ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ

ΣΧΟΛΗ

ΤΜΗΜΑ

ΤΟΜΕΑΣ

ΤΙΤΛΟΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΗΣ ΟΥΣΙΑΣ,

ΝΙΜΟΔΙΠΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΡΟΣΜΙΞΕΩΝ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ

ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ

ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ

ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ׃

ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ:

i

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Α.Θεωρητικό μέρος................................................................................................1

1. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης………….……………………………...2

1.1. Μηχανισμοί και είδη της HPLC………………………………………………...3

1.2. Διαλύτες κινητής φάσης………………………………………………………...6

1.3. Αντλίες υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης………………………...9

1.4. Σύστημα εισαγωγής δείγματος……………………………………………….10

1.5. Στήλες HPLC…………………………………………………….……………..11

1.5.1. Προστήλη……………………………………………………………….11

1.5.2. Αναλυτική στήλη………………………………………………………..12

1.5.3. Αποτελεσματικότητα στήλης…………………………………………..13

1.6. Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC…………………………….14

1.7. Προκατεργασία δείγματος…………………………………………………….17

1.8. Επιλογή τεχνικής-εκλογή κινητής φάσης, με τη χρήση HPLC...………....17

1.9. Εφαρμογές HPLC……………………………………………………………...18

2. Επικύρωση αναλυτικής μεθόδου………………………………………………….20

3. Χρωματογραφικές παράμετροι……………………………………………………23

4. Έλεγχος ποιότητας φαρμάκων………………………………………………...….27

4.1. Έλεγχος ομοιομορφίας περιεκτικότητας...………………………………….27

4.2.Παράγοντες που επηρεάζουν τον έλεγχο ομοιομορφίας περιεκτικότητας.28

4.3. Κριτήρια της μεθόδου ελέγχου………………………………………………30

5. Γενικά για την ένωση νιμοδιπίνη…………………………………………………..31

6. Μέθοδοι ανάλυσης φαρμάκου……………………………………..……………...35

6.1. Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι ………………………………..……………35

6.2. Ηλεκτροχημικές μέθοδοι………………………………………………………36

6.3. Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας……………………….…………………..37

6.4. Αέρια χρωματογραφία…………………………………...……………………37

6.5. Χρωματογραφία υψηλής απόδοσης……………………………...………....37

7. Σκοπός της εργασίας…………………………………...…………………………..39

Β.Πειραματικό μέρος……………………………………………………….………….40

8. Αντιδραστήρια-εξοπλισμός ……………………………………….……………....41

9. Μέθοδος ανάλυσης…………………………………………………………………43

10. Ανάλυση και επικύρωση.…………………………………………………………45

10.1. Γραμμικότητα και ευαισθησία…..…………………………...………………45

10.2. Επαναληψιμότητα και ακρίβεια ημέρας…..………………………….…….53

10.3. Ενδιάμεση επαναληπτικότητα και ακρίβεια σε έξι ημέρες……………….55

10.4. Ανθεκτικότητα (Robustness) της μεθόδου…………………….....………..56

11.Έλεγχος της νιμοδιπίνης και προσμίξεών της σε φαρμακευτικά σκευάσματα57

12. Συμπεράσματα..…………………………………………………………………...63

13. Βιβλιογραφία….…………………………………..……………………………….64

14. Περίληψη……….……………………………..…………………………………...66

15. Abstract…………..…………………….…………………………………………..67

Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Κεφ.1 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ

Η Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι μια διαχωριστική

τεχνική με πολλές εφαρμογές τα τελευταία χρόνια, καθώς θεωρείται η πλέον

κατάλληλη, για τον ακριβή και επαναλήψιμο προσδιορισμό ενός μεγάλου φάσμα-

τος χημικών ενώσεων. Η τεχνική της HPLC οφείλει την ανάπτυξή της στην

πρόοδο της τεχνολογίας με την κατασκευή ανθεκτικών στις μεγάλες πιέσεις χα-

λύβδινων στηλών καθώς και αντλιών υψηλής απόδοσης, σταθερής παροχής.

Επίσης, αναπτύχθηκαν διάφοροι τύποι ανιχνευτών όπως οι ανιχνευτές υπεριώ-

δους-ορατού, αγωγιμομετρικοί και φθορισμομετρικοί ανιχνευτές κ.λ.π. [1].

Καθώς οι εφαρμογές της χρωματογραφίας αυξάνονταν, αυξάνονταν και οι

απαιτήσεις για βελτιώσεις στην οργανολογία. Ετσι, για παράδειγμα οι αντλίες υ-

ψηλής πίεσης έγιναν περισσότερο ακριβείς και τα υλικά πλήρωσης περισσότερο

αποτελεσματικά για τους διάφορους διαχωρισμούς.

Η ΗPLC ανήκει στις χρωματογραφικές τεχνικές, άρα ο διαχωρισμός είναι

αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητικής φάσης.

Το δείγμα εισάγεται στην κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης

τα συστατικά του κινούνται με τη μορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα μετά

το άλλο. Οι προσδιοριζόμενες ουσίες κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της

κινητής φάσης με αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά

μήκος της στήλης. Στην υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι δυνατή η

χρήση μίγματος διαλυτών καθώς και η βαθμιαία μεταβολή της σύστασης της

κινητής φάσης. Ακόμα είναι δυνατή η χρησιμοποίηση αναλυτικών στηλών σε

σειρά, έτσι ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισμός των συστατικών ενός

μίγματος. Ο χρόνος ανάλυσης είναι συνήθως μικρός, της τάξης των μερικών

λεπτών, ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της είναι καλές.

Γενικά, η HPLC είναι μια ευαίσθητη αναλυτική τεχνική που υπερέχει σε

σχέση με τις υπόλοιπες χρωματογραφικές τεχνικές. Για το λόγο αυτό χρησιμοποι-

είται στον προσδιορισμό πολλών χημικών ενώσεων όπως αμινοξέων, αλκαλοει-

δών , αντιβιοτικών κ.λ.π. [1].

1.1. Μηχανισμοί και είδη της HPLC

Ανάλογα με το μηχανισμό που επικρατεί κατά το διαχωρισμό, προκύπτουν

τα εξής κύρια είδη χρωματογραφίας [1]:

1. Χρωματογραφία Προσρόφησης. Ο διαχωρισμός των διαφόρων ενώ-

σεων βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι

κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης.

Η χρωματογραφία προσρόφησης βρίσκει εφαρμογή στο διαχωρισμό ενώσεων με

παρόμοια δομή, αλλά με διαφορετική πολικότητα.

Ανάλογα με τη σχέση πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φά-

σης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης.

Χρωματογραφία κανονικής φάσης. Στη χρωματογραφία κανονικής φά-

σης, η στατική φάση (συνήθως SiO2) είναι πολικότερη απο την κινητή, η

οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο,

κ.α.

Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Η χρωματογραφία αντίστροφης

φάσης χρησιμοποιείται στο 80% των αναλυτικών εφαρμογών. Η στατική

φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται απο διοξείδιο

του πυριτίου, συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκύλια, φαινύλια,

αμινομάδες, κ.α., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών

διαλυτών (μεθανόλη) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό. Τα υλικά

συζευγμένης φάσης πλεονεκτούν ως προς την σταθερότητα, αλλά και τη

συμβατότητα με μεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστημάτων.

2. Χρωματογραφία Κατανομής. Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφο-

ρετική κατανομή των συστατικών μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής

φάσης και εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ομόλογων, μη ιονικών ενώσεων.

3. Χρωματογραφία Συγγένειας. Για να πραγματοποιηθεί ο διαχωρισμός,

οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι

είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου (SiO2).

4. Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις

ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσδιοριζόμενων ιόντων και των

φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης.

Σχήμα 1.1: Πειραματική διάταξη HPLC.

5. Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους ή Διάχυσης Πηκτής. Ο

δαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των προσδιοριζόμενων

ενώσεων και βρίσκει εφαρμογές στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των

πολυμερών.

Στη χρωματογραφία διάχυσης πηκτής, τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα

από τη στήλη, ενώ τα μικρά μόρια, καθώς εισέρχονται στους πόρους των

σωματιδίων της στατικής φάσης, καθυστερούν και βγαίνουν αργότερα.

Ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αποτελείται από

τα εξής τμήματα [1]:

Σύστημα διαλυτών

Αντλία

Σύστημα εισαγωγής δείγματος

Αναλυτική στήλη-Προστήλη

Ανιχνευτής

Σύστημα συλλογής και καταγραφής δεδομένων

1.2. Διαλύτες κινητής φάσης

Η κινητή φάση στην HPLC είναι συνήθως μίγμα διαφόρων αναλογιών,

κατά όγκο, ενός ή περισσότερων οργανικών διαλυτών και νερού ή ρυθμιστι-

κού διαλύματος στην κατάλληλη τιμή pH, στην περίπτωση της HPLC αντί-

στροφης φάσης, ή μίγμα μη πολικών διαλυτών στην περίπτωση της HPLC κανο-

νικής φάσης [1].

Για να μπορεί ένας οργανικός διαλύτης να χρησιμοποιηθεί στην υγρή

χρωματογραφία υψηλής πίεσης πρεπει να πληρεί ορισμένες προυποθέσεις [1] :

Να είναι υψηλής καθαρότητας και ειδικός για χρωματογραφία.

Να είναι σχετικά φθηνός.

Να έχει χαμηλή τοξικότητα.

Να μην απορροφάει στο UV.

Να ειναι δραστικός σε χαμηλές συγκεντρώσεις.

Να μην καταστρέφει το δείγμα.

Να μην αποσυντίθεται εύκολα.

Να μην είναι πτητικός.

Να έχει χαμηλό ιξώδες, χαμηλή πίεση επαναφοράς και μεγαλύτερη ικανό-

τητα διαχωρισμού.

Ο οργανικός διαλύτης που συνήθως προτιμάται είναι η μεθανόλη, η ο-

ποία είναι οικονομικότερη σε σχέση με το ακετονιτρίλιο κι έχει μικρότερο ιξώ-

δες σε σχέση με την αιθανόλη.

Για την αποθήκευση των χρησιμοποιούμενων διαλυτών χρησιμοποιού-

νται γυάλινες σκοτεινόχρωμες φιάλες, οι οποίες συνοδεύονται από ειδικό κα-

πάκι που διαθέτει [1]:

μεταλλικό φίλτρο για την αναρρόφηση των διαλυτών.

φίλτρο παροχής αερίου απαρέωσης διαλυτών.

σωλήνα από Teflon για την έξοδο του αέρα.

Οταν λαμβάνει χώρα ανάμιξη διαλυτών ή όταν χρησιμοποιούνται μίγματα

διαλυτών είναι απαραίτητη η απαέρωσή τους γιατί δημιουργούνται φυσαλίδες

αέρα από το διαλυμένο οξυγόνο και άζωτο του αέρα. Οι φυσαλίδες μπορούν να

προκαλέσουν θόρυβο στην ανίχνευση και απώλεια της διαχωριστικής ικανότητας

της στήλης. Η απαέρωση γίνεται συνήθως με διαβίβαση ηλίου το οποίο έχει την

ικανότητα να απομακρύνει το διαλυμένο οξυγόνο και άζωτο του αέρα από τους

διάφορους διαλύτες, χωρίς το ίδιο να διαλύεται και να δημιουργεί φυσαλίδες στο

σύστημα. Εναλλακτικός τρόπος απαέρωσης ενός διαλύτη είναι η χρήση υπερή-

χων και η εφαρμογή κενού. Ο τρόπος αυτός όμως δεν αποτελεί μόνιμη λύση,

αφού μετά την απομάκρυνση του διαλύτη από τη συσκευή κενού δημιουργούνται

και πάλι φυσαλίδες από τον ατμοσφαιρικό αέρα.

Η επιλογή της κινητής φάσης αποτελεί μία από τις πιο σημαντικές

παραμέτρους, όσον αφορά στην ανάπτυξη των αναλυτικών μεθόδων. Η εύρεση

της καταλληλότερης κινητής φάσης εξαρτάται από ορισμένες χαρακτηριστικές

ιδιότητες των διαλυτών και γίνεται με κριτήριο τον επιτυχή διαχωρισμό των

συστατικών του μίγματος σε εύλογο χρονικό διάστημα. Οι ιδιότητες που

εξετάζονται είναι [1]:

1. Πολικότητα: Η πολικότητα ενός διαλύτη καθορίζει σε συνδυασμό με

την πολικότητα των προσδιοριζόμενων ουσιών το χρόνο συγκράτησης. Ετσι, όσο

πιο πολικός είναι ένας διαλύτης, τόσο πιο γρήγορα εκλούονται οι πολικές

ενώσεις και τόσο πιο αργά οι μη πολικές.

2. Ελουοτροπική ισχύς: Είναι μία παράμετρος η οποία σχετίζεται με την

πολικότητα των διαφόρων διαλυτών και καθορίζεται από τη στατική φάση που

χρησιμοποιείται. Ετσι, το νερό το οποίο είναι ο διαλύτης με την μεγαλύτερη πολι-

κότητα, έχει τη μικρότερη ελουοτροπική ισχύ στη χρωματογραφία αντίστροφης

φάσης και τη μεγαλύτερη στη χρωματογραφία κανονικής φάσης.

3. Βασικότητα ή δυνατότητα διπολικών αλληλεπιδράσεων που υπεσέρ-

χονται στην εκλεκτικότητα του κάθε διαλύτη.

4. Τοξικότητα: Οι διαλύτες με τοξικές και ερεθιστικές ιδιότητες συνήθως α-

ποφεύγονται.

5. Συμβατότητα με το χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή. Οταν, για παράδει-

γμα, χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής UV/Vis, θα πρέπει να

λαμβάνονται υπόψη τα κατώτερα όρια απορρόφησης των διαφόρων διαλυτών

στο υπεριώδες.

6. Κόστος: To κόστος των χρησιμοποιούμενων διαλυτών αποτελεί απα-

γορευτική παράμετρο, ειδικά σε αναλύσεις ρουτίνας, όπου η κατανάλωση είναι

μεγάλη.

Η έκλουση των προσδιοριζόμενων συστατικών μπορεί να είναι ισοκρατική

ή βαθμωτή [1].

Ισοκρατική Έκλουση: Ονομάζεται η έκλουση κατά την οποία διατηρείται

σταθερή η σύσταση της κινητής φάσης σε όλη τη διάρκεια της ανάλυσης. Η

ισοκρατική έκλουση επιτρέπει τη γρήγορη ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων,

έχει το χαμηλότερο κόστος σε σχέση με τη βαθμωτή και παρέχει σταθερότερη

βασική γραμμή. Το κυριότερο μειονεκτήμα της είναι ότι δεν εξασφαλίζει το

διαχωρισμό ενώσεων με παρόμοιες ιδιότητες και παρόμοια δομή, όπως

πρωτεΐνες.

Βαθμωτή Έκλουση : Χαρακτηρίζεται από μεταβολή της σύστασης της κι-

νητής φάσης με το χρόνο για το διαχωρισμό μιγμάτων ενώσεων, οι οποίες συνή-

θως παρουσιάζουν παρόμοια δομή και ιδιότητες. Γενικότερα σκοπός της βαθμω-

τής έκλουσης είναι η ταχύτερη μετακίνηση των συστατικών που συγκρατιούνται

ισχυρά στη στήλη και ο ικανοποιητικός διαχωρισμός αυτών που συγκρατιούνται

ελάχιστα.

Τα βασικά στάδια που ακολουθούνται σε ένα διαχωρισμό με βαθμωτή

έκλουση είναι τα εξής [1]:

1. Καθορισμός της αρχικής και τελικής σύστασης της κινητής φάσης.

2. Καθορισμός του χρόνου ανάλυσης.

3. Επιλογή του τρόπου μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης.

4. Βελτιστοποίηση της ταχύτητας ροής.

5. Επαναφορά της στήλης στις αρχικές συνθήκες εξισορρόπησης.

1.3. Αντλίες υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης

Οι αντλίες που χρησιμοποιούνται στην υγρή χρωματογραφία είναι υψηλής

απόδοσης. Ο ρόλος τους είναι η άντληση της κινητής φάσης από το δοχείο της

και η διαβίβασή της κάτω από μεγάλη πίεση στη στήλη. Οι αντλίες αυτές πρέπει

να είναι ικανές να λαμβάνουν ακριβή όγκο διαλύτη, χωρίς παλμούς και με

επαναλήψιμα σταθερή ταχύτητα ροής και πίεση. Οι αντλίες που

χρησιμοποιούνται συνήθως είναι δύο τύπων [1]:

1) Αντλίες σταθερής ροής: Διακρίνονται σε αντλίες παλινδρόμησης, αντλί-

ες τύπου σύριγγας και αντλίες διαφράγματος. Το βασικό τους πλεονέκτημα είναι

ότι εξασφαλίζουν επαναλήψιμο όγκο έκλουσης και επαναλήψιμο εμβαδό κορυ-

φής, ανεξάρτητα από τις μεταβολές στο ιξώδες της κινητής φάσης ή από τυχόν

μπλοκάρισμα της αναλυτικής στήλης.

2) Αντλίες σταθερής πίεσης: Ανάλογα με το αν εφαρμόζεται ισοκρατική ή

βαθμωτή έκλουση για το διαχωρισμό οι αντλίες μπορούν να διακριθούν σε

αντλίες ισοκρατικής και αντλίες βαθμωτής έκλουσης αντίστοιχα. Το κυριότερο

πλεονέκτημα των αντλίων αυτών είναι η απλότητα στην κατασκευή και απουσία

παλμών, γεγονός που εχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του θορύβου και της

βασικής γραμμής. Επιπλέον, έχουν χαμηλό κόστος και χαρακτηρίζονται από

ευκολία στη χρήση και τη συντήρηση. Ωστόσο, απ’ την άλλη πλευρά

παρουσιάζουν προβλήματα, από τα οποία το σημαντικότερο είναι η διακύμανση

της ταχύτητας ροής. Αυτή η διακύμανση οφείλεται σε μεταβολές στο ιξώδες,

λόγω μεταβολών της θερμοκρασίας ή της σύστασης της κινητής φάσης.

Αποτέλεσμα των μεταβολών της ταχύτητας ροής είναι η αρνητική επίδραση, τόσο

στον ποιοτικό, όσο και στον ποσοτικό προσδιορισμό, εξαιτίας των διακυμάνσεων

που παρατηρούνται στο εμβαδό των κορυφών και στο χρόνο συγκράτησης

αντίστοιχα.

1.4. Σύστημα εισαγωγής δείγματος

H εισαγωγή του δείγματος μπορεί να γίνει [1]:

Με μικροσύριγγα.

Με ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος.

Με αυτόματο δειγματολήπτη.

Με τη μικροσύριγγα μας δίνεται η δυνατότητα της απ’ ευθείας εισαγωγής

του δείγματος στην αναλυτική στήλη. Ωστόσο, χρησιμοποιείται ελάχιστα, λόγω

των προβλημάτων που παρουσιάζει, όπως α) το μπλοκάρισμα της βελόνας από

μικρά σωματίδια και β) την αστάθεια στη βασική γραμμή [1].

Η ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος αποτελείται από έξι θέσεις, περιέχει

ένα βρόχο από τον οποίο εισάγεται το δείγμα και με τη βοήθεια της κινητής

φάσης μεταφέρεται στη στήλη. Όταν η βαλβίδα βρίσκεται στη θέση πλήρωσης, το

δείγμα αποβάλλεται από ειδική έξοδο. Στη συνέχεια με την περιστροφή της

βαλβίδας στη θέση εισαγωγής, το δείγμα εισάγεται στο εκλουστικό σύστημα το

οποίο διαβιβάζεται συνεχώς, κάτω από υψηλή πίεση στην αναλυτική στήλη. Τα

πλεονεκτήματα που εμφανίζει η μέθοδος εισαγωγής δείγματος με ειδική βαλβίδα,

σε σχέση την εισαγωγή του δείγματος με μικροσύριγγα είναι τα εξής [1]:

1) Η εισαγωγή του δείγματος στη στήλη γίνεται χωρίς να προκαλείται

διακοπή της ροής του εκλουστικού συστήματος.

2) Είναι δυνατή η εισαγωγή διαφορετικών όγκων δείγματος.

Βασικό μειονέκτημα της μεθόδου εισαγωγής δείγματος με ειδική βαλβίδα

είναι η αραίωση που υφίσταται το δείγμα πριν την εισαγωγή του στη στήλη.

Οι αυτόματοι δειγματολήπτες αποτελούνται από τη βαλβίδα εισαγωγής, το

βρόχο του δείγματος, τη σύριγγα, τα φιαλίδια που περιέχουν τα δείγματα και το

δίσκο, στον οποίο τοποθετούνται τα δείγματα. Κατά την εισαγωγή του δείγματος,

ο δίσκος περιστρέφεται μέχρις ότου το προγραμματισμένο φιαλίδιο βρεθεί κάτω

από τη μικροσύριγγα. Στη συνέχεια η μικροσύριγγα εισέρχεται στη φιάλη του

δείγματος και λαμβάνει μια ορισμένη ποσότητα δείγματος, η οποία και

διοχετεύεται στο βρόχο της βαλβίδας. Το σύστημα εισαγωγής δείγματος πρέπει

να εξασφαλίζει την εισαγωγή του χωρίς αραίωση και ο διαχωρισμός να

επιτυγχάνεται χωρίς διασπορά [1].

1.5. Στήλες HPLC

Οι στήλες HPLC ανάλογα με τις διαστάσεις τους κατατάσσονται στις εξής

κατηγορίες [1]:

Προστήλες

Αναλυτικές στήλες

Ημιπαρασκευαστικές στήλες

Παρασκευαστικές στηλες

1.5.1 Προστήλη

Η προστήλη χρησιμοποιείται σε διάταξη υγρής χρωματογραφίας υψηλής

απόδοσης για προληπτικούς λόγους. Σκοπός της είναι η προστασία της αναλυτι-

κής στήλης από δείγματα που περιέχουν αιωρούμενα σωματίδια ή δείγματα που

περιέχουν ενώσεις που προσροφώνται πολύ ισχυρά. Με τη χρήση προστήλης

παρατείνεται η απόδοση και η ζωή της αναλυτικής στήλης της οποίας το κόστος

είναι μεγάλο σε σχέση με τη διάρκεια ζωής της [1].

Η προστήλη τοποθετείται μεταξύ του συστήματος εισαγωγής του

δείγματος και της αναλυτικής στήλης. Το μήκος της είναι πολύ μικρότερο από

αυτό της αναλυτικής στήλης για να μην παρατηρείται διεύρυνση των

χρωματογραφικών κορυφών. Το υλικό πλήρωσης είναι το ίδιο μ’ εκείνο της

αναλυτικής στήλης, αλλά το μέγεθος των πόρων της είναι πιο μικρό. Πρέπει να

σημειώσουμε ότι οι προστήλες έχουν ορισμένη χωρητικότητα, δηλαδή έχουν ένα

σημείο κορεσμού. Το τέλος της διάρκειας των στηλών αυτών γίνεται αντιληπτό

από την πίεση που δημιουργείται και από την κακή επαναληψιμότητα των

αναλύσεων που πραγματοποιούνται.

Τα κύρια μειονεκτήματα που εμφανίζει η χρήση προστήλης σε μια

ανάλυση είναι τα ακόλουθα [1]:

Αύξηση της πίεσης επαναφοράς του συστήματος.

Διεύρυνση των κορυφών του χρωματογραφήματος.

1.5.2. Αναλυτική στήλη

Η αναλυτική στήλη πρέπει να είναι υψηλής πιστότητας, ώστε να δίνει

ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Η χρωματογραφική στήλη αποτελείται

από τον εξωτερικό κύλινδρο και το υλικό πλήρωσης. Ο εξωτερικός κύλινδρος

μπορεί να είναι κατασκευασμένος από μέταλλο, ανοξείδωτο χάλυβα, γυαλί ή

πολυμερές. Το υλικό πλήρωσης βρίσκεται στο εσωτερικό του κυλίνδρου και

επιλέγεται ανάλογα με τις ενώσεις που θα διαχωριστούν. Τα περισσότερα υλικά

πλήρωσης έχουν ως βάση την πηκτή διοξειδίου του πυριτίου ( silica gel - SiO2 ),

γιατί έχει χαμηλό κόστος και δεν καταστρέφεται εύκολα. Τα υλικά μπορεί να είναι

πορώδη ή μη πορώδη. Τα μη πορώδη αποτελούνται από ένα εσωτερικό

συμπαγή πυρήνα και από μία πορώδη εξωτερική στιβάδα, ενώ η μέση διάμετρος

των πόρων είναι 80-120 Å. Ένα τρίτο είδος υλικού είναι τα υλικά διάχυσης, τα

οποία έχουν δύο ειδών πόρους, μεγάλης διαμέτρου διείσδυσης (μερικών

χιλιάδων Å) και μικρούς πόρους διάχυσης με διάμετρο μερικών εκατοντάδων Å,

οι οποίοι δημιουργούν μεγάλη ειδική επιφάνεια και μικρά μονοπάτια διάχυσης.

Οι παράμετροι που επηρεάζουν την επιλογή της στατικής φάσης είναι οι

εξής [1]:

Το μέγεθος των μορίων του υλικού πλήρωσης και τα γεωμετρικά

χαρακτηριστικά της στήλης που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα και τον

αριθμό των θεωρητικών πλακών.

Η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία

καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης.

Η διάμετρος των πόρων του υλικού πλήρωσης.

Ο τύπος του υποστρώματος, το οποίο πρέπει να είναι χημικά σταθερό.

Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια.

Η μέθοδος παρασκευής του υποστρώματος.

1.5.3. Αποτελεσματικότητα στήλης

Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα μιας στήλης

είναι [1]:

1. Όσον αφορά στο υλικό πλήρωσης, σημαντικό ρόλο παίζουν η φύση της

επιφάνειας των κόκκων και η διάστασή τους.

2. Όσον αφορά στο περίβλημα, την αποτελεσματικότητα της στήλης

επηρεάζουν το μήκος και η διάμέτρος της.

3. Χημικοί παράγοντες, οι οποίοι επηρεάζουν τη διακριτική ικανότητα.

4. Μηχανικοί παράγοντες, οι οποίοι επηρεάζουν το χρόνο ζωής [1].

Για την αποφυγή συχνής αλλαγής στήλης, όταν εκτελούνται διαφορετικές

αναλυτικές μέθοδοι με το ίδιο σύστημα HPLC, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία

συσκευή, που αποτελείται από μία περιστρεφόμενη βαλβίδα έξι διαύλων, στους

οποίους μπορούν να συνδεθούν διαφορετικές στήλες [2].

Η τεχνική της HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασι-

σμένους σε προσρόφηση, κατανομή, ιοανταλλαγή και μοριακό αποκλεισμό, και

για κάθε μία εφαρμογή διατίθεται από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες οι

κατάλληλες στήλες. Η παρασκευή των στηλών είναι πολύ κρίσιμο στάδιο για την

καλή απόδοση της τεχνικής.

Τα υλικά στήριξης (Corasil, Zipax, Celite, κ.λ.π.), ξηραίνονται πριν από

την επικάλυψή τους με την υγρή στατική φάση, ενώ τα στερεά υλικά προσροφή-

σεως ενεργοποιούνται με πλήρωση. Για την ελαχιστοποίηση των λιμνάζοντων

χώρων στη στήλη, απαιτείται άριστη πλήρωση της, δηλαδή οι πόροι του υλικού

στήριξης πρέπει να γεμίζουν τελείως με την υγρή στατική φάση. Μία καλά πλη-

ρωμένη στήλη της μορφής αυτής, μπορεί να έχει μία απόδοση περίπου 400 θεω-

ρητικών πλακών ανά cm με σωματίδια 5-10 μm.

Επειδή η κινητή φάση μπορεί να διαλύει μερικώς την υγρή στατική φάση,

με αποτέλεσμα τη βαθμιαία καταστροφή της, συνήθως παρεμβάλλεται μία μικρή

στήλη πριν από την κύρια στήλη, πληρωμένη με το ίδιο υλικό (προστήλη). Ετσι, η

κινητή φάση, φθάνει στην κύρια στήλη κορεσμένη με την υγρή στατική φάση. Η

προστήλη επίσης προστατεύει την κύρια στήλη από ακαθαρσίες που προσρο-

φούνται μη αντιστρεπτά [2].

1.6. Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC

Ένας ανιχνευτής HPLC ανεξάρτητα από την αρχή στην οποία βασίζεται η

λειτουργία του πρέπει να πληρεί ορισμένες προυποθέσεις [1]:

1. Χαμηλό επίπεδο θορύβου: Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί τύποι θορύβου, ο

θόρυβος χαμηλής συχνότητας, ο οποίος εμφανίζεται με συχνότητα σημαντι-

κά μικρότερη από το εύρος του χρωματογραφήματος, ο θόρυβος υψηλής

συχνότητας, ο οποίος έχει συχνότητα της ίδιας τάξεως με εκείνης του χρωμα-

τογραφήματος και ο θόρυβος που έχει περίοδο 10 min ή και περισσότερο και

ονομάζεται απόκλιση βασικής γραμμής. Η απόκλιση βασικής γραμμής εμφα-

νίζεται ως συνεχής αύξηση ή ελλάτωση του σήματος, η οποία μπορεί να

οφείλεται σε μεταβολές παραμέτρων, όπως η θερμοκρασία, η πίεση, η ροή ή

ακόμη και σε ηλεκτρονικές μεταβολές.

2. Υψηλή ευαισθησία και μεγάλο εύρος γραμμικής περιοχής.

3. Μικρός χρόνος απόκρισης.

4. Μικρός νεκρός όγκος.

5. Ανεξαρτησία στις μεταβολές της θερμοκρασίας και της ροής.

6. Ευελιξία στις μεταβολές της σύστασης της κινητής φάσης.

7. Αξιοπιστία και ευκολία στη χρήση.

8. Δυνατότητα ανίχνευσης διαφόρων ενώσεων και παροχή στοιχείων για

την ταυτοποίηση τους.

9. Μη καταστροφή του αναλυόμενου δείγματος.

Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην υγρή χρωματογραφία υψηλής

πίεσης κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες [1]:

Α. Γενικοί Ανιχνευτές. Οι οποίοι μετράνε την αλλαγή μιας ιδιότητας της κι-

νητής φάσης.

Β. Ειδικοί Ανιχνευτές. Μετράνε την αλλαγή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας

των προσδιοριζόμενων συστατικών.

Ο ανιχνευτής αφού μετρήσει την αλλαγή της φυσικοχημικής ιδιότητας, τη

μετατρέπει σε ηλεκτρικό σήμα. Το σήμα του ανιχνευτή μπορεί να είναι ανάλογο

της συγκέντρωσης της ένωσης που προσδιορίζεται ή να είναι ανάλογο της ροής

μάζας της ουσίας.

Τα γενικά χαρακτηριστικά ενός ανιχνευτή είναι׃ α) η ευαισθησία, β) να είναι

αθόρυβος, γ) να έχει μεγάλη περιοχή γραμμικότητας και δ) η απόκρισή του, στις

αλλαγές της συγκέντρωσης της κινητής φάσης, πρέπει να είναι γρήγορη. Τέλος,

κατά την επιλογή ενός ανιχνευτή, πρέπει να συνυπολογίζεται το κόστος του, η

εμπορική του διαθεσιμότητα, η ευκολία συντήρησής του και η ευκολία στη χρήση

του.

Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην υγρή χρωματογραφία υψηλής

απόδοσης είναι οι ακόλουθοι [1]:

Ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού.

Ανιχνευτές παράταξης φωτοδιοδίων.

Φθορισμομετρικοί ανιχνευτές.

Ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές.

Αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές.

Φασματογράφοι μάζας.

Ανιχνευτής υπεριώδους-ορατού׃ Ο ανιχνευτής αυτός αποτελείται από μια

πηγή φωτός και από ένα φωτοανιχνευτή μεγάλης ευαισθησίας. Τα τοιχώματα του

τριχοειδή σωλήνα πρέπει να είναι διαπερατά από το υπεριώδες στο σημείο που

τοποθετείται ο ανιχνευτής. Έχει καλή διαχωριστική ικανότητα και ικανοποιητικό

χρόνο απόκρισης. Ετσι, μπορεί ν’ ανιχνεύει ζώνες ιόντων μικρού μήκους (0,05

mm). Το κυριότερο μειονέκτημα του είναι ότι ανιχνεύει μόνο ζώνες ιόντων που

απορροφούν την ακτινοβολία που διέρχεται από αυτές [3].

Υπάρχουν τρεις τύποι ανιχνευτών αυτού του τύπου [2]:

1. Ανιχνευτής σταθερού μήκους κύματος (απλό φωτόμετρο φίλτρου, που

μετρά την απορρόφηση σε ένα σταθερό μήκος κύματος της υπεριώδους ακτινο-

βολίας, συνήθως στα 254 nm, που είναι η κύρια γραμμή εκπομπής του φάσμα-

τος του υδραργύρου).

2. Ανιχνευτής πολλαπλών σταθερών μηκών κύματος (η διαφορά του με

τον προηγούμενο είναι ότι έχει τη δυνατότητα επιλογής περισσότερων μηκών

κύματος στο υπεριώδες και το ορατό, με τη βοήθεια φίλτρων).

3. Ανιχνευτής μεταβαλλόμενου μήκους κύματος (είναι ένα πλήρες φασμα-

τοφωτόμετρο, που με τη βοήθεια μονοχρωμάτορα επιτρέπει την επιλογή οποιου-

δήποτε μήκους κύματος στο υπεριώδες και το ορατό) [2].

Η ευαισθησία αυτού του ανιχνευτή εξαρτάται από τη μοριακή απορροφητι-

κότητα των διαφόρων συστατικών. Συνήθως ο ανιχνευτής μπορεί να χρησιμοποι-

ηθεί σε συγκεντρώσεις της τάξης του 0,01 μg/mL. Είναι ανεπηρέαστος σε μετα-

βολές της θερμοκρασίας, σχετικά φθηνός (οι πρώτοι δύο τύποι), και αποκρίνεται

σε μεγάλο αριθμό οργανικών ενώσεων. Αποτελεί τον περισσότερο χρησιμοποι-

ούμενο ανιχνευτή (στο 80% περίπου των αναλύσεων με HPLC) [2].

1.7. Προκατεργασία δείγματος

Ο συνεχώς αυξανόμενος αριθμός δειγμάτων που απαιτούν ανάλυση, οδή-

γησε στην ανάπτυξη διαφόρων αναλυτικών τεχνικών. Για να είναι δυνατή η

αξιοποίηση των δυνατοτήτων που μας προσφέρει η ενόργανη ανάλυση πρέπει

να συνοδεύεται και από μια αποτελεσματική προκατεργασία δειγμάτων. Οι

στόχοι της προκατεργασίας του δείγματος είναι [1]:

1. Η απομάκρυνση των παρεμποδίσεων.

2. Η εκλεκτική προσυγκέντρωση των ουσιών που αναλύονται.

3. Η προστασία του οργάνου.

Για να είναι μία μέθοδος προκατεργασίας αποτελεσματική πρέπει [1]:

1. Nα υπάρχει εκλεκτικότητα κατά την απομόνωση της ένωσης που ενδια-

φέρει στην ανάλυση.

2. Να υπάρχει επαναληψιμότητα στην ανάκτηση της ένωσης, εφόσον οι

συνθήκες προκατεργασίας παραμένουν σταθερές.

3. Η μέθοδος της προκατεργασίας να είναι γρήγορη.

4. Να είναι απλή σε ότι αφορά τους χειρισμούς προκατεργασίας του δεί-

γματος.

5. Να είναι οικονομική.

1.8. Επιλογή τεχνικής-εκλογή κινητής φάσης, με τη χρήση HPLC

Για την επιλογή του καταλληλότερου χρωματογραφικού συστήματος και

των συνθηκών διεξαγωγής μιας χρωματογραφικής αναλύσεως, ο αναλυτής βασί-

ζεται στη θεωρία της τεχνικής και στην πείρα του. Τα περισσότερα μείγματα ου-

σιών μπορούν να αναλυθούν με την HPLC, αρκεί να επιλεχθεί το κατάλληλο

σύστημα κινητής και στατικής φάσης [2].

Σε γενικές γραμμές, επιδιώκεται η εύρεση συνθηκών, στις οποίες τα συ-

στατικά ενός μείγματος συγκρατιούνται σε κάποιο βαθμό στη στατική φάση, αλλά

όχι πολύ ισχυρά. Αποδοτικός διαχωρισμός μπορεί να επιτευχθεί μόνο αν εξα-

σφαλιστεί διαφορετική ταχύτητα μετακινήσεως των ζωνών των συστατικών, λόγω

του διαφορετικού βαθμού συγκρατήσεώς τους στη στατική φάση. Επειδή οι

περισσότερο φαρμακευτικές ουσίες είναι μέσου μοριακού βάρους και ενδιάμεσης

πολικότητας, στη φαρμακευτική ανάλυση χρησιμοποιείται κυρίως η HPLC αντί-

στροφης φάσης, για μη ιονικές ενώσεις και η HPLC κατανομής ζεύγους ιόντων

για ιονικές ενώσεις [2].

1.9. Εφαρμογές HPLC

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για

το διαχωρισμό και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μειγμάτων

ουσιών ποικίλης προελεύσεως. Σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία, η υγρή

χρωματογραφία μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διαχωρισμούς και ανάλυση μειγ-

μάτων ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους και υψηλής πολικότητας, πολυμερών

και ιονικών ενώσεων. Η διαχωριστική της ικανότητα είναι 3 έως 10 φορές καλύτε-

ρη από αυτή της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, το κόστος όμως μίας συσκε-

υής HPLC είναι αρκετά υψηλό [2].

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αποτελεί σήμερα την τεχνική

επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης, αφού τα δείγματα με

τα οποία ασχολείται η φαρμακευτική ανάλυση είναι συνήθως μίγματα (π.χ. σκευ-

άσματα) [2].

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης βρίσκει εφαρμογές σε όλους

τους τομείς της χημικής ανάλυσης, τόσο σε αναλυτική, όσο και σε παρασκευαστι-

κή κλίμακα [1].

Φαρμακοβιομηχανίες: Αντιβοτικά, ηρεμιστικά, στεροειδή, αναλγητικά, κ.ά.

Βιοχημεία: Αμινοξέα, λιπίδια, υδατάνθρακες κ.ά.

Τρόφιμα: Τεχνητές γλυκαντικές ύλες, αντιοξειδωτικά κ.ά.

Χημικές βιομηχανίες: Απορρυπαντικά, βαφές, κ.ά.

Δικονομικές-τοξικολογικές μελέτες: Φάρμακα, ναρκωτικά, κ.ά.

Περιβαλλοντολογικές μελέτες: Παρασιτοκτόνα, φαινόλες, διοξίνες, κ.ά.

Κλινική χημεία: Οιστρογόνα, ορμόνες, μεταβολίτες φαρμάκων, κ.ά.

Κεφ.2 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Τα βασικά κριτήρια εκτίμησης για την αξιοπιστία και τη διεξαγωγή μιας

αναλυτικής μεθόδου είναι τα εξής [3]׃

Ακρίβεια

Επαναληπτικότητα

Όριο ανίχνευσης (LOD)

Όριο ποσοτικής αποτίμησης (LOQ)

Εξειδίκευση

Γραμμικότητα και Εύρος

Ανθεκτικότητα

Ακρίβεια׃ Ο βαθμός συμφωνίας των αποτελεσμάτων που παράγονται από

τη μεθόδο, με την πραγματική τιμή ή μιας παραδεκτή τιμής ως πραγματική τιμή

(διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής μιας σειράς μετρήσεων και της πραγματικής

τιμής). Η ακρίβεια μπορεί να εκτιμηθεί εφαρμόζοντας την αναλυτική μέθοδο σε

δείγματα ή μίγματα των συστατικών του υποστρώματος του δείγματος, στο οποίο

έχουν προστεθεί γνωστές ποσότητες του προσδιοριζόμενου συστατικού σε

συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες από τα επίπεδα που αναμένονται στα

δείγματα [3].

Επαναληπτικότητα׃ Ο βαθμός συμφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων,

όταν η μέθοδος εφαρμόζεται, κατ’ επανάληψη, σε πολλαπλά δείγματα. Διακρίνε-

ται σε επαναληψιμότητα, ενδιάμεση επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα

[3].

Επαναληψιμότητα׃ Διακυμάνσεις σε πολλαπλές αναλύσεις που διεξάγο-

νται στις ίδιες συνθήκες λειτουργίας και σε μικρό χρονικό διάστημα, ενώ ο

έλεγχος γίνεται πάντα την ίδια μέρα.

Ενδιάμεση Επαναληπτικότητα׃ Η μακροπρόθεσμη διακύμανση των

αποτελεσμάτων προκύπτει από τη σύγκριση των αποτελεσμάτων μιας

ανάλυσης, σ’ ένα εργαστήριο με την πάροδο του χρόνου, σε διαφορετικές

αναλυτικές συνθήκες και σε διαφορετικές ημέρες.

Αναπαραγωγιμότητα׃ Επαναληπτικότητα των αποτελεσμάτων μεταξύ δια-

φορετικών εργαστηρίων, υπό διαφορετικές συνθήκες, με τις ίδιες παραμέ-

τρους μεθόδου.

Εξειδίκευση׃ Ικανότητα της μεθόδου να δίνει σήμα για μία μόνο ουσία, σ’

ένα προκαθορισμένο επίπεδο ακρίβειας και επαναληψιμότητας, ακόμα και αν το

δείγμα περιέχει ενώσεις με παρόμοιες ιδιότητες. Η πιο συχνά αναφερόμενη

διαδικασία αποτίμησης της εξειδίκευσης είναι η ανάλυση ενός εικονικού

φαρμάκου (placebo), όπου το υπόστρωμα του δείγματος, χωρίς το συστατικό,

αναλύεται και εξετάζεται η απόκριση του συστήματος για σήματα, τα οποία

μπορεί να παρεμποδίζουν ή να επικαλύπτουν το συστατικό που μας ενδιαφέρει

[3].

Όριο ανίχνευσης׃ Η ελάχιστη συγκέντρωση του προσδιοριζόμενου

συστατικού, η οποία μπορεί ν’ ανιχνευτεί πάνω από τη βασική γραμμή του

θορύβου του ανιχνευτή στην πιο ευαίσθητη ρύθμιση του οργάνου, αλλά όχι

απαραίτητα και να προσδιοριστεί ποσοτικά. Στην πράξη, στη χρωματογραφία το

όριο ανίχνευσης είναι η εισαγόμενη ποσότητα, που παρέχει κορυφή με ύψος

διπλάσιο ή τριπλάσιο του ύψους του θορύβου της βασικής γραμμής [3].

Όριο ποσοτικής αποτίμησης׃ Εκφράζει τη συγκέντρωση του στοιχείου που

δίνει τιμή μέτρησης XQ, ίση με τη μέση τιμή των μετρήσεων Xb μιας σειράς από

λευκούς προσδιορισμούς, αυξημένη κατά το δεκαπλάσιο της τυπικής σπόκλισης

Sb αυτών των προσδιορισμών [4]. Στο σχήμα 2.1 δίνεται μία γραφική παράσταση

του ορισμού των ορίων ποσοτικού προσδιορισμού και ανίχνευσης [4].

Γραμμικότητα׃ Η γραμμικότητα μιας αναλυτικής μεθόδου είναι η ικανότητα

να υπολογίζονται τα αποτελέσματα των μετρήσεων άμεσα, ή με προκαθορισμέ-

νες μαθηματικές μετατροπές, σε αναλογία με τη συγκέντρωση των προσδιοριζό-

μενων συστατικών ενός δείγματος σε συγκεκριμένο εύρος συγκεντρώσεων, (r>

0,99) [3]. Η γραμμικότητα καθορίζεται από μία σειρά 3-6 εισαγωγών δείγματος

από πέντε ή περισσότερα πρότυπα, των οποίων η συγκέντρωση εκτείνεται στο

εύρος των αναμενόμενων συγκεντρώσεων, ή 80% από το χαμηλότερο

αναμενόμενο επίπεδο έως 120% του υψηλότερου αναμενόμενου επιπέδου, ή

50%-150% ή 10%-200% του αναμενόμενου εύρους της κλίμακας εργασίας

(working range), ή 25%-125% του εύρους του συγκεκριμένου συστατικού που

μας ενδιαφέρει [3].

Εύρος׃ Διάστημα μεταξύ ανώτερης και κατώτερης συγκέντρωσης του

συστατικού, για το οποίο υπάρχει ένα κατάλληλο επίπεδο ακρίβειας,

επαναληψιμότητας και γραμμικότητας [4].

Ανθεκτικότητα׃ Μέτρο ικανότητας της μεθόδου να δρα αποτελεσματικά

στην αντιμετώπιση μεταβολών σε λειτουργικές και περιβαλλοντικές συνθήκες [4].

Πιο συγκεκριμένα, η ανθεκτικότητα είναι η αναπαραγωγιμότητα των

αποτελεσμάτων της μεθόδου που αποκτήθηκαν από ανάλυση δειγμάτων κάτω

από ποικίλες συνθήκες, όπως διαφορετικά εργαστήρια, αναλυτές, όργανα,

διάφορα αντιδραστήρια, χρόνος ανάλυσης, θερμοκρασίες κ.τ.λ. [3].

Σχήμα 2.1: Γραφική παράσταση του ορισμού των ορίων (LOD-LOQ).

Κεφ.3 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

Οι χρωματογραφικές παράμετροι, οι οποίες είναι χρήσιμες για την

εκτίμηση της ποιότητας ενός χρωματογραφήματος είναι οι ακόλουθοι [5]׃

Συντελεστής συγκράτησης, k΄

Παράγοντας διαχωρισμού, α

Αριθμός θεωρητικών πλακών, ΝΤ

Παράγοντας ασυμμετρίας,, ΑS

Διαχωριστική ικανότητα, RS

Συντελεστής συγκράτησης׃ Εκφράζει το χρόνο εξόδου ενός μορίου από τη

στήλη, μετά την έγχυση του, με την προϋπόθεση ότι δε λαμβάνει χώρα

συγκράτηση. Η τιμή του παράγοντα, k΄, υπολογίζεται από την εξίσωση 3.1׃

(tR- tO)

k΄= (3.1)

tO

όπου: tR, είναι ο χρόνος συγκράτησης του συστατικού και tO, είναι ο νε-

κρός χρόνος, δηλαδή ο χρόνος συγκράτησης που εξέρχεται από τη στήλη, χωρίς

να κατακρατηθεί. Ο παράγοντας συγκράτησης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να

γίνει σύγκριση των χρόνων συγκράτησης για την ίδια ένωση όταν αλλάζει το

μήκος των στηλών ή η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης, εφόσον παραμένει το

ίδιο υλικό στη στατική φάση και η ίδια σύσταση στην κινητή φάση [5].

Παράγοντας διαχωρισμού׃ Ο παράγοντας διαχωρισμού εκφράζεται με το

λόγο των τιμών k΄ δύο χρωματογραφικών κορυφών k΄1, k΄2. Ο παράγοντας

διαχωρισμού δίνεται από την εξίσωση 3.2׃

k’2

α = (3.2)

k’1

όπου: k΄1, k΄2 οι δύο χρωματογραφικές κορυφές, των οποίων η τιμή τους

εξαρτάται, τόσο από τη στατική, όσο και από την κινητή φάση. Η τιμή του

παράγοντα διαχωρισμού δε μπορεί να είναι μικρότερη από τη μονάδα, ενώ η

συνθήκη 2<α<4, αντιπροσωπεύει τον ιδανικό διαχωρισμό δύο ενώσεων [5].

Αριθμός θεωρητικών πλακών׃ Με την παράμετρο αυτή χαρακτηρίζεται το

εύρος μιας χρωματογραφικής κορυφής. Ο αριθμός θεωρητικών πλακών χρησι-

μοποιείται για τον έλεγχο απόδοσης της στήλης. Στήλες με μεγάλη τιμή Ν, δίνουν

στενές κορυφές και γενικά καλούς διαχωρισμούς [5]. Ο αριθμός θεωρητικών

πλακών υπολογίζεται από την εξίσωση 3.3:

tR

Ν = 5,54 ( ) 2 (3.3)

WO×S

ή από την εξίσωση 3.4:

tR

Ν = 16 ( ) 2 (3.4)

W

όπου: tR ο χρόνος συγκράτησης της ουσίας, W το πλάτος της κορυφής στη

βάση της και WO×S το πλάτος της κορυφής στο μισό του ύψους αυτής.

Ασυμμετρία χρωματογραφικών κορυφών׃ Ο παράγοντας ασυμμετρίας εί-

ναι ένας συντελεστής που δείχνει ποσοτικά το βαθμό ασυμμετρίας μιας χρωματο-

γραφικής κορυφής. Η τιμή του Ν, αλλάζει για ασύμμετρες κορυφές. Οι τιμές του

παράγοντας ασυμμετρίας, για ιδανικές κορυφές, είναι από 0,9 μέχρι 1,2. Μεγάλες

τιμές έχουν ως αποτέλεσμα να παρουσιάζονται ατελή χρωματογραφήματα. Ο

παράγοντας ουράς (tailing factor), που εμφανίζεται στις κορυφές σημαίνει ότι

περισσότεροι από ένα μηχανισμοί λαμβάνουν χώρα στο διαχωρισμό. Για αντί-

στροφες στατικές φάσεις, η παρουσία κορυφών με ουρά, σημαίνει ότι ο αριθμός

των –OH ομάδων που δεν έχουν αντιδράσει με την υγρή στατική φάση είναι

υπερβολικά μεγάλος. Ο παράγοντας ασυμμετρίας υπολογίζεται, χαράσσοντας το

ύψος της κορυφής με μία κάθετο που ενώνει την κορυφή με την βασική γραμμή.

Κατόπιν, στο 10% του ύψους της υπολογίζεται το πλάτος της κορυφής [5]. Επο-

μένως ο παράγοντας ασυμμετρίας υπολογίζεται από την εξίσωση 3.5:

B

AS = (3.5)

A

Διαχωριστική ικανότητα׃ Συντελεστής που δείχνει την ποιότητα του διαχωρι-

σμού, δηλαδή το πόσο καλά διαχωρίζονται οι ουσίες. Η τιμή του RS, αυξάνει με

την αύξηση του αριθμού των θεωρητικών πλακών. Για να συμβεί αυτό, μπορεί να

ελαττωθεί η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης, ή να συνδέσουμε δύο στήλες

συγχρόνως σε σειρά. Έτσι, αυξάνοντας τη τιμή του Ν, μπορεί να βελτιωθεί ο

διαχωρισμός [5]. Η διαχωριστική ικανότητα δίνεται από την εξίσωση 3.6:

k’

RS = 0,25 ( ) (α-1) Ν½ (3.6)

1+k’

όπου: k’ ο συντελεστής συγκράτησης, α ο παράγοντας διαχωρισμού και Ν ο

αριθμός των θεωρητικών πλακών.

Κεφ.4 ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ

4.1. Έλεγχος ομοιομορφίας περιεκτικότητας

Η αμερικανική φαρμακοποϊία USP XIV (1950), εισήγαγε πρώτη τον έλεγ-

χο ομοιομορφίας μεμονωμένου βάρους (weight variation) στα δισκία. Για φαρμα-

κομορφές με μεγάλη δόση φαρμακευτικής ουσίας, η ακρίβεια της μεμονωμένης

δόσης είναι δεδομένη, όταν υπάρχει ικανοποιητική ομοιομορφία βάρους [6].

Ο έλεγχος ομοιομορφίας του μεμονωμένου βάρους σε δισκία, είναι ένα με-

γάλο βοήθημα στον έλεγχο κατανομής της δραστικής ουσίας, αν το ποσοστό των

βοηθητικών ουσιών είναι μικρό, δηλαδή μεγάλο ποσοστό δραστικής ουσίας. Στην

περίπτωση που το ποσοστό της δραστικής ουσίας είναι μικρό, τότε δεν είναι δυ-

νατή μία απευθείας σχέση μεταξύ της κατανομής δραστικής ουσίας και της ομοιο-

μορφίας βάρους σε στερεές ή ημιστερεές φαρμακομορφές.

Η ομοιογενής κατανομή της δραστικής ουσίας, είναι σπουδαία προϋπόθε-

ση για την αξιοπιστία της δραστικότητας ενός φαρμακευτικού σκευάσματος. Τό-

σο ο γιατρός, όσο και ο ασθενής θα πρέπει να είναι σίγουροι ότι κάθε δισκίο θα

περιέχει την αναγραφόμενη ποσότητα της δραστικής ουσίας ή θα βρίσκεται η

ποσότητα μέσα στα επιτρεπτά όρια.

Το πρόβλημα της ομοιογενούς κατανομής της δραστικής ουσίας, εμφανί-

ζεται σε στερεές ή ημιστερεές φαρμακομορφές εφάπαξ δόσης, στις οποίες το

δραστικό συστατικό, δε βρίσκεται σε διαλυμένη μορφή, όπως π.χ. απλά δισκία,

επικεκαλυμμένα δισκία, καψάκια, υπόθετα.

Προϋπόθεση για μια ομοιογενή κατανομή της δραστικής ουσίας σε φαρμα-

κομορφές εφάπαξ δόσης είναι, αφενός μία ομοιόμορφη κατανομή της δραστικής

ουσίας στο βασικό μίγμα, π.χ. στους κόκκους ή στη βάση των υποθέτων, αφετέ-

ρου η διατήρηση της κατανομής αυτής, κατά τη διάρκεια της περαιτέρω επεξερ-

γασίας (δισκοποίηση, πλήρωση καψακίων, παρασκευή υποθέτων).

Στην ανάπτυξη των φαρμακομορφών, η ομοιογενής κατανομή της δραστι-

κής ουσίας στο βασικό μίγμα, επιτυγχάνεται με τη βοήθεια κατάλληλων βοηθητι-

κών και δραστικών ουσιών με κατάλληλη κρυσταλλική μορφή και μέγεθος.

Ο φαρμακευτικός αναλυτής είναι εκείνος, που με τη βοήθεια κατάλληλων

αναλυτικών μεθόδων, θα πρέπει να ελέγξει τα καθοριζόμενα όρια ανοχής.

Είναι λοιπόν φανερό, ότι μόνο η περιεκτικότητα της δραστικής ουσίας των

μεμονωμένων φαρμακομορφών, είναι αυτή που παίζει ρόλο και καθορίζει τη θε-

ραπευτική δράση του φαρμάκου. Για το λόγο αυτό η αμερικανική φαρμακοποϊία

USP XVII (1965), εισήγαγε τον έλεγχο ομοιομορφίας περιεκτικότητας μεμονωμέ-

νων φαρμακομορφών (content uniformity test), για φαρμακομορφές με δραστική

ουσία κάτω των 50 mg [6].

4.2. Παράγοντες που επηρεάζουν τον έλεγχο ομοιομορφίας περιεκτι-

κότητας

Ως παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη στον έλεγχο ομοιομορ-

φίας περιεκτικότητας, μπορούν να αναφερθούν οι παρακάτω [6]:

Η δοσολογία : Πρέπει να είναι γνωστή η δοσολογία για τον έλεγχο περιεκτι-

κότητας μεμονωμένων φαρμακομορφών μια και οι έλεγχοι μεταβάλλονται

ανάλογα με τα δραστικά συστατικά.

Η συνταγολογία : Στον ποσοτικό προσδιορισμό του ποσού της δραστικής

ουσίας έχουμε επίδραση των εκδόχων.

Η ανάμιξη : Η ανάμιξη των συστατικών στα δισκία και στα καψάκια, μπορεί

να επηρεάσει την ομοιομορφία της περιεκτικότητας του δραστικού συστα-

τικού, όταν αυτό βρίσκεται σε χαμηλό ποσοστό. Ο παράγοντας αυτός,

φαίνεται να ήταν εκείνος που οδήγησε την USP XVII, να συμπεριλάβει τον

έλεγχο ομοιομορφίας περιεκτικότητας μεμονωμένων φαρμακομορφών, με

δραστικό συστατικό κάτω από 50 mg. Είναι αυτονόητο, ότι υπάρχουν με-

γαλύτερες δυσκολίες στην επίτευξη ομοιομορφίας περιεκτικότητας, όταν α-

ναμιγνύουμε 60 mg δραστικής ουσίας με τα απαιτούμενα έκδοχα, για την

παρασκευή δισκίων βάρους 600 mg, παρά όταν τα 60 mg τα αναμιγνύου-

με με έκδοχα για παρασκευή δισκίων βάρους 200 mg. Σε τέτοιες περιπτώ-

σεις, για την εκτίμηση της ομοιομορφίας πρέπει να ληφθεί υπόψη το πο-

σοστό της δραστικής ουσίας στο δισκίο και όχι το βάρος του.

Η μορφοποίηση : Η μορφοποίηση των στερεών φαρμακοτεχνικών σκευα-

σμάτων, επηρεάζει επίσης τη μεταβολή της περιεκτικότητας του δραστικού

συστατικού, άρα και την ομοιομορφία της περιεκτικότητας. Eτσι, π.χ. δι-

σκία που παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της υγράς κοκκοποίησης, δεί-

χνουν μικρότερη διασπορά σε δραστικά συστατικά απ’ ότι δισκία που

παρασκευάστηκαν με απευθείας δισκιοποίηση.

Η σταθερότητα : Τα επιτρεπτά όρια του ελέγχου της ομοιομορφίας περιε-

κτικότητας της δραστικής ουσίας, πρέπει να επηρεάζονται από τη σταθε-

ρότητα της δραστικής ουσίας. Έτσι για τη νιτρογλυκερίνη, παράγοντες

σταθερότητας οδήγησαν την USP στα επιτρεπτά όρια των 75%-125%.

Οι φαρμακολογικές ιδιότητες : Σημαντική επίδραση στον έλεγχο ομοιομορ-

φίας της δραστικής ουσίας, έχουν οι φαρμακολογικές ιδιότητές της, οι

οποίες επηρεάζουν τα επιτρεπτά όρια και τον αριθμό των δειγμάτων, που

απαιτούνται για τον έλεγχο. Αν ο θεραπευτικός δείκτης είναι μεγάλος, οι

φαρμακολογικές ιδιότητες δεν είναι μεγάλου ενδιαφέροντος στον έλεγχο

ομοιομορφίας περιεκτικότητας. Αν όμως ο θεραπευτικός δείκτης είναι μι-

κρός, τότε θα πρέπει να εφαρμοσθεί ένας έλεγχος ομοιομορφίας της περι-

εκτικότητας, έστω και αν δεν αναφέρεται στη μονογραφία.

Η βιοδιαθεσιμότητα : Η μελέτη του ελέγχου ομοιομορφίας περιεκτικότητας

της δραστικής ουσίας, σε συνδυασμό με τη βιοδιθεσιμότητα, μας δίνει

πληροφορίες για το ποσό της δραστικής ουσίας που διατίθεται για απορ-

ρόφηση.

Η αναλυτική μέθοδος : Ένας άλλος παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υ-

πόψη στον έλεγχο ομοιομορφίας περιεκτικότητας, είναι και η αναλυτική μέ-

θοδος. Αυτή θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της δραστικής ουσί-

ας και περιλαμβάνει το κόστος, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα της

μεθόδου.

Από τους παραπάνω παράγοντες μπορεί να συμπεράνει κανείς, ότι

τα όρια τέτοιων ελέγχων πρέπει να μπορούν να ρυθμιστούν κατάλληλα,

έτσι ώστε να ανταποκρίνονται στην εκάστοτε χρησιμοποιούμενη

φαρμακομορφή [6].

4.3. Κριτήρια της μεθόδου έλεγχου

Ως κύριο νόημα του ελέγχου ομοιομορφίας περιεκτικότητας,

αν πρόκειται για δισκία, μπορεί να ορισθεί ο προσδιορισμός επί τοις

εκατό ποσοστού της δραστικής ουσίας, Pt, το οποίο δίνεται από την

εξίσωση 4.1 [6]:

Dt

Pt = × 100 (4.1)

Dr

όπου Dt παριστάνει το πειραματικό προσδιοριζόμενο ποσό της

δραστικής ουσίας και Dr παριστάνει το δηλωμένο ποσό της δραστικής

ουσίας. Σε τέτοιου είδους μεθόδους ελέγχου ομοιομορφίας

περιεκτικότητας της δραστικής ουσίας, ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια [6]:

Η μέθοδος προσδιορισμού πρέπει να είναι ευαίσθητη, γιατί κάθε φορά η

μεμονωμένη αναγκαία δόση δραστικής ουσίας είναι πολύ χαμηλή.

Η μέθοδος πρέπει να είναι πολύ ειδική μια και συνυπάρχουν δραστικές

και βοηθητικές ουσίες, παρεμποδίζοντας τον ακριβή προσδιορισμό της

δραστικής ουσίας.

Η μέθοδος πρέπει να δίνει ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Η μέθοδος δεν πρέπει να απαιτεί πολύ χρόνο για τον έλεγχο, γιατί χρειά-

ζονται πολλές παράλληλες αναλύσεις [6].

ΚΕΦ.5 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΩΣΗ ΝΙΜΟΔΙΠΙΝΗ

Η νιμοδιπίνη είναι μια διϋδροπυριδίνη, η οποία δρα ως ανταγωνι-

στής ασβεστίου. Το συγκεκριμένο φάρμακο, χρησιμοποιείται για την πρό-

ληψη και θεραπεία ισχαιμικών νευρολογικών ελλειμμάτων, επακόλουθων

της υπαραχνοειδούς αιμορραγίας. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που μπο-

ρούν να προκληθούν από τη χρήση του φαρμάκου είναι υπόταση, πεπτι-

κές διαταραχές, διαταραχές του καρδιακού ρυθμού, κεφαλαλγία, έξαψη και

αίσθημα θερμότητας. Η νιμοδιπίνη χορηγείται κυρίως σε υπερτασικά άτο-

μα, ενώ αν χορηγηθεί με σιμετιδίνη ή άλλες αντιυπερτασικές ουσίες, ενι-

σχύεται η δράση της. Αντίθετα, δε θα πρέπει να χορηγείται μαζί με άλλους

ανταγωνιστές διαύλων ασβεστίου ή β-αναστολείς [7].

Η χημική ονομασία της νιμοδιπίνης είναι 1,4-διϋδρο-2,6-διμέθυλο-4-

(3-νιτροφαίνυλο)-3,5-πυριδίνο-δικαρβοξυλικό οξύ-2-μεθοξυαίθυλο-1-μεθυ-

λοαιθυλεστέρας, ενώ η χημική δομή της [7], καθώς και των προσμίξεων

της, δίνονται στο σχήμα 5.1[8].

Η νιμοδιπίνη είναι ένα φάρμακο ευαίσθητο στο φως, κατά την επί-

δραση του οποίου οξειδώνεται σε παράγωγο της πυριδίνης (NMDP), με

ταυτόχρονη μετάθεση της νιτροομάδας από μετα- σε παρα- θέση [9]. Το

προϊόν, που λαμβάνεται έχει χρώμα κίτρινο (ανοιχτό), ενώ το μοριακό της

βάρος είναι 418,5 [10]. Διάλυμα του φαρμάκου σε ποσότητα 1% (w/v) δια-

λύεται σε pH από 6 έως 6,8. Η νιμοδιπίνη, είναι πρακτικά, αδιάλυτη στο

νερό, ενώ διαλύεται στον οξικό αιθυλεστέρα και στην αλκοόλη. Η συγκε-

κριμένη ουσία λιώνει στους 125 °C. Από τη στοιχειακή ανάλυση του φαρ-

μάκου, συμπεραίνεται πως η νιμοδιπίνη αποτελείται από 60,28% C, 6,26%

H, 6,69% N, 26,76% O [10].

Nimodipine

Impurity A

Impurity B

Impurity C

Σχήμα 5.1: Χημικοί τύποι της νιμοδιπίνης και των προσμίξεων της, Imp.A (a),

Imp.B (b), Imp. C (c).

Η πορεία σύνθεσης της νιμοδιπίνης δίνεται στο σχήμα 5.2 [11]׃

Σχήμα 5.2: Σύνθεση της νιμοδιπίνης.

Όπως μπορεί να παρατηρηθεί από το σχήμα 5.2, τα στάδια

σύνθεσης της νιμοδιπίνης αναλυτικά είναι τα εξής: Αρχικά με προσθήκη,

μίας βάσης, ενός οξέος και ενός αλκυλαλογονιδίου, σε διάλυμα που

περιέχει ανθρακικό βάριο, παράγεται άλας του νατρίου. Στη συνέχεια, με

αντίδραση του άλατος με βενζοϋλοχλωρίδιο, παράγεται το

ακετυλοχλωρίδιο. Το ακετυλοχλωρίδιο αντιδρά με τον ανυδρίτη για να

προκύψει μία βενζυλική ένωση. Έπειτα, με προσθήκη αλκοόλης, η

βενζυλική ένωση μετατρέπεται σε εστέρα, από την αντίδραση του οποίου

με αμμωνία παράγεται μία εναμίνη. Στο τελικό στάδιο της σύνθεσης, από

την αντίδραση της εναμίνης με νιτροβενζυλική ένωση παράγεται η

νιμοδιπίνη.

Κεφ.6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ

Στη συνέχεια περιγράφονται ορισμένες δημοσιευμένες τεχνικές ανάλυσης

της δραστικής ουσίας, νιμοδιπίνης.

6.1. Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι

Δύο μέθοδοι προσδιορισμού της νιμοδιπίνης, περιγράφονται φασματοφω-

τομετρικά. Η πρώτη περιλαμβάνει τη χρησιμοποίηση της παρα-διμεθυλο-αμινο-

κινναμαλδεϋδης ως χρωμομετρικό αντιδραστήριο, και τη μέτρηση του προϊόντος,

το οποίο έχει χαρακτηριστικό χρώμα, στα 510 nm. Η δεύτερη μέθοδος βασίζεται

στη χρήση του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu, και τη μέτρηση χρωμομετρικά,

στα 640 nm. Ο νόμος του Beer, εφαρμόζεται για τα εύρη συγκεντρώσεων από

0,5 έως 4 και από 5 έως 20 μg/mL, αντίστοιχα [12].

Η αντίδραση μεταξύ της νιμοδιπίνης και της 4-διμεθυλοαμινο-βενζαλδεϋ-

δης (με χρήση καταλύτη Zn-HCl), έχει ως συνέπεια την παραγωγή ενός προϊό-

ντος, από την αναγωγή του οποίου προκύπτει μία βάση (Schiff). Μέσω του συγ-

κεκριμένου προϊόντος, μπορεί να προσδιοριστεί φασματοφωτομετρικά, η νιμοδι-

πίνη σε ταμπλέτες [13].

Το προϊόν, το οποίο έχει χαρακτηριστικό χρώμα, παρουσιάζει μέγιστη α-

πορρόφηση στα 580 nm, και παραμένει σταθερό για 30 min. Το ποσοστό ανά-

κτησης είναι 99% [13].

6.2. Ηλεκτροχημικές μέθοδοι

Η ανοδική ηλεκτροχημική συμπεριφορά των 1,4-διϋδροπυριδινών (συμπε-

ριλαμβάνοντας και τη νιμοδιπίνη), μελετήθηκε χρησιμοποιώντας μίγμα ρυθμιστι-

κού διαλύματος οξικού-φωσφορικού (pH 8), το οποίο περιείχε και 70% αιθανόλη

(v/v) [14].

Παρατηρήθηκε μία ανοδική κορυφή, εξαιτίας της οξείδωσης δύο

ηλεκτρονίων από το δακτύλιο της διϋδροπυριδίνης. Οι ανακτήσεις μετρήθηκαν σε

εύρος από 91,7 έως 104 %, με τη σχετική τυπική απόκλιση να είναι μικρότερη

από 3 % [14].

Επίσης, εφαρμόστηκε μία πολαρογραφική μέθοδος, σαρώνοντας καθο-

δικά το δυναμικό, για τον προσδιορισμό της νιμοδιπίνης σε ταμπλέτες. Η καμπύ-

λη αναφοράς, ήταν γραμμική για εύρος συγκέντρωσης από 1 μΜ έως 1 mΜ, χρη-

σιμοποιώντας μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος οξικού-φωσφορικού (pH 5), το

οποίο περιείχε και 20% αιθανόλη (v/v), ενώ η σχετική τυπική απόκλιση επί της

εκατό βρέθηκε ίση με 0,2% [15].

6.3. Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας

Ο προσδιορισμός της νιμοδιπίνης σε ταμπλέτες, έγινε με εφαρμογή της

χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (HPTLC), έπειτα από

εκχύλιση με μεθανόλη. Οι χρωματογραφικές πλάκες αναπτύχθηκαν με χρήση

μίγματος διαλυτών τολουενίου και οξικού αιθυλεστέρα (1 ,(1׃ και ο ποσοτικός

προσδιορισμός έγινε στα 240 nm. Οι καμπύλες αναφοράς ήταν γραμμικές για

εύρος συγκέντρωσης από 25 ng έως 200 ng. Το όριο ανίχνευσης μετρήθηκε στα

25 ng, ενώ το ποσοστό ανάκτησης και η σχετική τυπική απόκλιση ήταν 96,03%

και 0,56%, αντίστοιχα [16].

6.4. Αέρια χρωματογραφία

Ο προσδιορισμός της νιμοδιπίνης σε ταμπλέτες, εφαρμόζοντας αέρια

χρωματογραφία, έγινε έπειτα από εκχύλιση με χλωροφόρμιο, χρησιμοποιώντας

τη νιφεδιπίνη, ως εσωτερικό πρότυπο [17].

Το φέρον αέριο ήταν το άζωτο, ενώ ο ανιχνευτής ήταν μια πηγή ιονισμού

φλόγας. Η καμπύλη αναφοράς ήταν γραμμική για εύρος συγκέντρωσης από 0,5

έως 2 ng/mL [17].

6.5. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης

H νιμοδιπίνη προσδιορίστηκε ταυτόχρονα με πέντε φάρμακα, με την

εφαρμογή της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδoσης (HPLC), σε πρόγραμ-

μα αντιμετώπισης της υπέρτασης. Οι ταμπλέτες εκχυλίστηκαν με μεθανόλη, ενώ

η φελοδιπίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Η κινητή φάση ήταν

μίγμα ρυθμιστικού φωσφορικού διαλύματος (pH 4,5) /ακετονιτριλίου (1/1). Το

μήκος κύματος του ανιχνευτή ρυθμίστηκε στα 250 nm, ενώ η καμπύλη αναφοράς

ήταν γραμμική για εύρος συγκέντρωσης από 25 έως 3200 ng/mL [18].

Επίσης, μελετήθηκαν οι καμπύλες εξάρτησης συγκέντρωσης-χρόνου της

νιμοδιπίνης, ύστερα από ενδοφλέβια, αλλά και στοματική χορήγηση των εναντιο-

μερών του φαρμάκου, με τη χρήση της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης.

Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα φωσφορικού διαλύματος (pH

5), σε συγκέντρωση 1 mM, και μεθανόλης σε αναλογία όγκων (7/13) [19].

Η καμπύλη αναφοράς ήταν γραμμική για εύρος από 5-200 ng/mL. Τα

δεδομένα εκτιμήθηκαν από την αναλογία των αποκρίσεων των κορυφών των δύο

εναντιομερών [19].

H νιμοδιπίνη, η ταρσίνη και άλλοι τρεις μεταβολίτες προσδιορίστηκαν με

την εφαρμογή της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης, σε πλάσμα ασθενών

που επάσχαν από τη νόσο του Αlzheimer [20]. Τα δείγματα, εκχυλίστηκαν και

εξατμίστηκαν κάτω από συνθήκες ξηρού αζώτου. Έπειτα, αναλύθηκαν με στήλη

Hypersil phenyl (5-μm) και μετρήθηκαν με ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού [20].

Το μήκος κύματος του ανιχνευτή μετρήθηκε στα 239 nm. Οι καμπύλες

αναφοράς ήταν γραμμικές για εύρος συγκέντρωσης από 2 έως 500 ng/mL για τη

νιμοδιπίνη και για άλλους δύο μεταβολίτες [20].

Κεφ.7 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

Κύριος στόχος της εργασίας ήταν η επικύρωση μιας απλής, γρήγορης,

πρωτότυπης και σχετικά οικονομικής μεθόδου, για τον ταυτόχρονο

προσδιορισμό της δραστικής ουσίας της νιμοδιπίνης και των προσμίξεών της, με

την εφαρμογή της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης.

Η μέθοδος ανάλυσης εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για τον προσδιορισμό

της νιμοδιπίνης και των προσμίξεών της σε μορφή δισκίων. Ο σκοπός ήταν να

επικυρωθεί η μέθοδος με τον έλεγχο της γραμμικότητας, της ευαισθησίας, της

ακρίβειας, της επαναληψιμότητας, της ενδιάμεσης επαναληπτικότητας, καθώς και

της ανθεκτικότητας.

Στη συνέχεια, εφαρμόζεται μέθοδος ανάλυσης της νιμοδιπίνης και των

προσμίξεών της σε φαρμακευτικά σκευάσματα, με σκοπό να διαπιστωθεί αν οι

συγκεκριμένες ενώσεις περιέχονται μέσα στα σκευάσματα και σε ποια συγκέ-

ντρωση.

Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Κεφ.8 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ – ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ

Σημαντική παράμετρος στην ακρίβεια ανάλυσης του φαρμάκου είναι η

σωστή συντήρηση των διαλυμάτων. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η

προφύλαξη της ουσίας από την επίδραση του φωτός, για να αποφευχθεί ο

κίνδυνος οξείδωσής της. Επίσης, για την αποφυγή σφαλμάτων, η παρασκευή

των διαλυμάτων γίνεται πριν την ανάλυση, ώστε να μην υπάρχει καμία αλλοίωση

στη δομή των ενώσεων. Η νιμοδιπίνη είναι φωτοευαίσθητη ουσία. Έγινε μελέτη

φωτοευαισθησίας, στις συνθήκες πειράματος του εργαστηρίου και βρέθηκε ότι η

ουσία ήταν σταθερή σε διάλυμα MeOH, για 20 ημέρες. Τέλος, απαραίτητη

κρίνεται η διήθηση και η απαέρωση των διαλυμάτων της κινητής φάσης (γίνεται

με εφαρμογή λουτρού υπερήχων), ώστε να μην εισάγονται στο σύστημα της

HPLC φυσαλίδες.

Kατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιήθηκαν τα

ακόλουθα όργανα:

1. Διάταξη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (Shimadzu

Prominence (SP), Kyoto, Japan):

Απαερωτής SP (Model DGU-20A5)

Αντλία SP (Model LC-20AD)

Αυτόματος δειγματολήπτης SP (Model SIL-20AC)

Φούρνος της στήλης SP (Model CTO-20AC)

Ανιχνευτής UV-Vis (SP), μεταβλητού μήκους κύματος, (Model SPD-

20A)

2. Η χρωματογραφική ανάλυση έγινε με αναλυτική στήλη Interchrom C8 [(5

μm, 250 x 4,6 mm I.D.) Interchim, Frankfurt, Germany].

3. Οι μετρήσεις και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγιναν σε Shimadzu

LC-solution computer software program version 1,21 SP1.

Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία:

Λουτρό υπερήχων (ultra sonic) της εταιρείας ELMA,

Αναλυτικός ζυγός, ακρίβειας 4 δεκαδικών ψηφίων, της εταιρείας

KERN.

Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής:

Μεθανόλη (MeOH), της εταιρείας Merck, καθαρότητας HPLC.

Δις-αποσταγμένο νερό (H2O).

Ακετονιτρίλιο (ACN), της εταιρείας Merck, καθαρότητας HPLC.

Η δραστική ουσία (νιμοδιπίνη) και τα προϊόντα διάσπασής της, της

εταιρείας UQUIFA (Barcelona, Spain), ευγενική χορηγία από την

Pharmathen S.A.

Σκευάσματα (Δισκία) Νortolan της εταιρείας Anfarm (Athens,

Greece), Νimodil της εταιρείας Remedina (Athens, Greece), Βefimat

της εταιρείας Biomedica (Oxford, Great Britain), Νimotop της

εταιρείας Bayer (Leverkuzen, Germany) και Νimovac V της εταιρείας

Pharmathen (Athens, Greece), περιεκτικότητας 30 mg, τα οποία

αγοράστηκαν από το εμπόριο.

Κεφ.9 ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

Αρχικά έγινε μελέτη και βελτιστοποίηση των παραμέτρων που επηρεάζουν

τις συνθήκες διαχωρισμού: α) θερμοκρασία στήλης, β) είδος και συγκέντρωση

κινητής φάσης, γ) ρυθμός ροής και δ) pH.

Οι βέλτιστες συνθήκες που επιλέχθηκαν ήταν C8 ως στήλη για το σύστημα,

ενώ ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε ACN και H2O σε αναλογία όγκων 67,5/

32,5 (v/v). Η ταχύτητα ροής ρυθμίστηκε στα 0,9 mL/min, ενώ το μήκος κύματος

του ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού ήταν στα 236 nm. Η θερμοκρασία της στήλης

ήταν στους 40°C, ενώ το pH δεν ήταν σημαντικός παράγοντας κατά τη

διαδικασία επιλογής των βέλτιστων συνθηκών.

Eνα τυπικό χρωματογράφημα του μίγματος της φαρμακευτικής ένωσης της

νιμοδιπίνης και των προσμίξεών της, με τις παραπάνω βέλτιστες συνθήκες του

πειράματος, δίνεται στο σχήμα 9.1.

Σχήμα 9.1: Χρωματογράφημα του μίγματος της νιμοδιπίνης και των προσμίξεων

της (25 μg/mL).

Πίνακας 9.1: Τιμές διαχωριστικής ικανότητας (RS), αριθμού θεωρητικών πλακών

, παράγοντα ασυμμετρίας, συντελεστή συγκράτησης, χρόνου συγ-

κράτησης, για το πρότυπο χρωματογράφημα.

Ενώσεις

Χρόνος

συγ-

κράτησης

Διαχωρι

στική

ικανότη-

τα, Rs

Αριθμός

θεωρητικώ

ν πλακών,

Nτ

Παράγοντα

ς ουράς,

Tf

Παράγοντας

ασυμμετρίας,

Αs

Συντελεστής

συγκράτηση

ς, k’

Πρόσμιξη

C 5,088 -------- 10463 1,3 1,3 2,0

Νιμοδιπίν

η 6,552 6,8 13050 1,3 1,2 2,9

Πρόσμιξη

A

7,098 2,3 14224 1,3 1,2 3,2

Πρόσμιξη

B

9,202 8,0 16035 1,3 1,2 4,5

Ο παράγοντας ασυμμετρίας, η διαχωριστική ικανότητα, ο αριθμός θεωρη-

τικών πλακών και ο συντελεστής συγκράτησης υπολογίζονται με βάση τις εξι-

σώσεις που δίνονται παραπάνω, ενώ ο παράγοντας ουράς υπολογίζεται από την

εξίσωση 9.1, χαράσσοντας το ύψος της κορυφής με μία κάθετο που ενώνει την

κορυφή με τη βασική γραμμή. Κατόπιν, στο 5% του ύψους της υπολογίζεται το

πλάτος της κορυφής από την εξίσωση 9.1 [5]:

Α+Β

Τf = (9.1)

2 A

ΚΕΦ.10 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ

Στάδια Επικύρωσης

Έγιναν τα εξής στάδια επικύρωσης:

1. Γραμμικότητα και ευαισθησία.

2. Επαναληψιμότητα και ακρίβεια ημέρας.

3. Ενδιάμεση επαναληπτικότητα και ακρίβεια 6 ημερών.

4. Ανθεκτικότητα (Robustness) μεθόδου.

10.1 Γραμμικότητα και ευαισθησία

Αρχικά, ζυγίστηκαν 40 mg νιμοδιπίνης, με αναλυτικό ζυγό, ακρίβειας 4

δεκαδικών ψηφίων, τα οποία διαλύθηκαν σε 100 mL μεθανόλης, με αποτέλεσμα

να προκύψει μητρικό διάλυμα της ένωσης, συγκέντρωσης 400 μg/mL. Στη

συνέχεια, παρελήφθησαν από το μητρικό διάλυμα προκαθορισμένοι όγκοι

διαλυμάτων. Τα διαλύματα αραιώθηκαν σε φιάλες των 20 mL, με

προκαθορισμένους όγκους μεθανόλης, ώστε να προκύψουν διαλύματα, που θα

περιέχουν τη νιμοδιπίνη σε συγκεντρώσεις, των οποίων το εύρος θα κυμαίνεται

μεταξύ του 25% έως 125%, της συγκέντρωσης του φαρμάκου που περιέχεται στο

δισκίο (30 mg) [3].

Παράλληλα, παρασκευάζονται διαλύματα τα οποία περιέχουν τις προσμί-

ξεις. Η μέγιστη ποσότητα των προσμίξεων (impurities), που θα περιέχεται στα

διαλύματα, θα πρέπει να αντιστοιχεί στο 1% της αρχικής ποσότητας του φαρμά-

κου, (δηλαδή 0,3 μg/mL) [21].

Έπειτα, τα διαλύματα αραιώνονται με προκαθορισμένους όγκους νερού,

σε φιάλες των 20 mL. Όλα τα διαλύματα μεταφέρονται σε λουτρό υπερήχων,

ώστε να αναδευτούν και να γίνει καλή ανάμιξη των συστατικών τους.

Τελικά, τα δείγματα, μετά από διήθηση, μεταφέρονται στην HPLC, όπου

γίνονται τρεις μετρήσεις για το κάθε δείγμα. Έτσι, λαμβάνονται τα εμβαδά των

κορυφών για τη νιμοδιπίνη, καθώς και για τις προσμίξεις, στις τρεις μετρήσεις,

αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για τη νιμοδιπίνη δίνονται στον

πίνακα 10.1:

Πίνακας 10.1: Τιμές εμβαδών κορυφής, για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της νι-

μοδιπίνης.

Συγκεντρώσεις (μg/mL) Εμβαδόν κορυφής για νιμοδιπίνη

(μέσος όρος 3 μετρήσεων)

7,5 289959±1517

15,0 603826±1429

22,5 871808±3624

30,0 1185024±3978

37,5 1478829±3728

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα κατασκευάζεται η καμπύλη αναφο-

ράς για τα δείγματα της νιμοδιπίνης, η οποία δίνεται στο σχήμα 10.1.

R2 = 0,9995

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 10 20 30 40

C(μg/ml)

ΕΜ

ΒΑ

ΔΟ

Ν

. Σχήμα 10.1: Καμπύλη αναφοράς για δείγματα της νιμοδιπίνης, σε μετρήσεις

που έγιναν σε μία ημέρα.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για την πρόσμιξη A δίνονται στον πίνακα 10.2:

Πίνακας 10.2: Τιμές εμβαδών κορυφής, για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της

πρόσμιξης Α.

Συγκεντρώσεις (ng/mL) Εμβαδόν κορυφής για την πρόσμιξη

Α (μέσος όρος 3 μετρήσεων)

18,75 199±6

37,5 320±19

75,0 710±28

150,0 1315±58

300,0 2728±208

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα κατασκευάζεται η καμπύλη αναφο-

ράς για τα δείγματα της πρόσμιξης Α, η οποία δίνεται στο σχήμα 10.2.

R2 = 0,999

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 100 200 300 400C(ng/ml)

ΕΜ

ΒΑ

ΔΟ

Ν

Σχήμα 10.2: Καμπύλη αναφοράς για δείγματα της πρόσμιξης A, σε μετρήσεις

που έγιναν σε μία ημέρα.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για την πρόσμιξη B δίνονται στον πίνα-

κα 10.3:

Πίνακας 10.3: Τιμές εμβαδών κορυφής, για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της

πρόσμιξης Β.

Συγκεντρώσεις (ng/mL) Εμβαδόν κορυφής για την πρόσμιξη Β

(μέσος όρος 3 μετρήσεων)

18,75 1596±12

37,5 3166±76

75,0 6291±65

150,0 12038±119

300,0 22770±61

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα κατασκευάζεται η καμπύλη αναφο-

ράς για τα δείγματα της πρόσμιξης Β, η οποία δίνεται στο σχήμα 10.3.

R2 = 0,9993

0

7000

14000

21000

28000

0 100 200 300 400C(ng/ml)

EM

BA

ΔΟ

Ν

Σχήμα 10.3: Καμπύλη αναφοράς για δείγματα της πρόσμιξης B, σε μετρήσεις

που έγιναν σε μία ημέρα.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν για την πρόσμιξη C δίνονται στον πίνα-

κα 10.4:

Πίνακας 10.4: Τιμές εμβαδών κορυφής, για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της

πρόσμιξης C.

Συγκεντρώσεις (ng/mL) Εμβαδόν κορυφής για την πρόσμιξη

C (μέσος όρος 3 μετρήσεων)

18,75 1326±64

37,5 2122±33

75,0 3885±72

150,0 6656±127

300,0 13276±82

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα κατασκευάζεται η καμπύλη αναφο-

ράς για τα δείγματα της πρόσμιξης C, η οποία δίνεται στο σχήμα 10.4.

R2 = 0,9993

02000

400060008000

10000

1200014000

0 100 200 300 400C(ng/ml)

EM

BA

ΔΟ

Ν

Σχήμα 10.4: Καμπύλη αναφοράς για δείγματα της πρόσμιξης C, σε μετρήσεις

που έγιναν σε μία ημέρα.

Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα της γραμμικότητας και της ευαισθησίας

δίνονται στον πίνακα 10.5:

Πίνακας 10.5: Αποτελέσματα της γραμμικότητας και της ευαισθησίας για τη νι-

μοδιπίνη και τις προσμίξεις της.

Κλίση

(ng/mL)ˉ¹

Τεταγμένη επί

την αρχή

 

Συντελεστής

προσδιορισμ

ού

 

Όριο

ανίχνευσης

(ng/mL)

Όριο

ποσοτικής

αποτίμησης

(ng/mL)

Εύρος

γραμμικής

περιοχής

(ng/mL)

Ένωση y=0 R2 LOD LOQ Εύρος

Νιμοδιπίνη 3,9×104 ±52,52* -2674,2±1,1×103 0,9995 0,09** 0,28** 7,5-37,5**

Πρόσμιξη C 42,1±0,23 -24,08±0,28 0,9993 3,8 12 18,75 – 300

Πρόσμιξη A 9,01±0,05 6,66±0,183 0,9990 5,5 17 18,75 – 300)

Πρόσμιξη B 75,95±1,69 -140,5±0,019 0,9993 4,8 15 18,75 – 300

* (μg/mL)-1

** (μg/mL)

Οι υπολογισμοί για το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικού

προσδιορισμού (LOQ) έγιναν σύμφωνα με τις παρακάτω εξισώσεις [22]:

Y= α+b·X (10.1)

όπου: Υ το εμβαδόν της κορυφής και Χ η συγκέντρωση της ένωσης.

Ο συντελεστής b υπολογίστηκε σύμφωνα με την εξίσωση 10.2:

Σ(Χi-ΧΜ) (Υi-ΥΜ)

b= (10.2)

Σ(Χi-ΧΜ)2

όπου: ΧΜ,ΥΜ οι μέσες τιμές των συγκεντρώσεων και των εμβαδών αντί- στοιχα

και Σ(Χi-ΧΜ)(Υi-ΥΜ) το άθροισμα των διαφορών των τιμών που μετρήθη- καν από

τις μέσες τιμές.

Eτσι, αν συνδυάσουμε τις εξισώσεις 10.1 και 10.2, μπορεί να υπολογιστεί

ο συντελεστής α, σύμφωνα με την εξίσωση 10.3 :

α= Y-b·X (10.3)

Στη συνέχεια, υπολογίζονται οι τιμές Ŷi, από την εξίσωση 10.3, θεωρώντας

ότι Χ=0. Έτσι, υπολογίζεται ο συντελεστής SR, με βάση την εξίσωση 10.4:

Σ(Υi-Ŷi)2

SR= ( ) ½ (10.4)

n-2

όπου: n ο αριθμός των μετρήσεων συνολικά.

Έπειτα, υπολογίζεται ο συντελεστής Sb, από την εξίσωση 10.5:

SR

Sb= (10.5)

[Σ(Χi-ΧΜ)2] ½

Επίσης, ισχύει η εξίσωση 10.6 [22]:

ΥLOD=YO+3×SR (10.6)

Από την εξίσωση (10.1), προκύπτει ότι αν X=0, τότε Y=YO=α. Έτσι, μπορεί

να υπολογιστεί το ΥLOD με βάση την εξίσωση 10.7:

ΥLOD=α+3×SR (10.7)

Το όριο ανίχνευσης υπολογίζεται με βάση την εξίσωση 10.1, θεωρώντας

ότι Y= ΥLOD. Έπειτα, υπολογίζεται το όριο ποσοτικού προσδιορισμού με βάση την

εξίσωση 10.8:

10× LOD

LOQ= (10.8)

3,3

10.2. Επαναληψιμότητα και ακρίβεια ημέρας

Στο δεύτερο στάδιο της επικύρωσης, έγιναν αναλύσεις στα δείγματα, με

σκοπό να υπολογιστεί η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα των μετρήσεων. Η με-

θοδολογία που εφαρμόστηκε ήταν η επιλογή τριών από τις πέντε συγκεντρώσεις,

οι οποίες μετρήθηκαν κατά το στάδιο επικύρωσης της γραμμικότητας, για τη νιμο-

διπίνη και για τις προσμίξεις, αντίστοιχα [23]. Οι αναλύσεις έγιναν σε μία ημέρα

και όλα τα δείγματα μετρήθηκαν από τρεις φορές.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δίνονται στον πίνακα 10.6׃

Πίνακας 10.6: Τιμές τυπικής απόκλισης, επαναληψιμότητας (%) και σφάλματος

μέτρησης (%) για τη νιμοδιπίνη και για τις προσμίξεις της, για 3

επαναλαμβανόμενες μετρήσεις, σε μία ημέρα.

Ένωση

Συγκέντρω

ση (ng/mL)

Μετρηθείσα

(ng/mL) ±

(SD)

Επαναλη-

ψιμότητα

[RSD(%)]

Σφάλμα

μέτρησης

(%)

Χρόνος

συγκράτησης

(min) ± (SD)

Επαναλη-

ψιμότητα

[RSD(%)]

Νιμοδιπίν

η

7,5* 7,5 *± 0,01 0,13 0,1 7,098 ± 0,0006 0,01

22,5* 22,2 *± 0,06 0,27 -1,4 7,095 ± 0,0006 0,01

30* 30,1* ± 0,04 0,13 0,3 7,095 ± 0,0015 0,02

Πρόσμιξη

C

18,75 19,1 ± 0,15 0,79 1,8 5,378 ± 0,0012 0,02

75 76,2 ± 1,01 1,33 1,6 5,373 ± 0,0006 0,01

300 300,8 ± 0,46 0,15 0,3 5,374 ± 0,0010 0,02

Πρόσμιξη

A

18,75 19,0 ± 0,36 1,89 1,3 7,637 ± 0,0064 0,08

75 73,6 ± 1,34 1,83 -1,9 7,637 ± 0,0064 0,08

300 305,2 ± 0,31 0,10 1,7 7,684 ± 0,0010 0,01

Πρόσμιξη

B

18,75 18,4 ± 0,17 0,92 - 1,6 10,280± 0,0040 0,04

75 76,5 ± 0,95 1,24 1,6 10,271± 0,0006 0,01

300 299,8 ± 0,64 0,21 -0,1 10,272± 0,0015 0,01

*(μg/mL)

10.3. Ενδιάμεση επαναληπτικότητα και ακρίβεια σε έξι ημέρες

Στο τρίτο στάδιο της επικύρωσης, έγιναν αναλύσεις στα δείγματα, με σκο-

πό να υπολογιστεί η ακρίβεια και η ενδιάμεση επαναληπτικότητα των μετρήσεων,

σε έξι μέρες.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δίνονται δίνονται στον πίνακα 10.7׃

Πίνακας 10.7: Τιμές τυπικής απόκλισης, ενδιάμεσης επαναληπτικότητας (%), και

σφάλματος μέτρησης (%) για τη νιμοδιπίνη και για τις προσμίξεις

της, για 3 επαναλαμβανόμενες μετρήσεις, σε έξι ημέρες.

Ένωση Συγκέ- Ενδιάμεση Σφάλμα

ντρωση

(ng/mL)

Μετρηθείσα

(ng/mL) ±

(SD)

Επαναλη-

πτικότητα

[RSD(%)]

μέτρησης

(%)

Χρόνος

συγκράτησης

(min) ± (SD)

Ενδιάμεση

Επαναλη-

πτικότητα

[RSD(%)]

Νιμοδιπίνη

7,5* 7,6*± 0,14 1,87 1,7 7,097 ± 0,0017 0,02

22,5* 22,4*± 0,21 0,95 -0,4 7,096 ± 0,0016 0,02

30* 30,4*± 0,56 1,86 1,5 7,095 ± 0,0011 0,02

Πρόσμιξη C

18,75 19,2± 0,38 1,99 2,3 5,364 ± 0,0136 0,25

75 76,5±1,42 1,86 2,0 5,371 ± 0,0045 0,08

300 294,7±1,03 0,34 -1,7 5,373 ± 0,0018 0,03

Πρόσμιξη A

18,75 19,0± 0,37 1,95 1,3 7,644 ± 0,0018 0,23

75 73,3±1,34 1,83 -2,3 7,662 ± 0,0018 0,23

300 306,3± 2,84 0,92 2,1 7,680 ± 0,0043 0,06

Πρόσμιξη B

18,75 18,5± 0,36 1,95 -1,0 10,277± 0,0298 0,29

75 76,5±1,44 1,88 2,0 10,276± 0,0116 0,11

300 300,3± 0,66 0,22 0,1 10,275 ± 0,0045 0,04

*(μg/mL)

10.4 Ανθεκτικότητα (Robustness) της μεθόδου

Έγινε μελέτη ανθεκτικότητας της μεθόδου για 4 παράγοντες: 1) συγκέ-

ντρωση κινητής φάσης ±5%, 2) θερμοκρασία στήλης ±5οC, 3) ρυθμός ροής της

κινητής φάσης ±0,2 mL/min και 4) στο μήκος κύματος μέτρησης ±2 nm.

Οι τέσσερις παράγοντες εισήχθησαν σε έναν κλασματικό παραγοντικό

σχεδιασμό (fractional factorial design) δύο επιπέδων (+1, -1). Το εμβαδόν των

χρωματογραφικών κορυφών επιλέχθηκε ως απόκριση.

Τα αποτελέσματα των πειραμάτων εφαρμόστηκαν σε διαγράμματα ημι-

κανονικής πιθανότητας (half-normal probability plots) και ελέγχθηκε η

σημαντικότητα των εξεταζόμενων παραγόντων (σε 95% επίπεδο

σημαντικότητας). Από τους εξεταζόμενους παράγοντες η συγκέντρωση της

κινητής φάσης, η θερμοκρασία της στήλης και το μήκος κύματος δεν είχαν

σημαντική επίδραση στην ποιότητα του χρωματογραφήματος, οπότε μπορεί να

θεωρηθεί ότι η μέθοδος είναι ανθεκτική ως προς αυτούς τους παράγοντες.

Αντίθετα, οι διακυμάνσεις στο ρυθμό της ροής της κινητής φάσης είχαν σημαντική

επίδραση στην ποιότητα της μεθόδου.

Για το λόγο αυτό η επίδραση των μεταβολών του συγκεκριμένου

παράγοντα στο διαχωρισμό, μελετήθηκε περαιτέρω. Κρατώντας τους

υπόλοιπους παράγοντες σταθερούς, μελετήθηκε η εξέταση της επίδρασης του

παράγοντα σε ένα στενότερο όριο μεταβολής. Η διαχωριστική ικανότητα, το

εμβαδόν των χρωματογραφικών κορυφών και ο παράγοντας ασυμμετρίας του

διαχωρισμού εξεταστήκαν και διαπιστώθηκαν μεταβολές μικρότερες από 4% σε

όλες τις παραμέτρους. Μπορεί συνεπώς να διαπιστωθεί ότι οι μεταβολές του

ρυθμού ροής (στο επιλεγμένο στενό εύρος εξέτασης), δεν επηρεάζουν σημαντικά

την ποιότητα του διαχωρισμού.

Επομένως, η μέθοδος μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ανθεκτική ως προς

τους εξεταζόμενους παράγοντες.

Κεφ.11 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΝΙΜΟΔΙΠΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΡΟΣΜΙΞΕΩΝ

ΤΗΣ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ

Ο έλεγχος ομοιομορφίας περιεχομένου δραστικής ουσίας σε σκευάσματα

μίας δόσης βασίζεται στον ξεχωριστό προσδιορισμό του δραστικού συστατικού

σε έναν αριθμό επιμέρους μονάδων μίας δόσης, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο

οι μεμονωμένες περιεκτικότητες βρίσκονται μέσα στα όρια, που έχουν καθοριστεί

με αναφορά στη μέση περιεκτικότητα του δείγματος [6].

Ο παραπάνω έλεγχος δεν απαιτείται σε πολυβιταμινούχα σκευάσματα, και

σε σκευάσματα ιχνοστοιχείων, καθώς και σε άλλες περιπτώσεις, όπου υπάρχει

αιτιολόγηση και έγκριση.

Μέθοδος. Χρησιμοποιώντας κατάλληλη αναλυτική μέθοδο, προσδιορίζεται η

επί μέρους περιεκτικότητα σε δραστικό συστατικό σε δέκα μονάδες, που έχουν

επιλεγεί τυχαία.

Εφαρμόζονται τα κριτήρια εκτίμησης του ελέγχου [6].

Eλεγχος για δισκία:

Το σκεύασμα συμφωνεί με τον έλεγχο, αν κάθε επιμέρους περιεκτικότητα

βρίσκεται μεταξύ του 85% και του 115% της μέσης περιεκτικότητας. Το σκεύασμα

δε συμφωνεί με τον έλεγχο, αν περισσότερες από μία επιμέρους περιεκτικότητες

βρίσκονται έξω από τα παραπάνω όρια ή μία επιμέρους περιεκτικότητα βρίσκεται

έξω από τα όρια μεταξύ του 75% έως 125% της μέσης περιεκτικότητας.

Αν το πολύ μία επιμέρους περιεκτικότητα βρίσκεται έξω από τα όρια του

85% έως 115%, αλλά μέσα στα όρια του 75% έως 125%, τότε προσδιορίζονται οι

επιμέρους περιεκτικότητες σε άλλες είκοσι, τυχαία λαμβανόμενες μονάδες. Το

σκεύασμα συμφωνεί με τον έλεγχο, αν το πολύ μία από τις τριάντα επιμέρους

πε- ριεκτικότητες, βρίσκεται έξω από τα όρια του 85% έως 115% της μέσης

περιεκτι- κότητας, και καμμία έξω από τα όρια του 75% έως 125% της μέσης

περιεκτικό- τητας [6].

Έγινε έλεγχος των σκευασμάτων νιμοδιπίνης, περιεκτικότητας 30 mg, και

των ενδεχόμενων προσμίξεων σε πέντε φαρμακευτικα σκευασμάτα: Νortolan,

Νimodil, Βefimat, Νimotop, Νimovac V.

Από τα σκευάσματα, ελήφθησαν 3 δισκία, τα οποία λειοτριβήθηκαν και

διαλύθηκαν σε μεθανόλη. Έπειτα, έγινε εκχύλιση της δραστικής ουσίας

νιμοδιπίνης, με μεθανόλη, σε λουτρό υπερήχων (ultra sonic), και

παρασκευάστηκαν τα διαλύματα σε συγκεντρώσεις των 30 μg/mL. Έγινε ο

πλήρης καθαρισμός των δειγμάτων, μετά την δίοδο τους από φίλτρο, μεγέθους

0,45 μm, και τελικά αναλύθηκαν στην HPLC.

Όλες οι μετρήσεις έγιναν 3 φορές μέσα σε μία ημέρα (n = 3). Τα

αποτελέσματα που ελήφθησαν δίνονται στον πίνακα 11.1׃

Πίνακας 11.1: Τιμές τυπικής απόκλισης, επαναληψιμότητας (%), και απόκλισης

από την αναγραφόμενη τιμή μέτρησης (%), για την ένωση νιμοδι-

πίνη, για 3 επαναλαμβανόμενες μετρήσεις.

Φαρμακευ

τικό

Σκεύασμα

Ονομαστι

κή

Ποσότητα

(mg)

Ευρεθείσα

τιμή

για

νιμοδιπίνη

(mg)

Μέση τιμή

± (SD)

Απόκλιση

από την

αναγραφόμ

ενη τιμή (%)

Επαναλη

ψιμό τητα

[RSD(%)]

Nimovac-V

30 29,37

 

 

30 28,49 29,03±0,47 -3,2 1,62

30 29,22

Nimotop

30 30,73

30 29,94 1,71

30,53±0,52 1,8

30 30,93

Befimat

30 29,86

30 30,65

30,29±0,4 0,1

1,33

30 30,37

Nimodil

30 30,47

30 32,18

31,15±0,91 3,8

2,91

30 30,81

Nortolan

30 29,76

30 29,03 29,53±0,43 -1,6 1,46

30 29,79

Στα σκευάσματα δε βρέθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες των προσμίξεων

της νιμοδιπίνης.

Τα τυπικά χρωματογραφήματα των πρότυπων διαλυμάτων των πέντε φαρ-

μακευτικών σκευασμάτων, τα οποία περιέχουν την ένωση νιμοδιπίνη, δίνονται

στα σχήματα από 11.1 έως 11.5.

Σχήμα 11.1: Χρωματογράφημα της νιμοδιπίνης στο φαρμακευτικό σκεύασμα No-

rtolan (30 μg/mL).

Σχήμα 11.2: Χρωματογράφημα της νιμοδιπίνης στο φαρμακευτικό σκεύασμα Ni-

modil (30 μg/mL).

Σχήμα 11.3: Χρωματογράφημα της νιμοδιπίνης στο φαρμακευτικό σκεύασμα Be-

fimat (30 μg/mL).

Σχήμα 11.4: Χρωματογράφημα της νιμοδιπίνης στο φαρμακευτικό σκεύασμα Ni-

motop (30 μg/mL).

Σχήμα 11.5: Χρωματογράφημα της νιμοδιπίνης στο φαρμακευτικό σκεύασμα Ni-

movac-V (30 μg/mL).

Κεφ.12 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Η επικύρωση της μεθόδου προσδιορισμού της δραστικής ουσίας, νιμοδι-

πίνης, και των προσμίξεών της ήταν ο κύριος στόχος της παρούσας εργασίας. Η

μέθοδος προσδιορισμού των συγκεκριμένων φαρμακευτικών ουσιών κρίθηκε

απαραίτητο να επικυρωθεί ως προς τη γραμμικότητα, την ευαισθησία, την ακρί-

βεια, την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και την ανθεκτικό-

τητα.

Κατά το πειραματικό στάδιο, βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες διαχωρι-

σμού και παρατηρήθηκε πως το pH δεν αποτελεί σημαντικό παράγοντα. Όσον

αφορά στη γραμμικότητα της μεθόδου, οι συντελεστές προσδιορισμού ήταν

αρκετά αξιόπιστοι. Τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικού προσδιορισμού

(LOQ) των προσδιοριζόμενων ενώσεων, μετρήθηκαν, δείχνοντας ικανοποιητικά

αποτελέσματα.

Στη συνέχεια, η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς την επαναληψιμότητα και

την ακρίβεια ημέρας, καθώς και ως προς την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και

ακρίβεια έξι ημερών. Τα αποτελέσματα της επαναληψιμότητας και της ενδιάμε-

σης επαναληπτικότητας κρίθηκαν αρκετά ικανοποιητικά, εφόσον τηρούσαν τη

συνθήκη RSD≤(1-2)% [2]. Επίσης, τα αποτελέσματα της ακρίβειας που προέκυ-

ψαν από τις μετρήσεις, ήταν αξιόπιστα [2].

Κατά την επικύρωση της ανθεκτικότητας της μεθόδου, αποδείχθηκε πως η

μέθοδος είναι επικυρωμένη ως προς τους τρεις από τους τέσσερις παράγοντες,

με εξαίρεση το ρυθμό ροής της κινητής φάσης. Για το λόγο αυτό πρέπει να

γίνεται έλεγχος της διακύμανσης της τιμής της.

Η μέθοδος ανάλυσης της νιμοδιπίνης και των προσμίξεών της, σε φαρμα-

κευτικά σκευάσματα, έδειξε πως στα συγκεκριμένα σκευάσματα δε βρέθηκαν

ποσότητες των προσμίξεων. Οι τιμές επαναληψιμότητας της νιμοδιπίνης ήταν

μέσα στα επιτρεπτά όρια σ’ όλα τα σκευάσματα. Τα αποτελέσματα της ακρίβειας

βρέθηκαν ικανοποιητικά.

Κεφ.13 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Παπαδογιάννης, I.N., Σαμανίδου, Β.Φ., Ενόργανη Χημική Ανάλυση, 2η έκδοση,

Πήγασος, Θεσσαλονίκη, 2001, 263-317.

2. Χατζηιωάννου, Θ.Π., Κουππάρη, Μ.Α., Ενόργανη Ανάλυση, 5η έκδοση, Μαυ-

ρομάτη, Αθήνα, 2003, 479-491.

3. Παπαδογιάννης, Ι.Ν., Σύγχρονες Διαχωριστικές Τεχνικές στη Ενόργανη Χημική

Ανάλυση, 1η έκδοση, Πήγασος, Θεσσαλονίκη, 2004, 540-552.

4. Βουλγαρόπουλος, Α.Ν., Ζαχαριάδης, Γ.Α., Στράτης,Ι.Α., Εισαγωγή στην Ποσο-

τική Χημική Ανάλυση, 1η έκδοση, Ζήτη, Θεσσαλονίκη, 1999, 156-157.

5. Κουντουρέλλης, Ι.Ε., Μαθήματα Φαρμακευτικής Ανάλυσης II, 1η Έκδοση :

Υπηρεσία Δημοσιευμάτων ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη, 1997, 90-96.

6. Γεωργαράκης, Ε.Χ., Μέθοδοι Ελέγχου Φαρμάκων, 3η έκδοση, Πήγασος, Θεσ-

σαλονίκη, 1993, 101-104.

7. http://www.fda.gov/medwatch/SAFETY/2006/Jan_PI/Nimotop_PI.pdf

(τελευταία περιήγηση Νοέμβριος 2008).

8. Al-Omar, A., Prof. Drug Subst. Excip. Relat. Meth, 2004, 31, 355-369.

9. Ragno, G., Veronico, M., and Vetuschi, C., Intern. J. Pharm., 1995, 119, 115-

119.

10. Al-Omar, A., Prof. Drug Subst. Excip. Relat. Meth., 2004, 31, 337-354.

11. Scherling, D., J. Lab. Comp. Radiopharm., 1989, 27 (5), 599-603.

12.Reddy, M.N., Murthy, T.K., Rao-Kanna, K.V., Gopal Hara, A.V., and Sankar,

D.G., Ind. Drugs, 2001, 38 (3), 140-142.

13.Bharathi, S.N., Prakash, M.S., Nagarajan, M. and Kumar, K.A., Ind. Drugs,

1999, 36 (10), 661-662.

14.Alvarez-Lueje, A., Nunez-Vergana, L.J., and Squella, J.A., Electroanal., 1994

6, 259-264.

15.Squella, J.A., Strum, J.C., Leaue, R., and Nunez-Vergana, L.J., Anal. Lett.,

1992, 25, 281-292.

16.Shinde, V.M., Desai, B.S., and Tendolkar, N.M., Ind. Drugs, 1994, 31(3), 119-

121.

17.Sane, R.T., Gangrade, M.G., Bapat, V.V., Surve, S.R., and Chankar, N.L.,

Ind. Drugs, 1993, 30 (4), 147-151.

18.Patel, Y.P., Patil, S., Bhoir, I.C., and Sundaresan, M., J. Chrom. A,1998, 828,

283-286.

19.Wanner-Olsen, M., Gaarskaer, F.B., Mikkelsen, F.O., Jacobsen, P., and Vol-

dby, B., Chiral., 2000, 12, 660-664.

20.Aymard, G., Cayre-Castel, M., Feruandez, C., Lacomblez, L., and Diguet, B.,

Ther. Drug Monitor., 1998, 20, 422-429.

21.Xu, J.Q., Aubry, A. F., Chromatogr., 2003, 57, 67-71.

22.Miller, J.N., and Miller, J.C., Statistics and chemometrics for analytical

chemistry, 5th ed., Pearson Prentice Hall, Leicestershire, 2005, pp.111-124.

23.Mark Green, J., Anal. Chem., 1996, 68, 305A-309A.

Κεφ.14 ΠΕΡΙΛΗΨΗ

ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΗΣ ΟΥΣΙΑΣ, ΝΙΜΟΔΙΠΙΝΗΣ

ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΡΟΣΜΙΞΕΩΝ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑ-

ΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ

ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ

ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ

Στην παρούσα εργασία έγινε για πρώτη φορά η επικύρωση μιας νέας

μεθόδου για τον προσδιορισμό της νιμοδιπίνης, και των προσμίξεών της, σε δι-

σκία, με τη χρήση της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης.

Το πειραματικό στάδιο πραγματοποιήθηκε σ’ ένα οργανωμένο, άρτια

εξοπλισμένο εργαστήριο, της φαρμακευτικής βιομηχανίας Pharmathen, που

διέθετε όλα τα σύγχρονα όργανα, τα οποία απαιτούνται για την περάτωση των

διαδικασιών ελέγχου ποιότητας φαρμάκων.

Αρχικά, εφαρμόστηκε μέθοδος ανάλυσης, με σκοπό να επιτευχθεί η βελτι-

στοποίηση των παραμέτρων που επηρεάζουν τις συνθήκες διαχωρισμού. Έπει-

τα, επιλέχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες, κατά τις οποίες έγινε ο προσδιορισμός

των δειγμάτων των φαρμακευτικών ενώσεων.

Η επικύρωση της μεθόδου έγινε ως προς τη γραμμικότητα, την ευαισθη-

σία, την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και

την ανθεκτικότητα, δείχνοντας πολύ καλά αποτελέσματα.

Στο τελικό στάδιο, εφαρμόστηκε η μέθοδος ανάλυσης σε φαρμακευτικά

σκευάσματα, νιμοδιπίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος εφαρμόστηκε

επιτυχώς στα συγκεκριμένα σκευάσματα. Ως προς τον ποσοτικό προσδιορισμό

της νιμοδιπίνης στα πέντε σκευάσματα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι βρίσκονται

μέσα στα επιτρεπτά όρια (±5% της ονομαστικής ποσότητας). Σ’ όλα τα

σκευάσματα δε βρέθηκαν ποσότητες των προσμίξεων.

Κεφ.15 ABSTRACT

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THE ACTIVE PHARMACEUTICAL

INGREDIENTS NIMODIPINE AND IT’S IMPURITIES, BY HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY.

SURNAME

EXPERTISE

In the current study, a new high performance liquid chromatography

method for the separation of nimodipine and impurities, was validated for the first

time.

The experiments were conducted in an organized quality control

laboratory, with modern equipment, (Pharmathen S.A.).

Firstly, in this particular project the factors affecting the quality of the

separation were identified and optimized.

The validation of the method included the control of linearity, sensitivity,

accuracy, repeatability, intermediate precision and robustness. The results were

within the acceptable limits.

In the final stage, the analysis was applied to commercially available

nimodipine tablets. According to the obtained results, the recovery (%) of nimodi-

pine was in the acceptable limits (±5% of the nominal content). Quantities of

impurities were not found in the formulations.