Optičke metode�UV-VIS spektrofotometrija

Atomska apsorpciona spektrofotometrija

�Plamena fotometrija

�Fluorescentne metode

�Turbidimetrija i nefelometrija

�Masena spektroskopija

Analitički signal: svetlost�Svetlost:

�ČESTICA (FOTON-roj fotona)

�ELEKTROMAGNETNI TALAS

�Talasna dužina (λ)

�Frekvencija (ν)

�Energija (E)

�E=hνννν= h c/λλλλ

�E – energija fotona, odnosno svetlosti,�h – Plankova konstanta h = 6,625×10-34 J s),�ν – frekvencija svetlosti,�c – brzina prostiranja svetlosti, c = 300 000 km/s(u

vakuumu)λ – talasna dužina svetlosti.

� Jedinica za energiju fotona - nije Joul, već eV� 1eV = 1,602 × 10-19 J

λν ch

hE ==

�Talasna dužina

�Amplituda

Spektar

Spektar

Podela spektara

Prema izgledu:�Linijski (atomi)�Trakasti (molekuli)�Kontinualni (usijana čvrsta tela)

Prema mehanizmu nastajanja:�Apsorpcioni (uzorak apsorbuje)�Emisioni (uzorak emituje)�Ramanski (uzorak rasejava)

TrakastiLinijski

Kontinuirani

Apsorpciona spektrofotometrija

UV-VIS spektrofotometrija

�UV znači: ultra (iznad, preko) + violet (ljubičasto)200-380 nm

�VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm

Apsorpcija zračenja dovodi do prelaza valentnih elektrona iz osnovnog u

pobuđeno stanje

�hν = Eviše-Eniže

�hromoforna grupa ili hromofora

Molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju

u UV delu spektra

Pobuđuju se valentni elektroni:

�sigma(σ)elektroni

�pi (π) elektroni

�slobodni elektronski parovi(n)

Pobuđivanje:Iz vezivne u antivezivne

Dozvoljenielektronski prelazi

σ→σ*n→σ*π→π*n→π*

Jedan elektronski prelaz-jedna apsorpciona traka A=f(λλλλ)

λ max-ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje

1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina

Koliko je λ max ?

Šta utiče na λmax?

1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju

različite hromofore (molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti)

Apsorpcioni spektar benzena (1)oko

255 nm i fenola (2)oko 270 nm

180 200 220 240 260 280 300

2

1

n-π∗

π−π∗

A

λ, nm

Više dvostrukih vezapomeranje ka većim talasnim dužinama-batohromno pomeranje

Proteini (belančevine) apsorbuju u UV oblasti spektra

Belance je belo!

Hromofore:�Peptidna veza (-CONH-)�Aromatične aminokiseline u bočnom

lancu�Prostetične grupe

UV spektri :a)proteina b) nukleinskih kiselina

Pored strukture, na položaj apsorpcione trake utiču:

�pHSlaba baza ili slaba

kiselina-u jonskom ili molekulskom obliku u zavisnosti od pH

Izobestična tačka

Provera:Kapnite par kapilimuna u čaj…

Rastvarač�Jod u etru je ljubičast

�Jod u vodi je žućkasto-braon

Šta znači reč HROMOFORA?

�Grčki:

�NOSILAC BOJE chroma + phoros

Boja jedinjenja

Selektivna apsorpcijau vidljivom delu spektra(400-800 nm)Komplementarne bojeKomplementarno-koje se dopunjuje,nadopunjujuće

Predmeti su one boje koju reflektuju

Rastvori su one boje koju propuštaju, a ne apsorbuju

Zašto je NaClbezbojan, a NiCl2 obojen?

11Na→1s2 2s2 2p6 3s1

Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i NeVelika E da se prevede u pobuđeno

stanje ⇒u UV oblasti

28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8

Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6

Mala E da se prevede u pobuđeno stanje⇒ u VIS oblasti

Koje je boje ovo jedinjenje?

600 620 640 660 680 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

λλλλ, nm

Šta nam govore UV-VIS spektri?

�Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?

Ali ne možemo biti 100% sigurni

Aktivnostenzima prekopojaveili

nestanka spektara njihovih supstrata.

NADH ima maxna 340 nm

NAD+ nema max na340 nm

Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima koji katalizuju

reakcije koje uključuju učešće redoks paraNAD+/NADH .

� Alkohol-dehidrogenazakatalizuje:

C2H5OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+

Raste apsorbancija na 340 nm

� Sorbitol-dehidrogenazakatalizuje:

D-Fruktoza +NADH→ D-Sorbitol +NAD+

�Smanjuje se apsorbancija na 340 nm

Kvantitativna analiza kolika je koncentracija?

LAMBERT-BEEROV ZAKON

Ikdb

dI =−

∫∫ =−bI

J

dbkI

dIp

00

bkI

I p =−0

ln

kbp eII −= 0

Eksponencijalni oblik Lambertovogzakona

kbp eII −= 0

Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.

U zakon se “ubacuje” i Beer sa koncentracijom…

cbaA =Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji

tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazii apsorptivnosti rastvorene supstance.

Beerov zakon:

Lambert-Beerov zakon

A- apsorbancijaIo- intenzitet upadne svetlosti

Ip- intenzitet propuštene svetlostia-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost

b-dužina optičkog putac-koncentracija

cbaI

IA

p

== 0log

Transparencija

� Izražava se u procentima:

�Veza između apsorbancije i transparencije:

0I

IT p=

100%0

⋅=I

IT p

TT

I

IA p 1

logloglog0

=−=−=

TT

A %log21001001

log −=⋅=

Važna veličina,jedino se može meriti

Ip

Veza između A i T

IZME ĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A

TA log−=

Kalibraciona krivaBeerov zakon:nagib=ab, odsečak =0

cbaA =

0,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

koncentracija

y= kx + njednačina prave

A

Metoda kalibracione krive (standardna, analitička kriva)

A=f(c)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0

0,2

0,4

Ax

cx

A

c,%

Serija standardnihrastvora (najmanje 6)

poznatih koncentracija.Sa krive se odredi

nepoznatakoncentracija

Ograničenja Lambert-Beerovog zakona

Jedan do dva reda veličine� U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4

mol/dm3 ili1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3

Dve grupe razloga:� Zbog rastvorka i rastvarača,

t°C slabo� Zbog aparata (pozadinsko

zračenje)

Isključivo za monohromatsku svetlost!

Izbor radne talasne dužine

Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?

Instrumentimere APSORBANCIJU i TRANSPARENCIJU

�Fotometri

�Spektrofotometri

IZVOR ZRA ČENJAMONOHROMATOR

DETEKTOR

Izvori zračenja-lampe

� VIS deo spektra: volframova lampa(360- 950 nm)

� UV deo spektra: deuterijumovai vodonična (190-420 nm)

cevi za pražnjenježivina lampa-linijske spektre

Monohromator

� Od polihromatske treba da izdvoji monohromatsku svetlost.

� Sastoji se od:

1. Ulaznog i izlaznog razreza

2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)

3. Disperzionog elementa: prizma ili difrakciona rešetka

Disperzioni element

PRIZMADIFRAKCIONA

REŠETKA

U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne

Kivete

�Staklene- za VIS oblast

�Kvarcne-za UV oblast

�Najčešće

prečnika 1 cm (dužina optičkog puta)

Kivete

Detektor: fotoćelija, fotomultiplikator i fotodiode

Intenzitet fotostruje srazmeran

intenzitetu svetlostii= k ×××× Ip

Sheme spektrofotometra

Sheme spektrofotometara

Fotometar

� Jednostavniji uređaji od spektrofotometara

� Samo u VIS oblasti spektra

� Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora- određuje se koncentracija

Kao monohromatori FILTERI

Kako izabrati filter prema boji ispitivanog rastvora?

�Boja filtera je komplementarna bojiispitivanog rastvora.

�To znači da filter treba maksimalno da propusti svetlost one boje koju rastvor maksimalno apsorbuje.

Ako merimo apsorbanciju žutom rastvoru, izabraćemo filter:

�Crveni

�Žuti

�Zeleni

�Narandžasti

�Plavi

�Ljubičasti

Šta je slepa proba?

�Rastvor = rastvorak + rastvarač

�Apsorbuje i rastvorak i rastvarač

�Eliminisati apsorbanciju (transparenciju) rastvarača tako što se kazaljka instrumenta dovede na 0 apsorbancije, odnosno 100% transparencije

�Na taj način merenjem se dobija samo apsorbancija (transparencija) rastvorka.

Praktične vežbe

�1. SpektrofotometrijaSnimiti apsorpcioni spektar A=f(λ), naći λmax, na toj

talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih rastvora (koji ste prethodno napravili), nacrtati kalibracionu krivu i sa nje odrediti nepoznatu koncentraciju i molarni apsorpcioni koeficijent.

2. FotometrijaIzmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog i

nepoznatog rastvora i izračunati koncentraciju koristeći metodu standarda.