1

Supplementary Information  

Supplementary Methods 

 

Semiquantitative RT‐PCR   

Total  cellular  RNA  was  extracted  from  cells  using  Easy  BlueTM  (Intron  Company),  dissolved  in 

diethylpyrocarbonate‐treated  water,  and  quantified  by  UV  scanning.  RNA  (5  μg)  was  reverse‐

transcribed,  and  BLT1,  BLT2,  NOX1,  and  glyceraldehyde‐3‐phosphate  dehydrogenase  (GAPDH) 

were amplified using an RT‐PCR PreMix Kit (Intron), as previously described (Choi et al., 2008). 

 

Luciferase reporter gene assays for NF‐κB and MMP‐9 promoter activities 

Cells were  transiently co‐transfected with pcDNA3, pcDNA3‐H‐RasV12, pcDNA3‐BLT1, or pcDNA3‐

BLT2  and  the  reporter  plasmid  containing  the  NF‐κB,  AP‐1,  or  MMP‐9  promoter  fused  to  a 

luciferase  coding  sequence  or  stable  cells  (Rat‐2,  Rat2‐HO6,  or  Rat2‐BLT2)  were  transiently 

transfected with  the pNF‐κB, AP‐1, or MMP‐9‐Luc  reporter plasmid, cultured  for 24 h and  then 

serum‐starved  for 12 h. The  cells were  then harvested  and  the  luciferase  activity measured  as 

described previously (Woo et al., 2000). 

 

Invasion assays 

To monitor the invasion potential of Rat2‐HO6, Rat2‐BLT2, or NIH3T3‐HRasV12 cells, BD BioCoatTM 

MatrigelTM  Invasion  Chambers  (BD  Biosciences,  San  Jose,  CA)  were  used  according  to  the 

manufacturer’s  instructions. Cells (5 x 104) were removed from culture plates with trypsin‐EDTA, 

washed  in  DMEM/0.5%  FBS,  and  seeded  on  top  of  the  rehydrated  Matrigel  inserts.  DMEM 

containing 0.5% FBS and 300 nM of LTB4 was added to the lower chamber. Cells were allowed to 

migrate for 24 h. The filters were fixed in methanol and stained with hematoxylin and eosin (H&E). 

2

Invasive ells were counted microscopically in 10 random high‐power fields per filter; each sample 

was assayed in duplicate, and 5 independent assays were performed.   

 

Chemotactic transmigration assay   

Transmigration assays were performed using Transwell chambers  (Corning Costar,  Inc.) with 6.5‐

mm diameter polycarbonate filters (8‐μm pore size). Briefly, confluent Rat2, Rat2‐HO6, NIH3T3, or 

NIH3T3‐HRasV12 cells were incubated for 12 h in DMEM containing 0.5% FBS. The lower surfaces of 

the filters were coated with 10 µg/ml of collagen type I (Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO) for 1 h at 

37 °C. Cells were trypsinized and suspended  in DMEM containing 0.5% FBS before being  loaded 

into the upper chamber at a final concentration of 5 x 104 cells/well. The cells were then allowed 

to  migrate  to  the  lower  side  of  the  chamber,  which  contained  LTB4.  In  some  assays,  cell 

suspensions were exposed to inhibitors or antagonists for 30 min before seeding. After incubation 

at 37 °C for 6 h, the filters were disassembled, and the upper surface of each filter was scraped 

free of cells by wiping with a cotton swab. Cells that had migrated to the underside of the filters 

were  fixed  for  1  min  with  methanol  and  stained  for  20  min  with  H&E.  Cell  migration  was 

quantified by counting the number of cells on the lower side of the filter in 10 random high‐power 

fields  per  filter.  Each  sample  was  assayed  in  triplicate,  and  five  independent  assays  were 

conducted. Migration data were analyzed by Student’s t‐test using SPSS 12.0 software to examine 

differences among cell lines and groups. 

 

Western blotting for MMP‐9 levels 

Levels of MMP‐9  in culture supernatants were measured by western blot assay. Briefly, cultured 

cells  (4  x  105  cells/60‐mm  plate) were  incubated  for  24  h  in DMEM  containing  0.5%  FBS.  The 

culture supernatant was collected, solubilized in Laemmli buffer with reducing agent, and heated 

3

at  95  °C  for  5 min  prior  to  subjecting  samples to  8%  SDS‐PAGE.  Samples were  transferred  to 

polyvinylidine  difluoride  membranes  and  incubated  overnight  at  4°C  in  Tris‐buffered  saline 

containing nonfat dried milk (5%, w/v) and Tween 20 (0.01%, v/v). Subsequently, the membranes 

were incubated with the appropriate antibodies, followed by HRP‐conjugated secondary antibody, 

and developed by ECL, according to the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences). For 

inhibitor  experiments,  cells  were  treated  with  inhibitors  or  antagonists  in  DMEM  medium 

containing  0.5%  FBS  for  24  h.  Anti‐MMP‐9  (Sigma‐Aldrich)  was  used  at  a  dilution  of  1:1000. 

Tubulin (Sigma‐Aldrich) was used as a loading control. 

 

FACs analysis for BLT2 expression 

The  cell  surface expression of BLT2  in Rat2, Rat2‐HO6, Rat2‐BLT2, NIH3T3, and NIH3T3‐HRasV12 

cells was evaluated by  flow  cytometry using a  FACStarPLUS  (BD Biosciences)  analyzer and  rabbit 

plyclonal  Ab  anti‐BLT2  (Life  Span  Biosciences,  Inc.)  (1:200  dilution  for  2  h),  followed  by  a 

fluorescein  isothiocyanate  (FITC)‐conjugated  anti‐rabbit  IgG  (1:200  dilution,  Sigma‐Aldrich).  To 

evaluate the expression of cell surface BLT2, cells were fixed with 3% paraformaldehyde without 

permeablization before incubation with rabbit polyclonal Ab. Rabbit immunoglobulin (IgG, Sigma‐

Aldrich) was used as an isotype control. Data are expressed as the mean fluorescence intensity. 

 

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 

Nuclear protein extracts for electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were obtained by  lysing 

cells (5 x 106) with 200 μl of ice‐cold buffer A (10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 

0.1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, and 0.5 mM DTT). Samples were centrifuged at 800 x g for 10 min at 

4  °C  and  the  supernatants  were  collected  as  the  cytoplasmic  extract.  The  pellets  were 

resuspended  in 50 μl of Buffer B (20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM 

4

EDTA, 5% glycerol, 0.5 mM PMSF, and 0.5 mM DTT) to extract nuclear proteins. After  incubation 

for  20 min  on  ice,  the  samples were  centrifuged  at  10,000  x  g  for  30 min  at  4  °C,  and  the 

supernatants were collected as nuclear extracts and stored at ‐80 °C. The amount of protein in the 

nuclear extracts was quantified using the Bradford method (BioRad, Hercules, CA). The sequence 

of the sense strand of the double‐stranded oligonucleotide probes used in the EMSAs was 5'‐AGT 

TGA GGG GAC TTT CCC AGG C‐3'  for NF‐κB. Oligonucleotides were end‐labeled with  [γ‐32P] ATP 

using T4 polynucleotide kinase (MBI Fermentas Inc.), annealed, and purified on a Sephadex G‐50 

column (Amersham Biosciences, Corp.). Nuclear extracts (10 μg) were incubated with 0.5‐1 ng of 

labeled  probe  (10,000‐20,000  cpm)  for  30  min  at  room  temperature  in  binding  buffer  (MBI 

Fermentas) with 5 mM DTT. Unlabeled oligonucleotides, which were used as competitors, were 

added at a 100‐fold molar excess 10 min before addition of the labeled probe. The samples were 

separated in a 5% polyacrylamide Tris‐acetate‐EDTA gel, which was dried and then exposed to X‐

ray film at ‐80 °C. 

 

Experimental metastasis assays and morphological and histological analyses   

Rat‐2, Rat2‐HO6, and Rat2‐BLT2 cells (5 x 105 cells) from cultures in the logarithmic growth phase 

at the time of harvest were prepared for injection. In certain cases, siBLT2 or siMMP‐9‐transfected 

cells  were  prepared  for  injection.  For  delivery  of  siRNA  (siBLT2  or  siMMP‐9)  into  cells, 

polyethlyleneimine  (PEI; Sigma‐Aldrich), a  cationic polymer, was used as  the delivery vehicle  to 

prevent degradation and enhance cell membrane penetration of siRNAs, as described previously 

(Tan et al., 2005; Zhang et al., 2007). The cells were briefly treated with 0.025% trypsin and 0.1% 

EDTA  in  Hanks’  balanced  salt  solution  and  quickly  removed  from  the  culture  plates  by 

centrifugation, resuspended  in saline containing 300 nM of LTB4 (to ensure BLT2 activation), and 

injected  within  1  h  in  0.1 ml  into  the  lateral  tail  vein  with  a  30‐gauge  needle.  For  inhibitor 

5

experiments,  0.25  mg/kg  of  U75302,  2.5  mg/kg  of  LY255283,  or  12.5  mg/kg  of  SB‐3CT  was 

injected intraperitoneally 3 and 5 days after injection of cells. For siRNA experiments, control (1 μl 

of PEI + siRNA control) or dsRNA (1 μl of PEI + 5 μg of siRNA) was injected into the lateral tail vein 

5  and  10  days  after  injection  of  cells  transfected  with  siBLT2  or  siMMP‐9.  The  mice  were 

maintained under aseptic barrier conditions until sacrifice at 21 days after cell injection (n = 8 for 

each group) to identify pulmonary metastases. After 21 days, the mice were euthanized, and the 

number of  lung  surface metastasis nodules  larger  than 0.2 mm  in diameter and  the metastatic 

tumor burden evaluated by measuring whole  lung weight were determined. To  investigate  the 

mortality of injected mice, animals were monitored for 7 weeks (n = 8 for each group). The lungs 

were dissected and  fixed  in 4%  formalin, processed, and embedded  in paraffin. Sections  (4 μm) 

were stained with H&E, examined, and photographed using a BX51 microscope (Olympus, Tokyo, 

Japan) equipped with a DP71 digital  camera  (Olympus). Survival was analyzed by Kaplan‐Meier 

plots. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

Supplementary References 

Tan PH, Yang  LC, Shih HC,  Lan KC, Cheng  JT  (2005). Gene knockdown with  intrathecal  siRNA of 

NMDA receptor NR2B subunit reduces formalin‐induced nociception  in the rat. Gene Ther 12: 

59‐66. 

Woo CH, Lee ZW, Kim BC, Ha KS, Kim JH (2000). Involvement of cytosolic phospholipase A2, and 

the  subsequent  release  of  arachidonic  acid,  in  signalling  by  rac  for  the  generation  of 

intracellular reactive oxygen species in rat‐2 fibroblasts. Biochem J 348 Pt 3: 525‐30. 

Zhang S, Zhao B, Jiang H, Wang B, Ma B (2007). Cationic lipids and polymers mediated vectors for 

delivery of siRNA. J Control Release 123: 1‐10. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

Supplementary Figure Legends 

Supplementary Figure 1.    Up‐regulation of BLT2 by H‐Ras.  (a‐c) The elevated BLT2 expression 

induced by H‐Ras was analyzed by  FACS analysis  (a‐b) and  semiqauntitative RT‐PCR  (c). Rat‐2, 

Rat2‐HO6, Rat2‐BLT2, NIH3T3, and NIH3T3‐HRasV12 cells were examined for BLT2 antibodies, as 

described  under  Supplementary  information  (a‐b).  #  p  <  0.05,  *  p  <  0.01.  (c)  Upper  panel; 

Expression of BLT2  in Rat‐2  and Rat2‐HO6  cells or NIH3T3  and NIH3T3‐H‐RasV12  cells  (4  x 105 

cells/60‐mm  plate) was  examined  by  semiquantitative  RT‐PCR  using  BLT2‐specific  primers,  as 

reported previously (Choi et al., 2008). Lower panel; Rat‐2 cells and NIH3T3 cells were transiently 

transfected with 0, 0.5, 1, or 2 μg of H‐RasV12 expression plasmid, after which the transfectants 

were  serum‐starved  for  12  h  in DMEM  containing  0.5%  FBS  and  then  analyzed  for  transcript 

levels by semiquantitative RT‐PCR using BLT2‐specific primers. The samples were also assayed by 

western blot analysis. Antibodies specific for phospho‐ERK, total ERK (Cell Signaling Technology), 

or H‐Ras (Novus Biologicals) were used (1:1000 dilution). GAPDH  levels are shown as a control. 

The results shown are representative of three independent experiments with similar results.   

 

Supplementary Figure 2. ROS  generation occurs  via BLT2‐NOX1  signaling  in Rat2‐HO6  cells.  (a) 

Rat2, Rat2‐HO6, or Rat2‐BLT2 cells were pre‐treated with DMSO, 5 or 10 μM of LY255283, 0.5 or 1 

μM of U75302, and a combination of LY255283 (10 μM) and U75302 (1 μM) and then analyzed for 

the  level of ROS.  (b) ROS  levels are  regulated by NOX1  in Rat2‐HO6 or Rat2‐BLT2  cells. pSIREN 

(control  vector)  and pSIREN‐siNox1 were  transiently  transfected  into Rat‐2, Rat2‐HO6, or Rat2‐

BLT2 cells using LipofectAMINE‐plus. After 36 h, the cells were assayed for ROS levels, as described 

previously  (Choi  et  al.,  2008).  All  data  are  expressed  as  the  average  fold  increase  relative  to 

controls ± s.d. * p < 0.001.   

 

8

Supplementary Figure 3. The BLT2 signal axis is independent of AP‐1 transcriptional activity. (a‐b) 

Rat‐2  cells were  transiently  co‐transfected with  pcDNA3,  pcDNA3‐H‐RasV12,  and  the  pAP‐1‐Luc 

reporter plasmid  (a) or pcDNA3, pcDNA3‐H‐RasV12, pcDNA3‐BLT1, pcDNA3‐BLT2, and  the pAP‐1‐

Luc reporter plasmid (b), cultured for 24 h, and then serum‐starved for 12 h. For inhibition tests, 

cells were treated with 10 μM LY255283, 1 μM U75302, 20 μM NS398, and 100 μM PDTC for 6 h 

before  cell harvest,  followed by determination of  luciferase  activity. Data  are  expressed  as  the 

average fold increase over controls ± s.d. in three independent experiments.   

 

Supplementary Figure 4. Modulation of MMP‐9  via  the BLT2 axis  in Ras‐activated  cells. Rat‐2 

cells  were  transiently  co‐transfected  with  pcDNA3,  pcDNA3‐H‐RasV12,  and  the  pMMP‐9‐Luci 

reporter plasmid (a) or Rat‐2, Rat2‐HO6, and Rat2‐BLT2 cells were transfected with the pMMP‐9‐

Luc reporter plasmid (b), cultured for 24 h, and then serum‐starved for 12 h. For inhibition tests, 

cells were treated with buffer, 100 μM PDTC, 100 μM SN‐50M, or 100 μM SN‐50 for 6 h before 

cell harvest to determine luciferase activities. * p < 0.01, ** p < 0.001.   

 

Supplementary Figure 5. In vivo metastatic potential evoked by H‐RasV12  is suppressed by BLT2 

inhibition with LY255283. (a‐b) Mice were injected with Rat2, Rat2‐HO6, or Rat2‐BLT2 cells, and 

then administered DMSO  (control), 2.5 mg/kg LY255283, or 0.25 mg/kg U75302 twice (3 and 5 

days after the cell injections) intraperitoneally. Mice were sacrificed 21 days after cell injections 

and the  lungs were removed and photographed, and then  lung tissues were stained with H&E. 

The arrowheads  indicate metastatic nodules. (c) In vivo metastatic potential evoked by H‐RasV12 

in  NIH3T3  cells. Mice were  injected with  NIH3T3‐HRasV12 cells  and  then  administered  DMSO 

(control) or 2.5 mg/kg LY255283 twice  (3 and 5 days after the cell  injections)  intraperitoneally. 

Mice were sacrificed 21 days after cell injections and the lungs were removed and photographed. 

9

The  number  of  lung  surface metastatic  nodules  and  the metastatic  tumor  burden were  then 

determined. n = 7 mice. *** p < 0.0001. 

 

Supplementary Figure 6. Up‐regulated BLT2 expression  in  invasive or metastatic human  cancer 

tissues. BLT1 and BLT2 expression was detected in 6 aggressive human tumor tissues (brain, skin, 

lung, breast, bladder, and  thyroid gland) by  immunohistochemical  staining, as described under 

Materials  and Methods.  Expression  of  BLT2,  but  not  BLT1, was  strongly  detected  as  a  dense 

purple color in the cytoplasmic area. The results shown are representative of three independent 

experiments. Bar, 100 μm. 

a

100 101 102 103 104

ControlNIH3T3NIH3T3-HRas V12

0

30

60

90

1

20

150

Cou

nts

FITC BLT2

100 101 102 103 104

ControlRat2Rat2-HO6Rat2-BLT2

0

20

40

6

0

80 1

20 1

40C

ount

s

FITC BLT2

H-Ras

pERK

ERK

BLT2

GAPDH

- 0.5 1 2 DNA(μg)H-RasV12

BLT2

GAPDH

Rat-2

Rat2

-HO6

NIH3

T3-H

-Ras

V12

BLT2

GAPDH

NIH-

3T3

- 0.5 1 2 DNA(μg) H-RasV12

H-Ras

pERK

ERK

BLT2

GAPDH

b

Kim et al, Supplementary Figure 1

c

Rat

-2

Rat

2-H

O6

Rat

2-B

LT2

Rel

ativ

e flu

ores

cenc

e in

tens

ity **

NIH

3T3

NIH

3T3-

HR

asV1

2

#

Rel

ativ

e flu

ores

cenc

e in

tens

ity

Rat2-HO6

*

Rat

2-B

LT2

Rat

-2

Rel

ativ

e In

tens

ity (D

CF)

DM

SO

+ LY

2552

83_U

7530

2

+ LY

2552

83

+ U

7530

2

a b

Rat-2

*

Rel

ativ

e In

tens

ity (D

CF)

- + - - + - pSIREN

- - + - - + siNOX1

Rat2-HO6

*

Rel

ativ

e In

tens

ity (D

CF)

Rat-2

- + - - + - pSIREN

- - + - - + siNOX1

Rat2-BLT2

**

Kim et al, Supplementary Figure 2

a

Rel

ativ

e A

P-1

Luc

Act

ivity

pcD

NA3

+ H

Ras

V12

+ B

LT1

+ B

LT2

b

Rel

ativ

e A

P-1

Luc

Act

ivity

LY25

5283

+ H-RasV12D

MSO

NS3

98

PDTC

+ pcDNA3

U75

302

LY25

5283

DM

SO

NS3

98

PDTC

U75

302

Kim et al, Supplementary Figure 3

a

Rel

ativ

e M

MP-

9 Lu

c A

ctiv

ity

Rat

-2

Rat

2-H

O6

Rat

2-B

LT2

*

b

Rel

ativ

e M

MP-

9 Lu

c A

ctiv

ity

** **

-

Buf

fer

SN-5

0M

SN-5

0

PDTC

-

Buf

fer

SN-5

0M

SN-5

0

PDTC

+ pcDNA3 + H-RasV12

**

Kim et al, Supplementary Figure 4

c

NIH3T3-HRasV12 cells injected

+ DMSO + LY255283

Num

ber o

f Lun

g N

odul

es

DM

SO

LY25

5283

***

Lung

wei

ght (

tum

or b

urde

n:g)

LY25

5283

DM

SO

Pare

nt g

roup

***

a

+ DMSO + LY255283 + U75302Rat2-BLT2 cells injected

+ U75302Rat2-HO6 cells injected

+ LY255283+ DMSO

b

Rat-2 cell injected+ DMSO + LY255283 + U75302

200 μm

Kim et al, Supplementary Figure 5

BrainNon-neoplastic tissue Glioblastoma

BLT

1

100 μm

BLT

2

SkinNon-neoplastic tissue Invasive squamous cell carcinoma

Papillary carcinoma

LungNon-neoplastic tissue Squamous cell carcinoma

BLT

1B

LT2

BreastNon-neoplastic tissue Infiltrating ductal carcinoma

BladderNon-neoplastic tissue Invasive urothelial carcinoma

BLT

1B

LT2

Thyroid glandNon-neoplastic tissue Metastatic papillary carcinoma

Kim et al, Supplementary Figure 6