Post on 29-Nov-2015
description
Optičke metode�UV-VIS spektrofotometrija
Atomska apsorpciona spektrofotometrija
�Plamena fotometrija
�Fluorescentne metode
�Turbidimetrija i nefelometrija
�Masena spektroskopija
Analitički signal: svetlost�Svetlost:
�ČESTICA (FOTON-roj fotona)
�ELEKTROMAGNETNI TALAS
�Talasna dužina (λ)
�Frekvencija (ν)
�Energija (E)
�E=hνννν= h c/λλλλ
�E – energija fotona, odnosno svetlosti,�h – Plankova konstanta h = 6,625×10-34 J s),�ν – frekvencija svetlosti,�c – brzina prostiranja svetlosti, c = 300 000 km/s(u
vakuumu)λ – talasna dužina svetlosti.
� Jedinica za energiju fotona - nije Joul, već eV� 1eV = 1,602 × 10-19 J
λν ch
hE ==
�Talasna dužina
�Amplituda
Spektar
Spektar
Podela spektara
Prema izgledu:�Linijski (atomi)�Trakasti (molekuli)�Kontinualni (usijana čvrsta tela)
Prema mehanizmu nastajanja:�Apsorpcioni (uzorak apsorbuje)�Emisioni (uzorak emituje)�Ramanski (uzorak rasejava)
TrakastiLinijski
Kontinuirani
Apsorpciona spektrofotometrija
UV-VIS spektrofotometrija
�UV znači: ultra (iznad, preko) + violet (ljubičasto)200-380 nm
�VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm
Apsorpcija zračenja dovodi do prelaza valentnih elektrona iz osnovnog u
pobuđeno stanje
�hν = Eviše-Eniže
�hromoforna grupa ili hromofora
Molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju
u UV delu spektra
Pobuđuju se valentni elektroni:
�sigma(σ)elektroni
�pi (π) elektroni
�slobodni elektronski parovi(n)
Pobuđivanje:Iz vezivne u antivezivne
Dozvoljenielektronski prelazi
σ→σ*n→σ*π→π*n→π*
Jedan elektronski prelaz-jedna apsorpciona traka A=f(λλλλ)
λ max-ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje
1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina
Koliko je λ max ?
Šta utiče na λmax?
1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju
različite hromofore (molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti)
Apsorpcioni spektar benzena (1)oko
255 nm i fenola (2)oko 270 nm
180 200 220 240 260 280 300
2
1
n-π∗
π−π∗
A
λ, nm
Više dvostrukih vezapomeranje ka većim talasnim dužinama-batohromno pomeranje
Proteini (belančevine) apsorbuju u UV oblasti spektra
Belance je belo!
Hromofore:�Peptidna veza (-CONH-)�Aromatične aminokiseline u bočnom
lancu�Prostetične grupe
UV spektri :a)proteina b) nukleinskih kiselina
Pored strukture, na položaj apsorpcione trake utiču:
�pHSlaba baza ili slaba
kiselina-u jonskom ili molekulskom obliku u zavisnosti od pH
Izobestična tačka
Provera:Kapnite par kapilimuna u čaj…
Rastvarač�Jod u etru je ljubičast
�Jod u vodi je žućkasto-braon
Šta znači reč HROMOFORA?
�Grčki:
�NOSILAC BOJE chroma + phoros
Boja jedinjenja
Selektivna apsorpcijau vidljivom delu spektra(400-800 nm)Komplementarne bojeKomplementarno-koje se dopunjuje,nadopunjujuće
Predmeti su one boje koju reflektuju
Rastvori su one boje koju propuštaju, a ne apsorbuju
Zašto je NaClbezbojan, a NiCl2 obojen?
11Na→1s2 2s2 2p6 3s1
Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i NeVelika E da se prevede u pobuđeno
stanje ⇒u UV oblasti
28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8
Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6
Mala E da se prevede u pobuđeno stanje⇒ u VIS oblasti
Koje je boje ovo jedinjenje?
600 620 640 660 680 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
λλλλ, nm
Šta nam govore UV-VIS spektri?
�Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?
Ali ne možemo biti 100% sigurni
Aktivnostenzima prekopojaveili
nestanka spektara njihovih supstrata.
NADH ima maxna 340 nm
NAD+ nema max na340 nm
Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima koji katalizuju
reakcije koje uključuju učešće redoks paraNAD+/NADH .
� Alkohol-dehidrogenazakatalizuje:
C2H5OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+
Raste apsorbancija na 340 nm
� Sorbitol-dehidrogenazakatalizuje:
D-Fruktoza +NADH→ D-Sorbitol +NAD+
�Smanjuje se apsorbancija na 340 nm
Kvantitativna analiza kolika je koncentracija?
LAMBERT-BEEROV ZAKON
Ikdb
dI =−
∫∫ =−bI
J
dbkI
dIp
00
bkI
I p =−0
ln
kbp eII −= 0
Eksponencijalni oblik Lambertovogzakona
kbp eII −= 0
Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.
U zakon se “ubacuje” i Beer sa koncentracijom…
cbaA =Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji
tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazii apsorptivnosti rastvorene supstance.
Beerov zakon:
Lambert-Beerov zakon
A- apsorbancijaIo- intenzitet upadne svetlosti
Ip- intenzitet propuštene svetlostia-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost
b-dužina optičkog putac-koncentracija
cbaI
IA
p
== 0log
Transparencija
� Izražava se u procentima:
�Veza između apsorbancije i transparencije:
0I
IT p=
100%0
⋅=I
IT p
TT
I
IA p 1
logloglog0
=−=−=
TT
A %log21001001
log −=⋅=
Važna veličina,jedino se može meriti
Ip
Veza između A i T
IZME ĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A
TA log−=
Kalibraciona krivaBeerov zakon:nagib=ab, odsečak =0
cbaA =
0,00,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
koncentracija
y= kx + njednačina prave
A
Metoda kalibracione krive (standardna, analitička kriva)
A=f(c)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0
0,2
0,4
Ax
cx
A
c,%
Serija standardnihrastvora (najmanje 6)
poznatih koncentracija.Sa krive se odredi
nepoznatakoncentracija
Ograničenja Lambert-Beerovog zakona
Jedan do dva reda veličine� U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4
mol/dm3 ili1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3
Dve grupe razloga:� Zbog rastvorka i rastvarača,
t°C slabo� Zbog aparata (pozadinsko
zračenje)
Isključivo za monohromatsku svetlost!
Izbor radne talasne dužine
Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?
Instrumentimere APSORBANCIJU i TRANSPARENCIJU
�Fotometri
�Spektrofotometri
IZVOR ZRA ČENJAMONOHROMATOR
DETEKTOR
Izvori zračenja-lampe
� VIS deo spektra: volframova lampa(360- 950 nm)
� UV deo spektra: deuterijumovai vodonična (190-420 nm)
cevi za pražnjenježivina lampa-linijske spektre
Monohromator
� Od polihromatske treba da izdvoji monohromatsku svetlost.
� Sastoji se od:
1. Ulaznog i izlaznog razreza
2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)
3. Disperzionog elementa: prizma ili difrakciona rešetka
Disperzioni element
PRIZMADIFRAKCIONA
REŠETKA
U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne
Kivete
�Staklene- za VIS oblast
�Kvarcne-za UV oblast
�Najčešće
prečnika 1 cm (dužina optičkog puta)
Kivete
Detektor: fotoćelija, fotomultiplikator i fotodiode
Intenzitet fotostruje srazmeran
intenzitetu svetlostii= k ×××× Ip
Sheme spektrofotometra
Sheme spektrofotometara
Fotometar
� Jednostavniji uređaji od spektrofotometara
� Samo u VIS oblasti spektra
� Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora- određuje se koncentracija
Kao monohromatori FILTERI
Kako izabrati filter prema boji ispitivanog rastvora?
�Boja filtera je komplementarna bojiispitivanog rastvora.
�To znači da filter treba maksimalno da propusti svetlost one boje koju rastvor maksimalno apsorbuje.
Ako merimo apsorbanciju žutom rastvoru, izabraćemo filter:
�Crveni
�Žuti
�Zeleni
�Narandžasti
�Plavi
�Ljubičasti
Šta je slepa proba?
�Rastvor = rastvorak + rastvarač
�Apsorbuje i rastvorak i rastvarač
�Eliminisati apsorbanciju (transparenciju) rastvarača tako što se kazaljka instrumenta dovede na 0 apsorbancije, odnosno 100% transparencije
�Na taj način merenjem se dobija samo apsorbancija (transparencija) rastvorka.
Praktične vežbe
�1. SpektrofotometrijaSnimiti apsorpcioni spektar A=f(λ), naći λmax, na toj
talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih rastvora (koji ste prethodno napravili), nacrtati kalibracionu krivu i sa nje odrediti nepoznatu koncentraciju i molarni apsorpcioni koeficijent.
2. FotometrijaIzmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog i
nepoznatog rastvora i izračunati koncentraciju koristeći metodu standarda.