ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ• Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη

Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

Ενότητες• Απομόνωση DNA, RNA• Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης• Περιοριστικά ένζυμα• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης • Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA• Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών• Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης• Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing)• BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών • Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα• Σύνθεση cDNA μορίων• Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR)• Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays)• Deep sequencing• Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση

PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον Kary Mullis in 1993

Αναλώσιμα

+ MgCl2

+ Buffer διάλυμα

+ dNTPs

+ Taq polymerase

+ εκκινητές

ηλεκτροφόρηση

χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου

Ένας χώρος χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση απολυμαντικών και UV•Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών!•Χρονικός χωρισμός!

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώ νονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται

• Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

PCR απαιτούνται:

• Magnesium chloride: .5-2.5mM

• Buffer: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polymerase: 1-2.5 units

• Target DNA: 1–10 μg/ml

ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS)

Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια GC = 40-6-% ομοιογενώς κατανεμημένα.

Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης... 1–10 μg/ml DNA.

… ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή

Τm Wallace formula: Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C

ΜgCl 2 απαραίτητο για την Taq polymerase!!!

Κινητική της αντίδρασης της PCR

ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR

Αντιδραστήρια PCR

συγκέντρωση Mg++

συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα

θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR.

•Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και 3mM

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών•Stock of primers: 100pmol/μl•Υποδιπλάσιες αραιώσεις:

50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl,6,25pmol/μl και 3,125pmol/μlγια κάθε έναν από τους εκκινητές.

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών

Π.χ.

Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών

•Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC

Π.χ.

Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2

Cloning and selection markers

Antibiotics

The problem of self ligation

-Need for additional selection markers

Generation of engineered restriction sites on plasmids on selectionmarkers

LacZ, Blue-white selection

+INSERT

LacZ, Blue-white selection

Applications of PCRBasic Research Applied Research

•Detection of pathogens•Pre-natal diagnosis•Cancer research-Mutation detection•Molecular Epidemiology

•Genotyping•Genomic cloning• Sequencing

+Real time PCR+cDNA synthesis and quantitative RT-PCR

Basic Research_Molecular cloning

Γονοτυπιση και Ταυτοποίηση γενομικου DNA

• Το γενομικό DNA περιέχει πολυμορφικές περιοχές που διαφέρουν μεταξυ των ατόμων.

• Οι πολυμορφικές περιοχές περιέχουν αλληλοχίες μικροδορυφορικου DNA. Το μικροδορυφορικό DNA (ή short tandem repeats STR) είναι μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες DNA, μήκους 1-6 bp

• Οι πολυμορφικές περιοχές πολλαπλασιάζονται με multiplex PCR, και τα παραγόμενα κομμάτια DNA διαχωρίζονται με βάση το μεγεθός τους. Το παραγόμενο μοτίβο (pattern) λειτουργεί σαν πλαίσιο ταυτοποίησης (unique barcode) ενός ατόμου.

Short tandem repeat

DNA FRAGMENT ANALYSIS

STR1

STR2 STR3

STR4

DNA-Based Human Identification

DNA detection of pathogens

Ανίχνευση DNA με τεράστια ευαισθησία ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε ενα βιολογικό δείγμα

• Το PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση βακτηριακών

• Το PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονίδια ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αντιβιοτικά

PRC diagnostics

Viruses • HIV, SARS, H5N1

Bacteria • meningococcus, legionellosis

Analysis for resistant genes • MRSA, VRE

RT-PCR can detect specific RNA sequences within a sample.Example: Retroviruses have an RNA genome. Retroviral RNA can be detected by RT-PCR to diagnose retroviral infections.

Detection Of Pathogens

Sensitivity of detection of PCR-amplified M. tuberculosis DNA. (Kaul et al.1994)

Molecular Identification:

Mutation detection

Genomic PCR amplification

Sanger Sequencing

Sanger sequencing

PCR_ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

cDNA synthesis

RECOMBINANT PROTEINS

Production of recombinant Insulin

T7 RNA Polymerase is an RNA polymerase from the T7 bacteriophage that catalyzes the formation of RNA in the 5'→ 3' direction.

pET System