Techniques d'extraction et de caractérisation d'une protéine

Doc 1:Centrifugation différentielle

Doc 2:

Doc 3:

Doc 4:Solubilité de la β-galactosidase en fonction du pH à différentes concentrations de sels (NaCl).

Doc 5:Séparation de macromolécules par chromatographie d'affinité. Les carrés échancrés, les demi-cercles, et les triangles représentent schématiquement les sites de liaison du ligand sur les macromolécules. Seuls les sites de liaison du ligand représentés par des cercles oranges avec des échancrures triangulaires se lient spécifiquement aux ligands ancrés à la matrice chromatographique. Toutes les autres macromolécules ne sont pas retenues et sont éluées lors du lavage.

Doc 6: Chromatographie par gel-filtrationReprésentation schématique de la chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration). (a) Une bille de gel est constituée d'un gel-matrice et de canaux internes qui renferment un volume interne de solvant. Les petites molécules peuvent entrer librement dans les espaces internes remplis de solvant. Par contre, les plus grosses molécules ne peuvent pas entrer dans les porcs des billes du gel. (b) La solution échantillon commence à entrer dans la colonne de gel. Les plus petites molécules (en rouge) peuvent pénétrer dans les pores du gel, et sont plus ralenties que les molécules plus grosses (en bleu) qui ne peuvent pas entrer dans les pores du gel. (d) Les plus grosses molécules sortent les premières de la colonne, tandis que les plus petites sortent les dernières.

La chromatographie d'exclusion moléculaire, également appelée gel-filtration. Celte méthode sépare des protéines selon leur taille. La colonne contient un polymère avec des pores de taille sélective. Les plus grandes protéines migrent plus vite que les plus petites parce qu'elles sont trop grandes pour entrer dans les pores des billes et prennent donc une route plus directe à travers la colonne. Les plus petites protéines entrent dans les pores et sont ralenties par les voies labyrinthiques qu'elles doivent prendre à travers la colonne.

Doc 7: Détermination de la masse moléculaire d'une protéine par chromatographie par gel-filtration

Chromatographie par gel-filtration : méthode de séparation fondée sur la taille des molécules.

Déroulement d'une chromatographie par tamisage moléculaire.- Filtration sur gela : deux protéines, A et B (MA > MB), sont séparées, b : relation linéaire entre le volume d'élution V, et le logarithme décimal de la masse moléculaire.M (α : lactoglobuline, 37 kDa; β : ovalbumine, 48 kDa: γ :phosphatase alcaline, 80 kDa; δ : lactate déshydrogénase. 135 kDa).

Doc 8: Détermination de la masse moléculaire d'une protéine par Electrophorèse SDS-PageLa combinaison du sodium dodécylsulfate avec une protéine.

En rosé : tête négativement chargée du SDS.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS des protéines de la membrane érythrocytaire humaine (d'après Alloisio N. et al.. Hum. Genêt. : 59. 68-71, 1981).a : nomenclature numérique des protéines les plus abondantes, colorées par le bleu de Coomassie : 1 : α-spectrine. 2 : β-spectrine; 2.1 : ankyrine: 3 : transporteur des anions. 4.1 et 4.2 : bandes innominées; 5 : actine (monomère); 6 : glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase. b : représentation graphique de la distance de migration en fonction du logarithme de la masse moléculaire (exprimée en Da).

Doc 9: La chromatographie d'affinité

Doc 10: Chromatographie par échange d'ions

Supports échangeurs d'ions utilisés pour la séparation des protéines.Les supports se décomposent en billes microscopiques,a: carboxyméthylcellulose.b: diétnylaminoéthvlceUulose.

Représentation schématique illustrant la séparation de plusieurs protéines par chromatographie d'échanges d'ions par élution fractionnée. La partie brun clair de la colonne représente l'échangeur d'ions et les bandes colorées représentent les différentes protéines a) Le mélange de protéines est lié à la partie supérieure de l'échangeur d'ions dans la colonne. b) Au cours de l'élution, les différentes protéines se séparent sous forme de bandes discrètes en raison de leurs mobilités différentes sur l'échangeur d'ions compte tenu des caractéristiques prédominantes de la solution. A ce stade, la première bande de protéine a traversé la colonne et est recueillie séparément, alors que les bandes restantes, moins mobiles, sont encore dans le haut le haut de la colonne (c) La concentration saline du tampon d'élution a augmenté afin d'éluer les bandes restantes (d) Diagramme, d'élution du du mélange de protéines à la sortie de la colonne.

Doc 11: Electrophorèse

Sur papier:Dans l'électrophorèse sur papier, l'échantillon est déposé en un point au milieu d'une bande de papier filtre ou d'acétate de cellulose imbibée de solution tampon. Les extrémités de la bande plongent dans deux réservoirs de tampon séparés dans lesquels sont placées les électrodes. Quand on fait passer un courant continu, les ions de l'échantillon migrent vers les électrodes de signes opposés, à des vitesses différentes pour former, éventuellement, des bandes discrètes. La vitesse de migration d'un ion est influencée, dans une certaine mesure, par ses interactions avec la matrice support, mais elle est essentiellement fonction de sa charge. Lorsque l'électrphorégramme est achevé (en général après quelques), la bande est séchée et les constituants de l'échantillon sont localisés grâce aux mêmes techniques que celles utilisées dans la chromatographie sur papier.

Électrophorèse sur papier, (a) Représentation schématique de l'appareil utilisé. L'échantillon est déposé en un point au milieu de la feuille de papier imbibée de tampon. Les extrémités du papier plongent dans les réservoirs de tampon dans lesquels sont placées les électrodes et n champ électrique est appliqué, (h) Représentation schématique d'un électrophorégramme sur papier. Notez que les ions positifs (canons) ont migré vers la cathode et que les ions négatifs (anions) ont migré vers l'anode, les molécules non chargées n' ont pas migré.

Immnunoprécipitation:a: Electrophorèse du mélange de protéines, déposé dans le puits central.b: Diffusion: les protéines (antigènes) et les anticorps vont à la rencontre les uns des autres. La rencontre d'antigènes (a, b) et d'anticorps spécifiques (anti-a. anti-b) produit des arcs de précipitation.

BILAN

Les macromolécules cellulaires sont solubilisées en désorganisant les cellules par différents traitements chimiques ou mécaniques tels que les broyeurs. Après lyse des cellules, une purification partielle par centrifugation différentielles permet d'éliminer les débris cellulaires ou d'isoler un composant cellulaire intéressant. Une fois sorties du contexte protecteur de la cellule, les protéines et les autres molécules de la cellule doivent être traitées pour ne pas être endommagées sous l'influence de pH ou de températures extrêmes, ou par dégradation enzymatique ou chimique, ou par manipulation grossière. L'état de pureté d'une substance en cours de purification doit être contrôle tout au long de la purification par un dosage spécifique. Les protéines sont facilement purifiées en quantité appréciable par précipitation fractionnée, où les solubilité des protéines sont modifiées en faisant varier la concentration en sels ou le pH.

La chromatographie par échange d'ions utilise des supports tels que la cellulose ou des gels de polyacrylamide réticulés. Les séparations sont dues aux interactions électrostatiques différentes entre les groupes chargés du support échangeur d'ions et ceux des substances en coins de séparation. Dans la chromatographie sur papier, les composés sont séparés par partage entre une phase mobile d'un solvant non-polaire et une phase stationnaire aqueuse qui imprègne les tissus du papier.

On peut repérer les molécules en utilisant des colorants spécifiques comme la ninhydrine pour les acides aminés et les peptides, ou des marqueurs radioactifs. Par chromatographie en gel-filtration, les molécules se séparent en fonction de leur taille et de Ieur forme en utilisant des billes polyacrylamide ou d'agarose dont les pores ont des dimensions moléculaires. Une colonne de gel-filtration calibrée peut être utilisée pour déterminer les masses moléculaires des macromolécules. La chromatographie d'affinité permet la séparation de biomolécules en utilisant leurs capacités biochimiques uniques de se lier spécifiquement à d'autres molécules.

Avec l'électrophorèse, les molécules chargées sont séparées en fonction de leurs vitesses de déplacement dans un champs électrique sur un support solide comme le papier, l'acétate de cellulose, des gels de polyacrylamides réticulés ou l'agarose.

L'électrophorèse en gel utilise des gels de polyacrylamide réticulés ou des gel d'agarose comme support, ainsi les molécules sont séparées selon leur taille par gel-filtration et selon leurs charges. Les molécules séparées sont visualisées par coloration.Le détergent anionique dodécylsulfate de sodium (SDS) dénature les protéines et les recouvre uniformément, ce qui donne à la plupart des protéines une densité de charge et une forme semblables. La technique SDS-PAGE peut être utilisée pour déterminer les masses des macromolécules. Dans la focalisation iso-électrique, les protéines sont immergées dans un gradient de pH stable et soumises à un champ électrique qui les oblige à se déplacer jusqu'à ce qu'elles se trouvent à leur point isoélectrique.