Transizioni cooperative - sono caratterizzate dal fatto che già prima della transizione di fase sono presenti domini della nuova fase, che facilitano il processo di transizione.

T

Stato disordinato

Transizione ordine-disordineTransizione ordine-disordine

Transizione I ordineTransizione I ordine Stato ordinato

Ttr

gomitolo statistico ⇄ α-elica

Tm = temperatura di transizione (m = melting, fusione)

ch

hfh

Frazione di α-elica:

A T = Tm: fh = fc = 0.5

L’andamento sigmoidale è tipico di una transizione cooperativa.La pendenza della curva a T=Tm è una misura della cooperatività della transizione.

Transizione del I ordine

Transizione coil-elica della poli(L-lisina) in funzione del pH

Il pH di transizione (10.1) segue da vicino il pH di deprotonazione dei gruppi amminici (10.2): NH3

+ NH2 + H+

pH<10.2: il gruppo amminico laterale è protonato e la struttura elicoidale è destabilizzata dalle interazioni repulsive elettrostatiche tra le catene laterali. Lo stato di 'random coil' è invece stabilizzato da una solvatazione ottimale delle cariche elettrostatiche grazie alla maggiore libertà conformazionale del polipeptide.

pH>10.2: predomina la forma deprotonata del gruppo amminico e le interazioni di legame idrogeno intramolecolare rendono più stabile la conformazione ordinata.

Nel caso del poli(L-glutammico): COO- + H+ COOH

A pH acidi predomina la forma protonata e il polipeptide assume una struttura secondaria ordinata elicoidale, mentre a pH>4.5 predomina la forma deprotonata carica negativamente.

Transizione coil-elica del poli(L-glutammato) di sodio in funzione della percentuale di alcool isopropilico in miscele acqua/alcool.

I step: Nucleazione Formazione del primo legame idrogeno i→i+4

Richiede l’immobilizzazione di 6 angoli torsionali (Ψ=-47°; Φ=-57°)

II step: PropagazioneFormazione di un secondo legame idrogeno adiacente ad uno già formato.

Richiede l’immobilizzazione di soli 2 angoli torsionali

dipolosolvHBtrans HHHH

Formazione di legame idrogeno

Entalpia di solvatazione

Interazione tra dipoli ammidici

11 molkcal)]glutammicoL(poli[H trans T=298K

Formazione di legame idrogeno in N-metil acetammide in diversi solventi

MD

D

2

2 15 molkcalHHB

Competizione nella formazione di legame idrogeno:

CCl4 < diossano < H2O

HHsolvsolv = differenza di solvatazione tra il peptide in elica e il peptide in coil.

Un contributo generalmente sfavorevole alla transizione in elica (+2-3 kcalmol-1). Il coil è infatti libero di riaggiustarsi in modo da ottimizzare la solvatazione della sequenza peptidica (rigonfiamento).

coda)-(testa 2 1 molkcalH dipolo

213120

2112 3

4

coscoscosR

V

21

0

0

0

21

2

21

21 0

;

2

0

21

20

2

21

;012 V

Per un numero sufficientemente grande di residui (n10) il contributo attrattivo dovuto all’allineamento testa-coda dei dipoli predomina sul contributo repulsivo dei residui adiacenti, con una conseguente stabilizzazione della struttura elicoidale ( – 1-2 kcal·mol-1).

L’effetto di questa interazione è quello di favorire lunghi tratti elicoidali.

La valutazione dei contributi entropici del processo richiede una descrizione approfondita dei processi di solvatazione.

Il contributo entropico alla transizione elicacoil è generalmente favorevole ed aumenta all’aumentare della temperatura:

0 S - T

G ch

ch p,

Un modello a cooperatività infinita: le catene polipeptidiche possono esistere o in una configurazione tutta elica o in una configurazione tutto coil.

fh=0.5 significa che il 50% delle catene è in elica e il 50% in coil.

'ST'H'G

L’energia libera standard per la conversione di un singolo residuo da coil ad elica è:

Un processo favorito entalpicamente, ma sfavorito dal punto di vista entropico.

'ST)n('H)n('G 24

Nella formazione di un α-elica 4 residui non possono formare legame idrogeno e i due terminali restano comunque liberi di ruotare:

La variazione di energia libera dell’intero processo sarà:

hhhhh flnRT)f,T,()f,T,( 111 0

Scriviamo il potenziale chimico dei due stati:

ccccc flnRT)f,T,()f,T,( 111 0

h

hchtrans f

flnRT

10

All’equilibrio: chtrans 0

eqh

h

f

flnRT

1

0

Per T=Tm: fh=fc= 0.5

0 1 0 K

'ST)n('H)n( m 24

'S)n(

'H)n(Tm

2

4

Dall’equazione di van’t Hoff:

2

4

mTT RT

'H)n(

dT

Klnd

m

Poiché:

eqh

h

f

flnKln

1

m

m

TThhTT

flnflndt

d

dT

Klnd1

mm TT

h

hTT

h

h dT

df

fdT

df

f 1

11

mm TT

h

hhTT

h

dT

df

ffdT

df

4

1

11

'H)n(R

'S)n(

RT

'H)n(

dT

df

mTT

h

m

44

2

4

4 22

2

= misura della cooperatività della transizione

a) Modello per polipeptidi a basso peso molecolare

Sono possibili solo configurazioni del tipo:

cccccchhhhhhccccc o hhhhhhhcccccc

Vi può essere cioè una sola regione di nucleazione per catena.

Si trascurano effetti terminali di catena. Nel modello non vengono considerati i residui terminali, strutturalmente incapaci di dar luogo alla formazione di legami idrogeno.

Nel modello si identificano due contributi energetici:

I.I. Entropia di nucleazioneEntropia di nucleazione: congelamento dei primi 4 angoli torsionali.

II. PropagazioneII. Propagazione: formazione di un legame idrogeno adiacente ad un residuo già in elica

…ccchcccc… ….ccchhcc….

nuclS

'ST'H'G

I step: Nucleazione - formazione del primo legame idrogeno in una sequenza altrimenti in coil …cccccccc… ….ccchccc….

Consta di due contributi:

<entropia di nucleazione> + <energia libera di propagazione><entropia di nucleazione> + <energia libera di propagazione>

Il contributo dominante è quello entropico, il contributo entalpico può essere trascurato.

nuclnucl STG

'GG)I(G nucl

Per un’elica perfetta: 1h

Per il gomitolo statistico si assume, applicando l’approssimazione degli isomeri rotazionali, che vi siano 3 stati popolati per ogni angolo torsionale (t, g+,g-):

3c

c

hnucl lnRS

Dalla definizione statistica di entropia:

Moltiplicando per i 4 angoli torsionali bloccati durante il processo di nucleazione:

1 784

molcal.lnRS

c

hnucl

A 25°C:

162 molkcal.STG nuclnucl

1 1823

1

molcal.lnRSnucl

210

R

Sexp

RT

Gexp nuclnucl

0G 1 nucl

Transizione non cooperativa!Transizione non cooperativa!

Per:

A T=300K: =2.5 kcalmol-1 0.001

Quanto minore è σ, tanto più grande è l’energia libera di nucleazione, tanto più cooperativa è la transizione.

Dalla definizione di :

Snucl = Sh – Sc = RT ln

Sh=0 (wh=1) Sc = - RT ln

Tanto minore è il valore di , tanto maggiore sarà l’entropia del coil statistico, legata al numero di conformazioni accessibili al sistema, cioè al numero di isomeri rotazionali popolati.

Nella serie glicina (R=H), alanina (R=CH3), leucina (R=CH2-CH(CH3)2), il valore di segue l’aumento dell’ingombro sterico della catena laterale (0.00001, 0.0008, 0.0033), proprio perché diminuisce il numero di disposizioni geometriche accessibili ad ogni angolo torsionale.

ccchhhcccc

ccchhhhcccs

'ST'H'G

Assume il significato di una vera e propria costante di equilibrio relativa al processo di propagazione delle’elica.

RT

'Gexps

Gprop = - RT lns

Nel caso dei residui glicina, alanina e leucina (s=0.60,1.06,1.14 rispettivamente) al crescere delle dimensioni della catena laterale, aumentano le interazioni attrattive di Van der Waals.

Gruppi polari determinano l’instaurarsi di interazioni dipolari con il backbone peptidico, di cui bisogna valutare caso per caso l’entità sia rispetto al peptide in conformazione elicoidale, sia come gomitolo statistico.Nel caso dell’Asparagina (Asn, R=-CH2-CONH2), l’interazione della catena con il dipolo ammidico tende a destabilizzare l’elica.

Il parametro s è formalmente assimilabile ad una costante di equilibrio:

2prop

RT

H

dT

lns d

Per la formazione del primo legame idrogeno:

'GG)I(G nucl

RT

'GGexps nucl

Per la formazione del secondo legame idrogeno:

'G)II(G

RT

'Gexps

Per due residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:

'GGG nucl 2

RT

'GGexps nucl 22

Per tre residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:

'GGG nucl 3

RT

'GGexps nucl 33

RT

'GmGexps nuclm

Per m residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:

Da cui si ottiene per la transizione in cui m residui passano da coil ad elica:

Gtrans = Gnucl + m Gprop = - RT( ln + m ln s)

Dalla trattazione statistica dei vari modelli:

se RT

EE

c

hch

ch

hh s

sf

1

nc

nh

nh

n

n

h s

sf

1

n = numero dei residui

snns)s(

sn

ns)n(s)n(ns

)s(

sf

n

nn

h

11

1

22

1

12

12

3

00

hs

flim 1 h

sflim

b) Modello per polipeptidi ad alto peso molecolare

In questo caso bisogna introdurre la possibilità di avere più centri di nucleazione.

RT

'GmGjexps nuclmj

Per j centri di nucleazione e m residui adiacenti impegnati in legame idrogeno:

L’equilibrio tra sequenze lunghe e corte è in realtà il bilancio tra la tendenza a minimizzare l’energia e quella simultanea a massimizzare l’entropia.

Per catene molto lunghe la tendenza, entalpicamente favorita, di formare lunghe sequenze ordinate è controbilanciata dalla perdita di entropia complessiva.

Come risultato nella catena vi saranno piu centri di nucleazione con sequenze di eliche relativamente lunghe separate da regioni in coil (per esempio -turns in un filamento polipeptidico di una proteina globulare).

2

1

412

1

2

1

2

ss

sfh

Il risultato per 0.8 < s < 1.2 è:

Per s=1: 2

1hf

Per s<1: 2

1hf Per s>1:

2

1hf

per =110-4 s=0.8: fh=0.002 s=1.2: fh=0.997

per =110-2 s=0.8: fh=0.127 s=1.2: fh=0.837

1 s

s ]

s1

1-s 1 [

2

1

]s)2[(1

1-s

2

1

s] 4 s)-2[(1

1-s

2

1 f

1/221/22h

K f

f

f - 1

f s

c

h

h

h

Per =1 (Gnucl=0):

In questo caso si ha completa assenza di cooperatività, tutti i residui si comportano in maniera indipendente e s coincide con la costante di equilibrio della transizione.

Da cui si ottiene:

La cooperatività della transizione dipende da La cooperatività della transizione dipende da σσ (più piccolo è (più piccolo è σσ, , maggiore è l’energia libera di nucleazione, maggiore la maggiore è l’energia libera di nucleazione, maggiore la cooperatività della transizione).cooperatività della transizione).

Infatti:

ss

s

ds

d

ds

df

mTT

h

412

12

2

32

2

412

1

412

1

ss

s

ss

A T=Tm, fh=0.5, s=1:

4

1

1

s,TT

h

mds

df

Per σ→0:

1s,TT

h

mds

df

Per σ→1: 0G

4

1nucl

1

s,TT

h

mds

df

Transizione coil-elica per diversi valori di σ

Amminoacido

Gruppo laterale

Snucl(u.e.) s G(kcalmol-1)

Glicina -H 0.00001

-23.0 0.60 0.30

Alanina -CH3 0.0008 -14.3 1.06 -0.03

Leucina -CH2-

CH(CH3)2

0.0033 -11.4 1.14 -0.08

Serina -CH2-OH 0.0001 -18.3 0.76 0.16

Glutammico

-CH2-CH2-

COOH

0.0100 -9.1 1.32 -0.17

n=1500n=1500

n=46n=46

n=26n=26

Poli(γ-benzil-L-glutammato) in dicloroacetico/dicloroetilene (80/20, v/v)

σσ=2=2·10·10-4-4

• la cooperatività della transizione aumenta con n;

• la formazione dell’elica è favorita da un aumento di temperatura

Il tutto è dovuto alla competizione tra la formazione di legame idrogeno intramolecolecolare e la solvatazione della catena peptidica da parte delle molecole di acido dicloroacetico con formazione di legame idrogeno intermolecolare tra solvente e gruppi ammidici della catena peptidica.

Il processo è sostanzialmente guidato dal termine entropico che aumenta all’aumentare della temperatura a causa della desolvatazione dei gruppi ammidici e la liberazione in soluzione delle molecole di solvente.Questo contributo sovrasta la variazione negativa di entropia dovuta alla strutturazione della catena peptidica.

Nel computo globale dei processi in gioco:

00 H 00 S

000

S

T

G

Un processo guidato dall’entropia|Un processo guidato dall’entropia|

Per T=Tm, il numero massimo di regioni eleicoidali nella catena è pari a:

2

njmax 2

nm

1

j

m

Il rapporto <m>/<j> rappresenta la lunghezza media di una sequenza elicoidale:

Notare come questa grandezza sia indipendente dal numero dei residui.

Per n=103 (polipeptide a basso peso molecolare):

σ =1·10-4: <jmax>=5 <m>/<j>=100

σ =1·10-2: <jmax>=50 <m>/<j>=10

Per n=105 (polipeptide ad alto peso molecolare):

σ =1·10-4: <jmax>=500 <m>/<j>=100

σ =1·10-2: <jmax>=5000 <m>/<j>=10

Questi risultati sono l’effetto di due processi competitivi:

1) Il guadagno energetico (entalpico) dovuto alla formazione di sequenze elicoidali relativamente lunghe;

2) Il guadagno entropico legato alla presenza di più centri di nucleazione. I vantaggi entropici di avere più sequenze elicoidali è controbilanciato dal costo entropico del processo di nucleazione.

Nelle macromolecole a basso p.m. le sequenze elicoidali sono troppo corte per avere più centri di nucleazione.

Per polipeptidi a basso p.m. il processo di denaturazione avverrà preferibilmente a partire dagli estremi della catena, mentre per polipeptidi ad alto p.m. la transizione avverrà con la stessa probabilità in tutti i punti della catena.

L’energetica del processo può essere scomposta in due passi:- Associazione della prima coppia di basiUn passaggio con una forte perdita entropica e il guadagno entalpico legato alla sola formazione di legami idrogeno.-Associazione delle altre coppie di basiUn forte contributo entalpico legato alla formazione di legami idrogeno e alle favorevoli interazioni di stacking tra primi vicini.

)viciniprimi(G)I(GG 000

AT

TAG

TA

ATG)I(GG 0000

GT

CAG

CG

GCG

TC

AGG 000

kJ....... 718063945427318

Stabilizzazione per binding di ioni complessi [Co(en)3]3+

Acido poliadenilico – singola macromolecola di adenine stacked