ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7Ο

ΕΙΣΑΓΩΓΗΣυνδυασμός Επιστήμης και ΤεχνολογίαςΣκοπός=παραγωγή προϊόντων από ζωντανούς

οργανισμούς σε ευρεία κλίμακα Σχετίζεται με τη χρήση ζωντανών οργανισμών προς

όφελος του ανθρώπου Συνεισφέρει σε διάφορους τομείς όπως: ιατρική,

γεωργία, κτηνοτροφία, βιομηχανία και προστασία του περιβάλλοντος

Στηρίζεται κυρίως σε:τεχνικές καλλιέργειας και ανάπτυξης μικροοργανισμώντεχνικές ανασυνδυασμένου DNA (με τις οποίες έχουμε

εισαγωγή επιθυμητών χαρακτηριστικών-ιδιοτήτων σε ζωντανούς οργανισμούς)

Μικροβιακές καλλιέργειεςΣημαντικό εργαλείο για τη ΒιοτεχνολογίαΟ ρυθμός ανάπτυξης ενός πληθυσμού

μικροοργανισμών, δηλαδή ο ρυθμός με τον οποίο διαιρούνται τα κύτταρα του, καθορίζεται από το χρόνο διπλασιασμού.

Για παράδειγμα, αν ένας μικροοργανισμός έχει χρόνο διπλασιασμού 20 λεπτά, θα έχουμε 2 κύτταρα σε 20 λεπτά, 4 κύτταρα σε 40 λεπτά κ.ο.κ.

Ο χρόνος διπλασιασμού (αντιστρόφως ανάλογος με το ρυθμό ανάπτυξης) είναι χαρακτηριστικός για κάθε μικροοργανισμό.

ΠΑΡΑΓΟΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΟ ΧΡΟΝΟ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥΙ) Η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών

(είδος θρεπτικών, συγκέντρωσή τους στην καλλιέργεια)

ΙΙ) Το pΗIII) Το O2

IV) Η θερμοκρασία (η οποία είναι από τους πιο σημαντικούς παράγοντες που καθορίζουν το ρυθμό ανάπτυξης)

Διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών (ή αλλιώς«χημική σύσταση του θρεπτικού μέσου»)

νερόπηγή άνθρακα

για τους αυτότροφους = CO2 της ατμόσφαιρας για τους ετερότροφους = διάφορες οργανικές

ενώσεις, όπως υδατάνθρακεςπηγή αζώτου (για τους περισσότερους

μικροοργανισμούς είναι τα νιτρικά ή τα αμμωνιακά ιόντα)

διάφορα μεταλλικά ιόντα

pΗ

Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε pΗ 6-9.

Εξαιρέσεις: τα βακτήρια του γένους Lactobacillus που αναπτύσσονται σε pΗ 4-5.

O2Αν οι μικροοργανισμοί για την ανάπτυξη τους

χρειάζονται το οξυγόνο σε υψηλή συγκέντρωση, τότε τους χαρακτηρίζουμε υποχρεωτικά αερόβιους, όπως τα βακτήρια του γένους Mycobacterium.

Αν οι μικροοργανισμοί δεν αναπτύσσονται παρουσία O2 (είναι δηλαδή τοξικό για αυτούς), τότε μιλάμε για υποχρεωτικά αναερόβιους, όπως τα βακτήρια του γένους Clostridium.

Αν οι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτύσσονται παρουσία O2 πιο γρήγορα από ότι απουσία O2, τότε μιλάμε για προαιρετικά αερόβιους, όπως οι μύκητες που χρησιμοποιούνται στην αρτοβιομηχανία.

θερμοκρασίαΟι περισσότεροι

μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες 20-45 °C (π.χ. η Escherichia coli στους 37 °C).

Μερικοί αναπτύσσονται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από 45 °C, όπως αυτοί που ζουν σε θερμοπηγές.

Μερικοί αναπτύσσονται σε θερμοκρασία μικρότερη των 20 °C.

Thermus aquaticusΠρόκειται για ένα θερμόφιλο

βακτήριο, το οποίο αναπτύσσεται κοντά σε θερμοπηγές, όπου η θερμοκρασία πλησιάζει τους 80°C.

Το βακτήριο αυτό χρησιμοποιείται για την παραγωγή μιας DNA πολυμεράσης (Taq πολυμεράση). Το ένζυμο αυτό είναι ενεργό μέχρι τους 95°C.

Η ιδιότητά του αυτή το κάνει κατάλληλο για χρήση στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).

Οι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν είτε στο εργαστήριο είτε σε βιομηχανική κλίμακα.

Για την καλλιέργεια μικροοργανισμών είναι απαραίτητη:1. η απομόνωση διάφορων ειδών βακτηρίων και

μυκήτων2. η παρασκευή κατάλληλων θρεπτικών μέσων και3. η διαμόρφωση κατάλληλων συνθηκών ανάπτυξης

Είδη καλλιεργειώνΕργαστηριακή καλλιέργεια (μικρής κλίμακας)Βιομηχανική καλλιέργεια (μεγάλης κλίμακας)Και στα δύο είδη καλλιέργειας οι συνθήκες είναι

αυστηρά ελεγχόμενες. Τα τεχνητά θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται για

την ανάπτυξη των μικροοργανισμών πρέπει να περιέχουν νερό, αλλά και:πηγή άνθρακαπηγή αζώτουμεταλλικά ιόντα.

Στη συσκευή όπου πραγματοποιείται η καλλιέργεια θα πρέπει να υπάρχει και Ο2, αν ο μικροοργανισμός είναι αερόβιος.

ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝΤα θρεπτικά υλικά μπορεί να είναι:

υγρά, στα οποία τα θρεπτικά συστατικά διαλύονται σε νερό.

στερεά, τα οποία παρασκευάζονται με την ανάμειξη υγρών θρεπτικών υλικών με έναν πολυσακχαρίτη που ονομάζεται άγαρ. Το άγαρ είναι στερεό σε θερμοκρασίες μέχρι 45 °C

και ρευστό από τη θερμοκρασία αυτή και πάνω.

ΔΗΛΑΔΗ: υγρό θρεπτικό + άγαρ = στερεό θρεπτικό

ΖύμωσηΥπό στενή έννοια, σειρά αντιδράσεων

μεταβολισμού των μικροοργανισμών κάτω από αναερόβιες συνθήκες. Αυτές έχουν ως αποτέλεσμα τη μετατροπή των οργανικών ενώσεων σε διάφορα προϊόντα, όπως αιθυλική αλκοόλη ή γαλακτικό οξύ.

Υπό ευρεία έννοια, ο όρος ζύμωση χρησιμοποιείται για να περιγράψει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες (αερόβιες ή αναερόβιες), μέσα σε υγρό θρεπτικό μέσο.

Προϊόντα ζύμωσηςΗ βιομάζα, δηλαδή τα ίδια τα κύτταρα ή/καιΤα προϊόντα των κυττάρων, όπως:

πρωτεΐνεςαλκοόλαντιβιοτικά.

Βήματα για την ανάπτυξη μικροοργανισμού στο εργαστήριο1. Παρασκευή θρεπτικών υλικών τα οποία περιέχουν πηγή

άνθρακα, πηγή αζώτου, μεταλλικά ιόντα και νερό (και άγαρ αν θέλουμε το θρεπτικό υλικό να είναι στερεό) και έχουν την επιθυμητή τιμή pΗ.

2. Αποστείρωση των συσκευών και του θρεπτικού υλικού που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν (για την αποφυγή ανάπτυξης άλλων μικροοργανισμών, εκτός εκείνων που πρόκειται να καλλιεργηθούν).

3. Εμβολιασμός, δηλαδή προσθήκη μικρής ποσότητας του μικροοργανισμού στο θρεπτικό υλικό.

4. Τοποθέτηση σε κλίβανο που εξασφαλίζει σταθερή θερμοκρασία κατάλληλη για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού.

5. Αναμονή για 12-76 ώρες προκειμένου να παραχθεί μεγάλος αριθμός μικροοργανισμών.

6. Χρήση ή/και κατάψυξη των καλλιεργειών στους -80°C, ώστε να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον.

Ανάπτυξη μικροοργανισμού σε βιομηχανική κλίμακαΓια τη βιομηχανική καλλιέργεια μικροοργανισμών

(καλλιέργεια σε μεγάλη κλίμακα) χρησιμοποιούνται:

1. κατάλληλες συσκευές που λέγονται βιοαντιδραστήρες ή ζυμωτήρες. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε αυτούς γίνεται πάντα

σε υγρό θρεπτικό υλικό. Οι συσκευές αυτές επιτρέπουν τον έλεγχο και τη ρύθμιση

των συνθηκών καλλιέργειας , δηλαδή: θερμοκρασίας pΗ συγκέντρωσης O2

2. φτηνές πηγές άνθρακα (μελάσα κ.λπ.) στο θρεπτικό υλικό

Βήματα για την ανάπτυξη μικροοργανισμού σε βιομηχανική κλίμακα

Τα βήματα για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε βιομηχανική κλίμακα είναι τα ακόλουθα:

1.Απομόνωση μικροοργανισμού και δημιουργία καλλιέργειας στο εργαστήριο.

2.Παρασκευή υγρού θρεπτικού υλικού που περιέχει φτηνή πηγή άνθρακα.

3.Ανάπτυξη και πολλαπλασιασμός των μικροοργανισμών.

ΕΙΔΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ

Οι μικροοργανισμοί μπορούν να καλλιεργηθούν με διαφορετικούς τρόπους. Δύο από τους τρόπους ζύμωσης που χρησιμοποιούνται είναι:α. η κλειστή καλλιέργεια και β. η συνεχής (ή ανοικτή) καλλιέργεια.

Κλειστή καλλιέργειαΟρισμένη ποσότητα αποστειρωμένου θρεπτικού

υλικού τοποθετείται στο βιοαντιδραστήρα.Γίνεται εμβολιασμός με την αρχική καλλιέργεια

μικροοργανισμών (δηλαδή την εργαστηριακή).Η καλλιέργεια συνεχίζεται μέχρι την παραγωγή

του επιθυμητού προϊόντος, χωρίς να προσθέτουμε ή να αφαιρούμε οτιδήποτε.

ΦΑΣΕΙΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΛΕΙΣΤΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ

ΦΑΣΕΙΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΛΕΙΣΤΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ (ΙΙ)1. Η λανθάνουσα φάση, κατά την οποία ο αρχικός

πληθυσμός των μικροοργανισμών (από τον εμβολιασμό) παραμένει σταθερός μέχρι να προσαρμοστεί στις νέες συνθήκες.

2. Στη συνέχεια έχουμε τη φάση της εκθετικής αύξησης, κατά την οποία οι μικροοργανισμοί πολλαπλασιάζονται με ταχύ ρυθμό (γιατί οι συνθήκες είναι άριστες).

3. Ακολουθεί η στατική φάση, στην οποία ο πληθυσμός των μικροοργανισμών παραμένει σταθερός, λόγω εξάντλησης κάποιου θρεπτικού συστατικού ή λόγω συσσώρευσης τοξικών προϊόντων από το μεταβολισμό των μικροοργανισμών.

4. Τέλος, υπάρχει η φάση θανάτου, όπου ο αριθμός των μικροοργανισμών σταδιακά μειώνεται.

Στην κλειστή καλλιέργεια ...Η διαδοχή (σειρά) των φάσεων είναι

συγκεκριμένη, όμως η χρονική διάρκεια κάθε φάσης ποικίλλει ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού.

Χρήσιμα προϊόντα παράγονται κατά τη διάρκεια της εκθετικής και της στατικής φάσης ανάπτυξης.

ΣΥΝΕΧΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

ΣΥΝΕΧΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣε αυτό τον τύπο καλλιέργειας:οι μικροοργανισμοί τροφοδοτούνται συνεχώς

με θρεπτικά συστατικά, ενώ ταυτόχρονα απομακρύνονται από την καλλιέργεια

κύτταρα και άχρηστα προϊόντα.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ = ο μικροοργανισμός μένει συνεχώς στην εκθετική φάση ανάπτυξης

Παραλαβή και καθαρισμός των προϊόντων της ζύμωσης

Το επιθυμητό προϊόν της ζύμωσης μπορεί να περιλαμβάνεται:στα υγρά συστατικά, όπως συμβαίνει με πρωτεΐνες,

ιντερφερόνες, αντιβιοτικά κ.λπ. που εκκρίνουν τα κύτταρα στην καλλιέργεια

στα στερεά συστατικά, αν θέλουμε τα κύτταρα ή συστατικά που βρίσκονται ενδοκυτταρικά και δεν εκκρίνονται.

Βήματα για την παραλαβή των προϊόντων της ζύμωσης1. Διαχωρισμός των υγρών από τα στερεά

συστατικά με:i. Διήθηση («φιλτράρισμα»)ii. Φυγοκέντρηση

2. Απομόνωση με τη χρήση κατάλληλων μεθόδων του επιθυμητού προϊόντος (π.χ. απομόνωση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από τα υγρά συστατικά).

3. Καθαρισμός του προϊόντος, δηλαδή απομάκρυνση των προσμείξεων με κατάλληλες τεχνικές, ώστε να μπορεί να αξιοποιηθεί.

Σύγκριση κλειστής – συνεχούς καλλιέργειας

ΚΛΕΙΣΤΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΥΝΕΧΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ1. Η τροφοδοσία της

γίνεται μια φορά στην αρχή της καλλιέργειας.

1. Η τροφοδοσία της είναι συνεχής.

2. Είναι διακριτά τα 4 στάδια ανάπτυξης του πληθυσμού των μικροοργανισμών.

2. Ο πληθυσμός των μικροοργανισμών βρίσκεται συνεχώς στην εκθετική φάση ανάπτυξης.

3. Παραμένουν στην καλλιέργεια τα παραπροϊόντα που μεταβολισμού, που είναι τοξικές ουσίες.

3. Τα τοξικά παραπροϊόντα του μεταβολισμού απομακρύνονται.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (Ι)Α) Ανάλογα με τη θερμοκρασία στην οποία αναπτύσσονται, τα βακτήρια

διακρίνονται σε:Ψυχρόφιλα (βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης: 13 °C, π.χ. διάφορα είδη του γένους

Pseudomonas)Μεσόφιλα (βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης: 39 °C, π.χ. Staphylococcus aureus)Θερμόφιλα (βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης: 60 °C, π.χ. Thermus aquaticus)Υπερθερμόφιλα (βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης: άλλα στους 88 °C και άλλα στους

105 °C, π.χ. Aquifex aeolicus) Β) Ανάλογα με τις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο διακρίνονται σε:Υποχρεωτικά αερόβια (π.χ. Mycobacterium)Υποχρεωτικά αναερόβια (π.χ. Clostridium)Προαιρετικά αερόβια (π.χ. Escherichia coli) Γ) Ανάλογα με το αν φέρουν ή όχι κάψα (π.χ. τα στελέχη του βακτηρίου

Diplococcus pneumoniae). Δ) Ανάλογα με το αν φέρουν ή όχι πλασμίδια Ε) Ανάλογα με την τιμή του pΗ στην οποία αναπτύσσονται διακρίνονται σε:Οξεόφιλα (π.χ. Lactobacillus)Βασεόφιλα (π.χ. Bacillus okhensis) 

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (ΙΙ)ΣΤ) Ανάλογα με την πηγή άνθρακα που χρησιμοποιούν διακρίνονται σε:Αυτότροφα (π.χ. φωτοσυνθετικά βακτήρια)Ετερότροφα (π.χ. τα βακτήρια που θεωρούνται ως φυσιολογική χλωρίδα του

ανθρώπινου δέρματος ή του εντέρου) Ζ) Ανάλογα με την παθογένεια διακρίνονται σε:Παθογόνα (π.χ. Mycobacterium tuberculosis)Δυνητικά παθογόνα (π.χ. Escherichia coli)Μη παθογόνα Η) Ανάλογα με τη σχέση τους με άλλους οργανισμούς διακρίνονται σε:Συμβιωτικά (π.χ. η μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου μας)Παρασιτικά (π.χ. τα είδη Mycobacterium που προκαλούν φυματίωση στον άνθρωπο)Ελεύθερα (π.χ. Νιτροποιητικά βακτήρια του εδάφους) Θ) Ανάλογα με την τροποποίηση του γενετικού τους υλικού διακρίνονται

σε:Φυσικά στελέχηΓενετικά τροποποιημένα στελέχη Ι) Ανάλογα με τη μορφή τους διακρίνονται σε:Βάκιλους (ραβδοειδές σχήμα)Κόκκους (σφαιρικό σχήμα)Σπειρύλλια (ελικοειδές σχήμα)

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ

ΘΕΜΑ 4O [2004, ΕΣΠΕΡΙΝΟ]Η παρακάτω καµπύλη αποδίδει την ανάπτυξη µικροοργανισµών του είδους

Escherichia coli σε κάποια κλειστή καλλιέργεια.Α. Πώς ονοµάζεται η φάση από τη χρονική στιγµή t0 έως και t1 και τι συµβαίνει

µε τον πληθυσµό των µικροοργανισµών; Μονάδες 5Β. Πού οφείλεται η αύξηση του αριθµού των µικροοργανισµών που παρατηρείται

στο διάστηµα από t1 έως t2 και πώς ονοµάζεται η φάση αυτή; Μονάδες 5Γ. Τη χρονική στιγµή t3, και ενώ η σταθερή (στατική) φάση είναι σχεδόν στο

µέσον της, από βλάβη στο βιοαντιδραστήρα η θερµοκρασία ανεβαίνει απότοµα στους 80 0C. Η βλάβη αποκαθίσταται ταχύτατα. Να ερµηνεύσετε τις µεταβολές του πληθυσµού των µικροοργανισµών από τη στιγµή t3 και µετά, όπως αυτές περιγράφονται από την καµπύλη ανάπτυξης. Μονάδες 15

ΘΕΜΑ 4O [2006, ΕΣΠΕΡΙΝΟ]Σε αποστειρωμένο θάλαμο καλλιεργειών όπου η θερμοκρασία έχει ρυθμιστεί

στους 35 οC έχουν τοποθετηθεί δύο φιάλες με καλλιέργειες μικροοργανισμών. Στη μία φιάλη καλλιεργείται ο μικροοργανισμός Α και στην άλλη ο μικροοργανισμός Β. Από τις φιάλες αυτές έχει απομακρυνθεί ο αέρας. O μικροοργανισμός Α έχει άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους 35οC, ενώ ο μικροοργανισμός Β τους 45 οC.

Τη χρονική στιγμή t1, για κάποιο λόγο, απομακρύνονται τα πώματα από τις φιάλες των καλλιεργειών και οι μικροοργανισμοί έρχονται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα.

 1. Με βάση το παραπάνω διάγραμμα, ποια είναι η αλλαγή που παρατηρείται στους πληθυσμούς των μικροοργανισμών Α και Β; Μονάδες 5

2. Να εξηγήσετε γιατί συμβαίνει η αλλαγή αυτή στον καθένα από τους δύο πληθυσμούς. Μονάδες 10

Στη χρονική στιγμή t2 η θερμοκρασία του θαλάμου καλλιέργειας αλλάζει στους 45 οC.

 α. Ποια θα είναι η επίδραση της αλλαγής αυτής στον πληθυσμό του μικροοργανισμού Α; Μονάδες 5

β. Ποια θα είναι η επίδραση της αλλαγής αυτής στον πληθυσμό του μικροοργανισμού Β; Μονάδες 5