ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

Η επιστήμη που ασχολείται με

τη βιολογία των μικροοργανισμών,

τις νόσους που προκαλούν

την διάγνωση των νόσων,

την πρόληψη αυτών και

τη συμβολή στην διαμόρφωση της θεραπείας των νόσων.

ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ

ΒΑΚΤΗΡΙΑ

ΙΟΙ

ΠΑΡΑΣΙΤΑ

ΜΥΚΗΤΕΣ

(PRIONS)

4- Malaria

7- Tuberculosis

9- Hepatitis B

6- HIV/AIDS

3- Food poisoning

5- Strep throat

2- Influenza

8- Lyme disease

1- Giardiasis

ΑΞΙΩΜΑΤΑ ΤΟΥ KOCH (1882) Το αίτιο της λοίμωξης πρέπει να είναι

παρόν σε κάθε περίπτωση της νόσου

Ο μικροοργανισμός να απομονωθεί από την

εστία της λοίμωξης και να αναπτυχθεί in vitro

για μερικές γενεές

Ο μικροοργανισμός ενιέμενος σε πειραματόζωο

πρέπει να προκαλεί την ίδια λοίμωξη

Ο ίδιος μικροοργανισμός πρέπει να

απομονωθεί από το πειραματόζωο

Μικροβιολογικές τεχνικές

Επίπεδα Πληροφορίας

Ανοσολογική

Πληροφορία

Βιοχημική

Πληροφορία

Μικροσκοπική

Πληροφορία

Μακροσκοπική

Πληροφορία

Γενετική

Πληροφορία

Αξία

Πληροφορίας

Μικροσκόπηση

Είδη μικροσκοπίων

Σύνθετο ή κοινό

Ηλεκτρονικό

Αντιθέτου φάσεως

Πολωτικό

Σκοτεινού πεδίου

Φθορισμού

Στερεοσκοπικό 1675 Leenwenhoek :

ανακάλυψε τους

μικροοργανισμούς

Σύνθετο ή κοινό μικροσκόπιο

Το πιο πολύ χρησιμοποιούμενο

Αντικειμενικοί & προσοφθάλμιοι φακοί: 10χ – 2500χ

Διακριτική ικανότητα αντιστρόφως ανάλογη μήκους κύματος ακτινοβολίας

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Τα ηλεκτρόνια ως ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος

Μεγέθυνση: 150000χ – 200000χ

Όχι ζώντες οργανισμοί

Εικόνα πάντα ασπρόμαυρη

Μικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως Ζωντανό υλικό

Χωρίς χρώση & επεξεργασία

Διαφορετικοί δείκτες διάθλασης

This Phase Contrast image of

blood containing colonies of

yeast markers have proven

antibody positive for Candida

Albicans

Μικροσκόπιο φθορισμού Αποκάλυψη

ουσιών που φθορίζουν

Αυτο-φθορισμός

Ετερο-φθορισμός In this picture, monolayers were

permeablized and stained with antisera to

Leishmania amastigotes followed by FITC-

conjugated anti-IgG. Amastigotes appear

green. Macrophages were counterstained

with Propridium iodide. Nuclei appear red.

Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα Ούρα

Κόπρανα

Κολπικό έκκριμα

Μέθοδοι άμεσης εξέτασης Νωπό παρασκεύασμα Ούρα

Κόπρανα

Κολπικό έκκριμα

Πλεονεκτήματα Γρήγορη

Ειδική

Μειονεκτήματα Μικρή διαχωριστική εικανότητα

Εμπειρία

Μέθοδοι άμεσης εξέτασης

Νωπό παρασκεύασμα με ΚΟΗ

Βιολογικό υλικό ύποπτο για μύκητες Δέρμα

Νύχια

Τρίχες

Υγρά αναρρόφησης

Μέθοδοι άμεσης εξέτασης

Νωπό παρασκεύασμα με ΚΟΗ

Βιολογικό υλικό ύποπτο για μύκητες Δέρμα

Νύχια

Τρίχες

Υγρά αναρρόφησης

Πλεονεκτήματα Γρήγορη

Ειδική

Μειονεκτήματα Μικρή διαχωριστική ικανότητα

Εμπειρία

Χρώσεις μικροβίων

Απλές ή γενικές: Σινική μελάνη

Χρώση ιωδίου (Lugol)

Kυανό μεθυλενίου

Σύνθετες γενικές χρώσεις: χρώση Gram

οξεάντοχη χρώση

Ειδικές χρώσεις :σπόρων, ελύτρων, βλεφαρίδων, ρικετσιών, σπειροχαιτών,…

Χρώσεις με φθοριοχρώματα

ΒΕΝΖΟΛΙΟ (ΒΕΝΖΕΝΕ) PhH ή ΦH

Το βασικό στοιχείο της χημικής δομής των χρωστικών.

ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ

Ένας υγρός υδρογονάνθρακας C6H6 παράγωγο της λιθανθρακόπισσας.

Απορροφά ηλεκτομαγνητική ενέργεια μη ορατή (200nm).

Άχρωμος ουσία.

ΧΡΩΜΟΦΟΡΕΣ ΟΜΑΔΕΣ (Chromophores)

Χημική ομάδα που δίνει συγκεκριμένο χρώμα σε μια ένωση.

Η ένταση του χρώματος μιας χρωστικής εξαρτάται από τις

χρωμοφόρες ομάδες που περιέχει.

Η σύζευξη δύο ή περισσότερων χρωμοφόρων ομάδων προκαλεί

μετατόπιση της απορρόφησης της χρωστικής σε μικρότερα ή

μεγαλύτερα μήκη κύματος.

- ΥΠΟΧΡΩΜΙΚΗ/ΜΠΛΕ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ(hypochronic/blue shift)

- ΒΑΘΥΧΡΩΜΙΚΗ/ΕΡΥΘΡΗ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ(bathochromic/red shift)

ΟΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΧΡΩΜΟΦΟΡΕΣ ΟΜΑΔΕΣ

ΑΥΞΟΧΡΟΜΕΣ ΟΜΑΔΕΣ

(auxochromes)

Είναι μιά ομάδα ατόμων, ιόντων, που μπορούν να είναι δέκτες ή δότες

ηλεκρονίων ή και τα δύο (έχουν μη δεσμικά ηλεκτρόνια σθένους).

Μεταδίδουν την ιδιότητα του ηλεκτρολυτικού διαχωρισμού, τον διαχωρισμό

του μορίου της χρωστικής στα συστατικά της ή σε άτομα, δημιουργώντας

δεσμούς αλάτων με τα βακτήρια, ενισχύοντας την αντίδραση ενός δείγματος

με την χρωστική.

Δεν δίνουν χρώμα στην χρωστική αλλά επηρρεάζουν την έντασή της.

Ενισχύουν τη δράση του χρωμοφόρου στο να απορροφήσει την

ηλεκτρομαγνητική ενέργεια.

ΟΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΥΞΟΧΡΩΜΕΣ

ΟΜΑΔΕΣ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ ΒΕΝΖΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ

ΣΤΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ

Τολουόλη C7H8 –

αντικατάσταση Η+ με CH3_

Φαινόλη C6C5OH -

αντικατάσταση H+με OH-

Ανιλίνη C6H5NH2 (ελαιώδες υγρό) – τις περισσότερες χρωστικές στην Μικροβιολογία

αντικατάσταση Η+ με ΝΗ2_

ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΑΝΙΛΙΝΗΣ

Βενζολικές ενώσεις: aπό δύο ή περισσότερους βενζολικούς δακτυλίους

συνδεδεμένους με ισχυρούς χημικούς δεσμούς (chromophores, auxocromes)

ΧΗΜΙΚΗ ΔΟΜΗ ΧΡΩΣΤΙΚΗΣ

ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ

ΒΑΣΙΚΕΣ: Αποτελούνται από θετικό ιόν (cationic auxochrome),

Όχι σύμφωνα με την αντίδρασή τους στο ph

Xρησιμοποιούνται περισσότερο από τις όξινες

Κυανούν του μεθυλενίου, κρυσταλλικό ιώδες, πράσινο του μαλαχίτη,

σαφρανίνη

ΟΞΙΝΕΣ: Αποτελούνται από αρνητικό ιόν (anionic auxochrome)

Ηωσίνη, όξινη φουξίνη, νιγροσίνη

ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ ΤΟΥ

ΠΥΡΗΝΑ

ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ

Φυσικές

Τεχνικές: είναι άλατα υπό μορφή σκόνης ή κρυστάλλων

ΓΙΑΤΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΟ ΤΙΣ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ?

To έγχρωμο θετικό ιόν σε μια βασική χρωστική έλκεται

από τα αρνητικά φορτία του βακτηριακού κυττάρου.

Οι όξινες δεν προσελκύονται από τους περισσότερους τύπους

βακτηρίων, επειδή τα αρνητικά ιόντα της χρωστικής απωθούν

την αρνητικά φορτισμένη βακτηριακή επιφάνεια.

Απλές

Διαφορικές

Ειδικές

ΑΠΛΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ – SIMPLE STAIN

Είναι υδατικά ή αλκοολικά διαλύματα μιας μόνο βασικής

χρωστικής.

Συνήθως μπλε του μεθυλενίου, βασική φουξίνη, κρυσταλλικό ιώδες.

Μορφολογία των βακτηρίων (σχήμα, διάταξη).

Στο μονιμοποιημένο δείγμα – για ΟΡΙΣΜΕΝΟ χρονικό διάστημα – ξέπλυμα – στέγνωμα – παρατήρηση

SIMPLE STAIN

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ

Η μονιμοποίηση των μικροοργανισμών σε αντικειμενοφόρο

πλάκα.

Σκοτώνει τα μικρόβια.

Συντηρεί τα διάφορα μέρη των μικροβίων (΄΄παγώνουν ΄΄).

Heat fixing (θέρμανση σε φλόγα)

Chemical fixing (με εφαρμογή διαλύματος μεθυλικής

αλκοόλης για 1 min, διατήρηση έμορφων στοιχείων, καθαρό

υπόστρωμα)

ΔΙΑΦΟΡΙΚΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ

Αντιδρούν διαφορετικά στα διάφορα είδη μικροβίων.

Χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό διαφορετικών

ειδών μικροβίων.

Gram χρώση, acid-fast stain.

primary stain

mordant

counterstain

decolorization

positive

negative

Κύρια χρωστική

Σταθεροποιητής

Αποχρωματισμός

Βασική

αντίθεσης χρωστική

GRAM ΧΡΩΣΗ

Hans Christian Joachim Gram

Danish Bacteriologist

• Αναπτύχθηκε το 1884 από το Δανό βακτηριολόγο.

• Μία από τις πιο χρήσιμες χρώσεις της Μικροβιολογίας επειδή ταξινομεί τα βακτήρια σε δύο μεγάλες κατηγορίες.

• Gram (+), Gram (-).

• Aνακάλυψε ότι το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζει κάποια βακτήρια ενώ άλλα όχι μετά τον αποχρωματισμό.

• Gram (+) θετικά αυτά που διατηρούν το χρώμα , Gram (-) αρνητικά αυτά που όχι.

Η Gram χρώση είναι πολύ σημαντική.

ΧΡΩΣΗ

ΚΥΑΝΟΥ ΤΟΥ ΜΕΘΥΛΕΝΙΟΥ

Χρωστικό διάλυμα

A. Μητρικό διάλυμα

Μπλε του μεθυλενίου 1g

Αιθυλική αλκοόλη 95ο 100ml

Β. Διάλυμα εργασίας

Υδατικό διάλυμα 1% ΚΟΗ 1ml

dH2O 99ml

Μητρικό διάλυμα 30ml

Τεχνική χρώσης Κυανού του Μεθυλενίου

1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα.

2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά.

3. Μονιμοποίηση σε φλόγα.

4. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης.

5. Προσθήκη διαλύματος εργασίας (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας). Παραμονή 1 min.

6. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό.

7. Τοποθέτηση πλάκας σε κατακόρυφη θέση να στεγνώσει.

8. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

Όλα τα βακτήρια μπλε

Αν σπορογόνα, μικροβιακό σώμα μπλε, σπόρος σαν κενός χώρος

R. Koch, 1877

Αρχή της μεθόδου

Η ουσία πρέπει να είναι χρωμογόνος

Η ουσία πρέπει να διασπάται σε ιόντα(+)

και (-)

Cationic dye Acid dye

ΧΡΩΣΗ GRAM

Χρωστικά διαλύματα

Κρυσταλλικό ιώδες (μπλε χρωστική)

Διάλυμα Lugol (στυπτικό = σταθεροποίηση της

χρωστικής στη μικροβιακή μεμβράνη)

Μείγμα 60-40 οινόπνευμα - ακετόνη

(αποχρωματιστικός διαλύτης)

Σαφρανίνη (κόκκινη χρωστική)

Hans Christian Gram, 1884

Τι χρησιμοποιούμε σε μια χρώση Gram?

Gram (+)

Gram (-)

Χρώση Gram

Εξήγηση χρώσης Gram

Θεωρία της οξειδωτικής δράσης του ιωδίου:

ιώδιο ελαττώνει το ισοηλεκτρικό σημείο, μη

δράση οινοπνεύματος Gram (+)

Θεωρία διαπερατότητας κυτταρικού

τοιχώματος

Θεωρία ριβονουκλεονικού μαγνησίου:

ριβονουκλεονικό Mg σε μεγάλο πολυμερισμό,

ένωση με ιώδιο, ενώσεις μεγάλης μοριακής δομής

Gram (+)

Gram (-)

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΣ Ο ΤΡΟΠΟΣ ΠΟΥ ΣΤΡΩΝΟΥΜΕ ΕΝΑ

ΠΛΑΚΑΚΙ

ΛΑΘΟΣ ΣΩΣΤΟ

Τεχνική χρώσης Gram

1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα.

2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά.

3. Μονιμοποίηση σε φλόγα.

4. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης.

5. Προσθήκη διαλύματος κρυσταλικού ιώδους (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας). Παραμονή 1 min.

6. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό.

7. Προσθήκη διαλύματος Lugol. Παραμονή 1 min.

8. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύση.

9. Προσθήκη αποχρωματιστικού διαλύτη σε διαδοχικές φάσεις, ενώ ενδιάμεσα ξέπλυμα με νερό βρύσης (μέχρι μακροσκοπικού αποχρωματισμού).

10. Προσθήκη διαλύματος σαφρανίνης. Παραμονή 10 sec.

11. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύση. Στέγνωμα.

12. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

BHMA 1:

Το μονιμοποιημένο δείγμα καλύπτεται από μια βασική ιώδη χρωστική

συνήθως ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟ ΙΩΔΕΣ – ΚΥΡΙΑ ΧΡΩΣΤΙΚΗ

Βάφει όλα τα κύτταρα.

BHMA 2:

Ξέπλυμα με νερό

BHMA 3:

Το δείγμα καλύπτεται με ΙΩΔΙΟΥΧΟ ΔΙΑΛΥΜΑ

ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΤΗΣ

BHMA 4:

Ξέπλυμα με νερό

ΒΗΜΑ 5

ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΣ

με ΑΛΚΟΟΛΗ ή διάλυμα ΑΛΚΟΟΛΗΣ-ΑΚΕΤΟΝΗΣ

αποχρωματίζει ορισμένα κύτταρα

BHMA 6 :

Ξέπλυμα με νερό

ΒΗΜΑ 7

ΣΑΦΡΑΝΙΝΗ για 15 sec

ΒΑΣΙΚΗ ΚΟΚΚΙΝΗ ΧΡΩΣΤΙΚΗ

ΒΗΜΑ 8

ξέπλυμα-στέγνωμα

Gram Staining Procedure

Staphylococcus & Streptococcus pneumoniae

Clostridium perfringens

Candida albicans

Escherichia coli

Neisseria gonorrhoeae

ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen

Χρωστικά διαλύματα

Φαινικούχος φουξίνη (κόκκινη χρωστική)

Αποχρωματιστικό διάλυμα

Πυκνό HCl 3ml

Αιθυλική αλκοόλη 97ml

Μπλε του μεθυλενίου κατά Loeffler (μπλε χρωστική)

Ύπαρξη του μυκολικού οξέος στο τοίχωμα

των μυκοβακτηριδίων

Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται από το 1882,

όταν την εισήγαγε ο Ziehl και την τροποποίησε

το 1883 ο Neelsen.

Τα μυκοβακτηρίδια χρωματίζονται κόκκινα,

ενώ τα άλλα βακτήρια χρωματίζονται μπλε.

Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen

Gram(+) Gram(-)

Mycobacteria

Κηρός D (Wax D) στη σύνθεση του

τοιχώματος των μυκοβακτηριδίων

Πολύπλοκο μόριο και ανήκει χημικώς στα

πεπτιδογλυκολιπίδια.

Αποτελείται από πολυσακχαριδική αλυσίδα που

είναι ενωμένη με εστερικό δεσμό με το μυκολικό

οξύ και με αμιδικό δεσμό, μέσω της

γαλακτοζαμίνης με πεπτιδική αλυσίδα που

αποτελείται από 3 αμινοξέα

D και L αλανίνη,

D-γλουταμινικό οξύ και

α και ε-διαμινοαμιλικό οξύ.

Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen

Κανονικοί κηροί

εστέρες μακρών λιπαρών οξέων με λιπαρές

αλκοόλες)

Ιδιαίτεροι λιποπολυσακχαρίτες σε

ορισμένα είδη, όπως

ο Cord factor (μυκοσίδιο-Mycoside) ή

σχοινοειδής παράγων στο Μ. tuberculosis, που

αποτελείται από

τρεαλόζη ενωμένη με

δύο μόρια μυκολικού οξέος

Εξήγηση χρώσης Ziehl-Neelsen

Τρεαλόζη

Ο βασικός ρόλος του μυκολικού οξέος

στην οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen

H ειδική διάταξη, δίκην σχοινιού (ropelike),

του πεπτιδογλυκολιπιδίου (κηρός D) έχει ως

αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη παροχή μονάδων

μυκολικού οξέος για να αντιδράσουν με τη

φουξίνη.

Tα κορυνοβακτηρίδια και οι ακτινομύκητες,

που έχουν στο τοίχωμά τους διάφορα μυκολικά

οξέα, χωρίς όμως την ειδική αυτή διαμόρφωση

του πεπτιδογλυκολιπιδίου, δε βάφονται.

Ο βασικός ρόλος του μυκολικού οξέος

στην οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen

μυκοβακτηρίδια, τα οποία έχουν υποστεί

κατεργασία με αλκοολούχο ΚΟΗ, που

απομακρύνει τα λιποειδή, ή

έχουν εκτεθεί στη δράση της ισονιαζίδης, που

αναστέλλει τη σύνθεση του μυκολικού οξέος,

δεν βάφονται με τη χρώση Ziehl-Neelsen.

Η ιδιότητα της οξεαντοχής-αλκο­ολαντοχής.

χάνεται, μερικά ή ολικά, για ορισμένα είδη σε

κάποια στάδια ανάπτυξής τους.

Στα ταχέως αναπτυσσόμενα δυνατόν να είναι

οξεάντοχα, μόνο το 10% των μικροβιακών

κυττάρων.

Τεχνική χρώσης Ziehl-Neelsen 1. Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο πάνω σε καθαρή

αντικειμενοφόρο πλάκα.

2. Στέγνωμα στον αέρα για λίγα λεπτά. Μονιμοποίηση.

3. Μεταφορά στη σχάρα της λεκάνης χρώσης.

4. Προσθήκη διαλύματος πυκνής φαινικούχου φουξίνης (να καλύψει ΟΛΗ την επιφάνεια της πλάκας).

5. Κάτω επιφάνεια θερμαίνεται πάνω από φλόγα μέχρι να εμφανιστούν ατμοί (χωρίς να στεγνώσει η χρωστική)

6. Παραμονή 5 min.

7. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο νερό.

8. Προσθήκη αποχρωματιστικού διαλύτη σε διαδοχικές φάσεις, ενώ ενδιάμεσα ξέπλυμα με νερό βρύσης (μέχρι μακροσκοπικού αποχρωματισμού).

9. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης

10. Προσθήκη μπλε μεθυλενίου. Παραμονή 1 min.

11. Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης. Στέγνωμα.

12. Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

ΒΗΜΑ 1:

Μονιμοποίηση

ΒΗΜΑ 2:

Προσθήκη διαλύματος

πυκνής φαινικούχου

φουξίνης.

ΠΡΟΣΟΧΗ: κάλυψη ΟΛΗ

της επιφάνειας της

πλάκας.

ΒΗΜΑ 3:

Με τη χρήση λύχνου Bunsen θέρμανση κάτω επιφάνειας μέχρι να εμφανιστούν ατμοί (χωρίς να στεγνώσει η χρωστική)

Παραμονή 5 min.

ΠΡΟΣΟΧΗ: χρησιμοποίηση πολύ φλόγας μπορεί να σπάσει το

πλακάκι.

ΒΗΜΑ 4:

Ξέπλυμα με νερό

Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο

νερό.

ΒΗΜΑ 5: Προσθήκη αποχρωματιστικού

διαλύτη (3% οξινισμένο

οινόπνευμα) σε διαδοχικές

φάσεις για 5 min, ενώ ενδιάμεσα

ξέπλυμα με νερό βρύσης

ΠΡΟΣΟΧΗ: μέχρι μακροσκοπικού

αποχρωματισμού

Under decolorized

Over decolorized

ΒΗΜΑ 6:

Ξέπλυμα με νερό

Ελαφρό τίναγμα να στραγγίξει το περίσσειο

νερό.

ΒΗΜΑ 7:

Προσθήκη μπλε μεθυλενίου.

Παραμονή 1 min.

ΒΗΜΑ 8:

Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης.

Στέγνωμα.

ΒΗΜΑ 9:

Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

Εξέταση τουλάχιστον 100 οπτικών πεδίων.

Σάρωση του παρασκευάσματος σε σχήμα μαιάνδρου

ΒΗΜΑ 9:

Μικροσκόπηση με ελαιοκαταδυτικό φακό.

A F B

Αρνητικό αποτέλεσμα μικροσκόπησης –

Απάντηση: «Κατά την μικροσκοπική εξέταση δεν

παρατηρήθηκαν οξεάντοχα βακτηρίδια».

Θετικό αποτέλεσμα μικροσκόπησης –

Απάντηση ανάλογα με τον αριθμό των οξεάντοχων

που παρατηρήθηκαν ανά οπτικό πεδίο (ο.π.)

(όπως στον παρακάτω πίνακα)

Number of AFB

seen Report

None No AFB observed

1-2 / 300 fields +/-*

1-9 / 100 fields 1+

1-9 / 10 fields 2+

1-9 / field 3+

>9 / field 4+

Αποτέλεσμα

Ειδικότητα - Ευαισθησία Η οξεάντοχη χρώση είναι μη ειδική

Τα βραδέως αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδια είναι σταθερά οξεάντοχα

Άλλοι μικροοργανισμοί που δυνατόν να είναι οξεάντοχοι: Nocardia

Rhodococcus

Legionella micdadi

Κύστεις Cryptosporidium spp

Κύστεις Cyclospora spp

Σπόροι μικροβίων

Κοκκία λίπους μερικών μικροβίων

Ποσοστό ευαισθησίας 22-80%

Αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει φυματίωση

Για να είναι (+) το παρασκεύασμα πρέπει να υπάρχουν 5.000-10.000 βάκιλλοι / ml πτυέλου

Οξεάντοχα

Mycobacterium spp

Mycobacterium leprae

Nocardia spp

Gordonia spp

Tsukamurella spp

Legionella micdadei

Rhodococcus spp

Cryptosporidium,

Cyclospora, Isospora

Spores B. subtilis

Nocardia spp

M. kansasii M. avium

M. tuberculosis

Ψευδώς θετικά

Artifacts

Πρόσμιξη τροφών

Επιμολύνσεις

Λάθη στις τεχνικές εμπλουτισμού και χρώσεων

Σαπροφυτικά ΑFB

Χρήση νερού επιμολυσμένου με ΝΤΜ (συνήθως M. gordonae)

Φακοί-κεδρέλαιο

Ψευδώς αρνητικά

Ακατάλληλο κλινικό δείγμα

ανεπαρκής ποσότητα

ακατάλληλο δοχείο

συνθήκες και χρόνος φύλαξης

Μικροσκοπική εξέταση

μικρός αριθμός μυκοβακτηριδίων

ανεπαρκής χρόνος

έλλειψη εμπειρίας

Λάθη στον εμπλουτισμό, στις χρώσεις και χρωστικές

Τα ταχέως αναπτυσσόμενα μπορεί να φαίνονται οξεάντοχα σε ποσοστό <10% σε πρόσφατο καλλιέργημα και να μη βάφονται με φθορίζουσα χρωστική

Παραλλαγές – τροποποιήσεις Ζ-Ν

Για ανθρώπους που δεν ξεχωρίζουν το κόκκινο χρώμα, μπορεί να γίνει η χρώση με κρυσταλλικό ιώδες και ο μεταχρωματισμός με πικρικό οξύ (μυκοβακτηρίδια μπλε, σε περιβάλλον κίτρινο)

Χωρίς την υποβοήθηση της θερμότητας (ψυχρές χρώσεις)

Kinyoun,

Φθοριοχρώματα Auramine Ο και Rhodamine, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό.

Auramine O - Rhodamine

1938 ο Hageman

ιδιότητα ορισμένων ουσιών να προσροφούν τις υπεριώδεις ακτίνες και να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου κύματος, ορατού με το μάτι.

και οι δύο χρωστικές (φαινικούχος φουξίνη και φθοριόχρωμα) συνδέονται με το μυκολικό οξύ του τοιχώματος του μυκοβακτηριδίου.

Fluorescent - Auramine Rhodamine

Auramine O - Rhodamine

το M. fortuitum δεν χρωματίζεται πάντα με auramine

μη βιώσιμοι βακίλλοι, με διαφορές στα αποτελέσματα.

όσα παρασκευάσματα βρεθούν θετικά με auramine, επανελέγχονται και με τη χρώση της φουξίνης, για να επιβεβαιώσουν το αποτέλεσμα και να φυλάξουν το παρασκεύασμα στο αρχείο.

Φαινικούχος

φουξίνη

Auramine-Ο

Απάντηση

1000Χ

250Χ

450Χ

1-2 / 300 ο.π.

1-2 / 30 ο.π.

1-2 / 70 ο.π.

Αμφίβολο, επανάληψη

1-9 / 100 ο.π.

1-9 / 10 ο.π.

2-18 / 50 ο.π.

1 +

1-9 / 10 ο.π.

1-9 / 1 ο.π.

4-36 / 10 ο.π.

2 +

1-9 / 1 ο.π.

10-90 / 1 ο.π.

4-36 / 1 ο.π.

3 +

> 9 / 1 ο.π.

> 90 / 1 ο.π.

> 36 / 1 ο.π.

4 +

Αποτέλεσμα