Παρουσίαση MSc Avgeris

"ΔΙΚΤΥΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΙΚΗ ΜΟΛΥΝΣΗ"

Ευθύμιος Γεώργιος Αυγέρης

Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα «Μοριακή Ιατρική»

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Εργαστήριο Μοριακής ΒιολογίαςIIBEAA

Θάνος Group

πρωτεΐνες

RNA

DNA

Μεταγραφικοί παράγοντες

Κεντρικό δόγμα της Βιολογίας

•DNA μικροσυστοιχίες•RNA-seq

•ChIP-seq

Εισαγωγή

Ιική μόλυνση και κυτταρική απόκριση

Ιστονικές τροποποιήσεις

Ανάπτυξη αλγόριθμου - μεθοδολογίας που θα ενοποιεί και θα αξιοποιεί τις πληροφορίες από πειράματα DNA μικροσυστοιχιών, RNA-seq και ChIP-seq.

Εφαρμογή αυτού του αλγόριθμου - μεθοδολογίας σε βιολογικά συστήματα προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα για την λειτουργία τους. Το σύστημα μοντέλο που μελετήθηκε είναι ανθρώπινα κύτταρα μετά από ιική μόλυνση.

Μελέτη του επαναπρογραμματισμού του ανθρώπινου γονιδιώματος μετά από ιική μόλυνση.

Στόχοι

Υλικά / Μεθοδολογία

Βάσεις δεδομένων •GEO Datasets, SRA και Array Express Archive – δεδομένα από τεχνικές υψηλής απόδοσης από δημοσιευμένες μελέτες

•ISGs (Interferon Stimulated genes) Γονίδια που ρυθμίζονται από τις Ιντερφερόνες•INTERFEROME

• NfKB.org – Γονίδια που ρυθμίζονται από τον μεταγραφικό παράγοντα Nf-κB (Thanos D., Maniatis T. 1992, Antonaki A., Thanos D. , 2011)

• ENCODE (The Encyclopedia Of DNA Elements) – δεδομένα από ChIP-seq

πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε 147 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και μελετήθηκαν 119 μεταγραφικοί παράγοντες και 13 ιστονικές τροποποιήσεις.

Βάσεις δεδομένων

RNA - Transcriptome Histone ModificationsProteins -Transcription factors

•TOPHAT•HTSeq-count/DESeq•Cufflinks/Cuffdiff

ChIP-seq ChIP-seq DNA microarrays RNA-seq

•RMA•T-test•Fold change

•BOWTIE•MACS•CEAS


LIST OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES

DNA BINDING POSITIONS

DEFENSE RESPONSE MODULE

Διαγραμματική απεικόνιση των τεχνολογιών και της ανάλυσης τους που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα

εργασία

9

DNA μικροσυστοιχίες

DNA μικροσυστοιχίες

• HG-U 133_Plus_2 μικροσυστοιχίες : 3500 μελέτες με 100.000 πειράματα

• 20.000 γονίδια • 16 κυτταρικές σειρές• 12 ιικά και 3 βακτηριακά στελέχη• 60 πειράματα











εργασία

CEL files

Κανονικοποίηση με τον αλγόριθμο RMA στο πρόγραμμα Αffymetrix Expression Console

Στατιστική επεξεργασία στο πρόγραμμα TMeV•T-test

Ενοποίηση όλων των δεδομένων και δημιουργία βάσης δεδομένων Microsoft Access {SQL} και Excel

Υπολογισμός του λόγου αλλαγής της έκφρασης κάθε γονιδίου.

Ανάλυση DNA μικροσυστοιχιών











εργασία

RNA-seqΑπομόνωση ολικού RNA

Μετατροπή σε δίκλωνα μόρια cDNA και τμηματοποίηση

Πολλαπλασιασμός και προσκόλληση προσαρτημάτων

Αλληλούχιση











εργασία

Ανάλυση RNA-seq

1. Fastq αρχεία - Χαρτογράφηση διαβασμάτων με τον αλγόριθμο TOPHAT.

2. Υπολογισμός του αριθμού των διαβασμάτων που αντιστοιχούν σε κάθε γονίδιο με τον αλγόριθμο HTSeq-count .

3. Εύρεση γονιδίων των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται με τον αλγόριθμο DESEQ.

4. Ανάλυσης της γονιδιακής οντολογίας των γονιδίων που επάγονται.











εργασία

ChIP-seqΠροσήλωση μεταγραφικών παραγόντων/ιστονικών τροποποιήσεων στο DNA

Τμηματοποίηση χρωματίνης

Ανοσοκατακρήμνιση

Απομόνωση τμημάτων DNA

Αλληλούχιση











εργασία

ENCODE database

Ανάλυση ChIP-seq

1. Αρχεία BED με τις συντεταγμένες των θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων και ιστονικών τροποποιήσεων για τις κυτταρικές σειρές HeLa, A549, HUVEC.

2. Χρήση του αλγόριθμου CEAS για τον εντοπισμό των γονιδίων κοντά στα οποία υπάρχει πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων και των ιστονικών τροποποιήσεων.

3. Ταυτοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι προσδένονται σε απόσταση εως 5000bp ανοδικά η καθοδικά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής όλων των γονιδίων.

4. Μελέτη ύπαρξης ρυθμιστικού συμπλόκου μεταγραφικών παραγόντων και ιστονικών τροποποιήσεων με βάση τις κοινές θέσεις πρόσδεσής τους στο DNA.











εργασία

XGene repression

Gene activation

X

Αποτελέσματα

Βάση δεδομένων με ενοποιημένα τα αποτελέσματα των DNA μικροσυστοιχιών

Q1 Q2 Q3 Q40

100200300400500600700800900

1000

ISGsNF-KBInterferome

4 ομάδες-τεταρτημόρια γονιδίων με βάση τη συχνότητα εμφάνισης τους στα πειράματα όπου εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορική έκφραση.

Βιολογικές λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν τα 500 γονίδια που εμφανίζουν αλλαγή της έκφρασής τους στα περισσότερα πειράματα

immune responseresponse to virusdefense responseresponse to organic substanceregulation of cell proliferationresponse to woundingregulation of apoptosisregulation of programmed cell deathregulation of cell deathinflammatory response

Έλεγχος της αξιοπιστίας της μεθοδολογίας ανάλυσης των δεδομένων DNA μικροσυστοιχιών

Βιολογικές λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν τα 500 γονίδια που εμφανίζουν αλλαγή της έκφρασής τους στα

λιγότερα πειράματαsulfur compound biosynthetic processsexual reproductionproteolysisglutathione biosynthetic processtransmembrane transportspermatogenesismale gamete generationorganic acid transportpeptide biosynthetic processpositive regulation of protein ubiquitination

Ταυτοποίηση 348 γονίδιων των οποίων η έκφραση αυξάνεται μετά από μόλυνση

348 κοινά υπερεκφραζόμενα γονίδια σε όλες τις κυτταρικές σειρές μετά από μόλυνση ACTR2 C4orf34 CSNK1A1 GCH1 IL29 MMP14 PARP12 RIPK2 SMCHD1 TP53INP2 ADAR C5orf13 CST3 GGPS1 IL6ST MOBKL2C PARP14 RNF114 SNORD89 TPBG ADM C5orf28 CSTF3 GIMAP2 IL7 MT1M PARP9 RNF149 SOCS1 TPK1

ADPRHL2 C6orf150 CXCL10 GLRX IL7R MX1 PCDH17 RNF19B SOD2 TRAF1 AFAP1L1 C6orf192 CXCL11 GRK5 IRAK2 MX2 PCGF5 RNF213 SP100 TRAF3IP2

ANKH C7orf42 DCP1A GTPBP1 IRF2 MXD1 PDCD2 ROD1 SP110 TRAFD1 APOL1 CACNA1A DDX52 HAS2 IRF7 MYD88 PDZD2 RORA SP140L TREX1 APOL2 CALM3 DDX58 HDX IRF9 N4BP1 PECAM1 RPL35A SPHK1 TRIM14 APOL3 CARD16 DDX60 HERC5 IRS1 NAMPT PELO RSAD2 SPPL2A TRIM21 APOL6 CASP1 DHX58 HERC6 ISG15 NAPA PHC3 RTP4 SPTBN1 TRIM22

ARHGAP27 CASP4 DPH3 HES4 ISG20 NBN PHF11 SAMD9 SPTLC2 TRIM25 ASNS CASP7 DSP HIST1H2BK JAK1 NCOA7 PI4K2B SAMD9L SQRDL TRIM26 ASPH CBR3 DTX3L HLA-E JAK2 NDUFB2 PITPNC1 SAMHD1 SRD5A1 TRIM38 ATF3 CBX4 DUSP4 HLA-F KIAA1217 NEDD1 PLSCR1 SAP18 STAT1 TRIM5

ATPIF1 CCL5 EGFR HLA-G KRT10 NEDD9 PMAIP1 SAP30L STAT2 TRIM69 ATRIP CCNE2 EGR1 HSPA1A KYNU NFKB2 PNPT1 SAT1 STOM TSPAN13 AZI2 CCPG1 EIF2AK2 ICAM1 LAP3 NFKBIA PODXL SCARB2 STS TYMP BAG1 CCRN4L ERAP1 IFI16 LGALS3BP NFKBIZ POMP SCD STX11 UBA6 BATF2 CD47 ERAP2 IFI27 LGALS8 NLRC5 PPM1K SEL1L STX17 UBA7

BCL2L11 CDC42SE2 ERO1L IFI30 LGMN NMI PPP1R15A SEPW1 SYNPO2 UBE2F BHLHE40 CDCP1 ETNK1 IFI35 LOC728855 NRP1 PRDM1 SERPINB1 TAP1 UBE2J1

BIRC3 CDKN2A ETS1 IFI44 LRG1 NRP2 PRIC285 SERPINB8 TAP2 UBE2L6 BLZF1 CDKN2B ETS2 IFI6 LRP10 NT5C3 PRRG4 SETX TAPBPL USP15

BMPR2 CEBPD FAM26F IFIH1 LRRC8C NT5E PSMB10 SIPA1L2 TBC1D1 USP18 BTC CFB FAM40B IFIT1 LY6E NUB1 PSMB8 SLC17A5 TCEB3 WARS

BTN3A3 CFI FAS IFIT2 LYN OAS1 PSMB9 SLC22A4 TDRD7 XAF1 C15orf39 CFLAR FBXO6 IFIT3 MAFF OAS2 PSME1 SLC25A23 TFPI2 XRN1 C19orf66 CH25H FNDC3B IFIT5 MANEA OAS3 PSME2 SLC25A28 TMEM140 YAP1

C1R CMPK2 FOS IFITM1 MAP2K3 OASL PXK SLC25A30 TMEM47 YIPF1 C1S CNIH4 FRMD8 IFITM2 MAP3K8 OBFC2A RARRES3 SLC25A37 TMEM62 ZC3HAV1 C2 CNP FST IFITM3 MASTL OPTN RBCK1 SLC38A5 TNFAIP3 ZCCHC2

C21orf91 CPEB2 FZD5 IFNB1 MGAT4A OSMR RGS2 SLC3A2 TNFAIP6 ZFP36L2 C3orf23 CPM GBP1 IL15 MLEC OSTM1 RGS20 SLC8A1 TNFSF10 ZNFX1 C3orf38 CREM GBP3 IL15RA MLKL PANX1 RHEBL1 SLCO3A1 TNFSF13B C4orf3 CSGALNACT2 GCA IL28A MMAA PARP10 RHOC SLFN5 TNIP1

Βιολογικές λειτουργίες στις οποίες συμμετέχουν τα 348 γονίδια

immune responseresponse to virusdefense responseresponse to cytokine stimuluspositive regulation of response to stimulusimmune effector processinflammatory responseregulation of apoptosiscell deathantigen processing and presentation

Σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποίασυμμετέχουν τα 348 γονίδια

Jak-STAT signaling pathwayCytosolic DNA-sensing pathwayRIG-I-like receptor signaling pathwayToll-like receptor signaling pathwayAntigen processing and presentationCytokine-cytokine receptor interactionProteasomeApoptosisNOD-like receptor signaling pathwayAllograft rejection

Ανάλυση γονιδιακής οντολογίας 348 γονίδιων

Δίκτυο 348 γονιδίων που επάγονται μετά από μόλυνση

ChIP-seq

Βάση δεδομένων με ενοποιημένα τα αποτελέσματα από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων στα 348 γονίδια

Ομαδοποίηση μεταγραφικών παραγόντων των τριών κυτταρικών σειρών που σχετίζονται με τη ρύθμιση

των 348 γονιδίων

Ομάδα 1

Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4

Ταυτοποίηση ρυθμιστικού συμπλόκου μεταγραφικών παραγόντων και ιστονικών τροποποιήσεων για τη

κυτταρική σειρά Hela

ZNF2

74BR

F2BR

F1BD

P1RP

C155

GTF3

C2CT

CFRA

D21

SMC3

H3K7

9me2

H3K3

6me3

PRDM

1ST

AT1

FOS

JUN

JUN

DEP

300

STAT

3TC

F7L2

CEBP

DH2

AFZ

H3K4

me2

H3K4

me1

USF2

H3K2

7ac

SMAR

CC2

SMAR

CC1

MYC

ZKSC

AN1

ELK1

RFX5

RCO

R1H3

K9ac

H3K4

me3

MAZ

TBP

MXI

1GT

F2F1

CHD2

MAX

BRCA

1ZN

F143

MAF

KTF

AP2C

TFAP

2ASM

ARCA

4N

FYB

NFY

AIR

F3SU

PT2

NR2

C2EL

K4HC

FC1

POL2

INI1

NRF

1E2

F4E2

F1HA

E2F1

E2F6

GCN

5TA

F1G

ABPA

ZZZ3

H3K9

me3

H3K2

7me3

EZH2

NRS

FH3

K20m

e1

POL2HCFC1INI1ELK4NFYANFYBGABPATAF1HAE2F1NRSFGTF3C2RPC155TCF7L2IRF3SMARCC2BDP1BRF1ZNF274BRF2SMARCA4SUPT2NR2C2E2F6E2F4GCN5ZZZ3NRF1E2F1STAT1SMARCC1MYCJUNFOSPRDM1TFAP2ATFAP2CJUNDSTAT3EP300H4K20me1H3K79me2H3K36me3CEBPBH3K4me1H3K4me2H2AFZUSF2H3K27acZNF143ELK1ZKSCAN1BRCA1MAZCHD2MAXRCOR1H3K9acH3K4me3RFX5TBPMAFKSMC3RAD21CTCFH3K9me3H3K27me3EZH2

Module 1

MODULE 1POL2 GTF3C2TBP CTCFELK1 RAD21RFX5 SMC3MAX H3K79me2RCOR1 H3K36me3H3K9ac PRDM1H3K4me3 STAT1CHD2 FOSGTF2F1 JUNMAZ JUNDMXI1 EP300BRCA1 STAT3ZKSCAN1 TCF7L2ZNF143 CEBPBH3K36me3 H2AFZUSF2 H3K4me2H3K27ac H3K4me1H2AFZ USF2H3K4me2 H3K27acH3K4me1 SMARCC2CEBPB SMARCC1MAFK MYCSMC3 ZKSCAN1RAD21 ELK1CTCF RFX5H3K79me2 RCOR1 H3K9ac MAFK H3K4me3 MAZ TBP MXI1 GTF2F1 CHD2 MAX BRCA1 ZNF143

TSS

2500bp 1500bp 1000bp 500bp

H3K36me3 FOS

2000bp

JUN

JUND

H3K79me2

EP300

H3K4me1

H3K4me2

CTCF STAT3

GTF3C2 TCF7L2

H3K4me3

USF2RAD21

STAT1 PRDM1

H3K27ac

SMARCC1

MYC

CEBPB H3K9ac

MAFK SMARCC2

SMC3

BRCA1

GTF2F1

POL2 H2AFZ

RFX5

MAX CHD2

RCOR1

ELK1

TBPMXI1

MAZ

ZKSCAN1ZNF143

Θέσεις πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων και ιστονικών τροποποιήσεων του ρυθμιστικού

συμπλόκου από το σημείο έναρξης της μεταγραφής των 348 γονιδίων

Συμπεράσματα

• Αναπτύχθηκε ένας αξιόπιστος αλγόριθμος - μεθοδολογία για την ενοποίηση και αξιοποίηση πληροφοριών από πειράματα DNA μικροσυστοιχιών, RNA-seq, ChIP-seq.

• Εντοπίστηκε ένας πυρήνας 348 γονιδίων τα οποία επάγονται σε όλες τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μετά από μόλυνσή τους.

• Εντοπίστηκε ένα λειτουργικό σύμπλοκο μεταγραφικών παραγόντων και ιστονικών τροποποιήσεων που ρυθμίζουν αυτά τα γονίδια.

• Εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθοδολογίας σε άλλα συστήματα μελέτης.

Dr. Dimitris ThanosAlexandros PolyzosMaria KapasaMat LavigneMarios AgelopoulosGeorge SianidisChrysa NikopoulouEleni PsarraErsi TsellouAggelos BanosStefanos TsiftsoglouAntonis KokkalisFwtis Kyrilis

Eirini AlexopoulouMaria PapathanassiouMaria PliatsikaDepy PapadopoulouMenie MerikaEthan FordSpyros FoutadakisAggeliki TsaltaMariana Kolovou

Σας ευχαριστώ πολύ!

Παρουσίαση MSc Avgeris

Documents

Transcript of Παρουσίαση MSc Avgeris