T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

BEHÇET HASTALIĞINDA TÜMÖR NEKROZİS FAKTÖR-ALFA (TNF-αααα) GEN

POLİMORFİZMLERİNİN HASTALIĞIN GELİŞİM RİSKİ VE KLİNİĞİ ÜZERİNE

ETKİSİ

Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Gülay KINIKLI

Proje Numarası: 2001-08-09-65

Başlama Tarihi: 01.08.2001

Bitiş Tarihi: 01.07.2002

Rapor Tarihi: 09.12.2003

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2003 "

EK-8

I. PROJENİN ADI ve ÖZETİ TÜRKÇE ÖZET BEHÇET HASTALIĞINDA TÜMÖR NEKROZİS FAKTÖR-ALFA (TNF-αααα) GEN POLİMORFİZMLERİNİN HASTALIĞIN GELİŞİM RİSKİ VE KLİNİĞİ ÜZERİNE ETKİSİ Behçet hastalığının patogenezinde TNF-α’nın önemli rolü olduğunun düşünülmesine rağmen,

TNF-α gen polimorfizmlerinin etkisi yeterince değerlendirilmemiştir. Bu çalışmada, TNF-α geninin –308, –238 ve –376 pozisyonlarındaki polimorfizmlerin Behçet hastalığının gelişimi ve klinik şiddeti üzerine etkisinin incelenmesi amaçlandı. Çalışmaya 107 Behçet hastalıklı birey ile 102 sağlıklı kontrol alındı. Hastalar hastalık şiddeti, aktivitesi ve klinik özelliklere göre sınıflandırıldı. TNF-α genotipleri PCR-SSP yöntemi esas alınarak, serum TNF-α düzeyi ise ELISA tekniği ile belirlendi. TNF-α geninin –308, –238 ve –376 pozisyonlarında heterozigot mutasyon sıklığı hasta grubunda sırasıyla % 19.6, % 3.7 ve % 0.9, kontrol grubunda ise % 15.7, % 5.9 ve % 2.9 bulundu. Kontrol grubundan iki kişide –308 A/A genotipi mevcutken, hasta grubunda homozigot mutasyon gözlenmedi. TNF-α genotiplerinin dağılımı hasta ve kontrol gruplarında benzer idi. TNF-α –308 G/A genotip sıklığı ile hastalık şiddeti ve klinik bulgular arasında ilişki saptanmadı. Vasküler Behçetli olgularda TNF-α –238 G/A genotip sıklığı mukokutanöz olgulardan yüksek olmakla beraber, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.08). Tromboflebitli olgularda ise bu genotip sıklığı anlamlı olarak yüksek idi (p<0.05). Behçet hastalarında serum TNF-α düzeyi kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek bulundu (3.10 ± 1.45 ve 2.43 ± 1.94 pg/ml, p<0.01). Ancak, serum TNF-α düzeyi ile hastalık şiddeti, aktivitesi, klinik bulgular ve TNF-α genotipleri arasında ilişki saptanmadı. Bulgularımız, TNF-α gen polimorfizmlerinin Behçet hastalığının gelişimi ve kliniği üzerine önemli bir etkisi olmadığını düşündürmektedir.

İNGİLİZCE ÖZET EFFECTS OF TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA (TNF-αααα) GENE POLYMORPHISMS ON THE SUSCEPTIBILITY TO, AND CLINICAL SEVERITY OF BEHÇET’S DISEASE Although TNF-α is considered to be one of the important mediators in Behçet’s disease (BD),

the role of TNF-α gene polymorphisms in the pathogenesis of BD has yet to be elucidated. The purpose of this study was to examine the effects of TNF-α gene polymorphisms at positions –308, –238 and –376 on the susceptibility to, or severity of BD. One hundred-seven patients with BD and 102 healthy subjects were included in the study. The patients were classified according to disease severity, activity and clinical features. TNF-α genotypes were determined by a method based on PCR-SSP. Serum TNF-α concentration was measured by ELISA technique. The frequencies of heterozygous mutation at positions –308, –238 and –376 of the TNF-α gene were respectively 19.6%, 3.7% and 0.9% in patient group and 15.7%, 5.9%, 2.9% in control group. A homozygous mutation at position –308 was present in two controls. The distribution of TNF-α genotypes was found to be similar in BD patients and healthy controls. The frequency of TNF-α –308 G/A genotype in BD patients was not associated with disease severity and clinical findings. Although the frequency of TNF-α –238 G/A genotype in patients with vascular BD was higher than those of patients with mucocutaneous BD, the difference did not find statistically significant (p=0.08). This genotype was significantly associated with the presence of thrombophlebitis (p<0.05). Serum TNF-α level was significantly higher in patients with BD compared to controls (3.10 ± 1.45 and 2.43 ± 1.94 pg/ml, p<0.01). Serum TNF-α level was not found to be significantly associated with disease severity, activity, clinical findings and TNF-α genotypes. Our findings suggest that the TNF-α gene polymorphisms are unlikely to play an important role in the pathogenesis and severity of BD.

II. AMAÇ ve KAPSAM Behçet hastalığı, bir Türk doktoru olan Hulusi Behçet tarafından ilk defa tanımlanmış olan ve

vaskülitik sendromlar içinde yer alan kronik inflamatuvar bir hastalıktır. Tanı koydurucu özellikleri; tekrarlayan oral ve genital ülserler, göz ve cilt lezyonları ve paterji testi pozitifliği olmakla beraber; eklemler, damarlar, gastrointestinal ve santral sinir sistemi gibi birçok sistem de tutulabilmektedir (1-6).

Behçet hastalığının etyopatogenezi kesin olarak bilinmemekle beraber, mevcut veriler nötrofil aktivasyonu ve T hücre aracılı immün yanıtın önemli rolü olduğunu göstermektedir (7-16). Paterji reaksiyonu, Behçet hastalığında nötrofil aktivasyonunun en klasik göstergesidir (12). Otoimmün hastalıklar ve diğer vaskülitlerde olduğu gibi, Behçet hastalığında da Th1 lenfositlerin sitokin profili baskındır (7-9,11,14,16). Bu sitokinlerden TNF-α, özellikle akut faz yanıtı, vasküler adezyon, kemik iliğinde progenitör farklılaşma, apopitoz, nötrofil aktivasyonu ve T ve B lenfositlerin proliferasyonu üzerine olan düzenleyici etkileri nedeniyle, son zamanlarda Behçet hastalığının patogenezinde en önemli ilgi odaklarından biri durumuna gelmiştir (17,18). Yapılan çalışmalarda, Behçet hastalarının periferik kan mononükleer hücrelerinde TNF-α sentezinin arttığı gösterilmiş (11,14,15) ve serum örneklerinde TNF-α düzeyi yüksek bulunmuştur (8,9). TNF-α yapımındaki artış, Behçet hastalığındaki temel patogenetik mekanizmalardan birisi olan nötrofil aktivasyonuna aracılık edebilir (8,9).

Behçet hastalığında ortaya çıkan bu immünolojik değişikliklerin nedeni açık değildir. Virus, streptokok antijenleri, ısı şoku proteinleri gibi antijenik uyarıların ve genetik faktörlerin rolü üzerinde durulmaktadır (7-9). Behçet hastalığı klasik bir genetik hastalık değilse de; hastalığın coğrafi dağılımı, ailesel birikim özelliği ve HLA-B51 ile ilişkisi, patogenenezde genetik faktörlerin rolü olduğunu desteklemektedir (22-26). Değişik serilerin analizi; HLA-B51 taşıyıcılığına, 1.5-16 kat artmış hastalık gelişim riskinin eşlik ettiğini göstermiştir (22).

Ancak, HLA-B51 ile yüksek sıklıkta birlikteliğin HLA-B51’in direkt rolünden çok, HLA-B lokusuna yakın bölgede yerleşik hastalığa eğilim yaratan bir gen ile bağlantı dengesizliğine (linkage disequilibrium) bağlı olduğu düşünülmektedir. Hastalıktan sorumlu gen bölgesi henüz belirlenememiş olmakla beraber, MHC class III gen bölgesinde HLA-B genine komşu non-HLA genleri ve bu bölgede yer alan TNF-α geni en önemli aday durumundadır (8,27). Özellikle TNF-α geninin düzenleyici (promoter) bölgesinde –308 ve –238 pozisyonlarında tek baz değişikliği ile karakterize polimorfizmlerin, patogenezde rolü olduğu düşünülen TNF-α gen ekspresyonunu ve sentez hızını değiştirerek, hastalık gelişimine eğilim yaratabileceği ileri sürülmüştür (27,28). Aktif Behçet hastalarının periferik kan mononükleer hücrelerinde TNF-α gen ekspresyonunda artış saptanması, bu görüşü desteklemektedir (29). Ancak, Behçet hastalığında bu konu henüz yeterince araştırılmamıştır. Yapılan az sayıda çalışmada, TNF-α gen polimorfizm sıklığı kontrol grubundan farklı bulunmamış olmakla beraber (30,31); mevcut patogenetik veriler, TNF-α gen bölgesinin hastalık gelişimi ve şiddetinin belirlenmesinde önemli rolü olabileceğini düşündürmekte ve konuyla ilgili daha ileri çalışmaların yapılmasını gerekli kılmaktadır.

Genetik bir araştırma için yeterli sayıda deneği kapsayan bu çalışmada, Behçet hastaları ile sağlıklı bireylerde TNF-α geninin –308, –238 ve –376 pozisyonlarındaki polimorfizmler ve serum TNF-α düzeyi belirlenerek; TNF-α gen polimorfizmlerinin Behçet hastalığının gelişimi ve kliniği üzerine etkisinin, serum TNF-α düzeyi ile klinik özellikler arasındaki ilişkilerin ve TNF-α gen polimorfizmleri ile serum TNF-α düzeyi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

III. MATERYAL ve YÖNTEM Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi Klinik İmmünoloji ve Romatoloji Bilim

Dalı ve Multidisipliner Behçet Ünitesinde izlenen 65’i erkek, 42’si kadın 107 Behçet hastalığı olan birey çalışmaya alındı. Hastaların yaş ortalaması 35.0 ± 9.5 yıl (17-55 yıl), ortanca izlem süresi 60 ay (1-276 ay) idi. Yaş ortalaması 33.7 ± 8.8 yıl (18-55 yıl) olan 61’i erkek ve 41’i kadın toplam 102 sağlıklı birey ise kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edildi. Hastalar, Behçet Hastalığı için Uluslararası Çalışma Grubu kriterlerine göre tanı almıştı (32). Aktif infeksiyonu ve Behçet hastalığı dışında herhangi bir sistemik hastalığı bulunan olgular çalışma dışı bırakıldı. Çalışma, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulunun onayı ile gerçekleştirildi; hasta ve kontrol grubunu oluşturan bireylerden çalışmaya katılmayı kabul ettiklerine dair onay belgesi alındı.

Hasta grubunda tüm klinik bulgular ayrıntılı bir şekilde kaydedildi ve olgular hastalık aktivitesi ve şiddetine göre sınıflandırıldı. Çalışmaya alındığı sırada iki veya daha fazla klinik bulguya sahip hastalar aktif evrede, en az 1 aydır tekrarlayan oral ülser dışında hiçbir klinik bulgusu olmayan hastalar inaktif evrede kabul edildi. Hastalık şiddetine göre ise olgular hafif, orta ve şiddetli şeklinde sınıflandırıldı (33).

Hastalardan ve kontrol grubu bireylerden genetik çalışma ve serum TNF-α düzeyi tayini için sabah aç karnına kan örnekleri alındı. DNA izolasyonu için EDTA’lı tüpe alınan tam kan örnekleri ile serum TNF-α tayini için ayrılan serum örnekleri analiz yapılıncaya kadar –70°C’de saklandı.

TNF-αααα gen polimorfizmlerinin belirlenmesi Genetik çalışma için genomik DNA’nın saflaştırılması işlemi Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi

İmmünoloji Laboratuvarında, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifikasyon işlemi ve DNA dizi analizi ise METİS Biyoteknoloji AR-GE Laboratuvarında gerçekleştirildi.

Genomik DNA saflaştırılması DNA saflaştırma işlemi, QIAGEN firmasının DNA izolasyon kiti kullanılarak aşağıdaki şekilde

yapıldı (34): 1. 1.5 ml’lik tüpe 900 µl RBC Lysis Solüsyonu konuldu ve üzerine 300 µl tam kan ilave edildi.

Oda sıcaklığında 10 kez ters düz edilerek, 5 dakika inkübe edildi. 2. 14.000 rpm’de 20 saniye santrifüjden sonra tüpün dibinde beyaz pellet ile 10-20 µl rezidüel

sıvı kalacak şekilde supernatant atıldı. Pellet ile sıvının karışması için 10 saniye vortekslendi. 3. 300 µl Cell Lysis Solüsyonu eklenerek pipet ile karıştırıldı. 4. 100 µl Protein Precipitation Solüsyonu eklendi ve iyice karışması için yüksek hızda 10 saniye

vortekslendi. 5. 14.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildikten sonra DNA’yı içeren supernatant kısmı alındı ve

300 µl % 100’lük isopropanol’un üzerine ilave edildi. Yavaşça 50 kez ters düz edilerek karıştırıldı. Böylece DNA ipliksi yapıda görünür hale geldi.

6. 14.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildikten sonra supernatant dikkatlice döküldü ve tüpler kurutma kağıdı üzerinde kurutuldu.

7. DNA pelletini yıkamak için 300 µl % 70’lik etanol ilave edilip, birkaç kez ters çevrildi. 8. 14.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildikten sonra etanol dikkatlice döküldü. Tüpler kurutma

kağıdı üzerine ters çevrilerek kurutuldu. 9. 100 µl DNA Hydration Solüsyonu ilave edildi ve orta hızda 5 saniye vortekslendi. 10. 65°C’de 5 dakika inkübasyondan sonra, hazır hale gelen DNA analiz yapılıncaya kadar

-70°C’de saklandı. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) TNF-α geninin promoter bölgesinde guanin-adenin değişiminin olduğu −376, −308 ve −238

nükleotidlerindeki polimorfizmleri içine alan bölge, TNF-α gen bölgesine özgül primerler kullanılarak

PCR tekniğiyle amplifiye edildi. Herbiri 50 pmol/µl konsantrasyonunda 2 primer kullanılarak (forward, 5’-TGCCAACAACTGCCTTTA-3’; reverse, 5’-GAGTCTCCGGGTCAGAATGA-3’) (TıbMolbiol Syntheselabor; Almanya); 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2 içinde son konsantrasyonu 200 µM olacak şekilde dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 ünite Taq DNA Polimeraz ve 2.5 µl saflaştırılmış genomik DNA örneği eklenerek 50 µl toplam volümde polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımları “thermal cycler” içinde 94°C’de 30 saniye ve 56°C’de 1 dakika olacak şekilde 30 siklusta yapıldı. İlk siklusta denatürasyon 94°C’de 5 dakika ve son siklusta 68°C’de 7 dakika olarak tamamlandı. Amplifikasyon ürünleri daha sonra agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi (35).

Agaroz jel elektroforezi Agaroz istenilen yüzdede hazırlandı ve üzerine 1x TBE solüsyonu konuldu. Agaroz üzerine 2 µl

ethidyum bromide eklendi ve 5-6 kez karıştırılarak mikrodalga fırında pişirildi. Agar elektroforez tepsisine döküldükten sonra donması için 30-40 dakika beklendi. Amplifikasyon ürününden 10 µl, 5 µl orange G jel yükleme boyası ile karıştırılıp kuyucuklara yüklendi ve 45 dakika yürütüldü. Ultraviyole transuliminatör altında 671 bç büyüklüğüne denk gelen band aranarak analiz edildi. Sonuçlar, kırmızı filtre altında Polaroid film ile veya Image editor’de fotoğraflandı.

DNA dizi analizi Otomatik DNA analizatörü (Visible Genetics Inc., Kanada) kullanılarak −376, −308 ve −238

nükleotidlerindeki polimorfizmleri içine alan bölgenin dizi analizi yapıldı. 7-Deaza-dGTP Cy5/5.5 Dye Primer Cycle Sequencing Kit protokolü kullanılarak; 2.5 µl Cy 5.5 flöresan işaretli 3 µM konsantrasyona ayarlanmış primer (5’-CCTCACGACTCATCACAG-3’), 2.5 µl sequencing reaction buffer, dimetilsulfoxide, 4 µl sequencing Taq polimeraz ve 7 µl distile su eklenerek, toplam volüm 22 µl olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı. Karışımın 20 µl’si ayrıldıktan sonra üzerine 2 µl PCR ürünü eklendi. ddNTP’lerden (ddA, ddC, ddG, ddT) 3 µl alınarak 0.2 ml’lik PCR tüplerine dağıtıldı. Karışımın 5 µl’si herbir tüpe eklendi. Reaksiyon karışımları “thermal cycler” içinde 94°C’de 20 saniye, 58°C’de 30 dakika ve 72°C’de 1 dakika olacak şekilde 30 siklusta yapıldı. İlk siklusta denatürasyon 94°C’de 2 dakika ve son siklustan sonra 72°C’de 2 dakika olarak tamamlandı. Thermal cycler cihazı +4°C’ye geldiğinde, örneklerin üzerine formamide içeren stop solüsyondan 6 µl eklenip vortekslendi ve otomatik Dizi Analizatöründe kullanılıncaya kadar -20°C’de bekletildi. Dizi analizi yapılarak ürünler 94°C’de 2 dakika denatüre edildikten sonra +4°C’ye alınıp yükleme işlemi yapıldı (35).

Visible Genetics Otomatik DNA Dizi Analizatörü; Long-Read Tower sequencer, Geneobject software sistemi, microcell kasetleri, % 6’lık akrilamid karışımı, enjektör ve foto-polimerize akrilamid jel ünitelerini içermektedir. Akrilamid karışımı enjektör yardımıyla microcell kasete uygulandı ve UV ışık altında 3 dakika polimerize olması beklendi. Polimerize olduktan sonra Long-Read Tower sequencer içinde bulunan tampon odacık ünitesine yerleştirildi. İki dakika ön yürütme işleminden sonra, sekans ürünlerinden 1.8 µl alınarak jele yüklendi. 55°C’de 2000 voltta 110 dakika yürütme işlemini takiben, ham veriler Gen bankasından alınan (Accession no: Z15026) TNF-α gen bölgesi ile karşılaştırılarak −376, −308 ve −238 polimorfizmleri analiz edildi.

Serum TNF-αααα tayini Serum TNF-α konsantrasyonu, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji Laboratuvarında

R & S Systems firmasının “high sensitive” kitleri (Quantikine HS) kullanılarak sandwich enzyme immunoassay teknik ile ölçümlendi.

İstatistiksel analizler Grup ortalamalarının karşılaştırılmasında normal dağılım gösteren veriler için eşleştirmesiz

Student t-testi, normal dağılım göstermeyen veriler için Mann Whitney U testi; grup oranlarının karşılaştırılmasında ki-kare veya Fisher exact testleri kullanıldı. Korelasyon analizi, Pearson veya Spearman korelasyon katsayısı kullanılarak yapıldı. P<0.05, istatistiksel anlamlılık sınırı olarak kabul edildi.

IV. ANALİZ ve BULGULAR Hasta grubunun klinik özellikleri Hastaların 74’ü (% 69.2) mukokutanöz, 33’ü (% 30.8) vasküler Behçet olarak değerlendirildi.

Göz tutulumu ise toplam 42 hastada (% 39.3) saptandı. Hastalık şiddeti 41 olguda hafif (% 38.3), 36 olguda orta (% 33.6) ve 30 olguda şiddetli (% 28.0) olarak değerlendirildi. Çalışma yapıldığı sırada, hastalık 57 olguda aktif (% 53.3), 50 olguda ise inaktif (% 46.7) idi.

TNF-αααα gen polimorfizmleri Çalışma gruplarında TNF-α –308, –238 ve –376 gen polimorfizmlerine ilişkin genotip ve allel

sıklıkları sırasıyla Tablo I, II ve III’de görülmektedir. Hasta grubunda 21 bireyde (% 19.6), kontrol grubunda ise 16 bireyde (% 15.7) TNF-α –308 pozisyonunda heterozigot polimorfizm (–308 G/A genotipi) saptandı. TNF-α –238 G/A genotip sıklığı ise sırasıyla % 3.7 ve % 5.9 bulundu. Hasta grubunda hiçbir pozisyon için homozigot mutasyon gözlenmezken, kontrol grubunda sadece iki bireyde –308 A/A homozigot polimorfizm saptandı. Kontrol grubundan üç bireyde hem –238, hem de –376 pozisyonlarında bileşik heterozigot mutasyon vardı. Üç pozisyon için de, genotip ve allel sıklıkları bakımından hasta ve kontrol grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p>0.05).

TABLO I: TNF-α –308 genine ait genotip ve allel sıklıkları. Hasta Grubu Kontrol Grubu Genotip dağılımı –308 G/G 86 (% 80.4) 84 (% 82.4) –308 G/A 21 (% 19.6) 16 (% 15.7) –308 A/A 0 (% 0.0) 2 (% 2.0) Allel dağılımı –308G 193 (% 90.2) 184 (% 90.2) –308A 21 (% 9.8) 20 (%9.8)

TABLO II: TNF-α –238 genine ait genotip ve allel sıklıkları. Hasta Grubu Kontrol Grubu Genotip dağılımı –238 G/G 103 (% 96.3) 96 (% 94.1) –238 G/A 4 (% 3.7) 6 (% 5.9) –238 A/A 0 (% 0.0) 0 (% 0.0) Allel dağılımı –238G 210 (% 98.1) 198 (% 97.1) –238A 4 (% 1.9) 6 (% 2.9)

TABLO III: TNF-α –376 genine ait genotip ve allel sıklıkları. Hasta Grubu Kontrol Grubu Genotip dağılımı –376 G/G 106 (% 99.1) 99 (% 97.1) –376 G/A 1 (% 0.9) 3 (% 2.9) –376 A/A 0 (% 0.0) 0 (% 0.0) Allel dağılımı –376G 213 (% 99.5) 201 (% 98.5) –376A 1 (% 0.5) 3 (% 1.5)

TNF-αααα gen polimorfizmleri ile klinik parametrelerin ilişkisi Şiddetli klinik hastalığa sahip Behçet hastalarında TNF-α –308 G/A genotip sıklığı (% 10.0),

orta (% 19.4) ve hafif (% 26.8) olgulardan düşük olmakla beraber, aradaki farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (p>0.05). Behçet hastalarında TNF-α –308 gen polimorfizmi ile klinik bulgular arasındaki ilişkiler Tablo IV’de verilmiştir. Görüldüğü gibi, –308 G/A genotip varlığı herhangi bir klinik tutuluma eğilim yaratmamaktadır (p>0.05).

TABLO IV: Klinik bulgulara göre –308 G/A genotip sıklığı.

Klinik Bulgu Toplam Sayı –308 G/A Pozitifliği P Değeri Sayı % Genital ülser > 0.05 Pozitif 100 21 21.0 Negatif 7 0 0.0 Papülopüstüler erupsiyon > 0.05 Pozitif 73 16 21.9 Negatif 34 5 14.7 Eritema nodozum > 0.05 Pozitif 60 11 18.3 Negatif 47 10 21.3 Paterji testi > 0.05 Pozitif 54 12 22.2 Negatif 36 7 19.4 Göz tutulumu > 0.05 Pozitif 42 5 11.9 Negatif 65 16 24.6 Artrit > 0.05 Pozitif 33 7 21.2 Negatif 74 14 18.9 Tromboflebit > 0.05 Pozitif 26 7 26.9 Negatif 81 14 17.3 Derin ven trombozu > 0.05 Pozitif 24 5 20.8 Negatif 83 16 19.3 Vena cava trombozu > 0.05 Pozitif 7 0 0.0 Negatif 100 21 21.0 Arter tutulumu > 0.05 Pozitif 9 1 11.1 Negatif 98 20 20.4 Nörolojik tutulum > 0.05 Pozitif 7 1 14.3 Negatif 100 20 20.0

TNF-α –238 G/A genotip sıklığının hastalık şiddetine göre dağılımı değerlendirildiğinde,

şiddetli olgularda –238 G/A genotip sıklığı (% 6.7), hafif (% 2.4) ve orta şiddetteki olgulardan (% 2.9) yüksek olmakla beraber, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildir (p>0.05). TNF-α –238 gen polimorfizmi ile hastaların klinik bulguları arasındaki ilişki Tablo V’de verilmiştir. Genelde, çeşitli

tiplerde vasküler tutulum bulunan olgularda –238 G/A genotip sıklığı daha yüksek idi, bu yükseklik tromboflebit için istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). TABLO V: Klinik bulgulara göre –238 G/A genotip sıklığı.

Klinik Bulgu Toplam Sayı –238 G/A Pozitifliği P Değeri Sayı % Genital ülser > 0.05 Pozitif 100 4 4.0 Negatif 7 0 0.0 Papülopüstüler erupsiyon > 0.05 Pozitif 73 4 5.5 Negatif 34 0 0.0 Eritema nodozum > 0.05 Pozitif 60 2 3.3 Negatif 47 2 4.3 Paterji testi > 0.05 Pozitif 54 1 1.9 Negatif 36 2 5.6 Göz tutulumu > 0.05 Pozitif 42 1 2.4 Negatif 65 3 4.6 Artrit > 0.05 Pozitif 33 0 0.0 Negatif 74 4 4.2 Tromboflebit < 0.05 Pozitif 26 3 11.5 Negatif 81 1 1.2 Derin ven trombozu > 0.05 Pozitif 24 2 8.3 Negatif 83 2 2.4 Vena cava trombozu > 0.05 Pozitif 7 1 14.3 Negatif 100 3 3.0 Arter tutulumu > 0.05 Pozitif 9 1 11.1 Negatif 98 3 3.1 Nörolojik tutulum > 0.05 Pozitif 7 0 0.0 Negatif 100 4 4.0

Mukokutanöz ve vasküler tutulumlu olgular arasında TNF-α –308 G/A genotip sıklığı

bakımından anlamlı fark saptanmadı (% 18.9 ve % 21.2, p>0.05). Vasküler Behçetli olgularda –238 G/A genotip sıklığı mukokutanöz tutulumlu olgulardan daha yüksek olmakla beraber (% 9.1 ve % 1.4), aradaki fark istatistiksel olarak anlamlılık sınırına ulaşmıyordu (p=0.08).

Serum TNF-αααα konsantrasyonu Çalışma gruplarında serum TNF-α konsantrasyonları Şekil 1’de görülmektedir. Hasta

grubundaki ortalama düzey (3.10 ± 1.45 pg/ml), kontrol grubundan (2.43 ± 1.94 pg/ml) anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0.01).

KontrolHasta

Serum TNF-alfa (pg/ml)

8

6

4

2

0

ŞEKİL 1: Hasta ve kontrol gruplarında serum TNF-α düzeyi. Gerek kontrol, gerekse hasta gruplarında erkek ve kadın bireyler arasında serum TNF-α

konsantrasyonu bakımından anlamlı farklılık saptanmadı (p>0.05). Kontrol grubunda TNF-α düzeyi ile yaş arasında anlamlı negatif korelasyon mevcutken (r=-0.301, p<0.01), hasta grubunda benzer bir ilişki gözlenmedi (r=-0.015, p>0.05). Yine, Behçet hastalarında serum TNF-α düzeyi ile hastalık süresi arasında ilişki tespit edilmedi (r=0.047, p>0.05).

Serum TNF-αααα konsantrasyonu ile gen polimorfizmlerinin ilişkisi Kontrol ve hasta gruplarında farklı TNF-α genotiplerinde serum TNF-α düzeyleri Tablo VI’da

görülmektedir. Kontrol grubunda –308, –238 ve –376 G/A genotipini taşıyan olgularda serum TNF-α düzeyi G/G genotipli olgulardan daha yüksek olmakla beraber, aradaki farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (p>0.05). Hasta grubunda ise –238 G/A genotipli olgulardaki yüksek serum TNF-α düzeyi, olgu sayısının az olması nedeniyle anlamlı bulunmadı (p>0.05).

TABLO VI: Çalışma gruplarında farklı TNF-α genotiplerinde serum TNF-α düzeyleri (pg/ml). Kontrol Grubu Hasta Grubu G/A G/G P G/A G/G P –308 2.85 ± 2.12 2.33 ± 1.90 > 0.05 2.84 ± 1.02 3.16 ± 1.54 > 0.05 –238 3.16 ± 3.85 2.38 ± 1.78 > 0.05 4.80 ± 3.48 3.03 ± 1.31 > 0.05 –376 4.47 ± 5.64 2.27 ± 1.68 > 0.05 0.6 3.12 ± 1.44 Serum TNF-αααα düzeyi ile klinik özelliklerin ilişkisi Hastalık şiddetine göre yapılan analizde TNF-α düzeyi bakımından hafif (3.13 ± 1.55 pg/ml),

orta (3.21 ± 1.70 pg/ml) ve şiddetli (2.92 ± 0.91 pg/ml) olgular arasında anlamlı fark saptanmadı (p>0.05). Benzer şekilde, aktif ve inaktif olgular arasında da serum TNF-α düzeyi benzer bulundu (3.09 ± 1.37 ve 3.11 ± 0.55 pg/ml, p>0.05). Mukokutanöz ve vasküler tutulumlu olgular arasında serum TNF-α düzeyi bakımından anlamlı fark mevcut değildi (p>0.05). Tablo VII’de görüldüğü gibi, Behçet hastalarında serum TNF-α düzeyi herhangi bir klinik bulgunun varlığı ile ilişkili bulunmadı (p>0.05).

TABLO VII: Hasta grubunda klinik bulgulara göre serum TNF-α düzeyi (pg/ml). VAR YOK P Değeri Genital ülser 3.10 ± 1.47 3.11 ± 1.23 > 0.05 Papülopüstüler erupsiyon 3.24 ± 1.58 2.80 ± 1.07 > 0.05 Eritema nodozum 3.11 ± 1.35 3.08 ± 1.58 > 0.05 Paterji pozitifliği 3.19 ± 1.34 3.02 ± 1.82 > 0.05 Göz tutulumu 3.15 ± 1.17 3.06 ± 1.62 > 0.05 Artrit 2.78 ± 0.97 3.14 ± 1.50 > 0.05 Tromboflebit 3.15 ± 1.64 3.08 ± 1.40 > 0.05 Derin ven trombozu 3.26 ± 1.68 3.05 ± 1.39 > 0.05 Vena cava trombozu 2.94 ± 0.91 3.11 ± 1.48 > 0.05 Arter tutulumu 3.21 ± 0.70 3.09 ± 1.50 > 0.05 Nörolojik tutulum 2.90 ± 1.17 3.06 ± 1.62 > 0.05

V. SONUÇ ve ÖNERİLER Yoğun araştırmalara rağmen Behçet hastalığının etyopatogenezi çok bilinmeyenli bir denklem

olmaya devam etmektedir. Etyopatogenezin tam olarak bilinmemesi, hastalığa yönelik spesifik tedavi yaklaşımlarının uygulanmasını engellemekte ve bu da kronik seyre ve kötü prognoza katkıda bulunmaktadır.

Önceki çalışmalarda TNF-α gen polimorfizminin sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit, ankilozan spondilit ve psöriazis gibi HLA ile ilişkili hastalıkların patogenezinde rolü olduğunun gösterilmesine (35-41) ve mevcut verilerin bunun Behçet hastalığı için de geçerli olabileceğini düşündürmesine rağmen, çalışmamızda TNF-α geninin –308, –238 ve –376 pozisyonlarındaki polimorfizmlerin hastalığın gelişimi ve kliniği üzerine anlamlı bir etkisini saptanmadı. Keza, serum TNF-α düzeyi de, Behçet hastalıklı bireylerde sağlıklı kontrollerden yüksek saptanmasına rağmen, hastalığın kliniği ve TNF-α gen polimorfizmleri ile ilişkili bulunmadı. Ancak, bu konuda kesin yargılara varabilmek için değişik toplumlarda yapılacak değişik hastalık şiddetine sahip olguyu kapsayan geniş serili ve hücresel düzeyde TNF-α gen transkripsiyonu ve sentezinin de değerlendirildiği araştırmaların sonuçlarını beklemek gerekecektir.

VI. KAYNAKLAR

1. O’Duffy JD. Behçet’s disease. Curr Opin Rheumatol 6: 39-43, 1994. 2. Yazıcı H, Yurdakul S, Hamuryudan V. Behçet’s syndrome. In: Rheumatology: Klippel JH, Dieppe

PA (eds). Second edition, Mosby, Barcelona, 1998, pp 26.1-26.6 3. Kaklamani VG, Vaiopoulos G, Kaklamanis PG. Behçet’s disease. Semin Arthritis Rheum 27: 197-

217, 1998. 4. Sakane T, Takeno M, Suzuki N, Inaba G. Behçet’s disease. N Engl J Med 341: 1284-1291, 1999. 5. Kontogiannis V, Powell RJ. Behçet’s disease. Postgrad Med J 76: 629-637, 2000. 6. Aydıntuğ AO. Vascular manifestations in Behçet’s disease. In: Vascular Manifestations of

Systemic Autoimmune Diseases: Asherson RA, Cervera R (eds). CRC Press, Boca Raton, 2001, pp 361-373.

7. Lehner T. Immunopathogenesis of Behçet’s disease. Ann Med Interne 150: 483-487, 1999. 8. Gül A. Behçet’s disease: An update on the pathogenesis. Clin Exp Rheumatol 19 (Suppl 24): S6-

S12, 2001. 9. Direskeneli H. Behçet’s disease: infectious aetiology, new autoantigens, and HLA-B51. Ann

Rheum Dis 60: 996-1002, 2001. 10. Takeno M, Kariyone A, Yamashita N, Takiguchi M, Mizushima Y, Kaneoka H, Sakane T.

Excessive function of peripheral blood neutrophils from patients with Behçet’s disease and from HLA-B51 transgenic mice. Arthritis Rheum 38: 426-433, 1995.

11. Mege JL, Dilsen N, Sanguedolce V, Gül A, Bongrand P, Roux H, Öcal L, İnanç M, Capo C.

Overproduction of monocyte derived tumor necrosis factor α, interleukin (IL) 6, IL-8 and increased neutrophil superoxide generation in Behçet’s disease. A comparative study with familial Mediterranean fever and healthy subjects. J Rheumatol 20: 1544-1549, 1993.

12. Gül A, Esin S, Dilsen N, Koniçe M, Wigzell H, Biberfeld P. Immunohistology of skin pathergy

reaction in Behçet’s disease. Br J Dermatol 132: 901-907, 1995. 13. Esin S, Gül A, Hodara V, Jeddi-Tehrani M, Dilsen N, Koniçe M, Andersson R, Wigzell H.

Peripheral blood T cell expansions in patients with Behçet’s disease. Clin Exp Immunol 107: 520-527, 1997.

14. Yamashita N, Kaneoka H, Kaneko S, Takeno M, Oneda K, Koizumi H, Kogure M, Inaba G,

Sakane. Role of γδ T lymphocytes in the development of Behçet’s disease. Clin Exp Immunol 107: 241-247, 1997.

15. Kaneko S, Suzuki N, Yamashita N, Nagafuchi H, Nakajima T, Wakisaka S, Yamamoto S, Sakane

T. Characterization of T cells specific for an epitope of human 60-kD heat shock protein (hsp) in patients with Behçet’s disease (BD) in Japan. Clin Exp Immunol 108: 204-212, 1997.

16. Frassanito MA, Dammacco R, Cafforio P, Dammacco F. Th1 polarization of the immune response

in Behçet’s disease: a putative pathogenetic role of interleukin-12. Arthritis Rheum 42: 1967-1974, 1999.

17. Balkwill FR. Tumour necrosis factor. Br Med Bull 45: 389-400, 1989.

18. Beutler B. TNF, immunity and inflammatory disease: lessons of the past decade. J Invest Med 43: 227-235, 1995.

19. Akoğlu TF, Direskeneli H, Yazıcı H, Lawrence R. TNF, soluble IL-2R and soluble CD-8 in

Behçet’s disease. J Rheumatol 17: 1107-1108, 1990. 20. Hamzaoui K, Hamza M, Ayed K: Production of TNF-alpha and IL-1 in active Behçet’s disease. J

Rheumatol 17: 1428-1429, 1990. 21. Sayınalp N, Özcebe OI, Özdemir O, Haznedaroğlu İC, Dündar S, Kirazlı S. Cytokines in Behçet’s

disease. J Rheumatol 23: 321-322, 1996. 22. Verity DH, Marr JE, Ohno S, Wallace GR, Stanford MR. Behçet’s disease, the silk road and HLA-

B51: historical and geographical perspectives. Tissue Antigens 54: 213-220, 1999. 23. Gül A, İnanç M, Öcal L, Aral O, Koniçe M. Familial aggregation of Behçet’s disease in Turkey.

Ann Rheum Dis 59: 622-625, 2000. 24. Koné-Paut I, Geisler I, Wechsler B, Özen S, Özdoğan H, Rozenbaum M, Touitou I. Familial

aggregation in Behçet’s disease: High frequency in siblings and parents of pediatric probands. J Pediatr 135: 89-93, 1999.

25. Yazıcı H, Akokan G, Yalçın B, Müftüoğlu A. The high prevalence of HLA-B5 in Behçet’s disease.

Clin Exp Immunol 30: 259-261, 1977. 26. Ohno S, Ohguchi M, Hirose S, Matsuda H, Wakisaka A, Aizawa H. Close association of HLA-

Bw51 with Behçet disease. Arch Ophthalmol 100: 1455-1458, 1982. 27. Mizuki N, Ohno S, Sato T, Ishihara M, Miyata S, Nakamura S, Naruse T, Mizuki H, Tsuji K, Inoko

H. Microsatellite polymorphism between the tumor necrosis factor and HLA-B genes in Behçet’s disease. Hum Immunol 43: 129-135, 1995.

28. Mizuki N, Inoko H, Sugimura K, Nishimura K, Nakamura S, Tanaka H, Mizuki N, Mizuki H, Inaba

G, Tsuji K, Ohno S. RFLP analysis in the TNF-β gene and the susceptibility to alloreactive NK cells in Behçet’s disease. Invest Ophthalmol Vis Sci 33: 3084-3090, 1992.

29. Yamakawa Y, Sugita Y, Takahashi Y, Yamakawa T, Tanaka S, Nakamura S, Fukushima J,

Kawamoto S, Ohno S, Okuda K, Nakajima H. Gene expression of tumour necrosis factor-α (TNF-α) and heat-shock protein (HSP) 70 in patients with Behçet’s disease. Arch Dermatol Res 285: 505-508, 1993.

30. Verity DH, Wallace GR, Vaughan RW, Kondeatis E, Madanat W, Zureikat H, Fayyad F, Marr JE,

Kanawati CA, Stanford MR. HLA and tumour necrosis factor (TNF) polymorphisms in ocular Behçet’s disease. Tissue Antigens 54: 264-272, 1999.

31. Öz D, Karslı F, Atalay A, Şahin Ş. TNF-alpha gene polymorphisms in Behçet’s disease. In:

Behçet’s Disease, Proceedings of the 9th International Conference on Behçet’s Disease: Bang D, Lee ES, Lee S (eds). Design Mecca Publishing Co., Seoul, 2000, pp 161-165.

32. International Study Group for Behçet’s Disease. Criteria for diagnosis of Behçet’s disease. Lancet

335: 1078-1080, 1990. 33. Krause I, Rosen Y, Kaplan I, Milo G, Guedj D, Molad Y, Weinberger A. Recurrent aphthous

stomatitis in Behçet’s disease: clinical features and correlation with systemic disease expression and severity. J Oral Pathol Med 28: 193-196, 1999.

34. Miller SA, Dykes DD, Polesky HT. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acids Res 16: 1215, 1988.

35. Brinkman BMN, Huizinga TWJ, Kurban SS, Van Der Velde EA, Schreuder GMT, Hazes JMW,

Breedveld FC, Verweij CL. Tumour necrosis factor α gene polymorphisms in rheumatoid arthritis: Association with susceptibility to, or severity of, disease? Br J Rheumatol 36: 516-521, 1997.

36. Sullivan KE, Wooten C, Schmeckpeper BJ, Goldman D, Petri MA. A promoter polymorphism of

tumor necrosis factor α associated with systemic lupus erythematosus in African-Americans. Arthritis Rheum 40: 2207-2211, 1997.

37. Rood MJ, van Krugten MV, Zanelli E, van der Linden MW, Keijsers V, Schreuder GMT, Verduyn

W, Westendorp RGJ, de Vries RRP, Breedveld FC, Verweij CL, Huizinga TWJ. TNF-308A and HLA-DR3 alleles contribute independently to susceptibility to systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 43: 129-134, 2000.

38. Vinasco J, Beraun Y, Nieto A, Fraile A. Polymorphism at the TNF loci in rheumatoid arthritis.

Tissue Antigens 49: 74-78, 1997. 39. Kaijzel EL, Brinkman BMN, van Krugten MV, Smith L, Huizinga TWJ, Verjans GM, Breedveld

FC, Verweij CL. Polymorphism within the tumor necrosis factor α (TNF) promoter region in patients with ankylosing spondylitis. Human Immunol 60: 140-144, 1999.

40. Höhler T, Schaper T, Schneider PM, zum Büschenfelde KM, Marker-Hermann E. Association of

different tumor necrosis factor α promoter alleles frequencies with ankylosing spondylitis in HLA-B27 positive individuals. Arthritis Rheum 41: 1489-1492, 1998.

41. Höhler T, Kruger A, Schneider PM, Schopf RE, Knop J, Rittner C, zum Büschenfelde KHM,

Märker-Hermann E. A TNF-α promoter polymorphism is associated with juvenile onset psoriasis and psoriatic arthritis. J Invest Dermatol 109: 562-565, 1997.

VII. EKLER

a) Mali Bilanço

Kit Miktar Birim Fiyat Toplam Fiyat 1. TNF-alfa Cytimmune Sci 2 kutu 600 USD 1200 USD 2. TNF-α geni Cy.5 ve Cy5.5 dye primer Cycle sequencing kiti, 100 rxn 2 kutu 2200 USD 4400 USD 3. Cy.5 ve Cy5.5 dye terminator Cycle 4 kutu 650 USD 2600 USD sequencing kiti, 50 rxn 4. DNA sekans analizi hizmet bedeli 200 test 5 USD 1000 USD b) Makine ve Teçhizatın Durumu YOK c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar İlave teknik ayrıntı yok d) Sunumlar

1. Aşkın Ateş, Gülay Kınıklı, Nurşen Düzgün, Murat Duman. Behçet hastalığında tümör nekrozis faktör-alfa gen polimorfizmlerinin hastalığın oluşum riski ve klinik özellikleri ile ilişkisi. Ulusal Romatoloji Kongresi 2002, 01-04 Ekim 2002, Adana, Türkiye.

2. Aşkın Ateş, Gülay Kınıklı. Lack of association of tumour necrosis factor-alpha polimorphisms with disease susceptibility and severity in Behçet’s disease. Annual European Congress of Rheumatology EULAR 2003, 18-21 June 2003, Lisbon, Portugal.

e) Yayınlar ve Tezler Aşkın Ateş. Behçet hastalığında tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α) gen polimorizmlerinin

hastalığın gelişim riski ve kliniği üzerine etkisi. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik İmmünoloji ve Romatoloji Bilim Dalı Uzmanlık Tezi, Ankara, 2002.