurunkan kadar TGF-β1 dan kolagen tipe I pada

2 minggu dan 4 minggu ini menunjukkan bahwa EBD dapat menghambat proses

awal fibrogenesis sekaligus meningkatkan resolusi fibrosis. Dalam praktek klinis

ini berarti bahwa EBD diharapkan dapat mencegah fibrosis dan mengurangi

derajat fibrosis yang sudah terjadi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi

pertimbangan penggunaan EBD sebagai terapi tambahan, mendampingi terapi

baku yang sudah ada sehingga dapat menurunkan morbiditas dan mortalitas

terkait HAP.



BAB VII

KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

Berdasarkan analisis hasil penelitian yang dilakukan, dapat ditarik

kesimpulan bahwa ekstrak buah delima terbukti efektif :

1. Menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1

2. Menurunkan jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I

pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.

SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menilai efek pemberian EBD

terhadap ketebalan fibrosis pada ventrikel kanan.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek jangka

panjang penggunaan EBD terhadap fibrosis ventrikel kanan.



KEPUSTAKAAN

Adatia I, Kothari S, dan Feinstein J, 2010. Pulmonary Hypertension Associated with Congenital Heart Disease. Chest, 137, 52s-61s.

Afolayan A, Eis A, Teng R, Bakhutashvili I, Kaul S, dan Davis J, 2012. Decreases in Manganese Superoxide Dismutase Expression and Activity Contribute to Oxidative Stress in Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 303, L870–9.

Ahmed S, Wang N, Hafeez B, Cheruvu V, dan Haqiqi T, 2005. Punica Granatum Extracts Inhibits Il-1beta-Induced Expressionof Matrix Metalloproteinases by Inhibiting Theactivation of Map Kinases and Nf-Kappab in Human Chondrocytes in Vitro. J Nutr, 135, 2096-102.

Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. dalam: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72.

Andreollo N, Santos ED, Araujo M, dan Lopes L, 2012. Rat’s Age Versus Human’s Age: What Is the Relationship? Arq Bras Cir Dig, 25, 49-51.

Aviram M, dan Dornfeld L, 2001. Pomegranate Juice Consumption Inhibits Serum Angiotensin Converting Enzyme Activity and Reduces Systolic Blood Pressure. Atherosclerosis, 158 195–8.

Aviram M, Rosenblat M, Gaitinib D, Niteckic S, Hoffmanc A, Dornfeldd L, dan Et A, 2004 Pomegranate Juice Consumption for 3 Years by Patients with Carotid Artery Stenosis Reduces Common Carotid Intima-Media Thickness, Blood Pressure and Ldl Oxidation. Clin Nutr 23, 423–33.

Bader M, Peters J, Baltatu O, Muller D, Luft F, dan Ganten D, 2001. Tissue Renin- Angiotensin Systems: New Insights from Experimental Animal Models in Hypertension Research. J Mol Medicine, 79, 76–102.

Bae J-Y, Choi J-S, Kang S-W, Lee Y-J, Park J, dan Kang Y-H, 2010. Dietary Compound Ellagic Acid Alleviates Skin Wrinkle and Inflammation Induced by Uv-B Irradiation. Exp Dermatol, 19, e182–90.

Barst R, Mcgoon M, Elliott G, Foreman A, Miller D, dan Ivy D, 2012. Survival in Childhood Pulmonary Arterial Hypertension Insights from the Registry to



Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management. Circulation, 125, 113-22.

Barst R, Rubin L, Long W, Mcgoon M, Rich S, dan Badesch D, 1996. A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with

Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 334, 296-301.

Berger R, Beghetti M, Humpl T, Raskob G, Ivy D, Jing Z, dan Dkk, 2012. Critical Features of Paediatric Pulmonary Hypertension. Lancet, 379, 537–46.

Blanchette F, Day R, Dong W, Laprise M, dan Dubois C, 1997. Tgfβ1 Regulates Gene Expression of Its Own Converting Enzyme Furin. J Clin Invest, 99, 1974–83.

Border W, dan Noble N, 1994. Transforming Growth Factor Β in Tissue Fibrosis. N Engl J Med, 331, 1286-92.

Brilla C, dan Weber K, 1992. Reactive and Reparative Myocardial Fibrosis in Arterial Hypertension in the Rat. Cardiovasc Res 26, 671 -7.

Campbell D, 2008. Critical Review of Prorenin and (Pro)Renin Receptor Research. Hypertension, 51, 1259-64.

Cerda B, Ceron J, Tomas-Barberan F, dan Espin J, 2003. Repeated Oral Administration of High Doses of the Pomegranate Ellagitannin Punicalagin to Rats for 37 Days Is Not Toxic. J Agric Food Chem, 51, 3493-501.

Cerro M, Abman S, Diaz G, Freudenthal A, Freudenthal F, dan Harikrishnan, 2011. A Consensus Approach to the Classification of Pediatric Pulmonary Hypertensive Vascular Disease: Report from the Pvri Pediatric Taskforce, Panama 2011. Pulm Circ, 1, 286-98.

Chamseddine A, dan Miller F, 2003. Gp91phox Contributes to Nadph Oxidase Activity in Aortic Fibroblasts but Not Smooth Muscle Cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285, H2284–9.

Chan E, Dusting G, Guo N, Peshavariya H, Taylor C, Dilley R, dkk. , 2010. Prostacyclin Receptor Suppresses Cardiac Fibrosis: Role of Creb Phosphorylation. J Mol Cell Cardiol, 49, 176–85.

Cheng T-H, Cheng P-Y, Shih N-L, Chen I-B, Wang D, dan Chen J-J, 2003. Involvement of Reactive Oxygen Species in Angiotensin Ii-Induced Endothelin-1 Gene Expression in Rat Cardiac Fibroblasts. J Am Coll Cardiol, 42, 1845-54.



Chin K, Nick, Kim, dan Rubin L, 2005. The Right Ventricle in Pulmonary Hypertension. Coron Artery Dis 16, 13–8.

Chin K, dan Rubin L, 2008. Pulmonary Arterial Hypertension. JACC 51, 1527-38.

Christman B, Mcperson C, Newman J, King G, Bernard G, dan Groves B, 1992. An Imbalance between the Excretion of Thromboxane and Prostayclin Metabolites in Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 327, 70-5.

Clark J, Dedon T, Wayner E, dan Carter W, 1989. Effects of Interferon-'Y on Expression of Cell Surface Receptors for Collagen and Deposition of Newly Synthesized Collagen by Cultured Human Lung Fibroblasts. J Clin Invest, 83, 1505-11.

Clozel M, dan Salloukh H, 2005. Role of Endothelin in Fibrosis and Anti-Fibrotic Potential of Bosentan. Ann Med, 37, 2–12.

Colombo E, Sangiovanni E, dan Dell’agli M, 2013. A Review on the Anti-Inflammatory Activity of Pomegranate in the Gastrointestinal Tract. J Evid Based Complementary Altern Med, 2013, 1-11.

Corbett S, Daniel J, Drayton R, Field M, Steinhardt R, dan Garrett N, 2010. Evaluation of the Anti-Inflammatory Effects of Ellagic Acid. J Perianesth Nurs, 25, 214-20.

D'alonzo G, Barst R, Ayres S, Bergofsky E, Brundage B, Detre K, dan Fishman A, 1991. Survival in Patients with Primary Pulmonary Hypertension. Ann Intern Med, 115, 343-34.

Devipriya N, Srinivasan M, Sudheer A, dan Vp VM, 2007. Effect of Elagic Acid, a Natural Polyphenol on Alcohol Induced Prooxidant and Antioxidant Imbalance : A Drug Dose Dependent Study. Singapore Med J 48, 311-8.

Dolinay T, Kim YS, Howrylak J, Hunninghake G, An CH, Fredenburgh L, dan Dkk, 2012. Inflammasome-Regulated Cytokines Are Critical Mediators of Acute Lung Injury. Am J Respir Crit Care Med 185, 1225-34.

Duarte JD, Hanson RL, dan Machado RF, 2013. Pharmacologic Treatments for Pulmonary Hypertension. Future Cardiol, 9, 335-49.

Durmowicz A, Orton E, dan Stenmark K, 1993. Progressive Loss of Vasodilatorresponsive Component of Pulmonary Hypertension in



Neonatalcalves Exposed to 4,570 M. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 265, H2175-83.

Edwards D, Murphy G, Reynolds J, Whitham S, Docherty A, dan Angel P, 1987. Transforming Growth Factor Beta Modulates the Expression of Collagenase and Metalioproteinase Inhibitor. EMBO J 6 1899-904.

Fan D, Tawale A, Lee J, dan Kassiri Z, 2012. Cardiac Fibroblasts, Fibrosis and Extracellular Matrix Remodeling in Heart Disease. Fibrogenesis Tissue Repair 5, 15.

Franco V, 2012. Right Ventricular Remodeling in Pulmonary Hypertension. Heart Failure Clin 8 403–12.

Francois H, Athirakul K, Howell D, Dash R, Mao L, dan Kim H, 2005. Prostacyclin Protects against Elevated Blood Pressure and Cardiac Fibrosis. Cell Metab, 2, 201–7.

Galie` N, Hoeper M, Humbert M, Torbicki A, Vachiery J-L, Barbera JA, dan Et A, 2009. Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension. Eur Heart J 30, 2493–537.

George M, Champion H, Simon M, Guyach S, Tarantelli R, Kling H, dkk. , 2012. Physiologic Changes in a Nonhuman Primate Model of Hiv-Associated Pulmonary Arterial Hypertension. Am J Respir Cell mol Biol, 48, 374-81.

Ghofrani H, Barst R, Benza R, Champion H, Fagan K, Grimminger F, dkk. , 2009. Future Perspective for the Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension J Am Coll Cardiol, 54, S108-S17.

Giaid A, Yanagisawa M, Langleben D, Michel R, Levy R, dan Shennib H, 1993. Expresion of Endothelin-1 in the Lungs of Patients with Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 328, 1732–9.

Gomez-Arroyo J, Farkas L, Alhussaini A, Farkas D, Kraskauskas D, Voelkel N, dan Bogaard H, 2012. The Monocrotaline Model of Pulmonary Hypertension in Perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 302, L363-9.

Gong W, Yan M, Chen J, Chaugai S, Chen C, dan Wang D, 2014. Chronic Inhibition of Cyclic Guanosine Monophosphate-Specific Phosphodiesterase 5 Prevented Cardiac Fibrosis through Inhibition

of Transforming Growth Factor Β-Induced Smad Signaling. Front Med 8, 445–55.



Guignabert C, Raffestin B, Benferhat R, Raoul W, Zadigue P, Rideau D, dkk. , 2005. Serotonin Transporter Inhibition Prevents and Reverses Monocrotalineinduced Pulmonary Hypertension in Rats. Circulation, 111, 2812–9.

Gurevitch J, Frolkis I, Yuhas Y, Lifschitz-Mercer B, Berger E, Paz Y, dan Dkk, 1997. Anti–Tumor Necrosis Factor-Alpha Improves Myocardial Recovery after Ischemia and Reperfusion. JACC 30, 1554–61.

Haber SL, Joy JK, dan Largent R, 2011. Antioxidant and Antiatherogenic Effects of Pomegranate. Am J Health Syst Pharm 68, 1302-5.

Hamid I 2015. Pengenalan, Pemeliharaan, Dan Manajemen Pemilihan Hewan Coba. dalam: Suryaningtyas, W., Prasetyo, R., dan Dewi, B. (eds.) Penelitian Dan Teknik Laboratorium Pada Hewan Coba Dan Manusia. Surabaya: Airlangga University Press.

Handoko M, Man FD, Allaart C, Paulus W, Westerhof N, dan Vonk-Noordegraaf A, 2010. Perspectives on Novel Therapeutic Strategies for Right Heart Failure in Pulmonary Arterial Hypertension: Lessons from the Left Heart. Eur Respir Rev, 19, 72–82.

Hanif K, dan Dikshit M 2010. Effect of Aqueous Extract of Punica Granatum (Pomegranate) on Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension in Rats. Recent trends and future perspectives in high aktitude pulmonary research. Leh Ladakh J&K India.

Hemmati A, Rezaie A, dan Darabpour P, 2013. Preventive Effects of Pomegranate Seed Extract on Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Rat. Nat Pharm Prod, 8, 76-80.

Hironakaa E, Hongob M, Sakai A, Mawatarid E, Terasawae F, Okumurae N, dkk. , 2003 Serotonin Receptor Antagonist Inhibits Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension and Prolongs Survival in Rats$. Cardiovasc Res, 60, 692 – 9.

Humbert M, Sitbon O, dan Simonneau G, 2004. Treatment of Pulonary Hypertension. N Engl J Med, 351, 1425-36.

Ignarro LJ, Balestrieri ML, dan Napoli C, 2007. Nutrition, Physical Activity, and Cardiovascular Disease: An Update. Cardiovasc Res, 73, 326-40.

Ignotzand R, dan Massague J, 1986. Transforming Growth Factor-Β Stimulates the Expression of Fibronectin and Collagen and Their Incorporatioin to the Extracellular Matrix. J Biol Chem, 261, 4337-45.



Iradale J, 2001. Stellate Behaviour Cell During Resolution of Liver Injury. Semin Liver Dis, 21, 427-36.

Ivy DD, Abman S, Barst RJ, Berger RMF, Bonnet D, dan Fleming TR, 2013. Pediatric Pulmonary Hypertension. JACC, 62, 117-26.

Javanmard DH, dan Rafiee L, 2015. Antiangiogenic and Antiproliferative Effects of Black Pomegranate Peel Extract on Melanoma Cell Line. RPS, 10, 117-24.

Jianbo, Yan Z, Schwartz DE, Yu J, dan Asrar, 2013. Activation of Nlrp3 Inflammasome in Alveolar Macrophages Contributes to Mechanical Stretch-Induced Lung Inflammation and Injury. J Immunol, 1-10.

Jurenka J, 2008. Therapeutic Applications of Pomegranate (Punica Granatum L): A Review. Altern Med Rev 13, 129-44.

Kai H, Kuwahara F, Tokuda K, dan Imaizumi T, 2005. Diastolic Dysfunction in Hypertensive Hearts: Roles of Perivascular Inflammation and Reactive Myocardial Fibrosis. Hypertens Res, 28, 483–90.

Kay J, Suyama K, dan Keane P, 1982. Failure to Show Decrease in Small Pulmonary Blood Vessels in Rats with Experimental Pulmonary Hypertension. Thorax 32, 927-30.

Kholifah M, 2010. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Etanol Buah Delima (Punica Granatum Linn.) Terhadap Peningkatan Apoptosis Sel Kanker Lidah Manusia Sp-C1 in Vitro. Biomed., 2, 72-80.

Kisseleva T, dan Brenner D, 2008. Mechanisms of Fibrogenesis. Exp Biol Med, 233, 109–22.

Kolettis T, Vlahos A, Louka M, Hatzistergos K, Baltogiannis G, Agelaki M, dkk. , 2007. Characterisation of a Rat Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Hellenic J Cardiol, 48, 206-10.

Kong P, Christia P, G N, dan Frangogiannis, 2014. The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis. Cell Mol Life Sci, 71, 549–74.

Kuhn K, 1987. Structure and Function of Collagen Types. FASEB J, 5, 2814.

Lai Y, Olson J, dan Gillespie M, 1991. Ventilatory Dysfunction Precedes Pulmonary Vascular Changes in Monocrotaline-Treated Rats. J Appl Physiol, 70, 561–6.



Leask A, 2010. Potential Therapeutic Targets for Cardiac Fibrosis Tgf, Angiotensin, Endothelin, Ccn2, and Pdgf, Partners in Fibroblast Activation. Circ Res, 106, 1675-80.

Lee W-J, Ou H-C, Hsu W-C, Chou M-M, Tseng J-J, Hsu S-L, dkk. , 2010. Ellagic Acid Inhibits Oxidized Ldl-Mediated Lox-1 Expression, Ros Generation, and Inflammation in Human Endothelial Cells. J Vasc Surg, 52, 1290-300.

Levy M, Celermajer D, Szezepanski I, Boudjemline Y, dan Bonnet D, 2013. Do Tertiary Paediatric Hospitals Deal with the Same Spectrum of Paediatric Pulmonary Hypertension as Multicentre Registries? Eur Respir J, 41, 236–9.

Lez AG, Pez BaL, dan Dı´Ez J, 2004. Fibrosis in Hypertensive Heart Disease: Role of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. Med Clin N Am 88 83–97.

Liu P, Yan S, Chen M, Chen A, Yao D, Xu X, dkk. , 2015. Effects of Baicalin on Collagen Ι and Collagen Ιιι Expression in Pulmonary Arteries of Rats with Hypoxic Pulmonary Hypertension. Int J Mol Med, 35, 901-8.

Loon RLEV, Roofthooft MTR, Hillege HL, Harkel AT, Osch-Gevers MV, Delhaas T, dkk. , 2011. Pediatric Pulmonary Hypertension in the Netherlands Epidemiology and Characterization During the Period 1991 to 2005. Circulation, 124, 1755-64.

Loon RV, Roofthooft M, dan Berger R, 2009. Pulmonary Arterial Hypertension in Children with Congenital Heart Disease. PVRI rev, 1, 203-7.

Lopez-Reyes A, Arroyo-Curas N, Cano B, Lara-Diaz V, Guajardo-Salinas G, Islas J, dkk. , 2008. Black Bean Extract Ameliorates Liver Fibrosis in Rat with C C14 Induced Injury. Annals of hepatol, 7, 130-5.

Macgowan G, Mann D, Kormos RL, Feldman AM, dan Murali S, 1997. Circulating Interleukin-6 in Severe Heart Failure. Am J Cardiol, 79, 1128-31.

Man FD, Tu L, Rain MHS, Ruiter G, Francois CN, dan Dkk, 2012. Dysregulated Renin–Angiotensin–Aldosterone System Contributes to Pulmonary Arterial Hypertension. Am J Respir Crit Care Med, 186, 780–9.

Marcus J, Ct G, Jj Z, Boonstra A, Alaart C, Jkw M, dkk. , 2008. Interventricular Mechanical Asynchrony in Pulmonary Arterial Hypertension Left-to-Right Delay in Peak Shortening Is Related to Right Ventricular Overload and Left Ventricular Underfilling. J Am Coll Cardiol, 51, 750-7.



Marini M, Carpi S, Bellini A, Patalano F, dan Mattoli S, 1996. Endothelin-1 Induces Increased Fibronectin Expression in Human Bronchial Epithelial Cells. Biochem Biophys Res

Commun, 220, 896–9.

Marrone G, Mamone G, Luca A, Vitulo P, Bertani A, Pilato M, dkk. , 2010. The Role of 1.5t Cardiac Mri in the Diagnosis, Prognosis and Management of Pulmonary Arterial Hypertension. Int J Cardiovasc Imaging, 26, 655-81.

Martinon F, 2010 Signaling by Ros Drives Inflammasome Activation. Eur J Immunol 40, 616–9.

Miyauchi T, Yorikane R, Sakai S, Sakurai T, Okada M, dan Nishikibe M, 1993. Contribution of Endogenous Endothelin-1 to the Progression of Cardiopulmonary Alterations in Rats with Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension. Circ Res, 73.

Mohan M, Waghulde H, dan Kasture S, 2010. Effect of Pomegranate Juice on Angiotensin Ii-Induced Hypertension in Diabetic Wistar Rats. Phytother Res, 24, S196–203.

Nagase H, Visse R, dan Murphy G, 2006. Structure and Function of Matrix Metalloproteinases and Timps. Cardiovasc Res, 69, 562 – 73.

Nagase H, dan Woessner J, 1999. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 274, 21491 – 4.

Nicoletti A, Heudes D, Mandet C, Hinglais N, Bariety J, dan Michel J, 1996 Inflammatory Cells and Myocardial Fibrosis: Spatial and Temporal Distribution in Renovascular Hypertensive Rats. Cardiovasc Res, 32, 1096-107.

Nicoletti A, dan Michel J-B, 1999. Cardiac Fibrosis and Inflamation: Interaction with Hemodynamic and Hormonal Factors. Cardiovasc res, 41, 532-43.

Norton C, Broughton B, Jernigan N, Walker B, dan Resta T, 2013. Enhanced Depolarization-Induced Pulmonary Vasoconstriction Following Chronic Hypoxia Requires Egfr Dependent Activation of Nad(P)H Oxidase 2. Antioxid Redox Signal, 18, 1777–88

Nuisson B, Laflamme L, Bottari S, Gasparof MD, Gallo-Payet N, dan Payet M, 1995. A G Protein Is Involved in the Angiotensin At2 Receptor Inhibition of the T-Type Calcium Current in Non-Differentiated Ng108-15 Cells. J Biol chem, 270, 1670-4.



Ohtsu H, Frank G, Utsunomiya H, dan Eguchi S, 2005. Redox-Dependent Protein Kinase Regulation by Angiotensin Ii: Mechanistic Insights and Its Pathophysiology. Antioxid Redox Signal, 7, 1315-26.

Okada K, Bernstein M, Zhang W, Schuster D, dan Botney M, 1998. Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition Delays Pulmonary Vascular Neointimal Formation. Am J Respir Crit Care Med, 158, 939–50.

Pacurari M, Kafoury R, Tchounwou P, dan Ndebele K, 2014. The Renin-Angiotensin-Aldosterone System in Vascular Inflammation and Remodeling. Int J Inflam, 2014, 1-13.

Pimenta E, dan Oparil S, 2009. Role of Aliskiren in Cardio-Renal Protection and Use in Hypertensives with Multiple Risk Factors. Vasc Health Risk Manag, 5, 453–63.

Rabinovitch M, 2005. Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Hypertension Conference Summary. Chest, 128, 642S-6S.

Raghu G, Masta S, Dm D, dan Narayanan S, 1989. Collagen Synthesis by Normal and Fibrotic Human Lung Fibroblasts and the Effect of Transforming Growth Factor-Β. Am Rev Respir Dis, 140, 95-100.

Rahman MA. 2016. Efek Ekstrak Buah Delima Terstandar Elagic Acid 40% Terhadap Hambatan Progresivitas Hipertensi Arteri Pulmonalis Pada Tikus Sprague Dawley Melalui Regulasi Fibrosis Pada Dinding Arteri Pulmonalis. Komunikasi Personal, Universitas Airlangga.

Raja S, dan Raja S, 2011. Treating Pulmonary Arterial Hypertension: Current Treatments and Future Prospects. Ther Adv Chronic Dis, 2, 359–70.

Ramirez-Yanez G, Hamlet S, Jonarta A, Seymour G, dan Symons A, 2006. Prostaglandin E2 Enhances Transforming Growth Factor-Beta 1 and Tgf-Beta Receptors Synthesis: An in Vivo and in Vitro Study. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 74, 183–92.

Ricciotti E, dan Fitzgerald G, 2011. Prostaglandins and Inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31, 986–1000.

Ritchie M, Alan D, Qaggoner, Victor G, Davila R, Benico B, dkk. , 1993. Echocardiographic Characterization of the Improvement in Right Ventricular Function in Patients with Severe Pulmonary Hypertension after Single-Lung Transplantation. JACC, 22, 1170-4.



Rizvi M, Katwa L, Spadone D, dan Myers P, 1996. The Effects of Endothelin-1 on Collagen Type I and Type Iii Synthesis in Cultured Porcine Coronary Artery Vascular Smooth Muscle Cells. J Mol Cell Cardiol, 28, 243–52.

Roehl A, Steendijk P, Baumert J, Schnoor J, R rossaint, dan Hein M, 2009. Comparison of 3 Methods to Induce Acute pulmonary hypertension in Pigs. Comp Med, 59, 280-6.

Rosenkranz S, 2004. Tgf-H1 and Angiotensin Networking in Cardiac Remodeling. Cardiovas Res, 63 423– 32.

Rosenkranz S, Flesch M, Amann K, Haeuseler C, Kilter H, Seeland U, dan Et A, 2002. Alterations of Β-Adrenergic Signaling and Cardiac Hypertrophy in Transgenic Mice Overexpressing Tgf-Β1. Am J Physiol, 283, 1253-62.

Russell R, 1988. Side Effects of Calcium Channel Blockers. Hypertension, 11, II42-4.

Sandmann S, Claas R, Cleutjens J, Daemen M, dan Unger T, 2001. Calcium Channel Blockade Limits Cardiac Remodeling and Improves Cardiac Function in Myocardial Infarction–Induced Heart Failure in Rats. J Cardiovasc Pharmacol, 37, 64–77

Saputro I. 2013. Regulasi Fibrosis Pada Kulit Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Dengan Luka Bakar Derajat 2 Yang Mendapat Terapi Ekstrak Buah Delima Terstandard Elagic Acid 40% (Studi Eksperimental Laboratorium). Disertasi, Universitas Airlangga.

Satravaha G, Gassman G, Sangtherapitikul P, dan Grimm W, 2005. Adjunctive Periodontal Theraphy with Cantella Asiatica and Punica Granatum Extracts in Supportive Periodontal Theraphy. J Int Acad Periodontol, 7, 70-9.

Sciavolinol P, Lee T, dan Vileek J, 1994. Interferon-P Induces Metalloproteinasme Rna Expression in Human Fibroblasts. J Biol Chem, 269, 21627-34.

Seeram NP, Adams LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, dan Heber D, 2005. In Vitro Antiproliferative, Apoptotic and Antioxidant Activities of Punicalagin, Ellagic Acid and a Total Pomegranate Tannin Extract Are Enhanced in Combination with Other Polyphenols as Found in Pomegranate Juice. J Nutr Biochem, 16, 360-7.



Shen L, Shen J, Pu J, dan He B, 2011. Aspirin Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension in Rats by Reducing Plasma 5-Hydroxytryptamine Levels. Cell Biochem Biophys, 61, 23–3.

Shi-Wen X, Denton C, Dashwood M, Holmes A, Bou-Gharios G, dan Pearson J, 2001. Fibroblast Matrix Gene Expression and Connective Tissue Remodeling: Role of Endothelin-1. J Invest Dermatol, 116, 417–25.

Shi-Wen X, Howat S, Renzoni E, Holmes A, Pearson J, dan Dashwood M, 2004. Endothelin-1 Induces Expression of Matrix-Associated Genes in Lung Fibroblasts through Mek/Erk. J Biol Chem, 279, 23098–103.

Siwk D, Pagano P, dan Colucc W, 2001. Oxidative Stress Regulates Collagen Synthesis and Matrix Metalloproteinase Activity in Cardiac Fibroblasts Am J Physiol Cell Physiol, 280, C53–60.

Stratton R, Rajkumar V, Ponticos M, Nichols B, Shiwen X, dan Cm CB, 2002. Prostacyclin Derivatives Prevent the Fibrotic Response to Tgf-Beta by Inhibiting the Ras/Mek/Erk Pathway. Faseb J 16, 1949–51.

Suzuki Y, Steinhorn R, dan Gladwin M, 2013. Antioxidant Therapy for the Treatment of Pulmonary Hypertension. Antioxid Redox Signal 18 1723–6.

Tabima D, Frizzell S, dan Gladwin M, 2012. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Pulmonary Hypertension. Free Radic Biol Med 52 1970–86.

Tag CG, Sauer-Lehnen S, Weiskirchen S, Borkham-Kamphorst E, Tolba RH, Tacke F, dan Weiskirchen R, 2015. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J Vis Exp, 9, 1-11.

Takatsuki S, dan Dunbar D, 2013. Current Challenges in Pediatric Pulmonary Hypertension. Semin Respir Crit Care Med 34, 627–44.

Tanaka R, dan Shimizu M, 2012. The Relationship between Reactive Oxygen Species and Cardiac Fibrosis in the Dahl Salt-Sensitive Rat under Acei Administration. Vet Med Int, 2012, 1-6.

Tang B, Chen G-X, Liang M-Y, Yao J-P, dan Wu Z-K, 2015. Ellagic Acid Prevents Monocrotaline-Induced Pulmonary Artery Hypertension Via Inhibiting Nlrp3 Inflammasome Activation in Rats. Int J Cardiol 180, 134–41.



Toklu H, Dumlu M, Sehirli Ö, Ercan F, Gedik N, Gökmen V, dan Sener G, 2007. Pomegranate Peel Extract Prevents Liver Fibrosis in Biliary-Obstructed Rats. JPP 59, 1287–95.

Tomasek J, Gabbiani G, Hinz B, Chaponnier C, dan Brown R, 2002. Myofibroblasts and Mechanoregulation of Connective Tissue Remodelling. Mol Cell Biol, 3, 349-63.

Touyz RM, 2005. Reactive Oxygen Species as Mediators of Calcium Signaling by Angiotensin Ii: Implications in Vascular Physiology and Pathophysiology. Antioxid Redox Signal, 7, 1302-17.

Tschopp J, dan Schroder K, 2010 Nlrp3 Inflammasome Activation:The Convergence of Multiple Signalling Pathways on Ros Production? Nat Rev Immunol, 10 210–215.

Vidal A, Fallarero A, Pena BR, Em M, Gra B, Rivera F, dkk. , 2003. Studies on the Toxicity of Punica Granatum L. (Punicaceae) Whole Fruit Extracts. J Ethnopharmacol, 89, 295-300.

Villegas L, Kluck D, Field C, Oberley-Deegan R, Woods C, dan Yeager M, 2013. Superoxide Dismutasemimetic,Mnte-2-Pyp, Attenuates Chronic Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension, Pulmonary Vascular Remodeling, and Activation of the Nalp3 Inflammasome. Antioxid Redox Signal 18, 1753–64.

Voelkel N, Quaife R, Leinwand L, Barst R, Mcgoon M, Meldrum D, dkk. , 2006. Right Ventricular Function and Failure Report of a National Heart, Lung, and Blood Institute Working Group on Cellular and Molecular Mechanisms of Right Heart Failure. Circulation 114, 1883-91.

Voelkel N, dan Tuder R, 2000. Hypoxia-Induced Pulmonary Vascular Remodeling: A Model for What Human Disease? J Clin Invest, 106, 733-8.

Waghulde H, Mohan M, Kasture S, dan Balaraman R, 2010. Punica Granatum Attenuates Angiotensin-Ii Induced Hypertension in Wistar Rats. Int J PharmTech Res, 2, 60-67.

Wang W, Liu R, Cao G, Zhang F, Zhang Y, Zhang Z, dan Wu S, 2009. A Reliable Rabbit Model for Hyperkinetic Pulmonary Hypertension. Journal Thorac Cardiovasc Surg 140.

Wardle A, dan Tulloh R, 2012. Update on Pulmonary Arterial Hypertension in Children: Management Strategies and Clinical Utility of Sildenafil. Pediatric Health Med Ther, 3, 59–67.



Wedgwood S, Lakshminrusimha S, Czech L, Schumacker P, dan Steinhorn R, 2013. Increased P22phox/Nox4 Expression Is Involved in Remodeling through Hydrogen Peroxide Signaling in Experimental Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn. Antioxid Redox Signal, 18, 1765–76.

Wei X-L, Fang R-T, Yang Y-H, Bi X-Y, Ren G-X, Luo A-L, dkk. , 2015. Protective Effects of Extracts from Pomegranate Peels and Seeds on Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Rats. BMC Complementary and Alternative Medicine, 15, 1-9.

Wilson D, Segall H, Pan C, Lame W, dan Morin E, 1992. Mechanisms and Pathology of Monocrotaline Pulmonary Toxicity. Crit Revi in Toxicol, 22, 307-25

Wynn T, 2008. Cellular and Molecular Mechanisms of Fibrosis. J Pathol, 214, 199–210.

Xu Y, Deng J, Ma J, Chen S, Marshall R, dan Jones S, 2003. DNA Damaging Activity of Ellagic Acid Derivatives. Bioorg Med Chem 11, 1593–6.

Yokoyama T, Nakano M, Bedarczyk J, Mcintyre B, Entman M, dan Mann D, 1997. Tumor Necrosis Factor-Alpha Provokes a Hypertrophic Growth Response in Adult Cardiac Myocytes. Circulation, 95, 1247-52.

Yu H, Gallagher A, Garfin P, dan Printz M, 1997. Prostacyclin Release by Rat Cardiac Fibroblasts. Hypertension 30, 1047–53.

Yuniarti W. 2012. Efek Antifibrotik Ekstrak Buah Delima (Punika Granatum L) Pada Fibrosis Hati. Disertasi.

Yuniarti WM, Handajani R, Kusumobroto HO, dan Sudiana K, 2013. Ekstrak Buah Delima Terstandar Menurunkan Derajat Fibrosis Hati Pada Hewan Model Tikus Putih. Veteriner J., 14, 511-8.

Zaiman AL, Podowski M, Medicherla S, Gordy K, Xu F, Zhen L, dkk. , 2008. Role of the Tgf-B/Alk5 Signaling Pathway in Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension. Am J Respir Crit Care Med 177, 896–905.

Zarfeshany A, Asgary S, dan Javanmard SH, 2014. Potent Health Effects of Pomegranate. Adv Biomed Res, 3, 1-8.

Zhao W, Zhao T, Chen Y, Ahokas R, dan Sun Y, 2008 Oxidative Stress Mediates Cardiac Fibrosis by Enhancing Transforming Growth Factor-Beta1 in Hypertensive Rats. Mol Cell Biochem 317, 43–50.



Lampiran 3. Sertifikat Ekstrak Buah Delima



Lampiran 4. Hasil Pengolahan Data

Kelompok perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig.

BBawal

K2 .809 6 .071 K4 .912 4 .492 P2 .785 6 .043 P4 .920 6 .509

BBakhir

K2 .990 6 .989 K4 .963 4 .795 P2 .847 6 .149 P4 .907 6 .417

TDsis

K2 .826 6 .099 K4 .935 4 .622 P2 .963 6 .840 P4 .964 6 .853

TDdias

K2 .960 6 .823 K4 .900 4 .430 P2 .963 6 .845 P4 .962 6 .837

Berat paru

K2 .909 6 .428 K4 .942 4 .666 P2 .842 6 .135 P4 .942 6 .674

NPar Tests Kruskal-Wallis Test

Ranks Kelompok perlakuan N Mean Rank

BBawal

K2 6 11.00 K4 6 15.58 P2 6 11.42 P4 6 12.00 Total 24

Test Statisticsa,b BBawal Chi-Square 1.585 Df 3



Asymp. Sig. .663 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Kelompok perlakuan Oneway

Descriptives BBakhir N Mean Std.

Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum

Maximum

Lower Bound

Upper Bound

K2 6 294.00 39.805 16.250 252.23 335.77 236 351 K4 5 294.40 53.233 23.807 228.30 360.50 220 357 P2 6 318.50 66.455 27.130 248.76 388.24 254 443 P4 6 275.33 33.566 13.703 240.11 310.56 220 311 Total 23 295.61 48.899 10.196 274.46 316.75 220 443

Test of Homogeneity of Variances BBakhir

Levene Statistic df1 df2 Sig. .391 3 19 .761

ANOVA BBakhir Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 5633.445 3 1877.815 .760 .531 Within Groups 46972.033 19 2472.212 Total 52605.478 22 T-Test Kelompok perlakuan = K2

Paired Samples Statisticsa Mean N Std. Deviation Std. Error Mean

Pair 1 BBawal 303.83 6 37.462 15.294 BBakhir 294.00 6 39.805 16.250



a. Kelompok perlakuan = K2 Paired Samples Correlationsa

N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 6 .701 .120 a. Kelompok perlakuan = K2

Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig.

(2-tailed)

Mean Std. Deviati

on

Std. Error Mean

95% Confidence Interval of the

Difference Lower Upper

Pair 1

BBawal – Bbakhir

9.833 29.929 12.219 -21.576 41.242 .805 5 .457

a. Kelompok perlakuan = K2 Kelompok perlakuan = K4



a. Kelompok perlakuan = K4

Paired Samples Correlationsa N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 5 .192 .757 a. Kelompok perlakuan = K4

Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig. (2-

tailed) Mean Std. Deviati

on

Std. Error Mean



Pair 1

BBawal - BBakhir

20.400

54.985 24.590 -47.872 88.672 .830 4 .453

a. Kelompok perlakuan = K4



Kelompok perlakuan = P4



a. Kelompok perlakuan = P4

Paired Samples Correlationsa N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 6 .647 .165 a. Kelompok perlakuan = P4

Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig. (2-

tailed) Mean Std. Deviatio

n

Std. Error Mean



Pair 1 BBawal - BBakhir

25.000 25.791 10.529 -2.066 52.066 2.374 5 .064

a. Kelompok perlakuan = P4 NPar Tests Kelompok perlakuan = P2 Wilcoxon Signed Ranks Test

Ranksa N Mean Rank Sum of Ranks

BBakhir - BBawal

Negative Ranks 1b 4.00 4.00 Positive Ranks 5c 3.40 17.00 Ties 0d Total 6

a. Kelompok perlakuan = P2 b. BBakhir < BBawal



c. BBakhir > BBawal d. BBakhir = BBawal

Test Statisticsa,b BBakhir -

BBawal Z -1.367c Asymp. Sig. (2-tailed) .172 a. Kelompok perlakuan = P2 b. Wilcoxon Signed Ranks Test c. Based on negative ranks. Oneway

Descriptives N Mean Std.

Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum

Maximum

Lower Bound

Upper Bound

TDsis

K2 6 66.642 11.0694 4.5191 55.025 78.258 45.9 79.1 K4 4 65.025 5.4999 2.7500 56.273 73.777 59.5 71.4 P2 6 41.467 13.4723 5.5000 27.328 55.605 20.5 57.4 P4 6 44.733 12.6633 5.1698 31.444 58.023 26.0 60.6 Total 22 53.507 15.9017 3.3903 46.456 60.557 20.5 79.1

TDdias

K2 6 37.900 4.2591 1.7388 33.430 42.370 30.9 42.8 K4 4 37.275 7.9943 3.9972 24.554 49.996 26.9 44.1 P2 6 20.617 7.2486 2.9592 13.010 28.224 10.7 32.6 P4 6 26.283 9.1458 3.7338 16.685 35.881 13.7 38.2 Total 22 29.905 10.1430 2.1625 25.407 34.402 10.7 44.1

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig. TDsis .913 3 18 .454 TDdias .978 3 18 .425



ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

TDsis

Between Groups

2897.455 3 965.818 7.205 .002

Within Groups 2412.716 18 134.040 Total 5310.171 21

TDdias

Between Groups

1197.125 3 399.042 7.456 .002

Within Groups 963.364 18 53.520 Total 2160.490 21

Post Hoc Tests Multiple Comparisons

LSD Dependent Variable

(I) Kelompok perlakuan

(J) Kelompok perlakuan

Mean Difference

(I-J)

Std. Error

Sig. 95% Confidence Interval

Lower Bound

Upper Bound

TDsis

K2 K4 1.6167 7.4733 .831 -14.084 17.317 P2 25.1750* 6.6843 .001 11.132 39.218 P4 21.9083* 6.6843 .004 7.865 35.952

K4 K2 -1.6167 7.4733 .831 -17.317 14.084 P2 23.5583* 7.4733 .006 7.858 39.259 P4 20.2917* 7.4733 .014 4.591 35.992

P2 K2 -25.1750* 6.6843 .001 -39.218 -11.132 K4 -23.5583* 7.4733 .006 -39.259 -7.858 P4 -3.2667 6.6843 .631 -17.310 10.777

P4 K2 -21.9083* 6.6843 .004 -35.952 -7.865 K4 -20.2917* 7.4733 .014 -35.992 -4.591 P2 3.2667 6.6843 .631 -10.777 17.310

TDdias

K2 K4 .6250 4.7223 .896 -9.296 10.546 P2 17.2833* 4.2238 .001 8.410 26.157 P4 11.6167* 4.2238 .013 2.743 20.490

K4 K2 -.6250 4.7223 .896 -10.546 9.296 P2 16.6583* 4.7223 .002 6.737 26.580 P4 10.9917* 4.7223 .032 1.070 20.913

P2 K2 -17.2833* 4.2238 .001 -26.157 -8.410 K4 -16.6583* 4.7223 .002 -26.580 -6.737 P4 -5.6667 4.2238 .196 -14.540 3.207

P4 K2 -11.6167* 4.2238 .013 -20.490 -2.743 K4 -10.9917* 4.7223 .032 -20.913 -1.070 P2 5.6667 4.2238 .196 -3.207 14.540

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.



Oneway

Test of Homogeneity of Variances MAP

Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.149 3 18 .356

ANOVA MAP Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups

1667.897 3 555.966 8.832 .001

Within Groups 1133.072 18 62.948 Total 2800.970 21 Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable: MAP LSD (I) Kelompok perlakuan

(J) Kelompok perlakuan

Mean Difference

(I-J)

Std. Error

Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound

K2 P2 19.91389* 4.58070 .000 10.2902 29.5376 K4 .95556 5.12138 .854 -9.8041 11.7152 P4 15.04722* 4.58070 .004 5.4235 24.6709

P2 K2 -19.91389* 4.58070 .000 -29.5376 -10.2902 K4 -18.95833* 5.12138 .002 -29.7180 -8.1987 P4 -4.86667 4.58070 .302 -14.4904 4.7570

K4 K2 -.95556 5.12138 .854 -11.7152 9.8041 P2 18.95833* 5.12138 .002 8.1987 29.7180 P4 14.09167* 5.12138 .013 3.3320 24.8513

P4 K2 -15.04722* 4.58070 .004 -24.6709 -5.4235 P2 4.86667 4.58070 .302 -4.7570 14.4904 K4 -14.09167* 5.12138 .013 -24.8513 -3.3320




Tests of Normality

kelompok

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

TGFB1 minggu 2 (K) .283 6 .143 .921 6 .514

minggu 2 (P) .293 6 .117 .915 6 .473

minggu 4 (K) .312 6 .068 .793 6 .051

minggu 4 (P) .175 6 .200* .923 6 .530

COL1 minggu 2 (K) .223 6 .200* .908 6 .421

minggu 2 (P) .333 6 .036 .814 6 .078

minggu 4 (K) .196 6 .200* .890 6 .316

minggu 4 (P) .254 6 .200* .866 6 .212

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

TGFB1 1.462 3 20 .255

COL1 .879 3 20 .469

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

TGFB1 Between Groups 171.000 3 57.000 11.362 .000

Within Groups 100.333 20 5.017

Total 271.333 23

COL1 Between Groups 198.833 3 66.278 27.052 .000

Within Groups 49.000 20 2.450

Total 247.833 23



Multiple Comparisons

LSD

Depende

nt

Variable (I) kelompok (J) kelompok

Mean

Difference (I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

TGFB1 minggu 2 (K) minggu 2 (P) 2.833* 1.293 .040 .14 5.53

minggu 4 (K) -3.667* 1.293 .010 -6.36 -.97

minggu 4 (P) 2.833* 1.293 .040 .14 5.53

minggu 2 (P) minggu 2 (K) -2.833* 1.293 .040 -5.53 -.14

minggu 4 (K) -6.500* 1.293 .000 -9.20 -3.80

minggu 4 (P) .000 1.293 1.000 -2.70 2.70

minggu 4 (K) minggu 2 (K) 3.667* 1.293 .010 .97 6.36

minggu 2 (P) 6.500* 1.293 .000 3.80 9.20

minggu 4 (P) 6.500* 1.293 .000 3.80 9.20

minggu 4 (P) minggu 2 (K) -2.833* 1.293 .040 -5.53 -.14

minggu 2 (P) .000 1.293 1.000 -2.70 2.70

minggu 4 (K) -6.500* 1.293 .000 -9.20 -3.80

COL1 minggu 2 (K) minggu 2 (P) 2.833* .904 .005 .95 4.72

minggu 4 (K) -3.333* .904 .001 -5.22 -1.45

minggu 4 (P) 4.167* .904 .000 2.28 6.05

minggu 2 (P) minggu 2 (K) -2.833* .904 .005 -4.72 -.95

minggu 4 (K) -6.167* .904 .000 -8.05 -4.28

minggu 4 (P) 1.333 .904 .156 -.55 3.22

minggu 4 (K) minggu 2 (K) 3.333* .904 .001 1.45 5.22

minggu 2 (P) 6.167* .904 .000 4.28 8.05

minggu 4 (P) 7.500* .904 .000 5.61 9.39

minggu 4 (P) minggu 2 (K) -4.167* .904 .000 -6.05 -2.28

minggu 2 (P) -1.333 .904 .156 -3.22 .55

minggu 4 (K) -7.500* .904 .000 -9.39 -5.61




Case Processing Summary

kelompok

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

TGFB1 minggu 2 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 2 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 4 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 4 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

COL1 minggu 2 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 2 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 4 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

minggu 4 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%

Descriptives

kelompok Statistic Std. Error

TGFB1 minggu 2 (K) Mean 9.17 .543

95% Confidence Interval for

Mean

Lower Bound 7.77

Upper Bound 10.56

5% Trimmed Mean 9.19

Median 9.00

Variance 1.767

Std. Deviation 1.329

Minimum 7

Maximum 11

Range 4

Interquartile Range 2

Skewness -.440 .845

Kurtosis 1.335 1.741

minggu 2 (P) Mean 6.33 .422

95% Confidence Interval for Lower Bound 5.25



Mean Upper Bound 7.42


Median 6.00

Variance 1.067


Minimum 5

Maximum 8

Range 3


Skewness .666 .845

Kurtosis .586 1.741

minggu 4 (K) Mean 12.83 1.302


Mean

Lower Bound 9.49

Upper Bound 16.18


Median 12.00

Variance 10.167


Minimum 10

Maximum 19

Range 9


Skewness 1.892 .845


minggu 4 (P) Mean 6.33 1.085


Mean

Lower Bound 3.54

Upper Bound 9.12


Median 6.50

Variance 7.067




Minimum 2

Maximum 9

Range 7


Skewness -.728 .845

Kurtosis .158 1.741

COL1 minggu 2 (K) Mean 10.83 .477


Mean

Lower Bound 9.61

Upper Bound 12.06


Median 11.00

Variance 1.367


Minimum 9

Maximum 12

Range 3


Skewness -.668 .845

Kurtosis -.446 1.741



Mean

Lower Bound 6.85

Upper Bound 9.15


Median 8.00

Variance 1.200


Minimum 6

Maximum 9

Range 3




Skewness -1.369 .845


minggu 4 (K) Mean 14.17 .910


Mean

Lower Bound 11.83

Upper Bound 16.51


Median 14.00

Variance 4.967


Minimum 12

Maximum 18

Range 6


Skewness .991 .845




Mean

Lower Bound 5.09

Upper Bound 8.25


Median 7.00

Variance 2.267


Minimum 5

Maximum 9

Range 4


Skewness .313 .845

Kurtosis -.104 1.741



Lampiran 5. Gambar Tikus Sprague Dawley

Tikus Sprague Dawley. (A). Sebelum pembedahan. (B). Setelah pembedahan. (a); IV catheter 16 G sebagai pipa intubasi, (b): Organ jantung.

A

B a b



Lampiran 6. Gambar Alat Monitor Dash 5000

Alat Monitor Dash 5000. (A). Sebelum dihubungkan dengan arteri pulmonalis. (B) Sesudah dihubungkan dengan arteri pulmonalis. (a) Gambar gelombang tekanan arteri pulmonal. (b). Tekanan sistol (mmHg), (c). Tekanan diastol (mmHg), (d). Denyut jantung.

A

B

a b c

d

ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGArepository.unair.ac.id/55612/14/PPDS. IKA. 17-16 Pra...

Documents

Transcript of ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGArepository.unair.ac.id/55612/14/PPDS. IKA. 17-16 Pra...