trFTIR

Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion

NMR und XRD:

Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch ?

trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio-logischen Bedingungen!

Informationen: - Ladungsverteilung - H-Brücken - Protonierungszustände - Kinetik

Nutzung von trFTIR in der Bioanalytik

Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen

)(

)(log

2

1

vI

vIE

Differenzspektren

Hohe Anforderungen, da Hintergrundintensität viel stärker ist, als die Intensitätsänderungen (3-5 Größenordnungen)

• Michelson Interferometer (Multiplexvorteil)

• Gleiche Bedingungen bei jeder Messung!

• Wiederholungsmessungen zur Verbessung des Signal/Rausch Verhältnisses (~ )n

Apparatur

L M Z D

Michelson Interferometer

Apparatur

Reaktionsinitiierung

ATP

NO2

ATP

N+

O

O

O

N

O

ATP

hv

+

Zeitauflösung

a) Direkt über ns - Laserblitz nur bei photobiologisch aktiven Proteinen

z.B. Bacteriorhodopsin

b) Photolabile Trigger-Substanzen

z.B. Caged ATP

c) Mischzellen max. µs - Auflösung

Rapid Scan

• Spektrenaufnahme mit schneller Spiegelbewegung schnelle aufeinanderfolgende Aufnahme vollständiger Interferogramme - It(x)

• ms - Auflösung

• auf alle Reaktionen anwendbar

Step Scan

• Bei fixierter Spiegelposition wird Zeitabhängigkeit des Signals gemessen - Ix(t). Wiederholung der Messung bei jeder Spiegelposition

• ns - Auflösung (Detektionsbegrenzung)

• nur zyklische Reaktionen (z.B. Bacteriorhodopsin), andernfalls besondere Technik notwendig

Zeitauflösung

Häufige Reaktionswiederholung (oft > 1000x) genau gleiche Bedingungen! Techniken für azyklische Reaktionen:

• Flow cells Austausch der Substanz - hoher Substanzbedarf - kleine Extinktionsänderungen nicht messbar (grosse Zelldimensionen)

• Fokussierung des Laser/IR Strahls Messung von einzelnen Probensegmenten - 4 μm Film zwischen CaF2-Fenstern (Filmdicke ± 10%) - Aufheizung der Probe - Beeinflussung von Segmenten durch Streulicht

Zeitauflösung

Step Scan Technik

Austausch von Aminosäuren

Eine bestimmte Extinktions-änderung entfällt (neue Aminosäure ist unreaktiv)Problem: invasive Mutation

Isotopenmarkierung

Verschiebung der Wellenzahl der Extinktionsänderung (Isotopeneffekt)

Bandenzuordnung

• Kommerzielles FTIR Spektrometer mit Globar, Beamsplitter, Spiegel

• Farbstofflaser (Laserblitz ca. 20 ns)

• Individuelle Anfertigung von Messzelle und Signalverstärker

• Kommerzieller stickstoffgekühlter MCT-Detektor (Mercury/Cadmium/Tellur) mit einer Zeitauflösung von ca. 20 ns

• Schnelle Photodiode, die durch Laserreflex aktiviert wird und Aufnahme der Daten auslöst

• 3 mbar Vakuum im Geräteraum, um Vibration des Spiegels durch Geräusche zu minimieren

• Isolationstisch und Temperaturkontrolle

Beispiel für ein Step Scan trFTIR Gerät

Vorteile der trFTIR

- physiologische Bedingungen- Informationen über H-Atome und Ladungsverteilungen- Instabile Intermediate sind messbar - Kinetische Informationen

Nachteil

Noch keine Standardprozedur zur Vermessung verschiedener Proben verfügbar. Aufwändige, auf das Problem zugeschnittene, technische Modifikationen

Zusammenfassung und Ausblick

Ausblick

- Standardisierung und Validation der Methoden- fs - Zeitauflösung- Theoretische Berechnung kompletter IR-Spektren und Vergleich mit dem Experiment Struktur und Ladungsverteilung im Reaktionsverlauf!

Anwendung

• Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten

• Untersuchung molekularer Reaktionsmechanismen Verständnis Struktur, Funktion und Interaktion von Proteinen Voraussetzung Entwicklung gezielter wirkender

pharmakologische Substanzen

mit weniger Nebenwirkungen

Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin

• Aufklärung katalytische Schritte • Mechanismus stimmt mit 10 Jahre später über

Röntgenstrukturanalyse

ermittelter Kristallstruktur überein

Bakteriorhodopsin [2]

Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin

Protonentransfer im Bakteriorhodopsin mit Hilfe von Wasser [1]

•Retinal über Schiffsche Base Gebunden•Wird durch Licht angeregtIsomerisierung (pk-Änderung)H-Brücke W402 aufgespaltenFreie OH-Gruppe W401 kann negative Ladung des Asp 85 nicht mehr stabilisierenProtonentransfer von Schiffscher Base auf Asp 85Arg 82 bewegt sichProtonierter Wasserkomplex nahe der Oberfläche destabilisiertGibt Proton ab

Wasser aktiv beteiligt

Wie Proteine Protonen pumpen

•1190 cm-1

DeprotonierungZentrale Protonenbindestelle

•1762 cm-1

Protonierung Asp-85

Differenzspektrum Protonentransfer Bakteriorhodopsin [1]

Schaltmechanismus von GTPasen

• RAS kontrolliert Wachstumssignal • Mutationen unkontrolliertes Zellwachstum GAP hydrolysiert nicht mehr • Verfolgt RAS-GTP-Hydrolyse

Struktur vom Intermediat (H2PO42- ) [1]

Schaltmechanismus von GTPasen

GTP-Hydrolyse [1]Differenzspektrum GTP-Hydrolyse [2]

•Ras(*Ras)Gap: Intermediat (1143 cm-1)•Katalyse durch positive geladene Lys, Arg und Mg2+

Mutation Arg zu ungeladenem Gln -> Verlangsamung

Pharmascreening

• Nahezu alle Moleküle IR-aktiv (keine Fluoreszenzmarkierung)

Kann direkt Einfluss Pharmaka auf Protein bestimmen

z.B. Reaktivierung RAS• Studieren potentieller Pharmaka• Identifizierung aktivierender Pharmaka • Substanzen in natürlicher Umgebung studieren (RAS

über Lipidanker an Membranmodelle binden die auf ATR-Oberfläche aufgetragen sind)

– Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren

– Herstellung gezielter wirkender Pharmaka mit weniger Nebenwirkungen

– Untersuchung Protein mit unbekannter Raumstruktur

– Charakterisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren

Ausblick

Literatur

1. Proteinreaktionen: aufgelöst mit trFTIR, Nachrichten aus der Chemie, 5

2. http://www.innovationspreis-ruhr.de/Entwicklungsbeschreibung_17%2002%2006.pdf

3. K. Gerwert, Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1988, 92, 978

4. W. Uhrmann , A. Becker, C. Taran, F. Siebert, Appl. Spectrosc., 1991, 45, 390

5. R. Rammelsberg, B. Hessling, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Appl. Spectrosc., 1997, 51, 558

6. R. Rammelsberg, S. Boulas, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Vib. Spectrosc., 1999, 19, 143