UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

THIAGO BRASILEIRO DE VASCONCELOS

EFEITOS ANTIESPASMÓDICO E MIORRELAXANTE DO β-CITRONELOL EM

MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATOS: POTENCIAL AÇÃO NA

HIPERREATIVIDADE APÓS DESAFIO ANTIGÊNICO E ELUCIDAÇÃO DO

MECANISMO DE AÇÃO

FORTALEZA

2013

THIAGO BRASILEIRO DE VASCONCELOS

EFEITOS ANTIESPASMÓDICO E MIORRELAXANTE DO β-CITRONELOL EM

MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATOS: POTENCIAL AÇÃO NA

HIPERREATIVIDADE APÓS DESAFIO ANTIGÊNICO E ELUCIDAÇÃO DO

MECANISMO DE AÇÃO

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Farmacologia da Faculdade de Medicina

da Universidade Federal do Ceará, como

requisito parcial para obtenção do Título

de Mestre em Farmacologia. Área de

concentração: Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas

Magalhães.

FORTALEZA

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

V451e Vasconcelos, Thiago Brasileiro de.

Efeitos antiespasmódico e miorrelaxante do β-citronelol em músculo liso traqueal ratos: potencial ação na hiperreatividade após desafio antigênico e elucidação do mecanismo de ação. / Thiago Brasileiro de. Vasconcelos. – 2013.

118 f.: il. color., enc.; 30 cm. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Mestrado em Farmacologia, Fortaleza, 2013.

Área de Concentração: Farmacologia. Orientação: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães.

1. Cymbopogon. 2. Músculo Liso. 3. Broncodilatador. I. Título.

CDD 615.72

THIAGO BRASILEIRO DE VASCONCELOS

EFEITOS ANTIESPASMÓDICO E MIORRELAXANTE DO β-CITRONELOL EM

MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATOS: POTENCIAL AÇÃO NA

HIPERREATIVIDADE APÓS DESAFIO ANTIGÊNICO E ELUCIDAÇÃO DO

MECANISMO DE AÇÃO

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Farmacologia, da Faculdade de Medicina

da Universidade Federal do Ceará, como

requisito parcial para obtenção do Título

de Mestre em Farmacologia. Área de

concentração: Farmacologia.

Aprovada em: 19/12/2013.

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________

Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães

Universidade Federal do Ceará - UFC

____________________________________

Prof. Dr. Daniel Freire de Sousa

Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira - UNILAB

_____________________________________

Profa. Dra. Flávia Almeida Santos

Universidade Federal do Ceará - UFC

Dedico este trabalho às minhas avós Iraci

e Maria minha eterna gratidão e amor.

Ao meu pai, Enéas, que me ensinou a

superar os obstáculos com dignidade,

respeito e coragem.

À minha mãe, Lucinha, sinônimo de amor,

alegria, fé e paz.

Ao meu irmão, Yuri, companheiro, amigo

e fiel.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e por ser a fonte inesgotável de sabedoria.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães, pela sua orientação,

confiança e amizade. Muito obrigado pelos os ensinamentos, por ter acreditado em

mim quando eu não tinha muitas esperanças, e por me mostrar um pouco mais

sobre o que é ser um pesquisador.

Aos Profs. Drs. Rodrigo José Bezerra de Siqueira e Roberto César Pereira Lima

Júnior e a Profa. Dra. Nylane Maria Nunes de Alencar pela disponibilidade e preteza

em participarem da minha banca de qualificação.

Ao Prof. Dr. Daniel Freire de Sousa e a Profa. Dra. Flávia Almeida Santos que

participaram da minha defesa da dissertação de Mestrado, colaborando para a

conclusão deste estudo.

Ao amigo e companheiro de bancada Hélder Veras Ribeiro Filho, por ter me ajudado

na realização dos experimentos e me incentivado a buscar insistentemente novas

abordagens experimentais.

Aos colegas do Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso e Laboratório Escola

Prof. Luís Capelo, pela torcida, convivência, troca de conhecimentos,

companheirismo e alegria durante a realização dos experimentos, isso fez toda a

diferença.

Ao Prof. Dr. Vasco Pinheiro Diógenes Bastos, a quem eu considero como meu “pai

científico” que me incentiva e apoia desde o inicio da minha história acadêmica.

Aos professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia.

A toda minha família pelo apoio, torcida e amor.

A todos meus amigos que torcem e vibram por mim a cada conquista.

À Ana Richelly, meu “braço esquerdo”, que tornou minha vida mais leve e feliz, pela

sua torcida, compreensão, carinho e amor.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia e do Centro de

Biomedicina.

Aos técnicos, José Haroldo Pinheiro Ferreira e Maria Silvandira França Pinheiro pela

disponibilidade, carinho e atenção.

Às secretárias da Pós-Graduação em Farmacologia, Áurea Rhanes Yida, Márcia

Herminia Pinheiro Borges e Célia Araújo de Carvalho Gonzaga pela dedicação e

atenção.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

apoio financeiro.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste estudo.

Muito Obrigado!

“Se eu falasse as línguas dos homens e as dos

anjos, mas não tivesse amor, eu seria como um

bronze que soa ou um címbalo que retine.

Se eu tivesse o dom de profecia, se

conhecesse todos os mistérios e toda a ciência,

se tivesse toda a fé, a ponto de remover

montanhas, mas não tivesse amor, eu nada

seria”.

1 Coríntios 13:1-2.

RESUMO

O β-citronelol é um álcool monoterpênico de ocorrência natural em vários óleos essenciais como o óleo de citronela (obtido de Cymbopogon winterianus), de ampla utilização popular por suas propriedades repelentes de insetos. Recentemente, a esta molécula tem sido atribuídas outras propriedades que envolvem atividade antibacteriana, antifúngica, antiespasmódica, hipotensora e vasorrelaxante. Sendo assim, objetivamos estudar suas possíveis ações no comportamento motor do músculo liso do sistema respiratório de ratos Wistar. Os animais considerados nesse estudo foram divididos em 04 grupos: controle, sensibilizado, desafiado e tratado, em seguida, registros isométricos, in vitro, foram obtidos a partir de anéis isolados de

traqueia. A inalação de -citronelol (300 µM) preveniu a hiperreatividade traqueal mediante a adição de K+ ou ACh em animais submetidos a um modelo de asma, no

entanto, a adição cumulativa de -citronelol (10 a 1000 µM), na cuba para órgãos isolados, não produziu alteração significativa das preparações mantidas sob tônus

basal. Em preparações de traqueia mantidas contraídas, a adição de -citronelol relaxou total e significativamente (p < 0,001; Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) os anéis de traqueia, com CI50 de 120,44 [73,29 - 197,91] µM para o K+

e 211,10 [114,13 – 390,46] µM para a ACh, e esse efeito não foi alterado (p > 0,05; Teste de Mann-Whitney) após o tratamento com Propranolol, L-NAME, TEA, Azul de Metileno, Ortovanadato de Sódio, Capsazepina, Indometacina e A-967079. Em

experimentos realizados com a remoção do Ca2+ e contendo EGTA, o -citronelol inibiu a contração mediante a entrada de Ca2+ preferencialmente em canais VOC, mas em altas concentrações, pôde atuar também nos canais ROC e SOC, esse efeito foi mais pronunciado (p < 0,001; Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) na contração promovida pela adição de Ba2+, demonstrando uma maior

especificidade em atuar nos canais de Ca2+ operados por voltagem do tipo L. O -citronelol também foi capaz de diminuir a contração induzida pela estimulação

elétrica. Esses resultados demonstram que o -citronelol caracteriza-se como uma substância antiespasmódica e miorrelaxante do músculo liso respiratório, e esse efeito está parcialmente relacionado à sua capacidade de reduzir principalmente o acoplamento eletromecânico.

Palavras-chave: Cymbopogon. Músculo Liso. Broncodilatador.

ABSTRACT

The β-citronellol is an alcoholic monoterpene of natural occurrence that is found in several essential oils, including the citronella oil (obtained from Cymbopogon winterianus). In general, it is widely used as insect repellent. Recently this molecule has been studied as antibacterial, antifungal, antispasmodic, hypotensive and vasorelaxant agent. We aimed to study the effects of β-citronellol on smooth muscle contractility of rat airways. The animals were divided in four groups namely Control, Sensitized, Challenged and Treated. Isometric recordings were obtained from

isolated preparations from tracheal tissues cut as rings. Inhalation of -citronellol (300 µM) before antigen (ovalbumin, OVA) challenge prevented development of tracheal hyperreactivity in response to K+ or ACh in tissues of OVA-sensitized

animals. In vitro, the cumulative addition of -citronellol (10 to 1000 µM) did not change basal tone in tracheal smooth muscle preparations. In tracheal rings pre-

contracted with K+ or acetylcholine (ACh), the addition of -citronellol fully relaxed (p < 0.001, Two-Way ANOVA, Holm-Sidak) tracheal rings with IC50 values of 120.44 [73.29 – 197.91] µM for K+ and 211.10 [114.13 - 390.46] µM for ACh. The relaxing effect of β-citronellol was not altered (p > 0.05, Mann-Whitney test) after treatment with propranolol, N (G)-nitro-L- arginine methyl ester (L-NAME), tetraethylammonium (TEA), methylene blue, sodium orthovanadate, capsazepine, indomethacin and A-967079. Experiments performed in Ca2+ depleted medium containing EGTA revealed

that low concentrations of -citronellol preferentially inhibited contractions induced by recruiting Ca2+ influx via voltage-operated channels (VOC), although at higher concentrations it could also inhibit either on contractions evocked with receptor-operated (ROC) or store-operated (SOC) pathways. Such effect was supported by the more pronounced inhibitory effects of β-citronellol (p < 0.001, Two-Way ANOVA, Holm-Sidak) against contractions promoted in tracheal tissues maintained in Ba2+-

containing medium. -Citronellol also decreased the contractions induced by

electrical field stimulation. These results suggest that -citronellol has antispasmodic and myorelaxant properties on airway smooth muscle, which could be partly related to its ability in inhibiting the electromechanical coupling.

Keywords: Cymbopogon. Smooth Muscle. Bronchodilator.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Substâncias químicas produzidas pelo metabolismo primário e

secundário das plantas. ....................................................................................18

Figura 2 - Plantas do gênero Cymbopogon. .....................................................20

Figura 3 - Estrutura química do β-citronelol .....................................................23

Figura 4 - Contração do músculo liso traqueal. ................................................29

Figura 5 - Canais de Ca2+. ................................................................................29

Figura 6 - Relaxamento do músculo liso traqueal. ............................................31

Figura 7 - Hiperreatividade brônquica é decorrente do ambiente inflamatório. 32

Figura 8 - Método de inalação. .........................................................................43

Figura 9 - Protocolo experimental de sensibilização, tratamento e desafio. .....44

Figura 10 - Detalhe da montagem de anéis de traqueia de rato no sistema de

contratilidade in vitro. ........................................................................................45

Figura 11 - Sistema utilizado nos experimentos de contratilidade in vitro em

traqueia de rato. ................................................................................................46

Figura 12 - Tratamento com β-citronelol previne a hiperreatividade ao K+

induzida pelo desafio antigênico em animais sensibilizados ao antígeno... ......56

Figura 13 - Tratamento com β-citronelol previne a hiperreatividade à

acetilcolina induzida pelo desafio antigênico em animais sensibilizados ao

antígeno............................................................. ................................................57

Figura 14 - Efeito inibitório do β-citronelol nas curvas concentração-efeito para

K+.. ....................................................................................................................59

Figura 15 - Curva concentração-efeito para definir a concentração do

verapamil capaz de abolir a resposta contrátil ao K+... ......................................61

Figura 16 - Eliminação da participação dos canais de Ca2+ operados por

voltagem pelo verapamil na curva concentração-efeito em resposta à ACh em

anéis de traqueia de animais naive.. .................................................................62

Figura 17 - O β-citronelol não foi capaz de inibir as curvas concentração-efeito

para ACh na presença de verapamil.... .............................................................64

Figura 18 - β-Citronelol não alterou o tônus basal de preparações de traqueia

isolada de rato... ................................................................................................66

Figura 19 - Reversão pelo β-citronelol da contração de anéis de traqueia de

rato induzidas por K+.. .......................................................................................69

Figura 20 - Reversão pelo β-citronelol da contração de anéis de traqueia de

rato induzidas por acetilcolina. ..........................................................................70

Figura 21 - Reversão da contração serotoninérgica em anéis de traqueia de

rato induzida pelo β-citronelol... ........................................................................71

Figura 22 - Reversão da contração induzida por ortovandadato de sódio pelo

β-citronelol em anéis de traqueia de ratos.. ......................................................73

Figura 23 - Efeito relaxante do β-citronelol sobre a contração de ACh em anéis

de traqueia de rato não é alterado por inibidores farmacológicos... ..................75

Figura 24 - Efeito relaxante do β-citronelol sobre a contração de ACh em anéis

de traqueia de rato não é alterado por capsazepina ou indometacina... ...........76

Figura 25 - O β-citronelol produziu relaxamento na contração de ACh na

presença de A-967079 em músculo liso traqueal de ratos. ...............................78

Figura 26 - Efeito relaxante do β-citronelol na contração de anéis de traqueia

de rato induzida conjuntamente por K+ e ACh em meio contendo Ca2+ ou

Ba2+................. ..................................................................................................81

Figura 27 - β-citronelol inibiu a contração induzida pela adição de Ca2+ em

anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ com alta concentração de K+ (60

mM).... ...............................................................................................................83

Figura 28 - β-citronelol inibiu a contração induzida pela adição de Ba2+ em

anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ com alta concentração de K+ (60

mM).... ...............................................................................................................85

Figura 29 - β-Citronelol não alterou a contração induzida por adição de Ca2+

em anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ na presença de acetilcolina

e verapamil..... ...................................................................................................87

Figura 30 - β-Citronelol inibiu a contração de anéis de traqueia causada pela

restauração extracelular de Ca2+ após esgotar estoques intracelulares com

acetilcolina e tapsigargina..... ............................................................................89

Figura 31 - O β-citronelol inibiu a contração induzida por estimulo elétrico em

anéis de traqueia isolada de ratos...... ...............................................................91

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores da concentração inibitória capaz de produzir efeito

miorrelaxante em 50% da resposta contrátil (CI50) induzida pelo β-citronelol na

contração sustentada de K+, ACh ou 5-HT em anéis de traqueia de ratos na

ausência e na presença de várias substancias capazes de interferir no

mecanismo de contração/relaxamento da célula muscular lisa traqueal.. .........79

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT Serotonina

ACh Acetilcolina

Al(OH)3 Hidróxido de Alumínio

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

CaM Calmodulina

CCE Curva concentração–efeito

CI50 Concentração inibitória capaz de produzir 50% do efeito máximo

COX Enzima Ciclooxigenase

DAG Diacilclicerol

E.P.M. Erro padrão da média

EE Eletroestimulação

Emax Efeito Máximo

EGTA Ácido etileno-bis(β-amino-etil-éter)-N,N,N’,N’-tetracético

IL Interleucinas

IP3 Inositol 1,4,5-trifosfato

L-NAME L-nitro-arginina- metil- Ester

MLC Cadeia leve de miosina

MLCK Quinase de cadeia leve de miosina

MLCP Fosfatase de cadeia leve de miosina

NO Óxido nítrico

OVA Ovalbumina

PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C

PTP Proteína tirosina fosfatase

ROC Canal para Ca2+ operado por receptor

RS Retículo sarcoplasmático

RyR Receptor de rianodina

SERCA Bomba Ca2+-ATPase presente no retículo sarcoplasmático

SOC Canal para Ca2+ operado por estoque

TEA Tetraetilamônio

TNF- Fator de Necrose Tumoral Alfa

TRP Receptor de Potencial Transitório

TRPA1 Receptor de Potencial Transitório Anquirina do Tipo 1

TRPV1 Receptor de Potencial Transitório Vanilóide do Tipo 1

VOC Canal para Ca2+ operado por voltagem

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 15

1.1 Plantas medicinais ......................................................................................15

1.2 Óleos essenciais extraídos de plantas do gênero Cymbopogon ................17

1.3 Efeitos do β-citronelol ..................................................................................22

1.4 Músculo liso traqueal ...................................................................................24

1.5 Contratilidade do músculo liso................................................................ .....26

1.6 Asma.............................................................. ..............................................31

2 JUSTIFICATIVA ....................................................................................... 36

3 OBJETIVOS .............................................................................................. 38

3.1 Objetivo Geral .............................................................................................38

3.1 Objetivos Específicos ..................................................................................38

4 METODOLOGIA ...................................................................................... 40

4.1 Animais........................................................................................................40

4.2 Soluções e fármacos utilizados ...................................................................41

4.3 Métodos de sensibilização, desafio antigênico e tratamento.......................42

4.4 Experimentos in vitro ...................................................................................44

4.4.1 Traqueia isolada .......................................................................................44

4.5 Protocolos experimentais ............................................................................46

4.5.1 Curvas concentração-efeito ......................................................................46

4.6 Análise de dados .........................................................................................53

5 RESULTADOS ......................................................................................... 55

5.1 Inalação de β-citronelol previne a hiperreatividade traqueal induzida pelo

desafio antigênico .............................................................................................55

5.2 Efeito do β-citronelol sobre a curva concentração-efeito induzida por K+ em

anéis de traqueia ...............................................................................................58

5.3 Habilidade do β-citronelol para inibir respostas contráteis via recrutamento

de canais de Ca2+ da membrana plasmática .....................................................60

5.4 β-citronelol não altera o tônus basal de preparações de traqueia isolada de

rato ....................................................................................................................65

5.5 β-citronelol relaxa a contração sustentada induzida por K+, acetilcolina ou

serotonina (5-HT) em traqueia isolada de rato ..................................................67

5.6 Efeito inibitório do β-citronelol sobre a contração induzida por ortovanadato

de sódio em traqueia isolada de rato ................................................................72

5.7 Efeitos inibitórios do β-citronelol sobre a contração sustentada de

acetilcolina em traqueia isolada de ratos na presença de bloqueadores

farmacológicos e inibidores enzimáticos ...........................................................74

5.8 Efeito do β-citronelol em preparações isoladas de traqueia contraídas com

uma combinação de K+ e ACh em meio contendo Ca2+ ou Ba2+ .......................80

5.9 Efeitos inibitórios do β-citronelol nas curvas concentração-efeito induzidas

pela adição cumulativa de Ca2+ ou Ba2+ em preparações de traqueia mantidas

em meio sem Ca2+ despolarizadas com K+ .......................................................82

5.10 Efeitos inibitórios do β-citronelol nas curvas concentração-efeito induzidas

pela adição cumulativa de Ca2+ em preparações de traqueia mantidas em meio

sem Ca2+ estimuladas com ACh .......................................................................86

5.11 Efeito do β-citronelol na contração induzida pela adição de Ca2+ após a

depleção dos estoques intracelulares em preparações isoladas de traqueia

mantidas em meio sem Ca2+ estimuladas com ACh .........................................88

5.12 Efeito do β-citronelol na contratilidade induzida por estimulo elétrico em

traqueias isoladas de ratos................................................................................90

6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 93

7 CONCLUSÕES ......................................................................... 101

REFERÊNCIAS .........................................................................................102

ANEXO ........................................................................................................115

INTRODUÇÃO

15

1 INTRODUÇÃO

1.1 Plantas medicinais

Desde a origem das civilizações, os vegetais são fontes de alimento e de

matéria prima para uma gama de produtos utilizados pelo homem como objetos para

defesa, vestuário, transporte, habitação, dentre inúmeros outros. Os vegetais

representaram também a principal fonte de misturas usadas em rituais religiosos

para a cura de diversos males. Há aproximadamente 10 mil anos atrás, o homem foi

deixando de ser caçador-colhedor para tornar-se um produtor, passando a

selecionar entre as plantas e animais, os tipos mais adequados às suas

necessidades (SILVA, 2010a).

O uso de plantas medicinais tem suas raízes nas mais antigas práticas

curativas da humanidade. Muitas plantas usadas atualmente foram utilizadas

durante milhares de anos, mesmo antes das descrições científicas de suas

propriedades terapêuticas. Arqueólogos já descreveram traços de numerosas

plantas de reconhecido valor medicinal em antigos centros funerários e habitáculos

do homem primitivo. Segundo relatos na literatura, há aproximadamente três

milênios antes de Cristo, os antigos povos orientais já faziam uso de plantas no

tratamento de diversas doenças (WAGNER; FARNSWORTH, 1990).

As plantas são fontes importantes de produtos naturais biologicamente

ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de fármacos.

Alguns dos constituintes isolados de folhas, raízes, flores e frutos (flavonóides,

taninos, alcalóides, cumarinas e terpenos) são os principais responsáveis pelas

ações analgésicas, anti-inflamatórias, antivirais, hipoglicemiantes, antiespasmódicas

e antialérgicas encontradas nas plantas. Estudos na área de produtos naturais

mostram resultados impressionantes pelo fato desses produtos revelarem uma

diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas

(GUERRA; NODARI, 2000).

Acredita-se que o Brasil seja o país com a maior diversidade genética

vegetal do mundo, com mais de 50.000 espécies catalogadas e de

16

aproximadamente 450.000 existentes. Para se ter uma melhor noção dessa

riquíssima diversidade, países como o Canadá e os Estados Unidos possuem uma

diversidade vegetal nativa de no máximo 700 espécies (FONTENELE, 2004). A

biodiversidade brasileira associada ao conhecimento etnofarmacológico,

principalmente da população indígena e rural, constituem uma vantagem no

processo de desenvolvimento de programas e projetos relacionados à plantas

medicinais (SILVA et al., 2001).

Calixto (2000); Rates (2001) e Veiga-Junior (2008) confirmam que a

diversidade genética vegetal no Brasil é bastante significativa e em seu território

encontram-se cinco biomas principais, Floresta Amazônica, Cerrado, Mata Atlântica,

Pantanal e Caatinga, sendo todos fontes importantes de produtos terapêuticos.

Ressalta-se que a utilização das plantas medicinais no Brasil foi difundida

principalmente pela cultura indígena.

Recentemente Ngo; Okogun; Folk (2013) publicaram uma revisão sobre a

pesquisa de produtos naturais e o desenvolvimento de drogas e medicamentos

tradicionais, e os mesmos destacaram que, os produtos naturais são fontes

essenciais de novos produtos farmacêuticos, principalmente devido à imensa

variedade de metabólitos secundários potencialmente relevantes de espécies

microbianas e vegetais. A tecnologia que ascendeu no século 21, possibilitou o

desenvolvimento de ferramentas poderosas de análise, baseadas na genômica,

proteômica, metabolômica, bioinformática, dentre outras tecnologias, acelerando o

processo de identificação e caracterização dos produtos naturais.

Com o avanço da tecnologia, muitas substâncias sintéticas têm sido

produzidas no intuito de prevenir, controlar e curar doenças, e consequentemente,

aumentar a estimativa de vida humana. As estruturas bioativas inovadoras podem

ser otimizadas gerando novos candidatos a fármacos úteis no tratamento de várias

doenças (CRAGG; NEWMAN, 2013). No entanto, ainda existe uma grande procura

por produtos naturais, pois possuem um custo menor do que os produtos

industrializados. Em contrapartida, a grande maioria destas fontes naturais não

possuem relatos na literatura sobre sua eficácia. Acredita-se que 25% de todos os

medicamentos modernos sejam direta ou indiretamente derivados de plantas

(CALIXTO, 2000). Neste contexto, os óleos essenciais extraídos de plantas

medicinais têm sido amplamente estudados e seu potencial terapêutico tem sido

demonstrado através de experimentos envolvendo animais (MAGALHÃES;

17

LAHLOU; LEAL-CARDOSO, 2004; SOUSA et al., 2006; PINHO et al., 2012;

GBENOU et al., 2013).

1.2 Óleos essenciais extraídos de plantas do gênero Cymbopogon

Os óleos essenciais, também conhecidos como essências, são

compostos formados ao longo do crescimento do vegetal influenciados por fatores

genéticos fixos e ambientais que são variáveis, por exemplo, a temperatura, o solo,

a luz, dentre outros. Esses compostos agem na preservação e integridade da planta

e quando testados em sistemas biológicos ou células animais, podem causar

diversos efeitos que podem ser explorados farmacologicamente (CASTELLANI,

1997; SILVA; CASALI, 2000).

Acrescenta-se que esses compostos são insolúveis em água e solúveis

em solventes orgânicos. São obtidos de diversas partes das plantas por técnicas

específicas, sendo a mais frequente a destilação por arraste com vapor d’água.

Destaca-se que a propriedade química do óleo essencial pode variar de acordo com

a parte extraída do vegetal (caule, folhas, flores, fruto, semente e raiz) (CRAVEIRO

et al., 1980; VITTI; BRITO, 2003).

Vários constituintes químicos são identificados nos óleos essenciais,

dentre eles: álcool simples e terpênicos, hidrocarbonetos terpênicos, aldeídos,

cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, entre

outros (CRAVEIRO et al., 1981; SIMÕES et al., 2000; GONÇALVES et al., 2003;

OLIVEIRA et al., 2011). Todavia, alguns destes apresentam-se em maior

concentração e, por causa disso, são classificados como constituinte principal,

enquanto que, os que apresentam menor concentração são conhecidos como

compostos traços (VITTI; BRITO, 2003).

Segundo Peres (2004), as plantas por serem seres vivos, possuem

atividade metabólica, que compreende o conjunto de reações químicas que ocorrem

no interior das células. Em relação aos vegetais, o metabolismo é dividido em

primário (possui função essencial e está presente em todas as plantas, p. ex.

aminoácidos, carboidratos e clorofila) e secundário (não são necessários e não

possuem distribuição universal entre as plantas) (Figura 1).

18

Figura 1 - Substâncias químicas produzidas pelo metabolismo primário e secundário das plantas. Fonte: Torsell (1997).

Os óleos essenciais apresentam propriedades anti-inflamatórias (SIANI et

al., 2000; SÁ; ANDRADE; SOUSA, 2013), antibacterianas (SIANI et al., 2000),

analgésicas e antipiréticas (GBENOU et al., 2013) e vasodilatadoras (LUNA-

VÁZQUEZ et al., 2013), que muitas vezes condizem com a medicina popular. O

método de aplicação depende da fisiopatologia e do resultado desejado, é preciso

tomar cuidados de segurança com relação à toxicidade. Para o tratamento de

sintomas respiratórios e distúrbios do sistema nervoso, a inalação pode ser a melhor

forma de aplicação (SCHMITT et al., 2009), enquanto que a aplicação tópica é a

melhor maneira para tratar doenças de pele, por exemplo, as úlceras.

Diversos estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa - Fármacos e

Músculo Liso (CNPq), utilizando óleos essenciais obtidos de várias plantas

encontradas no Nordeste brasileiro, destacaram as suas propriedades

miorrelaxantes em tecidos isolados de traqueia de animais (MAGALHÃES, 2002;

MAGALHÃES et al., 2003; BASTOS, 2009; PINHO, 2010; DE SIQUEIRA et al.,

2012).

19

Um óleo essencial que possui efeito terapêutico é o de citronela. Ele é

produzido por espécies vegetais de gramíneas, uma das maiores familias de plantas

existentes (Família Poaceae), a qual pertence o gênero Cymbopogon e que são

conhecidas popularmente como “citronela”. Pertencente a esse, existem mais de

120 espécies originárias da Ásia tropical e amplamente distribuídas nas partes

tropicais do mundo (PEREIRA, 2009). Ela é comumente utlizada na medicina

tradicional indiana, chinesa e brasileira (SIMON; CHADWICK; CRAKER, 1984). O

cultivo de citronela no Brasil toma importante espaço no mercado de produtos

naturais, devido à grande procura por seu óleo essencial tanto no mercado interno

quanto para exportação (ROCHA; MING; MARQUES, 2000).

As espécies do gênero Cymbopogon são conhecidas popularmente como

(CASTRO; RAMOS, 2002; PRATO, 2013a; PRATO, 2013b):

Cymbopogon winterianus (Citronela, Capim-citronela, Citronela-de-

java, Citronela-do-ceilão);

Cymbopogon citratus (Capim-limão, Belgata, Belgate, Capim-cheiroso,

Capim-cidrão, Capim-cidreira, Erva cidreira, Capim-cidrilho, Capim-cidró, Capim-de-

cheiro, Capim-marinho, Capim-membeca, Capim-santo, Chá-de-caxinde, Chá-de-

estrada, Chá-de-príncipe, Chá-do-gabão, Cidró, Esquenanto, Palha-de-camelo,

Príncipe);

Cymbopogon nardus L. Rendle (Citronela, Cidró-do-paraguai).

20

Figura 2 - Plantas do gênero Cymbopogon.

A: Cymbopogon winterianus, B: Cymbopogon citratus e C: Cymbopogon nardus L. Rendle. Fontes: Silva (2009), figuras A e B; Castro; Ramos (2002), figura C.

A citronela destaca-se entre as plantas indicadas para o controle de

insetos (CASTRO; RAMOS, 2003), ela é perene e seu cultivo está presente nas

regiões tropicais e subtropicais em função das suas propriedades aromáticas

(ROCHA; MING; MARQUES, 2000; CASTRO; RAMOS, 2003). O óleo extraído de

suas folhas frescas ou parcialmente dessecadas é usado como repelente de

mosquitos e na perfumaria. Essa propriedade é atribuída à presença de substâncias

voláteis em suas folhas, como citronelal, citronelol, eugenol, geramiol e limoneno,

entre outras (SHASANY et al., 2000).

A utilização do óleo Cymbopogon nardus L. Rendle como ectoparasiticida

em bovinos leiteiros a partir de experimentações in vitro, demonstrou atividade

21

acaricida, havendo comportamento similar entre as soluções elaboradas com

produtos de diferentes fontes de produção (OLIVO et al., 2008).

Os estudos de Ghedini et al. (2002) apontam a eficácia da utilização de

capim-cidreira (Cymbopogon citratus) na formulação de xarope para combater a

tosse, gripe e febre em humanos. Carlini (1985), já destacava a utilização do chá de

suas folhas nas Ilhas Maurício e na península Malaia para o tratamento da gripe,

febre, pneumonia, problemas gástricos e também como sudorífero. Heimerdinger

(2005) acrescenta que o capim-cidreira pode ser uma forma alternativa de combate

a carrapatos em bovinos leiteiros.

Gomes; Negrelle (2003) destacam uma ampla gama de empregos

referenciados do capim-limão no Brasil, tais como: fortificante, digestivo,

antitussígeno, antigripal, analgésico, antiemético, anticardiopatias, antipirético, anti-

inflamatório de vias urinárias, diurético, antiespasmódico, diaforético e antiálgico.

Em relação ao óleo essencial de Cymbopogon winterianus (OECW),

Menezes et al. (2010) relataram suas propriedades vasodilatadoras e hipotensoras

em músculo liso vascular de ratos. Estes efeitos parecem ser mediados

principalmente por bloqueio dos canais de Ca2+ operados por voltagem. Além disso,

a maior dose de OECW induz bradicardia transitória e arritmias cardíacas devido a

uma ativação muscarínica secundária a uma descarga vagal.

Quintans-Júnior et al. (2008) estudaram os efeitos do óleo essencial das

folhas frescas de Cymbopogon winterianus e identificaram por meio da

espectrometria de massa como principais componentes do óleo: geraniol = 40,06%;

citronelal = 27,44%; citronelol = 10,45%; acetato geranil = 1,77% e limoneno =

1,58%, dentre outros. Outro estudo interessante de Oliveira et al. (2011) destacou

como componentes majoritários do óleo essencial de Cymbopogon nardus: citronelal

(34,61%), geraniol (23,18%) e citronelol (12,10%). Destacam ainda que, a maior

concentração de citronelal ocorreu, provavelmente, devido à oxidação do citronelol,

um álcool secundário, em citronelal.

Koh; Mokhtar; Iqbal (2012) acrescentam que o extrato de Cymbopogon

citratus pode ter atuado, ao menos em parte, como agente terapêutico protetor do

fígado contra danos ocasionados pelo estresse oxidativo. Contudo, antes de

considerá-lo como terapêutico, é essencial e necessário a descoberta de seus

mecanismos de ação, investigação e compreensão da sua farmacocinética e

biodisponibilidade dos seus constituintes bioativos.

22

Em 2012, Brito et al. (2012a) realizaram um levantamento de patentes

relacionadas ao citronelol (do inglês, citronellol) depositados no European Patent

Office (Espacenet), na World Intellectual Property Organization (WIPO), no United

States Patent and Trademark Office (USPTO) e no Banco de dados do Instituto

Nacional de Propriedade Industrial (INPI) do Brasil, com o objetivo de realizar um

rastreamento das pesquisas já desenvolvidas e patenteadas, avaliando-se as

diversas utilizações descritas para o citronelol. Foi verificado, então, que há um

pequeno número de patentes relacionados ao citronelol depositadas nos últimos dez

anos, porém, ressaltam que os Estados Unidos lideram o ranking de patentes entre

os países e que ainda existem poucas patentes com código A61K (preparações para

finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas). Sendo assim, o citronelol

destaca-se como um composto de boa relevância relacionada à inovação

tecnológica, principalmente no que diz respeito a tecnologias para preparações em

saúde.

1.3 Efeitos do β-citronelol

O β-citronelol, que possui como sinônimos, 3,7 dimetil-6-octeno-1-ol e,

citronellol (LAPCZYNSKI; LETIZIA; API, 2008) (Figura 3), monoterpeno alcoólico

com peso molecular de 156,27 g/mol, é um dos constituintes majoritários do óleo

essencial de algumas plantas medicinais utilizadas na medicina popular como droga

anti-hipertensora (ABEGAZ; YOHANNES; DIETER, 1983; QUINTANS-JÚNIOR et

al., 2008), anti-inflamatória (KATSUKAWA et al., 2011; GBENOU et al., 2013),

analgésica (BRITO et al., 2012b), anticonvulsivante (SOUSA et al., 2006),

antioxidante (BRITO et al., 2012b), anti-microbiana local e acaricida (MATTOS et al.,

2000), como Cymbopogon nardus L. Rendle, Cymbopogon citratus, Cymbopogon

winterianus, Eucalyptus citriodora, Óleo de rosa e Lippia alba. Esses diversos tipos

de efeitos são atribuídos aos monoterpenos, que são os principais componentes

químicos desses óleos essenciais (SOUSA et al., 2006).

23

Figura 3 - Estrutura química do β-citronelol.

Fonte: Sebastião et al. (2011).

Vários estudos observaram que plantas produtoras de citronelol possuem

potenciais atividades farmacológicas. Por exemplo, o capim citronela (Cymbopogon

winterianus) e a Erva-cidreira-de-arbusto (Lippia alba) são plantas medicinais que

possuem o citronelol em sua composição quimica e são indicadas no combate à

febre, tosse, gripe (GHEDINI et al., 2002) e asma (BARBOSA et al., 2007).

Um estudo clínico avaliou a junção de 4 extratos de plantas medicinais

(Ganoderma lucidum – 3 mg, Codonopsis pilosula – 27,1 mg, Angelica sinensis –

64,5 mg) e Citronellol (273,6 mg), chamado de CCMH, adiministrados por 6

semanas, em forma de cápsulas, para 105 pacientes (74 mulheres e 31 homens)

como terapia coadjuvante do câncer (n = 60 mama, n = 24 colorretal, n = 14

nasofaríngeo e n = 7 pulmão), ressalta-se que o pacientes estavam em tratamento

quimioterápico e/ou radioterápico. Foi realizado um hemograma completo antes e

após as 6 semanas de tratamento. O estudo demonstrou que foi possivel diminuir a

leucopenia, neutropenia, as células exterminadoras naturais ou células NK (do

inglês, natural killer cell) e as contagens de linfócitos CD4, demonstrando que o

tratamento com CCHM poderá ter implicações clinicas importantes em pacientes

com câncer que são submetidos ao tratamento com quimioterapia e/ou radioterapia

(ZHUANG et al., 2009).

O citronelol também possui registros de seus efeitos como inseticida e de

repelência contra mosquitos e moscas (RAJA et al., 2001), atividade acaricida

(OLIVO et al., 2008), elevada ação carrapaticida (CHUNGSAMARNYART;

JIWAJINDA, 1992), antifúngico (PATTNAIK; SUBRAMANYAM; KOLE, 1996;

NAKAHARA et al., 2003), anti-inflamatório (SU et al., 2010), vasodilatador (BASTOS

et al., 2009), melhora da função imunológica (ZHUANG et al., 2009) e possível

atividade anticonvulsivante (SOUSA et al., 2006; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008),

24

entretanto, não existem, até o momento, estudos sobre suas atividades

farmacológicas no músculo liso traqueal.

Guimarães; Quintans; Quintans-Júnior (2013) realizaram uma revisão

sistemática buscando elucidar quais os monoterpenos (citral, citronelal, citronelol,

geranial, linalol, linalil-acetato, 1,8 cineol, timol, -terpineol, entre outros) com

atividade analgésica, para isso, pesquisaram 27 monoterpenos utilizados em

modelos de nocicepção animal. Os autores destacaram que o citronelol, alvo do

nosso estudo, é um monoterpeno alcoólico com estrutura análoga a do citronelal, e

apresenta efeitos analgésicos provavelmente mediados pela inibição de mediadores

periféricos, como o Fator de Necrose Tumoral- (TNF-) e síntese de oxido nítrico,

bem como mecanismos inibitórios centrais via receptores opióides (BRITO et al.,

2012b). Por fim, os autores ressaltam os monoterpenos como importantes

candidatos para o desenvolvimento de novos medicamentos que diminuam as

condições dolorosas dos processos patológicos.

Sá; Andrade; Sousa (2013) realizaram outra revisão interessante sobre a

atividade anti-inflamatória de vários monoterpenos (1,8-cineol; L-mentol; terpineol;

timol; carvacrol; linalol; citral; citronelol; limoneno; entre outros), e concluiram que,

eles são substancias bioativas em modelos experimentais de doenças inflamatórias,

com elevado potencial terapêutico servindo como fontes para o desenvolvimento de

novos medicamentos.

1.4 Músculo liso traqueal

O músculo liso está presente em vários sistemas do organismo humano,

particularmente no revestimento de órgãos como os vasos sanguíneos, estômago,

intestino, traqueia, útero, pele, dentre outros, sendo um importante alvo para estudos

relacionados à fisiologia e farmacologia de diversos produtos naturais

(SILVERTHORN, 2010).

Em relação à traqueia, ela possui forma cilindróide sendo constituída, em

suas partes anterior e laterais, por 16 a 20 anéis de cartilagem hialina ovais,

revestidas por peritônio e unidos entre si por tecido conjuntivo frouxo e feixes

musculares lisos que lhe propiciam rigidez ao colabamento. A parte posterior é plana

25

e formada por miofibrilas lisas que constituem o músculo liso traqueal. Toda a

traqueia é envolvida por camadas: mucosa, submucosa, cartilaginosa e adventícia

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008).

Um dos mais importantes problemas em todas as vias respiratórias é

mantê-las abertas e permitir o fluxo livre de ar para os alvéolos e a partir deles. Para

evitar o colabamento da traqueia, múltiplos anéis cartilaginosos estendem-se por

cinco sextos do diâmetro traqueal. Nas paredes brônquicas, placas cartilaginosas

encurvadas menos extensas mantêm a rigidez de forma razoável, embora permitam

mobilidade suficiente para a expansão e contração dos pulmões. Em todas as áreas

da traqueia e brônquios ocupadas por placas cartilaginosas, as paredes são

compostas principalmente por músculo liso (GUYTON; HALL, 2011).

A túnica interna da traqueia é formada por epitélio pseudo-estratificado

cilíndrico e ciliado e uma lâmina própria. A célula ciliada é rica em mitocôndrias, no

pólo apical, e contém, aproximadamente, 270 cílios (JUNQUEIRA; CARNEIRO,

2008; GUIMARÃES, 2006).

As fibras parassimpáticas derivadas do nervo vago penetram no

parênquima pulmonar. Esses nervos secretam acetilcolina e quando ativados

causam constrição dos bronquíolos, de forma reflexa, com característica leve à

moderada. O sistema parassimpático é uma das principais vias responsivas à

irritação da membrana epitelial, que pode ser iniciada por: gases nocivos, poeira,

fumaça de cigarro ou infecção brônquica (GUYTON; HALL, 2011).

Johnson (2000); Junqueira; Carneiro (2008) destacam também, que a

traqueia possui além da função condutora a função protetora, através de dois

sistemas de defesa contra o meio externo; a barreira mucosa e a linfocitária, de

função imunitária, que se distribui ao longo de toda sua estrutura, assim como o

músculo liso traqueal.

O músculo liso é controlado involuntariamente e possui dois tipos de

contração: a tônica (resposta contrátil vagarosa e sustentada no tempo) e a fásica

(contrações súbitas e de curta duração). O músculo liso apresenta outra

característica peculiar, a possibilidade de contrair-se sincronicamente, através de

ligações entre si, facilitando a transmissão elétrica entre suas células (DOUGLAS,

2006).

26

1.5 Contratilidade do músculo liso

O músculo liso é encontrado principalmente na parede dos tubos e órgãos

ocos, e quando submetido a uma contração, ocorre uma alteração no formato do

órgão, mecanismo importante para a manutenção da homeostase corporal. Nos

humanos, o músculo liso pode ser dividido em 6 grupos principais: vascular,

gastrintestinal, urinário, respiratório, genital e ocular (SILVERTHORN, 2010).

Particularmente no músculo liso, o seu potencial de membrana está

sujeito a muitas influências externas e internas (RHOADES; TANNER, 2005). A

contratilidade dos músculos esquelético e liso são semelhantes no tocante à

ativação pelo aumento intracelular dos íons Ca2+, entretanto, em vez da troponina as

células musculares lisas possuem outra proteína reguladora chamada de

calmodulina. A calmodulina é uma proteína que possui 4 sítios de ligação para o

Ca2+ e compõe um importante papel de alvo intracelular (MANI; KAY, 1996). Para

fornecer energia para contração o trifosfato de adenosina (ATP) é degradado em

difosfato de adenosina (ADP) (GUYTON; HALL, 2011).

O músculo liso traqueal utiliza fontes extra e intracelulares de Ca2+ para

contrair-se. O Ca2+ pode entrar do meio externo através dos canais de Ca2+

operados por voltagem (VOC), chamado de acoplamento eletromecânico, ou pelos

canais de Ca2+ operados por receptor (ROC), chamado de acoplamento

farmacomecânico. Ambos os canais estão presentes na membrana, além de

inúmeros outros canais que se apresentam como alvos atrativos para abordagens

terapêuticas no tocante à asma (receptor de potencial transitório, canais ativados por

K+; canais de Ca2+ operados por estoque, entre outros) (RUSSEL, 1986; PEREZ-

ZOGHBI et al., 2009).

O aumento na concentração intracelular de Ca2+, ocasionada pela

abertura dos canais de Ca2+ ou pelo Ca2+ armazenado no retículo sarcoplasmático,

faz com que o Ca2+ se ligue a calmodulina (complexo Ca2+-calmodulina),

obedecendo a lei de ação das massas, e ativa a enzima quinase da cadeia leve de

miosina (MLCK do inglês, myosin light chain kinase), mecanismo conhecido como

sensibilização ao Ca2+. Em seguida, esta quinase começa a fosforilar a cadeia leve

da miosina (MLC do inglês, myosin light chain) permitindo a interação entre a

molécula de miosina com a de actina. Após a interação molecular ocorre a formação

27

das pontes cruzadas e clivagem de ATP pela ativação da ATPase (SOMLYO;

SOMLYO, 1968; WEBB, 2003).

A seguir destacamos os principais processos que ocorrem durante a

contração do músculo liso (SILVERTHORN, 2010):

1. Inicio da contração pelo aumento do Ca2+ no citosol;

2. O Ca2+ liga-se a calmodulina;

3. A ligação do Ca2+ com a calmodulina inicia uma sequência que termina na

fosforilação da miosina;

4. A fosforilação da miosina aumenta a atividade da ATPase da miosina e

resulta na contração.

A entrada de Ca2+ pela via VOC, ocorre após a despolarização da

membrana, que pode ser ocasionada de forma direta, pelo aumento da

concentração externa de K+, ou de forma indireta, pela ativação de ROC’s, abrindo

canais de Ca2+ (Figura 4 e 5). É importante ressaltar que essa entrada de Ca2+

ocorre de forma rítmica, aumentando e diminuindo continuamente, sendo essa

oscilação relacionada diretamente à concentração da substância contraturante

utilizada (PEREZ-ZOGHBI et al., 2009). Os VOC’s tipo L destacam-se no músculo

liso traqueal. Eles são sensíveis a dihidropiridinas (DHP) e estão presentes também

no músculo esquelético (CATTERALL, 1988).

A entrada de Ca2+ via ROC promove ativação da proteína G (tipo Gαq)

originando 2 segundos mensageiros, gerados na via da fosfolipase C, potentes a

partir do fosfolipídio de membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2): o inositol

1,4,5-trifosfato (IP3), que sinaliza receptores de membrana de IP3, mobilizando o

Ca2+ proveniente do retículo sarcoplasmático para o citosol, aumentando a

concentração de Ca2+ no meio intracelular, e o diacilglicerol (DAG), que ativa a

proteína quinase C (PKC), que fosforila proteínas alvo especificas. Sendo assim,

tanto a mobilização do Ca2+ como a ativação da PKC desempenham papeis críticos

e importantes no processo de broncoconstrição das vias aéreas (WEEB, 2003;

DOUGLAS, 2006; SILVERTHORN, 2010).

O Ca2+ pode ser liberado do retículo sarcoplasmático através de dois

mecanismos: pelo receptor de IP3 (IP3R), mencionado anteriormente, e pelos

recetores sensíveis à rianodina, denominados de receptores de rianodina (RyR),

esse receptor também pode ser ativado pelo próprio Ca2+, mecanismo chamado de

liberação do Ca2+ induzida por Ca2+ (CICR do inglês, calcium-induced calcium

28

release) (WRAY; BURDYGA, 2010). A resposta contrátil ocasionada pelo

acoplamento farmacomecânico pode promover, também, o aumento do Ca2+ por

ativação do trocador Na+/Ca2+ reverso (JACKSON, 2000). Já foi relatado também a

importância dos RyR na manutenção da contração atuando em conjunto com o IP3

(SANDERSON et al., 2008).

A participação da via adrenérgica, relacionada ao sistema nervoso

simpático, no músculo liso repiratório é pequena. Alguns autores afirmam até

mesmo a sua inexistência, mas é de conhecimento geral o papel importante dos

receptores adrenérgicos (tipo β2) no relaxamento bronquial mediado pelo aumento

do AMPc (3,5adenosina monofosfato cíclico) que ativa a proteína quinase A (PKA)

desviando a MLCK e promovendo a redução intracelular de Ca2+, mecanismo oposto

à via colinérgica, que provém do sistema nervoso parassimpático. Os receptores

colinérgicos muscarínicos (tipo M3) são os principais mediadores da contração em

vias aéreas ativando os canais ROC, essa via é a responsavel pela manutenção do

controle motor do músculo liso traqueal (WEBB, 2003; RANG et al., 2005).

Nas células musculares da via aérea existem também os canais de Ca2+

operados por estoque (SOC), que são ativados após a depleção dos estoques

intracelulares de Ca2+ provenientes do retículo sarcoplasmático (SWEENEY et al.,

2001). A superfamília de TRP’s também auxiliam a entrada de Ca2+ pelos canais

SOC, ela é composta por três sub-famílias: TRPC (canal de cátions clássico,

incluindo os 7 membros), TRPV (vanilóide) e TRPM (melastatina) (MARTHAN,

2004).

29

Figura 4 - Contração do músculo liso traqueal.

1. Ligação do agonista ao receptor de membrana. 2. Estimulação da fosfolipase C pela subunidade α da proteína G. 3. Clivagem do lipídio de membrana. 4. Geração de IP3 e DAG. 5. Ligação do IP3 a receptores específicos no Retículo Sarcoplasmático (IP3R) e atuação do DAG em diferentes mecanismos. 6. O aumento do Ca

2+ citosólico estimula a abertura dos canais receptores de rianodina

(RyR). 7. Ca2+

ligando-se à CaM. 8. Complexo CaM-4Ca2+

ativa a quinase de cadeia leve de miosina (MLCK). 9. MLCK fosforila a cadeia leve de miosina (MLC). 10. A fosforilação da MLC ocasionando contração. Fonte: Figura gentilmente cedida por Kennedy-Feitosa (2012).

Figura 5 - Canais de Ca2+.

30

A hiperpolarização da membrana é o mecanismo eletromecânico

envolvido no processo de relaxamento muscular, que pode ser desencadeada por

diversos fatores (KOMALAVILAS; LINCOLN, 1996). No acoplamento

farmacomecânico para a contração ser encerrada ou ocorrer relaxamento, é

necessário a remoção do estímulo contrátil ou ação de uma substância que estimule

a inibição do mecanismo contrátil. As concentrações intracelulares de Ca2+

começam a diminuir e se dissociar da calmodulina, indo em direção ao meio

extracelular ou captado para os estoques intracelulares (ativação da bomba Ca2+-

ATPase, a SERCA do inglês, sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium ATPase),

inativando a MLCK. Esse processo de relaxamento acontece através da fosfatase da

cadeia leve de miosina (MLCP do inglês, myosin light chain phosphatase) que

desfosforila a cadeia leve da miosina (Figura 6) (SOMLYO; SOMLYO, 1968; WEBB,

2003; PEREZ-ZOGHBI et al., 2009).

Interessante o destaque com relação ao nível molecular, indicado por

Sanderson et al. (2008), que informaram que a contração das vias aéreas é

fundamentalmente regulada pelas atividades antagônicas da miosina de cadeia leve

quinase (MLCK) e fosfatase (MLCP).

Segundo Silverthorn (2010), pela lei de ação das massas, um decréscimo

do Ca2+ livre no citosol determina que ele se desligue da calmodulina, na ausência

da ligação Ca2+-calmodulina a enzima quinase da cadeia leve de miosina é

inativada. A função de armazenamento de Ca2+ no retículo sarcoplasmático pode ser

suplementada pelas cavéolas, pequenas vesículas próximas à membrana celular.

31

Figura 6 - Relaxamento do músculo liso traqueal. 1. Dissociação do agonista do receptor de membrana. 2. Retorno da subunidade α. Os canais para membrana fecham-se em resposta à diminuição dos estímulos contráteis. Antiportador Na+-Ca

2+,

bombas de Ca2+

da membrana celular e do retículo sarcoplasmático retiram o Ca2+

do citosol. Na+-K

+-

ATPase restabelece o potencial de membrana. Os estoques intracelulares do Ca2+

são repostos. 3. Fosfatase de cadeia leve de miosina (MLCP) desfosforila a MLC ocasionando relaxamento. Fonte: Figura gentilmente cedida por Kennedy-Feitosa (2012).

1.6 Asma

A asma é uma das doenças crônicas mais comuns, presente em todos os

países, independente do grau de desenvolvimento em que estes se encontram.

Clinicamente ela pode ser dividida em: extrínseca, causada pela exposição a fatores

ambientais (estímulos químicos e físicos, exercícios, reações antígeno-anticorpo e

fumaça de cigarro) e intrínseca, não relacionada à alérgenos e menos responsiva à

terapia broncodilatadora (POLOSA et al., 1998; CARRIERE et al., 2007).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que

235 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de asma, com perspectiva de

aumento dessas taxas em 20% nos próximos 10 anos, além de ser a doença crônica

mais comum entre as crianças. Mais de 80% das mortes por asma ocorrem em

países de baixa e média-baixa renda, ela é comumente sub-diagnosticada e sub-

32

tratada, criando um ônus substancial aos indivíduos, famílias e governo (WORLD

HEALTH ORGANIZATION, 2013).

As causas da asma ainda não são completamente compreendidas. Os

fatores de risco mais fortes para o seu desenvolvimento são uma combinação de

predisposição genética com exposição ambiental às substâncias e partículas que

podem provocar reações alérgicas ou irritar as vias aéreas: alérgenos presentes em

ambientes interiores (ácaros em roupas de cama, tapetes e móveis estofados,

poluição e pêlos de animais); alérgenos presentes em ambientes exteriores (pólen,

fumaça de cigarro; irritantes quimicos do local de trabalho e poluição atmosférica)

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2013).

A asma é classificada como sendo uma doença inflamatória crônica,

caracterizada por limitação ao fluxo aéreo, que pode ser parcialmente ou

completamente revertida espontaneamente ou com tratamento específico. A

inflamação está associada à hiperresponsividade brônquica com estreitamento das

vias aéreas (diminuição do lúmen traqueal) em resposta a estímulos diversos (Figura

7), manifestando-se com sibilância, dispnéia, aperto no peito e tosse (MAUAD et al.,

2000; LIRA; SILVA, 2005). Com a progressão da obstrução ao fluxo aéreo na crise

asmática grave, pode ocorrer a insuficiência respiratória em consequência ao

aumento do trabalho respiratório, da troca gasosa ineficaz e da exaustão dos

músculos respiratórios (FITZGERALD; GRUNFELD, 2001; RODRIGO; RODRIGO;

HALL, 2004).

Figura 7 - Hiperreatividade brônquica é decorrente do ambiente inflamatório.

Fonte: Wikimedia Commons.

Aide et al. (2001) afirmam que uma das características principais da asma

é o seu carater inflamatório, apresentando alterações importantes nas vias aéreas

com a participação de vários tipos celulares e liberação de mediadores pró-

Vias aéreas normais

Vias aéreas inflamadas

33

inflamatórios, principalmente, mastócitos (histamina, leucotrienos, triptase e

prostaglandinas), macrófagos (TNF-, IL-6, óxido nítrico), eosinófilos (proteína

básica principal, proteína catiônica eosinofílica, peroxidase eosinofílica, mediadores

lipídicos e citocinas) e linfócitos T (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, fator de crescimento de

colônia de granulócitos), pelos neutrófilos (elastase) e pelas células epiteliais

(endotelina-1, mediadores lipídicos, óxido nítrico) a inflamação também provoca

hiperresponsividade brônquica a uma serie de estímulos.

Com o avanço científico e tecnológico foram descobertos vários

medicamentos que atuam no tratamento da asma, entre eles, destacam-se os

antagonistas muscarínicos, por exemplo, o brometo de ipratrópio (Atrovent®) e

brometo de tiotrópio (Spiriva®), e os agonistas 2-adrenégicos, no caso o salbutamol

(Aerolin®) destaca-se entre os demais por sua larga comercialização mundial, tendo

seu lançamento realizado em 1968. Apesar do alivio dos sintomas, os fármacos

broncodilatadores desempenham sua função em associação com anti-inflamatórios,

essa combinação é a terapia mais eficiente no manejo da asma (CORRÊA; MELO;

COSTA, 2008).

Outra forma de tratamento da asma é a administração de corticosteróides

inalatórios, eles são os principais medicamentos utilizados na manutenção e

profilaxia anti-inflamatória, tanto para adultos como em crianças. O tratamento

contínuo reduz a frequência, gravidade das exacerbações, número de

hospitalizações e dos atendimentos de emergência (IV DIRETRIZES BRASILEIRAS

PARA O MANEJO DA ASMA, 2006), porém, Ribeiro; Toro; Baracat (2006); Irwin;

Richardson (2006); Cerasoli (2006) destacam que o uso contínuo da associação

entre broncodilatadores 2-agonistas e corticosteróides inalatórios pode ocasionar

alguns efeitos adversos, dentre eles, candidíase oral, tolerância, alterações visuais

(glaucoma e catarata) e do crescimento (redução da densidade mineral óssea),

arritmias e aumento dos riscos cardiovasculares.

Vários estudos (MAGALHÃES, 2002; MAGALHÃES et al., 2003;

BASTOS, 2009; PINHO, 2010; BASTOS et al., 2011; BOSKABADY et al., 2011; DE

SIQUEIRA et al., 2012) foram realizados com o intuito de analisar os efeitos de óleos

essenciais em modelos experimentais de asma. Tais modelos utilizam o antígeno

ovalbumina, que mimetiza em animais as condições presentes na doença humana,

por exemplo, a hiperreatividade brônquica, aumento da secreção no trato

34

respiratório e dificuldade ventilatoria, sendo portanto, um modelo interessante

quando se deseja produzir as caracteristicas da asma em animais (KEIR; PAGE,

2008).

Segundo Gualdi et al. (2010), é essencial a utilização de animais em

modelos de asma com o intuito de compreender melhor o mecanismo da doença e

testar novos fármacos. A ovalbumina é o antígeno mais popular em experimentos

relacionados à asma, principalmente por sua disponibilidade comercial, facilidade de

manipulação e pelos animais não possuirem contato ambiental com a mesma.

35

JUSTIFICATIVA

36

2 JUSTIFICATIVA

-Citronelol é um dos constituintes majoritários do óleo essencial de

várias plantas medicinais utilizadas na medicina popular, às quais foram atribuídas

propriedades miorrelaxantes em músculo liso vascular e hipotensora (BASTOS et

al., 2009), anti-inflamatórias (SU et al., 2010; SÁ; ANDRADE; SOUSA, 2013),

antioxidantes (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2011), analgésicas (GUIMARÃES;

QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 20122013; BRITO et al., 2012b), antifúngicas

(PATTNAIK; SUBRAMANYAM; KOLE, 1996; NAKAHARA et al., 2003) e

anticonvulsivantes (SOUSA et al., 2006; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008). Por outro

lado, ainda são escarsas na literatura informações detalhadas sobre a eficácia desse

constituinte na mediação dessas ações, em especial em tecidos musculares lisos

oriundos das vias aéreas. Tal abordagem torna-se necessária dada a significativa

utilização popular do óleo de citronela como repelente de insetos e também em

velas aromáticas e incensos, procedimentos que frequentemente podem expor

indivíduos à inalação desses produtos a diferentes concentrações ambientais.

Portanto, a presente abordagem pretende estabelecer o perfil farmacológico da

interação citronelol – célula muscular lisa traqueal mediante avaliação de parâmetros

contráteis do músculo liso das vias aéreas mantidos em diferentes condições

experimentais (sob tônus basal, sob ativação contrátil por meio de substâncias

classicamente conhecidas, ou sob condições que envolvem hiperreatividade

traqueal em animais submetidos a desafio com o antígeno sensibilizante). Dentre as

potenciais propriedades farmacológicas desse composto, pretendemos esclarecer

se e como essa substância exerce efeito miorrelaxante em tecidos traqueais,

revelando também potencial ação anti-inflamatória, especialmente em animais que

simulam as condições típicas do processo asmático.

37

OBJETIVOS

38

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterizar as propriedades farmacológicas do β-citronelol em vias

aéreas de ratos Wistar.

3.2 Objetivos Específicos

1. Verificar, in vitro, o efeito do β-citronelol na resposta contrátil de traqueia

isolada de ratos Wistar sensibilizados e desafiados com antígeno.

2. Avaliar o efeito provocado pela presença do β-citronelol, in vitro, em anéis

de traqueia de rato mantidos sob tônus basal.

3. Caracterizar o efeito do β-citronelol, in vitro, em anéis de traqueia de rato

sob estímulo contrátil induzido por agonistas classicamente conhecidos.

4. Investigar a participação dos diferentes canais para Ca2+ como parte dos

efeitos induzidos pelo β-citronelol em anéis de traqueia de rato in vitro.

39

METODOLOGIA

40

4 METODOLOGIA

4.1 Animais

Neste trabalho foram utilizados ratos Wistar, pesando entre 200 – 280 g

provenientes do biotério central da Universidade Federal do Ceará (UFC) e mantidos

no Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC.

Os animais foram tratados com respeito às normas de cuidado e bem estar animal

preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O

presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFC

(CEPA), sob número de protocolo 28/12 (Anexo A).

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Farmacologia do

Músculo Liso (LAFARMULI) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.

Os animais foram alojados no Biotério setorial do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC durante o período que

precedeu a pesquisa em gaiolas plásticas, com medidas de 41 x 34 x 16 cm e

capacidade para 6 ratos. Durante o alojamento, a manipulação dos animais consistiu

apenas dos procedimentos necessários para troca de ração, água, limpeza e

higienização das gaiolas. Sendo água e ração fornecidas ad libitum, ressalta-se que

os animais foram mantidos em condições de temperatura constante (22 ± 2°C), com

um ciclo de 12 horas claro/escuro e, após sacrifício (exsanguinação pela artéria

carótida esquerda) e remoção dos tecidos para estudo, suas carcaças foram

encaminhadas para coleta seletiva sob responsabilidade da instituição.

Os animais considerados nesse estudo foram divididos em 04 grupos

principais:

Controle: Ratos naive, isto é, não submetidos a qualquer tratamento.

Sensibilizado: Ratos tratados com o antígeno sensibilizante, e

posteriormente desafiados pela inalação de aerossol de solução salina.

41

Desafiado: Ratos tratados com o antígeno sensibilizante e

posteriormente desafiados com inalação de aerossol de solução

contendo o antígeno sensibilizante.

Tratado

1. In vivo - Ratos tratados com o antígeno sensibilizante, e que

inalaram β-citronelol (300 µM) previamente ao desafio mediante

inalação do antígeno sensibilizante.

2. In vitro - Ratos submetidos ao tratamento com a adição de β-

citronelol na cuba para órgão isolado.

4.2 Soluções e fármacos utilizados

Utilizou-se a solução nutridora de Krebs-Henseleit com a seguinte

composição (nmol/L): NaCl = 118; K+ = 4,7; Ca2+ = 2,5; MgSO4 = 1,2; NaHCO3 = 25;

KH2PO4 = 1,2 e glicose = 10. A solução sem Ca2+ foi preparada com a retirada do

Ca2+ da solução de Krebs adicionando-se ácido etileno-bis (β-amino-etil-éter)-

N,N,N',N'-tetracético (EGTA).

O -citronelol foi preparado diariamente antes de cada experimento,

sendo dissolvido diretamente em Krebs-Henseleit e Tween 80 (2%, v/v para a

solução-mãe), sendo sonicado imediatamente antes da utilização. A máxima

porcentagem de Tween 80 na câmara de banho foi de 0,008% (v/v), não

apresentando efeito significativo sobre as preparações. As substâncias foram

preparadas como soluções estoque, dissolvidas conforme indicação do fabricante, e

foram adicionadas ao volume com solução de Krebs, a fim de obter uma

concentração desejada na câmara de banho.

Sais e drogas (todos de grau de pureza analítica) destacados abaixo

foram adquiridos da Sigma Chemical (Saint Louis, MO, E.U.A.), com exceção do

Hidróxido de Alumínio e Pentobarbital Sódico :

β-citronelol;

A-967079;

Atropina;

Azul de Metileno;

Cloreto de Potássio;

42

Cloridrato de cloreto de

acetilcolina;

Hidróxido de Alumínio (União

Química Farmacêutica

Nacional, SP, Brasil);

Indometacina;

L-NAME;

Ortovanadato de Sódio;

Ovalbumina;

Pentobarbital Sódico (Cristália

Produtos Químicos e

Farmacêuticos, SP, Brasil);

Tapsigargina;

Tetraetilamônio;

Verapamil.

4.3 Métodos de sensibilização, desafio antigênico e tratamento

A sensibilização dos animais foi obtida de forma ativa mediante

aplicações de injeções intraperitoneais do antígeno sensibilizante (ovalbumina –

OVA; chicken egg albumin, grade II, Sigma Chemical®, 10 mg/kg, 3 aplicações em

dias alternados – nos dias 1, 3 e 5) de acordo com adaptação do método descrito

por Weinreich; Undem (1987), mas com a adição de 1 mg/mL de Al(OH)3 como

adjuvante em solução salina (NaCl 0,9%) (MOURA 2004; REZENDE et al. 2008;

GUALDI et al. 2010; SHIN et al. 2013). Os animais foram utilizados após um período

mínimo de 21 dias e não mais que 50 dias após a última injeção aplicada no período

de sensibilização.

Em alguns grupos de animais submetidos ao processo de sensibilização

ocorreu o desafio antigênico, broncoprovocação, por meio da inalação de

ovoalbumina, que deve ser realizada entre os dias 21 e 50 pós-sensibilização,

impreterivelmente 12 horas antes da realização dos experimentos in vitro, no

presente estudo os animais foram desafiados no 25º dia após a sensibilização. Para

tal, os animais foram colocados em uma caixa de acrílico medindo 30 x 16,6 x 19,8

cm. Na parte superior da caixa existe uma tampa removível para introdução dos

animais. Nas porções laterais existem dois orifícios: um para acoplar o nebulizador

ultra-sônico (Respira Max® Inalador ultra-sônico, NS Indústria de Aparelhos Médicos

Ltda., SP, Brasil), por meio do qual foi realizada a nebulização de solução com o

43

antígeno sensibilizante (desafio antigênico) e o outro serviu de escape, evitando a

reinalação do ar expirado (Figura 8) (BASTOS, 2009; PINHO, 2010).

Figura 8 - Método de inalação.

Para a nebulização do antígeno sensibilizante, a ovalbumina foi diluída

em solução salina mantida à temperatura ambiente imediatamente antes da

inalação. Em seguida, a solução contendo ovalbumina foi colocada no nebulizador

que foi acoplado à caixa de acrílico para iniciar o processo de nebulização do

antígeno. Após a colocação do animal na caixa de acrílico, foi iniciado o processo de

inalação com duração de 30 minutos: 15 minutos na concentração de 1 mg/mL e 15

minutos com a concentração de 5 mg/mL de OVA (BASTOS et al., 2011; BEZERRA

et al., 2013). Durante o processo de desafio antigênico os animais foram observados

quanto ao aparecimento de alterações respiratórias (tiragem intercostal, desconforto

respiratório, epistaxe, aumento do ritmo respiratório ou tosse associada à coriza

intensa), se confirmadas, a inalação foi interrompida, pois a sobrevivência do animal

poderia ser comprometida.

Os animais sensibilizados utilizados como controle inalaram solução

salina (NaCl 0,9%) por 30 minutos e os animais do grupo tratado foram submetidos

ao pré-tratamento com a inalação de -citronelol na concentração de 300 µM

(escolhida através de experimentos preliminares por ser capaz de gerar entre 50-

75% do efeito miorrelaxante máximo em tecidos isolados), diluído em solução salina

(NaCl 0,9%) por 15 minutos antes do desafio antigênico (Figura 9). Ressalta-se que

o modelo de inalação com nebulizador ultra-sônico, descrito anteriormente, também

44

foi utilizado para a inalação de solução salina ou -citronelol, porém, foram

diferenciadas as caixas de acrílico e os nebulizadores de acordo com a divisão dos

grupos.

Figura 9 - Protocolo experimental de sensibilização, tratamento e desafio.

4.4 Experimentos in vitro

4.4.1 Traqueia isolada

Para os experimentos in vitro envolvendo a contratilidade traqueal os

animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.) e

posteriormente exsanguinados pela secção da artéria carótida esquerda. Em

seguida, após incisão mediana ventral, a traqueia foi rapidamente cortada em

segmento único de aproximadamente 10 - 12 mm conforme descrição literal em

BASTOS (2009). A seguir o segmento cortado, foi transportado para uma placa de

Petri contendo solução de Krebs-Henseleit à temperatura ambiente. Após a remoção

do excesso de tecido adjacente, a traqueia foi cortada em 3 ou 4 segmentos

cilíndricos e montada sob a forma de anéis. Estes foram mantidos em uma cuba

45

para órgão isolado contendo 5 mL de solução fisiológica de Krebs-Henseleit, pH =

7,4 à temperatura de 37C, mantida constante pela circulação de água proveniente

de banho maria (térmico) com propulsão, e continuamente aerados com mistura

carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2). A luz dos anéis traqueais foi atravessada

por duas peças metálicas confeccionadas em fino aço inoxidável, sem

intercruzamentos (Figura 10), as quais foram atados a dois pontos, um fixo na

câmara e outro conectado à unidade transdutora de força (ML870B60/C-V, AD

Instruments, Austrália) apropriada para o registro das contrações isométricas e

conectado a sistema de aquisição de dados (PowerLab™ 8/30, AD Instruments,

Austrália), como esquematizado na figura 11. A tensão inicial aplicada a cada

segmento traqueal foi ajustada em 1g. O período de equilíbrio foi de 1 hora com

troca do líquido de incubação a cada 15 minutos.

Os experimentos foram realizados de forma pareada, ou seja, a cada

sessão experimental foram montadas quatro traqueias em quatro cubas separadas,

sendo duas experimentais e duas controles. Este procedimento visou homogeneizar

ao máximo os procedimentos, tendo em vista que o líquido de incubação, e todas as

drogas utilizadas foram preparadas naquele momento, sendo, portanto utilizadas de

forma equânime nas traqueias controle e experimental. As soluções com os

fármacos foram preparadas pela adição da substância pura diretamente na solução

fisiológica e armazenadas em freezer em concentrações 100 a 1000 vezes maiores

que aquelas usadas na câmara durante os experimentos.

Figura 10 - Detalhe da montagem de anéis de traqueia de rato no sistema de contratilidade in vitro. Alterações no diâmetro da luz traqueal promovem contração (estreitamento da luz traqueal) ou relaxamento (aumento da luz traqueal). 1: Circulação de água destilada (37ºC); 2: Fio de algodão; 3: Transdutor de força; 4: Aeração com mistura carbogênica; 5: Descarte e 6: Anel de traqueia preso em peças triangulares de aço inoxidável. Fonte: Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso (LAFARMULI).

46

Figura 11 - Sistema utilizado nos experimentos de contratilidade in vitro em traqueia de rato. Fonte: Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso (LAFARMULI).

4.5 Protocolos experimentais

4.5.1 Curvas concentração-efeito

Para avaliar a viabilidade do tecido no início dos experimentos, as

preparações foram expostas a soluções despolarizantes com 60 mM de K+ até que

fossem obtidas duas respostas de mesma amplitude (esse período foi de

aproximadamente 30 a 60 minutos além do tempo necessário para o equilíbrio da

preparação). Após a confirmação da integralidade do tecido, os mesmos foram

expostos a diferentes estímulos contraturantes que serviram de referência para

expressar os resultados, sendo medidos pela diferença entre o pico da deflexão

positiva e o valor registrado no traçado de tensão basal antes da adição do agente

47

contrátil. Nos experimentos relacionados ao processo asmático utilizamos os pesos

dos tecidos para expressar os resultados, sendo assim, após o termino de cada

experimento os tecidos foram cuidadosamente retirados e colocados em estufa

durante 24 horas, após esse período foram mensurados os pesos de cada anel

traqueal, e os mesmos foram expressos em grama força por miligrama de tecido

(gF/mg de tecido).

Inicialmente foi avaliado os efeitos do -citronelol em um modelo que

simula a asma. Para isso, foram comparadas as respostas contráteis por meio de

curvas concentração-efeito (CCE) para K+ e para ACh em animais sensibilizados,

desafiados ou tratados com -citronelol.

As próximas series de experimentos foram realizadas em animais naive,

inicialmente buscamos analisar os possíveis efeitos inibitórios do β-citronelol, para

tanto, o composto foi adicionado na cuba para órgão isolado, antes da administração

de substâncias contráteis (K+ ou ACh). Para quantificar a inibição da contração

muscular, as preparações foram expostas inicialmente ao β-citronelol por 12

minutos, tempo estipulado após experimentos preliminares com confecção de curvas

dose-resposta, e então, estimuladas com um agente indutor de contração, ainda na

presença do β-citronelol.

Avaliou-se em seguida os efeitos do -citronelol sobre o tônus muscular,

para isso, duas peças adjacentes de tecido traqueal foram montadas e somente uma

foi exposta ao β-citronelol por 12 minutos. Nesse caso, o resultado foi considerado

pela diferença entre a linha de base da preparação experimental daquela da

preparação controle.

Em seguida, buscou-se compreender a atuação do -citronelol em

preparações pré-contraídas. As curvas concentração-efeito para determinar o efeito

miorrelaxante do β-citronelol foram obtidas pela exposição da preparação a

concentrações aumentadas deste, após o estimulo contrátil, de forma cumulativa no

banho, com intervalos sequenciais de 12 minutos para observar a resposta platô, em

alguns protocolos quando a contração do agonista não era sustentada foi necessário

a adoção do tempo de 3 ou 5 minutos de intervalo entre as concentrações de β-

citronelol.

Foram, também, realizados protocolos destinados à exploração

farmacológica do mecanismo de ação do β-citronelol, para tanto, diversos

48

antagonistas (Propranolol, L-NAME, TEA, Azul de Metileno, Ortovanadato,

Capsazepina, Indometacina e A-967079) foram utilizados com o intuito de observar

o efeito produzido pelo β-citronelol na presença desses bloqueadores. O β-citronelol

foi adicionado na cuba após a administração do antagonista e adição subsequente

de ACh, respeitando o intervalo de 12 minutos entre as concetrações do β-citronelol.

Para investigar a participação dos diferentes canais para Ca2+ nos efeitos

induzidos pelo β-citronelol em traqueia de ratos, foi trocado o liquido de incubação

por um modificado contendo zero Ca2+, substituído por EGTA. Em seguida, foram

adicionadas concentrações cumulativas de Ca2+ ou Ba2+, de forma pareada foram

utilizadas diferentes concentrações do -citronelol antes da adição de Ca2+ ou Ba2+ e

comparadas as respostas provenientes dos canais de Ca2+ operados por voltagem

(estimulados pela adição de K+) ou dos canais de Ca2+ operados por receptores

(estimulados pela adição de ACh em associação com o verapamil). Em outra serie

experimental, adicionou-se a tapsigargina com o intuito de avaliar a atuação do β-

citronelol na entrada de Ca2+ mediada por ativação de canais de Ca2+ operados por

estoques.

Efeito do β-citronelol sobre a hiperreatividade traqueal em animais controle ou

desafiados

No grupo controle o -citronelol foi adicionado nas cubas para órgão

isolado, e após 12 minutos foram confeccionadas CCE´s para as substâncias

contráteis (K+ e ACh). Para avaliação dos efeitos do -citronelol em inibir a

hiperreatividade traqueal, realizamos CCE´s com a adição cumulativa e crescente

das substâncias contraturantes K+ e ACh, que medeiam suas respostas em canais

VOC e ROC, respectivamente, respeitando o intervalo de 3 minutos entre as

concentrações.

No grupo de animais sensibilizados, desafiados ou tratados os

experimentos de contratilidade foram realizados após 12 horas da ultima inalação:

Grupo Sensibilizado - NaCl 0,9% durante 15 minutos; Grupo Desafiado –

ovalbumina por 15 minutos na concentração de 1mg/mL e 15 minutos com a de 5

mg/mL e Grupo Tratado - pré-tratamento com inalação de -citronelol por 15 minutos

na concentração de 300µM e em seguida desafiados.

49

Após a realização dos experimentos relacionados ao modelo de asma, os

anéis de traqueia dos animais sensibilizados, desafiados ou submetidos ao pré-

tratamento com -citronelol foram lavados com solução de Krebs-Henseleit

retornando as condições basais, em seguida, foi realizada a adição de OVA (10

µg/mL) na cuba para observarmos a reação de Schultz-Dale, que confirmou o

processo de sensibilização quando os tecidos apresentaram uma contração imediata

(tipo fásica), vigorosa e não sustentada.

Efeito do β-citronelol sobre o tônus basal em traqueia isolada de ratos

Para avaliar os efeitos do β-citronelol no tônus basal em traqueia isolada

de ratos, foram confeccionadas CCE’s com a adição cumulativa e crescente de β-

citronelol nas concentrações de 10, 30, 100, 200, 300, 600 e 1000 µM à solução

fisiológica nutridora normal na cuba para órgão isolado, respeitando o intervalo de

12 minutos entre as concentrações. O tônus basal foi avaliado mediante a subtração

entre a linha de base obtida ao final de cada período de exposição ao β-citronelol

com a linha de base obtida na ausência do mesmo, expressa como percentual (%)

da resposta controle obtida pela contração do K+ (60 mM). Após a adição da maior

concentração de β-citronelol, o tecido foi lavado mediante trocas sucessivas e

completas da solução fisiológica presente na cuba. Outro parâmetro avaliado que

indica a integridade do tecido ao final do experimento foi a repetição de uma

contração induzida pela adição de K+ (60 mM).

Efeito do β-citronelol sobre a contração sustentada de K+ ou ACh em traqueia

isolada de ratos

Este protocolo foi realizado com o intuito de avaliar qual a ação do β-

citronelol sobre um estimulo mediado pelo acomplamento eletromecânico (K+) ou

farmacomecânico (ACh), sendo assim, adicionou-se K+ (60 mM) ou ACh (5 µM) ao

meio de incubação dos anéis de traqueia isolada e após a resposta contrátil atingir o

platô, foram confeccionadas CCE´s com a adição cumulativa de β-citronelol nas

mesmas concentrações relatadas anteriormente, com o intervalo de 12 minutos

entre as concentrações. Experimentos similares foram realizados utilizando apenas

50

o veículo Tween 80 (2%, v/v) em concentrações equivalentes às utilizadas para

dissolver o β-citronelol.

Efeito do β-citronelol sobre a contração de 5-HT em traqueia isolada de ratos

Este protocolo foi realizado com o intuito de avaliar qual a ação do β-

citronelol sobre um estimulo contrátil mediado pelo neurotransmissor 5-HT, para

isso, estimulamos uma contração induzida por 5-HT (10 µM) em traqueia isolada de

ratos e após a obtenção do platô, foram confeccionadas CCE´s com a adição

cumulativa com o tempo de 3 minutos entre as concentrações de β-citronelol (10,

100, 300, 600 e 1000 µM) de forma pareada. A resposta à 5-HT não produziu uma

contração sustentada, por isso foi necessário a diminuição do tempo estipulado para

a adição do β-citronelol.

Efeito do β-citronelol sobre a contração de Ortovanadato de Sódio em traqueia

isolada de ratos

Este protocolo foi realizado com o intuito de observar qual a ação do β-

citronelol após o bloqueio da proteína responsável pelo mecanismo de relaxamento

do músculo liso traqueal (Proteína Tirosina Fosfatase), para isso, estimulamos uma

contração induzida por Ortovanadato de Sódio (0,3 mM) em traqueia isolada de

ratos e após a obtenção do platô, foram confeccionadas CCE´s com a adição

crescente e cumulativa de β-citronelol (10-1000 µM) de forma pareada, respeitando

o intervalo de 5 minutos entre as concentrações.

Participação dos Receptores β-Adrenérgicos, Óxido Nítrico, Canal de Potássio,

Guanilato Ciclase, Proteína Tirosina Fosfatase, Receptor TRPV-1, Enzima

Ciclooxigenase e Receptor TRPA-1 no efeito miorrelaxante do β-citronelol

sobre a contração de ACh em traqueia isolada de ratos

A fim de analisar farmacologicamente o efeito miorrelaxante do β-

citronelol em traqueia isolada de ratos, foi realizada a adição de bloqueadores

farmacológicos na cuba para órgão isolado, com um tempo mínimo de atuação de 5

minutos para cada droga, sendo assim, utilizou-se o Propranolol (10 µM),

51

bloqueador não-seletivo dos receptores β-adrenérgicos (MOREIRA, 2013), L-NAME

(50 µM), inibidor da enzima óxido nítrico sintase (BASTOS et al., 2009), TEA (5 mM),

bloqueador inespecífico de canais de K+ (SOUSA et al., 2010), Azul de Metileno (50

µM), inibidor da enzima guanilato ciclase (HWANG; WU; TENG, 1998),

Ortovanadato de Sódio (0,3 mM), inibidor não-seletivo de proteínas tirosina fosfatase

(YU et al., 2004), Capsazepina (30 µM), antagonista do receptor de potencial

transitório vanilóide - TRPV1 (ANDRE et al., 2006), Indometacina (10 µM), inibidor

não seletivo da enzima ciclooxigenase (COX) (MENEZES et al., 2010) e A-967079

(10 µM), bloqueador do receptor de potencial transitório anquirina 1 - TRPA1

(MCGARAUGHTY et al., 2010), em seguida foi produzida uma contração induzida

pela adição de ACh (5 µM) e após a resposta contrátil atingir um platô foram

confeccionadas CCE´s com o tempo de 12 minutos entre as concentrações

crescentes e cumulativas de β-citronelol (10-1000 µM).

Efeito do β-citronelol em preparações isoladas de traqueia contraídas com

uma combinação de K+ e ACh em meio contendo Ca2+ ou Ba2+

Com o objetivo de avaliar os efeitos do β-citronelol na entrada de Ca2+

através de canais VOC, preparações de traqueia foram estimuladas com 100 mM de

K+ na presença de solução contendo Ca2+ (2 mM) ou Ba2+ (2 mM). Após a contração

atingir um platô, a concentração de K+ foi aumentada em intervalos de 20 mM e 30

mM até atingir a concentração de 150 mM, promovendo uma contração máxima

oriunda dos canais VOC. Quando a concentração de K+ (150 mM) atingiu um platô,

adicionamos 60 µM de ACh na presença de altas concentrações de K+. Nessas

condições, o β-citronelol (10-1000 µM) foi adicionado às preparações respeitando

um intervalo de 12 minutos entre as concentrações de β-citronelol.

Efeito do β-citronelol nos canais de Ca2+ operados por voltagem, receptor ou

por estoque

Nas mesmas condições descritas acima, avaliou-se os efeitos do β-

citronelol sobre a liberação de Ca2+ do meio extra e intracelular. Inicialmente, após o

período de equilíbrio da preparação, foi modificada a solução fisiológica excluindo o

Ca2+ da solução e adicionando o EGTA (4 mM), um agente quelante de Ca2+, por 5

52

minutos. Em seguida as preparações foram estimuladas com K+ (60 mM), para ativar

canal de Ca2+ dependentes de voltagem, ou ACh (60 µM) na presença de Verapamil

(10 µM), para ativar canal de Ca2+ operados por receptor. Nessas condições os

anéis de traqueia não produziram contrações, ou quando produziram essa se

caracterizou por não ser sustentada, em seguida, após o estabelecimento de uma

tensão estável semelhante aos níveis basais, curvas concentração-efeito

cumulativas para o Ca2+ (0,1 - 50 mM), na presença de K+ ou ACh, ou Ba2+ (0,1 - 50

mM) na presença de K+, foram obtidas na ausência ou na presença de β-citronelol

(30, 100, 200 e 600 µM). A resposta máxima de Ca2+ foi considerada quando

determinado aumento na concentração não desenvolveu um aumento significativo

de força. A amplitude destas contrações foi registrada como percentual da contração

inicial induzida por K+ (60 mM).

Para a análise dos efeitos do β-citronelol em canais de Ca2+ operados por

estoque, adicionamos EGTA (4 mM) e Tapsigargina (1 µM), substância capaz de

inibir a bomba de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (SERCA) (PAREKH; PUTNEY,

2005), esperamos o tempo de 5 minutos, e em seguida, adicionamos ACh (60 µM),

esse procedimento foi repetido por 2 ou 3 vezes até a ausência de contração

demonstrando o esgotamento dos estoques intracelulares de Ca2+, e assim, ativando

consequentemente os canais SOC.

Então, após nova lavagem da preparação com solução sem Ca2+ para

remoção da ACh, e posterior adição de Tapsigargina (1 µM), o Ca2+ (2,5 mM) foi

adicionado para produzir um efeito contrátil promovido pela entrada capacitativa

desse íon via SOC, na ausência ou na presença de β-citronelol (30, 100, 200 e 600

µM). Como controle negativo, pré-tratamos os anéis de traqueia com Verapamil (1

µM) em substituição ao β-citronelol, mantendo as mesmas condições descritas

acima.

Efeito do β-citronelol na contratilidade induzida por estimulo elétrico em

traqueias isoladas de ratos

Avaliamos os efeitos do β-citronelol (100, 200 e 600 µM) sobre a

contratilidade traqueal de ratos induzida por estimulo elétrico. A luz dos anéis

traqueais foi atravessada por uma peça metálica confeccionada em fino aço

inoxidável, e atada a dois pontos, um fixo na câmara conectado ao estimulador

53

elétrico (PanLab Instruments, Barcelona, Espanha) e outro conectado à unidade

transdutora de força (ML870B60/C-V, AD Instruments, Austrália) apropriada para o

registro das contrações isométricas e conectado a sistema de aquisição de dados

(PowerLab™ 8/30, AD Instruments, Austrália).

Após o período de estabilização e adição de K+ (60 mM) para testar a

integridade do tecido, foram realizadas estimulações elétricas (duração do estímulo

de 5 segundos, frequência de 5 Hertz, intervalo entre os pulsos de 5 milisegundos e

tensão de 50 Volts) que induziram contração, em seguida, adicionamos β-citronelol

na preparação, respeitando o tempo de 12 minutos, e novamente estimulamos os

tecidos com os mesmos parâmetros descritos acima, respeitando o intervalo de 7

minutos entre os 3 estímulos.

4.6 Análise dos dados

As respostas experimentalmente observadas foram consideradas através

das deflexões dos traçados originais obtidos pelo sistema de aquisição de dados e

foram analisadas conforme cada situação apropriada. Elas foram expressas em

grama força por miligrama de tecido (gF/mg de tecido) ou em percentual (%) da

resposta média das contrações de referência induzidas por K+ (60 mM), obtida no

início de cada experimento. Alguns dados foram expressos como o percentual (%)

da contração do agonista na ausência do β-citronelol ou percentual da contração

inicial ocasionada pelo estimulo elétrico. Utilizamos as médias aritméticas ± erro

padrão da média (E. P. M.) para demonstrar os valores observados, com a

representação do número de observações experimentais (n). Alguns parâmetros,

como os valores médios de concentração inibitória (CI50) ou os valores médios de

concentração efetiva (CE50) calculados por interpolação semi-logarítmica, foram

expressos como a média geométrica e o intervalo de confiança 95%. A significância

estatística foi considerada quando a probabilidade de ocorrência da hipótese de

nulidade for menor que 5% (p < 0,05), o que foi avaliado através de análise de

variância (ANOVA) seguida de um teste de múltipla comparação (teste de Mann-

Whitney, Holm-Sidak e Dunn´s), conforme apropriado. Os testes e os gráficos foram

realizados através do programa de computador SigmaPlot 11.0.

54

RESULTADOS

55

5 RESULTADOS

5.1 Inalação de β-citronelol previne a hiperreatividade traqueal induzida pelo

desafio antigênico

Em animais previamente sensibilizados, a reapresentação do antígeno

sensibilizante simula várias condições que ocorrem no processo de asma (p.ex.

hiperreatividade, desconforto respiratório e tosse). Nesse modelo, foram avaliadas

as respostas contráteis de anéis de traqueia obtidos de animais submetidos 12 h

antes ao processo de desafio antigênico que consistiu de inalação de solução de

ovalbumina (1-5 mg/mL), grupo aqui referido como desafiado, ou inalação de

solução contendo β-citronelol (300 µM; grupo β-citronelol) conforme descrição

anterior. Os animais do grupo referido como Sensibilizado foram submetidos a 2

sessões subsequentes de inalação apenas de salina pelo mesmo período dos

demais animais. Como pode ser visto na Figura 12, o processo de desafio causou

aumento da resposta contrátil (considerada aqui como hiperreatividade) em função

da adição cumulativa de K+ (10 a 120 mM), cujos valores foram significativamente

maiores que nos tecidos obtidos de animais do grupo Sensibilizado (p < 0,001; Two-

Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak). Essa resposta contrátil aumentada não

foi observada nos tecidos obtidos de animais previamente tratados com β-citronelol

(300 µM).

Na Figura 13, vê-se que os tecidos traqueais de animais desafiados

também se mostraram hiperreativos à acetilcolina (10 nM a 3 mM) uma vez que os

valores de Emax foram significativamente maiores que em tecidos de animais

sensibilizados (52,56 ± 5,9 vs. 38,14 ± 4,7 gF/mg de tecido, respectivamente). Da

mesma forma que nos experimentos com estímulo potássico (Fig. 12), o tratamento

dos animais com β-citronelol antes do desafio antigênico preveniu o surgimento

dessa hiperreatividade (Figura 13). Foi observado na Figura 13, que o grupo de

animais expostos à inalação prévia de -citronelol (300 µM) produziu resposta

contrátil significativamente menor do que o grupo sensibilizado (p < 0,001; Two-Way

ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak).

56

K+ (mM)

0 20 40 60 80 100 120 140

Co

ntr

açã

o (

gF

/mg

de t

ec

ido

)

-10

0

10

20

30

40

Sensibilizado (n = 13)

Desafiado (n = 15)

-citronelol (300 uM) (n = 10)

#

Figura 12 - Tratamento com β-citronelol previne a hiperreatividade ao K+ induzida pelo desafio antigênico em animais sensibilizados ao antígeno. Gráfico com curvas concentração-efeito para K

+ (10 a 120 mM) obtidas de tecidos isolados de

traqueia de animais sensibilizados submetidos a desafio apenas com salina (circulo branco), ou com solução de ovalbumina (1 e 5 mg/mL) precedido (triângulo cinza) ou não (circulo preto) pela inalação de β-citronelol (solução com 300 µM por 15 min); dados expressos em média ± E. P. M., n = número de experimentos.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em comparação com a

curva do grupo sensibilizado ou tratado. As curvas foram construídas respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações de K

+.

57

ACh (µM)

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

Co

ntr

aç

ão

(g

F/m

g d

e t

ec

ido

)

0

10

20

30

40

50

60

Sensibilizado (n = 13)

Desafiado (n = 15)

-citronelol (300 uM) (n = 10)

# #

@

Figura 13 - Tratamento com β-citronelol previne a hiperreatividade à acetilcolina induzida pelo desafio antigênico em animais sensibilizados ao antígeno. Gráfico com curvas concentração-efeito para ACh (10 nM a 3 mM) obtidas de tecidos isolados de traqueia de animais sensibilizados submetidos a desafio apenas com salina (circulo branco), ou com solução de ovalbumina (1 e 5 mg/mL) precedido (triângulo cinza) ou não (circulo preto) pela inalação de β-citronelol (solução com 300 µM por 15 min); Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em

comparação com a curva do grupo sensibilizado ou tratado. @

p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em comparação com a curva do grupo sensibilizado. As curvas foram construídas respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações de ACh.

58

5.2 Efeito do β-citronelol sobre a curva concentração-efeito induzida por K+ em

anéis de traqueia

Inicialmente, foi avaliado o efeito do β-citronelol (30, 200 ou 600 µM) na

CCE para K+ (10 a 120 mM) construída em preparações isoladas de traqueia de

ratos Wistar, e observamos que, nas concentrações de 200 e 600 µM, mas não com

30 µM, o β-citronelol foi capaz de inibir a resposta máxima do K+ (p < 0,001; Two-

Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) para 52,26 ± 6,7% de contração

induzida por 60 mM K+ que serviu como referência. Na concentração de 600 µM, β-

citronelol inibiu por completo o efeito contraturante da adição de K+.

Nos tecidos tratados com β-citronelol na concentração de 200 µM, o

primeiro efeito contraturante significativo em resposta ao K+ (p < 0,001; One-Way

ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) foi observado na concentração de 60 mM

com magnitude correspondente a 31,7 ± 9,7% da resposta controle na ausência de

β-citronelol (Figura 14), enquanto que nas preparações controle (assim como

naquelas tratadas com 30 µM de β-citronelol) o primeiro efeito significativo foi

observado na concentração de 40 mM.

59

(A)

* L = Lavagem

(B)

K+ (mM)

0 20 40 60 80 100 120

% d

e c

on

tra

çã

o K

+ (

60

mM

)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Controle (n = 8)

-citronelol (30 µM) (n = 5)

-citronelol (200 µM) (n = 5)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

*

#

#

*

*

Figura 14 - Efeito inibitório do β-citronelol nas curvas concentração-efeito para K+. (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando efeito inibitório na curva de K

+ induzida

pela adição de β-citronelol (L = lavagem; K+ = contração induzida por 60 mM K

+).

(B) Gráfico com valores da resposta contrátil obtida em anéis de animais naive em função da adição cumulativa de K

+ (10 a 120 mM) na ausência (Controle; circulo preto) e na presença de β-citronelol

(µM) nas concentrações de 30 (quadrado branco), 200 (triangulo preto) ou 600 (losango branco) µM. O composto-teste foi adicionado previamente à preparação por 12 minutos para que a primeira concentração de K

+ fosse adicionada. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de

experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak). Cada curva foi construída

respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações de K+.

60

5.3 Habilidade do β-citronelol para inibir respostas contráteis via recrutamento

de canais de Ca2+ da membrana plasmática

Para estudar os mecanismos envolvidos nos efeitos inibitórios do β-

citronelol, tivemos a intenção de estudar a participação dos canais de Ca2+ operados

por voltagem ou operados por receptor. Para avaliarmos estes mecanismos,

selecionamos inicialmente a concentração de verapamil capaz de inibir totalmente a

resposta contrátil induzida por K+ (60 mM) em anéis de traqueia de ratos naives

conforme representada na curva concentração-efeito para reversão da contração

potássica por este bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Como

pode ser visto na Figura 15, essa concentração corresponde a 1 µM. Em seguida,

verificamos como se comporta a resposta contrátil induzida por ACh na presença da

concentração escolhida de verapamil a fim de eliminarmos da resposta colinérgica

qualquer influxo mediante abertura de canais de Ca2+ dependentes de voltagem.

A Figura 16 mostra a CCE para a ACh (0,01 a 104 µM) na ausência e na

presença de verapamil (1 µM). Observamos deslocamento da curva em paralelo

para a direita, efeito constatado pelo aumento significativo (p < 0,05; teste de Mann

Whitney) da CE50 da ACh (0,73 [0,54 – 1] µM na ausência e 7,3 [3,31 – 16] µM na

presença de verapamil; n = 8 e n = 9, respectivamente). A Figura 16 mostra também

que se a concentração de verapamil for aumentada para 10 µM, não há desvio à

direita adicional na CCE em resposta à ACh (CE50 = 11,02 [2,01 – 60,35] µM; p >

0,05; teste de Mann Whitney), indicando que os canais de Ca2+ operados por

voltagem realmente não mais participam da contração colinérgica nessas condições

(Figura 16).

61

Verapamil (µM)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10

% d

e c

on

tra

çã

o K

+ (

60

mM

)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Verapamil (n = 8)

*

Figura 15 - Curva concentração-efeito para definir a concentração do verapamil capaz de abolir a resposta contrátil ao K+. Gráfico mostrando a curva concentração-efeito para o efeito relaxante do verapamil (0,001 a 1 µM) adicionado ao platô da contração sustentada induzida por K

+ (60 mM) em anéis de traqueia de ratos

naive. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo. Curva construída respeitando intervalo de 5 minutos entre as concentrações de Verapamil.

62

ACh (µM)

0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

% d

e c

on

tração

K+

(6

0 m

M)

-50

0

50

100

150

200

250 Controle (n = 8)

Verapamil (1 µM) (n = 9)

Verapamil (10 µM) (n = 4)

* *

Figura 16 - Eliminação da participação dos canais de Ca2+ operados por voltagem pelo verapamil na curva concentração-efeito em resposta à ACh em anéis de traqueia de animais naive. Gráfico das curvas concentração-efeito em resposta à acetilcolina (ACh; 10 nM a 10

mM) obtidas em

anéis de traqueia de ratos naive na ausência (Controle; círculo preto) ou na presença de 1 (círculo branco) ou 10 µM (hexágono cinza) de verapamil. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo. Cada curva foi construída respeitando intervalo de 5 minutos entre as concentrações de ACh.

63

Considerando que a presença de verapamil (1 µM) é eficaz em anular o

recrutamento de canais de Ca2+ operados por voltagem, as curvas concentração-

efeito para ACh (10 nM a 10 mM) apresentadas a seguir foram realizados na

presença dessa concentração (1 µM) de verapamil, assumindo então que a força

contrátil envolve recrutamento dos canais de Ca2+ ativados por receptor. Assim, a

Figura 17 mostra que, mesmo na concentração de 600 µM, o -citronelol não foi

capaz de reduzir a resposta máxima para ACh na presença de verapamil. Ocorreu

deslocamento da curva para a direita em paralelo e aumento da CE50 - ACh 0,73

[0,54 – 1] µM na ausência e 7,9 [2,30 – 27,12] µM na presença de β-citronelol (600

µM) + verapamil (1 µM); n = 8 e n = 6, respectivamente (p < 0,05; teste de Mann

Whitney). O primeiro efeito significativo (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do

teste Holm-Sidak) da ACh foi observado na concentração de 0,3 µM nas

preparações controle, e esse efeito só foi alcançado com 1 e 3 µM nos tecidos

tratados com β-citronelol (com 200 e 30 µM, respectivamente). Já na concentração

de 600 µM de β-citronelol, assim como na curva de ACh na presença de verapamil,

o primeiro efeito contraturante significativo foi observado na concentração de 10 µM

(p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak). Como controle positivo,

o tratamento das preparações com atropina (1 µM) aboliu a resposta contrátil

colinérgica.

64

(A)

* L = Lavagem; V = Verapamil (1 µM).

(B)

ACh (µM)

0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

% d

e c

on

tração

K+

(60 m

M)

-50

0

50

100

150

200

250

Controle (n = 8)

-citronelol (30 µM) (n = 7)

-citronelol (200 µM) (n = 6)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

Verapamil (1 µM) (n = 7)

Atropina (1 µM) (n = 3)

@

#

**

**

*

Figura 17 - O β-citronelol não foi capaz de inibir as curvas concentração-efeito para ACh na presença de verapamil. (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando efeito inibitório na curva de ACh induzida pela adição de β-citronelol (L = lavagem; K

+ = contração induzida por 60 mM K

+; V = Adição de

Verapamil). (B) Gráfico com as curvas concentração-efeito para a contração de ACh (10 nM a 10

mM) em anéis

de traqueia obtidos de ratos naive na ausência (Controle; circulo preto) ou na presença de 30 (losango branco), 200 (losango verde) ou 600 µM (losango azul) de β-citronelol. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. Como bloqueadores utilizamos o verapamil 1 µM (triângulo vermelho) e atropina 1 µM (quadrado cinza). *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-

Sidak) em comparação com a curva do grupo controle. @

p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em comparação com a atropina. Intervalo de 3 minutos entre as concentrações de ACh.

65

5.4 β-citronelol não altera o tônus basal de preparações de traqueia isolada de

rato

Após os procedimentos normais que determinam a estabilização da

preparação experimental, concentrações cumulativas de β-citronelol (10 a 1000 µM)

foram adicionadas à solução de banho da preparação com intervalos de 12 minutos

entre as concentrações. Não observamos qualquer efeito significativo (p > 0,05,

ANOVA) induzido pelo β-citronelol nas preparações de traqueia mantidas sob tônus

basal (Figura 18). Ao final do experimento, foram realizadas lavagens sucessivas

(durante 20 min.) com solução fisiológica para retirada do β-citronelol e, em seguida,

a preparação foi novamente estimulada com K+ (60 mM). Observamos que o

desenvolvimento de contração potássica após a exposição ao β-citronelol ocorreu de

forma semelhante à do início dos experimentos indicando que o tecido ainda

permanecia responsivo ao agente contraturante.

66

(A)

* L = Lavagem

(B)

-citronelol [µM]

10 100 1000

% d

e c

on

tração

K+

[60

mM

]

-60

-40

-20

0

20

40

60

citronelol (n = 6)

Figura 18 - β-Citronelol não alterou o tônus basal de preparações de traqueia isolada de rato. (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando ausência de efeito sobre o tônus basal após a adição de β-citronelol. Note no final do traçado a recuperação da contração induzida por K

+

após o período de exposição ao β-citronelol (L = lavagem; K+ = contração induzida por 60 mM K

+).

(B) Gráfico com valores do tônus basal na presença de β-citronelol (10 a 1000

µM) em anéis de

traqueia isolada de ratos. Dados expressos como média ± E. P. M. n = número de experimentos. A curva foi construída respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações.

67

5.5 β-citronelol relaxa a contração sustentada induzida por K+, acetilcolina ou

serotonina (5-HT) em traqueia isolada de rato

Os resultados dessa seção serão apresentados nas Figuras 19 a 21. Uma

vez estabelecido o perfil do deslocamento de uma dada concentração de β-citronelol

nas curvas concentração-efeito em resposta ao estímulo potássico ou colinérgico,

conforme descrito nas seções anteriores, agora optou-se por avaliar qual o perfil da

resposta inibitória do β-citronelol após o estabelecimento da fase estável de

contrações sustentadas na musculatura lisa respiratória. Para isso, foi adotado a

contração induzida por 60 mM de K+ (Fig. 19), por 5 µM de ACh (Fig. 20), ou por 10

µM de serotonina (5-HT; Fig. 21), todas submaximais em traqueia de rato nas

nossas condições experimentais.

Após o estabelecimento do platô da contração em resposta a 60 mM de

K+, a adição cumulativa de β-citronelol (10 a 1000 µM) reverteu totalmente a resposta

contrátil de maneira dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), sendo esse

relaxamento significativamente diferente (p < 0,001; Two-Way ANOVA, seguido do

teste Holm-Sidak) das alterações registradas nas preparações tratadas apenas com

o veículo Tween 80 (Figura 19). O efeito relaxante do β-citronelol foi significativo a

partir da concentração de 100 µM (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste

Holm-Sidak), que relaxou a contração potássica para 59,8 ± 7,7% do valor

observado na ausência de β-citronelol. A concentração necessária de β-citronelol

capaz de produzir 50% de inibição da resposta contrátil (CI50) foi 120,4 [73,3 - 197,9]

µM (Tabela 1).

Nas contrações causadas por ACh (5 µM; Fig. 20), o β-citronelol (10 a

1000 µM) também reverteu totalmente a resposta contrátil de maneira dependente

de concentração (p < 0,001, ANOVA), sendo esse efeito diferente (p < 0,001; Two-

Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em comparação com as alterações

registradas nas preparações tratadas apenas com o veículo Tween 80. O efeito

relaxante do β-citronelol foi significativo (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do

teste Holm-Sidak) a partir da concentração de 100 µM, que relaxou para 64,72 ±

4,96% do valor observado na ausência de β-citronelol (Figura 20). A concentração

necessária de β-citronelol capaz de produzir 50% de inibição da resposta contrátil

(CI50) foi de 211,1 [114,1 – 390,5] µM (Tabela 1).

68

Contrações estabelecidas pela adição de 5-HT (10 µM; Fig. 21), a adição

cumulativa de β-citronelol (10 a 1000 µM), respeitando o intervalo de 3 minutos entre

as concentrações, reverteu totalmente a resposta contrátil de maneira dependente

de concentração (p < 0,001; ANOVA), sendo esse relaxamento diferente

significativamente (p < 0,001; Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) da

resposta controle de 5-HT. O efeito relaxante do β-citronelol foi significativo a partir

da concentração de 100 µM (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-

Sidak), que relaxou para 49 ± 5,5% do valor observado na ausência de β-citronelol

(Figura 21). A concentração necessária de β-citronelol capaz de produzir 50% de

inibição da resposta contrátil (CI50) foi de 98,76 [53,82 - 181,24] µM, não ocorrendo

diferença significativa (p > 0,05; teste de Mann-Whitney) em comparação com a

curva controle de ACh (Tabela 1).

69

(A)

(B)

-citronelol (µM)

10 100 1000

% d

e c

on

traç

ão

K+

(60

mM

)

-20

0

20

40

60

80

100

120

citronelol (n = 6)

Tween (n = 6)

*

#

*

0,0002 0,0004 0,0014 0,002 0,002 0,006 0,008

Tween 80 (% v/v)

Figura 19 - Reversão pelo β-citronelol da contração de anéis de traqueia de rato induzidas por K+. (A) Traçado típico do protocolo de reversão da contração sustentada induzida por K

+ pela adição de

β-citroneol nas concentrações indicadas na figura. (B) Gráfico com valores médios da contração de K

+ (60 mM) após a adição de diversas

concentrações de β-citronelol (10 a 1000

µM; circulo preto). Dados expressos como média ± E. P. M.,

n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com

a curva de Tween (círculo branco). Curvas construídas respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações. No eixo x, veem-se as concentrações de veículo correspondente na curva onde apenas o Tween foi adicionado, às quais são as mesmas da curva de β-citronelol.

70

(A)

(B)

10 100 1000

% d

e c

on

tra

çã

o A

Ch

(5

M

)

0

20

40

60

80

100

-citronelol (n = 6)

Tween (n = 6)

**

#

-citronelol (µM)

0,0002 0,0004 0,0014 0,002 0,002 0,006 0,008

Tween 80 (% v/v)

Figura 20 - Reversão pelo β-citronelol da contração de anéis de traqueia de rato induzidas por acetilcolina. (A) Traçado típico do protocolo experimental de reversão da contração induzida por acetilcolina (ACh) pelo β-citronelol nas concentrações indicadas na figura. (B) Gráfico com valores médios da contração sustentada de ACh (5 µM) após a adição de diversas concentrações de β-citronelol (10

a 1000

µM; circulo preto). Dados expressos como média ± E.P.M., n

= número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com

a curva de Tween (circulo branco). Curvas construídas respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações. No eixo x, veem-se as concentrações de veículo correspondente na curva onde apenas o Tween foi adicionado, às quais são as mesmas da curva de β-citronelol.

71

-citronelol (µM)

10 100 1000

% d

e c

on

traç

ão

5-H

T (

10

M

)

0

20

40

60

80

100 citronelol (n = 6)

Ausência de -citronelol (n = 6)

*

#

*

Figura 21 - Reversão da contração serotoninérgica em anéis de traqueia de rato induzida pelo β-citronelol. Gráfico com valores médios da contração de 5-HT (10 µM) após a adição de diversas concentrações de β-citronelol (10

a 1000

µM; circulo preto). Para esse experimento as preparações controle

(ausência de β-citronelol) foram contraídas com 5-HT e assim mantidas sem a adição de β-citronelol ou veículo em virtude da contração apresentar gradual decaimento; assim, os valores da curva controle correspondem à magnitude absoluta da contração observada no mesmo tempo em que as preparações teste recebiam a adição correspondente de uma dada concentração de β-citronelol. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA,

seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com a curva controle de 5-HT (circulo branco). Curvas construídas respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações.

72

5.6 Efeito inibitório do β-citronelol sobre a contração induzida por

ortovanadato de sódio em traqueia isolada de rato

A adição de ortovanadato de sódio (0,3 mM) contraiu anéis de traqueia de

rato que se caracterizou como contração sustentada quando a preparação foi

mantida na presença contínua de ortovanadato de sódio (Figura 22; p = 0,26; One-

Way ANOVA). Após atingir a estabilidade da contração, a adição cumulativa de β-

citronelol (10 a 1000 µM), reverteu quase que totalmente a resposta contrátil de

maneira dependente de concentração (p < 0,001; ANOVA). O efeito relaxante do β-

citronelol foi significativo (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-

Sidak) a partir da concentração de 200 µM que relaxou para 66,1 ± 5,5% a

contração inicial induzida por ortovanadato de sódio, enquanto que na concentração

de 1000 µM, promoveu efeito relaxante da musculatura lisa traqueal correspondente

a 91,8 ± 6,6% da contração induzida por ortovanadato de sódio na ausência de β-

citronelol (Figura 22). A concentração necessária de β-citronelol capaz de produzir

50% de inibição da resposta contrátil (CI50) foi de 280,7 [183,9 – 428,6] µM, não

ocorrendo diferença significativa (p > 0,05; teste de Mann-Whitney) em comparação

com a curva de ACh (Tabela 1).

73

-citronelol (µM)

10 100 1000

% d

e c

on

tra

çã

o O

rto

va

na

da

to (

0,3

mM

)

0

20

40

60

80

100

120

Ausência de -citronelol(n = 6)

-citronelol(n = 6)

#

*

Figura 22 - Reversão da contração induzida por ortovandadato de sódio pelo β-citronelol em anéis de traqueia de ratos. Efeito miorrelaxante do β-citronelol (10

a 1000

µM; (círculo preto) sobre a contração sustentada de

ortovanadato de sódio em comparação com a curva controle (circulo branco). Para esse experimento as preparações controle (ausência de β-citronelol) foram contraídas com ortovanadato de sódio (0,3 mM) e assim foram mantidas pelo mesmo tempo de experimento em que outras preparações recebiam β-citronelol para construção da curva concentração-efeito. Assim, os valores da curva controle correspondem à magnitude absoluta da contração de ortovanadato de sódio observada no mesmo tempo em que as preparações teste recebiam a adição correspondente de uma dada concentração de β-citronelol. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001

(Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com a curva controle de ortovanadato de sódio. Curvas construídas respeitando intervalo de 5 minutos entre as concentrações.

74

5.7 Efeitos inibitórios do β-citronelol sobre a contração sustentada de

acetilcolina em traqueia isolada de ratos na presença de bloqueadores

farmacológicos e inibidores enzimáticos

Já foi descrito anteriormente que a adição cumulativa de β-citronelol (10 a

1000 µM) reverte totalmente a contração sustentada induzida por ACh (5 µM). Na

presente série de experimentos objetivou-se avaliar quais as possíveis vias de

sinalização que poderiam estar envolvidas com os efeitos inibitórios do β-citronelol.

Para isso, anéis de traqueia foram mantidos inicialmente por 5 minutos na presença

de um dos seguintes compostos: propranolol (10 µM), L-NAME (50 µM),

tetraetilamônio (TEA; 5 mM), azul de metileno (50 µM) ou ortovanadato de sódio (0,3

mM) e só então foram estimulados a contrair com ACh (5 µM), após atingir o platô

da contração, o efeito relaxante do β-citronelol (10 a 1000 µM) foi avaliado. Como

pode ser visto na Figura 23, nenhum dos tratamentos alterou de maneira

significativa a curva concentração-efeito em reposta ao β-citronelol. Em geral, na

presença desses compostos, o primeiro efeito significativo (p < 0,001; One-Way

ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) foi observado na concentração de 100 µM de

β-citronelol, e a magnitude da contração induzida por ACh correspondeu a:

propranolol = 70,6 ± 6,3%; L-NAME = 67,0 ± 2,2%; TEA = 75,3 ± 3,0%; azul de

metileno = 80,8 ± 4,8% e ortovanadato de sódio = 81,9 ± 2,4% da magnitude

registrada na ausência de β-citronelol. Observamos que não ocorreram diferenças (p

> 0,05; teste de Mann-Whitney) entre as concentrações necessárias de β-citronelol

para produzir 50% de inibição da resposta contrátil (CI50) de ACh (Tabela 1).

75

-citronelol (µM)

10 100 1000

% d

e c

on

traç

ão

AC

h (

5

M)

0

20

40

60

80

100

120

Controle (n = 6)

Propranolol (10 µM) (n = 6)

L-NAME (50 µM) (n = 6)

TEA (5 mM) (n = 6)

Azul de Metileno (50 µM) (n = 6)

Ortovanadato (0,3 mM) (n = 6)

*

Figura 23 - Efeito relaxante do β-citronelol sobre a contração de ACh em anéis de traqueia de rato não é alterado por inibidores farmacológicos. Gráfico com as curvas concentração-efeito para a reversão de contração sustentada induzida por ACh (5 µM) após a adição cumulativa de β-citronelol (10

a 1000

µM) na ausência (círculo preto) ou na

presença de propranolol (quadrado branco), L-NAME (triângulo cinza), TEA (hexágono verde), azul de metileno (losango vermelho) e ortovanadato de sódio (hexágono azul). A concentração de cada agente é mostrada no gráfico. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) indica primeiro efeito significativo para todas as curvas. Curvas foram construídas respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações de β-citronelol.

76

Em outra série de experimentos, os anéis de traqueia foram previamente

tratados com capsazepina (30 µM) ou indometacina (10 µM) por 5 minutos para

serem, então, contraídos com ACh (5 µM). Tais tratamentos também não alteraram

o perfil da curva concentração-efeito para o efeito miorrelaxante do β-citronelol (10 a

1000 µM; Figura 24). O efeito relaxante do β-citronelol na presença de capsazepina

ou indometacina foi significativo a partir da concentração de 100 µM (p < 0,001; One-

Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), que relaxou a contração sustentada da

ACh para valores de 62,2 ± 3,7% e 70,5 ± 2,0% da magnitude inicial da contração

induzida por ACh na ausência de β-citronelol, respectivamente. A Tabela 1 indica as

concentrações necessárias de β-citronelol para produzir 50% de inibição da resposta

contrátil (CI50) à ACh. Observamos que não ocorreram diferenças (p > 0,05; teste de

Mann-Whitney) na CI50 em comparação com a curva controle de ACh.

-citronelol (µM)

10 100 1000

% d

e c

on

tração

AC

h (

5

M)

0

20

40

60

80

100

120

Controle (n = 7)

Capsazepina (30 µM) (n = 9)

Indometacina (10 µM) (n = 6)

*

Figura 24 - Efeito relaxante do β-citronelol sobre a contração de ACh em anéis de traqueia de rato não é alterado por capsazepina ou indometacina. Gráfico com as curvas concentração-efeito para a reversão de contração sustentada induzida por ACh (5 µM) após a adição cumulativa de β-citronelol (10

a 1000

µM) na ausência (círculo preto) ou na

presença de capsazepina (30 µM; triangulo cinza) ou indometacina (10 µM; quadrado branco). Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) indica primeiro efeito significativo em cada curva. Curvas foram construídas respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações de β-citronelol.

77

Grupo separado de anéis de traqueia foram tratados previamente por 5

minutos com A-967079 (10 µM), bloqueador seletivo de canais TRPA1, para serem

em seguida contraídos com ACh (5 µM). Adicionado ao platô da contração

sustentada de ACh, o β-citronelol (30, 100, 300 e 600 µM) relaxou totalmente a

contração colinérgica de forma independente da presença do antagonista A-967079.

Observamos que a CCE obtida na presença do A-967079 não diferiu

estatisticamente (p > 0,001; Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) da

CCE para ACh. O efeito relaxante do β-citronelol na presença de A-967079 foi

significativo a partir da concentração de 100 µM (p < 0,001; One-Way ANOVA,

seguido do teste Holm-Sidak), que produziu relaxamento de: 56 ± 4,7% da contração

induzida por ACh na ausência de β-citronelol, e na concentração de 1000 µM,

promoveu efeito relaxante da musculatura lisa traqueal correspondente a 83,81 ±

6,16% da contração induzida por ACh na ausência de β-citronelol (Figura 25).

A concentração necessária de β-citronelol capaz de produzir 50% de

inibição da resposta contrátil (CI50) foi de 158,53 [70,55 – 356,24] µM, não ocorrendo

diferença significativa (p > 0,05; teste de Mann-Whitney) em comparação com a

curva controle de ACh (Tabela 1). Em todos os tratamentos propostos, o efeito

miorrelaxante do β-citronelol não foi alterado.

78

#

*

*

30 100 300 600

% d

e c

on

tra

çã

o A

Ch

(5

M

)

0

20

40

60

80

100

120Controle (n = 5)

A-967079 (10 µM) (n = 6)

-citronelol (µM)

*

Figura 25 - O β-citronelol produziu relaxamento na contração de ACh na presença de A-967079 em músculo liso traqueal de ratos. Efeito miorrelaxante do β-citronelol (30, 100, 300

e 600

µM) sobre a contração sustentada da ACh

(círculo preto) na presença de A-967079 (circulo branco). Dados expressos em média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo. Curvas foram construídas respeitando intervalo de 12 minutos entre as concentrações de β-citronelol.

79

Tabela 1 - Valores da concentração inibitória capaz de produzir efeito miorrelaxante em 50% da resposta contrátil (CI50) induzida pelo β-citronelol na contração sustentada de K+, ACh ou 5-HT em anéis de traqueia de ratos na ausência e na presença de várias substancias capazes de interferir no mecanismo de contração/relaxamento da célula muscular lisa traqueal.

Droga

Acoplamento Excitação – Contração

CI50 (µM) n

K+ 120,44 [73,29 – 197,91] 6

5-HT

ACh

Propranolol

98,76 [53,82 - 181,24]

211,10 [114,13 – 390,46]

159,30 [112,88 – 224,82]

6

6

6

L-NAME 201,08 [154,06 – 262,45] 6

TEA 210,15 [168,71 – 261,76] 6

Azul de Metileno 294,98 [260,90 – 333,53] 6

Ortovanadato

Capsazepina

Indometacina

A-967079

243,04 [190,24 – 310,50]

133,87 [107,96 – 165,99]

173,96 [140,51 – 215,39]

158,53 [70,55 – 356,24]

6

9

6

6

CI50 representa média geométrica (intervalo de confiança de 95%) e n = número de experimentos; p > 0,05 (Teste de Mann-Whitney) em relação à curva controle de ACh.

80

5.8 Efeito do β-citronelol em preparações isoladas de traqueia contraídas com

uma combinação de K+ e ACh em meio contendo Ca2+ ou Ba2+

Preparações traqueais foram mantidas inicialmente em solução contendo

2 mM de Ca2+ ou Ba2+, e uma resposta contrátil máxima foi evocada com adições

cumulativas e saturantes de K+ (100, 120 e 150 mM). Ainda na presença da mais

alta concentração de K+, adicionou-se subsequentemente ACh (60 µM) a fim de

ativar as vias de contração muscular lisa recrutando ao mesmo tempo os canais de

Ca2+ operados por voltagem e os operados por receptor. Em geral, a adição de ACh

nessa etapa produziu incremento significativo da contração iniciada e sustentada

com alta concentração de K+ (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-

Sidak), alcançando valores entre 127 ± 3,7% a 138,6 ± 11,5% em comparação com

a contração obtida com 100 mM de K+ em meio contendo Ca2+ e Ba2+,

respectivamente. A adição cumulativa de β-citronelol (10 a 1000 µM) no pico da

contração induzida pela mistura K+ e ACh promoveu relaxamento de forma

dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA) nas preparações mantidas em

meio contendo Ca2+ ou Ba2+, porém, observamos que nas preparações mantidas em

meio com Ca2+ o primeiro efeito significativo foi observado na concentração de 200

µM de β-citronelol (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak),

enquanto que em meio contendo Ba2+ o primeiro efeito significativo foi observado na

concentração de 100 µM de β-citronelol (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do

teste Holm-Sidak) (Figura 26).

81

(A)

(B)

% d

e c

on

tração

K+

(100 m

M)

-200

-100

0

100

200

Cálcio (2 mM) (n = 6)

Bário (2 mM) (n = 5)

10 30 100 200 300 600 1000K+(100 mM)

K+ [120 mM]

K+ (150 mM)

ACh (60 µM)

-citronelol (µM)

#

**

Figura 26 - Efeito relaxante do β-citronelol na contração de anéis de traqueia de rato induzida conjuntamente por K+ e ACh em meio contendo Ca2+ ou Ba2+. (A) Traçados típicos do protocolo experimental em que os tecidos foram inicialmente expostos a altas concentrações de K

+ (100, 125 e 150 mM) e, logo após, também foram estimulados com alta

concentração de ACh (60 µM) em meio com Ca2+

(traçado superior) ou Ba2+

(traçado inferior). (B) Gráfico mostrando os valores registrados da força contrátil antes e após a adição cumulativa de β-citronelol (10

a 1000

µM) no pico da contração sustentada de K

+ e ACh em meio contendo Ca

2+ (2

mM; coluna preta) ou Ba2+

(2 mM; coluna cinza). Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) indica primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com

K+

(100 mM) em ambas as curvas. A construção da curva respeitou intervalo de 12 minutos entre as concentrações de β-citronelol.

82

5.9 Efeitos inibitórios do β-citronelol nas curvas concentração-efeito induzidas

pela adição cumulativa de Ca2+ ou Ba2+ em preparações de traqueia mantidas

em meio sem Ca2+ despolarizadas com K+

Em preparações de anéis de traqueia mantidas em solução normal, a

adição de K+ (60 mM) produz contração sustentada como mencionado

anteriormente, a substituição da solução fisiológica por outra sem Ca2+ (contendo

EGTA 4 mM) e estimulada novamente com K+ (60 mM), não produz contração.

Mantendo-se a concentração alta de K+, a adição subsequente de concentrações

crescentes de Ca2+ (0,1 a 10 mM) provocou contração de forma dependente da

concentração, efeito que se tornou significativo na concentração de 0,5 mM de Ca2+

(p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) e atingiu o valor

máximo de 118 ± 9,1% da contração de referência na concentração de 10 mM de

Ca2+ (Figura 27). Após lavagens sucessivas da preparação com solução fisiológica,

uma nova CCE de Ca2+ nas mesmas condições descritas acima foi construída, mas

na presença de β-citronelol (30, 100, 200 ou 600 µM). Como pode ser observado na

Figura 27, o β-citronelol reduziu significativamente o efeito máximo induzido pela

adição de Ca2+ em comparação com o grupo controle (p < 0,001; Two-Way ANOVA,

seguido do teste Holm-Sidak). Nos tecidos expostos ao β-citronelol (200 e 600 µM) a

resposta contrátil foi incipiente ou abolida, respectivamente (Figura 27).

83

(A)

* L = Lavagem; 1 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + K+ (60 mM); 2 = Curva

de Ca2+ (mM); 3 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + K+ (60 mM); 4 = -citronelol (µM) e 5 = Curva de Ca2+ (mM).

(B)

Ca2+

(mM)

0,1 1 10

% d

e c

on

tração

K+

(60 m

M)

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

Controle (n = 7)

-citronelol (30 µM) (n = 6)

-citronelol (100 µM) (n = 6)

-citronelol (200 µM) (n = 5)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

*

#

##

#

*

*

Figura 27 - β-citronelol inibiu a contração induzida pela adição de Ca2+ em anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ com alta concentração de K+ (60 mM). (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando o efeito inibitório do β-citronelol nas curvas concentração-efeito produzidas pela adição cumulativa de Ca

2+ em anéis de traqueia mantidos

em meio inicialmente sem Ca2+

e despolarizado por alto K+.

(B) Gráfico mostrando os valores registrados de força contrátil induzida pela adição cumulativa de Ca

2+ (0,1 a 10 mM) antes e após a adição do β-citronelol (30, 100, 200 ou 600 µM) em meio sem Ca

2+

e com alta concentração de K+. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de

experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com a

curva controle de Ca2+

. Curvas construídas respeitando intervalo de 3 min entre as concentrações de Ca

2+.

84

Resultados semelhantes aos descritos na seção anterior foram obtidos na

construção de curvas concentração-efeito em resposta à adição de Ba2+ em lugar de

Ca2+. Em suma, anéis de traqueia foram mantidos em solução de Krebs-Henseleit

modificada sem Ca2+ e contendo EGTA (4 mM), utilizamos o K+ (60 mM) para induzir

despolarização e adicionamos subsequentemente concentrações cumulativas de

Ba2+ (0,1 a 50 mM) na ausência ou na presença de β-citronelol (30, 100, 200 ou 600

µM). De acordo com a Figura 28, a contração induzida por Ba2+ na ausência de β-

citronelol atingiu valor máximo de 136,3 ± 8,9% da contração de referência de K+ (60

mM). É possível ver também na figura 28 que todas as concentrações de β-citronelol

foram capazes de reduzir o efeito máximo da curva de Ba2+ (p < 0,001; Two-Way

ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak), para valores de: (30 µM) = 53,04 ± 13,60%;

(100 µM) = 58,21 ± 13,77%; (200 µM) = 15,52 ± 4,31%, sendo a resposta abolida

com 600 µM de β-citronelol. Ressaltamos que nas preparações tratadas com 200

µM de β-citronelol não constatamos efeitos contráteis significativos na CCE apesar

do ligeiro aumento do tônus muscular (Figura 28). A redução dos valores máximos

na curva de Ba2+, ocasionada pela adição de β-citronelol em traqueia estimulada

com K+, foi significativamente maior do que a redução obtida na curva de Ca2+ (p <

0,001; Two-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak).

85

(A)

* L = Lavagem; 1 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + K+ (60 mM); 2 = Curva

de Ba2+ (mM); 3 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + K+ (60 mM); 4 = -citronelol (µM) e 5 = Curva de Ba2+ (mM).

(B)

Ba2+

[mM]

0,1 1 10 100

% d

e c

on

tra

çã

o K

+ (6

0 m

M)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Controle (n = 8)

-citronelol (30 µM) (n = 5)

-citronelol (100 µM) (n = 6)

-citronelol (200 µM) (n = 5)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

**

# #

#

#

*

Figura 28 - β-citronelol inibiu a contração induzida pela adição de Ba2+ em anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ com alta concentração de K+ (60 mM). (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando o efeito inibitório do β-citronelol nas curvas concentração-efeito produzidas pela adição cumulativa de Ba

2+ em anéis de traqueia mantidos

em meio inicialmente sem Ca2+

e despolarizado por alto K+.

(B) Efeito inibitório do β-citronelol (30, 100, 200 e 600 µM) nas curvas concentração-efeito produzidas pela adição cumulativa de Ba

2+ (0,1 a 50 mM) em anéis de traqueia mantidos em meio inicialmente

sem Ca2+

e despolarizado por alto K+. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de

experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo. #p <

0,001 (Two-Way ANOVA, teste Holm-Sidak), em comparação com a curva controle de Ba2+

. Curvas construídas respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações de Ba

2+.

86

5.10 Efeitos inibitórios do β-citronelol nas curvas concentração-efeito

induzidas pela adição cumulativa de Ca2+ em preparações de traqueia

mantidas em meio sem Ca2+ estimuladas com ACh

Seguindo os mesmos procedimentos descritos na seção anterior, anéis

de traqueia foram mantidos em solução de Krebs-Henseleit modificada sem Ca2+, na

presença de EGTA (4 mM) e verapamil (10 µM). Nessas condições, foi adicionada

ACh (60 µM), condição que produziu contração transitória, voltando o traçado

rapidamente para os mesmos valores observados na tensão basal. Nessa condição,

a adição cumulativa de Ca2+ (0,1 a 50 mM) produziu contração sustentada de forma

dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA) com primeiro efeito significativo (p

< 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) sendo registrado na

concentração de 0,5 mM de Ca2+, atingindo maior efeito correspondente a 81,7 ±

9,3% com 50 mM Ca2+ (Figura 29). Na presença de β-citronelol (30, 100, 200 ou 600

µM), não foram detectadas mudanças significativas do perfil da curva concentração-

efeito para a adição de Ca2+, como pode ser visto na Figura 29.

87

(A)

* L = Lavagem; 1 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + Verapamil (10 µM) + ACh (60 µM); 2 = Curva de Ca2+ (mM); 3 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) +

Verapamil (10 µM) + ACh (60 µM); 4 = -citronelol (µM) e 5 = Curva de Ca2+ (mM).

(B)

Ca2+[mM]

0,1 1 10 100

% d

e c

on

tra

çã

o K

+ (

60

mM

)

-20

0

20

40

60

80

100

120

140 Controle (n = 6)

-citronelol (30 µM) (n = 5)

-citronelol (100 µM) (n = 5)

-citronelol (200 µM) (n = 6)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

*

*

*

*

*

Figura 29 - β-citronelol não alterou a contração induzida por adição de Ca2+ em anéis de traqueia mantidos em meio sem Ca2+ na presença de acetilcolina e verapamil. (A) Traçado típico do protocolo experimental demonstrando que o β-citronelol não produz efeitos significativos nas curvas concentração-efeito ao Ca

2+ em anéis de traqueia mantidos em meio

inicialmente sem Ca2+

e estimulado com ACh na presença de verapamil. (B) Curvas concentração-efeito produzidas pela adição cumulativa de Ca

2+ (0,1 a 50 mM) em anéis de

traqueia mantidos em meio inicialmente sem Ca2+

e estimuladas com ACh (60 µM) na presença de verapamil (10 µM). Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) primeiro efeito significativo.

#p < 0,001 (Two-Way

ANOVA, teste seguido do teste Holm-Sidak), em comparação com a curva controle de Ca2+

. Curvas construídas respeitando intervalo de 3 minutos entre as concentrações de Ca

2+.

88

5.11 Efeito do β-citronelol na contração induzida pela adição de Ca2+ após a

depleção dos estoques intracelulares em preparações isoladas de traqueia

mantidas em meio sem Ca2+ estimuladas com ACh

Com o intuito de avaliar qual o efeito do β-citronelol sobre a entrada de

Ca2+ por meio dos canais de Ca2+ operados por estoques, anéis de traqueia foram

mantidos em solução de Krebs-Henseleit modificada sem Ca2+ contendo EGTA (4

mM) e tapsigargina (1 µM). Após intervalo de 5 minutos, adicionamos ACh (60 µM),

condição que produz contração transitória, cuja amplitude diminui até não ser mais

detectada, à medida que esse procedimento foi repetido várias vezes, momento em

que se considerou alcançado o esgotamento dos estoques intracelulares de Ca2+.

Então, após nova lavagem da preparação com solução modificada sem Ca2+ para

remoção da ACh (mas mantendo-se a tapsigargina 1 µM na cuba), a restauração

dos níveis extracelulares pela adição de Ca2+ (2,5 mM) produziu efeito contrátil

vigoroso que atingiu magnitude correspondente a 45,9 ± 11,3% da contração de

referência induzida no início dos experimentos com 60 mM K+. Quando esse

procedimento de restauração do Ca2+ extracelular foi realizado na presença de β-

citronelol (30, 100, 200 ou 600 µM), observamos diminuição da resposta contrátil

com diferença estatisticamente significativa na concentração de 600 µM de β-

citronelol (p < 0,05; Método de Dunn) (Figura 30), atingindo valor de 3,4 ± 1,9% da

contração de referência induzida por K+ (60 mM). Como controle negativo, pré-

tratamos os anéis de traqueia com verapamil (1 µM) em substituição ao β-citronelol,

mantendo as mesmas condições descritas acima, e observamos que, o verapamil

não influenciou a contração de Ca2+ mediada por estoques em comparação com o

grupo controle (p > 0,05; Método de Dunn; Figura 30).

89

(A)

* L = Lavagem; 1, 2 e 3 = Meio contendo ɸ Ca2+ + EGTA (4 mM) + Tapsigargina (1 µM); 4 = Tapsigargina (1 µM).

(B)

% d

e c

on

tra

çã

o K

+ (

60

mM

)

0

10

20

30

40

50

60

70

Controle (n = 6)

-citronelol (30 µM) (n = 7)

-citronelol (100 µM) (n = 7)

-citronelol (200 µM) (n = 6)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

Verapamil (1 µM) (n = 6)

-citronelol

Cálcio (2,5 mM)

*#@

Figura 30 - β-Citronelol inibiu a contração de anéis de traqueia causada pela restauração extracelular de Ca2+ após esgotar estoques intracelulares com acetilcolina e tapsigargina. (A) Traçado típico do protocolo experimental para esgotamento dos estoques intracelulares de Ca

2.

Note que o terceiro estímulo consecutivo com ACh em meio sem Ca2+

com tapsigargina já não induz mais resposta contrátil e que, após remoção do agente colinérgico, mas mantendo a tapsigargina, a reapresentação de Ca

2+ (2,5 mM) induz contração registrada na parte final do traçado.

(B) Gráfico demonstrando efeito inibitório do β-citronelol aplicado antes da reapresentação de Ca2+

, o qual foi significativo na concentração de 600 µM. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,05 (Método de Dunn) em comparação com o controle.

@p < 0,05

(Método de Dunn) em comparação com -citronelol (30 µM). #p < 0,05 (Método de Dunn) em

comparação com o verapamil (1 µM).

90

5.12 Efeito do β-citronelol na contratilidade induzida por estimulo elétrico em

traqueias isoladas de ratos

Nessa serie de experimentos buscamos analisar qual o efeito do β-

citronelol na contração induzida pela aplicação de estimulo por campo elétrico. Para

isso, foram realizadas 3 estimulações (duração do estímulo = 5 segundos;

frequência = 5 Hertz; intervalo entre os pulsos = 5 milisegundos e tensão = 50 Volts)

respeitando o intervalo de 7 minutos entre os estímulos. A contração na ausência de

β-citronelol foi utilizada como referencial e, ao adicionarmos em seguida o β-

citronelol (100, 200 ou 600 µM) nas memas condições descritas acima, foi repetido o

mesmo estimulo elétrico utilizado anteriormente e observamos que, o β-citronelol

reduziu significativamente a contratilidade traqueal de maneira dependente de

concentração (p < 0,001; One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak). O efeito

passou a ser significante a partir da concentração de 200 µM, cuja contração nessa

condição foi de 57,9 ± 2,7% da contração mediada pelo estimulo elétrico. Na

concentração de 600 µM, a contração em resposta ao estímulo elétrico foi de

apenas 13,8 ± 1,4% da contração inicial ocasionada pela estimulação elétrica na

ausência de β-citronelol (Figura 31).

91

% d

a c

on

tração

de E

E

0

20

40

60

80

100

Controle (n = 6)

-citronelol (100 µM) (n = 6)

-citronelol (200 µM) (n = 6)

-citronelol (600 µM) (n = 6)

*

*

Figura 31 - O β-citronelol inibiu a contração induzida por estimulo elétrico em anéis de traqueia isolada de ratos. Efeito inibitório do β-citronelol nas concentrações de 100 µM (coluna preta), 200 µM (coluna cinza) e 600 µM (coluna cinza escuro) na contração induzida por estimulação elétrica em traqueia isolada de ratos. Dados expressos como média ± E. P. M., n = número de experimentos. *p < 0,001 (One-Way ANOVA, seguido do teste Holm-Sidak) em comparação com o controle.

92

DISCUSSÃO

93

6 DISCUSSÃO

O presente estudo demonstrou que o β-citronelol possui efeito

antiespasmódico e miorrelaxante em traqueia isolada de ratos Wistar. Observamos

que esse efeito inibitório é dependente de concentração e está relacionado à sua

seletividade em atuar nos mecanismos contráteis relacionados à ativação de canais

de Ca2+ operados por voltagem, porém, em altas concentrações o β-citronelol atua

também inibindo a ação dos canais de Ca2+ operados por receptor ou por estoque,

além de diminuir a sensibilidade dos elementos contráteis ao Ca2+. Tais efeitos

parecem não estar relacionados a efeitos tóxicos na célula visto que, após a

realização de cada experimento, submetemos a preparação a estimulo

eletromecânico a fim de avaliarmos sua recuperação funcional, e constatamos que

os efeitos do β-citronelol são reversíveis, excluindo, ao menos em parte, a

possibilidade de que os efeitos inibitórios no comportamento contrátil do músculo liso

traqueal tenham sido decorrentes de eventual toxicidade.

A respeito, mediante ensaio de lactato desidrigenase (LDH), Silva (2009)

avaliou os possíveis efeitos tóxicos de dois óleos essenciais que apresentam o -

citronelol como um dos seus contituintes, o Cymbopogon citratus e o Cymbopogon

winterianus, e destacou que não foi constatado citotoxidade em nenhuma das

concentrações utilizadas, corroborando com nossos resultados. Gbenou et al. (2013)

acrescentam que concentrações ≤ 2.500 e 3.000 mg/kg, os óleos essenciais de

Cymbopogon citratus e Eucalyptus citriodora não são letais para animais, não

alteram a tolerância gástrica e a arquitetura histológica de alguns órgãos (estômago,

fígado), entretanto, ocorrendo letalidade apenas em concentrações maiores que

estas.

No presente estudo buscamos inicialmente caracterizar o efeito do β-

citronelol em um modelo animal que simula a asma humana e constatamos que,

quando administrado por inalação, o β-citronelol é agente protetor do

desenvolvimento de hiperreatividade traqueal típica após condições que envolvem

desafio antigênico. No estudo de Brito et al. (2012b) o citronelol apresentou

propriedades anti-inflamatórias em camundongos por diminuir a migração de

neutrófilos induzida pela carragenina, sendo esse efeito explicado pela sua

94

capacidade de inibir a sintese de mediadores inflamatórios, como o TNF-além de

seu efeito antioxidante (receptores opióides centrais) in vitro

Katsukawa et al. (2011) mostraram que o citronelol e o geraniol suprimem

a expressão da ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) e ativam receptores ativados por

proliferadores de peroxissoma (PPAR, em inglês, peroxisome proliferators-activated

receptors) eem cultura de células BAEC (células endoteliais de aorta

bovina)sendo um achado importante para a compreensão da sua propriedade anti-

inflamatória. Esse mesmo resultado, associando seus efeitos como agonista seletivo

de PPAR foi comprovado pelo estudo de Oliveira (2012), que verificou uma

diminuição nos valores de leucócitos totais, assim como na concentração de

citocinas de perfil inflamatório (TNF-α e IL-6) no fígado de camundongos Balb/c

obesos submetidos ao tratamento com óleo essencial de Xylopia aromatica (Lam.)

Mart.

Os efeitos relatados no presente estudo na prevenção de hiperreatividade

traqueal após o tratamento com β-citronelol podem ser devidos ao potencial efeito

anti-inflamatório desse composto, fato não investigado no presente estudo. A asma

é uma doença pulmonar inflamatória com altas taxas de prevalência e mortalidade

em todo o mundo, reversível espontaneamente ou com tratamento. Existem

inúmeras causas para seu aparecimento, por exemplo, exposição a substâncias

alérgicas, infecções virais ou bacterianas, poluição do ar e estilo de vida (JOACHIM

et al., 2004; SILVA; SILVA, 2013). Ao ser administrado previamente por inalação, o

β-citronelol apresentou efeito inibitório significativo no desenvolvimento de

hiperreatividade traqueal em resposta ao K+ ou ACh, tipicamente hiperreativos nos

tecidos de animais não tratados com o composto.

Esses achados foram interessantes para a continuação do estudo

objetivando entender melhor suas propriedades. Para isso, passamos a investigar os

efeitos desse composto na contratilidade traqueal em animais naive, não submetidos

ao processo de desafio antigênico. Esses tecidos foram submetidos tanto a

estímulos eletromecânicos (estímulo com K+) quanto farmacomecânicos (com

ênfase pela ACh). Submetemos também os anéis de traqueia de ratos à estimulação

por campo elétrico, e observamos que a exposição prévia por 12 minutos com β-

citronelol inibiu as contrações induzidas por esse tipo de estimulo elétrico. Segundo

Nagtegaal et al. (1995); Lima et al. (2011); Aguiar et al. (2012), a estimulação com

95

pulsos de duração curta, por exemplo 0,5 ms, geram uma contração relacionada à

estimulação colinérgica pós-ganglionar e promovem liberação de ACh, corroborando

com nossos resultados sobre a atuação do -citronelol na via colinérgica.

Buscamos então compreender se os efeitos inibitórios do β-citronelol

envolvem participação dos canais de Ca2+. Em anéis de traqueia sob tônus basal,

não foram observados efeitos relaxantes do -citronelol, porém, em preparações de

músculo liso traqueal pré-contraídas por estímulos eletromecânicos ou

farmacomecânicos, o -citronelol foi capaz de reverter totalmente a contração com

valores de CI50 que, embora não tenham sido significativos estatisticamente, foram

ligeiramente menores para as contrações induzidas por K+. Isso remete a provável

atuação do -citronelol nas duas principais vias de sinalização de Ca2+ na célula.

A adição de K+ em preparações de músculo liso traqueal ocasiona

ativação dos canais de Ca2+ operados por voltagem (VOC), e quando adicionamos

ACh, ativamos preferencialmente canais de Ca2+ operados por receptor (ROC),

estes geralmente acoplados a proteínas G, desencadeando subsequentemente uma

série de eventos intracelulares que culminam com a liberação do Ca2+ presente no

retículo sarcoplasmático (SOMLYO; SOMLYO, 1968; WEBB, 2003). Esses dois

mecanismos de ativação dos canais de Ca2+ geram contração da musculatura lisa

traqueal (BEZERRA et al., 2013). Menezes et al. (2010) investigaram os efeitos

cardiovasculares do óleo essencial de Cymbopogon winterianus em ratos, composto

principalmente por geraniol, citronelol e citronelal. Esses autores obervaram que

após a incubação com o óleo essencial, a curva de Ca2+ foi deslocada para a direita

com redução do efeito máximo de maneira dependente de concentração, sendo

caracterizado como um antagonismo não competitivo.

Na contração mediada por ativação de canais ROC (protocolo com ACh

na presença da concentração de verapamil selecionada a partir dos resultados na

Fig.15, os quais foram confirmados com os resultados das Fig. 16 e 17) a curva

concentração-efeito para a ACh se deslocou em paralelo e para a direita nas

concentrações mais baixas, enquanto que também diminuiu o Emax nas

concentrações mais altas (particularmente na concentração de 1 µM de Verapamil).

A estimulação dos receptores colinérgicos (tipo M3) é um dos principais

determinantes do tônus muscular liso das vias aéreas, o primeiro pico da entrada de

Ca2+ ocorre através da mobilização intracelular originada pela liberação de IP3 e

96

DAG, segundos mensageiros da estimulação do receptor muscarínico que vão ativar

a proteína quinase C (ROUX et al., 1997). Se compararmos a mesma concentração

de 600 µM de -citronelol, vemos que quando os anéis de traqueia foram

estimulados com diversas concentrações de K+ (Fig. 14), não foram detectadas

contrações significativamente mensuráveis nesses tecidos. Por outro lado, os

resultados dos experimentos recrutando ROC mostram que nessa mesma

concentração, os efeitos inibitórios do β-citronelol foram abolidos indicando que a

ação preferencial desse composto se dá por inibição ligeiramente preferencial sobre

canais Ca2+ operados por voltagem.

O desenvolvimento de contração no músculo liso traqueal está

relacionado a fontes de Ca2+ dos meios extracelular e intracelular, possuindo duas

vias principais para a sua entrada: os canais de Ca2+ operados por voltagem e os

canais de Ca2+ operados por receptor (YAMAKAGE et al., 2001). De posse dessas

informações, foi proposto avaliar qual seria a atuação do β-citronelol em

preparações isoladas de traqueia após a contração combinada de K+ (VOC) e ACh

(ROC) em meio contendo Ca2+ ou Ba2+, e observamos que o β-citronelol promoveu

relaxamento independente do meio Ca2+ ou Ba2+, porém, observamos uma ação

miorrelaxante mais evidente em meio contendo Ba2+. Essa maior capacidade de

atuação em meio contendo Ba2+, íon que possui permeabilidade por canais de Ca2+

operados por voltagem como forma de ativar o mecanismo contrátil (EVANGELISTA

et al., 2007; MENEZES et al., 2010; SILVA, 2010b; PINHO et al., 2012; DE

SIQUEIRA et al., 2012) reforça a hipótese de que o β-citronelol atua

preferencialmente em mecanismos contráteis que recrutam canais de Ca2+ operados

por voltagem. Igualmente, a redução significativa do efeito máximo induzido pela

adição de Ca2+ em meio sem Ca2+ e despolarizado com o K+, e também a redução

da curva de contração quando utilizamos o Ba2+ em substituição ao Ca2+ suportam

essa hipótese.

Para estudarmos se os efeitos inibitórios do β-citronelol envolvem os

canais para Ca2+ operados por estoque (SOC), anéis de traqueia foram mantidos em

solução de Krebs-Henseleit modificada sem Ca2+ contendo EGTA para produzir

quelação de Ca2+ livre e tapsigargina para inibir sua recaptação para os estoques

internos. Ao mesmo tempo, adicionamos ACh em alta concentração (60 µM) para

estimular a liberação do Ca2+ armazenado até o esgotamento dos estoques

intracelulares, este protocolo foi embasado no estudo de De Siqueira (2011), que

97

avaliou os efeitos do -bisabolol em várias preparações do músculo liso (traqueia,

aorta, mesentérica, fundo de estômago, bexiga, duodeno e cólon), particularmente

na aorta, o autor propôs avaliar os canais SOC utilizando o ácido ciclopiazônico

outro bloqueador da SERCA (WEBB, 2003) e provocou depleção dos estoques

intracelulares de Ca2+ com adições sucessivas de fenilefrina (agonista 1-

adrenérgico).

O esgotamento dos estoques intracelulares de Ca2+, foi constatado pela

não detecção de resposta contrátil após adição de ACh. Sabe-se que nessa

condição a célula muscular lisa ativa os canais de Ca2+ operados por estoque, o qual

provoca contração quando o Ca2+ é reapresentado através da ativação do que se

denominou entrada “capacitativa” (PUTNEY, 1990). Esses procedimentos de

ativação de corrente “capacitativa” também foram realizados na presença de β-

citronelol, adicionado imediatamente antes da adição de Ca2+, e observamos que o

β-citronelol inibe a resposta contrátil induzida por essa via de entrada de Ca2+ pelos

canais operados por estoque, principalmente na concentração de 600 µM de β-

citronelol semelhante à concentração de atuação nos protocolos direcionados à

ativação de canais VOC. Como controle negativo, utilizamos o verapamil numa

concentração (1 µM) que inibe totalmente a contração potássica, mas que não inibe

a resposta contrátil induzida pelos canais SOC. Isso nos permite concluir que,

apesar de agir preferencialmente em mecanismos que recrutam canais de Ca2+

dependentes de voltagem, não é possível caracterizá-lo como bloqueador desses

canais como o faz o verapamil. Isso diferencia o β-citronelol de outros compostos

quimicamente relacionados.

De Siqueira et al. (2012) já relataram que o -bisabolol, um dos

constituintes da Matricaria recutita, age preferencialmente em mecanismos que

ativam canais VOC, assim como Evangelista et al. (2007) mostraram que os efeitos

inibitórios do óleo essencial de Pterodon polygalaeflorus estariam relacionados à

inibição do acoplamento eletromecânico, o estudo de Lima et al. (2011) demonstra

que o eugenol (Syzygium aromaticum) bloqueou os canais VOC e ROC, além de

reduzir a sensibilidade das proteínas contráteis do Ca2+. Assim, a propriedade de

interferir em mecanismos que envolvem ativação de canais de Ca2+ não se restringe

apenas ao β-citronelol, e que agentes terpênicos parecem possuir relativa

seletividade para exercer seus efeitos antiespasmódicos.

98

Após a descrição do efeito relaxante do β-citronelol, despertou-nos o

interesse em pesquisar outros mecanismos de ação, por exemplo, a possível

diminuição da sensibilização dos elementos contráteis ao Ca2+, sendo assim,

adicionamos em nossos experimentos o ortovanadato de sódio, agente capaz de

provocar contração caracterizada por ser mediada por interferência com os níveis de

fosforilação de tirosina por inibir a tirosina fosfatase (YU et al., 2004). A oscilação

entre a fosforilação e a desfosforilação de proteínas atua como controle de diversos

eventos biológicos, por exemplo, divisão, diferenciação, contração, aprendizado,

dentre outros (AOYAMA et al., 2003). Moreira (2013) destacou que o citral, um

monoterpeno majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, análogo do

citronelol, diminuiu a sensibilidade dos elementos contráteis ao Ca2+ por inibir o

efeito contraturante do ortovanadato de sódio. Assim, após adicionarmos β-citronelol

observamos reversão completa da resposta contrátil indicando que as atividades

inibitórias desse composto são capazes de diminuir as contrações que recrutam

esse mecanismo.

Investigando ainda qual seria o possível mecanismo de ação do -

citronelol, buscamos bloquear algumas vias que poderiam estar influenciando na sua

propriedade relaxante. Considerando que o tratamento com as substâncias a seguir

(propranolol, L-NAME, TEA, azul de metileno ou indometacina), aplicadas

isoladamente, e que as concentrações adotadas são rotineiramente usadas como

eficazes em suas respectivas vias metabólicas, podemos considerar que os efeitos

relaxantes do β-citronelol independem: (i) da ativação de receptores adrenérgicos;

(ii) da atividade da enzima óxido nítrico sintetase; (iii) da abertura de canais de K+;

(iv) da atividade da enzima guanilato ciclase ou (v) da atividade da enzima

ciclooxigenase.

Em estudo recente, o β-citronelol tem sido apontado como agonista de

receptores TRPV1 (OHKAWARA et al., 2010), enquanto que seu análogo citronelal é

agonista de receptores TRPA1 (KWON et al., 2010). Proteínas TRP’s (p.ex. TRPV1

do inglês, transient receptor potential vanilloid subtype 1), podem ser canais iônicos

da membrana celular, alguns não seletivos para cátions, mas quando ativados

ocorre influxo predominantemente de Ca2+. Caceres et al., (2009) destacam que os

receptores TRPV1 e TRPA1 atuam como importantes mediadores na inflamação

alérgica das vias aéreas, portanto, eles podem ser alvos farmacológicos promissores

para o tratamento das doenças alérgicas inflamatórias, incluindo a asma. Tomando

99

como base essa linha de raciocínio, bloqueamos o canal TRPV1 com capsazepina e

estimulamos os anéis de traqueia à uma contração com ACh, em seguida após a

curva atingir um platô, adicionamos concentrações cumulativas do -citronelol que

relaxou o tecido, porém, não observarmos diferenças em relação a curva controle,

indicando que o -citronelol não atua em traqueia de ratos como agonista TRPV1.

Vasconcelos-Rios et al. (2013) avaliaram a administração oral de citronelil

acetato, um monoterpeno presente em diversas plantas, dentre elas, as do gênero

Cymbopogon citratus, e indicaram seu poder de atuação como uma substância com

atividade antinociceptiva em modelos de nocicepção aguda (acido acético,

formalina, capsaicina, mentol, salina ácida, acetato miristato de forbol, 8-bromo

monofosfato de adenosina cíclica e glutamato) em camundongos, porém, esses

efeitos não foram mediados pela via TRPA1. Neste trabalho, usamos a substância

A-967079, bloqueador do canal TRPA1, e verificamos que o efeito miorrelaxante do

β-citronelol não foi alterado.

Em resumo, evidenciamos que o β-citronelol possui propriedades

antiespasmódicas em músculo liso respiratório, sendo potencialmente agente anti-

inflamatório capaz de prevenir o surgimento de hiperreatividade em modelo animal

de asma. A ação farmacológica desse composto parece se dar em mecanismos que

são intracelulares na interferência com a capacidade da célula muscular produzir

força contrátil.

100

CONCLUSÕES

101

7 CONCLUSÕES

O β-citronelol possui efeito antiespasmódico e miorrelaxante em músculo liso

traqueal de ratos Wistar.

A administração prévia de β-citronelol, por via inalatória, preveniu a

hiperreatividade traqueal ocasionada pela adição de estímulos

eletromecânicos (K+) e farmacomecânicos (ACh), sendo potencialmente

agente anti-inflamatório em animais que mimetizam a asma.

Seus efeitos inibitórios, em animais naive, não foram influenciados após o

tratamento com antagonistas (propranolol, L-NAME, TEA, azul de metileno,

ortovanadato de sódio, capsazepina, indometacina e A-967079), porém,

observamos que seu efeito miorrelaxante é dependente de concentração.

O mecanismo envolvido inicialmente no efeito relaxante parece ser

intracelular visto que inibe as respostas contráteis mediadas pela abertura dos

canais VOC, mas em concentrações ligeiramente mais altas, o β-citronelol

também é capaz de atuar inibindo a contração mediada pela abertura dos

canais ROC e SOC.

102

REFERÊNCIAS

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ANEXO

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Anexo A – Termo de Aprovação pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA/UFC)