Proteínas envolvendo oxigênio

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Cap. 3 Proteínas Envolvendo Oxigênio Objetivos Identificar as estruturas e as propriedades físico-químicas das metaloproteínas transportadoras de oxigênio Reconhecer a importância dessas metaloproteínas para os sistemas vivos

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Material didático das Aulas de Química BioinorgânicaUniversidade Federal de Santa CatarinaAno 2005Autor: Prof. Dr. Ademir Neves

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Page 1: Proteínas envolvendo oxigênio

Cap. 3 Proteínas Envolvendo Oxigênio

Objetivos

       Identificar as estruturas e as propriedades físico-químicas das metaloproteínas transportadoras de

oxigênio

       Reconhecer a importância dessas metaloproteínas para os sistemas vivos

Page 2: Proteínas envolvendo oxigênio

. Propriedades vibracionais e geométricas das espécies dioxigênio.

Espécie (O-O) (cm-1) d(O-O) (Å)

O2+ 1905 1,12

O2 1580 1,21

O2- 1097 1,33

O22- 802 1,49

Page 3: Proteínas envolvendo oxigênio

Diagrama ilustrando as mudanças estruturais e de estado de spin que ocorrem pela ligação do O2 na Fe-

porfirina. (a) Spin-alto FeII e (b) Spin-baixo FeIII.

Page 4: Proteínas envolvendo oxigênio

Dados termodinâmicos para a redução do O2 e

do grupo Heme

Reação Eo’ (V vs. NHE) 4H+ + O2 + 4e- 2H2O +0,82

2H+ + O2 + 2e- H2O2 +0,27

H+ + O2 + e- HO2 -0,45

Hb.(Fe3+) + e- Hb.(Fe2+) +0,17

Page 5: Proteínas envolvendo oxigênio

Principais proteínas envolvendo O2: Hemoglobina, hemeretrina, Galactose

Oxidase, Hemocianina, Tirosinase, Catecol oxidase

Page 6: Proteínas envolvendo oxigênio

Hemoglobina (Hb) e Mioglobina (Mb)

Mb armazena O2 no tecido celular enquanto que a Hb transporta O2 no

plasma sanguíneo. Mb e Hb ligam O2 no estado reduzido (FeII) e os

termos oxi- e deoxi-Mb e Hb se referem a proteína no estado oxidado e reduzido, com e sem oxigênio, respectivamente. O2 é um forte oxidante

em pH 7 ( Eo’ = +0,82 V ).

Page 7: Proteínas envolvendo oxigênio

Hemeretrina (Hr)

Se diferencia da Hemoglobina (Hb) e Mioglobina (Mb) por não apresentar grupos heme. É um

transportador de oxigênio em algumas classes de invertebrados marinhos como o Spinculids e

Golfingia gouldii

Sua afinidade pelo oxigênio é levemente menor quando comparada à Hemoglobina, e não é encontrada cooperatividade na reação de

oxigenação.

Page 8: Proteínas envolvendo oxigênio

Estrutura da forma azidomethemeretrina

Page 9: Proteínas envolvendo oxigênio

Estruturas propostas para as formas oxi e deoxi-Hr e um possível mecanismo para a sua interconversão.

Page 10: Proteínas envolvendo oxigênio

Galactose oxidase

(GAO) é uma metaloenzima mononuclear de cobre, secretada por alguns fungos, como o Dactyllium dendroids e o Polyporus circinatus,

que catalisa a oxidação de vários álcoois primários aos correspondentes aldeídos com a redução acoplada do oxigênio

molecular a peróxido de hidrogênio

A função fisiológica precisa da GAO até o momento não é bem clara, porém tem sido sugerido que o H2O2 produzido é aparentemente usado no processo de degradação de lignina.

RCH2OH+O2RCHO+H2O2 (1)

RCHO + H2O + O2RCO2H+H2O2 (2)

Page 11: Proteínas envolvendo oxigênio

apoenzima pH 7.0 (água)

pH 4.5 (acetato)

Page 12: Proteínas envolvendo oxigênio

Cu2+-Tir

+e--e- Cu2+-Tir

+e--e- Cu+-Tir (3)

(GAOox) (GAOsemi) (GAOred)

Formas UV-vis, ,() nm, M-1cm-1

RPEa

A// x10-4 cm-1

GAO ativa 444 (5194),810 (3211)b

GAO inativa 438 (1000),625 (1167)b

g// = 2,277,

g = 2,055,

A// = 175

GAO reduzidad

450 ( 500), 650 ( 500)d

Apo-GAO 450, 800e g = 2,0055f

Page 13: Proteínas envolvendo oxigênio

O

CuIIN

N O

O

S

Tir-272

H

H

Cis-228

Tir-495

His-581

His-496

OH

O2

H2O2

O

CuIIN

N O

O

S

CHR

H

H

RCH2OH H2O

(i)

(ii)

O

CuIIN

N O

O

S

CHRH

H

(iii)

OH

O

S

OC

H

CuIIN

N R

H

(iv)

CuIN

N

HO

S

RO

C

H

(v)

Mecanismo molecular proposto para a GAO

Page 14: Proteínas envolvendo oxigênio

Hemocianina (Hc)

A hemocianina é responsável pelo transporte de oxigênio em moluscos e artrópodes, sendo esta a metaloenzima de cobre do tipo III com mais

informações estruturais disponíveis na literatura. As formas oxidada e reduzida da hemocianina

tiveram suas estruturas resolvidas por difratometria de raios X.

Page 15: Proteínas envolvendo oxigênio

Estrutura cristalina do sítio ativo da deoxi-hemocianina (A) e oxi-hemocianina (B).

Distância CuI...CuI = 3.8 0.4 Å Distância CuII...CuII = 3,5 Å

Page 16: Proteínas envolvendo oxigênio

A atribuição do estado de oxidação do oxigênio está baseado em compostos modelo, principalmente no complexo [{Cu2[HB(3,5-iPr2C3HN2)3}2(O2)], (HB(3,5-

iPr2C3HN2) = hidridotris(3,5-diisopropil-1-pirazolil)borato) apresentado por Kitajima e colaboradores, e em estudos espectroscópicos da metaloenzima propriamente dita. As

técnicas de espectroscopia eletrônica, RPE, Raman ressonante e magnetoquímica comprovam que os dois

centros metálicos contém um íon peróxido coordenado em ponte na forma -2:.

A utilização de compostos modelo auxiliando na resoluçãodo sítio ativo da metaloenzima

Page 17: Proteínas envolvendo oxigênio

Estrutura de um modelo para a oxi-hemocianina; [{Cu2[HB(3,5-iPr2C3HN2)3}2(O2)]

Page 18: Proteínas envolvendo oxigênio

Normalmente, compostos de Cu(II): uma banda pouco intensa devido a transições d-d na faixa de 600-700 nm.

Espectro eletrônico da forma oxi-hemocianina é dominado por bandas intensas em torno de 345 nm (=20000 M-1 cm-1) e 570 nm (=1000 M-

1 cm-1) atribuídas a transições de transferência de carga do tipo ligante metal do íon peróxido para Cu(II).

Raman ressonante apresenta uma banda na região de 750 cm-1 atribuída ao estiramento vibracional O-O do íon peróxido coordenado.

Diamagnetismo devido ao forte acoplamento antiferromagnético entre

os dois íons Cu(II) (-2J > 600 cm-1), o que resulta em ausência no espectro de RPE.

Page 19: Proteínas envolvendo oxigênio

TirosinaseA tirosinase é uma monooxigenase encontrada em microorganismos,

plantas e animais que catalisa a hidroxilação de monofenóis a o-difenóis e a oxidação de catecóis a o-quinonas conforme mostrado abaixo:

F u n ç ã o d e c r e s o l a s e

O 2O H O H

O HA H 2

+ H 2 O + A

F u n ç ã o d e c a t e c o l a s e o u c a t e c o l o x i d a s e

O 2O H

O H

O

O

+ H 2 O2 2

Page 20: Proteínas envolvendo oxigênio

- Estrutura de raios-X para o sítio ativo da tirosinase não disponível.

- Comparações das propriedades RPE, UV-Vis,CD e RR da tirosinase com aquelas da hemocianina revelam grande

semilaridade, o que sugere que a tirosinase também contém no seu sítio ativo um composto binuclear de cobre que forma um

aducto estável com o íon peróxido.

- Estudos de EXAFS da tirosinase Neurospora crassa revelam uma distância metal-metal de 3,6 Å para a espécie oxi-tirosinase e 3,4 Å

para a forma met-tirosinase, respectivamente.

- A forma met-tirosinase, corresponde a uma espécie binuclear de cobre(II) que não contém o íon peróxido coordenado e é

caracterizada por transições fracas na região de 600-700 nm e pelo forte acoplamento antiferromagnético que leva a ausência no

espectro de RPE.

Page 21: Proteínas envolvendo oxigênio

Mecanismo proposto por Solomon et al.

N

Cu

O

N

N

O

OCu

N

N

O2

OH

deoxi

N

NCu

O

ON

2+Cu

oxi

CuN

NO

Cu

O

N

N

H+

OH

OO

NN

NCu

O

ON

Cu

H+

OHHO

OH

CuN

NCu

N

N

met

H2O

O O

+

H2O

O O

+

H+

3

OHHO

H+

2

H+

2

CuN

N+Cu

N

N +

2+

2+

2+

2+

2+

2+2+

2+ 2+

Page 22: Proteínas envolvendo oxigênio

Catecol Oxidase

Catalisa a oxidação de catecóis às correspondentes o-quinonas, sem apresentar

atividade sobre tirosinas. As quinonas resultantes são altamente reativas e se auto-

polimerizam formando o pigmento escuro melanina

Recentemente, as estruturas cristalinas das formas oxidada e reduzida da catecol oxidase

isolada da batata doce foram determinadas por cristalografia de raios X

Page 23: Proteínas envolvendo oxigênio

. Estrutura cristalina do sítio ativo da forma oxidada da catecol oxidase

Page 24: Proteínas envolvendo oxigênio

Forma oxidada: dois centros de Cu(II) com geometria pirâmide trigonal

CuII.....CuII = 2,9 Å. Forma reduzida: CuI...CuI = 4,4 Å, perda da ponte

hidróxido. CuB assume uma geometria quadrada planar com um sítio de coordenação livre.

Cu

O

Cu

H

NN

NN

N

N N

NNN

N

N

Cu

N

N

N

N

N

N OH H

N

N

Cu

NN

N N

CuII-OH-CuII CuI-CuI

Page 25: Proteínas envolvendo oxigênio

Mecanismo proposto para a oxidação de catecóis catalisada pela catecol oxidase. Os ligantes N-doadores

foram omitidos por clareza.

CuA(I)

H2O

CuB(I) CuA(II) CuB(II)

OH

HO OH

H2O

H+

-

-

O2+

O O

-

- H2O

+ 2 H+

HO OHO O

- H+

CuA(II) CuB(II)O

O

-

-

O-OH

Page 26: Proteínas envolvendo oxigênio

Modelos Estruturais Relevantes para Metaloenzimas de Cobre – Karlin et al

OO

Py

Py

Cu

Py

N

Py

Py

Cu

Py

N

Py

N Cu

Py

OO

Py

Cu N

Py

(CH2)n

(n=3-5)

=440 nm (=2000 M-1 cm-1), 525 nm (= 11500 M-1 cm-1), 590 nm (ombro, 7600 M-1 cm-1)CuII...CuII = 4,36 Å 1.3 Å comparado com tirosinase devido ao modo de coord. do peróxido

Cu...Cu = 3,37 Å), porém esta distância foi estimada por EXAFS e assim o modo de coordenação do peróxido não fica completamente esclarecido

Page 27: Proteínas envolvendo oxigênio

O2

N N

RR

CuIN N

RR

RR

NN

H B

N N

RR

H

NN

R R

CuII

O

O

R R

NNCuII

RR

N N

NN

RR

B

RR

NN

H B

R = fenil, isopropilModelo para a oxi-hemocianina

Oxi-hemocianina [{Cu2[HB(3,5-Pri2C3HN2)3}2(O2)]

Diamagnético Diamagnético

580 nm(1000 M-1cm-1), 340nm(20000 M-1 cm-1)

551 nm(790 M-1cm-1), 349nm(21000 M-1cm-1)

(O-O) = 744-752 cm-1 (O-O) = 741 cm-1

Cu...Cu = 3,5 – 3,7 Å Cu...Cu = 3,56 Å

Page 28: Proteínas envolvendo oxigênio

Modelo estrutural obtido por Neves et. Al (Inorg. Chem. Commun. 1999, 2, 334

para o intermediário tirosinase – fenol durante o processo de oxidação de

catecóis

C(34)

C(35)

C(33)

C(36)

N(32)C(23)

C(9)

C(31)

O(20)C(24)

C(22)

O(7)

C(8)C(43)

C(25)

C(44)

C(37)

O(6)

C(21)

Cu(2)

N(42)

C(26)

C(45)

C(27)

O(1)

Cu(1)

N(5)

C(41)

C(3)

C(46)

C(13)

N(12)

N(1)

C(47)

C(4)

C(14)

C(2)

C(11)

C(15)

C(17)

C(16)

Page 29: Proteínas envolvendo oxigênio

Complexos Dinucleares de Cobre como Modelos Estruturais e

Funcionais para as Catecóis Oxidases

Ademir Neves e Colaboradores em:

Inorg. Chem. Commun. 1999, 2, 334Inorg. Chem. 2002, 41, 1788-1794.

Page 30: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Planejamento dos ligantes e complexos

LIGANTES

COMPLEXOS BINUCLEARES DE COBRE(II)

O

NN

CuCu

Npy / O fenol

Npy N py

Npy / O fenol

NOH

N

N

N

N

OH

H2BTPPNOL

NOH

N N

N

OH OH

H3BBPPNOL HTPPNOL

N

N

NN

N

OHN

Page 31: Proteínas envolvendo oxigênio

H3BBPPNOL: N,N’-bis(2-hidroxibenzil)-N,N’-bis(2-piridilmetil)-2-ol-1,3-propanodiamina

+CHO

OH

MeOH

NaBH4

MeOH

H3BBPNOL

2-OH-SALPN

2

H H

NH2H2N

OH

OH

N

OH OH

N

OH

N

OH

N

OH

OH

N

OH

N

OH

H3BBPNOL

NOH

NN+ Cl.HCl H2O

(Et)3N

2N

N

OH OH

H3BBPPNOL

Neves, A. ; Erthal, S. M. et al. Inorg. Chim. Acta 1992, 197,121.

CAPÍTULO 3 - Síntese dos ligantes

Page 32: Proteínas envolvendo oxigênio

H2BTPPNOL: N-(2-hidroxibenzil)-N,N’,N’-tris(2-piridilmetil)-2-ol-1,3-propanodiamina

CAPÍTULO 3 - Síntese dos ligantes

NH2NH2.H2SO4Et3N

EtOH/H2O1

HCl2

)

)

OH

CHO

1)

2)

MeOH

NaBH41)

2)

N

NHN

N

O

O

OH

NH2

OH

NHOH

NCl.HCl

MeOH/ OHN

NN

NN

HO

H2btppnol

base

O

ClNK

O

O

+N

O

OO

N

NN

N

NN

OH

N

NN

(A)

(B)(C)

(D)

T=130ºC

MeOHrefluxo

HAYASHI, Y. et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 11220.

Page 33: Proteínas envolvendo oxigênio

HTPPNOL: N,N,N’,N’-tetraquis(2-piridilmetil)-2-ol-1,3-propanodiamina

Chan, M. K., Armstrong W. H J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 9121.

N

N

OHNN

+ Cl.HCl H2O

N

HTPPNOL

OH

H2N NH24

NaOH N N

CAPÍTULO 3: Síntese dos ligantes

Page 34: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Síntese dos complexos

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(H2O)2]Cl2.2H2O (1)

Analise elementar de CHN para C31H38N4O7Cl2Cu2.2H2O:

Calculado: C, 45.92; H, 5.22; N, 6.91.

Encontrado: C, 45.80; H, 5.31; N, 6.76.

Condutividade molar = 180 -1 cm2mol-1.

Bandas no IV / cm-1: (O-H) 3358; a(COO-) 1564; s(COO-) 1458; (C=N, C=C) 1610,

1502, 1444; (O-H) 1384; (C-O) 1268; (C-H Arom.) 756.

(C2H5)4NCl.H2O

H2OH2O

Cu CuO

NN

O ON

O

N

OH H

2+

(Cl-)2H3BBPPNOLCu(CH3COO)2.H2O

MeOH

Page 35: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Síntese dos complexos

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(-ClO4)]ClO4· H2O·EtOAc (2)

CH3COONa.3H2O

OH

Cu CuO

NN

N N

OH

O O

O O

Cl

O O

MeOH

Cu(ClO4)2.6H2OH3BBPPNOL

+

ClO4-

Analise elementar de CHN para C35H44N4O16Cl2Cu2:

Calculado: C, 43.13; H, 4.55; N, 5.75.

Encontrado: C, 43.11; H, 4.63; N, 5.68.

Condutividade molar = 306 -1 cm2mol-1.

Bandas no IV / cm-1: (O-H) 3386; a(COO-) 1562; s(COO-) 1458; (C=N, C=C)

1612, 1446; (O-H) 1384; (C-O) 1264; (ClO4-) 1112, 1080; (C-H Arom.) 762.

Page 36: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 Síntese dos complexos

[Cu2(Hbtppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (4)

NaClO4

H2BTPPNOL Cu(CH3COO)2.H2O

Cu CuO

NN

N

OH N

NOO MeOH

2+

(ClO4-)2

Análise Elementar de CHN para Cu2C30N5O12H33Cl2:

Calculado: C: 42,21%; H: 3,90%; N: 8,20%.

Encontrado: C: 41,49%; H: 3,88%; N: 8,13%.

Condutividade molar = 306 -1 cm2mol-1.

Bandas no IV / cm-1: (O-H) 3240; a(COO-) 1554; s(COO-) 1442; (C=N, C=C) 1610,

1506, 1482; (O-H) 1368; (C-O) 1264; (ClO4-) 1092; (C-H Arom.) 764.

Page 37: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Síntese dos complexos

[Cu2(tppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (5)

NaClO4

HTPPNOL Cu(CH3COO)2.H2O

Cu CuO

NN

N

N

N

NOO MeOH

2+

(ClO4-)2

Análise Elementar de CHN para Cu2C29N6O11H32Cl2:

Calculado: C: 41,54%; H: 3,85%; N: 10,02%.

Encontrado: C: 41,66%; H: 3,92%; N: 10,54%.

Condutividade molar = 300 -1cm2mol-1.

Bandas no IV / cm-1: (O-H) 3426; a(COO-) 1556; s(COO-) 1448; (C=N, C=C)

1606, 1476; (C-O) 1264; (ClO4-) 1088; (C-H Arom.) 768.

MURTHY, N. N., KARLIN, K. D., BERTINI, I. et al.J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 2156

Page 38: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Estrutura Cristalina do Complexo (1)

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO) (H2O)2]Cl2.2H2O (1)

Sistema Cristalino: MonoclínicoGrupo Espacial:P21/c Dimensões da cela unitária: a = 15,050(3) Å, b = 22,447(5) Å, c = 11,843(2) Å

= = 90 º, = 100,71(3)º

Cu(1)-O(5) 1,885(8) Å

Cu(1)-O(3) 1,947(10) Å

Cu(1)-N(31) 1,993(11) Å

Cu(1)-N(1) 2,024(11) Å

Cu(1)-O(1) 2,433(10) Å

Cu(1)-O(1W) 2,695(17) Å

Cu(1)-Cu(2) 3,40 Å

Cu(1)-O(5)-Cu(2) 127,9º

R1 = 9,15%e wR2 = 31,88%

C23

C24

C2

C22

C1

C13

C25

C7

C14

C12

C6

C5

C21

N2

C26

C4

N1

O2

C15

C11

C3

O1

C16

O5

C42 C43

Cu2Cu1

C32

N41

C33

C44

N31

C46

O4

O1W

C45

O2W

O3

C34

C8C36

C35

C9

Page 39: Proteínas envolvendo oxigênio

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO) (H2O)2]Cl2.2H2O (1)

sólido 663nmágua 664 nm ( =193 M-1 cm-1) acetonitrila 669 nm ( =364 M-1 cm-1) 448 nm ( =285 M-1 cm-1)

Espectro Eletrônico

Espectro de RPE

H2OH2O

Cu CuO

NN

O ON

O

N

OH H

g|| = 2,235g= 2,062A|| = 185 x 10-4 cm-1

2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600

-4000

-3000

-2000

-1000

0

1000

2000

3000

Inte

nsid

ade

Campo [G]

Espectros de RPE ( espectro experimental e espectro simulado) do complexo (1) em acetonitrila a 77 K.

g|| > g > 2,04

geometria octaédrica alongada ou piramidal de base quadrada

CAPÍTULO 3: Caracterização do Complexo (1)

Page 40: Proteínas envolvendo oxigênio

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO) (H2O)2]Cl2.2H2O (1)

Propriedades MagnéticasH2OH2O

Cu CuO

NN

O ON

O

N

OH H

J = -25 cm-1

g = 2,1xp = 5,7 %

Acoplamento antiferromagnético

CAPÍTULO 3: Caracterização do Complexo (1)

0 50 100 150 200 250 300 350

2000

4000

6000

8000

10000

[ 1

0-6 c

m3 /

mol

]

T [ K ]

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

eff

[B ]

Page 41: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Estrutura Cristalina do Complexo (4)

[Cu2(Hbtppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (4)

Sistema Cristalino: MonoclínicoGrupo Espacial:P21 Dimensões da cela unitária: a=13,127(3) Å, b=14,134(3) Å, c=19,120(4) Å = = 90 º, = 102,48(3)º

Cu(2)-N(32) 2,211(12) Å

Cu(1)-O(1)-Cu(2) 130,4(5)º Cu(1)-Cu(2) 3,425(3)Å

C(34)

C(35)

C(33)

C(36)

N(32)C(23)

C(9)

C(31)

O(20)C(24)

C(22)

O(7)

C(8)C(43)

C(25)

C(44)

C(37)

O(6)

C(21)

Cu(2)

N(42)

C(26)

C(45)

C(27)

O(1)

Cu(1)

N(5)

C(41)

C(3)

C(46)

C(13)

N(12)

N(1)

C(47)

C(4)

C(14)

C(2)

C(11)

C(15)

C(17)

C(16)

Cu...Cu = 3,5 – 3,7 Å – na Hc

Page 42: Proteínas envolvendo oxigênio

sólido 676nm; 928 nmágua 680 nm ( =175 M-1 cm-1) ; 912 nm ( =179 M-1 cm-1) acetonitrila 687 nm ( =179 M-1 cm-1); 858 nm ( =146 M-1 cm-1);

428 nm ( = 61M-1 cm-1)

Espectro Eletrônico

Espectro de RPE

g|| = 2,135g= 2,040A|| = 130 x 10-4 cm-1

Espectros de RPE ( espectro experimental e espectro simulado) do complexo (4) em acetonitrila a 77 K.

g|| > g > 2,04

geometria octaédrica alongada ou piramidal de base quadrada

CAPÍTULO 3: Caracterização do Complexo (4)

[Cu2(Hbtppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (4)

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500-4000

-3000

-2000

-1000

0

1000

2000

3000

Inte

nsid

ade

Campo [G]

Cu CuO

NN

N

OH N

NOO

Page 43: Proteínas envolvendo oxigênio

Propriedades Magnéticas

J = + 18,4 cm-1

Jinter = -2,3 cm-1

g = 2,1

Acoplamento ferromagnético

CAPÍTULO 3: Caracterização do Complexo (4)

[Cu2(Hbtppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (4)

O O

O

Sobreposição dos orbitais magnéticos para o complexo (4) mostrando a natureza não-complementar das interações.

dx2-y2 dz2

dx2-y2

dz2

dxy

dxz, dyz

D4hOh

Octaédrico Octaédrico distorcido(alongado)

Bipirâmide trigonal

dz2

dxy,dx2-y2

dxz, dyz

D3h

Piramidal base quadrada

C4V

dxz, dyz

dxy

dz2

dx2-y2

0 50 100 150 200 250 300

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

[1

0-6 c

m3 /

mo

l]

T [K]

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

eff [ B

]

Page 44: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Complexo (5)

[Cu2(tppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (5)

Cu Cu

O

O ON

N

NN

N

N

MURTHY, N. N., KARLIN, K. D., BERTINI, I. et al.J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 2156

Cu(1)-O(1)(alcooxido) 1,898 Å

Cu(1)-O(2)(acetato) 1,935 Å

Cu(1)-N(1) 2,029 Å

Cu(1)-N(2) 2,007 Å

Cu(1)-N(3) 2,157 Å

Cu(1)-Cu(2) 3,417 Å

Cu(1)-O(1)-Cu(2) 128,8º

MURTHY, N. N., KARLIN, K. D comunicação pessoal

Page 45: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Eletroquímica

Potenciais de redução, em V vs. NHE, para os complexos (1) a (5).

Complexo Ered1 a Ered2 b (E)1,2 c

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(H2O)2]Cl22H2O (1) -0,527 -0,713 0,186

[Cu2(H2bbppnol)(- CH3COO)(-ClO4)]ClO4H2OEtOAc (2) -0,458 -0,742 0,284

[Cu2(Hbbppnol)(H2O)4](ClO4)2 2CH3OH (3) -0,559 -0,677 0,118

[Cu2(Hbtppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (4) –0,89 V –1,11 0,220

[Cu2(tppnol)(-CH3COO)](ClO4)2 (5) –0,615 V –0,917 0,302

a refere-se ao processo Cu(II)-Cu(II) Cu(II)-Cu(I); b refere-se ao processo Cu(II)-Cu(I) Cu(I)-Cu(I);c (E)1,2 = (Ered2 – Ered1)

Page 46: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Estudos de Equilíbrio Químico

Hn-1C + H+ HnC Ka1 = [H2C]/[HC][H+] Ka2 = [HC]/[C][H+]

Curva de distribuição das espécies para o complexo (1) em função de –log[H+] para uma solução aquosa contendo 1 x 10-3 M de complexo.

Tabela 2 – Valores dos log das constantes de protonação (pKa) para os complexos (1), (4) e (5), T = 25ºC e 0,100M KCl.

Espécies em solução aquosa pKa1 pKa2

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(H2O)2]Cl2 (1) 5,70 7,42

[Cu2(Hbtppnol)(- CH3COO)(H2O)2 ](ClO4)2 (4) 6,32 7,96

[Cu2(tppnol)(- CH3COO)(H2O)2](ClO4)2 (5) 6,82 8,15

%

Page 47: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3: Estudos de Equilíbrio Químico

2.15 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.455.6

6.0

6.4

6.8

7.2

7.6

8.0

8.4

pKa

Distância (Cu-Ligante axial) média (A)

Correlação entre os valores de pKa e as distâncias médias Cu-ligante axial para os complexo (1), (4) e (5).

(1)

(4)(5)

H2OH2O

Cu CuO

NN

O ON

O

N

OH H

Cu CuO

NN

N

OH N

NOO

H2OH2O

H2O H2O

Cu CuO

NNN

N

N

NOO

Complexo (1)

Complexo (4)

Complexo (5)

pKa1 = 5,70pKa2 = 7,42

pKa1 = 6,32pKa2 = 7,96

pKa1 = 6,82pKa2 = 8,15

Page 48: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Conclusões

Os ligantes empregados mostraram-se capazes de formar complexos binucleares de cobre(II) que servem de modelos estruturais para metaloenzimas de cobre tipo III:

simulam a distância metal-metal de 3,4 Å da forma met das enzimas;

apresentam a coordenação axial de grupo fenol protonados a centros de cobre(II) e representam os primeiros modelos estruturais para a coordenação axial do substrato fenólico a um dos centros de cobre sugerido quando a enzima tirosinase desempenha a função de cresolase;

Os complexos são capazes de fornecer grupo nucleófilo (OH), através da desprotonação das moléculas de água coordenadas ao metal, a pH próximo da neutralidade, sendo adequados para estudos de reatividade e podendo servir de modelos para metaloenzimas hidrolíticas;

Os complexos são adequados para o estudo de reatividade frente a substratos que necessitem da ação cooperativa de dois centros metálicos a distâncias em torno de 3 Å, p. ex. catecol.

Page 49: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Modelos funcionais para hemocianina, tirosinase e catecol oxidase

– ATIVIDADE CRESOLASE DA ENZIMA TIROSINASE: hidroxilação de anéis benzênicos que fazem parte do ligante ou de substratos contendo a função fenol

N

N

N

CuI

N

CuI N

N

O-

COOMe

CuI N

N

N

N

N

CuI

N

O

COOMe

O2

O

COOMe

CuI N

N

N

N

N

CuI

NO2

- OH-

COOMe

OO N

NCuIICuII

N

N

NN

2+ +

2++

N

N

Py

PyCuI

PyPyCuI

O2

Py

PyN

Cu

O

Cu

NPy

PyOHCu

Py Py

N N

PyPyCu

(O2)

N

N

Py

Py

PyPy

OH

II II

Karlin, K. et al J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 2121 Casella, L. et al Inorg. Chem. 1996, 35, 7516

Page 50: Proteínas envolvendo oxigênio

– ATIVIDADE CATECOLASE DAS ENZIMAS TIROSINASE E CATECOL OXIDASE: oxidação de substratos com a função catecol

+

HO

HO

+

HO

HO

Cu .....Cu2+ 2+

met

Cu .....Cu2+ 2+

met

+ Cu .....Cu+ +

deoxi

O

O

O

O

+

O

Cu CuO

oxi

Reação modelo + O2

OH

OH O

O

CAPÍTULO 3 - Modelos funcionais para hemocianina, tirosinase e catecol oxidase

Page 51: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO

SÍNTESE DO COMPLEXO DE Cu(I) E INTERAÇÃO COM OXIGÊNIO

marromverde

TA

Argônio

EtCN[Cu(CH3CN)4]ClO4+H2BTPPNOL

+

ClO4-

O2 / -80ºC ou TA

Cu CuO

NN

N

OH N

N(O2)

+

ClO4-

Cu CuO

NN

N

OH N

N

CH3CNCH3CN

2+

(ClO4-)2Cu Cu

O

NN

N

OH N

NOH H2O

Complexo (6)

Page 52: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Síntese do complexo de Cu(I) e interação com oxigênio

400 500 600 700 800 9000.0

0.5

1.0

1.5

Cu(II)O2

2-

verde

marrom

Abs

orbâ

ncia

/ nm

2400 2600 2800 3000 3200 3400-1000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

giso

= 2,1071

marrom

Inte

nsid

ade

Campo [G]

2400 2600 2800 3000 3200 3400-800

-600

-400

-200

0

200

400

verdeInte

nsid

ade

Campo [G]

Espectros de RPE em CH3CN a 77K. Espectros eletrônicos em EtCN a TA.

giso = 2,1071

g|| = 2,192; g= 2,085; A|| = 124 x 10-4 cm-1)

TA

(amarelo)(marrom)

(verde)

Complexo (6)

H2OOHN

NOH

N

N N

OCuCu (ClO4

-)2

2+

-80ºC ou TA

O2

(O2) N

NOH

N

N N

OCuCu

ClO4-

++

ClO4-

Cu CuO

NN

N

OH N

N

CH3CNCH3CN

Page 53: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Resultados e Discussão

OXIDAÇÃO DO SUBSTRATO 3,5-DI-TERC-BUTILCATECOL POR COMPLEXOS BINUCLEARES DE COBRE(II)

+ O2

OH

OH O

O

400 nm (=1900 M-1cm-1)

EFEITO DO pH NA REAÇÃO DE OXIDAÇÃO

Dependência da taxa de reação com o pH para a oxidação do 3,5-DtBC catalisada pelo complexo (1).

300 400 500 600 700 8000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Abs

, nm

Espécies pKa1 pKa2 pKacinético

[Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(H2O)2]Cl2 (1) 5,70 7,42 7,8 0,1

[Cu2(Hbtppnol)(- CH3COO)(H2O)2 ](ClO4)2 (4) 6,32 7,96 8,1 0,1

[Cu2(tppnol)(- CH3COO)(H2O)2](ClO4)2 (5) 6,82 8,15 8,2 0,1

3,5-DtBC1 10,35 14,71 TYSON, C. A., MARTELL, A. E. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 3379 - 3386

4 5 6 7 8 9

0.0

1.0x10-7

2.0x10-7

3.0x10-7

4.0x10-7

v 0 (M

s-1)

pH

Page 54: Proteínas envolvendo oxigênio

CAPÍTULO 3 - Oxidação do substrato 3,5-di-terc-butilcatecol por complexos binucleares de cobre(II)

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO NA REAÇÃO DE OXIDAÇÃO

Dependência da velocidade de reação com a concentração de 3,5-DtBC para as reação de oxidação catalisadas pelos complexos binucleares de cobre(II): () 1, () 2, () 3, () 4, () 5 e () branco . As reação foram realizadas em metanol saturado com O2 / tampão aquoso TRIS pH 8,0 (30:1), [c] = 2,4 x 10-5 M, [3,5-DtBC] = 3,0 x 10-4 a 9,0 x 10-3 M a 25ºC.

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

0.0

2.0x10-8

4.0x10-8

6.0x10-8

8.0x10-8

1.0x10-7

1.2x10-7

1.4x10-7

1.6x10-7

1.8x10-7

2.0x10-7

2.2x10-7

2.4x10-7

2.6x10-7

v o (M

s-1)

[3,5-DtBC] (M)

Eq. Michaelis-Menten

v = Vmáx [S] / (Km + [S])

1/v = Km/Vm[S] + 1/Vmax

Page 55: Proteínas envolvendo oxigênio

Parâmetros cinéticos para a oxidação do 3,5-DtBC catalisada por complexos binucleares de cobre(II)

Complexo Vmáx (M s-1) Km (M) Kass (=1/Km)(M-1) kcat (s-1) kcat/KM (M-1 s-1)

(1) 1,9 x 10-7 7,9 x 10-4 1,3 x 103 0,0079 10

(2) 1,4 x 10-7 8,4 x 10-4 1,2 x 103 0,0057 6,7

(3) 4,4 x 10-8 3,9 x 10-4 2,6 x 103 0,0018 4,7

(4) 1,9 x 10-7 9,5 x 10-4 1,0 x 103 0,0078 8,1

(5) 6,7 x 10-8 8,6 x 10-4 1,2 x 103 0,0028 3,3

Correlação entre parâmetros

cinético: k2 (=kcat/KM): eficiência catalítica

eletroquímico: (E)1,2 (= E(red)1 – E(red)2)

estrutural: distância média Cu-ligante axial para os complexos (1), (4) e (5). 0.18 0.20 0.22 0.24 0.26 0.28 0.30 0.32

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

k cat/K

M (

M-1 s

-1)

( E)1,2

(V vs. NHE)

2.05

2.10

2.15

2.20

2.25

2.30

2.35

2.40

2.45

(5)

(4)

(1)

Dis

tân

cia

(C

u-l

iga

nte

axi

al)

dia

(A

)

Page 56: Proteínas envolvendo oxigênio

PROPOSTA DE MECANISMO PARA A REAÇÃO DE OXIDAÇÃO

CAPÍTULO 3 - Oxidação do substrato 3,5-di-terc-butilcatecol por complexos binucleares de cobre(II)

O

O

N

N N

OCuCu

OH

N

OHII II

N

N N

OCuCu

OO

N

OH

O2

II

pH 8

HO OH

Complexo (1)

H2OH2O

Cu CuO

NN

N

OH

N

OH

O O

OH

O O

OH

OHII II

Cu CuO

NN

N

OH

N

OH

OH2 OH2

OAc-