TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: en el metabolismo, en la sealizacin y, por tanto, ......

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    TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN

    Objetivos Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas. Realizar la tcnica de transformacin bacteriana. Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo. Conocer la definicin de organismo transgnico. Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.

    IntroduccinDesde pocas antiguas, el ser humano ha seleccionado animales y plantas con caractersticas fenotpicas deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la produccin de insumos para consumo humano.Por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en promedio 2000 a 3000 litros de leche al ao; actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al ao, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 aos produca en promedio 70 huevos al ao, mientras que en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al ao.

    Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro produce la mula, que es estril. As, el nmero de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse slo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.

    Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, es decir, con la ingeniera gentica. Debido a que el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente igualpara todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos no relacionados y producir organismos con caractersticas tiles y particulares, que de otra manera sera imposible obtener: los denominados organismos transgnicos.

    Actualmente se ha identificado y caracterizado un gran nmero de genes. Este conocimiento abre la posibilidad de buscar mtodos para introducir o modificar un gene que proporcioneuna caracterstica deseable, como por ejemplo, curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes ajenos al husped se pueden ocasionar efectos indeseados, por ejemplo, que la caracterstica introducida lleve a una alteracin en el metabolismo, en la sealizacin y, por tanto, modifique la fisiologa y sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera indiscriminada a otros organismos.

    Requisitos para construir un vector de clonacin

    An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un organismo genticamente modificado se debe producir o construir un transgene, que consiste en el gene de inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la

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    funcin del gene en el nuevo husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una regin promotora en el extremo 5 del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor.Recuerda que la regin promotora es un segmento de DNA localizado ro arriba de la regin 5 del gen y que acta como un elemento que controla la expresin del gen. Asimismo, se debe aadir una secuencia de poli A en la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda ser traducido.

    Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en esta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (inserto) se denominavector recombinante.

    Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido debe poseer al menos tres caractersticas (Figura 4.3):

    1) Tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero.

    2) Tener un sitio de clonacin mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin deseada.

    3) Poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibitico.

    Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas circunstancias metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresin, denominados promotores fuertes, que tambin pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento.

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    Figura 4.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1 ori, origen de replicacin f1 y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lac I. Los vectores usualmente presentan ms de un origen de replicacin, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori es el origen de replicacin usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla.

    TransformacinExisten varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector, o mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformacin de plantas). En el caso de la transformacin de bacterias, generalmente se introduce el DNA ajeno por microelectroporacin o por choque trmico.

    Durante el choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre stos se encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga elctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lpidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que disminuye la repulsin de cargas elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la membrana y adems facilita la entrada del plsmido al interior celular. Las clulas que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introduccin de material gentico se denominan clulas competentes.

    Una vez que se introduce el material gentico a las clulas competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al colocar a las clulas en condiciones ptimas de crecimiento se obtienen las clulas transformantes.

    En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.4, que contiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que las clulas son transformantes.

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    Figura 4.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 4.3) fue utilizado para la construccin del vector pET-TEM-1. Se insert el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa. Para insertarlo se adicion el sitio de restriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen la secuencia que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a kanamicina ya que el plsmido contiene un gene que confiere la resistencia a ese antibitico.

    Material biolgico 1 tubo de microcentrfuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo,

    mantenerlas congeladas hasta su uso. 1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo,

    mantenerlas congeladas hasta su uso. Plsmido PET-TEM-1.

    Materiales y equipo2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL) Tubos de microfuga de 1.5 mL Varilla de vidrio en forma de L Recipiente para hieloMechero Bunsen Micropipeta de 100-1000 L Micropipeta de 10-100 LCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estrilesCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles

    Material por grupoBao de incubacin a 42C Incubadora con agitacin a 37C

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    Reactivos Medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression). Medio que se prepara