ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …Bu sonuçlara göre L-12 likenaz enzimi,...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ Fatma GÖZÜKARA TERMOFİL Bacillus sp. BAKTERİSİNDEN LICHENAZ (β-1,3 VE 1,4 GLUCANASE) ENZİMİ ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK KULLANILABİRLİĞİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009


TERMOFİL Bacillus sp. BAKTERİSİNDEN LICHENAZ (β-1,3 VE 1,4 GLUCANASE) ENZİMİ ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK

KULLANILABİLİRLİĞİ

Fatma GÖZÜKARA

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu Tez 06 / 08 / 2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir.

İmza............………...

Prof. Dr. Burhan ARIKAN

DANIŞMAN

İmza............………...

Prof.Dr. Mustafa CANLI

ÜYE

İmza............………...

Doç.Dr. Hatice KORKMAZ

GÜVENMEZ

ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ

Enstitü Müdürü İmza ve Mühür

Bu Çalışma Ç. Ü. Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2008YL27

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

TERMOFİL Bacillus sp. BAKTERİSİNDEN LICHENAZ (β-1,3 VE 1,4 GLUCANASE) ENZİMİ ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE

BİYOTEKNOLOJİK KULLANILABİRLİĞİ

Fatma GÖZÜKARA


BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman : Prof.Dr. Burhan ARIKAN Yıl : 2009, Sayfa : 91 Jüri : Prof.Dr. Burhan ARIKAN

Prof.Dr. Mustafa CANLI Doç.Dr. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ

Bu çalışmada, değişik ortamlardan izole edilen termofil Bacillus sp. suşlarından likenaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin farklı sıcaklık ve pH değerlerinde katı besiyerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri araştırılmıştır. İzole edilen enzimin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.

Bacillus sp. L-12 suşundan üretilen likenazın nativ-PAGE analizinde 100.74 ve 54.4 kDa moleküler ağırlıklarına sahip iki band elde edilmiştir. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 100ºC bulunmuştur. Enzim 30-110 ºC aralığında ortalama %66.5 aktivitesini korumuştur. Enzim, optimum aktivitesini pH 6.0’da gösterirken, 24 saat süreyle 55 ºC de pH 3.0-6.0 aralığında ortalama %88 stabilite göstermiştir. L-12 enzimi %7.5 NaCl konsantrasyonunda %67’lik optimum aktivite göstermiştir. Enzim aktivitesi 5 mM EDTA (%97), 5 mM CaCl2 (%95), 3 mM PMSF (%56), %1 v/v triton X-100 (%101), %1 w/v SDS (%38) ve 5mM ZnCl2 ile (%36) korunmuştur.

Bu sonuçlara göre L-12 likenaz enzimi, hipertermofil, termostabil, asidik ve asidostabil, halotolerant, surfaktanlardan etkilenmeyen ve kükürtlü amino asitlerce zengin enzim özelliği göstermektedir.

Enzim optimum aktivitesini asidik pH da gösteren termostabil ve asidik pH stabil özellikte olduğu için, özellikle tavuk yemi hazırlama alanında öncelikle kullanılabilecek özelliktedir.

Anahtar Kelimeler: Bacillus, likenaz, termofil, asidostabil, halotolerant

II

ABSTRACT

M.Sc. THESIS

ISOLATION OF THERMOPILIC Bacillus sp., PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF

BIOTECHNOLOGICAL APPLICATION OF LICHENASE (β-1,3 AND 1,4 GLUCANASE)

Fatma GÖZÜKARA

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor : Prof.Dr. Burhan ARIKAN

Year : 2009, Page : 91 Jury : Prof.Dr. Burhan ARIKAN

Prof.Dr. Mustafa CANLI Assoc.Prof.Dr. Hatice KORMAZ GÜVENMEZ

In this study, the lichenase enzymes from Bacillus sp. strains isolated from different environments were produced and characterized. For this purpose, different temperatures and pH values of bacteria in solid plate and enzymes to produce reproductive capabilities were investigated. Characterization of the enzyme has been isolated.

Molecular weight of the lichenase from Bacillus sp. LB-12 was estimated as 100.74 and 54.4 kDa on native-PAGE. The temperature of the enzyme shows optimum activity was found 100 ºC. The enzyme was retained it`s activity around %66.5 at the end of 24 hours between 30-110 ºC. The optimum activity was obtained at pH 6.0 the enzyme also presented the enzyme was 88% stable at 55 ºC between pH 3.0-6.0 for 24 hours. The optimum activity of L-12 lichenase has shown 67'lik% in the 7.5% NaCl concentration. The activity of enzyme was protected by 5 mM EDTA (%97), 5 mM CaCl2 (%95), 3 mM PMSF (%56), %1 v/v triton X-100 (%101), %1 w/v SDS (%38) and 5mM ZnCl2 ile (%36).

According to these result, L-12 lichenase is hiperthermophile, thermostable, acidic and asidostable, halotolerant, sulfur-rich amino acids and not affected by surfactants.

For the optimum activity of enzyme is indicating that acidic pH stable and acidic pH thermostable are stable properties, preparation of chicken feed, especially in the first available properties.

Key Words: Bacillus, lichenase, thermostable, acidostable, halotolerant

III

TEŞEKKÜR

Çalışmalarım sırasında ve tez konumun belirlenmesinde bana yardımcı olan

danışman hocam Sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN’a teşekkür ederim.

Çalışmalarım sırasında ve tezimin çalışmalarında bana yardım eden İnci Suna

HÜRTAŞ’a teşekkür ederim.

Çalışmalarım sırasında, iş hayatımda ve manevi hayatta desteğini ve

yardımını esirgemeyen Sayın Uzm. Dr. Hilal ONAÇ’a teşekkür ederim.

Tez aşamasında iyi günde, kötü günde her zaman benim yanımda olan ve

tezimin yazımındaki katkılarından dolayı Murat TAPANYİĞİT ve Mehmet

COŞKUN’a teşekkür ederim.

Her zaman yanımda olan ve benden maddi manevi desteklerini esirgemeyen

değerli aileme özellikle annem Hülya GÖZÜKARA’ya ne kadar teşekkür etsem

azdır.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ ……………………………………………………..……………………..……………..I

ABSTRACT …………………………………………………………………….....………II

TEŞEKKÜR ……………………………………….……………….…………………….III

İÇİNDEKİLER ………………………………….…………………................................IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ……………………………………………..….........................VII

ŞEKİLLER DİZİNİ ………...……………………………………………………....…VIII

SİMGE VE KISALTMALAR ………….…………………………….........................….X

1.GİRİŞ ………………………...…..…………..……………………………………......…1

1.1. Proteazlar .…………………………………………………………..………….5

1.2. Ksilanazlar ………………..………………………………….………...........…6

1.3. Amilazlar ………...……………………………………...…..…………………6

1.4. Selülaz (Glukanaz) ………………………….…………………………………7

1.4.1. Glukanaz’ların Uygulama Alanları …………………………………..9

1.4.1.1. Gıda Endüstrisinde Glukanazlar ………………………….10

1.4.1.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar …………….......10

1.4.1.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Glukanazlar ……………..….11

1.4.1.4. Tekstil Endüstrisinde Glukanazlar ………………………..11

1.4.2. β-(1,3)-(1,4)- Glukanaz (Likenaz)’ların Uygulama Alanları …….…11

1.5. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremezimler) ………………………………...…12

1.6. Elektroforez Uygulamaları …………………………………………...…...…13

1.6.1. Jel Elektroforezleri ………………………………………………….14

1.6.2. Doğal (Native) Jel Elektroforezi ……………………………………17

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ………………………………………………………..…..18

3. MATERYAL VE METOD …………………………………………………….….…22

3.1. Materyal ……………………………………………………………………....22

3.1.1. Kullanılan Çözeltiler ……………………………………….……….22

3.1.1.1. NaOH Çözeltisi ………………………………………..….22

3.1.1.2. Etanol …………………………………………………..…22

V

3.1.1.3. Kongo Kırmızısı (%0.1) …………………………………..22

3.1.1.4. NaCl Çözeltisi (1M) ………………………………………22

3.1.1.5. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M) ………………………...23

3.1.1.6. Sitrat Tamponu ……………………………………………23

3.1.1.7. Sodyum-Fosfat Tamponu …………………………………23

3.1.1.8. Glisin-NaOH Tamponu …………………………….......…24

3.1.1.9. DNS (Dinitro Salisilik Asit) ………………………...…....24

3.1.2. Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri ………25

3.1.2.1. LB Agar …………………………………………….…….25

3.1.2.2. Likenanlı Besiyeri ………………………………...………25

3.1.2.3. Likenaz Enzimi Üretimi Besiyeri ………………………...26

3.1.3. Elektroforez İşleminde Kullanılan Çözeltiler ………………………26

3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu) ………………………26

3.1.3.2. Solüsyon B (4X) ………………………………………….26

3.1.3.3. Solüsyon C (4X) ………………………………………….27

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) %10 ……………………….27

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu ……………………………………27

3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X) …………………………..27

3.1.3.7. Jel Boyama (Staining) Solüsyonu ………………………..28

3.1.3.8. Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu ……….28

3.2. Metod …………………………………………………………………………29

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi ………………………………………29

3.2.1.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ………………………..29

3.2.2. Bakterilerin İdentifikasyonu ………………………………….…….29

3.2.3. Katı Besiyerinde Likenaz Aktivitesinin Saptanması ……….………29

3.2.4. Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği pH

Aralığının Saptanması ……......……………………………….........30

3.2.5. Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Sıcaklık ve

pH Aralığının Saptanması ..……………………………………..…30

3.2.6. Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma ……………………….………30

VI

3.2.7. Enzimin pH Optimumunun Saptanması …………………………....31

3.2.8. Enzimin Optimum Sıcaklık Aktivitesinin Saptanması …………..…32

3.2.9. Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin Saptanması ……………………..…32

3.2.10. Likenaz Enziminin pH Stabilitesinin Saptanması ………………...33

3.2.11. NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi ……..33

3.2.12. Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal

İyonlarının Etkisi ………………………………………….......…..34

3.2.13. Nativ (Doğal) Jel Elektroforezinde Moleküler Ağırlık ve

Zimogram Analizi ….………………………………………..…….34

3.2.13.1. Nativ Jel Sisteminin Hazırlanması ……………………....34

3.2.13.2. Ayırıcı Jel’in Hazırlanması (%10’luk) …………………..34

3.2.13.3. Dengeleme Jel’inin Hazırlanması ……………………….35

3.2.13.4. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi …35

3.2.13.5. Nativ (Doğal) Jelinin Boyanması ve Zimogram

Analizi ….……………………………………………….36

4. BULGULAR VE TARTIŞMA ………….………………………..…………….……37

4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu …………………………...………………37

4.2. L-12 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları ……..... 38

4.3. Enziminin Optimum pH Aralığına Ait Bulgular ……………………..………52

4.4. L–12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerine Ait Sonuçlar ….…...………………………………………………..54

4.5. L-12 Likenaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar ……...………………57

4.6. L–12 Likenaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar ……….59

4.7. L-12 Likenaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün

Etkisine Ait Sonuçlar ……….…………….……………..……………………63

4.8. L-12 Likenaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal

İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar …………….…………………………........64

4.9. L-12 Likenaz Enziminin Native-PAGE ve Zimogram Analizi …………........66

5. SONUÇ VE ÖNERİLER ….…………………………………………….………...…69

KAYNAKLAR ……...…………………………………………………..…….….........…81

ÖZGEÇMİŞ …….………………......................................................................................91

VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 4.1. 20°C ve Farklı pH Değerlerindeki İnkübe Edilen Bacillus sp.

Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi ……..…....38


Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi ..………....40


Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi …..……....42


Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi …..……....43


Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi ………......45

Çizelge 4.6. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH

Değerine Ait Bulgular ...…………………….……..…………....52

Çizelge 4.7 L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerine Ait Bulgular …….…..…...….……….………………..54

Çizelge 4.8. L-12 Likenaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları ….………....57

Çizelge 4.9. L-12 Likenaz Enzimine Ait Termal Stabilite Sonuçları ………...60

Çizelge 4.10. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının L-12 Likenaz Enzimin

Aktivitesine Etkisi …………………………….………………...62

Çizelge 4.11. L-12 Likenaz Enzimi Üzerine Şelatör, Metal İyonları,

Deterjanlar ve İnhibitörlerin Etkisi ..….…………….…………...64

VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil 4.1.

L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 20°C, pH 5.0, 6.0,

7.0 ve 8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm .…....…47

Şekil 4.2. L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 20°C, pH 9.0 ve 10.0 da

gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ...…………….……....47

Şekil 4.3. L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 30°C, pH 5.0, 6.0,

7.0 ve 8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ……......48


gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ………………….…...48

Şekil 4.5. L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 40°C, pH 5.0, 6.0, 7.0 ve

8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ………..……...49


gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ………………………49


8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ………….……50




8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm ……………….51



Şekil 4.11. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH

Değerine Ait Sonuçlar …..……………………………………....53

Şekil 4.12. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık

Değerine Ait Sonuçlar …………………….………….………....55

Şekil 4.13. L-12 Likenaz Enziminin pH Stabilite Grafiği ..………………...58

Şekil 4.14. L–12 Likenaz Enziminin Termal Stabilite Grafiği ……………..61

IX

Şekil 4.15. L-12 Likenaz Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı NaCl

Konsantrasyonlarının Etkisi …..………………………………...63

Şekil 4.16. L12 Likenaz Enzimine Metal İyonu, Şelatör, İnhibitör ve

Deterjanların Etkisi …………….……………………………….66

Şekil 4.17. L-12 Likenaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zimogram

Analizi ..………………………………………………….……...68

X

SİMGELER VE KISALTMALAR

AMPS : Amonyum persülfat DNS : Dinitrosalisilikasit EDTA : Etilendiaminotetraasetik asit L : Litre LB : Luria Bertani M : Molar mL : Mililitre mM : Milimolar mg : Miligram µg : Mikrogram µL : Mikrolitre SDS : Sodyum dodesil Sülfat α : Alfa β : Beta rpm : dakikada devir sayısı Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol TEMED : N,N,N,N-Tetrametil etilendiamin TAE :Tris-Asetik Asit-Edta

1. GİRİŞ Fatma GÖZÜKARA

1

1.GİRİŞ

Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler

biyolojik yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler

biyoteknoloji şeklinde transformasyona uğrayan ve çağımıza damgasını vuran bir

alandır.

Dünyada, 1980-1983 yılları arasında sadece 300 küçük biyoteknoloji şirketi

çalışma gerçekleştirirken, bu sayı 1985 yılında sadece Amerika Birleşik

Devletlerinde (A.B.D) 400 düzeyine ulaşmıştır. Günümüzde A.B.D de 900, bütün

dünyada ise yaklaşık 1200 biyoteknoloji şirketi çalışmalarını çeşitli alanlarda

sürdürmektedirler. Örneğin sadece farmasötik alanında 2000’li yıllarda kullanılacak

biyoteknolojik ürünlerin toplam değerinin yaklaşık 60 milyar dolar/yıl düzeyinde

olacağı düşünülmektedir. Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış

olmakla birlikte, günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle

moleküler biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel

şirketlerin yanı sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı

almışlardır (Glick ve Pasternak, 1994).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının

çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin

endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem

kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışında diğer ülkelerin bu konuda tamamen

dışa bağımlı durumdadırlar.

Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da

bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek

ve peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. İlk

bulgular eski Mısıra kadar dayanmaktadır. Yakın tarihte ise Doğu ülkelerinde

birçok gıda fermentasyonu için ipliksi mantarlar enzim kaynağı olarak

kullanılmaktadır. Batıda 1896’da gerçek modern mikrobiyal enzim teknolojisi

‘takadiastase’ın ticareti ile başlamıştır. Bu Doğudan Batı toplumuna önemli bir

teknolojik transferdir (Uhlig, 1998).


2

Dericilikte, derinin yumuşatılması köpek ya da güvercin dışkıları ile muamele

edilerek yapılırken, bu yüzyıl başlarında Alman kimyacı ‘Otto Röhm’ köpek

dışkılarındaki aktif bileşenlerin proteinleri parçalayan proteaz enzimi olduğunu ve

hayvansal organlardan bu enzimin elde edilebileceğini ve bu işlemlerde köpek

dışkısı yerine kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Böylece 1905’den itibaren

domuz ve sığır pankreasları sosyal açıdan ve güvenilir bir enzim kaynağı olarak ön

plana çıkmıştır (Smith, 1996). Bitkisel kaynaklı enzimlerden bira üretiminde

kullanılan malt amilazı içecek endüstrisinde önemli bir yer tutmaktadır (John,

1987).

Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan

elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda

ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir. Bugüne kadar yaklaşık

2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım için

kendilerine yer bulmuşlardır. Bunlardan ise ancak 25 tanesi nişasta sanayi ile

deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün

enzimlerin %80’ini oluşturmaktadırlar (Rao ve ark., 1998). Bitkisel ve hayvansal

enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan

bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar,

biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden

dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark.,

1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı

mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang, 2004).

Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı

zaman, alkaline proteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10,

Trypsin %3, Lipaz %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz

gibi) %10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılımla

karşılaşılmaktadır (Rao ve ark., 1998).

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikroorganizma

kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan izole

edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik

aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve


3

daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi

avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve pH

değerlerinde çok yüksek düzeyde aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi,

1999).

Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin, bir ürünün

üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre, bir enzimin

herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz olması,

çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de enzimin

alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır

(Wiseman, 1987; Sarıkaya, 1995).

Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler

oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken,

karbonhidratları parçalayanlar ikinci sırada yer almaktadırlar (Hamilton ve ark.,

1999; Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim

piyasasında yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir (Sindhu ve ark.,1997; Rao ve

ark.,1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamuru beyazlatılması

olan ksilanazların endüstride kullanılması hızlı bir yükselişe geçmiştir (Wainq ve

Ingworsen, 2003).

Hidrolazlardan selülazlar ise selülozik materyalleri şekerlere dönüştürerek

özellikle biyo-etanol gibi biyolojik temelli yakıt katkı maddelerinin üretiminde

önemli bir yer tutmaya başlamışlardır. Bu nedenle selülaz’ların (glukanaz) enzim

piyasasındaki paylarının ciddi bir şekilde artması beklenmektedir. Sadece bitkisel

atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda bile, selülaz enzimlerinin Amerika

Birleşik Devletleri’nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmi yaratacağı

öngörülmektedir (Boyce ve Walsh, 2007).

Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının

yaklaşık 1.6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir. Bu enzimlerin kullanım

alanlarına göre dağılımına bakıldığında ise, %29’unun gıda endüstrisi, %15’inin

hayvan yemi sektörü ve %56’sının genel amaçlı teknik alanlar şeklinde dağıldığı

görülmektedir (Uhlig, 1998).


4

Endüstride yaygın şekilde kullanılan enzimler arasında Bacillus cinsine ait

tür ve alttürleri tarafından sentezlenen ondan fazla enzim vardır. Örneğin ticari

olarak üretilen ve kullanılan termostabil amilaz enzimlerinin üretilmelerinde

Bacillus amyloliquefaciens ve Bacillus licheniformis en çok kullanılan iki Bacillus

türüdür (Horikoshi, 1996; Lin ve ark., 1998; Horikoshi, 1999; Kumar ve Takagi,

1999).

Bacillus cinsi bakteriler toprak, hayvan dışkıları ve bitkisel atıklar üzerinde

yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi

kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısadır.

Genel olarak güvenli olmaları, sentezledikleri proteinleri dış ortama salgılama

kapasiteleri gibi birçok nedenden dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü,

gram negatif bakteriler ürettikleri proteinleri protoplazmalarında yada periplazmik

boşluklarında biriktirirler ve bu da üretilen ürünün izolasyonunu güçleştirerek

suştan birden fazla kez yararlanılmasını engeller. Ayrıca sentezlenen ürünlerin

organizmaya karşı toksik etki oluşturması söz konusudur. İntrasellüler ortamda

sentez ürünlerinin biriktirilmesi çözünmeyen protein oluşumu, yanlış protein

katlanmaları ve etkin olmayan disülfit bağ formasyonu gibi sorunları beraberinde

getirmektedir. Ayrıca gram negatif bakteriler, insanlara toksik olan endotoksin ve

intrasellüler protein üretmeleri nedeniyle, proteinlerin izolasyonu ve

saflaştırılmasında ekstra maliyet oluşturmaktadırlar (Boyce ve Walsh, 2007).

Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik yada alerjen bileşik üretimi de göz

önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakteriler, özellikle Bacillus türleri

endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmektedirler.

Bacillus sp. suşları, proteolitik enzimler ve karbonhidratazların en önemli

kaynağını oluşturmaktadırlar. Örneğin α-amilaz enzimi Bacillus sp. grubunda

oldukça yaygın şekilde bulunur ve başlıca, gıda endüstrisinde nişastanın maltoza

hidroliz edilmesi, maltoz şuruplarının hazırlanması, ekmek ve bira üretiminde

kullanılmaktadır. Diğer taraftan, gıdalarda tatlandırıcı ve kaliteyi arttırıcı olarak

(Anonymous, 1988a), tekstil endüstrisinde haşıl alma işlemlerinde (Tarakçıoğlu,

1979) ve alkol fermantasyonunda yaygın bir kullanım alanı vardır (Bhat, 2000).

Özellikle termofilik alkali amilazlar, pH 9’un üzerinde yüksek düzeyde aktif olup,


5

deterjan endüstrisinin en önemli katkı maddesini oluşturmaktadırlar. Bunların

dışında kağıt ve tekstil endüstrisi, çeşitli içeceklerin saflaştırılması ve

berraklaştırılması gibi geniş bir kullanım alanına sahiptirler (Rao ve ark., 1998).

Bacillus türleri çeşitli kompleks substratlara karşı aktivite gösteren çok sayıda

ve çeşitli hidrolitik enzimler üretmekte ve salgılamaktadırlar. Bu nedenle Bacillus

cinsindeki organizmalar, endüstriyel alanda α-amilaz, proteaz, glukanaz, glukoz

izomeraz ve endonükleaz gibi enzimlerin üretiminde yaygın şekilde

kullanılmaktadırlar (Uhlig, 1998).

Bu enzimler arasında endo β-(1,3)-(1,4)- glukanazlar (likenazlar), endosperm

hücrelerinin nişastasına α-amilazların ulaşımını kolaylaştırdığından dolayı içki

mayalama endüstrisinde spesifik uygulamalara sahiptirler (Beckmann ve ark.,

2006). β -1,3-1,4 glukanlar, yüksek yapılı bitkilerin hücre duvarlarının yapısında

bulunan hem β-1,3 hemde β-1,4 bağlı D-glukoz içeren lineer polisakkaritlerdir.

Likenazların, β-glukanları diğer glukanazlara göre daha yüksek düzeyde hidroliz

etmeleri nedeniyle, kümes hayvanları ve domuz yemlerinin hazırlanmasında

giderek ön plana çıkmaktadırlar (Beckmann ve ark., 2006).

1.1. Proteazlar

Proteazlar, doğada bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kalıntıların

dekompozisyonunda önemli rol oynayarak besin döngüsününün sürekliliğini

sağlayarak bitkilerin besinlerini alabilmelerini sağlamaktadır (Aoki, 1995).

Mikrobiyal proteazlar geniş pH aralıklarında aktivite gösterdikleri için asidik, nötral

ve alkali olmak üzere 3 gruba ayrılmışlardır. Proteaz enzimi üretimi birçok bakteri

ve mantar türünde oldukça yaygındır. Bununla birlikte Bacillus cinsinde yer alan

çeşitli suşlar enzim endüstrisinde çok önemli bir yere sahiptirler (Fogarty ve Kelly,

1979; Aunstrup, 1981).


6

1.2. Ksilanazlar

Ksilan, yüksek bitkilerin hücre duvarının hemiselülozik kısmının temel

bileşeni olup kullanılırlığı dikkate alındığında doğada en fazla bulunan ikinci

kaynaktır (Christov ve ark.,1996; Gessesse, 1997). Pek çok bakteri ve mantar suşu

ksilanı parçalayabilmek için ksilanaz enzimine gereksinim duyarlar (Gamerith ve

ark., 1992; Gessesse ve Gashe, 1997). Son on yıldır, ksilan ve ksilenaz enzimlerinin

endüstriyel uygulamaları araştırıcıların giderek ilgisini çekmektedir. Enzimin

kullanım alanlarına örnek olarak kağıt hamuru hazırlama sistemleri ve kağıt

endüstrileri, gıda ve hayvan yemi endüstrileri verilebilir (Kulkarni ve ark., 1999).

1.3. Amilazlar

Karbohidratazların en önemli kaynağını Bacillus cinsindeki organizmalar

oluşturmaktadır. Bir karbohidraz olan α-amilaz enzimi, ticari olarak kullanılan ilk

enzimdir (Radley, 1976). Amilazlar, nişasta ve glikojen moleküllerini hidrolize

ederek glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrinlerin oluşmasını sağlayan

ekstraselüler enzimlerdir. Bu enzimler hayvanlar ve bitkiler tarafından

sentezlenmesine rağmen, uygun koşullarda kısa sürede elde edilmesinden dolayı

asıl kaynağı mikroorganizmalar oluşturmaktadır. Fungal α-amilazların

termostabiliteleri bakteriyel α-amilazlardan daha düşüktür. Araştırmalar daha çok

bakteriyel özellikle de Bacillus amilazları üzerinde yoğunlaşmıştır (Wiseman,

1987).

Bacillus cinsine ait 8 suştan izole edilen α-amilaz enzimi çeşitli araştırıcılar

tarafından tanımlanmış ve bütün özellikleri karakterize edilmiştir. Bu suşlar B.

subtilis (Coleman ve Elliott, 1962.; Pazur, 1965.; Matsuzaki ve ark., 1974), B

.amyloliquefaciens (Borgia ve Campbell, 1978), B. caldolytcus (Grootegoed ve ark,

.,1973), B.coagulans (Bliesmer ve Hartman., 1973), B. licheniformis (Meer, 1972.,

Saito, 1973), B. macerans (Lane ve Pirt, 1973), B. stearothermophilus (Ogasahara

ve ark., 1970) ve B. subtilis var. amylosacchariticus (Matsuzaki ve ark., 1974)’dur.

Amilolitik enzimler bakteri ve mantarlarda oldukça yaygındır. Eskiden amilaz


7

terimi amilaz ve amilopektinin α-1,4-glukozidik bağlarını hidrolize eden endo-

amilaz enzimler için kullanılırdı.

Günümüzde amilazlar 3 grup altında sınıflandırılmaktadırlar. Bunlar ekzo-

amilaz, endo-amilaz ve dallanma göstermeyen amilaz enzimleridir (John, 1987).

Sıradışı bakteriyel amilazlar asidofilik, alkalifilik ve termoasidofilik bakterilerde

bulunmuştur (Boyer ve ark., 1972). Termoasidofilik ve alkalifilik bakterilerden elde

edilen enzimler ekstrem pH ve sıcaklık koşullarında kullanıma uygundur (Kindle,

1983). Çok yüksek sıcaklıklarda (80-90°C) optimal aktiviteye sahip olan α-amilaz

enzimi termofil ortamda üreyen B.licheniformis tarafından üretilmektedir (John,

1987).

1.4. Selülaz (Glukanaz)

Selüloz, doğada en bol bulunan yenilenebilir bir biyopolimer olup yaygın

olarak bitki hücre duvarlarında bulunur. Glikoz birimlerinin β-1,4 glikozidik

bağlarla bağlanmasıyla oluşan polimerlerdir. Nişastadan farklı olarak düz bir zincir

şeklinde olup herhangi bir sarmal yapı göstermez. Selüloz zincirleri hidrojen

bağları ile bağlanarak bir arada tutulurlar. Bazı durumlarda selüloz neredeyse saf

olarak bulunur. Birçok durumda ise selüloz lifleri hemiselüloz ve lignin gibi diğer

yapısal biyopolimerler arasına katılabilmektedir. Selülozun önemli bir özelliği,

diğer polisakkaritlerden farklı olarak kristal yapı oluşturabilmeleridir. Doğada

glikoz birimleri bir zincir halinde sentezlenirken biyosentez bölgesinde

kendiliğinden birleşerek elementer fibril olarak adlandırılan yaklaşık 30 selüloz

zincirinden oluşan birimlere dönüşür. Bunlar da daha geniş üniteler halinde

paketlenerek mikrofibril denen yapıları oluştururlar. Mikrofibriller ise selüloz

fibrillerini oluştururlar. Hidrojen bağları, zincirleri zincir içi ve zincirler arası

bağlarla birbirlerine bağlar ve sert bir yapı oluşmasını sağlar.

Selüloz, β-1,4 bağlarıyla birbirine bağlanmış glikoz moleküllerinden oluşmuş

bir homopolimerdir (Bath, 2000). Selülozun bakteriyel parçalanmasında hem

aerobik hem de anaerobik mikroorganizmalar görev yapmaktadır. Bu proses

sırasında selüloz glikoza kadar parçalanır. Bakterilerin selülolitik enzimleri ekzo-β-


8

1,4 ve endo-β-1,4 glukanazlar şeklinde tanımlanmışlardır (Bath, 2000).

Glukanazlar endo ve ekzo glukanazlar şeklinde ya β-1,3 veya β-1,4 bağlarına

etki göstererek glukan molekülünü parçalarken, likenaz enzimi β-1,3 ve β-1,4

bağlarını tek başına parçalayarak etki göstermektedir. Endoglukanazlar selüloz

molekülünde zincirin iç bölgelerinde rastgele hidroliz yaparlar ve değişik

uzunluklarda oligosakkaritler meydana getirirler. Ekzoglukanazlar ise selüloz

molekülünde zincirin indirgenen ve indirgenmeyen ucundan itibaren hidroliz

yaparak glukoz (glukanohidrolaz) yada sellobiozu (Sellobiohidrolaz) ana ürün

olarak açığa çıkarır. Ekzoglukanazlar aynı zamanda mikrokristal selüloz üzerine de

etki gösterirler. β-Glukozidazlar sellodekstrin ve sellobiyozu glukoza parçalarlar.

Genellikle bir selülaz sistemi birden fazla farklı enzimden oluşmaktadır. Üç

ana enzimatik aktivite tipi bulunmaktadır.

1.Endoglukanazlar (endo-β-1,4-glukanazlar, veya β-1,4-D-glukan-4-

glukanohidrolazlar, EC 3.2.1.4).

2.Ekzoglukanazlar (Sellodekstrinazlar, β-1,4-D-glukan glukanohidrolazlar)

(EC 3.2.1.74) ve Sellobiyohidrolazlar (ekzo-β-1,4-glukanazlar, veya β-1,4-D-

glukan sellobiyohidrolazlar, EC 3.2.1.91).

3.Sellobiyazlar (β-glukosidazlar, veya β-D-glukozid glukohidrolazlar, EC

3.2.1.21).

Endo-(1,3-1,4)- β- glukanaz enzimi, arpa ve yulaf gibi tahılların endosperm

hücre duvarlarının büyük kısmını oluşturan karma bağlı (1,3-1,4)-β-glukanları

hidrolize edebilme özelliğindedir. β- glukanaz üretme yeteneği B. subtilis, B.

amyloliquefaciens, B. macerans ve B. licheniformis’te oldukça yaygın olup,

sentezden sorumlu genler diğer organizmalarda klonlanmışlardır (Liming ve

Xueliang, 2004).

Endo-(1,3-1,4)- β- glukanaz enzimi bira üretimi sırasında malt enzimlerinin

daha iyi çalışmasını sağlamak için yoğun şekilde kullanılmaktadır. Termostabl β-

glukanazlar, maltın kurutulması sırasında inaktive olmadıkları için özellikle tercih

edilirler. Maltlanmış arpada bulunan β-1,3-1,4-glukanaza benzer özgüllük gösteren

bakteriyel β-1,3-1,4-glukanaz önemli bir endüstriyel enzimdir ve çoğunlukla ezme


9

işlemi esnasında akışkanlığı azaltmak için kullanılır. Hayvan yeminde, özellikle

ızgaralık piliç ve küçük domuzlarda, bakteriyel β-1,3-1,4-glukanazlar içeren

enzimatik preparatlar ilavesi arpa kökenli beslenmenin sindirilebilirliğini

geliştirebilir ve sağlıksal sorunları azaltabilir (Zhang ve ark., 2006).

Gelecekte termofil özellik gösteren extremophile mikroorganizmaların enzim

üretim alanında mikrobiyal fabrikalar şeklinde kullanılacakları ve bu şekilde

adlandırılacakları belirtilmektedir (Niehaus ve ark., 1999).

1.4.1. Glukanaz’ların Uygulama Alanları

Hayvan yemlerine enzim katılması ile ilgili ilk uygulama 1980 yılında

Finlandiya’da yapılmıştır. β–glukanaz enziminin arpadan üretilen tavuk yemlerine

karıştırılması ile birlikte, özellikle tavukçuluk sektöründe enzim kullanımı önemli

boyutlara ulaşmıştır. Bu uygulamayı domuz yemleri izlemiştir. Ruminantlar

uygulamanın nispeten daha az gerçekleştirildiği sektör olmuştur. Hayvan yemi

üretiminin boyutları düşünüldüğü zaman enzimler için çok büyük bir potansiyel

ortaya çıkmaktadır. Tek mideli hayvanların besinlerinde şuan yaklaşık %10’luk bir

uygulama söz konusudur (Wolfgang, 2004).

Özellikle hayvan yemi üretiminde tavukçuluk sektörünün hızlı gelişimine

paralel olarak yem gereksinimi önemli boyutlara ulaşmıştır. Tavuk yemi üretiminde

ana hammadde olarak mısırdan yararlanılmakla birlikte buğday, arpa ve çavdar da

kullanılmaktadır. Son yıllarda biyoteknolojik çalışmalarda çok hızlı ivme kazanan

diğer bir çalışma alanını biyoetanol oluşturmaktadır. Etanol üretiminde hammadde

olarak mısırın daha çok tercih edilmesi mısır fiyatlarının artmasına, dolayısı ile yem

fiyatlarının yükselmesine neden olmuştur.

Mısır yerine alternatif yem hammaddesi olarak arpa ön plana çıkmaktadır.

Tavuklarda arpada bulunan β-glukanı parçalayacak enzim sistemi yeterince

gelişmediği için yem üretiminde enzim kullanımı zorunluluğu ortaya çıkmıştır.

Özellikle glukanaz ve xylanase enzimi bu konuda ön plana çıkmaktadır (Wolfgang,

2004).


10

β–glukan β–1,3 ve β–1,4 şeklinde bağlanmış lineer glikoz birimlerinden

oluşur. Likenaz enzimi bu bağların hem β-1,3 hemde β-1,4 bağlarını kopartarak etki

gösterir.

Bakteriler arasında Cellulomonas sp., Bacillus sp. ve Thermoactinomyces sp.

ekstraselüler selülolitik akviteye sahip organizmaları oluşturur. Mantarlar arasında

Trichoderma reseii en önemli selülaz üreticisidir. Arpanın yaklaşık %3-4’ü β-

glukandan oluşmaktadır. β-glukan tavuk ve domuzlar tarafından sindirilemediği

için sindirim sisteminde viskos bir yapı oluşmakta ve dışkının yoğunluğu

artmaktadır (Wolfgang, 2004).

1.4.1.1. Gıda Endüstrisinde Glukanazlar

Tohumlardan yağ ve meyve suyu ekstraksiyonunda, meyve sularının

berraklaştırılmasında, tahılların homojen olarak su çekmesini sağlamak ve yeterince

ıslanmasının artırılmasında, soya sosu gibi fermente soya gıdaların üretiminde

soyanın dış zarının uzaklaştırılmasında, kokonat ve soya fasulyesinden protein

izolasyonunda, mısır ve tatlı patatesten nişasta üretiminde, sindirimini artırmak

amacı ile yosunlarının jelatinizasyonunda, su yosunlarından agar ekstraksiyonunda,

gıda katkısı maddesi olarak kullanılan öğütülmüş lignoselülozik materyalin

parçalanmasında, selülozik atıklardan çözünür şeker, glikoz ve sello-oligosakkarit

üretiminde, bioetanol üretimi için substrat eldesinde, kurutulmuş sebze ve çorba

karışımlarının geri sulandırımının artırılmasında, polisakkarit, protein, enzim ve tat

verici maddelerin açığa çıkışını kolaylaştırmak amacıyla bitki hücre duvarlarının

uzaklaştırılmalarında kullanılmaktadır (Bhat ve Bhat, 1997).

1.4.1.2. İçecek ve Şarap Endüstrisinde Glukanazlar

Rekombinant mayalardan elde edilen β-1,3 ve β-1,4 glukanazlar (likenazlar)

şaplarda aroma artışının sağlanması, biranın filtrasyonunun kolaylaştırılması ve

düşük kalite arpada bulunan β-1,3 ve β -1,4 glukan hidrolizinde kullanılmaktadırlar.


11

1.4.1.3. Hayvan Yemi Endüstrisinde Glukanazlar

Ruminant ve monogastrik hayvanlar yemlerinde sindirilebilirliği artırmak

amacı ile, lignoselülozik materyallerin ön işlemden geçirilmesinde, hububatların

kabuklarından arındırılmasında, ruminant ve monogastrik hayvanların selülozda

yararlanmalarını artırmak için silaj yapımında kullanılırlar.

1.4.1.4. Tekstil Endüstrisinde Glukanazlar

Kumaşlarda boyanın fazlasını almada (biostoning), bir çok yıkama sonunda

pamuk kumaşlardan çıkan mikrofibrillerin giderilmesinde, pamuk yada pamuklu

kumaşların yıkanması, renk parlaklığının artırılması ve yumuşaklığının geri

kazandırılmasında kullanılır (Bhat ve Bhat, 1997).

1.4.2. β-(1,3)-(1,4)- Glukanaz (Likenaz)’ların Uygulama Alanları





kullanılmaktadırlar (Uhlig, 1998). Bu enzimler arasında endo β-(1,3)-(1,4)-

glukanazlar (likenazlar), endosperm hücrelerinin nişastasına α-amilazların ulaşımını

kolaylaştırdığından dolayı içki mayalama endüstrisinde spesifik uygulamalara

sahiptirler (Beckmann ve ark., 2006). β -1,3-1,4 glukanlar yüksek yapılı bitkilerin

hücre duvarlarının yapısında bulunan hem β-1,3 hemde β-1,4 bağlı D-glukoz

içeren lineer polisakkaritlerdir. Likenazların, β-glukanları diğer glukanazlara göre

daha yüksek düzeyde hidroliz etmeleri nedeniyle, kümes hayvanları ve domuz

yemlerinin hazırlanmasında giderek ön plana çıkmaktadırlar (Beckmann ve ark.,

2006).




12




işlemi esnasında akışkanlığı azaltmak için kullanılır. Hayvan yeminde, özellikle

etlik tavuk ve küçük domuzlarda, bakteriyel β-1,3-1,4-glukanazlar içeren enzimatik

preparatlar ilavesi arpa kökenli beslenmenin sindirilebilirliğini geliştirebilir ve

sağlıksal sorunları azaltabilir (Zhang ve ark., 2006).

1.5. Ekstremofilik Enzimler (Ekstremezimler)

Ekstremofilik enzimler sıcaklık, basınç, pH ve tuzluluk gibi ekstrem şartlarda

çalışabilen ve endüstriyel uygulamalar için büyük öneme sahip enzimlerdir.

Mezofilik enzimler enzim stabilitelerindeki eksikliklerden dolayı endüstriyel

enzimlerden istenen zorlu reaksiyon şartları için, pek uygun değillerdir.

Ekstremofilik organizmlar ise ekstrem ortamlarda bulunabilen organizmalar

olup termofil, asidofil, halofil, alkalofil, psikrofil gibi bir çok farklı sınıflar altında

grublandırılabilirler. Dolayısı ile bu organzimalar, mezofillerin yaşayamlarını

sürdüremiyecekleri koşullarda aktivite gösteren enzimleri üretebilirler.

Mikroorganizmalar optimum büyüme sıcaklıkları dikkate alındığında

psikrofiller (20oC altında), mezofiller (20-55oC) ve termofiller (55oC üzeri) olmak

üzere üç ana gruba ayrılırlar. Bunlara ilaveten Kristjansson ve Stetter (1992)’

termofil grubu daha da genişletilerek 60-80oC arasında üreyenleri ekstermofil,

80oC’nin üzerinde üreyenler için hipertermofil tanımını kullanılmaktadırlar.

Gerek termofilik gerekse hipertermofilik enzimler karakteristik olarak

40oC’nin altında etkin bir aktivite göstermezler (Gomes ve Steiner, 2004). Sıcaklığa

dirençli proteinlerin amino asit kompozisyonu mezofilik organizmaların amino asit

kompozisyonu ile karşılaştırıldığında glisin yerine alanin, lizin yerine arjinin amino

asitinin sıcaklığa dirençli proteinlerde daha fazla yer aldığı görülmüştür. Aynı

zamanda arjinin termofilik proteinlerin yapısında bol bulunurken sıcaklığa en

hassas amino asit olan sistein bu proteinlerin yapısında daha sınırlı düzeyde

bulunmaktadır.


13

Deneysel çalışmalar hidrofobik interaksiyonların termofilik proteinlerin

stabilizasyonunda önemli bir rol aldığını göstermiştir. Sıcaklığa dirençli proteinler

hidrofobik interaksiyonlarla dimer oluşturarak termal hidrolize karşı daha dirençli

hale geçmektedir. Bunlardan başka sıcaklığa dirençli proteinler disülfit bağları,

molekül içi aromatik yapılar, zengin hidrojen bağları içermekte ve elektrostatik

mekanizmalarla yüksek sıcaklığı tolere edebilmektedirler (Kumar ve Nussinov,

2001).

Deterjan, gıda, yem, nişasta, tekstil, deri, kağıt hamuru, farmasötik endüstrisi,

termofilik enzimlerin en geniş kullanıldığı alanlardır (Gomez ve Steiner, 2004).

Örneğin nişasta endüstrisi, termostable amilazın en yaygın kullanıldığı alandır.

1.6. Elektroforez Uygulamaları

İyonlaşabilir gruplara sahip amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve

nükleik asitler gibi biyolojik moleküller, ayırıcı bir ortamın bulunduğu elektriksel

alanda, sahip oldukları elektrik yüküne bağlı olarak, anod veya katoda bölgesine

göç ederler. Moleküller aynı yüke sahip olsalar dahi, molekül ağırlık farklılığı

nedeniyle sahip olunan yükün molekül ağırlığına oranı (yük/kütle) farklı olacaktır.

Bu farklılıklar sayesinde solüsyon içindeki iyonlar bir elektriksel alana tabii

tutulduklarında moleküllerin göçüne yönelik farklılıklar ortaya çıkar.

Elektroforez için gereken gereçler güç kaynağı ve elektroforez tankından

oluşur. Güç kaynağı elektrodlar arasında doğru akımın dengeli ve düzgün şekilde

akışını sağlayarak elektriksel alanın istenilen özellikte oluşmasını neden olur.

Elektriksel alanda sürekli olarak, pozitif yüklü moleküller negatif kutba, negatif

yüklü moleküller pozitif kutba doğru göç ederler.

Örnekler elektroforezin düzgün gerçekleşmesi için tampon içinde çözülürerek

hazırlanmalıdır. Ayrıca elektroforzde istenilen başarının elde edilmesi için ayırıcı

ortmın mutlaka elektroforez tamponu ile hazırlanması şarttır. pH değişikliği

elektroforezi yapılan molekülün iyonik yükünü değiştirebileceğinden, tampon

pH’sının stabil tutlması önemlidir.


14

Ayırıcı ortam olarak filtre kağıdı, selüloz asetat, agaroz, nişasta, agar veya

poliakrilamid gibi sitemler kullanılabilir. Her sistemin ayırma gücü bir birinden

farklılık gösterir. Elektroforez işlemi ayırıcı ortamın konsantrasyonu, ortam

sıcaklığı, uygulanan akımın türü ve şiddeti, kullanılan tamponun iyonik gücü,

elektroforez süresi, molekül şekli ve ağırlığı gibi parametrelerden etkilenmektedir

(Aygan, 2008).

Elektrodlar arasındaki akımı genel olarak tampon iyonları az bir kısmı örnek

iyonları iletilir. Voltajdaki iletilen toplam yükün artışına neden olur. Sıcaklık artışı

elektroforez sırasında direncin düşmesine neden olur. Isı artışı tomponun

buharlamasına neden olduğunda iyonik gücün değişmesine yol açar.

Elektroforez düzeyi örneğin net elektriksel yükü arttıkça artacaktır. Diğer

taraftan molekül büyüklüğü arttıkça göç oranı düşecektir. Örnekler aynı molekül

büyüklüğüne sahip olsalar bile moleküllerin globüler yada fibröz oluşu moleüllerin

göçünde farklılığa neden olacaktır. Elektroforez işlemi, kullanılan tamponun

bileşimi ve iyonik yükünden faklı şekilde etkilenir. Yaygın olarak kullanılan

tamponlar agaroz için tris-asetat, tris-fosfat ve tris-borat, poliakrilamid için tris-

glisin karışımlarıdır.

Örnekle bağlanma davranışı göstermeyen tamponlar molekülün göç oranını

değiştirken, karbonhidratların analizinde kullanılan borik asit tamponu moleküle

bağlandığı için elektroforezde olumsuzluğa yol açar. Aynı şekilde tamponun iyonik

gücü artarsa, tampondan geçen elektrik akımıda artacaktır. (Wilson ve Goulding,

1986; Aygan, 2008).

1.6.1. Jel Elektroforezleri

Ayırıcı ortam olarak jellerin kullanılmaya başlanması, nükleik asit ve protein

gibi büyük moleküllü maddelerin separasyonunda “düşük voltajlı ince tabaka

elektroforez” sistemlerinin devre dışı kalmasına sebep olmuştur. Suda çözünmez,

hidrofilik ve yarı-katı kolloid yapıda olmaları gibi fiziksel özellikleri tercih

edilmelerinde önemli faktörleri oluşmuştur. Nişasta, agar ve poliakrilamid jel

elektroforez uygulamalarında kullanılan malzemeler olup, kullanmadan hemen


15

önce hazırlanırlar.

Nişasta jeller, uygun tampon içerisinde kısmen hidrolize olmuş nişasta

karışımı ısıtılıp soğutularak hazırlanır. Nişastanın amilopektin bileşeni dallanmış

zincirlerinin sarılmaları ile yarı katı jelin oluşumunu sağlar. Nişastanın moleküler

elek özelliğinde olması, fizyolojik aktif proteinler ve kompleks yapısal molekül

karışımlarının analizinde tercih edilmelerine neden olmuştur.

Agar ucuz, toksik olmayan, zararsız bir malzeme olup agaroz ve

agaropektinden oluşmuştur. Agar tampon içerisinde kaynatılarak çözülürken ortam

sıcaklığı 40oC ye düşürüldüğünde katılaşarak jelleşir. Geniş por çapına sahip

olmaları nedeniyle elektroforez esnasında iyonların hareketi çok hızlı

gerçekleşmektedir.

Bu özellik makromoleküllerin separasyonunu için bir avantajdır. Agar,

separasyondan sonra boyama için çok uygun bir materyal olup, özellikle difüzyon

direncinin düşük olması nedeniyle, immünelektroforez uygulamalarında fazlaca

tercih edilmektedir. Saflaştırılmış agaroz jel saf halde izole edilmiş nükleik asit

yapılarının analizi için yaygın bir kullanım alanına sahiptir.

Poliakrilamid jeller oldukça toksik kimyasal bileşiklerle hazırlanır. Akrilamid

monomerleri (CH2=CHCONH2) taze hazırlanmış amonyumpersülfat ve TEMED

(Kimyasal katalizör sistemi) varlığında genellikle N,N-metilenbisakrilamidin

(CH2(NHCOCH=CH2)2) çapraz bağlanmaları ile polimerize olurlar. Moleküler

oksijenin polimerizasyonu inhibe etmesi nedeniyle monomer, tampon ve su

sistemine AMPS ve TEMED in ilavesinden önce degaz işlemi gerçekleştirilir. Bu

amaçla karışım vakum pompası yada vakumlu desikatörde veya ultrasonik su

banyosunda 5 dakika bekletilir.

Jelin dökümünden hemen sonra üst yüzeydeki yüzey gerilimi nedeniyle

meydana gelen eğimli yüzey oluşumunun separasyonu olumsuz etkilemesi ve

atmosferik oksijenin difüzyonunun engellenmesi için jelin üst tabakası distile su

veya suya doyurulmuş bütanol ile kapatılır. Jelin polimerizasyonunda riboflavin ve

TEMED sisteminden yararlanılacaksa (foto-polimerizasyon) reaksiyon ışık altında

gerçekleştirilir (Wilson ve Goulding, 1986; Aygan, 2008).


16

Akrilamid jel uygulamaları kesiksiz (Continuous) ve kesikli (discontinuous)

olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleştirilebilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı

jel vardır ve tanklarla jelde aynı tampon kullanılır. Kesikli sistemde ise jel, farklı

tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur. Büyük porlu stacking (dengeleme jeli)

ve küçük porlu separating (ayırıcı) jel şeklindedir.

Jelin porlarının büyüklüğü/küçüklüğü akrilamid monomerinin konsantrasyonu

ile değişir. Jeller mevcut akrilamidin toplam yüzdesi ile %3 ila %30 arasında bir

konsantrasyonda hazırlanabilir. Düşük konsantrasyonlarda geniş por yapıları oluşur

ve büyük moleküllerin separasyonu için tecih edilir.

Proteinlerin seperasyonu çoğunlukla %5-15 lik jellerde gerçekleştirilmektedir.

Benzer yüklere sahip olsalar bile farklı şekil ve büyüklükteki moleküllerin

analizinde çok uygun bir elektroforez tekniğidir.

Elektroforetik separasyon sonunda proteinler ya doğrudan jel içerisinde yada

sabit bir yüzeye (örn: nitroselüloz veya naylon membran) aktarıldıktan sonra

saptanır ve analiz edilir. Protein bandlarının görünür hale getirilmesinde en uygun

yöntem boyamadır. Jeldeki proteinler genellikle Coomassie Brillant Blue veya

Gümüş Nitrat ile, filtreye emdirilmiş proteinler ise amido black ve ponceau S gibi

boyalarla boyanır.

Boyama sonunda bir birinden ayrılmış proteinler jel yada membran üzerinde

bantlar şeklinde görünürler. Herhangi bir yöntemle boyanmış protein bantlarının

bulunduğu jel çeşitli çözeltiler içinde birkaç ay veya jel kurutma aletinde

kurutulduktan sonra yıllarca saklanabilir. Ancak görüntünün kalıcı olması açısından

en pratik yol fotoğrafının çekilmesidir (Aygan, 2008).

Proteinlerin elektroforez uygulamaları farklı amaçlara göre denatüre veya

native (Doğal) jel elektroforezi olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilir. Denatüre

jeller SDS veya üre gibi denatüre edici ajanların jel içerisine karıştırılması ile

hazırlanırlar. Bu tür uygulama başta molekül ağırlık belirlenmesi olmak üzere,

proteinlerin saflıklarının araştırılması, konsantrasyonlarının tanımlanması ve enzim

aktivitelerinin saptanmasına olanak verir.


17

1.6.2. Doğal (Native) Jel Elektroforezi

Doğal jel elektroforezinde kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer denatüre

edici ajanları içermediğinden, işlemler doğal şartlarda gerçekleştirilir. Fazla sayıda

protein içeren karışımların bir birinden ayrılmasında, bir protein ya da protein

kompleksinin aktivite veya yapısı ile ilgili elektroforetik çalışmalarda, protein saflık

kontrolü ve proteinin denatüre olup olmadığının saptanmasında kullanılır.

Doğal jel elektroforez uygulamasında, örneklerin molekül ağırlıkları hakkında

kesin bir bilgi edinmek mümkün değildir. Bunun nedeni, molekül büyüklüğünün

yanında molekül şekli ve yükünün de ayrımı etkilemesidir (Aygan, 2008).

Bu çalışmada, glukan molekülünü oluşturan β–1,3 ve β–1,4 glikozid bağları

ile bağlanmış birimlerin yüksek sıcaklıkta tam hidrolizini gerçekleştirecek termofil

ve termostabil Likenaz enzim üreticilerinin izolasyonu, enzim üretiminin

gerçekleştirilmesi ve enzimin karakterizasyonunun yapılarak, biyoteknolojik

kullanılabilirliğinin (Arpa, yulaf ve buğdaydan hayvan yemi üretimi alanında)

araştırılması amaçlanmaktadır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatma GÖZÜKARA

18

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Biodin ve Effront (1917), B. subtilis kültürlerinden enzim hazırlanmasıyla

ilgili çalışmalar yapmıştır.

Miller (1951), Karbonhidrataz etkisi gösteren enzimlerin aktivite

analizlerinde indirgen şeker miktarının saptanması için Dinitrosalisilik asit (DNS)

yöntemini kullanmıştır. Bu metod ile 3,5-dinitrosalisalisilik asitin, 3-amino-5-

nitrosalisilik asite indirgendiğini ve aldehit grupların karboksilik gruplara okside

olarak gelişen renk reaksiyonunu oluşturduklarını bildirmiştir.

Morgan ve Priest (1981), 40°C’nin üzerinde aktivitelerini kaybeden

Bacillus suşlarında termostabilite yeteneklerini araştırmışlardır.

Louw ve ark. (1993), Bacillus brevis bakterisinden endo β-(1,3)-(1,4)-

glukanaz (likenaz) genini Escherichia coli’de klonlamışlardır. Üretilen enzimin

optimum aktivite sıcaklığı 65-70°C, optimum aktivite pH’ı 8-10 aralığında

bulunmuştur. Enzim 1 saat süreyle 70°C’de inkübe edildiği zaman orijinal

aktivitesini %85 oranında korumuştur. Likenaz enziminin SDS-PAGE analizi

sonucunda moleküler ağırlığı 29 kDa olarak saptanmıştır.

Akita ve ark (2005), Bacillus halodurans C-125 suşundan izole edilen

enzimin ince tabaka kromatografisi analizinde endo özellik gösterdiğini

bulmuşlardır. Enzim optimum aktivitesini 60°C de pH 6 ve 8 de göstermiştir.

Enzimin orijinal aktivitesini 50 ve 60°C de 2 saatlik inkübasyondan sonra %100

koruduğunu saptamışlardır.

Oyekola ve ark. (2007), izole ettikleri endoglukanaz enziminin pH

optimumunun 6-6.5, sıcaklık optimumunun ise 50°C olduğunu saptamışlardır.

Enzim Cu, Ni ve Zn gibi divalent katyonlarla inhibe olurken, Fe, Mg ve Ca ile

aktive olmuştur.

Endo ve ark. (2001) alkalifilik Bacillus suşundan izole edilen alkaline

endoglucanase enziminin optimum aktivite pH’ının 10.0, sıcaklık optimumunun

ise 55°C olduğunu saptamışlardır. SDS-PAGE ile yapılan analizlerde enzimin

moleküler ağırlığının 50 kDa olduğu bulunmuştur.


19

Hirasawa ve ark. (2006), alkalifilik Bacillus agaradhaerens suşundanizole

edilen endoglucanase enziminin moleküler ağırlığının 38 kDa, optimum aktivite

gösterdiği pH aralığının 7.0-9.4 ve optimum aktivite sıcaklığının 60°C olduğunu

bulmuşlardır.

Zhang ve ark. (2006), β-1,3-1,4-glukanaz enziminin termostabilitesini

yönlendirilmiş mutasyonla artırmışlardır.

Hreggvidsson ve ark. (1996), izole ettikleri termofilik selülaz enziminn

moleküler ağırlığının 49 kDa, optimum aktivite pH’ının 7.0 olduğunu

saptamışlardır. Enzim 100°C de 3.5 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitesini

%50 korurken, 90°C de 16 saat inkübe edildiğinde %80 korumuştur. Enzim

yüksek düzeyde termostabil olarak tanımlanmıştır.

Robson ve Chambliss (1984), Bacillus sp.’den üretilen selülaz enziminde

aktivite analizi yapmışlar ve maksimum selülaz aktivitesin pH 4.8 ve 58°C’de

gerçekleştiğini bulmuşlardır.

Soutschek-Bauer ve Staudenbauer (1987), Clostridium thermocellum’dan

elde edilen genini B.subtilis’e ve B.stearothermophilus’a transfer ederek CMC-az

üretimi gerçekleştirmişlerdir.

Hakamada ve ark (1997), alkalifilik Bacillus sp. KSM-S237’den izole

edilmiş termostabil alkali selülazın optimum aktivitesini pH 8.6-9.0 ve 45°C’de

gösterdiği bildirmişlerdir.

Yernool ve Eveleigh (1998), iki termostabil endoselülaz izolasyonu yapmış

ve moleküler ağırlıkları 29 ve 30kDa olan enzimlerin optimum pH 6.0-6.6 ve

95°C’de aktif olduklarını bulmuştur.

Krishna (1999), katı faz fermentasyon ile B. subtilis’ten selülaz enzimi

üretimini gerçekleştirmişler ve substrat, nem, parça büyüklüğü, ortam pH’sı,

inkübasyon sıcaklığı azot ve karbonun, enzim üretimine etkilerini araştırmışlardır.

Mawadza ve ark (2000), iki Bacillus suşundan üretilen selülazın

karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Her iki enzimin molekül ağırlığı 40 kDa

olup, enzimlerin otimum aktivitelerini pH 5.0-6.5’de ve 65 ve 70°C’de

gösterdiklerini belirlemişlerdir.


20

Hakamada ve ark (2002), Bacillus circulans’dan izole ettikleri alkalin

endoglukanazın pH 8.5’da 55°C’de optimal çalıştığını ve 43 kDa moleküler

ağırlığa sahip olduğunu saptamışlardır.

Singh ve ark (2001), termostabil alkali CMC-az enzimini Bacillus sp. VG1

suşundan izole etmişler ve enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 9.0-

10.0, yarılanma ömrünün ise 100°C’de 12 dakika olduğunu bulmuşlardır.

Coral ve ark (2002), Aspergillus niger’den moleküler ağırlıkları 83 ve

50kDa olan, optimum aktivitesini pH 3.0-9.0 aralığında gösteren CMC-az enzimi

izole etmişlerdir. Enzimin optimum aktivite sıcaklığını 40°C bulmuşlardır.

Kang ve ark (2004), Aspergillus niger KK2 suşundan solid state

fermentasyon tekniği ile pirinç ve buğday kabukları kullanılarak selülaz enzimi

üretimi gerçekleştirmişlerdir.

Saha (2004), Mucor circinelloides’ten izole ettikleri endoglukanazın

optimum aktivitesini pH 4.0-6.0 ve 55°C’de gösterdiğini, enzimin moleküler

ağırlığının 27 kDa olduğunu belirtmiştir.

Huang ve Monk (2004), Caldibacillus cellulovorans’dan izolasyonunu

yaptıkları CMC-az enziminin 85.1 kDa molekül ağırlığa sahip olduğunu ve

maksimum aktivitenin ise 80°C’de gerçekleştiğini bildirmişlerdir.

Singh ve ark (2004), Bacillus sphaericus JS1suşundan alkali selülaz

enzimi izole ederek enzimin üretimi ve karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir.

Enzimin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlığının 42 kDa olduğu saptanmış ve

enzimin termostabilite, pH stabilitesi ve hidrolitik kapasitesi açısından, deterjan

sanayi için uygun olduğunu belirtmişlerdir.

Kim ve ark (2005), alkalifilik Bacillus sp. suşundan HSH-810’dan alkali

selülaz izolasyonu yapmışlar ve enzimin pH 10.0’da ve 50°C’de optimum aktivite

gösterdiğini belirtmişlerdir.

Zverava ve ark (2006), haloalkalifilik anaerobik bakteriden izole ettikleri

selülaz enziminin moleküler ağırlığının 75 ve 84 kDa olduğunu bildirmişlerdir.

Hirasawa ve ark (2006), Bacillus agaradhaerens suşundan endoglukanaz

enzimi izolasyonu gerçekleştirmişler, farklı sıcaklık ve pH’larda enzim

aktivitesine bakarak, NaCl ile enzim aktivitesinde artış olduğunu belirlemişlerdir.


21

NaCl’ün enzim aktivitesini artırıcı yöndeki etkisinin pH 6.5-7.0 arasında ve

60°C’de, altı kat daha yüksek olduğunu ortaya koymuşlardır.

Kang ve ark (2007), Pyrococcus horikoshii’den, kristalin selüloza karşı

oldukça etkin hipertermofilik selülaz izolasyonu gerçekleştirmişler ve enzimin

disülfit bağına sahip olduğunu belirtmişlerdir.

3. MATERYAL VE METOD Fatma GÖZÜKARA

22

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

3.1.1. Kullanılan Çözeltiler

3.1.1.1. NaOH Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını ayarlamak ve tampon çözeltilerin hazırlanması amacı

ile 0.2N ve 2N NaOH çözeltisi kullanılmıştır.

3.1.1.2. Etanol

Sıvı besiyerlerinde üretilen enzimlerin çöktürülmesi amacı ile daha önceden

soğutulmuş %96’lık soğuk etanol kullanılmıştır.

3.1.1.3. Kongo Kırmızısı (%0.1)

Katı besiyerindeki enzim aktivitesi ve Nativ Jel uygulamasında jeldeki

likenaz aktivitesinin gösterilmesi için %0.1’lik kongo kırmızısı 100 mL distile suda

çözülerek hazırlanmıştır (Voget ve ark, 2006).

3.1.1.4. NaCl Çözeltisi (1M)

Petri kutusunda likenaz aktivitesini saptamak ve zimogram analizinde jelde

bulunan aktivite bandını görünür hale getirmek amacıyla kullanılmıştır (Voget ve

ark, 2006).


23

3.1.1.5. Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M)

Çöktürme sonucu elde edilen enzimin çözülerek resüspanse edilmesi için

kullanılmıştır.

3.1.1.6. Sitrat Tamponu

Enzimin pH 3.0-5.0 aralığındaki aktivitesini saptamak için kullanılır.

Tamponun hazırlanmasında 0.2 M Sitrik asit ve 0.2M Na2HPO4.7H2O çözeltileri ve

distile su’dan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir

karışım elde edilir (Temizkan ve Arda, 2004).

pH

0.2 M Sitrik Asit

(19.21g/1000mL)

mL

0.2M Na2HPO4.H2O

(53.65g/1000mL)

mL

Distile Su

mL

3.0 39.80 10.20 50

4.0 30.70 19.30 50

5.0 24.30 25.70 50

3.1.1.7. Sodyum-Fosfat Tamponu

Enzimlerin pH 6.0-8.0 arasındaki aktivite düzeylerinin saptanmasında

kullanılmıştır. Tamponun hazırlanmasında 0.2M NaH2PO4 ile 0.2M Na2HPO4.7H2O

çözeltileri ve distile sudan uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine

sahip yeni bir karışım elde edilir (Temizkan ve Arda, 2004).


24

pH

0.2M NaH2PO4

(27.8g/1000mL)

mL

0.2M Na2HPO4

(53.65g/1000mL)

mL

Distile Su

mL

6.0 87.70 12.3 100

7.0 39 61 100

8.0 5.3 94.7 100

3.1.1.8. Glisin-NaOH Tamponu

Enzimlerin pH 8.5-10.5 aralığındaki aktivitelerini saptamak için kullanılır.

Tamponun hazırlanmasında 0.2M Glisin ile 0.2M NaOH çözeltileri ve distile su’dan

uygun hacimlerde karıştırılarak, istenilen pH değerine sahip yeni bir karışım elde

edilir (Temizkan ve Arda, 2004).

pH 0.2M Glisin (15.01g/1000mL)

mL

0.2M NaOH (8 g/1000mL)

mL

Distile Su

mL

9.0 8.80 50 141.2

10.0 32 50 118

3.1.1.9. DNS (Dinitro Salisilik Asit)

Enzim aktivitesini durdurmak ve indirgen şeker miktarının saptanması amacı

ile kullanılmıştır (Aiba ve ark., 1983). 1 g DNS (50 mL de-iyonize su içinde

çözüldükten sonra), 30 g K-Na-Tartarat ve 20 mL 2N NaOH ilave edilerek, son

hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır (Aiba ve ark.,1983).


25

3.1.2. Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri

3.1.2.1. LB Agar

Bakterilerin izolasyonu ve stok kültürlerin saklanması için kullanılmıştır

(Sambrook ve Russell, 2001).

Bileşimi g/L

Tripton 10

Maya Özütü 5

NaCl 10

Agar 15

3.1.2.2. Likenanlı Besiyeri

Likenaz aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılmıştır (Kim ve ark, 2005).

Bileşimi g/L

Likenan 10

Pepton 5

Maya Özütü 5

KH2PO4 1

MgSO4.7H2O 0.2

NaCl 10

Agar 15


26

3.1.2.3. Likenaz Enzimi Üretimi Besiyeri (Krishna,1999).

Bileşimi g/L

Na2HPO4.7H2O 1.18

KH2PO4 0.9

NaNO3 1

KCl 0.5

MgSO4.7H2O 0.5

Maya Özütü 0.5

Pepton 0.5

Likenan 10

3.1.3. Elektroforez İşleminde Kullanılan Çözeltiler

3.1.3.1. Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)

Bileşimi g

Akrilamid 29.2

Bisakrilamid 0.8

Distile su 100 mL

Yukardaki bileşikler bir miktar distile su içerisinde çözüldükten sonra son

hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.2. Solüsyon B (4X)

Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için 75 mL 2M Tris-HCl (pH

8.8) ve son hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. (Bollag ve ark, 1996).


27

3.1.3.3. Solüsyon C (4X)

Nativ jel uygulamalarında SDS kullanılmadığı için 50 mL 1M Tris-HCl (pH

6.8) ve son hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) %10

0.5g AMPS 5mL distile su içerisinde çözülerek hazırlanır (Bollag ve ark,

1996).

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu

Bileşimi g/L

Tris 3

Glisin 14.4

Distile su 1000mL

Nativ Jel uygulandığından SDS kullanılmamıştır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X)

Bileşimi mL

1 M Tris-HCl (pH 6.8) 0.6

Gliserol %50 5

β-Merkaptoetanol 0.5

Bromfenol mavisi %1 1

Distile su 0.9

Nativ Jel uygulandığından SDS kullanılmamıştır (Bollag ve ark, 1996).


28

3.1.3.7. Jel Boyama (Staining) Solüsyonu

Bileşimi

Comassie Brillant Blue R-250 1 g

Metanol 450 mL

Glasial Asetik Asit 100 mL

Distile su 450 mL

1g Coomassie Brillant Blue R-250, 450 mL metanol içerisinde çözülüp filtre

kağıdından süzüldükten sonra, karışımın üzerine 100 mL Glasial asetik asit ve 450

mL distile su eklenerek hazırlanır (Bollag ve ark, 1996).

3.1.3.8. Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu (Bollag ve ark, 1996).

Bileşimi mL

Metanol 100

Glasial Asetik Asit 100

Distile su 800


29

3.2. Metod

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi

3.2.1.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Değişik ortamlardan örnekler alınarak 1’er g tartılıp 5 mL steril distile su

içerisinde süspansiyon haline getirilmiştir. Bacillus sp. sporlu bir bakteri olduğundan,

elde edilen süspansiyon 80ºC’de 10 dakika inkübe edilerek ısı şoku uygulanmıştır

(Lennete ve ark., 1985).

Isı şoku uygulamasından sonra tek koloni oluşumunu sağlayabilmek için

örnekten seri sulandırmalar yapılarak, pH sı 7.0 olan LB agar besiyerine yayma

şeklinde ekim yapılmış ve 55ºC’de 1 gece inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda

besiyerinde tek düşmüş farklı morfolojik görünüme sahip koloniler seçilmiş ve LB

agar besiyerine çizgi şeklinde ekim yapılarak identifikasyon ve Likenaz aktivitesinin

saptanması amacı ile stok kültür şeklinde saklanmışlardır.

3.2.2. Bakterilerin İdentifikasyonu

Seçilen bakteri örneklerini tanımlamak amacı ile indol, hidrojensülfür,

hareket, asit, katalaz, jelatin ve kazeini kullanma gibi biyokimyasal testler ile spor,

yüzeyde zar oluşturma, dipte çökelti oluşturma ve gram boyama testleri yapılmıştır

(Jin ve ark., 1990).

3.2.3. Katı Besiyerinde Likenaz Aktivitesinin Saptanması

Tanımlanmaları yapılan stok Bacillus sp. suşları Likenan içeren pH sı 7.0’ye

ayarlanmış LB agar besiyerine çizgi ekim tekniği kullanılarak aşılanmışlar ve

55ºC’de 24 saat üremeye bırakılmışlardır. İnkübasyon sonunda koloniler %0.1’lik

kongo kırmızısı ile 15 dakika boyandıktan sonra 1M’lık NaCl ile 15 dakika boyanın

geri alınması işlemi uygulanmıştır. Kolonilerin etrafında kırmızı zeminde sarı zon


30

oluşumu likenaz pozitif şeklinde değerlendirilmiştir (Hols ve ark., 1994; Burhan ve

ark., 2003).

3.2.4.Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği pH Aralığının

Saptanması

Bu amaçla 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 pH değerlerine sahip Likenan’lı LB

agar besiyerlerine, tanımlanması yapılan ve likenaz pozitif özellik gösteren suşlardan

çizgi şeklinde ekim yapılmıştır. Örnekler bakteri izolasyonunun gerçekleştirildiği

sıcaklık olan 55ºC’de 24 saat üretildikten sonra en iyi üreme ve enzim sentezinin

gerçekleştiği pH değeri ve aralığı koloni çapı ve aktivite zon genişliği ölçülerek (mm

olarak) saptanmıştır (Hols ve ark.,1994; Burhan ve ark. 2003).

3.2.5. Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Sıcaklık ve pH

Aralığının Saptanması

Tanımlamaları yapılan ve ilk analizlerde iyi aktivite gösteren 20 suş 20, 30,

40, 50 ve 60 ºC lerde pH değerleri 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 ve 10.0 a ayarlanmış

likenanlı LB agar besiyerinde üretilerek üreme ve enzim sentezinin sıcaklık ve pH

değerlerine göre değişimi araştırılmıştır. Örnekler 24 saat süreyle belirtilen

sıcaklıklarda inkübe edildikten sonra gereçekleşen koloni çapları ve aktivite zon

genişlikleri ölçülerek (mm olarak) en iyi üreme ve enzim sentezinin gerçekleştiği

sıcaklık değeri ve aralığı saptanmıştır (Arikan, 2008).

3.2.6. Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma

Seçilen bakteri örneklerinden en geniş zon çapı oluşturan L-12 suşu enzim

üretimi için kullanılmıştır. Bu amaçla seçilen suşun bir gecelik taze kültüründen

içerisinde likenan bulunan ve pH sı 7.0 olan sıvı LB besiyerine uygun şekilde

aşılama yapılarak 24 saat süreyle 55ºC’de 250 devir/dakikada çalkalama kültür

şeklinde üretim gerçekleştirilmiştir.


31

Elde edilen karışık kültür +4ºC ve 6000 rpm’de 20 dakika santrifüj edilerek

bakteriler kültürden uzaklaştırılmış ve sıvı faz temiz bir tüpe aktarılmıştır. Örneğin

üzerine orijinal hacmin %70’i oranında %96’lık soğuk etanol eklenmiş ve –33ºC’de

bir gece bekletilerek alkol presipitasyonu yapılmıştır.

Soğuk çöktürme ortamından alınan örnek +4ºC de 20 dakika süreyle 8000

rpm’de santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Dipte toplanan enzim çökeltisi 0.1 M’lik

pH’sı 6.8 olan sodyum fosfat tamponunda çözülerek, toplam 250 mL’lik enzim

solüsyonu elde edilmiştir. Elde edilen enzimden likenan bulunan katı besiyerine 50

µL damlatılarak aktivite kontrolü yapılmıştır (Srivastava, 1987; Arikan, 2008).

3.2.7. Enzimin pH Optimumunun Saptanması

Alkol çöktürme tekniği kullanılarak kısmi saflaştırma işlemi ile elde edilen

enzim çözeltisinin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin saptanması için Sitrat-

fosfat (pH 3.0-5.0), Na-fosfat (pH 6.0-8.0) ve Glisin-NaOH (pH 8.5-10.5) tamponları

kullanılarak %0.1’lik likenan çözeltileri hazırlanmıştır (Anonymous, 1917).

Aktivite tayini için 0.5 mL enzim çözeltisi ve her pH değerindeki substrat

çözeltisinden 0.5 mL örnek alınarak tüpe konulmuştur. Her pH değeri için üç seri tüp

analiz edilmiştir. Hazırlanan enzim substrat karışımları enzimin üretildiği sıcaklık

olan 55ºC’lik su banyosunda 30 dakika süreyle inkübe edilmiştir.

İnkübasyonun sonunda her bir örnek tüpüne eşit miktarda DNS ayıracı

konularak (1 mL enzim+substrat, 1 mL DNS) 5 dakika süreyle kaynatma işlemi

uygulanmıştır. Tüpler soğutulduktan sonra 540 nm dalga boyu kullanılarak Cecil5500

UV-visible spektrofotometresinde köre karşı (eşit hacimde substrat ve DNS ayıracı

kullanılarak hazırlanmıştır) okuma işlemi yapılmıştır (Arikan, 2008).

En yüksek absorbans değerinin elde edildiği pH değeri 100 kabul edilerek

diğer pH değerleri buna göre oranlanarak relatif enzim aktivitesi saptanmıştır

(Gessesse ve Gashe., 1997; Burhan ve ark., 2003).


32

3.2.8. Enzimin Optimum Sıcaklık Aktivitesinin Saptanması

Kısmi saflaştırma ile elde edilen enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık

değerinin saptanması için 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ve 110ºC’lik sıcaklık

değerleri seçilmiştir. İnkübasyonlardan 30-90ºC aralığındaki denemeler su

banyosunda, 100-110 ºC aralığındaki denemeler ise yağ banyosunda yapılmıştır.

Aktivite tayini için 0.5 mL enzim ve 0.5 mL substrat çözeltisi (optimum

aktivitenin gerçekleştiği pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak seçilen sıcaklık

değerlerinde 30 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir.






En yüksek absorbans değerinin elde edildiği sıcaklık değeri 100 kabul

edilerek diğer sıcaklık değerleri buna göre oranlanarak relatif enzim aktivitesi

saptanmıştır (Gessesse ve Gashe., 1997; Burhan ve ark., 2003).

3.2.9. Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin Saptanması

Likenaz enziminin sıcaklık stabilitesinin (termal stabilite) saptanması için 30-

110ºC arasındaki sıcaklık değerlerinde 15 dakikalık ön inkübasyon

gerçekleştirilmiştir (sadece enzim kullanılarak). Ön inkübasyon işleminden sonra 0.5

mL enzim ve 0.5 mL substrat solusyonu karıştırılarak optimum aktivitenin

gerçekleştiği sıcaklık değerinde 30 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilip,

standart aktivite tayini yapılmıştır (Aiba ve ark., 1983; Srivastava, 1987; Gessesse ve

Gashe, 1997; Mehrotta ve ark., 1999; Burhan ve ark. 2003; Arikan, 2008).






33


3.2.10. Likenaz Enziminin pH Stabilitesinin Saptanması

Likenaz enziminin pH stabilitesinin saptanması için pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0,

8.0, 9.0 ve 10.0 değerine sahip çözeltiler kullanılarak enzim 24 saat süreyle 37ºC ön

inkübasyon işlemine tutulmuştur. Kısmi saflaştırma ile elde edilmiş sıvı enzim

örneğinden (bütün aktiviteler için kullanılan stok enzim) her pH değeri için üçer

örnek olacak şekilde her tüpe 2 mL enzim konularak 10.000 rpm de 5 dakika

çöktürülmüştür. Üst faz atıldıktan sonra tüplere (üçerli) önceden hazırlanmış farklı

pH değerindeki tamponlardan eklenmiş ve enzim sıvılaştırılarak 37ºC de 24 saat ön

inkübasyona bırakılmıştır (Arikan, 2008).

Aktivite analizi için ön inkübasyonu yapılmış enzim ve optimum pH daki

tamponda hazırlanmış substrat çözeltisinden 0.5’er mL alınarak optimum sıcaklığın

gerçekleştiği sıcaklık değerinde 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiş ve standart

aktivite tayini yapılmıştır.

3.2.11. NaCl’ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

Sıvı enzim örneğinden 2 mL alınarak eppendorf tüpünde çöktürülmüş, sıvı

faz atılarak tüpe farklı konsantrasyonda NaCl (%3.5, %5.0, %7.5, %10.0, %15.0 ve

%20.0) çözeltilerinden 2 mL eklenmiş ve enzim tekrar resüspanse edilmiştir. Her

konsantrasyon için üç örnek hazırlanmıştır. Sıvılaştırılan enzim 37°C de 15 dakika

inkübasyona bırakılmıştır. Ön inkübasyon aşamasından sonra, 0.5 mL enzim ve 0.5

mL substrat (optimum aktivitenin görüldüğü pH değerinde hazırlanmış) karıştırılarak

optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon gerçekleştirilip

standart aktivite tayini yapılmıştır (Aygan, 2008; Arikan, 2008).


34

3.2.12. Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal İyonlarının

Etkisi

Stok enzim örneğinden her bir inhibitör için üç seri analiz yapılacak şekilde

0.5’er mL alınarak 10000 rpm’de çöktürülmüştür. Sıvı faz dökülerek ependorf

tüpüne (her tüp için ayrı ayrı olacak şekilde) 0.5 mL uygun konsantrasyonda

inhibitör madde ilave edilerek enzim süspansiyon haline getirilmiş ve 37ºC de 15

dakika süreyle inkübasyon yapılmıştır. İnhibitör madde olarak 5mM EDTA, 5mM

CaCl2, 3mM PMSF, %1v/v SDS, %1v/v Triton X-100, 5mM Na-Sülfide, 5mM

ZnCl2 ve 8M üre kullanılmıştır.

Ön inkübasyon işleminden sonra enzim örneğinin üzerine 0.5 mL optimum

pH değerinde hazırlanmış substrat karıştırılarak optimum aktivitenin elde edildiği

sıcaklıkta 30 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda

standart aktivite tayini yapılmıştır. Başlangıç enzim aktivitesini saptamak için enzim

ve substrat karışımı optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta 30 dakika inkübe

edilerek başlangıç enzim aktivitesi saptanmıştır. Başlangıç testinden elde edilen

değer 100 olarak değerlendirilip inhibitör, şelatör, deterjan ve metal iyonları ile

yapılan analiz sonunda elde edilen değerler % olarak oranlanıp, relatif olarak kalan

enzim aktivitesi saptanmıştır. (Burhan ve ark., 2003).

3.2.13. Nativ (Doğal) Jel Elektroforezinde Moleküler Ağırlık ve Zimogram

Analizi

Enzimlerin moleküler ağırlıkları ve enzim fraksiyonuna ait aktivitenin

(zimogram) analizi için Nativ jel sistemlerinden yararlanılmıştır (Laemmli, 1970).

3.2.13.1. Nativ Jel Sisteminin Hazırlanması

3.2.13.2. Ayırıcı Jel’in Hazırlanması (%10’luk)

Doğal (nativ) jel elektroforezi için kullanılacak jel bileşenleri (Sol B, Sol C,


35

Elektroforez tamponu, ve örnek yükleme tamponu) SDS’siz olarak hazırlanır.

%10’luk homojen native jel hazırlamak için 6.5 mL Sol A, 5 mL Sol B ve 8.5

mL distile su 50 mL’lik cam bir şişe içerisine ilave edilerek moleküler oksijenin

uzaklaştırılması amacı ile vakum pompasıyla 5 dakika degaz işlemi yapılmıştır.

Karışıma 66 µL %10’luk AMPS çözeltisinden, 13 µL TEMED (N,N,N,N -

tetrametilen-etilendiamin) çözeltisinden ilave edilmiş ve şişe karıştırılmıştır.

Hazırlanan solüsyon bir enjektör yardımı ile cam plaklar arasına dökülmüştür. Jel

yüzeyinin düzgün olması ve atmosferik oksijenin jele difüzyonunu engellemek amacı

ile üst yüzey ince bir su tabakası ile kapatılmıştır. Jelin polimerize olabilmesi için,

oda sıcaklığında 30-60 dakika bekletilmiştir (Bollag ve ark.,1996; Coral ve ark.,

2002; Burhan ve ark., 2003).

3.2.13.3. Dengeleme Jel’inin Hazırlanması

1 mL Sol A, 1.5 mL Sol C ve 3.5 mL distile su 20 mL’lik cam bir şişe

içerisine konmuş ve vakum pompası ile 5 dakika degaz işlemi yapılmıştır. Karışımın

üzerine 20 µL AMPS ve 5 µL TEMED çözeltisinden ilave edilerek şişe birkaç kez

karıştırılmıştır. Hazırlanan karışım, ayırıcı jelin üzerine döküldükten sonra örnek

gözlerinin oluşturulması için üst taraftan tarak yerleştirilmiştir. Atmosferik oksijen

difüzyonunu önlemek amacıyla üst yüzey su ile kaplanmış ve oda sıcaklığında 30-60

dakika süreyle polimerizasyon gerçekleştirilmiştir. Polimerizasyon işlemi

tamamlandıktan sonra tarak jelden çıkarılmış ve oluşan gözlere örneklerin daha iyi

yerleşmesi ve gözlerin bozulmaması için 100 µL elektroforez tamponu

doldurulmuştur (Bollag ve ark.,1996; Coral ve ark., 2002; Burhan ve ark., 2003).

3.2.13.4. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Polimerize olmuş jeldeki tarak, oluşan örnek yükleme gözleri yırtılmadan

çıkarılır ve örnek yükleme tamponu ile karıştırılmış protein örnekleri ceplere 30 µL

miktarda doldurulmuştur. Elektroforez işlemi sonunda moleküler ağırlıkları doğru

saptamak için gözlerden birine içeriği ve moleküler ağırlığı bilinen protein standart’ı


36

(68.000 Da ağırlığa sahip sığır serum albumininden 5 µL konmuştur) konur. Örnek

yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez uygulaması başlatılır. Örnekte

bulunan izleme boyası ayırma jeli içine girinceye kadar yaklaşık 30 mA, daha sonra

20 mA akım uygulanır. İzleme boyası jelin diğer ucuna 2 cm uzaklığa ulaştığı zaman

elektroforez işlemi sonlandırılır.

3.2.13.5. Nativ (Doğal) Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri

Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra marker proteinin yürütüldüğü

bölüm jelde kesilerek çıkartılır ve boya çözeltisine konularak 12 saat boyama

gerçekleştirilmiştir. Boyama işleminden sonra marker proteinin bulunduğu jel

destaining solüsyonuna konularak boyanın geri alınması işlemi yapılmıştır.

Analiz edilecek örneğin bulunduğu diğer jel bölümü içerisinde %3 likenan

bulunan pH’sı 6.0 olan (optimum enzim aktivitesinin gözlendiği pH değeri) 0.2 M

Na-fosfat tamponu içerisine alınmıştır. Jel 55 ºC ye konularak 50 dev/dk. da

çalkalamalı karıştırıcı kullanılarak 30 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

İnkübasyon işleminden sonra jel %0.1’lik Kongo Kırmızısı (w/v) içerisinde

15 dakika süreyle boyanmıştır. Aktivite zonlarının görülebilmesi için fazla boyanın

giderilmesi amacıyla jel 1M NaCl çözeltisinde 15 dakika inkübe edilmiştir. Kırmızı

zeminde sarı zon bölgeleri enzimin bulunduğu bölgeler şeklinde değerlendirilmiştir.

Enzim bandlarının moleküler ağırlığını saptamak amacıyla marker proteinin

bulunduğu jel bölgesi ile enzimin bulunduğu jel bölgesi birleştirilerek

görüntülenmiştir (Aygan, 2008).

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatma GÖZÜKARA

37

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Değişik ortamlardan örnekler alınarak 1’er gr tartılıp 5 ml steril distile su ile

karıştırıldıktan sonra süspansiyon haline getirilmiştir. Bacillus sp. sporlu bir bakteri

olduğundan, elde edilen süspansiyon 80ºC’de 10 dakika inkübe edilerek ısı şoku

uygulanmıştır (Lennete ve ark., 1985).

Isı şoku uygulamasından sonra tek koloni oluşumunu sağlayabilmek için

örnekten seri sulandırmalar yapılarak, LB agar besiyerine yayma şeklinde ekim

yapılmış ve 55ºC’lik etüve konularak 1 gece süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

İnkübasyon sonunda besiyerinde tek düşmüş farklı morfolojik görünüme sahip 20

koloni seçilmiş ve LB agar besiyerine çizgi şeklinde ekim yapılarak identifikasyon

ve Likenaz aktivitesinin saptanması amacı ile stok kültür şeklinde saklanmışlardır.

Enzim üretimi ve karakterizasyonu için kullanılmak üzere seçilen suşlar,

geniş ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine sahiptirler. Suşlar gram pozitif, aerob,

spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakterilerdir.

İzolasyonu ve biyokimyasal testlere göre tanımlanmaları tamamlanan 20

Bacillus sp. suşu farklı sıcaklık ve pH değerlerindeki üreme ve enzim sentezleme

yeteneklerinin saptanması için likenan içeren katı besiyerlerine çizgi yöntemine göre

ekilerek analiz edilmişlerdir. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.1. , 4.2. , 4.3. , 4.4. ve

4.5. de gösterilmiştir.


38

4.2. L-12 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları

Çizelge 4.1. 20°C ve Farklı pH Değerlerindeki İnkübe Edilen Bacillus sp. Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi

pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0 pH 8.0 pH 9.0 pH 10.0 Ö.N İnk. Sıc. K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç

1 20°C 0 0 0 0 0 2 0 2 0 3 0 2 2 20°C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 20°C 0 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 4 20°C 0 0 0 3 0 3 0 3 0 4 0 3 5 20°C 2 4 0 5 0 4 0 4 0 4 0 3 6 20°C 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 7 20°C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 20°C 0 0 0 0 0 2 0 2 0 2 0 0 9 20°C 0 2 0 4 0 4 0 3 0 3 0 3

10 20°C 2 4 2 4 0 4 0 4 2 6 0 4 11 20°C 0 3 3 4 3 6 2 5 1 3 2 5 12 20°C 0 5 0 5 0 5 0 4 1 5 2 5 13 20°C 2 10 3 10 2 12 3 10 3 12 3 10 14 20°C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 20°C 0 0 0 2 0 0 0 0 0 3 0 0 16 20°C 0 4 0 4 0 3 0 3 1 4 0 4 17 20°C 0 5 0 4 0 5 0 7 0 7 0 5 18 20°C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 20°C 0 0 2 0 1 0 0 0 1 0 3 2 20 20°C 3 9 2 6 2 10 3 11 2 8 3 10

(K.Ç: Koloni Çapı (mm); Z.Ç: Aktivite Zon Çapı (mm)

Üreme ve aktivite analizi için 20°C de yapılan inkübasyonlar sonunda pH

5.0-10.0 aralığında 2, 7, 14 ve 18 numaralı suşlarda üreme ve aktivite

gözlenmemiştir. Bir numaralı suşta bütün pH değerlerinde belirgin koloni üremesi

görülmezken (sadece çizgi şeklinde aktarılan örnek sürme bölgesi görülümekte) pH

7.0 ve 8.0 de 2 mm, pH 9.0 da 3 mm ve pH 10.0 da 2 mm aktivite zonu saptanmıştır.

Üç numaralı suşta pH 5.0 te 3 mm 6.0 da 2 mm aktivite zonu görülürken, bütün pH

değerlerinde üreme görülmemiştir.

Dört numaralı suşta pH 5.0 te üreme ve aktivite zonu bulunmazken, pH 6.0,

7.0, 8.0 ve 10.0 da 3 mm pH 9.0 da ise 4 mm aktivite zonu elde edilmiştir. Buna

karşılık bu pH değerlerinde üreme gözlenmemiştir.


39

Beş numaralı suş pH 5.0 de 2 mm koloni çapı oluşturarak üremiş fakat diğer

pH değerlerinde üreme gerçekleşmemiştir. Bununla birlikte bütün pH değerlerinde

aktivite zonu (pH 5.0 te 4 mm, 6.0 da 5 mm, 7.0, 8.0 ve 9.0 da 4 mm ve 10.0 da 3

mm) ölçülmüştür. Altı numaralı suşta pH 5.0 ve 6.0 da üreme gözlenmezken 2 mm

aktivite zonu elde edilmiştir. Diğer pH değerlerinde ise üreme ve aktivite zonu

saptanmamıştır.

Sekiz numaralı suşta bütün pH değerlerinde belirgin üreme saptanmamıştır.

Bununla birlikte pH 7.0-9.0 da 2 mm aktivite zonu saptanmıştır. Dokuz numaralı suş

bütün pH değerlerinde üreme göstermezken pH 5.0 de 2, 6.0 ve 7.0 de 4, 8.0, 9.0 ve

10.0 da 3 mm aktivite zonu ölçülmüştür. On numaralı suşta pH 5.0 ve 6.0 da 2 mm

bakteri 4 mm aktivite zonu gözlenmiştir. pH 7.0, 8.0 ve 10.0 da üreme gözlenmediği

halde 4 er mm aktivite zonu saptanmıştır. pH 9.0 da ise 2 mm bakteri, 6 mm aktivite

zonu elde edilmiştir. On bir numaralı suşta pH 5.0 te üreme görülmeden 3 mm çaplı

aktivite zonu oluşmuştur. Diğer bütün pH değerlerinde üreme ve aktivite zonu

meydana gelirken en yüksek aktivite 6 mm ile pH 6.0 da saptanmıştır. On iki

numaralı suşta ortalama 5 mm aktivite zonu saptanırken, pH 5.0, 6.0, 7.0 ve 8.0 de

üreme görülmezken diğer pH değerlerinde 1-2 mm çaplı üreme gerçekleşmiştir.

On üç numaralı suş bu sıcaklık değerinde en yüksek aktivite zonlarının elde

edildiği örnek olmuştur. Ortalama koloni çapı 2 mm olarak saptanırken, ortalama

aktivite zon çapı 10.6 mm en geniş zon ise pH 7.0 ve 9.0 da 12 mm olarak

gözlenmiştir. On beş numaralı suşta bütün pH değerlerinde belirgin üreme

görülmezken pH 6.0 da 2, 9.0 da 3 mm aktivite zonu saptanmıştır.

On altı numaralı suşta pH 9.0 da 1 mm koloni çapı oluşumu söz konusu iken

diğer pH larda üreme olmamıştır. Bununla birlikte bütün pH değerlerinde ortalama 4

mm aktivite zonu saptanmıştır. On yedi numaralı suşta hiçbir pH değerinde üreme

gözlenmezken, pH 8.0 ve 9.0 da 7 mm, diğer pH’larda ise ortalama 5 mm’lik aktivite

zonu elde edilmiştir. On dokuz numaralı suşta pH 5.0 ve 8.0 de hem üreme hemde

aktivite gözlenmemiştir. Buna karşılık pH 10.0 da 3 mm koloni çapı ve 2 mm

aktivite zonu saptanmıştır. Diğer pH değerlerinde ise üreme gerçekleşmemiş fakat

ortalama 1 mm aktivite zonu elde edilmiştir. Yirmi Numaralı suşta bütün pH

değerlerinde üreme gerçekleşmiş ve ortalama 2 mm’lik koloniler üremiştir. Bütün pH


40

değerlerinde ortalama 9 mm aktivite zonu elde edilirken, özellikle pH 7.0 ve 8.0 de

sırasıyla 10 ve 11 mm çaplı aktivite zonu saptanmıştır.

Bu değerlendirmelerin ışığında, onüç ve yirmi numaralı suşlarda bütün pH

değerlerinde üreme ve geniş aktivite zonları (ortalama 11 mm) saptanmıştır. On yedi

numaralı suşta bütün pH değerlerinde belirgin üreme görülmezken, tamamında

ortalama 5.5 mm aktivite zonu oluşmuştur (Çizelge 4.1).


pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Ö.N İnk. Sıc. K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç

1 30°C 4 14 6 12 6 15 4 12 4 15 3 15 2 30°C 4 13 3 12 4 11 3 10 4 10 3 12 3 30°C 4 13 3 14 5 12 4 10 4 10 4 15 4 30°C 5 16 4 15 4 15 3 14 4 13 5 16 5 30°C 6 16 5 14 6 14 4 14 4 14 4 15 6 30°C 4 16 4 15 4 16 4 15 4 16 5 15 7 30°C 5 17 4 16 4 15 4 14 3 14 4 15 8 30°C 5 16 3 15 4 15 3 15 4 14 3 14 9 30°C 3 6 5 15 4 13 5 15 5 12 5 14

10 30°C 4 14 3 15 3 13 3 14 3 13 3 13 11 30°C 3 10 3 10 3 10 3 12 4 10 3 11 12 30°C 5 15 3 15 3 13 3 14 3 14 4 15 13 30°C 3 10 3 10 3 10 3 10 4 10 4 15 14 30°C 4 13 3 13 3 11 3 13 4 11 4 15 15 30°C 3 12 3 14 2 11 6 20 3 18 3 20 16 30°C 3 13 4 13 4 13 5 14 3 11 6 17 17 30°C 4 18 4 20 4 20 4 20 4 18 4 18 18 30°C 4 14 4 14 4 14 5 14 5 14 3 13 19 30°C 3 9 4 15 4 12 5 12 3 14 4 15 20 30°C 3 15 4 16 3 16 3 15 3 14 4 15


İnkübasyon sıcaklığı 30°C ye yükseltildiği zaman bütün suşların test edilen

bütün pH değerlerinde üreme gösterdikleri saptanmıştır. Test edilen suşlar arasında

on yedi numaranın bütün pH değerlerinde 4 mm çaplı üreme gösterdiği bulunmuştur.

Aktivi zon çapları ise pH 6.0, 7.0 ve 8.0 de 20 mm, pH 5.0, 9.0 ve 10.0 da 18 mm

olarak ölçülmüştür. Bu sonuçlar suşun geniş bir pH aralığında üreme ve enzim


41

sentezleme yeteneğinde olduğunu göstermektedir. Suşlar arasından en iyi üreme pH

5 te beş numaralı şuşta 6 mm, pH 6 da bir numaralı suşta 6 mm, pH 7.0 de bir ve beş

numaralı suşlarda 6 mm, pH 8.0 de 15 numaralı suşta 6 mm, pH 9.0 da dokuz ve

onsekiz numaralı suşlarda 5 mm ve pH 10.0 da 16 numaralı suşta 6 mm olarak

gerçekleşmiştir. Aktivite zon çaplarının genişliği dikkate alındığında ise ph 5.0, 6.0

ve 7.0 de onyedi numaralı suş sırasıyla 18, 20 ve 20 mm ile en geniş zonu

oluşturmuştur. pH 8.0 de on beş ve on yedi numaralı suşlar 20 mm, pH 9.0 da on beş

ve on yedi numaralı suşlar 18 mm, pH 10.0 da ise on beş numaralı suş 20 mm, on

yedi numaralı suş 18 mm aktivite zonu oluşturmuşlardır. Bu sonuçlara göre bütün

suşların geniş bir pH aralığında (pH 5.0-10.0) üreme ve enzim sentezleme yeteneğine

sahip oldukları görülmektedir. Bununla birlikte özellikle on yedi numaralı suşun

bütün pH değerlerinde yüksek bir aktivite sahip olduğu saptanmıştır. On beş

numaralı suş ise daha çok pH 8.0-10.0 aralığında (alkali) geniş aktivite zonu

oluşturmuştur (Çizelge 4.2).


42


pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Ö.N İnk. Sıc. K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç

1 40°C 6 21 9 22 7 22 8 24 8 22 7 22 2 40°C 8 22 7 20 10 20 6 18 11 20 7 16 3 40°C 10 25 8 22 8 24 9 22 8 23 7 21 4 40°C 10 25 9 23 9 23 8 23 8 25 7 21 5 40°C 10 25 9 24 10 27 8 22 9 24 8 21 6 40°C 6 25 6 23 6 22 8 21 8 20 8 20 7 40°C 10 22 8 21 9 22 10 20 8 20 10 20 8 40°C 6 25 12 25 5 22 12 22 8 21 8 20 9 40°C 6 14 6 12 6 12 5 12 5 12 6 12

10 40°C 6 26 9 21 6 20 9 20 9 19 9 20 11 40°C 10 24 10 21 7 20 8 19 8 18 9 20 12 40°C 10 34 9 30 8 26 8 26 9 25 9 25 13 40°C 8 22 8 21 8 21 9 22 8 21 8 20 14 40°C 10 24 8 22 8 22 9 22 8 22 10 24 15 40°C 8 24 8 24 8 24 8 23 7 22 9 22 16 40°C 7 22 7 20 7 20 6 20 5 20 6 20 17 40°C 5 25 4 21 4 22 5 23 5 22 5 21 18 40°C 6 23 7 23 9 24 6 22 7 23 8 23 19 40°C 7 16 7 12 7 16 6 15 7 15 5 15 20 40°C 5 24 9 22 8 22 10 22 7 21 5 21


İnkübasyon sıcaklığının 40°C olarak seçildiği çalışmalarda, sıcaklığın

yükselmesine paralel olarak bütün pH değerlerinde üreme ve enzim sentezi

gerçekleşmiştir. On iki numaralı suş bütün pH değerlerinde ortalama 9 mm koloni

çapı oluşturarak ürerken, pH 5.0 te 10 mm ile en iyi üreme görülmüştür. pH 5.0 34

mm lik aktivite zonu ile aynı zamanda en geniş aktivite zonunun ölçüldüğü değer

olmuştur. pH’nın yükselmesine paralel olarak aktivite zonunun daraldığı

görülmektedir. Ortalama zon çapı dikkate alındığında bütün pH değerleri için

ortalama değer 27.6 olarak bulunmuştur. Bütün pH değerleri dikkate alındığında

üreme ve aktivite zonu en iyi olan ikinci örnek beş numaralı suştur. Ortalama koloni

çapı 9 mm aktivite zon çapı 23 mm olarak ölçülmüştür. On yedi numaralı suş bütün

pH değerlerinde ortalama 4.6 mm koloni çapı oluşurken, ortalama 23 mm aktivite

zonu saptanmıştır. Sekiz numaralı suş pH 6.0 ve 8.0 de 12 mm koloni çapı


43

oluşturarak üreme gösterirken, aktivite zonu asidik pH değerlerinde daha geniş

ölçülmüştür. Genel olarak değerlendirildiğinde bütün suşların pH 5.0 ve 6.0 da hem

daha iyi üredikleri hemde daha geniş aktivite zonu oluşturdukları bulunmuştur.

Özellikle 3, 4, 5, 7, 11, 12 ve 14 numaralı suşlar diğerlerine göre (ortalama 10 mm

koloni çapı) daha iyi üreme göstermişlerdir. Aynı suşların aktivite zon çaplarıda

diğer suşlardan belirgin şekilde geniştir (pH 5.0 te 25.8 mm, pH 6.0 da 23.3mm)

(Çizelge 4.3).

Çizelge 4.4. 50°C ve Farklı pH Değerlerindeki İnkübe Edilen Bacillus sp. Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10

Ö.N İnk. Sıc. K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç 1 50°C 7 20 6 19 5 20 6 20 7 20 5 18 2 50°C 8 17 15 19 8 19 8 18 6 18 6 17 3 50°C 8 19 8 21 9 22 9 22 7 22 10 21 4 50°C 9 21 8 21 9 24 11 23 13 25 9 21 5 50°C 8 21 8 23 10 22 9 25 9 23 9 21 6 50°C 13 20 16 28 10 21 11 21 14 21 16 21 7 50°C 17 20 11 20 10 18 13 20 14 20 15 20 8 50°C 15 23 7 24 11 22 12 22 18 27 9 22 9 50°C 8 14 6 14 7 12 5 12 6 11 7 11 10 50°C 9 18 11 22 9 20 10 21 8 21 8 19 11 50°C 8 19 9 19 14 21 11 21 8 20 10 20 12 50°C 12 27 16 29 23 36 20 35 19 35 21 31 13 50°C 10 21 9 19 10 21 11 24 8 20 9 19 14 50°C 10 22 11 21 17 27 11 24 23 27 10 21 15 50°C 10 24 10 21 11 27 11 21 6 17 6 16 16 50°C 7 20 11 22 9 22 8 21 8 22 8 21 17 50°C 5 21 6 21 7 17 7 20 6 16 6 16 18 50°C 10 22 7 22 17 24 7 23 16 22 12 21 19 50°C 6 11 6 12 8 13 6 11 5 12 4 - 20 50°C 11 21 10 21 10 22 9 25 7 22 6 22


İnkübasyon sıcaklığı 50°C ye yükseltildiği zaman bütün pH değerlerinde

bütün suşların daha iyi üredikleri görülmektedir. On iki numaralı suşun bütün pH

değerlerinde ortalama 18.5 mm koloni çapı oluşturarak ürediği saptanmıştır. En iyi

üreme ise 23 mm ile pH 7.0 de gerçekleşmiştir. En geniş aktivite zonu 36 mm ile pH


44

7.0 de gözlenirken, pH 8.0 ve 9.0 da 35 er mm’lik aktivite zonu ölçülmüştür. On iki

numaralı suşun bütün pH değerlerinde ortalama 32.6 mm aktivite zonuna sahip

olduğu saptanmıştır. On iki numaralı suşta pH 7.0 den itibaren hem koloni çapı

hemde aktivite zon genişliği artmıştır. Zon koloni oranlaması yapıldığında aktivite

zonunun koloni çapına göre 1.6 kat olduğu görülmektedir. On yedi numaralı suşta ise

üreme ve zon oluşumu pH 5.0 ve 6.0 da daha yüksek (ortalama koloni çapı 5.5 mm,

zon çapı 21 mm) iken pH arttıkça üremenin daha iyi olduğu buna kariışık aktivite

zonunun daraldığı görülmektedir. On yedi numaralı suşta zon koloni oranlaması

yapıldığı zaman zon çapının koloni çapından ortalama 4 kat geniş olduğu

görülmektedir. Ondokuz numaralı suşta pH 10 da 4 mm koloni çapı oluşurken,

aktivite zonu saptanmamıştır. Bu sonuca göre ondokuz numaralı suşun enzim

sentezleme yeteneğinin pH 9.0 da sona erdiği görülmektedir (Çizelge 4.4).


45

Çizelge 4.5. 60°C ve Farklı pH Değerlerindeki İnkübe Edilen Bacillus sp. Bakterilerinin Katı Besiyerindeki Likenaz Aktivitesi pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10

Ö.N İnk. Sıc. K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç K.Ç Z.Ç 1 60°C 5 7 5 11 4 7 8 9 5 10 7 8 2 60°C 13 21 6 17 12 17 34 20 9 21 22 24 3 60°C 4 17 6 19 4 18 7 20 9 24 8 24 4 60°C 9 21 6 21 4 19 10 20 16 27 23 30 5 60°C 10 19 6 17 7 16 10 23 12 21 6 15 6 60°C 5 20 4 22 6 22 6 21 7 20 9 25 7 60°C 4 20 5 19 6 20 5 21 7 24 8 20 8 60°C 7 21 5 21 5 20 6 23 14 25 7 24 9 60°C 4 7 3 11 4 10 5 9 6 10 5 9

10 60°C 4 16 4 17 12 22 10 15 8 20 10 19 11 60°C 11 18 4 18 6 17 6 21 22 20 11 21 12 60°C 5 21 5 21 5 22 6 23 21 25 6 26 13 60°C 5 16 5 15 5 16 5 16 6 15 5 13 14 60°C 5 14 8 19 6 19 10 23 10 22 7 21 15 60°C - - - - - - 7 14 7 13 10 13 16 60°C - 10 4 18 6 22 6 21 7 24 24 30 17 60°C - 5 - - - 6 9 13 6 13 4 - 18 60°C - 5 7 15 5 20 5 22 6 22 10 24 19 60°C - 5 - 16 - 13 - 12 - 12 - - 20 60°C - - - - - - - 17 5 26 - -


İnkübasyon sıcaklığı 60°C olarak seçilen çalışmalarda en iyi üreme iki

numaralı suşta gerçekleşmiştir. Farklı pH değerlerinde çok farklı koloni çapı

ölçülmüştür. Sırası ile pH 5.0 te 13, 6.0 da 6, 7.0 de 12, 8.0 de 34, 9.0 da 9 ve 10.0 da

22 mm koloni çapları elde edilmiştir.

On iki numaralı suş pH 9.0 da 21 mm koloni çapı oluşturarak üreme

gösterirken, diğer pH değerlerinde ortalama 5 mm koloni çapı saptanmıştır (Bu pH

değerlerindeki ortalama aktivite zon çapı 23 mm dir). On beş numaralı suşta pH 5.0,

6.0 ve 7.0 de üreme ve enzim üretimi gerçekleşmemiştir. pH 8.0, 9.0 ve 10.0 ise

ortalama 8 mm koloni çapı oluşturacak şekilde üreme ve ortalama 13 mm zon çapı

oluşumu gözlenmiştir. On altı numaralı suş pH 5.0 te belirgin şekilde üremediği

halde 10 mm aktivite zonu oluşmuştur. pH 6.0-9.0 aralığında ortalama 6 mm koloni

çapı saptanırken, aynı pH değerlerindeki aktivite zonlarının ortalama genişliği


46

ortalama 21 mm olmuştur. pH 10.0 da ise koloni çapı 24 mm, aktivite zon genişliği

30 mm olmuştur. Yirmi numaralı suş ile yapılan çalışmalarda pH 5.0-7.0 aralığında

üreme ve enzim sentezi saptanmamıştır. pH 8.0 de üreme gerçekleşmediği halde

(belirgin) 17 mm genişliğinde aktivite zonu oluşmuştur. pH 9.0 da 5 mm çapında

koloni oluşumu ve 26 mm genişliğide aktivite zonu gözlenmiştir. pH 10.0 da ise

üreme ve enzim sentezi gerçekleşmemiştir (Çizelge 4.6).

Bu sıcaklık değerindeki üreme ve aktivite zon çapının ortalama genişlikleri

dikkate alındığında on iki numaralı suşta aktivite zon genişliğinin koloni çapının

ortalama üç katı olduğu saptanmıştır. Bu özelliği, bütün pH değerlerinde birbirine

yakın aktivite zon genişliği oluşturması ve bütün sıcaklık değerlerinde üreme ve

yüksek enzim sentezi gerçekleştirmesi nedeni ile on iki numaralı suş, çalışmanın

amaçları doğrultusunda enzim üreticisi olarak seçilmiştir.

Literatür verilerinde Bacillus sp. sularının katı besiyerinde farklı pH ve

sıcaklık değerlerinde üreme ve aktivite zonu ile ilgili değişik çalışmalar vardır.

Lin ve ark (1998), Bacillus sp. TS-23 suşunun enzim sentezinin 42-60°C

sıcaklıkta ve optimum 55°C’de meydana geldiğini belirtmişlerdir. Hakamada ve ark

(2002), Bacillus circulans’dan izole ettikleri alkalin endoglukanazın pH 8.5’da

55°C’de optimal aktivite gösterdiğini saptamışlardır. L-12 suşu ile yapılan

çalışmalarda optimum enzim sentezinin 50°C de gerçekleştiğinin bulunması

Hakamada ve arkadaşlarının bulguları ile tam bir uyum göstermektedir. Yine, Bajbai

ve Bajbai (1987)’de yapmış oldukları çalışmalarda Bacillus licheniformis TCRDC-

B13 suşu için enzim üretimi ve üreme sıcaklığının 25-50°C de ve maksimum enzim

üretiminin ise 35°C’de gerçekleştiğini bulmuşlardır.

Katı besiyerinde farklı sıcaklık ve pH değerlerinde L-12 suşu ve enzim

aktivitesine ait görüntüler şekil 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ve 15 de

görülmektedir.


47

Şekil 4.1. L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 20°C, pH 5.0, 6.0, 7.0 ve 8.0 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.

Şekil 4.2. L-12 suşunun katı besiyerinde üremesi 20°C, pH 9.0 ve 10.0 da gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.


48




49




50




51




52

4.3. Enziminin Optimum pH Aralığına Ait Bulgular

L-12 likenaz enzimi üç farklı tampon sistemi (Sitrat-fosfat pH 3.0-5.0, Na-

fosfat, pH 6.5-8.0 Glisin-NaOH, pH 8.5-10.0) kullanılarak en iyi aktivite gösterdiği

pH değeri ve aralığının saptanması için analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar

Çizelge 4.6 da gösterilmiştir.

Çizelge 4.6. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait Bulgular

pH Değerleri İnk. Sıc. Absorbans AB1 AB2 ABO

Rölatif Aktivite

% 3 55°C 550 0.161 0.187 0.174 74 4 55°C 550 0.211 0.183 0.197 84 5 55°C 550 0.205 0.194 0.200 85 6 55°C 550 0.182 0.285 0.234 100 7 55°C 550 0.231 0.198 0.214 92 8 55°C 550 0.195 0.219 0.207 88

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi optimum aktivteyi pH 6.0 da göstermiştir.

Analiz edilen diğer pH değerlerinde sırasıyla pH 3.0 te %74, 4.0 te %84, 5.0 te %85,

7.0 de % 92 ve 8.0 de %88 relatif aktivite elde edilmiştir. Bütün pH değerleri dikkate

alındığı zaman ortalama genel aktivite %87.1 olarak saptanmıştır. pH 4.0-8.0

aralığındaki ortalama aktivite yaklaşık %90 olarak gerçekleşmiştir.

Enzim pH 3.0-6.0 aralığında ortalama %86 aktiviteye sahiptir. Optimum

aktivite değeri dahil test edilen bütün pH değerlerinde oldukça yüksek bir aktivite

elde edilmesi enzimin etki spektrumunun çok geniş olduğunu göstermektedir. Elde

edilen bulgular çizelge 4.6 da sayısal, şekil 4.11 de grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu

sonuçlara göre Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi asidoalkalofilik özellik

göstermektedir.


53

50

60

70

80

90

100

110

3 4 5 6 7 8

pH Değerleri

Rela

tif E

nzim

Akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.11. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerine Ait

Sonuçlar

Birçok araştırmacı değişik organizmalarda alkalin özellik gösteren çok sayıda

endoglukaz enzimi izolasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Robson ve Chambliss (1984),

Hreggvidsson ve ark (1996), Tahara ve ark (1997), Mawadza ve ark (2000), George

ve ark (2001), Murashima ve ark (2002), Saha (2004), Huang ve ark (2004), Li ve

ark (2006), Voget ve ark (2006), izolasyonun gerçekleştirdikleri selülaz enzimlerinin

optimum pH 4.0 ve 7.0 aralığında aktivite gösterdiklerini belirtmişlerdir. Jung ve ark.

(2007) Bacillus sp. A8-8 bakterisinden izole edilen termostabil likenaz enziminin

optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 6.0 olduğunu belirtmişlerdir. Li ve ark.

(2006), Bacillus sp. AC-1 bakterisinden izole edilen termoasidofilik endoglukanaz

enziminin optimum aktiviteyi pH 4.5-6.5 aralığında gösterdiğini belirtmişlerdir. Fu

ve ark. (2008), Bacillus subtilis bakterisinden izole edilen şimerik termostabil likenaz

enziminin optimum aktivitesini pH 5.0 te gösterdiğini saptamışlardır. Eckert ve

Schneider (2003), Alycyclobacillus acidocaldarius organizmasından izole edilen

termoasidofilik endoglukanaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değerini 4.0

olarak saptamışlardır. Ri ve ark. (2009), Laetiporus sulphureus var. miniatus

organizmasından elde edilen termostabil β-(1,3)-(1,4)-glukanaz enziminin optimum

aktivitesini pH 4.0 te gösterdiğini saptamışlardır. Yernool ve ark (1998), iki


54

termostabil endoselülaz izole etmiş ve optimum enzim aktivitesinin pH 6.0-6.6 da

gerçekleştiğini bildirmişlerdir.

Çalışmamızda izolasyonu L-12 likenaz enzimi optimum aktivitesini pH 6.0

da göstermiştir. Bu özellik, literatür verilerinin bir çoğu ile birebir uyum

içerisindedir. Literatür verilerinde likenaz enzimleri ile elde edilen en düşük pH

değeri 4.0 iken (Voget ve ark.,2006), L-12 likenaz enziminin pH 3.0 te %74 aktivite

göstermesi ve pH spektrumunun genişliği dikkate alındığında enzimin

literatürdekilerden çok daha geniş kullanım alanına sahip olduğu düşünülmektedir.

4.4. L–12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine

Ait Sonuçlar

L-12 likenaz enziminin optimum aktiviteyi gösterdiği sıcaklık değerinin

saptanması için 30°C-110°C arasındaki sıcaklıklarda optimum pH değerinde

hazırlanmış substrat kullanılarak standart aktivite analizleri gerçekleştirilmiştir.

Çizelge 4.7. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Bulgular

İnk. Sıc.

İnk. pH’sı Absorbans A1 A2 AO

Rölatif Aktivite

% 30 6 550 0.214 0.222 0.218 66 40 6 550 0.231 0.218 0.224 67 50 6 550 0.303 0.186 0.244 73 60 6 550 0.292 0.240 0.266 80 70 6 550 0.299 0.236 0.267 80 80 6 550 0.309 0.319 0.314 95 90 6 550 0.345 0.293 0.319 96

100 6 550 0.300 0.365 0.332 100 110 6 550 0.306 0.316 0.311 94

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi optimum aktivitesini 100°C de göstermiştir.

Enzim 60 ve 70°C lerde %80 aktivite gösterirken 80°C %95, 90°C de ise %96

aktivite göstermiştir. Sıcaklık 110°C ye yükseltildiğinde (yağ banyosunda


55

inkübasyon yapılmıştır) enzim aktivitesi %94 e düşmüştür.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi 60-110°C’ler arasında ortalama %91 aktivite

göstermektedir. Enzimin üretim sıcaklığından daha düşük olan 30-50°C’ler

arasındaki ortalama aktivitesi ise %69 düzeyindedir. Optimum aktivite için test

edilen bütün sıcaklıklar (30-110°C) dikkate alındığı zaman Bacillus sp. L-12 likenaz

enziminin ortalama aktivite değeri %83.4 olarak hesaplanmıştır.

Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin bu özellikleri dikkate alındığında

özellikle yüksek sıcaklıklarda (80-110°C arasındaki değerlerde ortalama %96.25

aktiviteye sahiptir) %95’lerden daha yüksek aktiviteye sahip olduğu görülmektedir.

Bu nedenle enzim yüksek düzeyde termofil özellik göstermektedir. Diğer taraftan

enzimin test edilen bütün sıcaklık değerlerinde %66’nın üzerinde aktivite göstermesi,

özellikle termofil aralık öncelikli olmak üzere bütün sıcaklık değerlerinde hemen her

türlü alanda kullanılabilecek özelliğe sahip olduğunu göstermektedir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimine ait optimum aktivite sıcaklığı ile ilgili

sonuçlar çizelge 4.7 de sayısal, şekil 4.12 de grafiksel olarak verilmiştir.

50556065707580859095

100105

30 40 50 60 70 80 90 100 110

İnkübasyon Sıcaklığı (ºC)

Rel

atif

Enzi

m A

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.12. L-12 Likenaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine

Ait Sonuçlar


56

Literatür verilerinde optimum aktivite sıcaklığı farklı olan çok sayıda

endoglukanaz enzimi yer almaktadır. Bunlar içerisinde asidik özellikte olan

endoglukanaz enzimlerinin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerleri farklılık

göstermektedir. Mawadza ve ark, (2000), izole edilen endoglukanaz enziminin

optimum aktivitesini 65-70°C, Li ve ark. (2006), elde edilen endoglukanaz enziminin

70°C Huang ve Monk (2004) izole ettikleri endoglukanaz enziminin optimum relatif

aktivitesini 80°C de gösterdiğini saptamışlardır. Bischoff ve ark, (2006), termofilik

Bacillus licheniformis B-41361’den izole edilen endoglukanaz enziminin optimum

sıcaklığını 65ºC olarak belirtmişlerdir. Ri ve ark. (2009), Laetiporus sulphureus var.

miniatus suşundan elde edilen β-(1,3)-(1,4)-glukanaz enziminin optimum aktivitesini

75°C de gösterdiğini bulmuşlardır.

Yernool ve ark (1998), izolasyonunu gerçekleştirdikleri iki termostabil

endoglukanaz enziminin optimum aktivitesini 95°C de gösterdiğini saptamışlardır.

Zverlov ve ark. (1997) Thermotoga neopolitana suşundan izole edilen yüksek

düzeyde termostabil 1,3-beta endoglukanaz enzimlerinden 73 kDa büyüklükteki

fragmentin optimum aktivitesini 95°C, 52 kDa büyüklükteki fragmentin 85°C de

göstediğini saptamışlardır. Çalışmamızda Termofil Bacillus sp. suşundan izole

ettiğimiz L-12 likenaz enzimi optimum aktivitesini 100ºC de göstermektedir.

Literatür verilerinden daha yüksek optimum aktivite sıcaklığına sahip olan enzim,

hiper termofilik özelliktedir.

4.5. L-12 Likenaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Sonuçlar

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi pH stabilitesinin saptanması için pH 3.0-

10.0 aralığında 24 saat 37ºC de ön inkübasyona tabi tutulmuştur. Sıvılaştırma

tamponu içerisindeki enzimle başlangıç aktivite değerinin saptanması için analiz

yapılmış ve bu değer 100 şeklinde alınarak, ön inkübasyon sonucu elde edilen

değerler oranlanmışlardır. Analizler sonunda elde edilen bulgular Çizelge 4.8 de

gösterilmiştir.


57

Çizelge 4.8. L-12 Likenaz Enzimine Ait pH Stabilite Sonuçları

pH Ön İnk. Sıcaklığı

Ön İnk.

Süresi

İnk. Süresi

İnk. Sıcaklığı AB1 AB2 ABO

% Kalan

aktivite

Kont - - 30 100°C 0.320 0.344 0.332 100 3 37 24 h 30 100°C 0.292 0.240 0.266 80

4 37 24 h 30 100°C 0.296 0.256 0.276 83

5 37 24 h 30 100°C 0.305 0.308 0.306 92 6 37 24 h 30 100°C 0.340 0.298 0.319 96 7 37 24 h 30 100°C 0.258 0.300 0.279 84

8 37 24 h 30 100°C 0.296 0.238 0.267 80 9 37 24 h 30 100°C 0.294 0.230 0.262 79

10 37 24 h 30 100°C 0.240 0.232 0.236 71 Ön inkübasyondan geçirilmemiş enzimden elde edilen aktivite sonucu ile

karşılatırıldığı zaman kalan enzim aktivitesinin 24 saat sonunda pH 6.0 da %96

olduğu bulunmuştur. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin stabilitenin

en iyi olduğu pH değeri olduğu görülmektedir.

Enzim pH 3.0-6.0 aralığında ortalama %88 stabilitesini korumuştur. pH

aralığı 3.0-8.0 e çıkarıldığında stabilitenin ortalama %86 korunduğu görülmektedir.

pH aralığı 9.0-10.0 olarak seçildiğinde aktivitenin %75 korunduğu saptanmıştır.

Stabilite çalışmaları için seçilen bütün pH değerleri dikkate alındığında ise (pH 3.0-

10.0) orijinal aktivitenin 24 saatlik 37°C deki inkübasyon sonunda ortalama %83

devam ettiği saptanmıştır. Enzim yüksek düzeyde pH stabil özellik taşımaktadır.

Bu sonuçlar Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin asidik bölgede ( pH 3.0-6.0)

daha yüksek bir stabiliteye sahip olmakla birlikte (ortalama %88), pH 3.0-10.0

aralığındaki bütün pH değerlerinde 24 saat süreyle 37 ºC de başlangıç aktivitesini

yaklaşık %83 koruyarak yüksek düzeyde stabil olduğunu göstermektedir. Enzim

asidoalkaline stabil özelliktedir. Bacillus sp. L-12 likenaz enzimiyle ilgili sonuçlar

çizelge 4.8 de sayısal, şekil 4.13 te grafiksel olarak gösterilmiştir.


58

60

70

80

90

100

3 4 5 6 7 8 9 10

pH Değeri

Kal

an R

elat

if En

zim

Akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.13. L-12 Likenaz Enziminin pH Stabilite Grafiği

George ve ark, (2001), izole edilen endoglukanaz enziminin pH 5.0 de ve

50ºC de 1 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise

aktivitenin %55’e düştüğü gözlemlemişlerdir.

Li ve ark (2006), Ba-EGA endoglukanaz enziminin pH 7.5 ve 10.5 te 30ºC de

2 saat inkübasyon sonunda başlangıç aktivitesini %80’in üzerinde devam ettirdiğini

belirtmişlerdir.

Tabernero ve ark (1994), alkalofilik Bacillus sp. suşundan izole ettikleri ve

Escherichia coli’ye klonlanan BgaA’nın likenaz enziminin pH 6-12 pH arasında ve

70ºC 1 saatlik inkübasyon sonrasında aktivitesinin %65’ini koruduğunu

belirtmişlerdir.

Zhu ve ark. (2008), yeni izole edilen beta 1,3 endoglukanaz enziminin pH

5.0-8.0 aralığında 25 dakika süreyle aktivitesini koruduğunu belirtmişlerdir. Jung ve

ark. (2007) Bacillus sp. A8-8 suşundan izole edilen termostabil β-(1,3-1,4)-glukanaz

enziminin pH 9.0-12.0 aralığında 2 saatlik inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini

%40’ın üzerinde koruduğunu belirtmişlerdir.

Bacillus circulans suşundan izole edilen ve optimum aktivitesini pH 8.5 ve

55ºCde gösteren endoglukanaz enziminin, pH 5.0-11.0 aralığında ve 30ºC’de 1


59

saatlik inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini %100’e yakın koruduğu

bulunmuştur (Hakamada ve ark, 2002). Bacillus sp. HSH-810 suşundan izole edilen

alkalin endoglukanaz enziminin pH 7.0–9.0 aralığında ve 50ºC 10 dakika inkübe

edildiğinde aktivitenin yaklaşık %10 kaybolduğu saptanmıştır (Kim ve ark, 2005).

L–12 likenaz enzimin 24 saat süreyle 37ºC de ön inkübasyondan geçirilip

aktivite analizi yapıldığı zaman pH 3.0–10.0 aralığında orjinal aktivitesini ortalama

%83.1 koruduğu bulunmuştur. Ön inkübasyon süresinin uzunluğu ve stabilite

sonuçlarının yüksekliği L-12 likenaz enziminin literatür bilgilerinden çok daha

yüksek ve geniş pH aralığında stabiliteye sahip olduğunu göstermektedir. L-12

likenaz enzimi asido-alkali pH stabil özelliktedir.

4.6. L–12 Likenaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar

L–12 likenaz enziminin termal stabilitesini saptamak için 30–110ºC

aralığında 15 dakikalık ön inkübasyon uygulamaları gerçekleştirilmiştir. Enzimin 30-

60 ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde orijinal aktivitesini ortalama %92.5, 30-70

ºC aralığında ortalama %90.6, 70-90 ºC aralığında ortalama %79, ve 100-110 ºC

aralığında ortalama %66.5 koruduğu belirlenmiştir.

Ön inkübasyon sıcaklık aralığı 80-110 ºC seçildiğinde enzimin ortalama %72

kalan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Ön inkübasyon işleminden sonra ölçülen

kalan aktivite değerleri bütün sıcaklıklar dikkate alındığında ortalama %82.2 olarak

saptanmıştır.

Elde edilen sonuçlar sayısal olarak çizelge 4.9, grafiksel olarak şekil 4.12 de

gösterilmiştir. Bu bulgular likenaz enziminin termostabil özellikte olduğunu

göstermektedir.


60

Çizelge 4.9. L–12 Likenaz Enzimine Ait Termal Stabilite Sonuçları

Ön İnk. Sıcaklığı

Ön İnk

Süresi

İnk. Süresi

İnk. Sıcaklığı AB1 AB2 ABO

% Kalan

Aktivite

Kontrol - 30 100°C 0.346 0.331 0.338 100

30 15 30 100°C 0.327 0.321 0.324 96.0

40 15 30 100°C 0.327 0.303 0.315 93.0

50 15 30 100°C 0.320 0.296 0.308 91.0

60 15 30 100°C 0.295 0.312 0.303 90.0

70 15 30 100°C 0.282 0.280 0.281 83.0

80 15 30 100°C 0.269 0.251 0.260 77.0

90 15 30 100°C 0.269 0.251 0.260 77.0

100 15 30 100°C 0.234 0.228 0.231 68.0

110 15 30 100°C 0.222 0.216 0.219 65.0

Hakamada ve ark, (1997), alkalofilik Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen

ve optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık

inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de %100 koruduğunu, 40ºC’de

aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü belirtmiştir.

Endo ve ark, (2001) optimum aktivite sıcaklığı 55ºC olan alkalin

endoglukanaz enziminin, orijinal aktivitesini 40ºC ve 15 dakika inkübasyon sonunda

%100’e yakın koruduğunu, ortam sıcaklığı 60ºC’ye yükseltildiğinde ise aktivitenin

yaklaşık %50 düzeyine düştüğünü belirtmişlerdir.


61

Şekil 4.14. L–12 Likenaz Enziminin Termal Stabilite Grafiği

Bacillus circulans suşundan üretilen alkalin endoglukanaz enziminin, 15

dakikalık ön inkübasyon sonunda, orijinal aktivitesini 55ºC’de tamamen koruduğunu,

60ºC de ise aktivitenin %50’ye düştüğü, sıcaklığın 65ºC‘ye yükseltilmesiyle

aktivitenin tamamen kaybolduğu saptanmıştır (Hakamada ve ark., 2002).

Fu ve ark. (2008), Bacillus subtilis suşundan elde edilen şimerik termostabil

likenaz enziminin 90 ºC de 10 dakikalık ön inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini

yaklaşık %83. oranında koruduğunu belirtmişlerdir.

Zverlov ve ark. (1997) Thermotoga neapolitana suşundan izole edilen yüksek

düzeyde termostabil 1,3-beta endoglukanaz enzimine ait 73 kDa’luk fragmentin 30

dakika süreyle 100 ºC de ön inkübasyonundan sonra orijinal aktivitesinin %57 ye

düştüğünü belirtmişlerdir.

Bacillus sp. L–12 likenaz enzimine ait termal stabilite sonuçları literatür

verilerinden oldukça yüksek değerlere sahip olup, enzim termostabil özellik

göstermektedir.

50

60

70

80

90

100

110

Kont 30 40 50 60 70 80 90 100 110Ön İnkübasyon Sıcaklığı (°C)

Kal

an R

elat

if E

nzim

Akt

ivite

si (%

)


62

4.7. L-12 Likenaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl’ün Etkisine Ait

Sonuçlar

Bacillus sp. L-12 likenaz enzim aktivitesi üzerine farklı NaCl

konsatrasyonlarının etkisi %3.5-20 aralığında değişen konsantrasyonlarda test

edilmiştir. Elde edilen bulgular çizelge 4.10 da sayısal, şekil 4.15 de grafiksel olarak

gösterilmiştir.

Çizelge 4.10. Farklı NaCl Konsantrasyonlarının L-12 Likenaz Enzimin Aktivitesine Etkisi

NaCl % Molar

Ön İnk. Sıc.

Ön İnk. Sür.

İnk. Sıc.

İnk. Sür. Abs Ab1 Ab2 Abort

Kalan Aktivite

%

Kont 55 30 100°C 30 550 0.956 0.894 0.925 100.00

3.5 0.60 55 30 100°C 30 550 0.612 0.560 0.586 63.00

5.0 0.86 55 30 100°C 30 550 0.542 0.578 0.560 61.00

7.5 1.29 55 30 100°C 30 550 0.606 0.630 0.618 67.00

10.0 1.74 55 30 100°C 30 550 0.510 0.502 0.506 55.00

15.0 2.58 55 30 100°C 30 550 0.515 0.498 0.506 55.00

20.0 3.44 55 30 100°C 30 550 0.498 0.480 0.489 53.00

Yapılan analizler sonunda 55 ºC de 30 dakikalık ön inkübasyondan sonra en

yüksek aktivite değeri %7.5 NaCl konsantrasyonunda %67 olarak bulunmuştur.

%3.5-7.5 NaCl kullanıldığında ortalama kalan enzim aktivitesi %62 olarak

gerçekleşirken, %10-20 NaCl konsantrasyonunda ortalama % 54.33 olarak

saptanmıştır. Genel olarak değerlendirildiğinde %3.5-20 NaCl aralığındaki ortalama

enzim aktivitesi %59 olarak gözlemlenmiştir.

Kullanılan NaCl konsantrasyonları ayrı ayrı değerlendirildiğinde elde edilen

kalan enzim aktivite değerleri %3.5, %5.0, %7.5, %10.0, %15.0 ve %20.0 NaCl

konsantrasyonları için sırasıyla %63, %61, %67, %55, %55 ve %55 olarak

bulunmuştur. NaCl konsantrasyonu %10-20 aralığında kullanıldığı zaman %7.5


63

konsantrasyona göre aktivitedenin ortalama %12.6 azaldığı saptanmıştır.

40

45

50

55

60

65

70

3,5 5 7,5 10 15 20

NaCl Konsantrasyonları (%)

Kal

an R

elat

if En

zim

Akt

ivite

si

Şekil 4.15. L-12 Likenaz Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı NaCl

Konsantrasyonlarının Etkisi

Wang ve ark. (2009), Salinivibrio sp. NTU-05 suşundan izole edilen

halostabil endoglukanaz enziminin %0-25 aralığında değişen geniş bir NaCl

konsnatrasyonunda aktif olduğunu ve optimum aktivitenin %5 NaCl

konsantrasyonunda elde edildiğini bildirmişlerdir. NaCl konsantrasyonunun %15 den

25 e yükseltilmesiyle aktivitenin kaybolduğu bildirilmiştir. NaCl konsantrasyonu

%25 olarak seçildiğinde enzim aktivitesi 4 saat sonunda %24 e düşmüştür.

Aygan (2008), Bacillus sp. C-14 suşundan izole edilen endoglukanaz

enziminin %3-7 NaCl bulunduğunda 60 dakikalık inkübasyon sonunda orijinal

aktivitesini %70 koruduğu bulunmuştur.

Hirasawa ve ark (2006), alkalifilik Bacillus agaradhaerens’ten izole edilen

endoglukanaz enziminin, farklı sıcaklık ve pH’larda aktivitesi üzerine tuzların

etkisini araştırmışlardır. 0.2M tuz konsantrasyonunun enzim aktivitesini 4 kat

(%400) artırdığını ve 0.2–1.5 M aralığında aktivitenin sabit kaldığını, tuz

konsantrasyonun artmasına paralel olarak aktivitede keskin bir düşüşün gözlendiğini

belirtmişlerdir.


64

Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin optimum aktivite gösterdiği NaCl

konsantrasyonu literatürden daha yüksek olup, enzim halotolerant özelliktedir.

4.8. L-12 Likenaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal

İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar

L-12 likenaz enzim aktivitesine şelatör, metal iyonları, inhibitörler ve

deterjanların etkisinin araştırılması amacı ile 5 mM EDTA, 5mM CaCL2, 3 mM

PMSF, 5 mM NaSO3, 5 mM ZnCL2, 8M Üre, %1 w/v SDS, %1 v/v ve Triton X-100

kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar sayısal olarak Çizelge.4.11, grafiksel olarak şekil

4.16 da verilmiştir.

Çizelge 4.11. L-12 Likenaz Enzimi Üzerine Şelatör, Metal İyonları, Deterjanlar ve İnhibitörlerin Etkisi

İnhibitör İnhibitör Kons.

Ön İnk Sıc

İnk Sıc

Ön İnk Süre dk

İnk Süre dk

AB1 AB2 ABO %

Kalan Aktivite

Kont Yok - 100 30 0.349 0.361 0.355 100.0

EDTA 5 mM 37 100 15 30 0.341 0.347 0.344 97.00

CaCl2 5 mM 37 100 15 30 0.340 0.332 0.336 95.00

PMSF 3 mM 37 100 15 30 0.188 0.210 0.199 56.00

SDS %1 w/v 37 100 15 30 0.140 0.132 0.136 38.00

TRİT %1 v/v 37 100 15 30 0.350 0.364 0.357 101.0

Na2SO3 5 mM 37 100 15 30 0.140 0.148 0.144 40.00

ZnCL2 5 mM 37 100 15 30 0.131 0.125 0.128 36.00

Üre 8 M 37 100 15 30 0.120 0.100 0.110 31.00

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi EDTA ve CaCl2 kullanılan testlerde stabil

kalarak sırası ile %97 ve %95 oranında orijinal aktivitesini korumuştur. Bu sonuç

enzimin metallo enzim özelliği taşımadığını göstermektedir. Enzim PMSF ile %56


65

oranında inhibe olmuştur. L-12 likenaz enzimi SDS ile %62 oranında aktivitesini

kaybederken non iyonik deterjan olan triton-X 100 ile %101 oranında aktivite

göstermiştir. Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi Na2SO3, ZnCL2 Üre kullanılan

çalışmalarda orijinal aktivitesini sırası ile % 60, %64 ve %69 oranında kaybetmiştir.

Literatür bulgularında EDTA ile gerçekleştirilen aktivite çalışmalarında kalan

enzim aktivitesinin %90-95 aralığında gerçekleştiği belirtilmiştir (Singh ve ark,

2001; Huang ve Monk, 2004; Li ve ark, 2006).

Huang ve Monk, (2004), Termofilik aerobik Caldibacillus cellulovorans

bakterisinden izole edilen CMCase enzimine ait orijinal aktivitesinin Zn ile önemli

derecede inhibe edildiğini belirtmişlerdir. L-12 likenaz enziminden elde edilen sonuç

literatürle uyum içindedir. Jung ve ark. (2007), Bacillus sp. A8-8 bakterisinden izole

edilen termostabil β-1,3-1,4 glukanaz enziminin 5 mM EDTA ile aktivitesini

koruduğunu ve etkilenmediğini, buna karşılık Ca ile aktivitenin arttığını

belirtmişlerdir. Aynı araştırma ekibi birçok β-1,3-1,4 glukanaz enziminin Ca ve Co

iyonları ile aktivitelerinin arttığını buna karşılık EDTA, Zn ve Fe ve Mn ile

aktivitenin inhibe edildiğini belirtmişlerdir.

Ng Son ve ark. (2009), termofilik Geobacillus sp. 70PC53 bakterisinden izole

edilen ve geniş bir sıcaklık aralığında stabilite gösteren CelA endoglukanaz

enziminin konsantrasyona bağlı olarak Zn ve Cu iyonları ile güçlü şekilde inhibe

edildiğini, buna karşılık Ca ile azda olsa sitümüle edildiğini belirtmişlerdir. Aynı

araştırma grubu CelA endoglukanaz enzim aktivitesinin Na, Mg ve EDTA ile

etkilenmediğini belirtmişlerdir. Ng Son ve ark. (2009), CelA endoglukanaz enzim

aktivitesinin 2-merkaptoethanol (β-mercaptoethanol) ile dramatik şekilde arttığını

belirtmişlerdir.

Li ve ark. (2006) Bacillus sp. AC.1 bakterisinden izole edilen termoasidofilik

endoglukanaz enziminin %0.5 SDS ile %66 oranında inhibe olurken, %0.25 triton X-

100 ile %127 aktive edildiğini belirtmişlerdir. Aynı enzimin 5 mM EDTA ile orijinal

aktivitesini %95 koruduğu belirlenmiştir. İzole edilen Bacillus sp. L-12 likenaz

enziminin Li ve ark (2006) nın bulguları ile çok büyük benzerlik gösterdiği

görülmektedir.

Akita ve ark. (2005) Bacillus halodurans C-125 bakterisinden izole edilen


66

beta glukanaz enziminin 1 mM Zn ile inhibi olduğunu buna karşılık 10 mM CaCl2ve

EDTA’dan etkilenmediğini bildirmişlerdir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enziminden elde edilen sonuçlar literatürde

belirtilen termostable endoglukanaz enzimlerine ait sonuçlarla çok büyük uyum

göstermektedir.

Şekil 4.16. L-12 Likenaz Enzimine Metal İyonu, Şelatör, İnhibitör ve Deterjanların

Etkisi

4.9. L-12 Likenaz Enziminin Native-PAGE ve Zimogram Analizi

Analiz edilen L-12 likenaz enzimi %10’luk Native-PAGE’de (%1’lik likenan

içeren) yürütüldükten sonra jel iki parçaya ayrılarak, marker bölgesi Comassie

Brillant Blue R-250 ile boyanırken, diğer parça renatürasyon işlemlerinden sonra

aktivitenin saptanması için kongo kırmızısı ile boyanarak analiz edilmiştir. Elde

edilen sonuçlar Şekil 4.17 de gösterilmiştir.

0

20

40

60

80

100

120

Kont EDTA CaCl2 PMSF SDS Trit-X100 Na-Sülfit ZnCl

2 Üre

İnhibitörler

Kal

an R

ölat

if E

nzim

Akt

ivite

si (%

)


67

Marker Enzim Şekil 4.17. L-12 Likenaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zimogram Analizi

(Marker olarak Sığır serum albumin kullanılmıştır, 68.000 Da)

Likenaz enzimi zymogram analizi sonucunda moleküler ağırlıkları 54.4 ve

100.74 kDa olan bir birinden bağımsız iki aktivite bandı elde edilmiştir.

Literatürde endoglukanaz enzimlerinin büyük çoğunluğunda moleküler

ağırlıkların 35 kDa 85 kDa arasında değiştiği belirtilmiştir (Han ve ark.,1995;

Hakamada ve ark., 1997; Mawadza ve ark.,2000; Hakamada ve ark., 2002; Singh ve

ark., 2001; Endo ve ark.,2001; Kim ve ark., 2005; Voget ve ark., 2006; Zvereva ve

ark, 2006; Zhang ve ark, 2006; Aygan, 2008).

Li ve ark., (2006), Bacillus sp. AC.1 bakterisinden izole edilen termo-

asidofilik endoglukanaz (Ba-EGA) enziminin SDS-PAGE analizi sonucunda 67 kDa

moleküler ağırlıkta tek bir bandan meydana geldiğini saptanmıştır.

Eckert ve Schneider (2003) Alycyclobacillus acidocaldarius bakterisinden

izole edilen termoasidofilik CelB endoglukanaz enziminin PAGE gel analizi

sonucunda moleküler ağırlıkları 30-100 kDa arasında değişen 5 farklı alt birimden

oluştuğunu bulmuşlardır.

Ri ve ark. (2009) Laetiporus sulphureus var. miniatus organizmasından izole

edilen termostabil β-1,3-1,4 glukanaz enziminin SDS-PAGE elektroforez analizi

sonucunda 52 kDa ağırlığa sahip tek bir bandan meydana geldiğini bulmuşlardır.

100.74

68 kDa

54.4 kDa


68

Zverlov ve ark. (1997), Thermotoga naepolitana organizmasından izole

edilen yüksek düzeyde termostabil endo-1,3- β-glukanaz enziminin 52 ve 73 kDa

ağırlığa sahip bağımsız iki alt birimden oluştuğunu belirtmişlerdir.

Huang ve Monk (2004), Termofilik aerobik Caldibacillus cellulovorans

bakterisinden izole edilen CMCase enziminin SDS-PAGE analizi sonunda moleküler

ağırlığı 85.1 kDa olan tek bir bandan meydana geldiğini belirtmişlerdir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin native-PAGE jelinde yapılan analiz

sonunda iki farklı badın saptanması ve moleküler ağırlıklar, termoasidofilik

endoglukanaz enzimlerinin özellikleriyle uygunluk göstermektedir.

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Fatma GÖZÜKARA

69

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da

bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek ve

peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. İlk bulgular

eski Mısıra kadar dayanmaktadır. Yakın tarihte ise Doğu ülkelerinde birçok gıda

fermantasyonu için ipliksi mantarlar enzim kaynağı olarak kullanılmaktadır. Batıda

1896’da gerçek modern mikrobiyal enzim teknolojisi ‘takadiastase’ın ticareti ile

başlamıştır. Bu Doğudan Batı toplumuna önemli bir teknolojik transferdir (Uhlig,

1998).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının

çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin

endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem

kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışında diğer ülkelerin bu konuda tamamen dışa

bağımlı durumdadırlar.

Dünyada, 1980-1983 yılları arasında sadece 300 küçük biyoteknoloji şirketi

çalışma gerçekleştirirken, bu sayı 1985 yılında sadece Amerika Birleşik

Devletlerinde (A.B.D) 400 düzeyine ulaşmıştır. Günümüzde A.B.D de 900, bütün

dünyada ise yaklaşık 1200 biyoteknoloji şirketi çalışmalarını çeşitli alanlarda

sürdürmektedirler. Örneğin sadece farmasötik alanında 2000’li yıllarda kullanılacak

biyoteknolojik ürünlerin toplam değerinin yaklaşık 60 milyar dolar/yıl düzeyinde

olacağı düşünülmektedir.

Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış olmakla birlikte,

günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler

biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanı

sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve

Pasternak, 1994).

Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan

elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda

ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir. Bugüne kadar yaklaşık 2500

farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım için


70

kendilerine yer bulmuşlardır. Bunlardan ise ancak 25 tanesi nişasta sanayi ile

deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün

enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Rao ve ark. 1998). Bitkisel ve hayvansal

enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir

şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar,

biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden

dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark,

1998).

Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90’ı

mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang, 2004). Bunun nedeni,

mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek olması,

istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları, büyük

boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin

mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve pH değerlerinde çok yüksek düzeyde

aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999).

Bir enzimin bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz

olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de

enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır

(Wiseman, 1987; Sarıkaya, 1995).

Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı

zaman, alkaline proteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10,

Trypsin %3, Lipaz %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve xylanaz

gibi) %10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılımla

karşılaşılmaktadır (Rao ve ark., 1998).

Hidrolazlardan selülazlar ise selülozik materyalleri şekerlere dönüştürerek

özellikle biyo-etanol gibi biyolojik temelli yakıt katkı maddelerinin üretiminde

önemli bir yer tutmaya başlamışlardır. Bu nedenle selülaz’ların (glukanaz) enzim

piyasasındaki paylarının ciddi bir şekilde artması beklenmektedir. Sadece bitkisel

atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda bile, selülaz enzimlerinin Amerika

Birleşik Devletleri’nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmi yaratacağı

öngörülmektedir (Boyce ve Walsh, 2007).


71

Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının

yaklaşık 1.6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir. Bu enzimlerin kullanım

alanlarına göre dağılımına bakıldığında ise, %29’unun gıda endüstrisi, %15’inin

hayvan yemi sektörü ve %56’sının genel amaçlı teknik alanlarda şeklinde dağıldığı

görülmektedir (Uhlig, 1998).

Endüstride yaygın şekilde kullanılan enzimler arasında Bacillus cinsine ait

tür ve alttürleri tarafından sentezlenen ondan fazla enzim vardır. Örneğin ticari

olarak üretilen ve kullanılan termostabil amilaz enzimlerinin üretilmelerinde Bacillus

amyloliquefaciens ve Bacillus licheniformis en çok kullanılan iki Bacillus türüdür

(Horikoshi, 1996; Lin ve ark., 1998; Horikoshi, 1999; Kumar ve Takagi, 1999).

Bacillus cinsi bakteriler toprak, hayvan dışkıları ve bitkisel atıklar üzerinde

yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi

kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısadır. Genel olarak güvenli

olmaları, sentezledikleri proteinleri dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok

nedenden dolayı endüstriyel organizmalardır.








sahiptirler (Beckmann ve ark., 2006).

Çalışmalar sırasında tanımlanmaları yapılarak morfolojik, boyanma davranışı

ve biyokimyasal testler sonucunda Bacillus sp. şeklinde adlandırılan toplam 68

bakteri suşu öncelikli olarak üreme ve enzim sentezleme özelliklerinin saptanması

amacı ile 20-60°C ortam sıcaklığı ve 5.0-10.0 aralığındaki pH değerlerinde analiz

edilmişlerdir. Analizler içerisinde likenan bulunan katı besiyerinde

gerçekleştirilmiştir.

Çalışmamızda izole edilen suşlar arasından 20 adet Bacillus sp. suşu 20, 30,

40, 50 ve 60°C sıcaklık ve pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 ve 10.0 da analiz edilerek katı


72

besiyerindeki üreme ve enzim sentezleme davranışları ayrıntılı olarak analiz

edilmiştir (Şekil 4.1., Şekil 4.2., Şekil 4.3., Şekil 4.4., Şekil 4.5., Şekil 4.6., Şekil

4.7., Şekil 4.8., Şekil 4.9., Şekil 4.10.).

Sıcaklık ve pH değerleri farklılaştıkça suşların üreme ve enzim sentezleme

davranışlarında da farklılıklar saptanmıştır.

İnkübasyon sıcaklığı 20°C seçildiğinde 2, 7, 14 ve 18 numaralı suşların bütün

pH değerlerinde üremedikleri saptanmıştır. Bir numaralı suş bütün pH değerlerinde

belirgin şekilde üremediği halde pH 7.0, 8.0, 9.0 ve 10.0 da ortalama 2 mm

genişliğinde aktivite zonu oluşturmuştur. Üç numaralı suş bütün pH değerlerinde

belirgin üreme göstermemiş fakat pH 5.0 ve 6.0 da ortalama 3 mm genişliğinde

aktivite zonu saptanmıştır. On üç numaralı suş bütün pH değerlerinde ortalama 2.6

mm çaplı koloni oluşturarak ürerken, ortalama 10.6 mm genişliğinde aktivite zonu

elde edilmiştir. On iki numaralı suş pH 5.0, 6.0, 7.0 ve 8.0 de üremediği halde bu pH

değerlerinde ortalama 5 mm genişliğinde aktivite zonu saptanmıştır. Beş numaralı

suş sadece pH 5.0 te üremiş fakat bütün pH değerlerinde (ortalama 4 mm) enzim

aktivitesi saptanmıştır. Bu inkübasyon sıcaklığında on üç numaralı suş bütün pH

değerlerinde üremiş ve ortalama 10.6 mm genişliğinde aktivite zonu saptanmıştır

(Çizelge 4.1.).

İnkübasyon sıcaklığı 30°C ye yükseltildiğinde bütün suşların analiz edilen

bütün pH değerlerinde üreme ve enzim sentezi gerçekleştirdiği saptanmıştır.

İnkübasyon sıcaklığının yükseltilmesine paralel olarak koloni çapı ve aktivite zon

genişliğinde belirgin artış görülmüştür. Bu inkübasyon sıcaklığında en geniş aktivite

zonu (bütün pH değerleri için ortalama 20 mm) 17 numaralı suşta elde edilmiştir. On

beş numaralı suşta pH 5.0, 6.0 ve 7.0 de koloni çapı ortalama 2.5 mm, aktivite zon

genişliği 12 mm olarak ölçülürken, pH 8.0, 9.0 ve 10.0 da koloni çapı ortalama 4 mm

zon genişliği 20 mm bulunmuştur. On iki numaralı suşta ortalama koloni çapı 3.5,

aktivite zon genişliği 14.3 mm olarak saptanmıştır (Çizelge 4.2.).

Ortam sıcaklığı 40°C ye yükseltildiğinde özellikle 5 ve 12 numaralı suşların

koloni ve aktivite zon çapı genişlikleri diğer örneklerden daha yüksek değerlere

ulaşmıştır. Beş numaralı suşta ortalama koloni çapı 9 mm, aktivite zon genişliği 23.8

mm olmuştur.


73

On iki numaralı suşta ise koloni çapı 8.8 mm, aktivite zon genişliği 27.6 mm

ölçülmüştür. Özellikle pH 5.0 ve 6.0 da oralama 32 mm aktivite zon genişliği

saptanırken, pH değerleri yükseldikçe aktivite zon genişliği giderek düşmüş ve

ortalama 25.5 mm olarak gerçekleşmiştir (Çizelge 4.3.).

Ortam sıcaklığı 50°C ye yükseltildiğinde koloni çapı ve aktivite zon

genişliğinin diğer suşlardan daha yüksek değerlere ulaştığı saptanmıştır. Altı

numaralı suşta ortalama koloni çapı 13.3 mm, aktivite zon genişliği ise 22 mm olarak

bulunmuştur. Bu suşta en geniş zon 28 mm ile pH 6.0 da elde edilmiştir.

On iki numaralı suşta ortalama koloni çapı 18.5 mm aktivite zon genişliği

32.16 mm’ye ulaşmıştır. On iki numaralı suşta en geniş zon 36 mm ile pH 7.0 de elde

edilirken, sırası ile pH 8.0 de 35, 9.0 da 35 ve 10.0 da 31 mm olarak bulunmuştur

(Şekil 4.7., Şekil 4.8.). Bu sıcaklık değerinde özellikle pH 5.0 te 7 numaralı suşun 17,

sekiz numaralı suşun ise 15 mm koloni çapı ile en iyi üreme gerçekleşmiştir

(Çizelge 4.4.).

Ortam sıcaklığı 60°C ye yükseltildiğinde 15 numaralı suşun pH 5.0, 6.0 ve

7.0 de ürediği halde enzim sentezinin gerçekleşmediği saptanmıştır. On yedi

numaralı suşta pH 5.0 te üreme olmadığı halde 5 mm’lik aktivite zonu elde

edilmiştir. Buna karşılık aynı suş pH 10.0 da ürediği halde enzim sentezi

gerçekleşmemiştir. On dokuz numaralı suş bütün pH değerlerinde üreme

göstermemiş fakat pH 5.0 te 5 mm, 6.0 da 16 mm, 8.0 ve 9.0 da 12 mm aktivite zonu

elde edilmiştir. pH 10.0 da ise üreme ve enzim sentezi gerçekleşmemiştir.

Yirmi numaralı suşta sadece pH 9.0 da üreme gerçekleşmiş (5 mm koloni

çapı) ve 26 mm aktivite zon genişliği saptanmıştır. pH 8.0 de ise üreme olmadığı

halde 17 mm aktivite zonu görülmüştür. Diğer pH değerlerinde üreme ve enzim

sentezi meydana gelmemiştir.

Bu inkübasyon sıcaklığında iki numaralı suş bütün pH değerlerinde ortalama

16 mm koloni çapı oluşturacak şekilde üremiştir. Özellikle pH 8.0 de 34 mm’lik

koloni çapı saptanmıştır. Bu suşun aktivite zon çapı ise ortalama 20 mm olarak

bulunmuştur.

On iki numaralı suş, bütün pH değerlerinde ortalama 8 mm koloni çapı

oluşturacak şekilde üreme göstermiştir. pH 9.0 da 21 mm’lik koloni çapı elde


74

edilirken, pH 8.0 ve 10.0 da 6 mm çaplı üremenin gerçekleşmesi bu suş için pH 9.0

un ekstrem bir değer olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte aktivite zon

genişliğinin 25 mm olması, bu pH’ın enzim sentezi açısından ekstrem olmadığını

göstermektedir (örneğin pH 5.0 te 5 mm koloni, 21 mm, pH 10.0 da 6 mm koloni 26

mm aktivite zonu ölçülmüştür). On iki numaralı suşun bütün pH değerlerinde yüksek

bir aktivite zonuna sahip olduğu ve değerlerin birbirine yakın olduğu bulunmuştur

(pH 5.0 te 21 mm, pH 10.0 da 26 mm aktivite zonu). Bütün pH değerleri için

ortalama 23 mm aktivite zonu elde edilmiştir (Çizelge 4.5.).

Aktivite zonunun koloni çapına oranlaması (ortalama zon genişliği/ortalama

koloni çapı) yapıldığında on iki numaralı suşun aktivite zon genişliği koloni çapının

yaklaşık 3 katı değerindedir.

L-12 likenaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değeri 6.0 olarak

ölçülmüştür (Şekil 4.11.). Enzim pH 4.0-8.0 aralığında ortalama % 90 relatif

aktiviteye sahiptir. Bütün pH değerleri dikkate alındığında ortalama relatif aktivite

%87 düzeyinde gerçekleşmiştir. Likenaz enzimi bu özellikleri ile çok geniş bir pH

aralığında aktive gösterme özelliğine sahiptir. Bununla birlikte optimum pH

değerinin 6.0 olması likenaz enziminin asidik, aynı zamanda alkali bölgede yüksek

aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir (Çizelge 4.6.).

Jung ve ark. (2007) Bacillus sp. A8-8 bakterisinden izole edilen termostabil

likenaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin 6.0 olduğunu

belirtmişlerdir. Huang ve Monk (2004), termofilik aerobik bakteri Caldibacillus

cellulovarans izole edilen CMCase enziminin optimum aktivite gösterdiği pH

aralığının 6.5-7.0 olduğunu belirtmişlerdir. Zhu ve ark. (2008), Stichopus japonicus

organizmasından izole edilen beta-1,3 glukanaz enziminin optimum aktivitesini pH

5.5 te gösterdiğini belirtmişlerdir. Zverlov ve ark (1997), yüksek düzeyde termostabil

1,3-beta endoglukanaz enziminin optimum relatif aktiviteyi pH 6.2 de gösterdiğini

bulmuşlardır. Li ve ark. (2006), Bacillus sp. AC-1 bakterisinden izole edilen

termoasidofilik endoglukanaz enziminin optimum aktiviteyi pH 4.5-6.5 aralığında

gösterdiğini belirtmişlerdir. Fu ve ark. (2008), Bacillus subtilis bakterisinden izole

edilen şimerik termostabil likenaz enziminin optimum aktivitesini pH 5.0 te

gösterdiğini saptamışlardır. Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi ile elde edilen sonuçlar


75

literatür verileri ile birebir uyum içinde olup, enzim asidofiliktir.

Ön inkübasyondan geçirilmemiş enzimden elde edilen aktivite sonucu ile

karşılaştırıldığı zaman kalan enzim aktivitesinin 24 saat sonunda pH 6.0 da %96

olduğu bulunmuştur. Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin stabilitenin

en iyi olduğu pH değeri olduğu görülmektedir.

Enzim pH 3.0-6.0 aralığında ortalama %88 stabilitesini korumuştur. pH

aralığı 3.0-8.0 e çıkarıldığında stabilitenin ortalama %86 korunduğu görülmektedir.

pH aralığı 9.0-10.0 olarak seçildiğinde aktivitenin %75 korunduğu saptanmıştır.

Stabilite çalışmaları için seçilen bütün pH değerleri dikkate alındığında ise (pH 3.0-

10.0) orijinal aktivitenin 24 saatlik 37°C deki inkübasyon sonunda ortalama %83

devam ettiği saptanmıştır. Enzim yüksek düzeyde pH stabil özellik taşımaktadır

(Çizelge 4.8.).

Li ve ark (2006), Ba-EGA endoglukanaz enziminin pH 7.5 ve 10.5 te 30ºC de

2 saat inkübasyon sonunda başlangıç aktivitesini %80’in üzerinde devam ettirdiğini

belirtmişlerdir.

Zhu ve ark. (2008), yeni izole edilen beta 1,3 endoglukanaz enziminin pH

5.0-8.0 aralığında 25 dakika süreyle aktivitesini koruduğunu belirtmişlerdir. Jung ve

ark. (2007) Bacillus sp. A8-8 suşundan izole edilen termostabil β-(1,3-1,4)-glukanaz

enziminin pH 9.0-12.0 aralığında 2 saatlik inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini

%40’ın üzerinde koruduğunu belirtmişlerdir.

George ve ark, (2001) İzole edilen endoglukanaz enziminin optimum

aktivitesinin pH 6.0-8.0 aralığında gösterdiğini saptanmışlardır. Enzim pH 5.0 de ve

50ºC’de 1 saat inkübe edildiğinde orijinal aktivitenin %100 korunduğu, pH 6.0 da ise

aktivitenin %55’e düştüğü gözlemişlerdir. Likenaz enzimi asidofilik ve asidostabil

özelliktedir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi optimum aktivitesini 100°C de göstermiştir

(Şekil 4.12.). Enzim 60 ve 70°C lerde %80 aktivite gösterirken 80°C %95, 90°C de

ise %96 aktivite göstermiştir. Sıcaklık 110°C ye yükseltildiğinde (yağ banyosunda

inkübasyon yapılmıştır) enzim aktivitesi %94 gibi oldukça yüksek bir değerde

ölçülmüştür (Çizelge 4.7.).

Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin bu özellikleri dikkate alındığında


76

özellikle yüksek sıcaklıklarda (80-110°C arasındaki değerlerde ortalama %96.25

aktiviteye sahiptir) %95’lerden daha yüksek aktiviteye sahip olduğu görülmektedir.

Bu nedenle enzim yüksek düzeyde termofil özellik göstermektedir.

Yernool ve ark (1998), izolasyonunu gerçekleştirdikleri iki termostabil

endoglukanaz enziminin optimum aktivitesini 95°C de gösterdiğini saptamışlardır.

Zverlov ve ark. (1997) Thermotoga neopolitana suşundan izole edilen yüksek

düzeyde termostabil 1,3-beta endoglukanaz enzimlerinden 73 kDa büyüklükteki

fragmentin optimum aktivitesini 95°C, 52 kDa büyüklükteki fragmentin 85°C de

göstediğini saptamışlardır. Çalışmamızda Termofil Bacillus sp. suşundan izole

ettiğimiz L-12 likenaz enzimi optimum aktivitesini 100ºC de göstermektedir (Şekil

4.12.). Literatür verilerinden daha yüksek optimum aktivite sıcaklığına sahip olan

enzim, hiper termofilik özelliktedir. L-12 likenaz enzimi hipertermofil özelliktedir.

Enzimin 30-60 ºC aralığındaki sıcaklık değerlerinde orijinal aktivitesini

ortalama %92.5, 30-70 ºC aralığında ortalama %90.6, 70-90 ºC aralığında ortalama

%79, ve 100-110 ºC aralığında ortalama %66.5 koruduğu belirlenmiştir (Çizelge

4.9.).

Fu ve ark. (2008), Bacillus subtilis suşundan elde edilen şimerik termostabil

likenaz enziminin 90 ºC de 10 dakikalık ön inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini

yaklaşık %83. oranında koruduğunu belirtmişlerdir.

Zverlov ve ark. (1997) Thermotoga neapolitana suşundan izole edilen yüksek

düzeyde termostabil 1,3-beta endoglukanaz enzimine ait 73 kDa’luk fragmentin 30

dakika süreyle 100 ºC de ön inkübasyonundan sonra orijinal aktivitesinin %57 ye

düştüğünü belirtmişlerdir.

Hakamada ve ark, (1997), alkalofilik Bacillus sp. KSM-S237’den izole edilen

ve optimum aktivite sıcaklığı 50ºC olan endoglukanaz enziminin 10 dakikalık

inkübasyon sonunda orijinal aktivitesini 20ºC’de %100 koruduğunu, 40ºC’de

aktivitenin %90’a, 50ºC’de %50’ye 100ºC’de ise %30’a düştüğü belirtmiştir.

Bacillus sp. L–12 likenaz enzimine ait termal stabilite sonuçları literatür

verilerinden oldukça yüksek değerlere sahip olup, enzim yüksek düzeyde termostabil

özellik göstermektedir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi değişik NaCl konsantrasyonlarında analiz


77

edilmiş ve en yüksek aktivite değeri %7.5 NaCl konsantrasyonunda %67 olarak

bulunmuştur. %3.5-7.5 NaCl kullanıldığında ortalama kalan enzim aktivitesi %62

olarak gerçekleşirken, %10-20 NaCl konsantrasyonunda ortalama % 54.33 olarak

saptanmıştır (Çizelge 4.10.).

Simankova ve ark. (1993), Hallocella cellulosilytica bakterisinden izole

edilen enzimin mikrokristalin selülozu %5-20 arasındaki NaCl konsantrasyonlarında

parçaladığını, fakat optimum aktivitenin %10 NaCl konsantrasyonunda

gerçekleştiğini belirtmişlerdir.

L-12 likenaz enziminin %3.5-20.0 NaCl konsantrasyonlarında ortalama %59

aktivite göstermesi, enzimin halotolerant olduğununun kanıtıdır.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi EDTA ve CaCl2 kullanılan testlerde stabil

kalarak sırası ile %97 ve %95 oranında orijinal aktivitesini korumuştur.

L-12 likenaz enzimi SDS ile %62 oranında aktivitesini kaybederken non

iyonik deterjan olan triton-X 100 ile %101 oranında aktivite göstermiştir. Bacillus sp.

L-12 likenaz enzimi Na2SO3, ZnCL2 Üre kullanılan çalışmalarda orijinal aktivitesini

sırası ile % 60, %64 ve %69 oranında kaybetmiştir (Çizelge 4.11.).

Joung ve ark. (2007), Bacillus sp. A8-8 bakterisinden izole edilen termostabil

β-1,3-1,4 glukanaz enziminin 5 mM EDTA ile aktivitesini koruduğunu ve

etkilenmediğini, buna karşılık Ca ile aktivitenin arttığını belirtmişlerdir.

Ng Son ve ark. (2009), termofilik Geobacillus sp. 70PC53 bakterisinden izole

edilen ve geniş bir sıcaklık aralığında stabilite gösteren CelA endoglukanaz

enziminin konsantrasyona bağlı olarak Zn+2 ve Cu+2 iyonları ile güçlü şekilde inhibe

edildiğini, buna karşılık Ca+2 ile azda olsa sitümüle edildiğini belirtmişlerdir. Aynı

araştırma grubu CelA endoglukanaz enzim aktivitesinin Na+, Mg+2 ve EDTA ile

etkilenmediğini belirtmişlerdir.

Li ve ark. (2006) Bacillus sp. AC.1 bakterisinden izole edilen termoasidofilik

endoglukanaz enziminin %0.5 SDS ile %66 oranında inhibe olurken, %0.25 triton X-

100 ile %127 aktive edildiğini belirtmişlerdir. Aynı enzimin 5 mM EDTA ile orijinal

aktivitesini %95 koruduğu belirlenmiştir.

Akita ve ark. (2005) Bacillus halodurans C-125 bakterisinden izole edilen

beta glukanaz enziminin 1 mM Zn+2 ile inhibi olduğunu buna karşılık 10 mM


78

CaCl2ve EDTA’dan etkilenmediğini bildirmişlerdir.

Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi metalloenzim özelliği göstermeyen, PMSF

ile inhibe olan (%44), ZnCl2ile önemli düzeyde inhibe olan (%64) ve noniyonik

surfaktan olan Triton X-100 den etkilenmeyen ve azda olsa aktivitesi uyarılan

(%101) enzim özelliğindedir. Çinko iyonları ve üre ile önemli derecede inhibe

olması (ZnCl2 ile %64, Üre ile %69) enzimin hiper termofil, termostabil ve

halotolerant karakterde olduğunu göstermektedir (Lin ve ark., 1998).

Bu özellikleri ile Li ve ark. (2006), nın Bacillus sp. AC-1 termoasidofilik

endoglukanaz enzimi ile tam bir uyum göstermektedir.

Likenaz enziminin zymogram analizi sonucunda birbirinden bağımsız

moleküler ağırlıkları 100740 Da ve 54400 Da olan iki aktivite bandı elde edilmiştir

(Şekil 4.17.).

Literatürde endoglukanaz enzimlerinin büyük çoğunluğunda moleküler

ağırlıkların 35 kDa 85 kDa arasında değiştiği belirtilmektedir (Han ve ark,1995;

Hakamada ve ark., 1997; Mawadza ve ark.,2000; Hakamada ve ark., 2002; Singh ve

ark., 2001; Endo ve ark.,2001; Kim ve ark., 2005;Voget ve ark., 2006; Zvereva ve

ark, 2006; Zhang ve ark, 2007; Aygan, 2008).

Zverlov ve ark. (1997), Thermotoga naepolitana organizmasından izole

edilen yüksek düzeyde termostabil endo-1,3- β-glukanaz enziminin 52 ve 73 kDa

ağırlığa sahip bağımsız iki alt birimden oluştuğunu belirtmişlerdir.

Huang ve Monk (2004), termofilik Caldibacillus cellulovorans bakterisinden

izole edilen endoglukanaz enziminin 85.1 kda moleküler ağırlığa sahip olduğunu,

optimum aktivitesini pH6.5-7.0 de gösterdiğini ve enzimin Zn+2 iyonu ile inhibe

olduğunu belirtmişlerdir.

Geçen son 20 yıl içerisinde selülaz kullanımı özellikle tekstil, temizlik, kağıt,

içecek ve şarap endüstrisinde önemli düzeyde artış göstermiştir. Ayrıca hayvan

yemlerinin üretimi, tekstil ve temizlik endüstrisi, kağıt hamuru hazırlama işletmeleri

ile tarımsal uygulamalar endoglukanazların kullanım alanları arasındadır.

Günümüzde selülaz (enduglukanaz) enziminin dünya enzim ticaretindeki yeri

yaklaşık %20 düzeyindedir. Selülazların ana uygulama alanları gıda, hayvan yemi

üretimi, tekstil, biyo-yakıt, kimya, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların


79

giderimi, tıbbi ve farmasötik endüstrisi, protoplast üretimi, genetik mühendisliği ve

kirlilik giderimidir (Bhat ve Bhat, 1997).

İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz Bacillus sp. L-12 likenaz enziminin

optimum aktivitesinin pH 6.0 da gerçekleşmesi, pH stabilitesinin yüksekliği,

optimum aktivite sıcaklığının 100°C ve termostabil olması, orta düzeyde halofilik

özellik göstermesi ve triton X-100 gibi surfaktanlara dirençli olması, enzimin tekstil

uygulamaları, kağıt endüstrisi, temizlik alanı ve özellikle hayvan yemi hazırlanması

gibi bir çok biyoteknolojik alanda uygulanabilir özellikte olduğunu göstermektedir.








sahiptirler (Beckmann ve ark., 2006). β -1,3-1,4 glukanlar yüksek yapılı bitkilerin

hücre duvarlarının yapısında bulunan hem β-1,3 hemde β-1,4 bağlı D-glukoz içeren

lineer polisakkaritlerdir. Likenazların, β-glukanları diğer glukanazlara göre daha

yüksek düzeyde hidroliz etmeleri nedeniyle, kümes hayvanları ve domuz yemlerinin

hazırlanmasında giderek ön plana çıkmaktadırlar (Beckmann ve ark., 2006).






işlemi esnasında akışkanlığı azaltmak için kullanılır. Hayvan yeminde, özellikle etlik

tavuk ve küçük domuzlarda, bakteriyel β-1,3-1,4-glukanazlar içeren enzimatik

preparatlar ilavesi arpa kökenli beslenmenin sindirilebilirliğini geliştirebilir ve

sağlıksal sorunları azaltabilir (Zhang ve ark., 2006).


80

Sonuç olarak;

1. Bacillus sp. L-12 likenaz enzimi asidik pH koşullarında (pH 3.0-6.0)

yüksek düzeyde aktivite göstermesi, geniş bir pH aralığında 24 saat süreyle yüksek

düzeyde stabil kalması, optimum enzimatik aktivitesini 100°C de gösterip, aynı

zamanda termostabil karakterde olması nedeniyle hayvan yemi hazırlama amacı ile

kullanılabilecek ideal bir enzimdir. Özellikle tavuk yemlerinin hazırlanması sırasında

peletleme işleminin 80°C de gerçekleştirilmesi ve beslenme sırasında yemin barsağa

ulaşıncaya kadar (kursak-mide yolunda pH 2-4 arasında değişmektedir) ortalama 4

saat beklemesi dikkate alınacak olursa, enzimin 24 saat süreyle pH 3.0-6.0

aralığındaki aktivite ve stabilitesi (ortalama %88) özel bir önem kazanmaktadır. Bu

özellikleri nedeniyle tavuk yem endüstrisi için ideal bir enzimdir.

2. Selülozik materyali parçalayan enzimler ya β-1,3 yada β-1,4 glikozid

bağlarını koparma ve molekülü hidroliz etme yeteneğindedirler. Bu nedenle hidroliz

ürünlerinin verimi düşük olmakta ve selülozik materyalden yararlanma oranı

azalmaktadır. İzolasyonunu gerçekleştirdiğimiz likenaz enzimi β-1,3-1,4 glikozid

bağlarını aynı derecede parlama yeteneğinde olduğu için selülozik materyalden elde

edilen verim üst düzeylere ulaşmaktadır. Bu özellik selüloz parçalanma ürünlerinin

kullanımının hedeflendiği, yem endüstrisi, içecek endüstrisi ve biyoetanol üretimi

alanları için, L-12 likenaz enziminin önemini artırmaktadır.

3. Likenaz enzimi arpadan malt üretimi sırasında amilaz enziminin

endosperme ulaşmasını kolaylaştırmak amacıyla yaygın şekilde kullanılmaktadır.

Malt oluşumu sırasında kurutma işlemi yüksek sıcaklıkta yapıldığı için izolasyonunu

gerçekleştirdiğimiz likenaz enziminden termofil özelliği nedeniyle bu alanda çok

daha yüksek verim alınmasında yararlanılması mümkündür.

81

KAYNAKLAR

AIBA, S., KILAL, K., and IMANAKA, T., 1983. Cloning and expression of

thermostable α-amilase gene from Bacillus stearotermophilus, Bacillus

subtilis. Appl. And Environm. Microbiol. 46 (5):1059-1065

AKITA, M., KAYATAMA, K., HATADA, Y., ITO, S., and HORIKOSHI, K. 2005.

A novel β-glucanase gene from Bacillus halodurans C-125. FEMS

Microbiology Letters. 248:9-15.

ANONYMOUS, 1917. Buffer solutions. Handbook of Biochemistry and Molecular

Biology, s. 370-382.

ANONYMOUS., 1988a., Handbook of amylases and related enzymes. Edited by the

amylase research society of japan. Pergamon press, Oxford.

ARIKAN, B. 2008. Highly Thermostable, Thermophilic, Alkaline, SDS and Chelator

Resistant Amylase from a Thermophilic Bacillus sp. Isolate A3-15.

Bioresource Technology. 98 (8):3071-3078.

AOKI, K., MIYAMOTO, K., MURAKAMI, S., and SHINKE, R., 1995. Anaerobic

Synthesis of Extracellular Proteases by The Soil Bacterium Bacillus sp. AM-

23: Putrification and Characterization of The Enzymes. Soil Biol. Biochem.

27(11):1377-1382.

AUNSTRUP, K., 1981. Industrial Aspects of Biochemistry (B. Spencer editör),

pp:23-29. FEES, Dublin.

AYGAN, A., 2008. Haloalkalofil Bacillus sp. İzolasyonu, Amilaz, Selülaz ve

Ksilanaz Enzimlerinin Üretimi, Karakterizasyonu ve Biyoteknolojik

Uygulamalarda Kullanılabilirliği. Ç.Ü. FBE. Doktora Tezi.

BAJPAI, P. and BAJPAI, K.P., 1987. High temperature alkaline a-amylase from

Bacillus licheniformis TCRDC-B13. Biotechnology and Bioengineering,

33:72-78.

BECKMANN, L., SIMON, O., and VAHJEN, W. 2006. Isolation and identification

of mixed linked β-glucan egrading bacteria in the intestine of broiler chickens

and partial characteriation of respective 1,3-1,4-glucanase activities. J Basic

Microbiol. 46 (3): 175-185.

82

BHAT, M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnology

Advences. 18 (5): 355-458.

BIODIN, A. and EFFRONT,J.,1917. Process manufacturing diastases and toxins by

oxidizing ferments. U.S.Patent 1, 227,525.

BISCHOFF, K.M., ROONEY, A.P., and LI, X.L., 2006. Purification and

characterization of a family 5 endoglucanase from a moderately thermophilic

strain of Bacillus licheniformis. Biotechnol Lett. 28:1761-1765

BHAT, M.K., and BHAT, S., 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential

industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583-620.

BLEISMER, B.O., and HARTMAN, P.A., 1973. Diferential heat stabilities of

Bacillus subtilis amylases. J.Bacteriol. 113:526-528.

BOLLAG,D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN, S.J., 1996. Protein Methods (2nd

Edt). Viley-Liss Press, USA. 414s.

BORGIA, P.T. and CAMPBELL, L.L., 1978. α-Amylases from Five Strains of

Bacillus amyloliquefaciens: Evidence for Identical Primary Structures.

J.Bacteriol. 134(2):389-393.

BOYCE, A. and WALSH, G. 2007. Production, purification and application-relevant

characterisation of an endo-1,2 (4)-β-glucanase from Rhizomucor miegei.

Appl Microbiol Biotechnol. 76:835-841.

BOYER, F.W., INGLE, M.B., and MERCER, G.D. 1972. Starch. 31:66-71

BURHAN, A., ÜNALDI, N., CORAL, G., COLAK, O., AYGAN, A., and

GÜLNAZ, O. 2003. Enzymatic properties of a novel thermostable,

thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic

Bacillus sp. İsolate ANT-6. Process Biochemistry. 38:1397-1403.

COLEMAN, G., and ELLIOTT, W.H., 1962. Studies on α-Amylase formation by

Bacillus subtilis, Biochcm. J. 83:256-263.

CORAL, G., ARIKAN, B., ÜNALDI, M.N., and GÜVENMEZ KORKMAZ, H.

2002. Some properties of thermostable xylanase from an Aspergillus niger

strain. Ann. Microbiol. 52:299-306.

83

CHRISTOV, L.P., AKHTAR, M., and PRIOR, B.A. 1996. Impact of Xylanase and

Fungal Pretreatment on Alkali Solubility and Brightness of Dissolving Pulp.

Biobleaching of Sulphite Pulp. 50: 579-582.

ECKERT, K., and SCHNEIDER, E. 2003. A thermoacidophilic endoglucanase

(CelB) from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequence

similarity to arabinofuranosidases belonging to family 51 of glycoside

hydrolases. Eur. J. Biochem. 270:3593-3602 (2003).

ENDO, K., HAKAMADA, Y., TAKIZAWA, S., KUBOTA, H., SUMITOMO, N.,

KOBAYASHI, T., and ITO, S. 2001. A novel alkaline endoglucanase from

an alkaliphilic Bacillus isolate: Enzymatic properties, and nucleotide and

deduced amino acid sequences. Appl Microbiol Biotechnology. 57:109-116.

FOGARTY, W.M., and KELLY, C.T., 1979. Developments in microbial

extracellular enzymes. In: Wiseman A, editor. Topics in enzyme and

fermentaion biotechnology. 3:45-108.

FU, L.L., XU, Z.R., SHUAI J.B., HU, C.X., DAI, W., and LI, W.F., 2008. High-

Level Secretion of a Chimeric Thermostable Lichenase from Bacillus subtilis

by Screening of Site- Mutated Signal Peptides with Structural Alterations.

Curr Microbiol 56:287-292.

GAMERITH, G., GROICHER, R., ZEILINGER, S., HERZOG, P., KUBICEK, C.P.,

1992. Cellulase-Poor Xylanases Produced by Trichoderma reesei RUTC-30

on Hemicellulase Substrates. Appl Microbiol Biotechnol. 38: 315-322.

GEORGE, S.P., AHMAD, A., RAO,M.B., 2001. Studies on carboxymethyl cellulase

produced by an alkalothermophilic actinomycete. Bioresource Tech., 77:171-

175.

GESSESSE, A., and GASHE. B:A., 1997. Production of Alkaline Xylanase by an

Alkaliphilic Bacillus sp. Isolated From an Alkaline Soda Lake. Journal of

Applied Microbiology., 83: 402-406.

GLICK, B.R., and PASTERNAK, S.S., 1994. Molecular biotechnology: Principles

and Applications of Recombinant DNA. Cold Spring Harbor Laboratory,

New York.

84

GOMES, J. and STEINER,W., 2004. The Biocatalytic Potential of Extremophiles

and Extremozymes. Food Technology and Biotechnology, 42(4): 223-235.

GROOTEGOED, J.A., and LAUVERS, and A.M., 1973. Separation and partial

purification of extracellular amylase and protease from Bacillus caldolyticus

Arch. Mikrobiol 90:223-232.

HAN, S.J., Y.J. YOO, and H.S. KANG. 1995. Characterization of a bifunctional

cellulase and its structural gene. J.Biol. Chem. 270:26012-26019.

HAKAMADA, Y., ENDO, K., TAKIZAWA, S., KOBAYASHI, T., SHIRAI, T.,

YAMANE, T., and ITO, S., 2002. Enzymatic properties, crystallization and

deduced aminoacid sequence of an alkaline endoglucanase from Bacillus

circulans. Biochimica et Biophysica Acta,1570: 174-180.

HAKAMADA, Y., KOIKE, K., YOSHIMATSU, T., MORI, H., KOBAYASHI, T.,

and ITO,S., 1997. Thermostable alkaline cellulase from an alkaliphilic

isolate, Bacillus sp. KSM-S237. Extremophiles, 1:151-156.

HAMILTON, LM., KELLY, C.T., and FOGARTY, W.M. 1999. Purification and

properties of the raw starch degrading α-amylase of Bacillus sp. IMD434.

Biotechnol. Lett. 2:111-115.

HIRASAWA, K., UCHIMURA, K., KASHIWA, M., GRANT, W.D., ITO, S.,

KOBAYASHI, T., and HORIKOSHI, K. 2006. Salt-activated endoglucanase

of a strain of alkaliphilic Bacillus agaradhaerens. Antonie van Leeuwenhoek.

89:211-219.

HOLS, P., FERAIN, T., GARMYN, D., BERNARD, N., and DELCOUR, J., 1994.

Use of expression secretion signals and vector free stable chromosomal

integration in engineering of Lactobacillus plantarum for α-amilaseand

Levanase expression. Appl. And Environm. Microbiol. 60 (5): 1401-1403.

HORIKOSHI, K., 1996. Alkaliphiles-from an industrial point of view. FEMS

Microbiology Reviews, 18:259-270.

HORIKOSHI, K., 1999. Alkaliphiles: Some applications of their products for

biotechnolgy. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (4): 735-

750.

85

HREGGVIDSSON, G.O., KAISTE, E., HOLST, O., EGGERTSSON, G.,

PALDSDOTTIR, A., and KRISTJANSSON, J. 1996. An extremely

thermostable cellulase from the thermophilic eubacterium Rhodothermus

marinus. App. Environmental Microbiology, 62 (8):3047-3049.

HUANG, X.P., and MONK, C., 2004. Purification and characterization of a cellulase

(CMCase) from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium

Caldibacillus cellulovarans gen. nov., sp. nov. World J. Microbiol.

Biotechnol., 20: 85-92.

JIN, F., CHENG, X., SHI, Y., and ZHANG, C., 1990. Isolation of New

Thermophilic Aerobic Bacteria Which Produce Thermostable α-Amylase. J.

Gen. Appl. Microbiol. 36:415-424.

JOHN, F.K., 1987. Enzyme technology. Biotechnology, Vol 7A. NewYork. P. 37-62

JUNG, Y.J., YOO, J.S., and LEE, Y.S. 2007. Purification and characterization of

thermostable β-1,3-1,4 glucanase from Bacillus sp. A8-8. Biotechnol.

Bioprocess Eng. 12:265-270.

KANG, H-J., UEGAKI, K., FUKADA, H., and ISHIKAWA, K., 2007. Improvement

of the enzymatic activity of the hyperthermophilic cellulase from Pyrococcus

horikoshii. Extremophiles,11, 251-256.

KANG, S.W., PARK, Y.S., LEE, J.S., HONG, S.I., and KIM, S.W., 2004.

Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from

lignocellulosic biomass. Bioresource Tech.,91: 153-156.

KIM, J-Y., HUR, S-H., HONG, J-H., 2005. Purification and characterization of an

alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. HSH-810.

Biotechnol. Lett., 27:313-316.

KINDLE, K.L., 1983. Characterization and production of thermostable α-amilase.

Appl. Biochem. Biotechnol. 8:153-158.

KRISHNA, C., 1999. Production of bacterial cellulases by solid state bioprocessing

of banana waste. Bioresorce Tech., 69:231-239.

KRISTJANSSON, J.K., and STETTER, K.O., 1992. Thermophilic Bacteria.

(J.K.Kristjansson, editör) Thermophilic Bacteria. CRC Pres, London,1-18s.

86

KUMAR, H.D. and NUSSINOV, R., 2001. How Do Thermophilic Proteins Deal

with Heat? A review. Cellular and Molecular Life Sciences, 58: 1216-1233.

KULKARNI, N., SHENDYE, A., and RAO, M., 1999. Moleculer and

Biotechnological Aspects of Xylanases. FEMS Microbiology Reviews 23:

411-456.

KUMAR, G.C., and TAKAGI, H., 1999. Microbial alkaline proteases from a

bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594.

LAEMMLI, U.K., 1970., Cleauage of Structural Proteins During the Assembly of the

Head of the Bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

LANE, A.G. and PIRT, S.J., 1973. Production of Cyclodextrin Glycoyltransferase by

Batch and Chemostat Cultures of Bacillus macerans in Chemically Defined

Mediom. J. Appi. C hem. Biotech., 23:309-321.

LENNETE, E.H., BALOWS, A., HAUSLER, J.W. Jr., and SHADOMY, J.H., 1985.

Manuel of clinical Microbiology. USA, Vol 4, p.1149.

LI, Y-H., DING,M., WANG, J., XU, G-J., and ZHAO, F., 2006. A novel

thermoacidophilic endoglucanas, Ba-EGA, from a new cellulosedegrading

bacterium, Bacillus sp. AC-1. Appl. Microbiol.Biotechnol., 70:430-436.

LIMING, X. AND XUELIANG, S. 2004. High-yield celllase production by

Trichoderma reesei ZU-02 on corn cob residue. Bioresource Technology.

91:259-262.

LIN, L.L., CHYAU, C.C., and HSU, W.H., 1998. Production and properties of a raw

strach degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp.

Biotechnol. Appl. Biochem. 28:61-68

LOUW, M.E., REID, S.J. and WATSON, T.G. 1993. Characterization, cloning and

sequencing of a thermostable endo β-(1,3-1,4) glucanase-encoding gene from

an alkalophilic Bacillus brevis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 507–513.

MATSUZAKI, H., YAMANE, K., YAMAGUCHI, K, NAGATA, K., and MAROU,

B., 1974. Hybrid Alpha-Amylases Produced by Transformants of Bacillus

subtilis. I Purification and Characterization of Extracellular ct-Amylases

Produced by the Parental Strains and Transformants: Biochim. Biophy. Acta.,

365, 235-247.

87

MAWADZA, C., HATTI-KAUL, R., ZVAUYA, R., and MATTIASON, B., 2000.

Purification and characterization of cellulases produced by Bacillus Strain. J.


MEER, J.L., 1972. The Regulation Of Alpha-Amylase Production in Bacillus

licheniformis. Antonievon Leuvenhoek: J. Microb. Serol., 38:570-585.

MEHROTRA ,S., PANDEY, P.K., GAUR, R., and DARMWAL, N.S., 1999. The

prufication of alkaline protease by a Bacillus sp. isolated. Bioresource

Technology. 67:201-203.

MILLER, G.L., 1951. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical Chemistry,426-428.

MORGAN, F.J. and PRIEST, F.G., 1981. Characterization of a thermostable α-

amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346. J.Appl. Bacteriol., 50:107-

114.

MURASHIMA, K., NISHIMURA, T., NAKAMURA, Y., KOGA, J., MORIYA, T.,

SUMIDA, N., YAGUCHI, T., and KONO,T., 2002. Purification and

characterization of new endo-1,4-β-D-glucanases from Rhizopus oryzae.

Enzyme. Microbial Technol., 30: 319-326

NG, L.S., LI, C.W., YEH, Y.F., and CHEN, P.T., 2009. A novel endoglucanase from

the thermophilic bacterium Geobacillus sp. 70PC53 with high activity and

stability over a broad range of temperatures. Extremophiles, 13:425-435.

NIEHAUS, F., BERTOLDO, C., KAHLER, M., and ANTRANIKIAN, G., 1999.

Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. App

Microbiol Biotechnol, 51:711-729

OGASAHARA, K., IMANISHI, A., and ISEMURA, T., 1970. Studies on

Thermophilic α- Amylase from Bacillus stearothermophilus. I. Some General

and Physiochemical Properties of Thermophilic α- Amylase. J. Biochem.,

Vol.67, No:1 65-75.

OYEKOLA, O.O., NGESI, N., and WHITELEY, C.G. 2007. Isolation, purification

and characterisation of an endogluanase and β-glucosidase from an anaerobic

sulphidogenic bioreactor. Enzyme and Microbial Technology. 40:637-644.

88

PAZUR, H.H., 1965. Starch Chemistry and Technology, p: 133 Academic Press,

New York.

RADLEY, J.A., 1976. Production of Microbial Amylolytic Enzymes: Starch

Production Technology (L.A. Underkofler Editör). Chapter 16., Applied

Science Publisher Ld., England, p: 295-309.

RAO, B.M., TANKSALE, M.A., GHATHE, S.M., and DESHPANDE, V.V., 1998.

Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology

and Molecular Biology Reviews. 62 (3):597-635.

ROBSON, L.M. and CHAMBLISS, G.H., 1984. Characterization of the cellulolytic

activity of a Bacillus isolate. Appl. Environ.Microbiol.,47:1039-1046.

RI, M.H., KIM, Y.S., JOO, A.R., LEE, J.K., KIM, Y.S., and OH, D.K., 2009.

Purification and Characterization of a Thermostable β-1,3-1,4-Glucanase

from Laetiporus sulphureus var. miniatus. J. Microbiol. Biotechnol. (2009),

19(2), 000–000 doi: 10.4014/jmb.0812.674

SAHA, B.C. 2004. Endoglucanase from a newly isolated strain of Mucor

circinelloides. Process Biochemistry 39(12): 1871-1876

SAITO, N., 1973. Thermophilic extracellular α-amilase from Bacillus licheniformis.

Arc. Biochem. Biophy. 155:290-298.

SAMBROOK, J. and RUSSELL, D.W.,2001. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

SARIKAYA, E., 1995. α-amilaz üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme

parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu. Ankara

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi.

SIMANKOVA, M.V.,CHERNYCH, N.A., OSIPOV, G.A. and ZAVARZIN, G.A.,

1993. Hellocella cellulolytica gen. nov., sp. nov., a new obligately anaerobic,

halophilic, cellulolytic bacterium. Syst. Appl. Microbiol. 16. 385-389.

SINDHU, G.S., SHAMA, P., CHAKRABARTI, T., and GUPTA, J.K. 1997. Strain

improvement for the production of a themostable α-amylase. Enzyme

Microbil. Technol. 24:584-59.

89

SINGH, J., BATRA, N., and SOBTI, R.C., 2001. A highly thermostable, alkaline

CMCase produced by a newly isolated Bacillus sp. VG1. World J. Microbiol.


SMITH, J.E.,1996. Biotechnology. Chambridge University Pres, Chambridge, 233s.

SOUTSCHEK-BAUER, E. and STAUDENBAUER L., 1987. Synthesis and

secretion of a heat stable carboxymethylcellulase from Clostridium

thermocellum in Bacillus subtilis and Bacillus stearothermophilus. Mol.Gen.

Genet., 208: 537-541.

SRIVASTAVA, R.A.K., 1987. Purification and Chemical Characterization of

Thermostable Amylases Produced by Bacillus stearothermophilus.

Biochemistry Laboratory, Botany Department, University of Gorakhpur,

Gorakhpur 273001, India.

TABERNERO, C., COLL, P.M., FERNANDEZ-ABALOS, J.M., PEREZ, P., and

SANTAMARIA, R.I., 1994. Cloning and DNA squencing of bgaA, a gene

encoding an endo-β-1,3-1,4-glucanase, from an alkalophilic Bacillus strain

(N137). Appl. Environ. Micribiol. 60,1213-1220.

TARAKÇIOĞLU, Y., 1979. An amylase producing maltotriose from Bacillus

subtilis. Agric. Biol. Chem. 49 (4):1091-1097.

TAHARA, N., YANA, H., YOSHINAGA, F., 1997. Two types of Cellulase Activity

Produced by a cellulose-producing Acetobacter Strain. Journal of

Fermentation and Bioengineering, 83: 389-392.

TEMİZKAN, G. ve ARDA, N., 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler.

Nobel Tıp Kitabevi, İst.345s.

UHLIG, H. 1998. Industrial enzymes and their applications. JOHN WILEY&SONS,

INC. NEW YORK.

VOGET, S., STEELE, H.L., and STREIT, W.R., 2006. Characterization of

metagenome-derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol 126:26-36.

WAINQ, M., and INGWORSEN, K. 2003. Roduction of β-xylnase and β-xylosidase

by the extremelyhalophilic arceon Halorhabdus utahensis. Extremophiles,

7:87-93.

90

WANG, C.H., HSİEH, Y.R., NG, C.C., CHAN, H., LIN H.T., TZENG W.S., and

SHYU, Y.T., 2009. Purification and characterization of a novel halostable

cellulase from Salinivibrio sp. strain NTU-05. Enzyme and Microbial Techn.,

44:373-379

WILSON, K. And GOULDING, K.H., 1986. A Biologist’s Guide to Principles and

Techniques of Practical Biochemistry. Edward Arnold, London.396s.

WISEMAN, A., 1987. Handbook of enzyme biotechnology. Second Edition. Chapter

3. The application of enzymes in industry, p.274-373.

WOLFGANG, A. 2004. Enzymes in industry: Production ad applications. WILEY-

VCH Verlag GmbH&Co. KgaA, Weinheim.

YERNOOL, J-D.B.D., and EVELEİGH, D.E., 1998. Purification, characterization

and molecular analysis of thermostable cellulase CelA and CelB from

Thermotoga neapolitana. Appl.Environ.Microbiol,64:4774-4781.

ZHANG, X.Y., RUAN, H., MU, L., HE, G., TANG, X.J., and CHEN, O.H. 2006.

Enhancement of the thermostability of β-1,3-1,4-glucanase by directed

evolution. J Zhejiang Univ SCIENCE A .7(11):1948-1955.

ZHU, B.W., ZHAO, J.G., YANG, J.F., MIKIRO, T., ZHANG, Z.S., and ZHOU,

D.Y., 2008. Purification and partial characterization of a novel β-1,3-

glucanase from the gut of sea cucumber Stichopus japonicus. Process

Biochem (2008) 43:1102-1106

ZVERAVA, E.A., FEDOROVA,T.V., KEVBRIN, V.V., ZHILINA, T.N. and

RABINOVICH, M.L. , 2006. Cellulase activity of a haloalkaliphilic

anaerobic bacterium, strain Z-7026. Extremophiles, 10: 53-60.

ZVERLOV, V. V., VOLKOV, I. Y., VELIKODVORSKAYA, T. V. and

SCHWARZ, W. H. (1997) Highly thermostable endo-1,3-β-glucanase

(laminarinase) LamA from Thermotoga neapolitana : nucleotide sequence of

the gene and characterization of the recombinant gene product. Microbiology

143, 1701–1708.

91

ÖZGEÇMİŞ

1983 yılında Adana’da doğdum. İlkokul, ortaokul ve lise öğrenimimi

Adana’da tamamladıktan sonra 2001 yılında Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat

Fakültesi Biyoloji bölümünü kazandım.

2005 yılında mezun olup aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Biyoteknoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisansa başladım.

2006 yılında Acıbadem Hastanesi LabMed Adana’da mikrobiyoloji

laboratuvar teknisyeni olarak işe başladım. 2009 yılında Kan Bankası sorumlu

teknisyenliğine atandım ve halen çalışmaktayım.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …Bu sonuçlara göre L-12 likenaz enzimi,...

Documents

Transcript of ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …Bu sonuçlara göre L-12 likenaz enzimi,...