Le système immunitaire réagit à l’infection au VIH en sécrétant des γ globulines. La séropositivité au VIH indique que le sérum contient des anticorps anti-VIH. Comment savoir si les anticorps produits, les γ globulines du plasma, sont spécifiques au VIH ou pas ? Quelle structure de l’anticorps permet cette spécificité au VIH. Déroulement du TP Le dépistage d’une séropositivité se fait par la fixation d’anticorps sur des antigènes choisis, suivie d’une coloration enzymatique du complexe fixé. Test ELISA

Résultats de secours L’anticorps est une molécule symétrique, possédant 2 sites de fixation d’antigène. Leur partie variable est complémentaire d’un antigène spécifique. RASTOP L’anticorps est une protéine, formée d’une séquence d’acides aminés ANAGENE La comparaison de leur séquence permet d’identifier les parties variables et constantes. LE COMPTE RENDU SE PRESENTE SOUS LA FORME :

d’un tableau regroupant les résultats associés au contenu de chaque tube.

d’un schéma représentant les molécules liées entre elles dans le puits lors d’un résultat positif. Symboles

d’une phrase courte indiquant l’antigène fixé au fond du puits dans le cas d’une contamination au VIH.

d’un schéma de structure d’un anticorps, sur lequel sont chiffrées les séquences d’acides aminés des parties variables et constantes.

T.P. 4.2 : DEPISTAGE ET STRUCTURE DES ANTICORPS

TEST ELISA suivi du TP Principe : Le sérum que l’on veut analyser contient des anticorps. Il est versé dans un puits où est fixé l'antigène complémentaire de l’anticorps (= AC1) recherché : AC1 se fixe sur AG si le sérum contient cet anticorps. Un lavage permet d'éliminer les anticorps non liés à l’antigène ; seuls restent ceux qui sont liés à AG. Pour détecter la présence d’AC1 resté dans le puits, on ajoute un anticorps secondaire (AC2) qui se fixe sur la partie constante de l'AC1. Cet AC2 est couplé à un enzyme capable de réagir avec un substrat et de le colorer.

Cas de la recherche d'anticorps anti-VIH Dans le cas du test appliqué à la recherche d'une séropositivité, les protéines du VIH sont fixées en tant qu'antigènes dans le puits. Les individus infectés par le VIH possèdent dans leur sérum des anticorps dirigés contre ces protéines virales. (Plus précisément contre les « épitopes », c’est-à-dire contre les déterminants antigéniques). Ces anticorps anti-VIH sont détectés dans les six semaines qui suivent l'infection. Une autre technique, le Western blot, confirme et détermine si le patient possède des anticorps qui réagissent avec une ou plusieurs protéines virales.

Matériel : suivi du TP

une barrette de puits au fond desquels sont fixés des antigènes : AG. (GP120 par exemple)

des solutions d’anticorps à tester, de taux variable : AC1 (anti-VIH par exemple).

une solution de traceur AC2 (= association du 2° anticorps et d’un enzyme)

le réactif d’ELLMAN = substrat de l’enzyme. L’enzyme colore ce substrat (incolore au départ) en bleu.

une pissette d’eau pure pour le rinçage, des pipettes

PROTOCOLE

1. Placer dans chaque puits 2 gouttes d’une solution à tester. Attention, 1 solution/puits. 1 pipette/solution. Penser à repérer les puits. Les solutions à tester sont notées : Témoin, C1, C2, C3, C4, C6, C8, sérum non immunisé

2. Attendre 15 minutes. Puis vider les puits par retournement rapide (pour éviter les mélanges de puits) Laver 2 fois au tampon PSB (pour enlever les AC1 ainsi que les autres AC non fixés)

3. Ajouter dans chaque puits 2 gouttes de la solution d’anticorps traceurs [AC2 associé à l’enzyme].

4. Attendre 15 minutes. Puis vider les puits par retournement rapide (pour éviter les mélanges de puits) Laver 2 fois au tampon PSB (pour enlever les AC2 non fixés)

5. Ajouter dans chaque puits 2 gouttes de TMB, substrat de l’enzyme associée à AC2.

6. Laisser agir 2 minutes : regarder le résultat ; le noter. RESULTATS DE SECOURS suivi du TP

RASTOP suivi du TP Pour télécharger RASTOP sur son disque dur, utiliser le lien vers le site de l’INRP :

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/rastop/html/telechargement.htm Dans votre ordinateur, préparez un dossier pour recevoir le logiciel. Téléchargez la version exécutable Téléchargez les DLL complémentaires ; il n’est pas nécessaire de les mettre dans le répertoire de Windows/système ou WINNT/system32. Vous pouvez les mettre dans le même dossier que vous venez d’utiliser pour RASTOP. Il faut ensuite charger les molécules utiles Soit précisément en cliquant sur ce lien : http://librairiedemolecules.education.fr/molecule.php?idmol=88 Soit en allant dans l’accueil de la LIBRAIRIE DE MOLECULE : http://librairiedemolecules.education.fr/. Puis vous suivez le chemin suivant : applications pédagogiques, recherche par entrée du programme, TS obligatoire, immunologie 2, structure et fonction des anticorps : en savoir plus. Cliquer sur anticorps anti-GP120, la page suivante s’ouvre.

RASTOP en français

Version 2.01 Exécutable et répertoire d'aide

Version 2.03 Exécutable seulement - (actualisation par C. Duqué)

Version 2.03 Exécutable et répertoire d'aide

Attention : Sur certaines machines, des Dll supplémentaires (MFC42.DLL, MFC42D.DLL et MSVCRTD.DLL) peuvent être requises. Les télécharger et les décompacter dans le répertoire windows/system ou WINNT/system32

Télécharger les DLL de RasTop

Cliquer sur le fichier non compressé (format pdb)

ANTICORPS ANTI-GP120-VIH

RÉFÉRENCES

Auteurs : Ghiara J.B., Stura E.A., Stanfield R.L., Profy A.T., Wilson I.A., Publication : "Crystal structure of principal neutralization." in Science 1994 n°264 pages 82-85 PubMed

Source : PDB Identifiant : 1ACY

CLASSIFICATION : organisme d'origine : souris catégorie : organique > protide > proteine > structure > enveloppe virale > anticorps anti-gp120-vih organique > protide > proteine > immunite > immunoglobulines > anticorps anti-gp120-vih

DESCRIPTION Un fragment Fab d'une molécule d'anticorps anti-glycoprotéine 120 du virus du SIDA.

VISUALISATION EN LIGNE : visualisation rapide , molusc , protein explorer

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Enregistrer : sélectionner le même dossier de téléchargement que pour RASTOP suivi du TP

Recommencer de même pour les séquences suivantes :

Anticorps anti-virus de la grippe : http://librairiedemolecules.education.fr/molecule.php?idmol=99

Anticorps anti-protéine 24 du virus du sida : http://librairiedemolecules.education.fr/molecule.php?idmol=95

Anticorps anti-lysozyme : http://librairiedemolecules.education.fr/molecule.php?idmol=101

Au lycée, utilisez directement RASTOP : suivi du TP Les séquences peuvent être copiées sur une clé.

Pour visualiser une molécule : Chemin : poste de travail, TS, SVT-CC, sida, TP22 anticorps, ouvrir RASTOP : Dans : Fichier, ouvrir : dans le dossier « molécules », « immuno » : IGGTOTAL.pdb Comprendre :

La structure de l’anticorps : structure symétrique : atomes en sphère.

L’association de 4 chaînes d’acides aminés : 2 chaînes lourdes, 2 chaînes légères : atomes ; colorer par chaîne. Sans fermer « IGGTOTAL.pdb », ouvrir de nouvelles molécules : « anticorps anti-VIH-1ACY ».

« anticorps anti-lysozyme-1FDL ». Suivre le même protocole pour montrer :

l’anticorps, en bleu et vert, associé à l’antigène, en rouge.

l’antigène est différent ; les extrémités variables des chaînes lourdes et légères sont différentes.

repérer dans le bandeau du bas, les noms des chaines et les positions des acides aminés.

l’imbrication entre antigène et anticorps : positionner la molécule avec l’antigène vers soi ; cliquer sur « front » puis sur « ► » pour modifier la profondeur de la coupe : chercher à visualiser l’imbrication antigène/anticorps.

Après cette visualisation, schématiser la structure d’un anticorps :

symétrie des chaînes lourdes et légères.

parties variable et constante.

site de fixation antigénique.

ANAGENE suivi du TP

Pour visualiser les séquences : Chemin : démarrer, programmes, anagène 2 : Sélectionner les chaines H et L d’immunoglobuline anti VIH de la banque de séquence en Terminale S.

Comparer les chaines H d’une part, puis les chaines L d’autre part : comparaison avec discontinuités suivi du TP Identifier les parties constantes et les parties variables à chaque fois.

SYMBOLES DE SCHEMA suivi du TP

AC anti-AG AG fixé au fond du puits

AC traceur associé à l’enzyme E

Substrat de l’enzyme

Suivi du TP 2° exemple de symboles