UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN α–GLUKOSIDASE DARI BEBERAPA TANAMAN FAMILI CLUSIACEAE

Berna Elya, Abdul Mun’im, Eva Kurnia Septiana

Departemen Farmasi FMIPA-UI

11/10/2012

1

Diabetes Melitus

2005:

173 juta orang

2030:

366 juta orang

2000:

Indonesia posisi ke-4

8,4 juta orang

2030:

21,3 juta orang

Latar Belakang

Diabetes Melitus Tipe 2

90-95%

Kendala : resistensi obat

Tujuan ideal: obat yang bekerja pada

target dan juga tanpa masalah

toleransi

penghambat

enzim

α-glukosidase

akarbose, miglitol, voglibose

Latar Belakang

Latar Belakang

11/10/2012

4

Keanekaragaman

Flora Indonesia

Eksplorasi tanaman

Indonesia

Beberapa Jenis dari Famili

Clusiaceae diketahui memiliki

efek inhibisi terhadap enzim

α-glukosidase

(Garcinia atriviridis,

G. brevipedicellata, G.kola,

G.indica,G. cambogia,)

Salah satu metode pengobatan diabetes

mellitus tipe II

Menghambat enzim α-amylase pankreatik &

α-glukosidase di usus halus

Mencegah hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa & monosakarida lainnya

Akarbose(Indo: Glucobay) perut kembung, diare, nyeri perut, hepatotoksik (Andrade et al., 1998).

untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung pada ekstrak beberapa tanaman famili Clusiaceae

untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase

oleh ekstrak tanaman-tanaman tersebut

untuk mengetahui jenis mekanisme penghambatan enzim α-glukosidase

dari ekstrak tanaman dengan aktivitas penghambatan baik

Tujuan

Bahan dan Alat

Simplisia Uji

1. Calophyllum tomentosum Wight. Folium,

2. Garcinia bancana Miq. Folium,

3. Garcinia daedalanthera Pierre. Folium,

4. Garcinia hombroniana Pierre. Folium,

5. Garcinia kydia Roxb. Folium,

6. Garcinia rigida Miq. Folium

11/10/2012

7

Bahan-Bahan 11/10/2012

8

enzim α–glukosidase

substrat para-nitrofenil-α-D-glukopiranosida

bovine serum albumin

akarbose

natrium karbonat

pelarut untuk uji aktivitas penghambatan enzimatis

Alat refluks,

spektofotometer UV-Vis

penguap vakum putar

shaking bath incubator

oven

timbangan analitik

vortex

11/10/2012

9

ALAT

Cara Kerja

penyiapan bahan uji

ekstraksi identifikasi golongan

senyawa kimia

uji pendahuluan

uji aktivitas penghambatan

enzim α-glukosidase

penentuan kinetika

penghambatan enzim α-

glukosidase

Penyiapan Bahan Uji

pengumpulan bahan baku

sortasi basah dan pencucian

perajangan

pengeringan

pembuatan serbuk

Ekstraksi

serbuk simplisia

direfluks dengan

etanol 80%

3 x 1 jam

pelarut diuapkan

ekstrak kental

identifikasi golongan senyawa

kimia

alkaloid

flavonoid

terpenoid

tanin glikosida

saponin

antrakuinon

Pengujian Aktivitas Penghambatan α–Glukosidase

glukosa p-nitrofenol p-nitrofenil-α-D-

glukopiranosida

Prinsip Uji Aktivitas

10 mM 20 mM

0,3 U/mL

0,15 U/mL

0,075 U/mL

0,0375 U/mL

Optimasi

Konsentrasi

Enzim

enzim

20 mM

10 mM

5 mM

2,5 mM

1,25 mM

0,625 mM

0,03125 mM

Optimasi

Konsentrasi

Substrat

Uji

Pe

nd

ah

ulu

an

Penyiapan Standar/Sampel

Timbang 100 mg standar/ sampel

Larutkan dengan buffer fosfat pH 6,8 cukupkan hingga 10,0 ml (konsentrasi 1 %)

Pipet 5 ml, tambahkan buffer fosfat pH 6,8

Cukupkan hingga 10,0 ml (konsentrasi 0,5%)

Pengenceran dilakukan kembali hingga diperoleh konsentrasi 0,25% dan 0,125 %

Pengujian B0 atau S0

(kontrol blangko atau kontrol sampel)

10 µL DMSO atau sampel

inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC

tambahkan 2000 µL 200 mM Na2CO3

inkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC

tambahkan 250 µL enzim 0,15 U/ml

ukur absorbansi pada panjang gelombang 400 nm

250 µL PNP-G 5mM 490 µL dapar fosfat pH

6,8

Pengujian B1 atau S1 (Blangko dan Sampel)

10 µL DMSO atau sampel

inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC

tambahkan 250 µL enzim 0,15 U/ml

inkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC

tambahkan 2000 µL 200 mM Na2CO3

ukur absorbansi pada panjang gelombang 400 nm

250 µL PNP-G 5mM 490 µL dapar fosfat pH

6,8

Penghitungan Aktivitas Penghambatan

α-Glukosidase

% Inhibisi dihitung dengan rumus :

• Keterangan :

C = selisih absorbansi blangko dan absorbansi kontrol blangko

S = selisih absorbansi sampel dan absorbansi kontrol sampel

11/10/2012

20

• Penghitungan IC50 : menggunakan persamaan

regresi linear,

y = a + bx

x : konsentrasi sampel

y : % inhibisi

• Persamaan:

IC50 =

11/10/2012

21

Penghitungan IC50 α-Glukosidase

Tabel. sistem Reaksi Uji Inhibisi α–glukosidase 11/10/2012

22

Blanko (µL) tanpa enzim

Blanko (µL) dengan enzim

So (µL)

S1 (µL)

Sampel - - 10 10

DMSO 10 10 - -

Dapar fosfat pH 6,8 490 490 490 490

PNP 250 250 250 250

Inkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit

Enzim α-glukosidase - 250 - 250

Natrium Karbonat 2000 - 2000 -

Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit

Enzim α-glukosidase 250 - 250 -

Natrium Karbonat - 2000 - 2000

11/10/2012

23

Metode Penentuan kinetika inhibisi enzim

Substrat : pNP

(5 konsentrasi)

Sampel uji/ inhibitor : larutan ekstrak

(4 konsentrasi)

Blangko : satu kontrol blangko

Jenis inhibisi : metode Lineweaver-Burk

Penghitungan Tetapan kinetika Michaelis-Menten : y = a + b x

Grafik Lineweaver-Burk

11/10/2012

24

Hasil : Nilai IC50

No Simplisia Uji Bagian yang

Digunakan

IC50

(µg/ml)

1. Akarbose - 116,95

2. Calophyllum tomentosum Wight. daun 15,83

3. Garcinia bancana Miq. daun 22,41

4. Garcinia daedalanthera Pierre. daun 2,33

5. Garcinia hombroniana Pierre. daun 11,30

6. Garcinia kydia Roxb. daun 3,88

7. Garcinia rigida Miq. daun 24,48

11/10/2012

25

Grafik Kinetika Enzimatis G.kydia

y = 0.420x + 0.355

y = 1.571x + 0.966

y = 3.140x + 1.861

-1

0

1

2

3

4

5

6

-2 -1 0 1 2

1/v

1/CS

1/vb

1/v16

1/v33

11/10/2012

26

Hasil identifikasi menunjukkan pada famili Clusiaceae umumnya mengandung tanin, terpen, saponin, glikosida, flavonoid dan antrakuinon.

Nilai IC50 ekstrak etanol dalam penelitian ini berkisar antara yang paling tinggi dengan nilai IC50 2,33 µg/mL sampai dengan yang paling rendah dengan nilai IC50 24,48 µg/mL

Ekstrak etanol daun Garcinia kydia merupakan simplisia yang memiliki aktivitas penghambatan dengan nilai IC50 3,88 µg/mL, jenis mekanisme penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol daun Garcinia kydia adalah penghambat non kompetitif

KESIMPULAN

Perlu diadakan penelitian lebih lanjut meliputi fraksinasi dan karakterisasi senyawa aktif dari simplisia-simplisia yang digunakan pada penelitian ini.

Selain itu, pengujian secara in vivo juga disarankan untuk lebih memastikan potensi dari dari simplisia-simplisia yang digunakan pada penelitian ini

SARAN

Hasil Uji Terpen Pada Simplisia

Simplisia Uji Terpen

Daun Calophyllum tomentosum +

Daun Garcinia bancana +

Daun Garcinia daedalanthera +

Kulit batang Garcinia daedalanthera

+

Garcinia hombroniana +

Garcinia kydia +

Garcinia rigida +

11/10/2012

30

Hasil Uji Tanin pada Simplisia

Simplisia FeCl3 1% Gelatin 10% Na-Cl

gelatin

Daun Calophyllum tomentosum + + +

Daun Garcinia bancana + + +

Daun Garcinia daedalanthera + + +

Kulit batang Garcinia daedalanthera

+ + +

Garcinia hombroniana + + +

Garcinia kydia + + +

Garcinia rigida + + +

11/10/2012

31

Hasil Uji Saponin Pada Simplisia

Simplisia Saponin

Daun Calophyllum tomentosum +

Daun Garcinia bancana +

Daun Garcinia daedalanthera +

Kulit batang Garcinia daedalanthera

+

Garcinia hombroniana +

Garcinia kydia +

Garcinia rigida +

11/10/2012

32

Hasil Uji Glikosida pada Simplisia

Simplisia Molisch Liebermann burchard

Daun Calophyllum tomentosum + -

Daun Garcinia bancana + -

Daun Garcinia daedalanthera + +

Kulit batang Garcinia daedalanthera + -

Garcinia hombroniana + +

Garcinia kydia + -

Garcinia rigida + -

11/10/2012

33

Hasil Uji Flavonoid pada Simplisia

Simplisia Reduksi Zn Reduksi Mg Kompleks Aseton-Borat

Daun Calophyllum tomentosum + + +

Daun Garcinia bancana + + +

Daun Garcinia daedalanthera + + +

Kulit batang Garcinia daedalanthera

+ + +

Garcinia hombroniana + + +

Garcinia kydia + + +

Garcinia rigida + + +

11/10/2012

34

Hasil Uji Antrakuinon pada Simplisia

Simplisia Uji Antrakuinon

Daun Calophyllum tomentosum -

Daun Garcinia bancana -

Daun Garcinia daedalanthera +

Kulit batang Garcinia daedalanthera

+

Garcinia hombroniana +

Garcinia kydia +

Garcinia rigida +

11/10/2012

35