-galaktosidas assay fr studie av promotorregion i kloritdismutas frn Ideonella dechloratans

-galactosidase assay for a study of the promoterregion of chlorite dismutase

from Ideonella dechloratans

Emelie Johansson

Fakulteten fr teknik och naturvetenskap

Biokemi/Biovetenskapligt program

Kandidatuppsats 15hp

Maria Rova

Jrgen Samuelsson

27 mars 2014

1

2

Sammanfattning

Oxoklorater r anjoner som delvis frekommer naturligt i naturen men ocks sprids via olika

froreningar frn bland annat pappersindustrin. Dessa freningar r skadliga fr bde naturen

och mnniskor vilket gr det ndvndigt att finna ett bra stt fr nedbrytning av dem. Det

finns tv olika typer av bakterier som kan anvnda oxoklorater som elektronacceptorer under

sin metabolism, bakterier som bryter ner klorat och bakterier som bryter ner bde perklorat

och klorat. En bakterie som kan bryta ner klorat under anaeroba frhllanden r Ideonella

dechloratans vilken har gener fr kloritdismutas och kloratreduktas som r enzymer fr

nedbrytning av klorat. Genuttryck och enzymaktivitet av kloritdismutas induceras under

anaeroba frhllanden vilket gr det intressant att ta reda p hur denna reglering gr till fr att

bttre kunna utnyttja dessa bakterier vid biologisk vattenrening. Fr att studera uttrycket av

genen fr kloritdismutas har en mjlig promotor- och reglersekvens tidigare klonats i en

reportervektor som frts in i Escherichia coli (E.coli) bakterien XL-1 blue. Detta arbete gick

ut p att utveckla en -galaktosidas assay fr kvantifiering av genuttrycket i detta system och

tillmpa metoden p aeroba respektive anaeroba bakteriekulturer. Metoden optimerades fr

odling i LB-medium och mtningarna av genuttrycket visade hgre promotoraktivitet under

anaeroba jmfrt med aeroba odlingsfrhllanden fr samtliga studerade kloner. Detta

betyder att alla kloner innehller en sekvens som kan fungera som promotor i E. coli och att

dess aktivitet kar under anaeroba frhllanden.

3

Abstract

Oxochlorates are anions with a partially naturally occurrence in nature but are also spread by

human activities, including the paper industry. These compounds are harmful to both nature

and humans, which makes it necessary to find a good way for their degradation. There are

two different kinds of bacteria that can use oxochlorates as electron acceptors in their

metabolism, bacteria that break down perchlorate and bacteria that break down both

perchlorate and chlorate. A bacterium that can break down chlorate under anaerobic

conditions is Ideonella dechloratans which holds the genes for chlorite dismutase and

chlorate reductase which are enzymes for the degradation of chlorate. Gene expression and

enzyme activity of chlorite dismutase are induced under anaerobic conditions, which makes it

interesting to find out how this regulation functions in order to better exploit these bacteria in

biological wastewater treatment. To study the expression of the gene for chlorite dismutase a

potential promoter and regulatory sequence has previously been cloned in a reporter vector

and transformed into Escherichia coli (E.coli) bacterium XL-1 blue. This work was to

develop a -galactosidase assay for the quantification of gene expression in this system and

apply it to aerobic and anaerobic bacterial cultures. The method was optimized for cultivation

in LB-medium and measurements of gene expression showed higher promoter activity during

anaerobic compared with aerobic culture conditions for all of the studied clones. This means

that all the clones contain a sequence which can function as promoter in E. coli, and that its

activity increases during anaerobic conditions.

4

Frkortningar

Cld Kloritdismutas

Clr Kloratreduktas

IPTG Isopropyl- -D-1-thiogalaktopyranosid

LB Luria Bertani broth

OD Optisk densitet

ONPG o-nitrofenyl--D-galaktosid

N ver natt

dH2O Destillerat vatten

MCS Multiple cloning site

E.coli Escherichia coli

FNR Fumarat och nitrat reduktas

SEM Standars error of mean

I.dechloratans Ideonella dechloratans

5

Innehllsfrteckning

Sammanfattning ....................................................................................................................... 2

Abstract ..................................................................................................................................... 3

Frkortningar ........................................................................................................................... 4

1. Inledning ............................................................................................................................ 6

1.1 Oxoklorater ........................................................................................................................... 6

1.2 Genreglering i fakultativt anaeroba bakterier ................................................................... 6

1.3 Ideonella dechloratans .......................................................................................................... 7

1.3.1 Kloritdismutas i I. dechloratans ....................................................................................... 7

1.4 pQLacZ-1 ............................................................................................................................... 8

1.5 -galaktosidas och -galaktosidas assay ............................................................................. 9

2. Syfte.................................................................................................................................. 10

3. Material och metod ......................................................................................................... 11

3.1 Kloner och bakteriestammar ............................................................................................. 11

3.2 Odling i minimalmedium.................................................................................................... 11

3.3 Aerob odling i LB medium ................................................................................................. 12

3.4 Anaerob odling i LB medium ............................................................................................. 12

3.5 -galaktosidas assay ............................................................................................................ 12

4. Resultat och diskussion .................................................................................................. 14

4.1 Odling i minimalmedium.................................................................................................... 14

4.2 Aerob odling i LB-medium................................................................................................. 15

4.3 Anaerob odling i LB-medium ............................................................................................ 16

4.4 -Galaktosidas assay ........................................................................................................... 18

5. Slutsats ............................................................................................................................. 26

6 Referenser ........................................................................................................................ 27

Appendix I: Recept ................................................................................................................ 28

Appendix III: Rdata fr -galaktosidas assay ................................................................... 29

Resultat fr tester med den optimerade assayen: ........................................................................ 29

Kontrollfrsk aerob odling med tillsats av nitrat: ..................................................................... 33

6

1. Inledning

1.1 Oxoklorater

Oxoklorater bland annat klorit CO2-, klorat CO3

- och perklorat CO4

- r anjoner som har en

hg lslighet i vatten. Dessa r naturligt frekommande i miljn men det faktum att de

anvnds aktivt som raketkrut, ogrsmedel och blekmedel inom pappersindustrin gr dem till

stora vattenfroreningar [1]. Klorat kan bland annat pverka den marina miljn genom sin

toxicitet fr alger, frmst fr s kallade brunalger [2] perklorat kan i fr stora mngder

pverka transporten av jod till skldkrteln [3] och klorit kan ka toxiciteten av andra

froreningar, d det verkar oxiderande eller klorerande [4].

P grund av spridningen av oxoklorater och dess toxicitet r nedbrytning av klorat och

perklorat ndvndig, det r drfr intressant att studera nrmare. Nedbrytningen sker med

hjlp av bakterier som under anaeroba frhllanden anvnder klorat eller perklorat som

slutlig elektronacceptor. Det finns tv typer av kloratreducerande bakterier, de som kan bryta

ned perklorat och klorat, och de som bara kan bryta ner klorat. Nedbrytningen av perklorat

och klorat sker drfr antingen genom en tre- eller tvstegsreaktion. I de bakterier som bara

kan bryta ner klorat sker endast en tvstegsreaktion, klorat reduceras i det frsta steget till

klorit med hjlp av kloratreduktas. I perkloratreducerande bakterier reduceras perklorat med

hjlp av perkloratreduktas frst till klorat och sedan reduceras klorat till klorit. Klorit