PEMANFAATAN REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN

Suharsono- Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB

- Departemen Biologi, FMIPA, IPBE-mail: sony-sh@ipb.ac.id; sony@rcbio.org

1. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN TERHADAP SERANGGA

Metode:Mengekspresikan di tanaman gen penyandi:•insektisidal protoksin dari Bacillus thuringiensis•inhibitor α-amilase•inhibitor protease•lektin

GEN PENYANDI PROTOKSIN Bt

Ekspresi gen protoksin Bt di tanaman

PROTOKSIN Bt

Penggerek tongkol Penggerek batang Penggerek buah

•B. thuringiensis•beracun bagi:

•Lepidoptera (ngengat), •Diptera (lalat dan nyamuk), •Coleoptera (kumbang)

•tidak beracun pada mamalia dan biodegradable.

CARA MENINGKATKAN EKSPRESI•memotong gen (tersisa N-terminal)

98% ujung N: terkonservasiujung C bervariasipotong menjadi 646 aa ujung N dari 1156 aa

•menggunakan promoter kuat

Manduca sextaHeliothis zeaKeiferia lycopersicella

CARA LAIN MENINGKATKAN EKSPRESI Bt

1.Mutagenesis situs terarah (95.6% WT) 10 x 2.Modifikasi sekuen (78.9% WT) 100 x 3.Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida

transit + sekuen termodifikasi ekspresi di kloroplast (1% protein daun)

4. Introduksi gen protoksin ke kloroplast 2-3% protein daun

INTEGRASI GEN Bt DI KLOROPLAST

Keuntungan:1. Tidak ada modifikasi protoksin2. Jumlah kloroplast tiap sel banyak toksin tinggi3. Tidak ada resiko penyebaran gen melalui polen

Kerugian:•Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang tidak mempunyai kloroplast

PENCEGAHAN RESISTENSI SERANGGA TERHADAP Bt

•sebagai agen seleksi serangga resistenPencegahan:•Ekspresi pada waktu singkat (promoter terinduksi PR-1a pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat)•Fusi dengan gen toksin lain (inhibitor α-amilase)•Kombinasi dengan insektisida kimiawi dosis rendah•Strategi pengungsian (refugee) dengan 20% area non-transgenik. Serangga resisten di tanamantransgenik (80%) jumlahnya sedikit (99.9% mati) kawin dengan serangga sensitif di area 20% non-transgenik dilusi ketahanan

2. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN HERBISIDA

Tanaman resisten herbisida:1. Menghambat penyerapan herbisida2. Produksi berlebihan protein sasaran herbisida 3. Mengurangi kemampuan protein sasaran

mengikat herbisida4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme

EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)•substrat sintesis aa aromatik•sasaran herbisida glyphosateEkspresi EPSPS mutan E. coli di tanaman resistenterhadap glyphosate

CARA LAIN MERAKIT TANAMAN RESISTEN HERBISIDA

•Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi herbisida bromoxynile tanaman resisten•Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile) menghambat fotosintesis

TANAMAN RESISTEN TERHADAP BROMOXYNIL

3. PERAKIAN TANAMAN RESISTEN VIRUS

Resistensi alami:•mencegah transmisi virus•mencegah terbentuknya virus•mengatasi gejala virus

Rekayasa genetik:•Mencegah terbentuknya (perbanyakan) virus

MENCEGAH PERBANYAKAN VIRUS

• Sintesis protein pembungkus virusResisten terhadap TMV, CuMV, AMV, tobacco streak virus, tobacco rattle virus, PVX, PVY, tobacco etch virus

• Teknologi RNA antisense protein pembungkus CuMV

• Teknologi RNAi

EKSPRESI PROTEIN MANTEL VIRUS

Tanaman transgenik mengekspresikan protein mantel:•RNA sense resisten•dengan antisense resisten pada dosis virus rendah

Proteksi dengan protein mantel virus

Resistensi terhadap banyak virusProtein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus, WMV2 Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga virus

4. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN FUNGI DAN BAKTERI

ekspresi pathogenesis-related (PR) protein:β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat

•chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin N-acetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)

EKSPRESI ASAM SALISILAT DI TANAMAN•Resisten terhadap fungi dan bakteri•Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate synthase dan isochorismate lyase

5. PERAKITAN TANAMAN TOLERAN CEKAMAN DAN KEGUGURAN

Ekspresi Super Oksida Dismutase (SOD):•tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong)

Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase) (GST):•tahan garam, beku

Toleran terhadap cekaman garam/kering

•perlu osmoprotectant: gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain, 3-methylsulfoniopropionate

•ekspresi choline dehydrogenase (betA) betain

6. PENUNDAAN BUAH MASAK DAN BUNGA LAYU

Buah masak:•ekspresi polygalacturonase dan cellulase

ekspresinya dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda)

Bagaimana menghambat ekspresi?•RNA antisense thd gen penyandi•mengalihkan jalur sintesis enzim

MENGALIHKAN JALUR SINTESIS ETILEN

untuk menghambat sintesis etilen

ACC= amino cyclopropan carboksilik acid

Degradasi ACC sintesis etilen dihambat

7. MANIPULASI PIGMENTASI BUNGA

Antosianin (flavonoid) pigmen bungaChrysanthemum + cDNA CHS sense/antisense bunga putih

Astaxanthin:•pink (salmon, udang)•dari bakteri & mikroalga•mencegah telur rusak karena UV•meningkatkan daya hidup & laju tumbuh antioksidan

Produksi astaxanthin:-ekspresi cDNA β-caroten ketolase (β-C-4 oxygenase) alga hijau (Haematococcus pluvialis)

8. MODIFIKASI KANDUNGAN NUTRISI

memperbaiki:-kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji)-komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak-rasa buah dan sayuran

MENINGKATKAN KANDUNGAN LISIN

Over produksi lisin: menghentikan feedback inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase

ekspresi gen DHDPS lysin-feedback-insensitive dari Corynebacterium & AK lysin-feedback-insensitive dari E. coli dikendalikan promoter biji biji mengandung 2-5 x lisin

Kandungan lipid

Kanola transgenik: antisense gen stearate desaturase dari Brasicca akumulasi asam stearat(tidak menjadi asam oleat)

Vitamin AMamalia: β-carotene (provitamin A) vitamin Aβ-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik

Ekspresi β-carotene di beras via A. t:1: Phytoene synthase (psy)2: Lycopene b-cyclase (lcy)1+2 padi beras mengandung β-carotene shg berwarna kuning/emas

golden rice

9. MODIFIKASI RASA DAN TAMPILAN

Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/o-difenol o-quinon perubahan warna buah/sayuranPerubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase

Kentang:antisense polifenol oksidase

+p35S/pGBSS resisten thd black spotSense polifenol oksidase tidak tahan

Mencegah perubahan warna

PemanisMonellin: -Dioscoreophyllum cumminsii-3000 x lebih manis darpd sukrosa-Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen-Rusak oleh: panas, asam

Pemanis rendah kalori

Kandungan pati

Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati

Amilosa: ikatan α-1,4

Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6

Biosintesis pati

Glukan+glukan α-1,6 amilopektin

p35S + antisense startch branching enzyme amilosa naik: 28% 60-80%

Tanaman sebagai bioreaktor

Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)

Antibodi

Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah (produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000, tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang

Produksi biopolimer

Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA Alcaligenes eutrophus

Acetyl Co-A Acetoacetyl Co-A D-3-Hydroxybutyryl co-A PHA

Acetoacetyl Co-A reductase Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase3-ketothiolase

PHA: bioplastik, di A. eutrophus 1 operon tidak dikenal tanaman

ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana target ke kloroplast1 mg /g daun segar PHA

Mengubah kandungan ligninLignin:tinggi mutu pulp dan hijauan pakan rendahrendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase