ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

54
ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

description

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ. ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. - PowerPoint PPT Presentation

Transcript of ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Page 1: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Page 2: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ• Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη

Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

Page 3: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Ενότητες• Απομόνωση DNA, RNA• Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης• Περιοριστικά ένζυμα• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης • Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA• Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών• Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης• Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing)• BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών • Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα• Σύνθεση cDNA μορίων• Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR)• Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays)• Deep sequencing• Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων

Page 4: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση

PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον Kary Mullis in 1993

Page 5: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Αναλώσιμα

Page 6: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

+ MgCl2

+ Buffer διάλυμα

+ dNTPs

+ Taq polymerase

+ εκκινητές

ηλεκτροφόρηση

χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου

Page 7: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Ένας χώρος χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση απολυμαντικών και UV•Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών!•Χρονικός χωρισμός!

Page 8: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώ νονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται

• Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

Page 9: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

PCR απαιτούνται:

• Magnesium chloride: .5-2.5mM

• Buffer: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polymerase: 1-2.5 units

• Target DNA: 1–10 μg/ml

Page 10: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS)

Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια GC = 40-6-% ομοιογενώς κατανεμημένα.

Page 11: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 12: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης... 1–10 μg/ml DNA.

… ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή

Τm Wallace formula: Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C

ΜgCl 2 απαραίτητο για την Taq polymerase!!!

Page 13: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Κινητική της αντίδρασης της PCR

Page 14: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 15: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 16: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR

Αντιδραστήρια PCR

συγκέντρωση Mg++

συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα

θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)

Page 17: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR.

•Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και 3mM

Page 18: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών•Stock of primers: 100pmol/μl•Υποδιπλάσιες αραιώσεις:

50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl,6,25pmol/μl και 3,125pmol/μlγια κάθε έναν από τους εκκινητές.

Page 19: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών

Π.χ.

Page 20: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών

•Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC

Π.χ.

Page 21: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 22: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA

Page 23: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 24: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 25: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 26: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2

Page 27: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 28: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 29: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Cloning and selection markers

Antibiotics

Page 30: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

The problem of self ligation

-Need for additional selection markers

Page 31: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Generation of engineered restriction sites on plasmids on selectionmarkers

Page 32: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

LacZ, Blue-white selection

+INSERT

Page 33: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

LacZ, Blue-white selection

Page 34: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 35: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Applications of PCRBasic Research Applied Research

•Detection of pathogens•Pre-natal diagnosis•Cancer research-Mutation detection•Molecular Epidemiology

•Genotyping•Genomic cloning• Sequencing

+Real time PCR+cDNA synthesis and quantitative RT-PCR

Page 36: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Basic Research_Molecular cloning

Page 37: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Γονοτυπιση και Ταυτοποίηση γενομικου DNA

• Το γενομικό DNA περιέχει πολυμορφικές περιοχές που διαφέρουν μεταξυ των ατόμων.

• Οι πολυμορφικές περιοχές περιέχουν αλληλοχίες μικροδορυφορικου DNA. Το μικροδορυφορικό DNA (ή short tandem repeats STR) είναι μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες DNA, μήκους 1-6 bp

• Οι πολυμορφικές περιοχές πολλαπλασιάζονται με multiplex PCR, και τα παραγόμενα κομμάτια DNA διαχωρίζονται με βάση το μεγεθός τους. Το παραγόμενο μοτίβο (pattern) λειτουργεί σαν πλαίσιο ταυτοποίησης (unique barcode) ενός ατόμου.

Page 38: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Short tandem repeat

Page 39: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

DNA FRAGMENT ANALYSIS

STR1

STR2 STR3

STR4

Page 40: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

DNA-Based Human Identification

Page 41: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

DNA detection of pathogens

Ανίχνευση DNA με τεράστια ευαισθησία ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε ενα βιολογικό δείγμα

• Το PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση βακτηριακών

• Το PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονίδια ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αντιβιοτικά

Page 42: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

PRC diagnostics

Viruses • HIV, SARS, H5N1

Bacteria • meningococcus, legionellosis

Analysis for resistant genes • MRSA, VRE

RT-PCR can detect specific RNA sequences within a sample.Example: Retroviruses have an RNA genome. Retroviral RNA can be detected by RT-PCR to diagnose retroviral infections.

Page 43: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Detection Of Pathogens

Sensitivity of detection of PCR-amplified M. tuberculosis DNA. (Kaul et al.1994)

Molecular Identification:

Page 44: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Mutation detection

Page 45: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Genomic PCR amplification

Sanger Sequencing

Page 46: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Sanger sequencing

Page 47: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 48: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

PCR_ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

Page 49: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

cDNA synthesis

Page 50: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

RECOMBINANT PROTEINS

Page 51: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

Production of recombinant Insulin

Page 52: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

T7 RNA Polymerase is an RNA polymerase from the T7 bacteriophage that catalyzes the formation of RNA in the 5'→ 3' direction.

pET System

Page 53: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ
Page 54: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ  ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ