The PERK-eIF2α signaling pathway is involved in TCDD-induced ER

stress in PC12 cellsZhiqing Duan, Jianya Zhao,Xikang Fan, Cuiying Tang, Lingwei Liang,

Xiaoke Nie, Jiao Liu, Qiyun Wu, Guangfei Xu

Nantong University, Republic of China

Neurotoxicology 44: 149-1592014

Autores: Camila Leyton Santander- Ignacio Maureira CaviedesProfesor Tutor: TM. Verónica Bahamondes L.

Curso de Microscopía ElectrónicaDepartamento de Tecnología MédicaFacultad de MedicinaUniversidad de Chile 2014

2, 3, 7, 8 tetraclorodibenzo-p-dioxina

Subproducto no intencional de la combustión incompleta o

incineración en industria química

Efectos agudos

Efectos crónicos no cancerígenos

Efectos crónicos cancerígenos

Efectos en reproducción

Introducción

Introducción

Figura 1. Micrografía obtenida por METque muestra retículo endoplásmicorugoso

Condiciones fisiológicas1. Plegamiento de proteínas

nacientes• GRP78• PDI

2. Glicosilación3. Homeostasis de Calcio

TCDD Condición de estrés Neurotoxicidad

Cambios ambientales o estresor químico conduce a mal plegamiento proteico, acumulación y activación

UPR

Introducción

Figura 2. Condición de estrés de retículo. Activación de UPR

Objetivo General

Evaluar si los efectos de distintas concentraciones deTCDD en línea celular PC12 y cultivo primario decorteza de rata inducen un estrés de retículo queconlleva a la activación de UPR

Objetivos

Objetivos Específicos

1- Examinar los efectos de distintas concentraciones deTCDD sobre CHOP y GRP78, así como de proteínas queparticipan en la vía ER-UPR (IRE1, ATF-6 y PERK) en líneacelular PC12 mediante las técnicas Western Blot,Inmunofluorescencia, microscopía electrónica detransmisión y transfección de siRNA.

2- Evaluar los efectos de distintas concentraciones deTCDD en cultivo primario de corteza de rata mediantemicroscopía electrónica de transmisión.

Objetivos

Cultivos celulares

Línea de Células PC12

Tratamiento a distintas

concentraciones de TCDD y Solubrimal

Cultivo primario de células de la corteza cerebral

de ratón

Materiales y Métodos

• Semi cuantificación de proteínas involucradas en vías de estrés de retículo y apoptosis.

• Anticuerpos utilizados contra : GRP78, p-PERK, PERK, p-IRE1, IRE1, cleaved ATF-6, ATF-6, caspasa-3 activa, CHOP, p-eIF2α o eIF2α.

Western Blot

• Localización de proteínas involucradas en vías de estrés de retículo e inducción de apoptosis.

• Anticuerpos primarios utilizados: GRP78, CHOP y eIF2α.

• Anticuerpo secundario conjugado a FITC.

Inmunofluorescencia

Western Blot

Inmunofluorescencia

Materiales y Métodos

Microscopía electrónica de transmisión

Observación de corte fino de loscultivos para análisis decambios de volumen delretículo endoplásmico encorrelación con el estrés deretículo y apoptosis.

Materiales y Métodos

Microscopía electrónica de transmisión

Células PC12 y neuronas primarias

tratadas con TCDD (1, 10, 50,200 nM) por 24

hrs.

Lavado en PBS

Fijación en glutaraldehído 4%

p/v

Inclusión de la muestra en resina epoxy (Epon 812)

Deshidratación en concentraciones de

etanol ascendentes.

Post fijación en Tetróxido de

Osmio (OsO4) 1% p/v

Cortes ultrafinos

MET

*Cada experimento tiene al menos 3

repeticiones.

Materiales y Métodos

Tratamiento con TCDD altera la ultraestructura del retículo endoplásmico en células PC12 y cultivo primario de neuronas de rata

Resultados MET

Fig. 3. Alteraciones ultraestructurales del RE en células PC12 tratadas con TCDD (Control: A; 10 nM: C; 50

nM: D; 200 nM: E) por 24 horas observadas por microscopía electrónica de transmisión en células PC12.

Cél

ula

s P

C1

2

Resultados MET

Fig. 4. Alteraciones ultraestructurales del RE en cultivo 1° con TCDD (Control: G; H: 1nM, I:10 nM: J:

50 nM: K: 200 nM: E) por 24 horas observadas por microscopía electrónica de transmisión en cultivo 1°

TCDD provoca una respuesta de estrés en el retículo endoplásmico en las células PC12.

Resultados Western Blot

Fig 5. Western blot de las células PC12 las cuales fueron lisadas y se utilizaron anticuerpo contra CHOP y GPR78 para observar la variación en el tiempo de

la concentración de estos marcadores al tratar las células con TCDD. (A). Western blot con TCDD a una concentración 1,10 y 100nM.(B). Densitometríarelativa de GRP78. (C) Densitometría relativa de CHOP.

Fig. 6. Inmunofluorescencia que muestra la expresión de CHOP (verde) en células

con TCDD (200 nM) y controles

Aumento en GRP78 y CHOP en células PC12 respecto a controles por altas concentraciones de TCDD

Resultados IF

Altas concentraciones de TCDD (200 nM)

inducen una condición de estrés de retículo

TCDD estimula la UPR y activa la vía PERK-eIF2α en células PC12

Resultados Western Blot

Fig. 7. Activación de PERK y eIF2α inducido por TCDD en células PC12. (A) IZQ. Western blot que muestra el efecto de TCDD (200nM) en la activación de la vía UPR a diferentes tiempos de exposición. DER. Grafico donde se aprecia la densidad relativa de las bandas del western blot anterior. (B) Expresión relativa de p-eIF2α y eIF2α.

Resultados IF

Figura 8. Inmunofluorescencia de p-eIF2α (verde) en células controles y tratadas con TCDD por 3 horas. Núcleo marcados

con DAPI.

Aumento de la vía p-eIF2α producto de altas concentraciones de TCDD. Activación de UPR por condición de estrés

ResultadosSalubrinal protege a la célula PC12 de la muerte celular neuronal

inducida por TCDD

Resultados Western Blot

Fig. 9. Efecto del salubrinalen muerte celular de células PC12 inducidas porTCDD. (A)Western blot de células PC12 tratadas con 30uM de salubrimal.(C)Análisis por western blot de la expresión de CHOP, GRP78 y caspasa 3.

Discusión

Alteración de la morfología del RE

Dilatación de los lúmenes a altas concentraciones de TCDD

1. Acumulación de proteínas mal plegadas

MET

Se produce estrés de retículo

1. Se corrobora acumulación de proteínas mal plegadas (GRP78)

2. Activación de eIF2α

Western BlotInmunofluorescencia

Conclusiones

La utilización de las distintas técnicas en este trabajo nos permite cumplir con elobjetivo general, el cual era examinar si concentraciones de TCDD producían unacondición de estrés de retículo que conlleva a la activación de proteínas de la víaUPR.

El aumento del lumen del retículo endoplásmico es posible observarlo mediantemicroscopía electrónica de trasmisión, pero esta herramienta debe estaracompañada de técnicas de biología molecular (Western Blot), acompañada deinmunofluorescencia, que nos permiten entender cómo TCDD induce la vía UPR(PERK-eIF2α)a través de la semi cuantificación de las moléculas que estáninvolucradas en esta vía

Cabe destacar que para este trabajo la sola utilización de técnicas de biologíamolecular no permitía cumplir el objetivo, ya que no hubiese sido posibleobservar cambios ultra estructurales de los lúmenes del retículo endoplásmico

Conclusiones

BibliografíaBibliografía