-galaktosidas assay för studie av promotorregion i ... 714770/  · finns två olika typer

download -galaktosidas assay för studie av promotorregion i ... 714770/  · finns två olika typer

of 33

  • date post

    03-Sep-2018
  • Category

    Documents

  • view

    213
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of -galaktosidas assay för studie av promotorregion i ... 714770/  · finns två olika typer

  • -galaktosidas assay fr studie av promotorregion i kloritdismutas frn Ideonella dechloratans

    -galactosidase assay for a study of the promoterregion of chlorite dismutase

    from Ideonella dechloratans

    Emelie Johansson

    Fakulteten fr teknik och naturvetenskap

    Biokemi/Biovetenskapligt program

    Kandidatuppsats 15hp

    Maria Rova

    Jrgen Samuelsson

    27 mars 2014

    1

  • 2

    Sammanfattning

    Oxoklorater r anjoner som delvis frekommer naturligt i naturen men ocks sprids via olika

    froreningar frn bland annat pappersindustrin. Dessa freningar r skadliga fr bde naturen

    och mnniskor vilket gr det ndvndigt att finna ett bra stt fr nedbrytning av dem. Det

    finns tv olika typer av bakterier som kan anvnda oxoklorater som elektronacceptorer under

    sin metabolism, bakterier som bryter ner klorat och bakterier som bryter ner bde perklorat

    och klorat. En bakterie som kan bryta ner klorat under anaeroba frhllanden r Ideonella

    dechloratans vilken har gener fr kloritdismutas och kloratreduktas som r enzymer fr

    nedbrytning av klorat. Genuttryck och enzymaktivitet av kloritdismutas induceras under

    anaeroba frhllanden vilket gr det intressant att ta reda p hur denna reglering gr till fr att

    bttre kunna utnyttja dessa bakterier vid biologisk vattenrening. Fr att studera uttrycket av

    genen fr kloritdismutas har en mjlig promotor- och reglersekvens tidigare klonats i en

    reportervektor som frts in i Escherichia coli (E.coli) bakterien XL-1 blue. Detta arbete gick

    ut p att utveckla en -galaktosidas assay fr kvantifiering av genuttrycket i detta system och

    tillmpa metoden p aeroba respektive anaeroba bakteriekulturer. Metoden optimerades fr

    odling i LB-medium och mtningarna av genuttrycket visade hgre promotoraktivitet under

    anaeroba jmfrt med aeroba odlingsfrhllanden fr samtliga studerade kloner. Detta

    betyder att alla kloner innehller en sekvens som kan fungera som promotor i E. coli och att

    dess aktivitet kar under anaeroba frhllanden.

  • 3

    Abstract

    Oxochlorates are anions with a partially naturally occurrence in nature but are also spread by

    human activities, including the paper industry. These compounds are harmful to both nature

    and humans, which makes it necessary to find a good way for their degradation. There are

    two different kinds of bacteria that can use oxochlorates as electron acceptors in their

    metabolism, bacteria that break down perchlorate and bacteria that break down both

    perchlorate and chlorate. A bacterium that can break down chlorate under anaerobic

    conditions is Ideonella dechloratans which holds the genes for chlorite dismutase and

    chlorate reductase which are enzymes for the degradation of chlorate. Gene expression and

    enzyme activity of chlorite dismutase are induced under anaerobic conditions, which makes it

    interesting to find out how this regulation functions in order to better exploit these bacteria in

    biological wastewater treatment. To study the expression of the gene for chlorite dismutase a

    potential promoter and regulatory sequence has previously been cloned in a reporter vector

    and transformed into Escherichia coli (E.coli) bacterium XL-1 blue. This work was to

    develop a -galactosidase assay for the quantification of gene expression in this system and

    apply it to aerobic and anaerobic bacterial cultures. The method was optimized for cultivation

    in LB-medium and measurements of gene expression showed higher promoter activity during

    anaerobic compared with aerobic culture conditions for all of the studied clones. This means

    that all the clones contain a sequence which can function as promoter in E. coli, and that its

    activity increases during anaerobic conditions.

  • 4

    Frkortningar

    Cld Kloritdismutas

    Clr Kloratreduktas

    IPTG Isopropyl- -D-1-thiogalaktopyranosid

    LB Luria Bertani broth

    OD Optisk densitet

    ONPG o-nitrofenyl--D-galaktosid

    N ver natt

    dH2O Destillerat vatten

    MCS Multiple cloning site

    E.coli Escherichia coli

    FNR Fumarat och nitrat reduktas

    SEM Standars error of mean

    I.dechloratans Ideonella dechloratans

  • 5

    Innehllsfrteckning

    Sammanfattning ....................................................................................................................... 2

    Abstract ..................................................................................................................................... 3

    Frkortningar ........................................................................................................................... 4

    1. Inledning ............................................................................................................................ 6

    1.1 Oxoklorater ........................................................................................................................... 6

    1.2 Genreglering i fakultativt anaeroba bakterier ................................................................... 6

    1.3 Ideonella dechloratans .......................................................................................................... 7

    1.3.1 Kloritdismutas i I. dechloratans ....................................................................................... 7

    1.4 pQLacZ-1 ............................................................................................................................... 8

    1.5 -galaktosidas och -galaktosidas assay ............................................................................. 9

    2. Syfte.................................................................................................................................. 10

    3. Material och metod ......................................................................................................... 11

    3.1 Kloner och bakteriestammar ............................................................................................. 11

    3.2 Odling i minimalmedium.................................................................................................... 11

    3.3 Aerob odling i LB medium ................................................................................................. 12

    3.4 Anaerob odling i LB medium ............................................................................................. 12

    3.5 -galaktosidas assay ............................................................................................................ 12

    4. Resultat och diskussion .................................................................................................. 14

    4.1 Odling i minimalmedium.................................................................................................... 14

    4.2 Aerob odling i LB-medium................................................................................................. 15

    4.3 Anaerob odling i LB-medium ............................................................................................ 16

    4.4 -Galaktosidas assay ........................................................................................................... 18

    5. Slutsats ............................................................................................................................. 26

    6 Referenser ........................................................................................................................ 27

    Appendix I: Recept ................................................................................................................ 28

    Appendix III: Rdata fr -galaktosidas assay ................................................................... 29

    Resultat fr tester med den optimerade assayen: ........................................................................ 29

    Kontrollfrsk aerob odling med tillsats av nitrat: ..................................................................... 33

  • 6

    1. Inledning

    1.1 Oxoklorater

    Oxoklorater bland annat klorit CO2-, klorat CO3

    - och perklorat CO4

    - r anjoner som har en

    hg lslighet i vatten. Dessa r naturligt frekommande i miljn men det faktum att de

    anvnds aktivt som raketkrut, ogrsmedel och blekmedel inom pappersindustrin gr dem till

    stora vattenfroreningar [1]. Klorat kan bland annat pverka den marina miljn genom sin

    toxicitet fr alger, frmst fr s kallade brunalger [2] perklorat kan i fr stora mngder

    pverka transporten av jod till skldkrteln [3] och klorit kan ka toxiciteten av andra

    froreningar, d det verkar oxiderande eller klorerande [4].

    P grund av spridningen av oxoklorater och dess toxicitet r nedbrytning av klorat och

    perklorat ndvndig, det r drfr intressant att studera nrmare. Nedbrytningen sker med

    hjlp av bakterier som under anaeroba frhllanden anvnder klorat eller perklorat som

    slutlig elektronacceptor. Det finns tv typer av kloratreducerande bakterier, de som kan bryta

    ned perklorat och klorat, och de som bara kan bryta ner klorat. Nedbrytningen av perklorat

    och klorat sker drfr antingen genom en tre- eller tvstegsreaktion. I de bakterier som bara

    kan bryta ner klorat sker endast en tvstegsreaktion, klorat reduceras i det frsta steget till

    klorit med hjlp av kloratreduktas. I perkloratreducerande bakterier reduceras perklorat med

    hjlp av perkloratreduktas frst till klorat och sedan reduceras klorat till klorit. Klorit