Proteína recombinante
β-Lactamasa
Procedimiento• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con
vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL)• Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD600 0.6-0.8• Apartar 1 mL (T0, Control negativo) e inducir el resto de
cultivo con IPTG 0.5 ó 1 mM (final)• Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30
min por 2 h.• Tomar 50 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar
(10 min a 95 ͦC). Cargar 25 µL y correr en SDS-PAGE.
Peculiaridades de la construcción:
• En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas:
• 1) β-lactamasa• 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la
membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) • Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-
lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis• Pero… al parecer esto sólo es teoría…
RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….
2h 1.5 h 1h 0
Después de la inducción
Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
cDNA
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original.
Proteínas recombinantes
Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria.....Estructura terciaria y cuaternariamodificaciones post-traduccionalesIncompatibilidad de codones.... depende de la complejidad de la proteína
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias:
fácil de cultivarfácil de modificar genéticamentetrabajo rápidoalto rendimiento (80%)ahorro de $$$$$
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Clonación de DNADecisiones a tomar…
•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
•Vector de clonación (vehículo)
•Organismo huésped •(E. coli)
Ajuste de condiciones
Vector híbrido o recombinante
Clonación/Síntesis de Genes
Optimización
OPERON LAC
Vector de clonación pET-24a(+)
Selección de bacterias transformadas
Leaking o Goteo
• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción
El sistema de expresión también debe tener las siguientes características en su genoma:
Cromosoma de E. coli
Análogos de lactosa
Diferencias entre DH5alfa y BL21(DE3)
• DH5 alfa: tiene al gen recA mutado, no puede realizarrecombinación heteróloga (asegura la estabilidad delinserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo ladigestión del plásmido. Esta cepa es competente para laselección de colonias azules y blancas.
• BL21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos alas proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasaT7 (cepa DE3) que se induce con IPTG.
Purificación de la proteína recombinante
Proteína GFP
Purificación de la proteína recombinante
https://www.youtube.com/watch?v=r2P1S_U3_pA
Clonación tradicional
Gateway cloning
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