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  • UNIVERSIDADE DE LISBOA

    FACULDADE DE FARMÁCIA

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor

    Human γδ T Cell Differentiation

    Master Thesis Dissertation

    Gisela Silva Gordino

    Master in Biopharmaceutical Sciences - FFUL

    Supervisor

    Dra. Julie C. Ribot

    Molecular Medicine Institute

    2016

  • FFULisboa

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor Human γδ T Cell Differentiation 2

    UNIVERSIDADE DE LISBOA

    FACULDADE DE FARMÁCIA

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor

    Human γδ T Cell Differentiation

    Master Thesis Dissertation

    Gisela Silva Gordino

    Master in Biopharmaceutical Sciences - FFUL

    Supervisor

    Dra. Julie C. Ribot

    Molecular Medicine Institute

    2016

  • FFULisboa

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor Human γδ T Cell Differentiation 3

    Abstract

    Recent developments in the immunology field have validated immunotherapy as being

    capable of extending cancer patients survival, highlighting its role as a promising anti-tumor

    treatment. However, a wider and more successful application of adoptive cell therapy requires

    a better understanding of the molecular determinants, in effector lymphocytes, of functional

    differentiation, recognition and elimination of tumor cells.

    γδ T cells have been proposed as the first line of immune defense, acting in response to a

    variety of stress-inducible or pathogen-associated metabolites. Their activation includes a

    potent cytolytic and inflammatory activity against a wide range of malignant cells as one of

    its most important features. Although clinical trials have aimed at modulating their activity,

    they were only able to achieve objective responses in the range of 10-33%. Therefore, it has

    become evident that understanding the mechanisms involved in regulating γδ T cell activation

    and functional differentiation is critical for their manipulation in clinical settings.

    Importantly, data from the host laboratory has recently shown that the anti-tumor effector

    properties of γδ T cells were selectively acquired upon stimulation with interleukin (IL)-2, but

    not with IL-7. The effects caused by IL-2 depended on the Mitogen-Activated Protein

    Kinase/Extracellular Signal-Related Kinase (MAPK/ERK) signaling and induced de novo

    expression of the transcription factors (TFs) T-bet and eomesodermin, as well as the cytolytic

    enzyme perforin. Based on this background, this project proposes to explore an additional

    layer in the regulation of γδ T cell differentiation, by characterizing the post-transcriptional

    mechanisms mediated by microRNAs (miRs).

    In mammals, more than 700 miRs have already been identified and shown to regulate many

    developmental and differentiation processes. For instance, with regard to the immune system,

    overexpressing miR-491 decreases the interferon (IFN)-γ production in cluster of

    differentiation (CD)8 + T cells, miR-583 inhibits natural killer (NK) cells differentiation

    process, and miR-181a expression regulates activation of memory T helper (Th)17 cells

    through modulation of ERK phosphorylation. This notwithstanding, no miRs have yet been

    implicated in human γδ T cell differentiation into anti-tumor effectors.

    By performing a ribonucleic acid-sequencing (RNA-seq) analysis, we have been able to

    identify a discrete repertoire of miRs possibly implied in regulating γδ T cell type 1 functional

    differentiation. Selected miRs candidates have been validated by reverse transcriptase-

    polymerase chain reaction (RT-PCR): miR-135b, 10a and 20b were upregulated in mature γδ

    T cells while; miR-181a and 196b were downregulated in mature γδ T cells.

    We next manipulated the expression of these miRs following two different gain-of-function

    strategies (electroporation with mimics and retroviral transduction). We observed that miR-

    181a and 196b overexpression decreases γδ T cell differentiation into type 1 effectors, while

    enhancing their proliferation. On the other hand, our preliminary results indicate that miR-

    135b, 10a and 20b impair γδ T cell proliferation without affecting their anti-tumor functions.

    If confirmed, these findings could have major implications for the manipulation of γδ T cells

    in cancer immunotherapy.

    Keywords: Anti-tumor; Differentiation; γδ T cells; Immunotherapy; microRNA.

  • FFULisboa

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor Human γδ T Cell Differentiation 4

    Resumo

    Desenvolvimentos recentes na área da imunologia validaram a imunoterapia como sendo

    capaz de aumentar a sobrevivência de pacientes com cancro, evidenciando o seu papel

    promissor no tratamento desta doença. No entanto, uma aplicação mais abrangente e bem-

    sucedida da terapia celular adoptiva requer um conhecimento profundo dos determinantes

    moleculares, em linfócitos T efectores, de diferenciação funcional, reconhecimento e

    eliminação de células tumorais.

    Os linfócitos T γδ têm sido propostos como a primeira linha de defesa imunológica, em

    resposta a uma variedade de metabolitos induzidos pelo stress ou associados a organismos

    patogénicos. A activação destas células inclui uma actividade citolítica e inflamatória potente,

    contra uma vasta gama de células malignas, como uma das suas características principais.

    Embora os ensaios clínicos tenham tentado modular a actividade destes linfócitos, estes só

    alcançaram respostas objectivas na ordem dos 10-33%. Tornou-se assim evidente que a

    compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação da activação e da diferenciação

    funcional dos linfócitos T γδ é crítica para a sua manipulação em contextos clínicos.

    De forma importante, resultados obtidos pelo laboratório de acolhimento demonstraram que

    as propriedades anti-tumor efectoras dos linfócitos T γδ eram adquiridas, selectivamente,

    mediante estimulação com IL-2, mas não quando estimulados com IL-7. Os efeitos mediados

    por IL-2 eram dependentes da via de sinalização de MAPK/ERK e induziam a expressão de

    novo dos factores de transcrição T-bet e eomesodermina, assim como da enzima citolítica

    perforina. Com base nestes dados, este projecto propõe explorar um outro nível de regulação

    na diferenciação de linfócitos T γδ, caracterizando os mecanismos pós-transcrição mediados

    por miRs.

    Em mamíferos, mais de 700 miRs foram já identificados e demonstrados como sendo capazes

    de regular vários processos de desenvolvimento e diferenciação. Em relação ao sistema

    imunitário, os padrões de expressão destas pequenas espécies de RNA variam consoante o

    tipo de linfócitos e também de acordo com o estadio de desenvolvimento. Curiosamente,

    alguns estudos demonstraram que esses perfis de expressão são únicos em cada etapa do

    desenvolvimento das células T tímicas. De acordo com esta informação, a remoção dos miRs

    maduros na fase inicial do desenvolvimento de timócitos resultou num bloqueio do seu

    desenvolvimento e na consequente redução de linfócitos T αβ periféricos assim como reduziu

    a pool de células iNKT. Adicionalmente, vários miRs têm sido também correlacionados com

    a desregulação das capacidades efectoras de diversos tipos de linfócitos. Alguns exemplos

    incluem: a sobreexpressão do miR-491 em linfócitos T CD8 + que demonstrou ser capaz de

    diminuir a produção de IFN-γ; a expressão do miR-583 foi correlacionada com a inibição da

    diferenciação de células NK e; a expressão do miR-181a demonstrou regular a activação de

    linfócitos de memória Th17 ao modular a fosforilação da ERK. Apesar disso, não surgiram

    ainda miRs implicados na diferenciação de linfócitos T γδ humanos em efectores anti-

    tumorais.

    Neste trabalho fomos capazes de identificar um repertório discreto de miRs possivelmente

    implicados na regulação da diferenciação funcional do tipo 1 em linfócitos T γδ. Para tal,

    recorremos à análise dos dados obtidos em ensaios de sequenciação de RNA em linfócitos T

  • FFULisboa

    Targeting MicroRNAs for Modulation of the Anti-Tumor Human γδ T Cell Differentiation 5

    γδ imaturos versus maduros, isolados a partir de amostras de timo humano. Utilizando a

    metodologia de RT-PCR validámos esses dados, reduzindo a lista inicial de treze para cinco

    potenciais candidatos: miR-135b, 10a e 20b que se encontravam sobreexpressos em linfócitos

    T γδ maduros e; miR-181a e 196b que tinham expressão reduzida em linfócitos T γδ maduros.

    Surpreendentemente, quando analisada a presença destes miRs por RT-PCR em linfócitos T

    γδ isolados da periferia (i.e. amostras de sangue de dadores saudáveis), o padrão de expressão

    para os cinco candidatos era mais semelhante à sua expressão em timócitos γδ recém-isolados

    – ou seja, imaturos – do que à expressão observada em timócitos γδ em cultura com IL-2 – ou

    seja, maduros/diferenciados. Tais res