APLIKASI REKAYASA GENETIKA TANAMAN - ordinary · PDF filePHA: bioplastik, di A....
Transcript of APLIKASI REKAYASA GENETIKA TANAMAN - ordinary · PDF filePHA: bioplastik, di A....
PEMANFAATAN REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN
Suharsono- Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB
- Departemen Biologi, FMIPA, IPBE-mail: [email protected]; [email protected]
1. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN TERHADAP SERANGGA
Metode:Mengekspresikan di tanaman gen penyandi:•insektisidal protoksin dari Bacillus thuringiensis•inhibitor α-amilase•inhibitor protease•lektin
GEN PENYANDI PROTOKSIN Bt
Ekspresi gen protoksin Bt di tanaman
PROTOKSIN Bt
Penggerek tongkol Penggerek batang Penggerek buah
•B. thuringiensis•beracun bagi:
•Lepidoptera (ngengat), •Diptera (lalat dan nyamuk), •Coleoptera (kumbang)
•tidak beracun pada mamalia dan biodegradable.
CARA MENINGKATKAN EKSPRESI•memotong gen (tersisa N-terminal)
98% ujung N: terkonservasiujung C bervariasipotong menjadi 646 aa ujung N dari 1156 aa
•menggunakan promoter kuat
Manduca sextaHeliothis zeaKeiferia lycopersicella
CARA LAIN MENINGKATKAN EKSPRESI Bt
1.Mutagenesis situs terarah (95.6% WT) 10 x 2.Modifikasi sekuen (78.9% WT) 100 x 3.Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida
transit + sekuen termodifikasi ekspresi di kloroplast (1% protein daun)
4. Introduksi gen protoksin ke kloroplast 2-3% protein daun
INTEGRASI GEN Bt DI KLOROPLAST
Keuntungan:1. Tidak ada modifikasi protoksin2. Jumlah kloroplast tiap sel banyak toksin tinggi3. Tidak ada resiko penyebaran gen melalui polen
Kerugian:•Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang tidak mempunyai kloroplast
PENCEGAHAN RESISTENSI SERANGGA TERHADAP Bt
•sebagai agen seleksi serangga resistenPencegahan:•Ekspresi pada waktu singkat (promoter terinduksi PR-1a pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat)•Fusi dengan gen toksin lain (inhibitor α-amilase)•Kombinasi dengan insektisida kimiawi dosis rendah•Strategi pengungsian (refugee) dengan 20% area non-transgenik. Serangga resisten di tanamantransgenik (80%) jumlahnya sedikit (99.9% mati) kawin dengan serangga sensitif di area 20% non-transgenik dilusi ketahanan
2. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN HERBISIDA
Tanaman resisten herbisida:1. Menghambat penyerapan herbisida2. Produksi berlebihan protein sasaran herbisida 3. Mengurangi kemampuan protein sasaran
mengikat herbisida4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme
EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)•substrat sintesis aa aromatik•sasaran herbisida glyphosateEkspresi EPSPS mutan E. coli di tanaman resistenterhadap glyphosate
CARA LAIN MERAKIT TANAMAN RESISTEN HERBISIDA
•Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi herbisida bromoxynile tanaman resisten•Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile) menghambat fotosintesis
TANAMAN RESISTEN TERHADAP BROMOXYNIL
3. PERAKIAN TANAMAN RESISTEN VIRUS
Resistensi alami:•mencegah transmisi virus•mencegah terbentuknya virus•mengatasi gejala virus
Rekayasa genetik:•Mencegah terbentuknya (perbanyakan) virus
MENCEGAH PERBANYAKAN VIRUS
• Sintesis protein pembungkus virusResisten terhadap TMV, CuMV, AMV, tobacco streak virus, tobacco rattle virus, PVX, PVY, tobacco etch virus
• Teknologi RNA antisense protein pembungkus CuMV
• Teknologi RNAi
EKSPRESI PROTEIN MANTEL VIRUS
Tanaman transgenik mengekspresikan protein mantel:•RNA sense resisten•dengan antisense resisten pada dosis virus rendah
Proteksi dengan protein mantel virus
Resistensi terhadap banyak virusProtein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus, WMV2 Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga virus
4. PERAKITAN TANAMAN RESISTEN FUNGI DAN BAKTERI
ekspresi pathogenesis-related (PR) protein:β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat
•chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin N-acetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)
EKSPRESI ASAM SALISILAT DI TANAMAN•Resisten terhadap fungi dan bakteri•Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate synthase dan isochorismate lyase
5. PERAKITAN TANAMAN TOLERAN CEKAMAN DAN KEGUGURAN
Ekspresi Super Oksida Dismutase (SOD):•tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong)
Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase) (GST):•tahan garam, beku
Toleran terhadap cekaman garam/kering
•perlu osmoprotectant: gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain, 3-methylsulfoniopropionate
•ekspresi choline dehydrogenase (betA) betain
6. PENUNDAAN BUAH MASAK DAN BUNGA LAYU
Buah masak:•ekspresi polygalacturonase dan cellulase
ekspresinya dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda)
Bagaimana menghambat ekspresi?•RNA antisense thd gen penyandi•mengalihkan jalur sintesis enzim
MENGALIHKAN JALUR SINTESIS ETILEN
untuk menghambat sintesis etilen
ACC= amino cyclopropan carboksilik acid
Degradasi ACC sintesis etilen dihambat
7. MANIPULASI PIGMENTASI BUNGA
Antosianin (flavonoid) pigmen bungaChrysanthemum + cDNA CHS sense/antisense bunga putih
Astaxanthin:•pink (salmon, udang)•dari bakteri & mikroalga•mencegah telur rusak karena UV•meningkatkan daya hidup & laju tumbuh antioksidan
Produksi astaxanthin:-ekspresi cDNA β-caroten ketolase (β-C-4 oxygenase) alga hijau (Haematococcus pluvialis)
8. MODIFIKASI KANDUNGAN NUTRISI
memperbaiki:-kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji)-komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak-rasa buah dan sayuran
MENINGKATKAN KANDUNGAN LISIN
Over produksi lisin: menghentikan feedback inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase
ekspresi gen DHDPS lysin-feedback-insensitive dari Corynebacterium & AK lysin-feedback-insensitive dari E. coli dikendalikan promoter biji biji mengandung 2-5 x lisin
Kandungan lipid
Kanola transgenik: antisense gen stearate desaturase dari Brasicca akumulasi asam stearat(tidak menjadi asam oleat)
Vitamin AMamalia: β-carotene (provitamin A) vitamin Aβ-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik
Ekspresi β-carotene di beras via A. t:1: Phytoene synthase (psy)2: Lycopene b-cyclase (lcy)1+2 padi beras mengandung β-carotene shg berwarna kuning/emas
golden rice
9. MODIFIKASI RASA DAN TAMPILAN
Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/o-difenol o-quinon perubahan warna buah/sayuranPerubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase
Kentang:antisense polifenol oksidase
+p35S/pGBSS resisten thd black spotSense polifenol oksidase tidak tahan
Mencegah perubahan warna
PemanisMonellin: -Dioscoreophyllum cumminsii-3000 x lebih manis darpd sukrosa-Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen-Rusak oleh: panas, asam
Pemanis rendah kalori
Kandungan pati
Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati
Amilosa: ikatan α-1,4
Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6
Biosintesis pati
Glukan+glukan α-1,6 amilopektin
p35S + antisense startch branching enzyme amilosa naik: 28% 60-80%
Tanaman sebagai bioreaktor
Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)
Antibodi
Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah (produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000, tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang
Produksi biopolimer
Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA Alcaligenes eutrophus
Acetyl Co-A Acetoacetyl Co-A D-3-Hydroxybutyryl co-A PHA
Acetoacetyl Co-A reductase Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase3-ketothiolase
PHA: bioplastik, di A. eutrophus 1 operon tidak dikenal tanaman
ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana target ke kloroplast1 mg /g daun segar PHA
Mengubah kandungan ligninLignin:tinggi mutu pulp dan hijauan pakan rendahrendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase