Act a hi st.oohem. B d. 63 , S. 80 -88 (1978)

Anatom isch es Insti tut des Bereich es Medizin (Charit e)

del' Humboldt-Univer sit.at zu Berlin

(Komm, Direktor : Prof. Dr. sc, m ed, J . STAUDT)

Zur Spezifitat des fluorescenzhistochemischen Nachweisesder y-Aminobuttersaure (GABA)

Some notes on the specifity of the fluorescencehistochemical demonstration of GADA

Von CLAUS PFI STER und RAINER GORNE

Mit 2 Abbildungen

(Eingegangen am 20. April 1978)

Zusammenfassung

~Iit einer Modifik a ti on del' fluorescen zhistoch emi sch en Method e n ach ' V OL MAK (1971) wurde

die Vertei lung de l' GA BA in de n Purkinje-Zellen des R a ttencereb ellum dargestellt. Drei Purk in je­

Zell typen m it un terschiedl icher Inten sit iit und T op ik de l' "GABA-F luorescenz" wurden gefunden,

Durch ph arm akologisch e Vorbehandlung konnte di e "GABA -F lu orescenz" deutlich beeinflu13t

werden: I soni cotinaaurehydrazid, Penicillamin und Chlorprom azin fuhren zu einer Granulierung

des normal er weise homogenen F luorescenzproduktes und zu seine r eindeuti ge n Verminderung.

Summary

The dist ri bution of th e GA BA in the Purkinje cells of the ra t cerebe llum was demonstra t ed by

means of m odified fluorescence histo ch emical m ethod accord ing to ·W OLMAN (1971). Three types of

Purkinje cells , with resp ect to their fluorescence inten sit y and GA B A di st ribut ion , were ev ident.The GABA·fluo res cence was striking ly by ph armacological pretrea tment. I soni cot in ic acid hy dra zide ,

P enicillamine and Chlorpro mazine cause a granulation and mark ed reduct ion of t he fluorescence

compo und, being normally h omogen eous.

Einleitung

Fur die Grundlagenforschung zur AufkHirung neuronaler Transmissionsmeehanis­men und deren Plastizitiit ist die histotopcchemische Darstellung von Transmi tter­subst anzen im Gehirn mittels hinliinglich spezifischer Methoden wcsentlich.

Fur die y-Arninobuttersiiure (GABA), die als inhibit orischer Transmitter anzusehenist (ROBER'fS et al . 1970 ; CURTIS und JOHNSON 1974 ; SOTELO 1975), wurde 1971 vonWOLlIIAN auf del' Basis del' Ninhydrin-Reaktion zurn Nachweis von Arninogruppencine f'Iuorescenzhistochemisohe Nachweismethode erarbe i tet, di e cine "GABA-Fluo­rescenz" auch irn Hirngewebe ergibt. Die Orte dies el' " GABA-Fluorescenz" stimmengut uberein mit den Arealen, in den en biochemiseh GABA naohgewiesen wurde, bzw.

Zur Spezifitut des fluorescenzhistochemischen Nachweises 81

mit Strukturen, die bevorzugt fH-GABA akkumulieren (ENNA et 301. 1975, Lit.I).

Eine Reproduktion der Fluorescenzmethode naeh WOLMAN (1971) und eine systema­tische Anwendung am Gehirn ist uns aus der Literstur bislang nicht bekannt ge.

worden.Irn Rahmen Iaufender Untersuchungen zur 'I'ransmitterproblematik im limbischen

System der Ratte kam es uns zunachst darauf an, die o. g. Methode hinsichtlich ihrerSpezifitat zu testen und festzustellen, ob die "GABA-Fluorescenz" durch Pharmaka,die auf die Enzyme des GABA-Stoffwechsels und die Membranbindung des Trans­mitters wirken, eindeutig und interpretierbar beeinfluBt wird.

Ais Teststruktur wahlten wir die Purkinje-Zellen des Cerebellum, die mindestens

z. T. als "GABA-Neurone" angesprochen werden konnen (OBATA et 301. 1967; HOK­FELT und LJUNGDAHL 1972, Lit.I).

Material und Methoden

Es wurden insgesamt 31 mannlichc, adulte Ratten (l50 bis 200 g; Stamm Rehbrucke) fluorescenz­

histochemisch untersucht. In den Cerebelli von 15 Tieren wurde die Normalverteilung del' GABA

dargestellt, 16 Tiere wurden mit Pharmaka behandelt ,

Die Ratten wurden mit Ather anaesthetisiert, die Cerebelli rasch herausprapariert., in hochstens

3 mm dicke Scheiben zerlcgt, in mit fhissigem Stickstoff gekiihltes Isopentan fur 2 bis 3 min einge­

legt und anschlieJ.lend in fliissigen Stickstoff iiberfiihrt. Aus dern Stickstoff wurden die Hirnsohoiben

in den Rezipienten oiner Hochvakuumgefriertrocknungsanlage gegeben und in Gegenwart von

Phosphorpentoxyd fiir 18 bis 24 h in del' Kalte bei einem Vakuum von 10-2 bis 10-3 Torr getrocknet

und sodann im Vakuum in Paraffin (Sehmelzpunkt: 52 bis 53°C) eingebettet. Es wurden Mikrotom­

schnitte von 8 bis lO,um Dicke angefertigt, auf mit Chromschwefelsaure gereinigte Objekt.trager

uberfuhrt, durch kurzes Ziehen durch die Flamme cines Bunsenbrenners gestreckt und anschlieJ.lend

fur 12 bis 24 h in oinem Exsiccator iiher Phosphorpentoxyd belassen. Die Schnitte wurden danach

fiir hochstons 30 s in Ather-Alkohol (1: 1) getaucht und anschlieJ.lend fur 1 min mit 1%igem Celloidin

behandelt. Die so praparierten Hirnschnitte wurden folgender Fluochromierungsreaktion (mod. naeh

VVOL,IA~ 1971) unterworfen:

1. Einlegen del' Praparate in eine gesattigte Losung von Chlorarnin 'I' in Octanol bei 37°C fur 2 h.

2. Griindliches Waschen in Octanol.

3. Priiparate fur 1 h hei ~ 10°C in eine Lasung von zu gleichen Teilen- 0,2%ige Losung von Ninhydrin (Reanal, Budapest) in Octanol

- ::VTischung von gleichen Teilen 0,5 M Losung von Glutamat in Wasser und 0,025 M Losung

vonHyamin X in Methanol.

4. Grundliches Wasohen in Octano!.

5. Priiparate fiir 1 h in eine gesiittigte Losung von Kupferaeetat in Octanol bei 27°C.

6. Grundliches Waschen in Octanol,

Die so bchandelten l'riiparato wurdcn kurz in Athor-Alkohol getauoht und mit Vorteil in Celloidin

montiert.

Kontrollpraparate wurden ohno diose Fluochromierung untersucht.

Irn pharmakologischen Versuch kamen folgende Substanzenzum Einsatz:

Isonicotinsaurehydraaid (IKH), VEE Carmol-Werke, Rheinsherg/Mark; 200 mg/kg, i. P» iiber

3 Tage;

Penicillamin (tJ,tJ-Dimethyicysteinhydrochlorid), SPOFA,Prag; 1 g/kg, i. p., tiber 3 Tage;Chlorpromazinhydrochlorid, VEB Deut.sches Hydrierwerk Rodleben; 1,2 gfkg, transcardiale

Perfusion;

INH und Penicillamin wurden in physiologischer Elektrolytlosung gelost.

6 Acta histochem. Rd. 63

82 C. PFISTER unrl R . GOR~E

Die f'luorescenzmikroskopische Auswortung erfolgte mit eine m F luo rescenzmikroskop P luocal s'

des VEB Car l Z eiss J ena bei Auf'lichtf'luoresconz ; Filterkombination BG 12/4 g, OG 1 oder OG 4.

1Il ikroph oto graphie : Exaet a RTL 1000, Ih aqee K amermce rl:e Dresden ; Fi lmmaterial : OR\VO NP 27.

Befunde

1. No r mo log i sc he Ve rte i l u n g d el' GA B A

im Stratum ganglionar e d e s Cerebe ll u m

Das Stratum ganglionare des Cerebellum del' Ratte impon iert bereits bei schwacherVergrollerung als flu orescierendes Band. Bei starkerer Vergrollerung sind hinsich tli ch

del' Intensitiit del' " GABA-Fluor escen z" 3 Typen von Purkinje-Zellen zu unterscheid en:

1.J. Purkinj e-Zellen,

deren gesamt es Cytcplasma star k fluorescierb bei in Abhiingigkeit von del' Schnittefiihrung mehr oder mindel' ausgesparuem, nicht fluorescierendem ZeJIkern (Abb, 2 C, 1).Visuell deutlich, photographisch schlecht zu dokumentieren , sind Zellfortsatze dieses

Purkinje-Zelltyps mit merklich schwacherer ab el' deutlicher cytcplasmat isoher Fluo­resc enz erkennbar , Diese Fortsatze (Dendriten?) scheinen sich in Entfernung vom

Perikaryon zu verzweigen ; sie sind von GefaGen eindeutig untersehieden , da in diesend ie Erythro cyten un d in Abhiingigkeit vom GefiiGkaliber Anteile del' GefiiBwand

eine klar ti ngierte Fluorescenz zeigen .

1.2. Purki nje-Zellen ,

die am P erikaryonrand eine sohwache Fluorescenz zeigen , die entweder den ganze nZelleib umgibt oder lokal als kap penartige stiirkere F luorescenz erscheint. E s ist im

F luorescenzmikros kop nicht eindeutig erkennbar , ob diese " GABA-F luoreseenz"intra- oder extrazellular lokalisiert ist (Abb. 2c , 2).

1.3. P urkin je-ZeJIen

olme jegliche Fluorescenz. Die Perikar ya sind opt isch gerade noeh gegen den ein ­

heitlich dunklen Untergrund zu erkenne n (Abb. 2c, 3).Irn Stratum granulosum ist vereinzelt eine "GABA-Fluorescenz" darstellbar, di e

wir bislang cytologisch ni cht cindeut ig zuordnen konnen,

2. B e einflu s sung d el' " GA B A -F lu or e s cenz" dur ch Ph a r m aka

2.1 . Isonioot insaurehydrazid (INH)

Nac h intrap eritonealer Gabe von I NH in einer Konzentration von 200 mg/kg

iiber 3 Tage kom mt es zu einer deutlichen Redukt ion der " GAB A-F luorescenz" inden Purkinje-Zellen des Cerebellum . Die in den Purkinje-Zellen von Nor rnalt ierenfestgestellte homogene Fluorescenz wird grob- his feinstgranular . Diese fluorescieren­den Gra nula sind vor allem am Perikaryonrand sicht bar, der Zellkern ist deutlichausgespart . Nach dem Gra d del' Redu ktion del' "GABA -Fluoresce nz" sind auch nach

ZUl' Spezif'itat des fluorcscecczhistochemischen Nachweises

Abb. 1. Stratum ganglionare des Cerebellum del' Ratte.

a, b und d): "GABA-Fluorescenz" nach Isonicotinsaul'e-Applikation.

c): "GABA-Fluorescenz" in den Purkinjezellen unbehandelter Tiere zum Vergleich.

a) 136: 1; b-d): 360: 1.

83

Beeinflussung mit INH verschiedene Purkinje-Zelltypen erkennbar: Purkinje-Zellenmit grobgranularem Fluorescenzprodukt; die "GABA-Fluorescenz" ist jedoch ins­gesamt noch relativ stark; Purkinje-Zellen mit deutlich verminderter Fluorescenzund Lokalisation der Granula am Zellrand (Abb. l a b, d).

2.2. Penicillamin (PA)

Penicillamin ftihrt gleichfalls zu einer Verminderung der "GABA-Fluorescenz".Naoh Gabe von 1 mg/kg PA tiber 3 Tage ist in den Purkinje-Zellen eine Granulierungdes Fluorescenzproduktes deutlich. Man kann Purkinje-Zellen mit grobgranuliertem6*

Abb. 2. Stratum ganglionaro des Cerr-bellum del' Ratto.

a und b): "GABA-Fluorescfmz" nach Chlorpromazin-Applikation. :WO: l.

0): Unterschiedliohe Topik del' "GABA-Fluorescenz" in den Purkinje-Zellon des Cerebellum un­

behandelter T'iere. 480: l.

d und e): "GABA-Fluorescenz" nach Penicillin-Applikat.ion. 360: 1.

Zur Spezifitiit des f1uorescenzhistochemischen Nachweises 85

Fluorescenzprodukt bei insgesamt verwaschener und deutlich schwiicherer Fluorescenz

(Abb, 2e) von Purkinje-ZelIen mit klar tingierten fluorescierenden kleinen Granula

am Zellrand (Abb. 2d) unterscheiden.

2.3. Chlorpromazinhydrochlorid (CPA)

Auch nach transkardialer Perfusion von 1,2 g/kg CPA ist die"GABA-Fluorescenz",verglichen mit dem Bild der Purkinje-Zellen unbehandelter Tiere, deutlich beein­trachtigt. Die meisten Purkinje-Zellen zeigen keine Fluorescenz, einige jedoch weisenstark fluorescierende, scharf tingierte Granula im Cytoplasms auf (Abb. 1b). EineKonzentration der fluorescierenden Granula auf den Perikarycnrand wie bei INHund PA-behandelten Tieren war naeh Gabe von CPA in keinem FaIle zu beobachten.

Diskussion

Die y-Aminobuttersaure wird als postsynaptisch wirkender inhibitorischer Transmitter im Zentral

nervensystem del' Mammalier angesehcn (BAXTER 1970; BAXTER et al. 1972; ROBERTS 1974; CURTIS

und JOHNSTON 1974) und im Zusammenhang mit psychosomatischen bzw, psychischen Krankheits­

bildern diskutiert (MELDRUM 1975; WOOD [1975). Die GABA liegt abhangig von del' Natrium- bzw.

Calcium-Ionenaktivitat membrangebunden VOl' (SWANSON et al. 1974; ENNA und SNYDER 1975; ENNA

et al. 1975; GOODARD und ROBINSON 1976; KAMINO et al. 1976; TAPIA und MEZA-RuIZ 1977); spezi­

fische GABA-Rezeptoren wurden gefunden (YOUNGet al. 1976, Lit. I). Das GABA-System, als aktuelles

Verhaltnis von GABA und Glutamat verstanden, das im wesentlichen durch die Enzyme des GABA­

shunts, Glutamat-Decarboxylase (GAD) und GABA-Transaminase (GABA-T), i m Zusammenhang

mit del' Polarisierung del' Membran eingestellt wird (KANIG 1973), ist seit langem Gegenstand von

Untersuchungen mit unterschiedlichsten Methoden.

Neben biochemisch-pharmakologischen Arbeiten zur GABA selbst, bzw, zur GABA-T und/oder

GAD in Hirnhomogenaten (BAXTER et al. 1972; ROBERTS et al. 1970; ROBERTS 1974) und Unter­suchungen zur Rezeptorbindung del' GABA (ENNA et al. 1975; TAPIA und MEZA-RuIZ 1977) existieren

Iicht- und elektronenoptische Studien uber die Verteilung exogener, 3H-markierter GABA in unter­

schiedliehen Regionen des Gehirns (HOKFELT und LJUNGDAHL 1972; SOTELO 1975). Ein direkter

Nachweis del' GABA am histologischen Schnitt ist von WOLMAN (1971) mittels einer Fluorescenz­

methode auf del' Basis del' Ninhydrinreaktion erarbeitet worden, ohne dal3 bislang die chemische

Struktur des fluorescierenden "GABA-Produktes" ermittelt werden konnte, Da einerseits die Auto­

radiographie nul' exogene GABA darstellt und andererseits del' Nachweis del' Enzyme nur die mag.

lichen Orte von Synthese odor Abbau des Transmitters erfal3t, halten wir Versuche zur Darstellung

del' Transmitter selbst in del' intakten, experimentell oder pathologisch veriinderten Morphe des

Gehirns fiir unabliissig.

WOLMAN (1971) hat auf del' Basis umfangreicher Modellexperimente in Losungen und an gefrier­

getrockneten Geweben unterschiedlicher Art wahrscheinlich gemacht, dal3 die Ninhydrinreaktion,

die unter verschiedenen definierten Bedingungen zum Nachweis von a-, fl-, Yo, iL und s-Arninogrup­

pen geeignet ist (SCHMIDT 1938; DENT 1948), bei Verwendung von Octanol ZUI' histotopoehemischen

Darstellung del' y-Aminogruppen del' GABA geeignet ist. Nach MCCALDIN (1960), del' den versehie­

denen Hypothesen des Reaktionsmeehanismus des Ninhydrin mit Aminogruppen, Aminosiiuren und

Aminen, eine eigene Hypothese hinzugefugt hat, liiuft die Ninhydrinreaktion in wal3rigen Losungen

in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten und schlieflt mit del' Bildung eines farbigen Kondensa­

tionsproduktes abo Dicse Kondensatbildung findet bei Verwendung von Octanol als Medium nicht

statt (VVOLMAN 1971). Andererseits ist. del' Einsatz von Kupferacetat ein Faktor del' ·WOLMAN-Me-

86 C. PFISTER unrl R. GORXE

thode. Fur Kupferverbindungen ist eine Chelatbildung mit Amino- und Carboxylgruppen bekannt.

Wir nehmen an, daB diese Chelatbildung in Octanol stattfindet und fur die Bildung des im Fluorescenzlicht instabilen Produktes del' "GABA-Fluorescenz" verantwortlich sein konnte. Es kommt

hinzu, daB WOLYIAXS Experimente mit Losungen unterschie.Ilicher Arninosauron bei Anregung

durch Licht untersehiedlicher Wellenlange eine fur die GABA typische Fluorescenz, die gleicherma13en

in Gewebeschnitten verifizierbar ist, crgaben. Es be:larf ferner dor Erwahnung, da13

a) die Verteilung der fluoreseenzhistochemisch nachgewiesenen Substanz in Kongruenz mit bio­

chemischen Daten resp. dem Verteilungsmuster nach lnkorporation von markiertem Material ist und

b) Ubereinst.immung mit der Aufnahme von exog.mem Transmitter rlurch Hirnhomogenate de­

finierter Hirnregionen im Zusammenhnag mit. del' Receptorbinrlung existiert.

Ausgehond vom Chornismus des GABA-shunts schien urrs eine pharmakologisohe Beeinflussung

mit dem Ziel eines Spezif'itatstestes der "GABA-Fluorescenz" sinnvoll, wenn eine Wirkung erzielt

wird auf die Enzyme GAD und GABA-T und auf die Membranbindung del' GABA. Ein EinfluB auf

die GAD ist fur Penicillamin und zusatzbch auf die GABA-T fur Isoniootinsaurehydrazid bekannt

(BAXTER 1970; WOOD und PEESKER 1972). Die Beeinflussung der Membranbindung del' GABA

durch Chlorpromazin ist durch biochemische Untersuchungen an Hirnhomogenaten mit morpholo­

gisch definierten Membrananteilen nachgewiosen (SELLSTROul und HA>IBERGER 1975; ROBERTS et al.

1970).

Als Teststruktur wahlten wir die Purkinje-Zellen des Cerebellum, da wir die Auffassung teilen,

dafl "the cerebellum has been by far the most favorable site for investigations of possible substances

which may mediate the activity of neurons with inhibitory functions (ROBERTS 1974; p. 2641)".

Unsere Ergebnisse an den Purkinje-Zellen des Cerebellum unbeeinflufiter Ratten zeigen cine gute

Ubereinst.immung mit dem GABA-Nachweis in diesen Zellen nach autoradiographischer Technik

(HOKFELT und LJUNGDAHL 1972; LJUNGDAHL et al. 1973), bioehemischen Befunden zur Verteilung

der GAD (FONNUM et al. 1970) und der Topik enzymhistochemisch dargestelltor Reaktionsprodukte

des GABA-SSA-DH-Systems irn Stratum ganglionare des Rattencerebellum (RITTER und WENK

(1974). Die eingesetzten Pharmaka fiihren allgemein zu einer Granulierung des normalerweise homo­

genen Fluorescenzproduktes und zu dessen Reduktion in del' Reihenfolge INH, PA und CPA.

Aus den Ergebnissen schluBfolgern wir:

1. Die Pharmaka INH und P A, die klinisch als Tuberculostaticum bzw. Antidoteingesetzt werden, rufen in den angegebenen Konzentrationen eine chemisch ver­sbandliohe Aktion am Enzymsystem der GABA hervor und fiihren zu einer eindeutigerkennbaren Verminderung der "GABA-Fluorescenz" in den PurkinjeZellen.

2. Die distinkte Granulierung des Fluorescenzproduktes allgemein als Folge derPharmakawirkung, aber besonders nach Applikation von CPA, werten wir als mor­phologischen Ausdruck fur den differenten EinfluB des Neurolepticums auf die Mem­branbindung des Transmitters.

3. Dss morphologische Verteilungsbild der "GABA-Fluorescenz" und unsere Er­gebnisse nach pharmakologischer Beeinflussung rechtfertigen den Einsatz der WOL­

MAN-Methode, wenn bei Untersuchungen zur Transmitterproblematik im Gehirndurch einen Vergleich der Ergebnisse, die mit unterschiedlichen morphologischenMethoden gewonnen werden konnen, funktionelle Aussagen getroffen werdensollen,

Zur Spezifitiit des f'Iuoreszenzhist.ochemiaohcn Naohwoises

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Anschrift der Verfasser: Dr. rer. nat. CLAUS PFISTER und cando med. RAINER GORNE, Anatomi­

sehes Institut des Bereiches Medizin (Charite) der Humboldt-Universite.t zu Berlin, DDR - 104 Ber­

lin, Philippstral3e 12.