Post on 12-May-2018
UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN α–GLUKOSIDASE DARI BEBERAPA TANAMAN FAMILI CLUSIACEAE
Berna Elya, Abdul Mun’im, Eva Kurnia Septiana
Departemen Farmasi FMIPA-UI
11/10/2012
1
Diabetes Melitus
2005:
173 juta orang
2030:
366 juta orang
2000:
Indonesia posisi ke-4
8,4 juta orang
2030:
21,3 juta orang
Latar Belakang
Diabetes Melitus Tipe 2
90-95%
Kendala : resistensi obat
Tujuan ideal: obat yang bekerja pada
target dan juga tanpa masalah
toleransi
penghambat
enzim
α-glukosidase
akarbose, miglitol, voglibose
Latar Belakang
Latar Belakang
11/10/2012
4
Keanekaragaman
Flora Indonesia
Eksplorasi tanaman
Indonesia
Beberapa Jenis dari Famili
Clusiaceae diketahui memiliki
efek inhibisi terhadap enzim
α-glukosidase
(Garcinia atriviridis,
G. brevipedicellata, G.kola,
G.indica,G. cambogia,)
Salah satu metode pengobatan diabetes
mellitus tipe II
Menghambat enzim α-amylase pankreatik &
α-glukosidase di usus halus
Mencegah hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa & monosakarida lainnya
Akarbose(Indo: Glucobay) perut kembung, diare, nyeri perut, hepatotoksik (Andrade et al., 1998).
untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung pada ekstrak beberapa tanaman famili Clusiaceae
untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase
oleh ekstrak tanaman-tanaman tersebut
untuk mengetahui jenis mekanisme penghambatan enzim α-glukosidase
dari ekstrak tanaman dengan aktivitas penghambatan baik
Tujuan
Bahan dan Alat
Simplisia Uji
1. Calophyllum tomentosum Wight. Folium,
2. Garcinia bancana Miq. Folium,
3. Garcinia daedalanthera Pierre. Folium,
4. Garcinia hombroniana Pierre. Folium,
5. Garcinia kydia Roxb. Folium,
6. Garcinia rigida Miq. Folium
11/10/2012
7
Bahan-Bahan 11/10/2012
8
enzim α–glukosidase
substrat para-nitrofenil-α-D-glukopiranosida
bovine serum albumin
akarbose
natrium karbonat
pelarut untuk uji aktivitas penghambatan enzimatis
Alat refluks,
spektofotometer UV-Vis
penguap vakum putar
shaking bath incubator
oven
timbangan analitik
vortex
11/10/2012
9
ALAT
Cara Kerja
penyiapan bahan uji
ekstraksi identifikasi golongan
senyawa kimia
uji pendahuluan
uji aktivitas penghambatan
enzim α-glukosidase
penentuan kinetika
penghambatan enzim α-
glukosidase
Penyiapan Bahan Uji
pengumpulan bahan baku
sortasi basah dan pencucian
perajangan
pengeringan
pembuatan serbuk
Ekstraksi
serbuk simplisia
direfluks dengan
etanol 80%
3 x 1 jam
pelarut diuapkan
ekstrak kental
identifikasi golongan senyawa
kimia
alkaloid
flavonoid
terpenoid
tanin glikosida
saponin
antrakuinon
Pengujian Aktivitas Penghambatan α–Glukosidase
glukosa p-nitrofenol p-nitrofenil-α-D-
glukopiranosida
Prinsip Uji Aktivitas
10 mM 20 mM
0,3 U/mL
0,15 U/mL
0,075 U/mL
0,0375 U/mL
Optimasi
Konsentrasi
Enzim
enzim
20 mM
10 mM
5 mM
2,5 mM
1,25 mM
0,625 mM
0,03125 mM
Optimasi
Konsentrasi
Substrat
Uji
Pe
nd
ah
ulu
an
Penyiapan Standar/Sampel
Timbang 100 mg standar/ sampel
Larutkan dengan buffer fosfat pH 6,8 cukupkan hingga 10,0 ml (konsentrasi 1 %)
Pipet 5 ml, tambahkan buffer fosfat pH 6,8
Cukupkan hingga 10,0 ml (konsentrasi 0,5%)
Pengenceran dilakukan kembali hingga diperoleh konsentrasi 0,25% dan 0,125 %
Pengujian B0 atau S0
(kontrol blangko atau kontrol sampel)
10 µL DMSO atau sampel
inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC
tambahkan 2000 µL 200 mM Na2CO3
inkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC
tambahkan 250 µL enzim 0,15 U/ml
ukur absorbansi pada panjang gelombang 400 nm
250 µL PNP-G 5mM 490 µL dapar fosfat pH
6,8
Pengujian B1 atau S1 (Blangko dan Sampel)
10 µL DMSO atau sampel
inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC
tambahkan 250 µL enzim 0,15 U/ml
inkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC
tambahkan 2000 µL 200 mM Na2CO3
ukur absorbansi pada panjang gelombang 400 nm
250 µL PNP-G 5mM 490 µL dapar fosfat pH
6,8
Penghitungan Aktivitas Penghambatan
α-Glukosidase
% Inhibisi dihitung dengan rumus :
• Keterangan :
C = selisih absorbansi blangko dan absorbansi kontrol blangko
S = selisih absorbansi sampel dan absorbansi kontrol sampel
11/10/2012
20
• Penghitungan IC50 : menggunakan persamaan
regresi linear,
y = a + bx
x : konsentrasi sampel
y : % inhibisi
• Persamaan:
IC50 =
11/10/2012
21
Penghitungan IC50 α-Glukosidase
Tabel. sistem Reaksi Uji Inhibisi α–glukosidase 11/10/2012
22
Blanko (µL) tanpa enzim
Blanko (µL) dengan enzim
So (µL)
S1 (µL)
Sampel - - 10 10
DMSO 10 10 - -
Dapar fosfat pH 6,8 490 490 490 490
PNP 250 250 250 250
Inkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit
Enzim α-glukosidase - 250 - 250
Natrium Karbonat 2000 - 2000 -
Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit
Enzim α-glukosidase 250 - 250 -
Natrium Karbonat - 2000 - 2000
11/10/2012
23
Metode Penentuan kinetika inhibisi enzim
Substrat : pNP
(5 konsentrasi)
Sampel uji/ inhibitor : larutan ekstrak
(4 konsentrasi)
Blangko : satu kontrol blangko
Jenis inhibisi : metode Lineweaver-Burk
Penghitungan Tetapan kinetika Michaelis-Menten : y = a + b x
Grafik Lineweaver-Burk
11/10/2012
24
Hasil : Nilai IC50
No Simplisia Uji Bagian yang
Digunakan
IC50
(µg/ml)
1. Akarbose - 116,95
2. Calophyllum tomentosum Wight. daun 15,83
3. Garcinia bancana Miq. daun 22,41
4. Garcinia daedalanthera Pierre. daun 2,33
5. Garcinia hombroniana Pierre. daun 11,30
6. Garcinia kydia Roxb. daun 3,88
7. Garcinia rigida Miq. daun 24,48
11/10/2012
25
Grafik Kinetika Enzimatis G.kydia
y = 0.420x + 0.355
y = 1.571x + 0.966
y = 3.140x + 1.861
-1
0
1
2
3
4
5
6
-2 -1 0 1 2
1/v
1/CS
1/vb
1/v16
1/v33
11/10/2012
26
Hasil identifikasi menunjukkan pada famili Clusiaceae umumnya mengandung tanin, terpen, saponin, glikosida, flavonoid dan antrakuinon.
Nilai IC50 ekstrak etanol dalam penelitian ini berkisar antara yang paling tinggi dengan nilai IC50 2,33 µg/mL sampai dengan yang paling rendah dengan nilai IC50 24,48 µg/mL
Ekstrak etanol daun Garcinia kydia merupakan simplisia yang memiliki aktivitas penghambatan dengan nilai IC50 3,88 µg/mL, jenis mekanisme penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol daun Garcinia kydia adalah penghambat non kompetitif
KESIMPULAN
Perlu diadakan penelitian lebih lanjut meliputi fraksinasi dan karakterisasi senyawa aktif dari simplisia-simplisia yang digunakan pada penelitian ini.
Selain itu, pengujian secara in vivo juga disarankan untuk lebih memastikan potensi dari dari simplisia-simplisia yang digunakan pada penelitian ini
SARAN
Hasil Uji Terpen Pada Simplisia
Simplisia Uji Terpen
Daun Calophyllum tomentosum +
Daun Garcinia bancana +
Daun Garcinia daedalanthera +
Kulit batang Garcinia daedalanthera
+
Garcinia hombroniana +
Garcinia kydia +
Garcinia rigida +
11/10/2012
30
Hasil Uji Tanin pada Simplisia
Simplisia FeCl3 1% Gelatin 10% Na-Cl
gelatin
Daun Calophyllum tomentosum + + +
Daun Garcinia bancana + + +
Daun Garcinia daedalanthera + + +
Kulit batang Garcinia daedalanthera
+ + +
Garcinia hombroniana + + +
Garcinia kydia + + +
Garcinia rigida + + +
11/10/2012
31
Hasil Uji Saponin Pada Simplisia
Simplisia Saponin
Daun Calophyllum tomentosum +
Daun Garcinia bancana +
Daun Garcinia daedalanthera +
Kulit batang Garcinia daedalanthera
+
Garcinia hombroniana +
Garcinia kydia +
Garcinia rigida +
11/10/2012
32
Hasil Uji Glikosida pada Simplisia
Simplisia Molisch Liebermann burchard
Daun Calophyllum tomentosum + -
Daun Garcinia bancana + -
Daun Garcinia daedalanthera + +
Kulit batang Garcinia daedalanthera + -
Garcinia hombroniana + +
Garcinia kydia + -
Garcinia rigida + -
11/10/2012
33
Hasil Uji Flavonoid pada Simplisia
Simplisia Reduksi Zn Reduksi Mg Kompleks Aseton-Borat
Daun Calophyllum tomentosum + + +
Daun Garcinia bancana + + +
Daun Garcinia daedalanthera + + +
Kulit batang Garcinia daedalanthera
+ + +
Garcinia hombroniana + + +
Garcinia kydia + + +
Garcinia rigida + + +
11/10/2012
34
Hasil Uji Antrakuinon pada Simplisia
Simplisia Uji Antrakuinon
Daun Calophyllum tomentosum -
Daun Garcinia bancana -
Daun Garcinia daedalanthera +
Kulit batang Garcinia daedalanthera
+
Garcinia hombroniana +
Garcinia kydia +
Garcinia rigida +
11/10/2012
35