T-Zell-Rezeptor Vββ β (TRBV) Dominanz bei der ... TRBV-Repertoire in expandierten...

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Transcript of T-Zell-Rezeptor Vββ β (TRBV) Dominanz bei der ... TRBV-Repertoire in expandierten...

  • T-Zell-Rezeptor V (TRBV) Dominanz bei der

    inflammatorischen Kardiomyopathie (DCMi).

    Dissertation

    zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der

    Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

    eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie

    der Freien Universitt Berlin

    vorgelegt von

    Maria Rohde

    aus Salzwedel

    Mai 2009

  • 1. Gutachter: Prof. Dr. Heinz-Peter Schultheiss

    2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Kleuser

    Disputation am: 24.09.2009

  • Inhaltsverzeichnis

    I

    Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________ I

    1 Einleitung ______________________________________________________________ 1

    1.1 Dilatative Kardiomyopathie (DCM) und inflammatorische Kardiomyopathie

    (DCMi) __________________________________________________________________ 1

    1.1.1 Pathogenese der inflammatorischen Kardiomyopathie (DCMi) _______________ 2

    1.1.2 Pathogenese-Modelle der Myokarditis Einsichten aus tierexperimentellen

    Anstzen _______________________________________________________________ 5

    1.2 T-Zellfunktionalitt in der AMC/DCM ____________________________________ 9

    1.2.1 T-Zellen __________________________________________________________ 9

    1.2.2 T-Zellrezeptor (TCR) _______________________________________________ 13

    1.2.3 T-Zell-Funktionalitt und Marker-Genexpression _________________________ 15

    1.2.4 Datenlage zur TRBV Expression bei experimenteller und humaner Myokarditis und

    DCM / DCMi ____________________________________________________________ 16

    1.3 Zielstellungen der Promotionsarbeit __________________________________ 17

    2 Material und Methoden __________________________________________________ 19

    2.1 Patienten- und Kontrollgruppen ______________________________________ 19

    2.2 Material ___________________________________________________________ 20

    2.2.1 Gerte __________________________________________________________ 20

    2.2.2 Chemikalien und Enzyme ___________________________________________ 21

    2.2.3 Oligodesoxynukleotide _____________________________________________ 21

    2.3 Molekularbiologische Methoden ______________________________________ 25

    2.3.1 Prparation von RNA aus PBMCs und kultivierten Zellen __________________ 25

    2.3.2 Prparation von RNA aus Herzmuskelgewebe und EMBs __________________ 25

    2.3.3 Prparation von DNA aus Gewebe ____________________________________ 26

    2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsuren __________________________ 27

    2.3.5 Reverse Transkription von RNA ______________________________________ 27

    2.3.6 Pramplifikation __________________________________________________ 29

    2.3.7 Real-time RT-PCR ________________________________________________ 31

    2.3.8 Quantifizierung der relativen Genexpression, Berechnung der

    Pramplifikationsuniformitt, der Inter- und der Intra-Assay Varianz ________________ 32

    2.3.9 Agarose-Gelelektrophorese _________________________________________ 33

    2.4 Zellbiologische Methoden ___________________________________________ 34

  • Inhaltsverzeichnis

    II

    2.4.1 Zellkultur ________________________________________________________ 34

    2.4.2 Interferon- Sekretions-Assay ________________________________________ 36

    2.4.3 Immunhistologische Frbung ________________________________________ 36

    2.5 Statistische Analyse ________________________________________________ 38

    3 Ergebnisse ____________________________________________________________ 40

    3.1 Aufbau eines TRBV Nachweis-Systems ________________________________ 40

    3.1.1 RNA-Extraktions-Optimierung _______________________________________ 40

    3.1.2 Entwicklung eines Real-time RT-PCR Systems zum Nachweis des TCR ______ 43

    3.1.3 Entwicklung von Pramplifikationsmethoden zum Nachweis des TCR ________ 49

    3.1.4 Differentielle Genexpressionsanalysen mittels T-PreAmp real-time RT-PCR in

    EMBs von Patienten mit immunhistologischem Nachweis einer DCMi _______________ 61

    3.1.5 Murines SWR-Modell der akuten und chronischen Myokarditis ______________ 64

    3.2 TRBV-Repertoire in expandierten T-Zellen ______________________________ 69

    3.2.1 In vitro Expansion von humanen T-Zellen ______________________________ 69

    3.2.2 TRBV Expression nach T-Zellexpansion _______________________________ 74

    3.3 Analyse der Expression der funktionellen T-Zellmarker (FTZM) und des T-

    Zellrezeptor Vbeta (TRBV) in EMBs __________________________________________ 76

    3.3.1 Ergebnisse der immunhistologischen und virologischen EMB Diagnostik ______ 76

    3.3.2 Genexpression von CD3d, CD3z und TRBC ____________________________ 77

    3.3.3 Immunhistologisch nachgewiesene DCMi und erhhte Expression von CD3d,

    CD3z und TRBC ________________________________________________________ 78

    3.3.4 Expression von funktionellen T-Zellmarker (FTZM) in EMBs ________________ 80

    3.3.5 TRBV Expression in EMBs __________________________________________ 82

    3.4 TRBV-Dominanz und funktionelle Charakterisierung von B19V-NS1-

    antigenspezifischen T-Zellen bei einem Patienten mit akuter B19V assoziierter

    inflammatorischer Kardiomyopathie und initialer B19V Virmie __________________ 85

    3.4.1 Immunhistologischer Verlauf der DCMi ________________________________ 87

    3.4.2 TRBV11 Dominanz der NS1-B19V-antigenspezifischen T-Zellen ____________ 90

    4 Diskussion ____________________________________________________________ 92

    4.1 RNA-Extraktionsoptimierungen an Herzmuskelgewebe ___________________ 92

    4.2 Entwicklung eines Real-time RT-PCR Systems zum Nachweis des TCR _____ 94

    4.2.1 Entwicklung einer Pramplifikation zum Nachweis des TCR ________________ 95

    4.2.2 TRBV- und FTZM-Expression in der experimentellen CVB-induzierten Myokarditis

    bei SWR-Musen _______________________________________________________ 100

  • Inhaltsverzeichnis

    III

    4.3 TRBV-Expression bei in vitro expandierten humanen T-Zellen unter

    Verwendung von feeder cells Einflsse von Zellkulturmedien _________________ 102

    4.4 Analyse der Expression der funktionellen T-Zellmarker (FTZM) und des T-

    Zellrezeptor Vbeta (TRBV) in EMBs _________________________________________ 105

    4.4.1 Potentielle diagnostische Relevanz einer erhhten Expression von CD3d, CD3z

    und TRBC in DCMi _____________________________________________________ 106

    4.4.2 Funktionelle Charakterisierung der T-Zell-Infiltrate bei DCMi _______________ 106

    4.4.3 Virus-assoziierte differentielle TRBV-Expression ________________________ 108

    4.5 TRBV-Dominanz und funktionelle Charakterisierung von B19V-

    antigenspezifischen T-Zellen aus PBMCs bei B19V-assoziierter DCMi ____________ 110

    5 Zusammenfassung ____________________________________________________ 113

    6 Summary _____________________________________________________________ 116

    7 Literatur _____________________________________________________________ 118

    8 Publikationen _________________________________________________________ 139

    9 Danksagung __________________________________________________________ 140

    10 Lebenslauf _________________________________________________________ 141

    Anhang ____________________________________________________________________ I

    Zusammensetzung von Medien, Puffern und Lsungen __________________________ I

    Abkrzungsverzeichnis _____________________________________________________ I

    Abbildungen _____________________________________________________________ IV

    Abbildungsverzeichnis ___________________________________________________ XXI

  • Einleitung

    1

    Einleitung

    1.1 Dilatative Kardiomyopathie (DCM) und inflammatorische

    Kardiomyopathie (DCMi)

    Die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Herzmuskelerkrankung, die durch eine Ein-

    schrnkung der linksventrikulren (LV) und/oder rechtsventrikulren (RV) Funktion bei gleichzei-

    tiger Dilatation des linken (LV) und/oder rechten Ventrikels (RV) charakterisiert ist und sich hu-

    fig in der 3. bis 5. Lebensdekade manifestiert. In den statistischen Erhebungen und Transplanta-

    tionsregistern der letzten Dekade stellt die DCM neben der koronaren Herzkrankheit die hufigs-

    te Ursache der Herzinsuffizienz dar (1, 2). Bei ca. 30% der untersuchten Patienten entwickelt

    sich die Herzinsuffizienz auf dem Boden einer DCM. In der Bundesrepublik Deutschland liegt

    derzeit die Prvalenz der Herzinsuffizienz bei ca. 1,5 Millionen Patienten. Folglich ist davon aus-

    zugehen, dass mindestens 500.000 Patienten an einer DCM leiden.

    Infolge der groen klinischen Relevanz dieses Krankheitsbildes besteht groer Handlungsbe-

    darf zur Entwicklung neuer Diagnose- und Therapieverfahren. Die Bedeutung der DCM wird

    allein daran deutlich, dass diese Erkrankung neben der koronaren Herzkrankheit die Hauptindi-

    kation fr eine Herztransplantation (HTX) darstellt. Nach der Definition der WHO/ISFC Task

    Force on the Definition and Classification of Cardiomyopathies ist eine myokardiale Entzndung

    und/oder Virusinfektion = Inflammatorische Kardiomyopathie (DCMi) die hufigste Ursache einer

    DCM (3). Trotz Fortschritten in der Herzinsuffizienztherapie ist die Prognose dieser Erkrankung

    bei einer 5-Jahres-Mortalitt von mehr als 50% als sehr ernst einzuschtzen. Fr die meisten

    DCM-Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz stellt die Herztransplantation bei Versagen der