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Modulation der immunsuppressiven Funktion

von humanen T-Zell-Rezeptor-αβ+ CD4

- CD8

-

doppelt-negativen T-Zellen

Modulation of the immunosuppressive function of

human T-cell-receptor-αβ+ CD4

- CD8

- double-negative T cells

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Andrea Allgäuer

aus München

2015

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen

Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 07. Oktober 2015

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms

Gutachter: Prof. Dr. Lars Nitschke

Prof. Dr. Andreas Mackensen

Kurzzusammenfassung

Die Population der TZRαβ+ CD4

- CD8

- doppelt-negativen (DN) T-Zellen übt eine

starke suppressive Funktion gegenüber T-Zellantworten aus und ist damit an der

Regulation des Gleichgewichts zwischen Immunreaktivität und Immuntoleranz

beteiligt. So kann ein adoptiver Transfer muriner DN T-Zellen allogene CD4+ und

CD8+ T-Zell-Antworten spezifisch unterdrücken und dadurch die Entwicklung einer

Graft-versus-Host-Disease (GvHD) nach allogener hämatopoetischer Stammzell-

transplantation (HSZT) verhindern. In Hinblick auf einen angestrebten therapeuti-

schen Einsatz der DN T-Zellen wurden in dieser Arbeit potentielle Modulatoren der

suppressiven Aktivität von humanen DN T-Zellen charakterisiert.

Als Modulatoren wurden homöostatische und proinflammatorische Zytokine

untersucht, die nach HSZT erhöhte Serumspiegel aufweisen. Insbesondere

Interleukin (IL)-7 stand aufgrund beschriebener Assoziationen mit der Pathogenese

der GvHD im Zentrum der Untersuchung. Interessanterweise zeigte sich in dieser

Arbeit, dass IL-7 die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber Effektor T-Zell-

Antworten entscheidend beeinträchtigt. Der Verlust der DN T-Zell-Funktion konnte

auf die Aktivierung eines spezifischen Signalweges – dem Akt/mTOR Signalweg – in

den DN T-Zellen zurückgeführt werden. Weitere Untersuchungen an dem

zugrundeliegenden Mechanismus ergaben, dass das durch IL-7 amplifizierte

Akt/mTOR Signal einen Anergie-ähnlichen Phänotyp der DN T-Zellen aufhebt. Die

daraus resultierende gesteigerte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen führte

zu einer Reduktion der suppressiven Aktivität.

Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe weiterer Zytokine,

die mit der GvHD assoziiert sind, die Funktionalität der DN T-Zellen nicht beeinflus-

sen. Das Th2 Zytokin IL-4 hingegen konnte als weiterer Modulator der DN T-Zell-

Suppression identifiziert werden.

IL-4 und IL-7/Akt/mTOR stellen somit Einflussfaktoren der Funktionalität von DN T-

Zellen dar, die als neue Angriffspunkte zur therapeutischen Modulation der

immunregulatorischen Aktivität humaner DN T-Zellen für die Vermeidung der GvHD

dienen können.

Abstract

TCRαβ+ CD4

- CD8

- double-negative (DN) T cells have been described to effectively

suppress immune responses in both mice and humans. In the context of allogeneic

hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) the adoptive transfer of murine DN T

cells specifically suppressed alloreactive T cells and prevented development of graft-

versus-host disease (GvHD). Recently, clinical studies have demonstrated an

inverse correlation between the frequency of DN T cells and the severity of acute

GvHD after HSCT, indicating a therapeutic potential of human DN T cells in HSCT.

So far no study has considered modulation of DN T cell functionality.

After HSCT the concentration of certain homeostatic and proinflammatory cytokines

has been shown to be increased. Thus, this work aimed to elucidate the effect of

these cytokines on the functionality of human DN T cells. Since Interleukin (IL)-7 has

been described to interfere with T-cell function and increased IL-7 serum levels have

been associated with the incidence of GvHD, we first focused on the influence of IL-7

on regulatory function of DN T cells. Intriguingly, we could demonstrate that IL-7

abrogates the suppressive activity of DN T cells towards allogeneic effector T cells

by amplifying the Akt/mTOR pathway. Importantly, selective inhibition of the protein

kinases Akt or mTOR in human DN T cells was able to reverse the effect of IL-7

thereby restoring the functionality of DN T cells, whereas inhibition of other central T

cell signaling pathways did not. Our analysis on the underlying mechanism

suggested that the IL-7/Akt/mTOR signaling cascade reverses an anergy-like status

of the DN T cells. Coincidently, the activation and proliferation of the DN T cells were

shown to be increased and associated with the loss of their suppressive activity.

Of interest, other cytokines associated with GvHD could not impair DN T-cell

functionality. However the Th2 cytokine IL-4 influenced DN T-cell mediated

suppression similar to IL-7.

Together, the present study uncovered that the IL-7/Akt/mTOR network and

potentially IL-4 are critical factors for the suppressive capacity of human DN T cells.

Targeting of these pathways by pharmacological agents may re-establish and

enhance the regulatory function of human DN T cells in GvHD.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .................................................................................. I

Abkürzungsverzeichnis ........................................................................ V

1 Einleitung ......................................................................................... 8

1.1 Immunregulation ......................................................................................... 8

1.1.1 Immunreaktivität und -toleranz ......................................................... 8

1.1.2 Immunantwort nach allogener Stammzelltransplantation............... 10

1.2 DN T-Zellen .............................................................................................. 14

1.2.1 Charakterisierung der DN T-Zellen ................................................ 14

1.2.2 Immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen ............................ 16

1.2.3 Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression .................. 18

1.3 Interleukin-7 .............................................................................................. 21

1.3.1 Rolle von IL-7 im Immunsystem ..................................................... 21

1.3.2 Signaltransduktion von IL-7 ............................................................ 22

1.3.3 Regulation von IL-7 bei Immunkrankheiten .................................... 24

1.4 Zielsetzung ............................................................................................... 27

2 Material und Methoden .................................................................. 29

2.1 Material ..................................................................................................... 29

2.1.1 Medien, Puffer, Lösungen .............................................................. 29

2.1.2 Zytokine und Stimulatoren ............................................................. 30

2.1.3 Inhibitoren ...................................................................................... 31

2.1.4 Magnetische Aufreinigungs-Kits ..................................................... 31

2.1.5 Farbstoffe ....................................................................................... 32

2.1.6 Antikörper ....................................................................................... 32

2.1.7 Molekularbiologische Kits, Primer und Enzyme ............................. 34

Inhaltsverzeichnis II

2.1.8 Verbrauchsmaterialien ................................................................... 34

2.1.9 Software und Datenbanken ........................................................... 35

2.2 Methoden .................................................................................................. 35

2.2.1 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau Ausschlussfärbung ....... 35

2.2.2 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen ................................. 36

2.2.3 Dichtegradientenzentrifugation ...................................................... 36

2.2.4 Elutriation zur Monozyten-Isolation ................................................ 36

2.2.5 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten .................. 37

2.2.6 Magnetische Zellseparation ........................................................... 37

2.2.7 Kultivierung von DN T-Zellen ......................................................... 38

2.2.8 CFSE/ CPD/ VPD -Färbung ........................................................... 38

2.2.9 Suppressionstest ........................................................................... 39

2.2.10 Inhibition von Signaltransduktionswegen ....................................... 40

2.2.11 Durchflusszytometrie ...................................................................... 40

2.2.11.1 Oberflächenfärbung .................................................................. 41

2.2.11.2 Intrazellulärfärbung ................................................................... 41

2.2.11.3 FoxP3-Färbung ......................................................................... 42

2.2.11.4 PhosFlow-Färbung ................................................................... 42

2.2.12 Zellviabilitäts-Bestimmung ............................................................. 43

2.2.13 RNA-Isolation ................................................................................. 44

2.2.14 RNA-Sequenzierung ...................................................................... 44

2.2.15 Reverse Transkription .................................................................... 45

2.2.16 Quantitative Polymerase Kettenreaktion ........................................ 46

3 Ergebnisse ..................................................................................... 47

3.1 Messmethoden zur Bestimmung der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen .............................................................................................. 47

3.2 Untersuchung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 ............................................................................ 52

3.2.1 Expression und Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors ................. 52

3.2.2 Charakterisierung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 .................................................................. 56

3.2.3 Einfluss von IL-7 auf die Zell-Viabilität ........................................... 60

Inhaltsverzeichnis III

3.2.4 Untersuchung der IL-7 Signaltransduktion in DN T-Zellen ............. 62

3.2.5 Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges durch IL-7 ...................... 64

3.2.6 Die Rolle des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression ............................................... 66

3.2.7 Die Rolle weiterer IL-7 induzierter Signalwege bei der Modulation der Suppression .......................................................... 67

3.2.8 Transkriptom-Analyse zur Charakterisierung des molekularen Wirkmechanismus von IL-7/Akt/mTOR in DN T-Zellen .................. 69

3.2.9 Korrelation des Aktivierungs- und Proliferationszustandes von DN T-Zellen mit der suppressiven Funktion ................................... 77

3.2.10 Modell: Mechanismus zur Modulation der suppressiven Fähigkeit von humanen DN T-Zellen ............................................. 81

3.3 Charakterisierung weiterer Modulatoren der Suppression ........................ 82

3.3.1 Akt/mTOR als Angriffspunkt zur Modulation der Suppression ....... 82

3.3.2 Modulation der Suppression durch proinflammatorische Zytokine ......................................................................................... 83

3.3.3 Modulation der Suppression durch γ-Ketten-Zytokine ................... 84

4 Diskussion ..................................................................................... 86

4.1 Modulation der humanen DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7…………………………………………………………………… .............. 86

4.1.1 Einfluss von IL-7 auf die suppressive Aktivität humaner DN T-Zellen ............................................................................................. 86

4.1.2 Signaltransduktion in den DN T-Zellen .......................................... 91

4.1.3 Molekularer Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR ............... 97

4.2 Charakterisierung weiterer Modulatoren der DN T-Zell-Suppression ..... 101

4.3 Zusammenfassung und Ausblick ............................................................ 104

5 Verzeichnisse ............................................................................... 107

5.1 Abbildungsverzeichnis ............................................................................ 107

5.2 Literaturverzeichnis ................................................................................. 109

Inhaltsverzeichnis IV

6 Anhang ......................................................................................... 130

6.1 Veröffentlichungen .................................................................................. 130

6.2 Danksagung ........................................................................................... 131

Abkürzungsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Beschreibung

7-AAD 7-Aminoactinomycin (Avitalfarbstoff)

αCD3/28 Anti-CD3/CD28 gekoppelte Beads

γc γ-chain (γ-Untereinheit bestimmter Zytokinrezeptoren)

Akt Alternative Bezeichnung: Proteinkinase B

ALPS Autoimmun Lmyphoproliferatives Syndrom

AML Akute Myeloische Leukämie

AMPK AMP-aktivierte Proteinkinase

AxV Annexin-V

APZ Antigen-präsentierende Zelle/n

Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (Transkriptionsfaktor)

CBL Casitas B-lineage Lymphoma (E3 Ubiquitin-Protein Ligase)

CD Cluster of Differentiation (Gruppen von Oberflächenproteinen zur Immunphänotypisierung von Zellen)

cDNA Komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester (fluoreszierender Zellfarb-stoff)

CPD Cell Proliferation Dye eFluor 670 (Zellfarbstoff)

CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CD152

DMSO Dimethylsulfoxid (Lösungsmittel)

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

DN T-Zelle Doppelt-negative T-Zelle

DZ Dendritische Zelle/n

EGR Early growth response proteine (Transkriptionsfaktor)

Erk Extracellular-signal regulated kinase

FACS Fluorescence-activated cell sorting (zytometrisches Messverfahren)

FasL Fas Ligand

FCS Fötales Kälberserum

FoxO Forkhead-Box-Protein O (Transkriptionsfaktor)

FoxP3 Forkhead-Box-Protein P3 (Transkriptionsfaktor)

GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (Zytokin)

Abkürzungsverzeichnis VI


GSK-3β Glykogensynthase-Kinase 3β

GvHD Graft-versus-Host-Disease

GvL Graft-versus-Leukämie

HIF Hypoxie-induzierter Faktor (Transkriptionsfaktor)

HLA Humane Leukozytenantigene

HSZT Hämatopoetische Stammzelltransplantation

IFN Interferon

IGF-1 Insulin-like growth factor 1

IL Interleukin

IL-7R Interleukin-7 Rezeptor

IPA Ingenuity Pathway Analysis (Software zur Auswertung von Transkriptom-Daten)

IRF4 Interferon regulatory factor 4 (Transkriptionsfaktor)

JAK Januskinase

JNK c-Jun N-terminale Kinase

Ki-67 Zellproliferationsmarker-Protein

KLF4 Kruppel-like factor 4 (Transkriptionsfaktor)

lpr lymphoproliferativ

LPS Lipopolysaccharid

Ly-6A Lymphocyte antigen 6 complex, locus A

MAPK Mitogen-aktivierte Protein Kinase

MFI Mittlere Fluoreszenzintensität

MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätsantige-ne)

MLR Mixed Lymphocyte Reaction

mTOR mechanistic Target of Rapamycin

n Anzahl an durchgeführten Experimenten

NFAT Nuclear factor of activated T cells (Transkriptionsfaktor)

NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (Transkriptionsfaktor)

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

p27kip1

Alternative Bezeichnung: Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 1B

Abkürzungsverzeichnis VII


PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell (Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PGE2 Prostaglandin E2

PI3K Phosphoinositid-3-Kinase

PTEN Phosphatase und Tensin Homolog

qPCR Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

S6 Ribosomales Protein S6

SC-79 Akt Aktivator (C17H17CIN2O5)

SH2 Src Homology 2 –Domäne (vermittelt Interaktion mit phosphorylier-ten Proteinen)

SLE Systemischer Lupus Erythematodes

STAT Signal Transducers and Activators of Transcription

T-bet T-Box Transkriptionsfaktor

TGF-β Transforming growth factor β

Th3 Typ 3 T-Helferzelle/n

TNF Tumornekrosefaktor

Tr1 Regulatorische T-Zelle Typ 1

Treg-Zelle Regulatorische T-Zelle (CD4+ FoxP3

+ CD25

+)

TZR T-Zell-Rezeptor

VPD Violet Proliferation Dye 450 (Zellfarbstoff)

8 1 Einleitung

1 Einleitung

1.1 Immunregulation

1.1.1 Immunreaktivität und -toleranz

Das Immunsystem bezeichnet das Organsystem höherer Lebewesen, welches dem

Schutz vor Krankheitserregern dient. Es ist für die Beseitigung von Pathogenen und

für die Elimination von entarteten körpereigenen Zellen verantwortlich. Die

Immunabwehr teilt sich auf zwei miteinander interagierende Systeme, dem

angeborenen und dem adaptiven Immunsystem, auf. Das angeborene Immunsystem

stellt die erste Verteidigungslinie des Körpers dar und ist in der Lage, Pathogene

unspezifisch zu erkennen und abzuwehren. Das adaptive Immunsystem hingegen

zeichnet sich durch hohe Spezifität und die Fähigkeit zur Gedächtnisausbildung aus.

Die Zellen des adaptiven Immunsystems, die Lymphozyten, tragen einzigartige

Rezeptoren, mit denen sie spezifische Strukturen der Krankheitserreger, die

sogenannten Antigene, erkennen können. Hat ein Lymphozyt sein spezifisches

Antigen erkannt, kann dieser zu Effektor-Lymphozyten klonalen Ursprungs

differenzieren und diverse Mechanismen zur Beseitigung des Erregers in Gang

setzen. Extrazelluläre Erreger werden dabei vor allem durch B-Lymphozyten erkannt,

die nach Aktivierung lösliche Antikörper zu dessen Abwehr sekretieren. Intrazellulär

infizierte Zellen sowie entartete körpereigene Zellen werden von T-Lymphozyten

erkannt und durch unterschiedliche Effektormechanismen eliminiert: zytotoxische T-

Lymphozyten, die durch den CD8-Rezeptor charakterisiert sind, lysieren und

zerstören die Zielzelle direkt; CD4+ Helfer T-Lymphozyten produzieren bestimmte

Zytokine, die eine Reihe weiterer Effektorzellen, darunter B-Zellen und phagozy-

tierende Makrophagen, aktivieren und kontrollieren können [1, 2].

Zur Induktion einer adaptiven Immunantwort werden Antigen-präsentierende Zellen

(APZ) benötigt, die pathogenes Material prozessieren und die resultierenden Peptide

über MHC-Moleküle (von engl. Major Histocompatibility Complex, Haupthistokompa-

tibilitätskomplexe) als Antigen präsentieren. Anschließend können naive T-

Lymphozyten über ihren T-Zell-Rezeptor (TZR) diese Antigene erkennen. Zudem

präsentieren APZ kostimulatorische Moleküle, welche an spezielle Rezeptoren der T-

9 1 Einleitung

Zellen binden und hierdurch die vollständige Aktivierung der T-Lymphozyten

induzieren. Abhängig vom jeweiligen Zytokinmilieu reifen die aktivierten T-Zellen zu

Zellen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen heran, um letztlich das Pathogen zu

eliminieren [3-5].

Die Aktivierung einer Immunantwort muss streng reguliert werden, damit keine

Gewebsschäden im Körper entstehen. Damit körpereigene Substanzen (Selbstanti-

gene) keine Immunantwort auslösen, wird über verschiedene Mechanismen die

immunologische Selbsttoleranz geregelt. Ein zentraler Toleranzmechanismus findet

bereits während der T-Zell-Entwicklung im Thymus statt, indem neugebildete

Lymphozyten, die eine starke Autoreaktivität aufweisen, über Apoptoseinduktion

klonal deletiert werden. Wie die Nobelpreisträger Medawar und Burnet erstmals

zeigten, findet diese Toleranzinduktion bereits im Embryo statt [6-8]. Darüber hinaus

existieren außerhalb des Thymus weitere periphere Toleranzmechanismen, die die

Selbsttoleranz reifer Lymphozyten gewährleisten. Diese beruhen auf Anergie,

Deletion und Suppression mit Hilfe regulatorischer T-Zellen [9]. Anergie bezeichnet

das Abschalten einer funktionellen Immunantwort aufgrund fehlender Reaktion auf

ein Antigen. Diese zelluläre Inaktivierung kann infolge eines fehlenden oder eines

negativen kostimulatorischen Signales bei der T-Zell-Rezeptor-Stimulation erfolgen

und führt zur Tolerierung des Selbstantigens. Intensive Untersuchungen der letzten

Jahre an anergen Zellen haben gezeigt, dass bestimmte hemmende Faktoren durch

unvollständige Stimulationssignale induziert werden und diese Faktoren aktiv einen

anergen Zustand herbeiführen [10]. Reaktive Zellen können außerdem über

Aktivierungs-induzierten Zelltod deletiert werden. Über Todesrezeptoren wie dem

Fas-Rezeptor oder TRAIL (von engl. TNF-related apoptosis-inducing ligand) kann

dabei in der Zielzelle Apoptose induziert werden [11]. Des Weiteren spielen

regulatorische T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Selbsttole-

ranz. Verschiedene immunregulatorische T-Zell-Subpopulationen können dabei mit

unterschiedlichen Mechanismen Immunantworten kontrollieren. Die derzeit am

Intensivsten untersuchte Population von regulatorischen T-Zellen sind CD4+ T-

Zellen, deren Entwicklung und Funktion von der konstitutiven Expression des

Transkriptionsfaktors FoxP3 (Forkhead box P3) sowie der α-Kette des Interleu-

10 1 Einleitung

kin(IL)-2 Rezeptors (CD25) abhängt [12-14]. Die CD4+ FoxP3

+ CD25

+ T-Zellen

(Treg-Zellen) machen im Mensch circa 2% aller T-Lymphozyten aus. Ihrer

immunregulatorischen Funktion kommt bei der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz

und Vermeidung von Autoimmunkrankheiten eine entscheidende Bedeutung zu [15-

20]. So führt beim Mensch ein Verlust der Treg-Zellen durch Mutationen im FoxP3-

Gen zur Autoimmunkrankheit IPEX (immunodysregulation polyendocrinopathy

enteropathy X-linked syndrome) [21, 22]. Außerdem spielen die Treg-Zellen eine

Rolle bei der Regulation von Immunreaktionen gegen Infektionen, Tumore,

Transplantate und Allergene [18, 23-26].

Innerhalb der CD4+ T-Zell-Population stehen darüber hinaus noch zwei weitere

Subpopulationen, die Typ 3 T-Helferzellen (Th3) und die regulatorischen T-Zellen

Typ 1 (Tr1) aufgrund ihrer suppressiven Aktivität im Fokus vieler Forschungsarbeiten

[27-30]. Zudem konnten auch innerhalb der CD8+ Population T-Zellen mit

immunregulatorischer Funktion identifiziert werden, welche durch die Marker CD103+

oder CD28- charakterisiert wurden [31-33]. Die doppelt-negativen T-Zellen, die im

Rahmen dieser Doktorarbeit im Detail analysiert werden, tragen weder den CD4

noch den CD8 Korezeptor und bilden eine weitere interessante Untergruppe der

immunregulatorischen T-Zellen.

Dem Gleichgewicht zwischen Immunreaktivität und Immuntoleranz kommt insofern

eine entscheidende Bedeutung zu, da eine Reaktion des Immunsystems gegen

Krankheitserreger und Tumore essentiell für die Gesundheit ist, jedoch eine zu

starke Reaktion beziehungsweise fehlende Toleranz gegenüber Selbstantigenen

Autoimmunkrankheiten auslösen kann. Insbesondere nach Transplantationen liegt in

dem Einstellen dieser Balance eine große therapeutische Herausforderung, um eine

Transplantatabstoßung durch reaktive Immunzellen zu verhindern.

1.1.2 Immunantwort nach allogener Stammzelltransplantation

Die Transplantation von allogenen hämatopoetischen Stammzellen (HSZT) stellt ein

wichtiges kuratives Therapieverfahren bei verschiedenen Formen der Leukämie und

malignen Lymphomen sowie bei manchen angeborenen Immunschwächekrankhei-

11 1 Einleitung

ten dar. Zur Behandlung des erkrankten blutbildenden oder lymphatischen Systems

werden dabei hämatopoetische Stammzellen von einem gesunden Spender auf den

Patient übertragen. Zur Vorbereitung auf eine allogene hämatopoetische Stammzell-

transplantation wird der Patient einer Konditionierungstherapie unterzogen. In der

Regel wird das kranke Knochenmark hierbei durch eine Kombination aus

Chemotherapie und Bestrahlung zerstört, um die bösartigen Zellen abzutöten und

das Immunsystem vor der Transplantation zu unterdrücken. Die Blutstammzellen

eines gesunden Spenders werden auf den Patient übertragen und rekonstituieren

dessen Hämatopoese [34].

Für den Erfolg der Stammzelltransplantation spielen T-Zellen eine bedeutende Rolle.

Die transplantierten T-Zellen können einerseits residuelle Tumorzellen des

Empfängers erkennen und eliminieren. Dieser erwünschte Graft-versus-Leukämie

(GvL)-Effekt ist für die Erreichung einer kompletten Remission und Vermeidung

eines Rezidives der Erkrankung von großer therapeutischer Bedeutung [35, 36].

Zudem werden die T-Zellen zur Bekämpfung von opportunistischen Infektionen

benötigt. Wenn die T-Zellen des Spenders anderseits auch das Gewebe des

Empfängers als fremd erkennen und angreifen, verursachen sie die Hauptkomplika-

tion der HSZT, die Graft-versus-Host-Disease (GvHD). Auslöser dieser Gewebeun-

verträglichkeit sind die polymorphen Gene des MHC – im Menschen HLA (Humane

Leukozytenantigene), die sich zwischen Spender und Empfänger außer bei

syngenen eineiigen Zwillingen unterscheiden. Diese nicht-identischen MHC-Moleküle

können von alloreaktiven T-Zellen des Transplantats erkannt werden und eine

Immunreaktion gegen das Empfängergewebe induzieren. Die Ausgangsfrequenz von

T-Zellen, die auf allogene HLA-Moleküle reagieren, kann bis zu 10% betragen [37,

38]. Man unterscheidet zwischen der direkten und der indirekten Allogen-Erkennung

[39]. Bei der direkten Erkennung reagiert der TZR der Spender T-Zelle mit dem

allogenen MHC-Komplex einer Empfänger-APZ. Bei der indirekten Erkennung

werden fremde MHC-Moleküle von Spender-APZ aufgenommen, prozessiert und an

Spender-T-Zellen präsentiert. Die Beobachtung, dass GvH-Reaktionen auch in HLA-

identischen Zwillingspaaren ausgelöst werden können, führte zu der Entdeckung der

Minor-Histokompatibilitätsantigene (mHA) [40, 41]. mHA sind polymorphe Proteine,

12 1 Einleitung

die in Spender und Empfänger unterschiedlich exprimiert werden und nach

Prozessierung in APZ ebenso über MHC-Moleküle präsentiert werden.

Um die Entwicklung einer GvHD zu vermeiden, werden die MHC-Typen von Spender

und Empfänger zur Minimierung der Alloreaktivität aufeinander abgestimmt [42]. Da

jedoch selbst bei einer MHC-Übereinstimmung die mHA eine Immunreaktion

hervorrufen können, kommt es bis heute häufig zum Auftreten einer akuten oder

chronischen GvHD. Die akute GvHD kann bereits einige Tage nach Transplantation

auftreten und wird durch alloreaktive T-Zellen des Transplantats vermittelt, die das

Empfänger-Gewebe schädigen, indem sie selbst zytotoxische Effektormoleküle

produzieren oder inflammatorische Zytokine zur Aktivierung weiterer Effektorzellen

sekretieren. Insbesondere die Haut, die Leber und der Gastrointestinaltrakt werden

dadurch angegriffen und zerstört. Abbildung 1-1 zeigt schematisch die zugrundelie-

genden Mechanismen der GvHD-Induktion.

13 1 Einleitung

Abbildung 1-1: Pathophysiologie der akuten GvHD (modifiziert nach [43]). Durch die

Konditionierungstherapie vor HSZT werden im Patienten Gewebeschäden hervorgerufen,

die zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin (IL)-1 und Tumor

Nekrose Faktor (TNF) führen. Empfänger-APZ werden infolgedessen aktiviert und

exprimieren verstärkt kostimulatorische Moleküle sowie MHC- und Adhäsions-Moleküle.

Schädigungen an der Mukosa des Darmtraktes führen zum Eintritt von gramnegativen

Bakterien in die Blutbahn und nachfolgend zur Ausschüttung von Lipopolysacchariden

(LPS). Diese inflammatorischen Stimuli fördern die Aktivierung der APZ. Transplantierte

Spender-T-Zellen migrieren in sekundäre lymphatische Organe und werden durch die APZ

aktiviert. Die aktivierten T-Zellen expandieren, differenzieren zu Effektorzellen und verlassen

das lymphatische Gewebe, um in typische Zielorgane wie Darm, Haut und Leber zu

migrieren. In dieser Effektor-Phase kommt es zu einer komplexen Kaskade aus zellulären

und inflammatorischen Prozessen. Die von aktivierten T-Zellen sezernierten Zytokine (zum

Beispiel IL-2 und Interferon (IFN)-γ) aktivieren hierbei weitere Zellen des adaptiven und

angeborenen Immunsystems, wodurch die Gewebeinflammation und zytotoxische

Gewebeschädigung weiter vorangetrieben wird. [44, 45]

14 1 Einleitung

Die chronische GvHD ist durch eine langsamere Gewebsschädigung gekennzeich-

net, die frühestens 100 Tage nach HSZT auftritt. Sie wird sowohl durch T- und B-

Zellen vermittelt und geht mit pathologischen Veränderungen der Blutgefäße einher.

Trotz stetiger Fortschritte im immunologischen Verständnis der GvHD sowie ihrer

Prävention und Behandlung erkrankt gegenwärtig die Mehrheit der Patienten nach

HSZT an einer GvHD. Die GvHD-bedingte Mortalitätsrate liegt zwischen 15-19% [46-

48].

Zur Behandlung der akuten und chronischen GvHD werden standardmäßig

immunsuppressive Kortikosteroide eingesetzt, um die T-Zell-Immunantwort sowie die

Inflammation systemisch zu unterdrücken [49, 50]. Diese Therapie birgt jedoch die

Gefahr eines Rezidivs der Grunderkrankung und einer erhöhten Anfälligkeit für

opportunistische Infektionen. Da die GvHD bei einigen Patienten Steroid-refraktär ist,

werden derzeit diverse neue Therapieansätze erarbeitet beziehungsweise evaluiert

[51]. Als eine neuartige und vielversprechende Strategie zeichnet sich dabei die

spezifische Regulation der alloreaktiven T-Zellen mittels zellulärer Toleranzinduktion

ab. Für diesen zelltherapeutischen Ansatz kommen experimentell verschiedene

regulatorische Zellpopulationen in Frage. Diverse Modellsysteme zeigten, dass der

adoptive Transfer von Treg-Zellen eine Linderung und/oder Schutz der GvHD

vermitteln kann [52, 53]. Ein therapeutischer Einsatz der Treg-Zellen gegen humane

GvHD wird derzeit in klinischen Studien geprüft.

1.2 DN T-Zellen

1.2.1 Charakterisierung der DN T-Zellen

Neben den eben erwähnten Treg-Zellen weisen auch die TZRαβ+ CD4

- CD8

-

(doppelt-negativen, DN) T-Zellen eine immunsuppressive Funktion und damit

einhergehend das Potential zur therapeutischen Regulation der Immuntoleranz auf.

Sowohl in der Maus als auch beim Menschen wurde die Existenz von T-Zellen mit

diesem spezifischen Phänotyp in lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben

beobachtet [54]. Neue Studien zeigten, dass die DN T-Zell-Population 1-5% aller im

Blut zirkulierenden TZRαβ+ T-Zellen ausmacht [55, 56]. DN T-Zellen sind durch ein

15 1 Einleitung

besonderes Expressionsprofil an Oberflächenmolekülen und Zytokinen sowie durch

ein spezifisches epigenetisches Muster charakterisiert [56, 57]. So exprimieren DN

T-Zellen den TZRαβ in Kombination mit dem CD3 Rezeptor, allerdings weder den

CD4 noch den CD8 Korezeptor. In Gegensatz zu CD4- CD8

- invarianten NK-T-Zellen

tragen die DN T-Zellen ein polyklonales Repertoire an TZR und keine NK-Zellmarker

wie CD16 oder CD56 [56]. Außerdem zeigen DN T-Zellen weder eine Expression

des Treg-assoziierten Transkriptionsfaktors FoxP3 noch des koinhibitorischen CTLA-

4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CD152). Die Expression von CD25

kann durch Stimulation induziert werden. Im ruhendem Zustand findet man DN T-

Zellen sowohl mit naiven Phänotyp als auch mit antigenerfahrenen Effektor- und

Gedächtnis-Phänotyp [56, 58].

Eine weitere Charakterisierung der DN T-Zellen kann anhand deren Zytokinprodukti-

on erfolgen. Nach Aktivierung sind die DN T-Zellen durch eine überwiegende

Interferon-γ (IFN-γ) Produktion gekennzeichnet [55, 56]. Die hohe IFN-γ Expression

scheint durch eine im Vergleich zu CD4+ und CD8

+ T-Zellen starke Demethylierung

des IFN-γ-Gens in DN T-Zellen ermöglicht zu werden [57]. Die Beobachtung einer

erhöhten Transkription von IFN-γ-regulierten Genen in murinen DN T-Zellen lässt

weiterhin vermuten, dass DN T-Zellen das produzierte IFN-γ auch autokrin nutzen

[59]. Neben IFN-γ wurde in murinen DN T-Zellen die Sekretion der Zytokine TNF

(Tumornekrosefaktor) und TGF-β (von engl. transforming growth factor β)

nachgewiesen [55]. Die Zytokine IL-2, IL-4 und IL-10 werden von DN T-Zellen nicht

oder nur in sehr geringfügigen Mengen produziert [56].

Das Methylierungsprofil humaner DN T-Zellen weist darauf hin, dass die für IL-17

und IL-18 codierenden Gene in den DN T-Zellen gut zugänglich sind [57]. Bisher

wurden diese proinflammatorischen Zytokine in DN T-Zellen nicht nachgewiesen,

jedoch wäre eine Produktion unter pathologischen Bedingungen denkbar. Hinweise

auf proinflammatorische DN T-Zellen, die IL-17 produzieren, gibt es aus Infektions-

modellen mit Francisella tularensis und Listeria monocytogenes sowie von Patienten

mit der Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) [60-62].

16 1 Einleitung

1.2.2 Immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen

Ein zentrales Charakteristikum der DN T-Zellen liegt in ihrer Funktion, verschiedene

Immunantworten regulieren zu können. Eine suppressive Aktivität von DN T-Zellen,

die eindeutig durch den TZRαβ definiert und somit von TZRγδ+ T-Zellen abgegrenzt

wurden, wurde erstmals von Strober et al. beschrieben [63]. So zeigte sich, dass DN

T-Zellen in der Lage sind, immunologische Toleranz gegenüber Selbst- und Allo-

Antigenen zu kontrollieren.

Die Rolle der DN T-Zellen zur Erhaltung der Selbsttoleranz wurde in unterschiedli-

chen Diabetes mellitus Typ I in vivo Studien nachgewiesen. Die autoreaktiven T-

Zellen, die die Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas angreifen und dadurch

die autoimmune Stoffwechselkrankheit verursachen, können durch murine DN T-

Zellen unterdrückt werden. Durch die Gabe oder Anreicherung autologer DN T-

Zellen kann so eine Ausbildung des Diabetes mellitus verhindert werden [64-67].

Eine ungewöhnlich hohe Frequenz an DN T-Zellen findet man in Mäusen mit

Defekten in der Fas/FasLigand-vermittelten Apoptose [54, 68]. Diese lpr (lympho-

proliferativen) oder gld (von engl. generalized lymphoproliferative disease) Mäuse

entwickeln eine lymphoproliferative Autoimmunkrankheit, die dem menschlichen

Autoimmunen Lymphoproliferativen Syndrom (ALPS) sehr ähneln [69]. Die

aktivierten DN T-Zellen von lpr-Mäusen können in vitro und in vivo die Proliferation

von Effektor-T-Zellen supprimieren, wenn diese einen funktionellen Fas-Rezeptor

exprimieren. Aus diesen Studien kann geschlossen werden, dass lpr Mäuse eine

Autoimmunkrankheit entwickeln, weil DN T-Zellen ohne Fas Rezeptor keine

zytotoxische Aktivität mehr ausüben können. Die erhöhte Anzahl an DN T-Zellen

könnte daher teilweise aus einem fehlgeschlagenem Versuch zur Kompensation der

defekten Suppression resultieren [70, 71]. Patienten mit ALPS und SLE weisen

ebenfalls eine erhöhte Frequenz an DN T-Zellen auf [72-74]. Inwieweit diese DN T-

Zellen noch über eine immunregulatorische Funktion verfügen oder deren defekte

Funktionalität mit der Krankheitsentstehung in Zusammenhang steht, ist Bestandteil

laufender Forschungsarbeiten.

17 1 Einleitung

Über die Regulation von Autoimmunantworten hinaus sind DN T-Zellen auch bei der

Regulation allogener Immunreaktionen beteiligt. Zhang et al. zeigten erstmals, dass

murine DN T-Zellen Antigen-spezifisch Toleranz gegenüber allogenen Transplanta-

ten vermitteln können, indem sie CD8+ T-Zellen, welche die gleiche TZR-Spezifität

aufweisen, spezifisch eliminieren. Durch diese suppressive Aktivität der DN T-Zellen

konnte die Abstoßung von allogenen Hauttransplantaten verhindert werden [55]. Wie

Untersuchungen an weiteren Mausmodellen zeigten, konnten DN T-Zellen nicht nur

CD8+ T-Zellen sondern auch CD4

+ T-Zellen unterdrücken [70]. Dadurch konnten die

DN T-Zellen beispielsweise auch bei xenogenen Herztransplantaten eine

Immuntoleranz induzieren [75, 76].

Die Bedeutung der DN T-Zell-vermittelten Suppression gegenüber alloreaktiven

Effektor-T-Zellen nach HSZT wurde in verschiedenen Untersuchungen belegt. In

einem transgenen Mausmodell von Young et al. wurde durch Injektion von CD8+ T-

Zellen in eine bestrahlte Maus mit einem nichtübereinstimmenden MHC eine GvHD

ausgelöst [77]. Wurden dagegen DN T-Zellen zusammen mit den dazu syngenen

CD8+ T-Zellen transplantiert, konnte die Ausbildung der GvHD unterdrückt werden.

Bei Knochenmarkstransplantationen von nicht-transgenen MHC-nichtidenten

Mäusen zeigte sich, dass im Gegensatz zu CD4+ oder CD8

+ T-Zellen durch die

Übertragung von DN T-Zellen keine GvHD verursacht wird [78, 79]. Vielmehr

vermittelten die murinen DN T-Zellen Spender-spezifische Allo-Toleranz nach HSZT.

Diese Ergebnisse konnten in neueren Studien, welche zeigten, dass murine DN T-

Zellen alloreaktive Effektor-T-Zellen und auch NK-Zellen supprimieren und hierdurch

die GvHD verhindern, bestätigt werden [79, 80].

Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass humane DN T-Zellen ebenfalls eine

starke immunregulatorische Funktion aufweisen. So konnten DN T-Zellen die

Proliferation und Effektorfunktion von alloreaktiven CD4+ und CD8

+ T-Zellen

unabhängig von deren Differenzierungsstadium unterdrücken [81]. Erste klinische

Studien zeigten das Potenzial der humanen DN T-Zellen bei der Toleranzinduktion

nach HSZT auf. So wurde bei Patienten nach HSZT eine inverse Korrelation

zwischen der Frequenz zirkulierender DN T-Zellen und der Schwere der GvHD

festgestellt. Je mehr DN T-Zellen vorhanden waren, desto wenig GvHD wurde

18 1 Einleitung

beobachtet, wobei keiner der Patienten mit mehr als 1% DN T-Zellen eine schwere

GvHD (Grad 2-4) entwickelte. Eine geringe Anzahl an DN T-Zellen konnte dagegen

mit einer Expansion an alloreaktiven Effektor T-Zellen assoziiert werden [82]. In

Patienten mit akuter GvHD konnte im Vergleich zu Patienten ohne GvHD eine

langsamere Rekonstitution an DN T-Zellen beobachtet werden. Generell rekonstitu-

ierten sich die DN T-Zellen deutlich zügiger als die Treg-Zellen. Die absolute DN T-

Zellzahl an Tag 60 und 90 nach allogener HSZT korrelierte dabei invers mit dem

Auftreten einer akuten GvHD [83]. Daher liegt die Vermutung nahe, dass auch

humane DN T-Zellen vor dem Auftreten einer GvHD schützen können.

Interessanterweise sind die DN T-Zellen nicht nur in der Lage, eine GvHD zu

verhindern, sondern außerdem lymphatische Tumorzellen anzugreifen. So konnte

eine Injektion von murinen DN T-Zellen das Auswachsen eines Tumors verhindern

und somit einen GvL-Effekt erzielen. In vitro ließ sich eine starke zytotoxische

Aktivität der murinen DN T-Zellen gegen Lymphomzellen nachweisen [84, 85]. In

einer prä-klinischen Studie bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML)

wurden DN T-Zellen isoliert und nach ihrer Expansion analysiert. Bei sechs von

sieben Patienten zeigten die DN T-Zellen eine lytische Aktivität gegen autologe

Leukämiezellen [86]. Die Identifizierung von DN T-Zellen, die ein spezifisches

Melanom-Antigen erkennen, verstärkt die potentielle Rolle der DN T-Zellen bei der

Tumorbekämpfung [87].

Aufgrund der immunregulatorischen Funktion der DN T-Zellen und ihrer Auswirkung

auf sowohl die GvHD-Regulation als auch den GvL-Effekt kommen die DN T-Zellen

für innovative Zell-basierte Immuntherapien in Frage.

1.2.3 Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression

Im Gegensatz zu Treg-Zellen, die ihre suppressive Aktivität unabhängig vom Antigen

vermitteln, können murine DN T-Zellen Immunreaktionen Antigen-spezifisch

unterdrücken. DN T-Zellen sind zur Trogozytose befähigt, was bedeutet, dass

allogene MHC-Peptide über den TZR von der DN T-Zelle aufgenommen und

präsentiert werden [88]. Dadurch können syngene CD8+ T-Zellen, die die gleiche

19 1 Einleitung

Antigenspezifität aufweisen, unterdrückt werden [56, 89]. Die spezifische CD8+ T-

Zelle wird durch die DN T-Zelle über einen Zellkontakt-abhängigen Mechanismus

eliminiert, indem über eine Fas/FasL-Interaktion ein Todessignal induziert wird [55].

So zeigten murine DN T-Zellen mit einem blockierten oder defekten FasL-Rezeptor

eine stark verminderte suppressive Aktivität gegenüber CD8+ T-Zellen [55, 70].

Abbildung 1-2 zeigt auf, mit Hilfe welcher Mechanismen DN T-Zellen in der Maus

andere Immunzellen unterdrücken können. Neben der Fas/FasL-basierenden

Suppression können DN T-Zellen allo- oder autoreaktiven Effektor T-Zellen auch

über einen weiteren Mechanismus eliminieren. DN T-Zellen schütten dabei die

zytolytischen Proteine Perforin und Granzym B aus, die in der Zielzelle Apoptose

induzieren [90]. Da bei einem Fehlen von Ly-6A (von engl. lymphocyte antigen 6

complex, locus A) die Suppression der DN T-Zellen beeinträchtigt wird, scheint

dieses Oberflächenprotein ebenso an der Regulation von T-Zellantworten beteiligt zu

sein [91]. Der genaue Mechanismus und der Ligand von Ly-6A sind jedoch noch

unklar. Bemerkenswerterweise kann die zytotoxische Aktivität der DN T-Zellen durch

IL-10 beeinträchtigt werden [92]. Inwieweit weitere Zytokine die Funktionalität der DN

T-Zellen beeinflussen können, wurde dagegen noch nicht untersucht.

Murine DN T-Zellen sind dazu in der Lage, nicht nur T-Zellantworten zu unterbinden,

sondern auch weitere Immunzellen zu supprimieren. Bislang konnte gezeigt werden,

dass DN T-Zellen auch B-Zellen, NK-Zellen und DZ durch Fas/FasL-Interaktion oder

über Perforin/Granzym B regulieren können [78, 90, 93]. Zudem konnten DN T-

Zellen eine verminderte Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und

CD86 auf DZ induzieren und dadurch eine Immunreaktion unterdrücken [93].

20 1 Einleitung

Abbildung 1-2: Mechanismus der murinen DN T-Zell-vermittelten Suppression

(modifiziert nach [94])

Während mit Hilfe verschiedener Mausmodelle der molekulare Mechanismus der DN

T-Zell-Funktion charakterisiert werden konnte, liegen von den entsprechenden

humanen Zellen wenige Daten vor. Völkl et al. zeigten, dass humane DN T-Zellen

über ihren TZR aktiviert werden müssen, um ihre suppressive Funktion gegenüber T-

Zellantworten ausüben zu können. Nach Aktivierung konnten die DN T-Zellen die

Proliferation sowie die Produktion von Effektormolekülen der alloreaktiven T-Zellen

effektiv und dosisabhängig unterdrücken. Im Gegensatz zum Mausmodell wurden

die Effektor T-Zellen dabei nicht über Fas/FasL oder Perforin/Granzym B eliminiert.

Statt die Effektor T-Zellen abzutöten, wurden diese durch einen aktiven Suppressi-

onsmechanismus der DN T-Zellen gehemmt. Die suppressive Aktivität der DN T-

Zellen wurde dabei weder durch eine indirekte Modulation der APZ noch durch eine

Kompetition um Wachstumsfaktoren wie IL-2 oder noch durch immunsuppressive

Zytokine vermittelt. Vielmehr nutzten die DN T-Zellen einen Zell-Zell-Kontakt-

abhängigen Mechanismus, der aktiv den Zellzyklus in der Zielzelle hemmt. Da

Blockadeexperimente zeigten, dass die DN T-Zellen nach TZR-Stimulation für ihre

suppressive Aktivität auf die Synthese und Translokation von Proteinen angewiesen

sind, wäre ein Zellkontakt-abhängiger Mechanismus über inhibitorische Rezeptoren

21 1 Einleitung

denkbar. [81] Welche Signalwege von der TZR-Aktivierung bis hin zur Proteinsyn-

these von Bedeutung sind, ist bisher unbekannt.

1.3 Interleukin-7

1.3.1 Rolle von IL-7 im Immunsystem

Zytokine werden eine Gruppe von Proteinen bezeichnet, die zur Kommunikation und

Koordination der Immunzellen untereinander dienen. Ein insbesondere für T-

Lymphozyten bedeutsames Zytokin stellt Interleukin-7 (IL-7) dar. Neben Keratinozy-

ten und intestinalen Endothelzellen produzieren hauptsächlich nicht-

hämatopoetische Stromazellen im Thymus, Knochenmark und weiteren lymphoiden

Organen dieses Zytokin [95, 96]. Weiterhin können DZ geringe Mengen an IL-7

sezernieren, während T- und B-Zellen kein IL-7 produzieren [97].

IL-7 bindet an den IL-7 Rezeptor (IL-7R), welcher aus der α-Untereinheit CD127 und

der γ-Untereinheit CD132 (γc von engl. γ-chain) zu einem Heterodimer zusammenge-

setzt ist. CD132 bildet nicht nur einen Teil des IL-7R, sondern ist ebenso Bestandteil

der Zytokinrezeptoren von IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 und IL-21 [98, 99]. Der IL-7R wird

auf DZ und Monozyten, sowie auf nahezu alle reifen T-Zellen exprimiert [100, 101].

Während CD132 relativ konstant auf den T-Zellen unterschiedlicher Differenzie-

rungsstadien exprimiert wird, wird CD127 in Folge von IL-7 Signalen und in Folge

von T-Zell-Aktivierung herunterreguliert. Durch diese Feedback-Regulation des IL-7R

können T-Zell-Immunantworten feinmoduliert werden. [96] Treg-Zellen sind dagegen

durch eine geringe Expression von CD127, die invers mit der FoxP3 Expression

korreliert, charakterisiert [102, 103].

IL-7 spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von T-Lymphozyten im

Thymus. Diese absolute Notwendigkeit von IL-7 zeigt sich eindrucksvoll bei

Menschen mit Mutationen im IL-7R, die aufgrund des defekten IL-7 Signales keine

T-Lymphozyten entwickeln und durch diesen Mangel an T-Zellen eine als schwerer

kombinierter Immundefekt (SCID, von engl. severe combined immunodeficiency)

bezeichnete Krankheit aufweisen [104, 105]. Da in diesen Patienten B-Zellen

22 1 Einleitung

nachweisbar sind, scheint IL-7 für B-Lymphozyten eine nicht so essentielle

Bedeutung zuzukommen wie für T-Lymphozyten. Nichtsdestotrotz ist IL-7 an der B-

Zell-Entwicklung beteiligt, indem es bestimmte Transkriptionsfaktoren induziert und

somit zur Expansion unreifer B-Zellen und zur Generierung des B-Zell-Repertoires

beiträgt [106-109]. Während der T-Zell-Entwicklung nimmt IL-7 in den verschiedenen

Entwicklungsstufen unterschiedliche Funktionen ein. IL-7 steuert dabei benötigte

Überlebens- und Proliferationssignale in den Thymozyten [110, 111]. Zudem ist IL-7

an der genetischen Rekombination der γ-Kette und der β-Kette des TZR beteiligt

[112, 113].

Außerhalb des Thymus nimmt IL-7 eine wichtige Rolle bei der Homöostase der

peripheren T-Zellen ein. So kontrolliert IL-7 durch anti-apoptotische und kostimulato-

rische Signale das Überleben und die Proliferation von naiven CD4+ und CD8

+ T-

Zellen [114-116]. Während der T-Zell-Effektorphase spielt IL-7 eine untergeordnete

Rolle. CD127 wird infolge der TZR-Aktivierung und der kostimulatorischen Signale

herunterreguliert und andere Zytokine, die im Gegensatz zu IL-7 nur während einer

aktiven Immunantwort produziert werden, wirken auf die aktivierten T-Zellen ein

[117]. Bei der anschließenden Differenzierung der Effektor T-Zellen zu Gedächtnis

T-Zellen ist IL-7 wiederum wesentlich beteiligt [118, 119]. So ergaben Studien, dass

sich bei fehlendem IL-7 keine Gedächtnis-T-Zellpopulation nach erfolgter

Immunantwort ausbilden konnten [116, 118, 120]. Des Weiteren zeigte sich, dass ein

basaler IL-7 Spiegel für das Überleben und die Aufrechterhaltung von Gedächtnis-T-

Zellen nötig war [121-123].

1.3.2 Signaltransduktion von IL-7

IL-7 kann über unterschiedliche Signalwege das Überleben, die Proliferation und die

Differenzierung von T-Zellen steuern. In Abbildung 1-3 sind die zentralen Signal-

transduktionswege von IL-7 schematisch dargestellt. Bindet IL-7 an den heterodime-

ren IL-7R, wird zunächst die CD127-assoziierte Januskinase (JAK)-1 und die

CD132-assoziierte JAK3 aktiviert. Die aktivierten JAK phosphorylieren spezifische

Tyrosinreste in der Src-homology 2 (SH2)-Domände von STAT5 (von engl. Signal

23 1 Einleitung

transducers and activators of transciption 5). Phosphoryliertes STAT5 kann

dimerisieren, in den Zellkern translozieren und dort für eine Reihe an Genen als

Transkriptionsfaktor fungieren [124]. Wie in Abbildung 1-3 angedeutet, werden

dadurch beispielsweise pro-Survival-Gene wie Bcl-2 (von engl. B-cell lymphoma 2)

oder Mcl-1 (von engl. Myeloid cell leukemia 1) hochreguliert und pro-apoptotische

Gene herunterreguliert. Neben dem JAK-STAT-Signalweg transduziert der IL-7R

außerdem wichtige Signale über den Akt-Signalweg. So kann die durch IL-7

aktivierte Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) Phophatidylinositol-4,5-bisphosphat

(PtdIns(4,5)P2) zu Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PtdIns(3,4,5)P3)

umwandeln. PtdIns(3,4,5)P3 dient als Andockstelle für die Pyruvat-Dehydrogenase-

Kinase 1 (PDK1) und die Proteinkinase Akt (alternativ als Proteinkinase B

bezeichnet), wodurch letztlich Akt phosphoryliert wird. Ein bedeutender Gegenspieler

dieses Signalweges ist die Phosphatase PTEN (Phosphatase und Tensin Homolog),

die PtdIns(3,4,5)P3 dephosphorylieren und somit eine Signalweiterleitung

unterbinden kann. Der Serin-/Threoninkinase Akt kommt eine Schlüsselfunktion zu,

da sie eine Vielzahl an Proteinen reguliert. So wird unter anderem das Enzym mTOR

(von engl. mechanistic Target of Rapamycin) aktiviert, welches eine bedeutende

regulatorische Funktion auf den Metabolismus von Zellen und somit auf deren

Überleben und Wachstum ausübt (zusammengefasst in [125]). Weitere zentrale

Proteine, die von Akt gesteuert werden, sind FoxO (Forkhead-Box-Protein O) oder

GSK-3β (Glykogensynthase-Kinase 3β). Durch diese Faktoren werden verschiedene

für den Zellzyklus benötigte Cycline beziehungsweise Zellzyklusinhibitoren wie

p27kip1

kontrolliert. [126-128]

24 1 Einleitung

Abbildung 1-3: IL-7 Signaltransduktion für die T-Zell-Homöostase [127]

1.3.3 Regulation von IL-7 bei Immunkrankheiten

IL-7 nimmt eine wichtige Funktion bei der Lymphopoese sowie bei der Homöostase

von T-Zellen außerhalb des Thymus ein. Aus diesem Grund kommt IL-7 eine große

Bedeutung bei Patienten mit einem Mangel an Lymphozyten, einer sogenannten

Lymphopenie, zu. Lymphopenien können bei Virus-Infektionen, Autoimmun- oder

Immundefizienz- sowie bei Blutkrebserkrankungen auftreten. Außerdem werden

Lymphopenien häufig durch T-Zell-depletierende Behandlungen wie Bestrahlung,

25 1 Einleitung

Zytostatika oder immunsuppressive Medikamente ausgelöst. Die Konditionierung vor

HSZT verursacht daher ebenso eine Lymphopenie.

Verschiedene Studien zeigten, dass T-Zell-Lymphopenien mit einem erhöhten IL-7

Spiegel einhergehen [129]. So konnten hohe IL-7 Konzentrationen unter anderem

bei Patienten mit erworbenem Immundefektsyndrom (AIDS von engl. acquired

immunodeficiency syndrome), mit idiopathischer CD4+ Lymphopenie oder mit

lymphopenischer Multipler Sklerose beobachtet werden [130-132]. Des Weiteren

wurde auch nach Chemotherapie ein hoher IL-7 Spiegel festgestellt [133]. Bolotin et

al. zeigten, dass Kinder nach allogener HSZT einen erhöhten IL-7 Spiegel aufwiesen

[134]. Folgestudien an Erwachsenen ergaben ebenso eine inverse Beziehung

zwischen der Anzahl an peripheren T-Zellen nach HSZT und dem systemischen IL-7

Spiegel [135]. Andere Zytokine, welche ebenfalls über die γc-Kette ihr Signal

weiterleiten, zeigten dagegen keine Korrelation mit der T-Zellzahl [133]. Wodurch die

erhöhten IL-7 Spiegel unter lymphopenischen Bedingungen entstehen, ist nicht

vollständig geklärt. Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass erhöhte IL-7

Spiegel aus einem verringerten Verbrauch des Zytokins aufgrund des T-Zell-Mangels

resultieren [97].

Eine erhöhte IL-7 Konzentration kann das Immunsystem auf mehrere Arten

beeinflussen. IL-7 induziert ab einer gewissen Dosis die Proliferation von naiven und

Gedächtnis-T-Zellen [121, 136]. Dadurch kann IL-7 entscheidend zur peripheren

Expansion der T-Lymphozytenpopulation und zur Immunrekonstitution beitragen

[137, 138]. Zahlreiche Studien zeigten, dass eine zusätzliche pharmakologische

Gabe von IL-7 die Immunrekonstitution insbesondere nach Chemotherapie und nach

HSZT verbessert [138-140]. Mittels rekombinantem humanem IL-7 (CYT107)

konnten die CD4+ und CD8

+ T-Zellen nach HSZT stark expandiert und damit eine

zügige Regeneration des T-Zell-basierten Immunsystems erreicht werden [141, 142].

Nachdem erste klinische Daten ein interessantes therapeutisches Potential

aufzeigten, werden zurzeit mehrere klinische Studien durchgeführt, welche den

Nutzen von IL-7 bei verschiedenen lymphopenen Grunderkrankungen untersuchen

[126, 143]. Interessanterweise scheinen durch IL-7 hauptsächlich naive T-Zellen zu

26 1 Einleitung

proliferieren, wodurch T-Zellen mit einer breiten Diversität im TZR-Repertoire

hervorgebracht werden [144-146]. Ebenso bemerkenswert ist der Befund, dass Treg-

Zellen im Vergleich zu den anderen T-Zellpopulationen mittels IL-7 nicht oder nur

geringfügig expandiert werden [141, 146].

Ein erhöhter IL-7 Spiegel kann für die Regeneration der T-Zell-Aktivität nach einer

Lymphopenie von großem Vorteil sein. Allerdings muss auch beachtet werden, dass

eine steigende Reaktivität der Immunzellen meist auf Kosten von immunologischen

Toleranzmechanismen erfolgt. Hinweise auf eine Beeinträchtigung der immunologi-

schen Toleranz aufgrund von IL-7 gibt es unter anderem durch Studien an

Autoimmunerkrankungen. Zum Beispiel führt der Lymphopenie-assoziierte IL-7

Anstieg oder exogene Gabe von IL-7 in Diabetes Typ I Mäusen zur Expansion von

selbstreaktiven T-Zellen [147]. Durch eine Blockade des IL-7R konnte die Aktivität

der Effektor T-Zellen inhibiert und entscheidende inhibitorische Signalwege

wiederhergestellt werden, wodurch die Ausbildung des Typ I Diabetes verhindert

wurde [148, 149]. Ein weiteres Beispiel für die Bedeutung von IL-7 bei der

Beeinträchtigung der Immuntoleranz zeigte sich bei Arthritis-Patienten. Erhöhte IL-7

Spiegel konnten bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis sowohl systemisch als

auch in der Synovialflüssigkeit im Gelenk nachgewiesen werden und damit zur

Pathophysiologie beitragen [150-153]. Interessanterweise zeigte sich bei Patienten

mit juveniler idiopathischer Arthritis, dass IL-7 die suppressive Funktion von Treg-

Zellen außer Kraft setzt [154, 155]. Eine exogene Zugabe von IL-7 inhibierte ebenso

die suppressive Aktivität der Treg-Zellen gegenüber Effektor T-Zellen [156]. Weitere

Untersuchungen an Treg-Zellen aus gesunden Spendern zeigten, dass die

Beeinträchtigung der Funktionalität der Treg-Zellen nach dem Entfernen von IL-7

reversibel ist. Da durch eine Blockade des IL-7R auf Treg-Zellen die suppressive

Aktivität der Treg-Zellen wiederhergestellt werden konnte, wird vermutet, dass IL-7

eine direkte Wirkung auf die Treg-Zellen hat und dadurch die Toleranz gegenüber

Autoantigenen brechen kann [157, 158].

Im Falle der HSZT wird durch die Konditionierungstherapie eine systemische

Lymphopenie ausgelöst, die mit erhöhten IL-7 Spiegeln einhergeht [159]. Mehrere

27 1 Einleitung

Studien deuten darauf hin, dass hohe IL-7 Konzentrationen eine verstärkte

Immunreaktivität induzieren. So konnte in Mausmodellen gezeigt werden, dass IL-7

an der Entwicklung von akuter GvHD beteiligt ist und deren Krankheitsverlauf

verschlechtert [160-162]. Durch eine IL-7R Blockade konnte die Ausbildung einer

GvHD verhindert werden [163]. Dean et al. konnten in einer klinischen Studie

beobachten, dass nach allogener HSZT hohe IL-7 Spiegel sowohl mit der

Entwicklung als auch der Schwere einer akuten GvHD assoziiert sind [135]. Kürzlich

veröffentlichte Studien bestätigen, dass hohe IL-7 Spiegel kurz nach der HSZT einen

prognostischen Marker für das Auftreten und den Grad an akuter GvHD darstellen

und darüber hinaus mit einer ansteigenden Mortalitätsrate assoziiert sind [164-166].

Weitere Belege des Zusammenhangs zwischen IL-7 Signalen und der Alloreaktivität

nach HSZT liefern Untersuchungen, die Änderungen im IL-7R mit der Entwicklung

von GvHD und einem höheren Mortalitätsrisiko assoziieren [167-171]. Der

zugrundeliegende Mechanismus, wie IL-7 möglicherweise über bestimmte T-

Zellpopulationen letztlich die Entwicklung einer GvHD beeinflusst, ist weitgehend

unbekannt.

1.4 Zielsetzung

Im Fokus dieser Arbeit steht die noch weitgehend unbekannte Population

regulatorischer T-Zellen, die DN T-Zellen, welche Immunantworten effektiv

supprimieren können. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung, ob und

wie die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-Zell-

Antworten moduliert werden kann.

Da unsere Arbeit das langfristige Ziel verfolgt, humane DN T-Zellen therapeutisch

zur Vermeidung oder Behandlung der GvHD einzusetzen, sollten als potentielle

Modulatoren Zytokine untersucht werden, die nach allogener HSZT erhöhte

Serumspiegel aufweisen. Im Zentrum unserer Untersuchung steht das Zytokin IL-7,

welches unter anderem mit der Pathogenese der GvHD assoziiert ist. Der Einfluss

von weiteren γc- sowie proinflammatorischen Zytokinen sollte ebenso untersucht

werden.

28 1 Einleitung

Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit sollte der zugrundeliegende Mechanismus

aufgeklärt werden, wie die DN T-Zell-vermittelte suppressive Aktivität durch die

identifizierten Faktoren modifiziert wird. Hierfür sollten erstmals zentrale Signalwege

in den DN T-Zellen und ihre Bedeutung auf die Funktionalität der DN T-Zellen

analysiert werden. Zudem sollte untersucht werden, welche Veränderungen im

Transkriptom mit einer Modulation der DN T-Zell-Funktion assoziiert sind.

29 2 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Medien, Puffer, Lösungen

Reagenz Hersteller oder Rezeptur

AB-Serum, human PAN Biotech, Aidenbach

AnnexinV-Puffer BD, Heidelberg

β-Mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Cellfix BD, Heidelberg

DTT (Dithiothreitol) Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, München

Dynal-Puffer PBS + 2% FCS

EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Sigma, München

Einfriermedium 10% FCS+ 10% DMSO

Ethanol Th.Geyer, Renningen

FACS Clean, Flow, Rinse BD, Heidelberg

FCS (Fötales Kälberserum) PAN Biotech, Aidenbach

FCS-haltiges Medium Standardmedium + 10% FCS

Fixation/Permeabilization Solution BD, Heidelberg

Fixierlösung PBS + 10% Cellfix (10x)

Hanks‘-Puffer Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA

HSA (Humanes Serumalbumin) Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA

L-Glutamin Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Lymphozytenseparationslösung (Pancoll)

PAN Biotech, Aidenbach

MACS-Puffer PBS + 2mM EDTA + 0,5% HSA

MEM NEAA PAN Biotech, Aidenbach

Natriumpyruvat PAN Biotech, Aidenbach

PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung)

Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Penicillin/ Streptomycin Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA


Reagenz Hersteller oder Rezeptur

Perm/Wash Puffer BD, Heidelberg

PhosFlow Perm Puffer III BD, Heidelberg

PhosFlow Waschpuffer PBS + 2% FCS

RPMI 1640 Medium PAN Biotech, Aidenbach

Standardmedium (serumfrei) 500ml RPMI mit 200 mmol/l L-Glutamin, 5ml Vitamine (100x), 5ml MEM NEAA (100x), 1mM Pyruvat, 5ml Penicillin/ Streptomycin (100x), 50 μmol/l β-Mercaptoethanol

TE Puffer Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Trypanblau Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA

T-Zell-Medium Standardmedium + 10% humanes AB-Serum

T-Zell-Stimulationsmedium T-Zell-Medium + 100 U/ml IL-2

Vitamine PAN Biotech, Aidenbach

Wasserstoffperoxid Merck Millipore, Billerica, USA

2.1.2 Zytokine und Stimulatoren

Reagenz Hersteller

α-CD3/CD28 Dynabeads, human Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)

CellGenix, Freiburg

Insulin growth factor 1 (IGF-1) PeproTech, Hamburg

Interferon-γ (IFN-γ) PeproTech, Hamburg

Interleukin-1β PromoCell, Heidelberg

Interleukin-2 Novartis, Nürnberg

Interleukin-4 PromoCell, Heidelberg

Interleukin-6 CellGenix, Freiburg


Interleukin-9 Miltenyi, Bergisch-Gladbach

Interleukin-12 Miltenyi, Bergisch-Gladbach



Reagenz Hersteller

Interleukin-21 PromoKine, Heidelberg

Prostaglandin E2 (PGE2) Enzo Life Sciences, Lörrach

Tumornekrosefaktor (TNF) PromoCell, Heidelberg

2.1.3 Inhibitoren

Inhibitor Eingesetzte

Konzentration Hersteller

Akt Inhibitor IV 2 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

Erk Activation Inhibitor Peptide I

10 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

JAK Inhibitor I (PAN) 1 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

JNK Inhibitor SP600125 10 μM Tocris, Bristol, UK

mTOR Inhibitor IV Ku-63794

2,5 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

IKK (NF-κB) Inhibitor II 10 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

p38 Inhibitor SB203580 2 μM Tocris, Bristol, UK

PI3K/mTOR Inhibitor III PKI-179

2,5 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

SC-79 20 μg/ml Tocris, Bristol, UK

STAT5 Inhibitor 100 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA

2.1.4 Magnetische Aufreinigungs-Kits

Kit Hersteller

CD4+ T cell isolation kit, human Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach

CD4 Microbeads Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach

CD8 Microbeads Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach

DN T cell isolation kit, human Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach


2.1.5 Farbstoffe

Farbstoff Hersteller

7-AAD (7-Aminoactinomycin) BD, Heidelberg

AnnexinV FITC BD, Heidelberg

Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD) eBioscience, Frankfurt

CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester) Sigma, München

TF2-VAD-FMK im Cell Meter generic fluorometric caspase activity assay kit

AAT Bioquest, Sunnyvale, USA

Violet Proliferation Dye 450 (VPD) BD, Heidelberg

2.1.6 Antikörper

Spezifität Isotyp Klon Herkunft Konjugation Hersteller

CD1a IgG1 HI149 Maus FITC BD

CD3 IgG1, ĸ UCHT1 Maus Alexa647 BD

CD3 IgG1, ĸ SK7 Maus APC-H7 BD

CD3 IgG1, ĸ UCHT1 Maus BV510 BD

CD4 IgG1 SK3 Maus FITC BD

CD4 IgG1 13B8.2 Maus APC Beckman Coulter

CD4 IgG1, ĸ RPA-T4 Maus APC-Cy7 BD

CD8 IgG1 RPA-T8 Maus APC BD

CD8 IgG1, ĸ RPA-T8 Maus BV421 BD

CD11c IgG2b S-HCL-3 Maus APC BD

CD14 IgG2b MOP9 Maus PerCP BD

CD25 IgG1, ĸ 2A3 Maus PE-Cy7 BD

CD25 IgG1, ĸ M-A251 Maus APC-H7 BD

CD80 IgG1 L307.4 Maus PE BD

CD83 IgG1, ĸ HB15e Maus APC BD

CD86 IgG1, ĸ B70/B7-2 Maus PE BD

CD127 IgG1 M21 Maus PE BD


Spezifität Isotyp Klon Herkunft Konjugation Hersteller

CD132 IgG2b, κ TUGh4 Ratte APC BioLegend

CD154 IgG1 24-31 Maus APC BioLegend

CyclinA IgE BF683 Maus PE BD

CyclinE IgG2b HE12 Maus FITC SantaCruz

FoxP3 IgG1 236A/E7 Maus APC eBioscience

HIF-1α IgG2b, κ 546-16 Maus PE BioLegend

HLA-ABC IgG1 G46-2.6 Maus FITC BD

HLA-DR IgG2a L243 Maus PerCP BD

IgG1 IgG1 X40 Maus PE BD

IgG2b IgG2b MOPC-195 Maus APC BD

IRF4 IgG1, ĸ 3E4 Ratte FITC eBioscience

Ki-67 IgG1 B56 Maus FITC BD

Ki-67 IgG1 B56 Maus PE BD

KLF4 IgG IC3640A Ziege APC R&D Systems

p-GSK3β (S9)

IgG D85E12 Kaninchen

PE CellSignaling

p-S6 (S235/236)

IgG1, ĸ N7-548 Maus V450 BD

p-S6 (240) IgG1, ĸ N4-41 Maus PE BD

p-STAT5 (Y694)

IgG1, ĸ 47 Maus PE BD

T-bet IgG1, ĸ 4B10 Maus PE eBioscience

TZRαβ IgG2b BW242/412 Maus PE Miltenyi

TZRαβ IgG1, ĸ IP26 Maus BV421 BioLegend


2.1.7 Molekularbiologische Kits, Primer und Enzyme

Reagenz Hersteller

dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphos-phate)

Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

Hs_B2M_1_SG (QT00088935) Qiagen, Hilden

Hs_CBL_1_SG (QT 00070301) Qiagen, Hilden

Hs_EGR2_1_SG (QT00000924) Qiagen, Hilden

Hs_EGR3_1_SG (QT00246498) Qiagen, Hilden

Hs_FOXO4_1_SG (QT00029141) Qiagen, Hilden

Hs_NFATC3_1_SG (QT00052185) Qiagen, Hilden

QuantiTect SYBR Green PCR Kit Qiagen, Hilden

Random Decamers Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

RNaseOut rekombinanter Ribo-nuklease Inhibitor

Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

RNeasy Micro Kit Qiagen, Hilden

SuperScript II Reverse Transkriptase Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA

2.1.8 Verbrauchsmaterialien

Gegenstand Hersteller

2ml Schraubröhrchen Sarstedt, Nürnbrecht

24-well Platten Corning/ Costar, New York, USA

96-well Rundbodenplatten Corning/ Costar, New York, USA

Einfrierröhrchen Greiner, Frickenhausen

Eppendorf Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht

FACS-Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht

Falcons Corning/ Costar, New York, USA

Kulturflaschen Greiner, Frickenhausen

Pipetten Corning/ Costar, New York, USA

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg

pPCR-Platten und -Röhrchen Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, USA


2.1.9 Software und Datenbanken

Software Verwendung Anbieter

EndNote X7 Literaturverwaltung Thomson Reuters

FACSDiva Durchflusszytometrie BD

FlowJo V10 Analyse von FACS-Daten Celeza

Ingenuity Pathway Analysis

Transkriptomdaten-Analyse

Qiagen

Prism 5.03 Datenvisualisierung und Statistik-Berechnung

GraphPad

NCBI Literaturrecherche http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

StepOne V2.2.2 qPCR-Daten-Analyse Applied Biosystems

Mit Hilfe des GraphPad Prism Programms wurde die statistische Signifikanz von den

erhaltenen Datensätzen analysiert. Wenn nicht anderweitig angegeben, wurde der

Mann-Whitney-Test aufgrund des Vorliegens von nicht-normal verteilten Messwerten

angewandt. Die p-Werte wurden in den Ergebnissen folgendermaßen markiert:

* p<0,05, ** p<0,001, *** p<0,005.

2.2 Methoden

2.2.1 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau Ausschlussfärbung

Zur Ermittlung der Zellzahl wurden Zellen in einer Lösung von 0,4% Trypanblau in

PBS verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer mit Hilfe eines Zeiss PrimoStar

Mikroskops ausgezählt. Da abgestorbene Zellen aufgrund ihrer fehlenden

Membranintegrität eine starke Blaufärbung aufweisen, können diese von lebenden

Zellen unterschieden werden. Die Zellzahl pro ml wurde mit folgender Formel

berechnet:


2.2.2 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen

Vor dem Einfrieren wurden Zellen in PBS gewaschen und in 1 – 1,5ml 4°C kaltem

Einfriermedium pro Einfrierröhrchen aufgenommen. Die Zellzahl betrug maximal

100 x 106 Zellen/ Einfrierröhrchen. Die befüllten Einfrierröhrchen wurden in einer mit

Isopropanol gefüllten Kryobox von Nalgene Nunc, die ein definiertes Abkühlen der

Zellen um -1°C/ ml pro Minute gewährleistet, in den -80°C Gefrierschrank gestellt

und dort gelagert.

Zum Auftauen von Zellen wurde diesen sukzessiv Standardmedium, welches zuvor

auf Raumtemperatur gebracht wurde, zugeführt. Aufgetaute Zellsuspension wurde

zügig in ein Falcon mit Medium überführt. Anschließend wurden die Zellen

abzentrifugiert und in frischem serumhaltigen Medium resuspendiert.

Wenn nicht anders angegeben wurde Zellen stets in der Megafuge 16R (Thermo

Scientific) bei 317 x g für 7 Minuten bei 4°C zentrifugiert.

2.2.3 Dichtegradientenzentrifugation

Die für die Dichtegradientenzentrifugation verwendeten Zellen wurden aus gesunden

Spendern mittels Leukapherese gewonnen. Dabei wurden aus dem Blut die

Leukozyten abgetrennt und das übrige Erythrozyten-reiche Blut dem Spender

zurückgegeben. Das Leukapherisat wurde 1:1 in PBS verdünnt, auf Lymphozyten-

separationslösung aufgetragen und für 20 Minuten bei 800 x g und 20°C zentrifu-

giert. Die Dichtegradientenzentrifugation führt zur Auftrennung einer schweren

Erythrozyten-reichen Fraktion, der Interphase mit PBMC und dem Überstand mit

Thrombozyten und Plasma. Die Interphase wurde mit einer Pipette gesammelt und

zweimal gewaschen. Die gewonnen PBMC wurden gezählt und direkt verwendet

oder bei -80°C eingelagert.

2.2.4 Elutriation zur Monozyten-Isolation

Unter Verwendung der Gegenstrom-Elutriation wurden aus den gewonnenen PBMC

in einer J6-M/E Zentrifuge (Beckman) Monozyten isoliert. Bei dieser Methode werden


die PBMC nicht nur nach Ihrer Dichte, sondern auch nach ihrer Größe aufgetrennt.

Vor der Elutriation wurde das System mit einer 30%-igen H2O2-Lösung sterilisiert, mit

PBS gewaschen und der Pumpdruck mit Hanks‘-Puffer geeicht. Für die Elutriation

wurden die Zellen mit 6% autologem Plasma in Hanks‘-Puffer in das System

eingebracht. Die Auftrennung und Sammlung der einzelnen Zellfraktionen erfolgte

durch die kontinuierliche Erhöhung der Durchflussrate bei konstanter Umdrehungs-

zahl der Zentrifuge. Bei einer Durchflussrate von 111 ml/Min wurde die letzte

Fraktion gesammelt, in der sich die Monozyten befinden. Die gewonnenen

Monozyten wurden gewaschen, resuspendiert und gezählt.

2.2.5 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten

Die durch Elutriation gewonnenen Monozyten wurden in FCS-haltigem Medium

(106 Zellen/ml) mit den Zytokinen IL-4 (5ng/ml), GM-CSF (500U/ml) und TGF-β

(5ng/ml) in einer Kulturflasche über 5 Tage zu unreifen DZ differenziert. Durch

Zugabe folgender Zytokine wurden die DZ nach Jonuleit et al. [172] über 2 weitere

Tage ausgereift: IL-4 (2,5ng/ml), GM-CSF (250U/ml), IL-1β (10ng/ml), IL-6

(1000U/ml), PGE2 (1μg/ml) und TNF (10ng/ml). Die Zellsuspension der reifen DZ

wurde geerntet und die Ausdifferenzierung mittels einer FACS-Färbung auf folgende

Marker hin überprüft: CD14-, CD1a

+, CD11c

+, CD80

+, CD83

+, CD86

+, HLA-ABC

+,

HLA-DR+. Die reifen DZ wurden entweder direkt in den Versuchen verwendet oder

eingefroren.

2.2.6 Magnetische Zellseparation

Die magnetische Zellseparation dient der Aufreinigung von definierten Zellpopulatio-

nen und wurde mit Hilfe von Miltenyi Kits nach dem jeweiligen Protokoll des

Herstellers durchgeführt. Die Methode beruht auf der Bindung von Antikörper-

beschichteten Eisenpartikel („Microbeads“) an die Zellen. Durch die Adhäsion der

somit markierten Zellen an einen Magneten können dadurch die aufzureinigenden

Zellen von den unbenötigten Zellen separiert werden. Die Anreicherung kann dabei

auf zwei unterschiedlichen Prinzipien beruhen: während bei der positiven


Anreicherung die Microbeads an die gewünschte Zellpopulation gebunden werden,

werden bei der negativen Anreicherung die zu depletierenden Zellpopulationen

markiert. CD4+ T-Zellen wurden stets durch die schonendere negative Selektion aus

PBMC isoliert - das heißt, sämtliche Zellen mit unerwünschtem Phänotyp werden

durch Antikörper gebunden und bleiben an dem Magneten haften. Für die Isolation

von DN T-Zellen wurden zunächst CD4+, CD8

+, CD11b

+, CD16

+, CD19

+ CD20

+ und

CD56+ Zellen depletiert und in einem zweiten Schritt durch eine positive Selektion

anhand von TZRαβ die DN T-Zellen aufgereingt. Wenn eine DN T-Zell-Kultur eine

Verunreinigung von mehr als 5% an CD4+ oder CD8

+ T-Zellen aufwies, wurden die

CD4+

und CD8+ T-Zellen mittels anti-CD4 und anti-CD8 Microbeads depletiert.

2.2.7 Kultivierung von DN T-Zellen

DN T-Zellen wurden in T-Zell-Stimulationsmedium (enthält 100U/ml IL-2) in 96-well

Rundbodenplatten kultiviert und wöchentlich mit allogenen reifen DZ stimuliert. Pro

well wurden dabei 100.000 T-Zellen mit 25.000 DZ in einem Gesamtvolumen von

225μl eingesetzt. Alle 2-3 Tage wurde ein Mediumwechsel vorgenommen und die

DN T-Zellen bei einer hohen Zelldichte 1:1 gesplittet. Die Reinheit der DN T-Zell-

Kultur wurde jede Woche durchflusszytometrisch analysiert und im Falle einer

Verunreinigung mit anderen T-Zellen (DN T-Zell-Population < 95%) durch eine

magnetische Nachreinigung wiederhergestellt. Für sämtliche Experimente wurden

DN T-Zellen eingesetzt, deren letzte Restimulation mindestens 5 Tage zurücklag.

2.2.8 CFSE/ CPD/ VPD -Färbung

Zur Untersuchung der Proliferation von Zellen oder der Markierung gewisser

Zellpopulationen zu Gating-Zwecken wurden die fluoreszierenden Farbstoffe CFSE,

CPD oder VPD verwendet. Diese Farbstoffe emittieren in unterschiedlichen

Wellenlängen (siehe Tabelle) und unterliegen einem ähnlichen Wirkprinzip. CFSE,

VPD und CPD können durch die Zellmembran diffundieren und an zytoplasmatische

Proteine binden. Teilt sich die Zelle, wird der Farbstoff gleichmäßig auf die beiden


Tochterzellen verteilt. Dadurch können proliferierende Zellen anhand der Abnahme

ihrer Fluoreszenz erkannt werden.

Für die Färbung der Zellen mit einem der Farbstoffe wurden maximal 10 x 106 Zellen

in ein 50ml Falcon überführt und in PBS gewaschen. Bei einer Zellzahl ≤ 106 wurden

die Färbung in einem 2ml Schraubröhrchen durchgeführt, um den Zellverlust

während der Waschvorgänge zu reduzieren. Die Färbung erfolgte nach dem in der

Tabelle angegebenen Protokoll. Im Anschluss wurde der Färbeprozess mit PBS,

welches 10% FCS enthielt, abgestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden

die Zellen noch einmal in PBS gewaschen und in T-Zell-Medium resuspendiert sowie

ausgezählt.

CFSE CPD VPD

Färbelösung 5nM in PBS (stets frisch angesetzt)

5mM in DMSO 1mM in DMSO

Färbevolumen 200μl PBS + 500μl Färbelösung

1ml PBS + 0,5μl CPD

1ml PBS + 1μl VPD

Färbekonzentration ~ 2nM ~ 2,5μM ~ 1μM

Färbedauer 4 Min, RT(dunkel) 7 Min, 37°C 10 Min, 37°C

Emission 521nm 670nm 450nm

2.2.9 Suppressionstest

Die DN T-Zell-vermittelte Suppression von allogenen T-Zell-Antworten wurde

entweder mittels der Messung der CFSE-Fluoreszenz oder der intrazellulären

Expression des Zellzyklusproteins Ki-67 untersucht. Dafür wurden CD4+ T-Zellen aus

PBMC isoliert und bei Bedarf CFSE gefärbt. Zur Stimulation der T-Zellen wurden in

einer modifizierten „Mixed lymphocyte reaction“ (MLR) allogene reife DZ verwendet.

Als alternative T-Zell-Stimulation kamen anti-CD3/CD28 gekoppelte (αCD3/28)

Beads, die nach dem Protokoll des Herstellers zuvor im Dynalpuffer gewaschen

wurden, zum Einsatz. Als Suppressor-Zellen dienten DN T-Zellen, die zuvor über


mehrere Wochen expandiert worden waren und zur einfachen Unterscheidung von

anderen Zellen im FACS-Gating teilweise mit VPD angefärbt wurden. In den

Versuchen wurden pro well 50.000 CD4+ T-Zellen zusammen mit 50.000 DN T-

Zellen und 25.000 DZ oder αCD3/28 Beads im Verhältnis 1:50 zu den T-Zellen in

225μl T-Zell-Medium eingesetzt. Die Ki-67 Messungen erfolgten nach einer

Inkubation von 2 Tagen, die CFSE-Messung nach 5 Tagen. Die Zellen wurden

abgeerntet und αCD3/28 Beads dabei über einen Magneten entfernt. Die Zellen

wurden mit unterschiedlich konjugierten Antikörpern gefärbt und die Proliferation der

CD4+ T-Zellen im FACS analysiert. Als Kontrolle dienten Ansätze, bei denen die

CD4+ T-Zellen nicht stimuliert oder ohne die Suppressor-Zellen inkubiert wurden. Die

Zytokine, die in einigen Experimenten zum Einsatz kamen, wurden - wenn nicht

anderweitig angegeben - mit einer Konzentration von 20 ng/ml direkt in den Ansatz

des Suppressionstests zugegeben.

2.2.10 Inhibition von Signaltransduktionswegen

Um zu untersuchen, inwieweit bestimmte Signaltransduktionswege Einfluss auf die

suppressive Funktion der DN T-Zellen nehmen, wurden in den DN T-Zellen vor ihrem

Einsatz in den MLRs definierte Signalmoleküle inhibiert. Für die Blockade wurden

200.000-300.000 DN T-Zellen in 375μl T-Zell-Medium in ein 2ml Schraubröhrchen

überführt und der jeweilige Inhibitor (siehe Kapitel 0) zugegeben. Die Zellen wurden

für 2 Stunden bei 37°C mit dem Inhibitor inkubiert und schließlich zweimal mit T-Zell-

Medium gewaschen, um ungebundene Inhibitoren wegzuwaschen. Unbehandelte

DN T-Zellen wurden als Kontrolle ebenso inkubiert und gewaschen. Die somit

blockierten DN T-Zellen wurden nach ihrer Resuspension in den Suppressionstest

eingesetzt.

2.2.11 Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie dient der phänotypischen Analyse von Zellen, indem die

Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner Zellen gemessen werden. Die zu

untersuchenden Zellen werden dabei mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern oder


bestimmten Farbstoffen wie CFSE markiert und in einer Trägerflüssigkeit an einem

Laserstrahl vorbeigeführt. Im verwendeten Gerät FACSCanto II (BD) standen drei

Laser für die Anregung der Fluoreszenz zur Verfügung. Als Fluorochromkonjugate

wurden FITC (Fluorothioisocyanat), PE (Phycoerythrin), PerCP (Peridinin-

Chlorophyll-Protein), APC (Allophycocyanin), PE-Cy7 (PE-Cyanin-Konjugat), APC-

H7 (APC-Cyanin-Konjugat), V450, BV (Brilliant Violet) 421 oder BV510 verwendet.

Die Wellenlänge des emittierten Lichtes ist abhängig vom Farbstoff und wurde in der

vorliegenden Arbeit in 8 Kanälen detektiert. Des Weiteren wird die Lichtstreuung

jeder Zelle gemessen, um zusätzliche Informationen zur Beschaffenheit der Zellen

zu erhalten. Das Vorwärts-Streulicht gibt Auskunft über die Größe der Zelle. Das

Seitwärts-Streulicht, welches im 90° Winkel zum einfallenden Licht gemessen wird,

vermittelt Informationen über die intrazelluläre Granularität.

2.2.11.1 Oberflächenfärbung

Zur Untersuchung bestimmter Oberflächenproteine im Durchflusszytometer wurden

Zellen mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern angefärbt. Die zu analysierenden

Zellen wurden in FACS-Röhrchen geerntet und in PBS gewaschen. Sämtliche

Zentrifugationsschritte mit FACS-Röhrchen erfolgten bei 500 x g und 4°C für 4

Minuten. Auf das gelöste Zellpellet wurde die vom Hersteller angegebene Menge an

Antikörper pipettiert und diese für 10 Minuten bei 4°C mit den Zellen inkubiert. Nach

Zugabe von PBS und erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 200-350μl PBS

oder Fixierlösung aufgenommen und am FACS vermessen.

2.2.11.2 Intrazellulärfärbung

Für die durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären Molekülen wurden die

Zellen geerntet, in PBS gewaschen und der oben beschriebenen Oberflächenfär-

bung unterzogen. Im Anschluss wurden die Zellen mit 250μl der BD Fixati-

on/Permeabilisation-Lösung für 20 Minuten bei 4°C fixiert und permeabilisiert. Nach

zwei Waschschritten mit BD Perm/Wash Puffer folgte die Inkubation der Zellen mit

den gegen intrazelluläre Proteine gerichteten Antiköpern für 30 Minuten bei 4°C. Die


Zellen wurden anschließend erneut zweimal mit Perm/Wash Puffer gewaschen, in

Fixierlösung resuspendiert und am FACS analysiert.

2.2.11.3 FoxP3-Färbung

Für die durchflusszytometrische Untersuchung des Transkriptionsfaktors FoxP3

wurden die Lösungen des FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set von

eBioscience nach dem Protokoll der Herstellers verwendet. Die Fixierung/

Permeabilisierung erfolgte für 40 Minuten, die Inkubation mit dem anti-FoxP3

Antikörper für 30 Minuten.

2.2.11.4 PhosFlow-Färbung

Über die Phosphorylierung von Tyrosin-, Serin-, oder Threoninresten wird die

Aktivität von Signalproteinen wie Kinasen oder Phosphatasen und somit die zelluläre

Signaltransduktion gesteuert. Mit Hilfe von Fluorochrom-markierten Antikörpern, die

an spezifische Phosphogruppenreste in einem Protein binden, kann der Phosphory-

lierungsstatus eines Signalproteins nachgewiesen werden.

Für die Analyse von Phosphoproteinen wurden die zu untersuchenden Zellen in

15ml Falcons geerntet und in PBS gewaschen. Die Oberfläche der Zellen wurde mit

FITC-, Alexa647-, oder BV-konjugierten Antiköpern 15 Minuten auf Eis im Dunkeln

angefärbt. Nach einmaligem Waschen der Zellen mit PBS wurden 500μl der

vorgewärmten BD Fixation/Permeabilisation-Lösung zugegeben und die Zellen für 10

Minuten im 37°C warmen Wasserbad fixiert. Es folgten zwei PBS-Waschschritte.

Unter kontinuierlichem Vortexen wurde 1ml des PhosFlow Perm Puffers III zugetropft

und die Ansätze 30 Minuten auf Eis bei Dunkelheit inkubiert. Im Anschluss wurde der

Methanol-haltige Permeabilisierungs-Puffer durch drei Waschvorgänge mit dem

PhosFlow Waschpuffer entfernt. Aufgrund des lockeren Zellpellets wurde die Zellen

ab diesem Waschschritt mit 600 x g für 7 Minuten zentrifugiert. Die PE- oder V450-

konjugierten Phospho-Antikörper wurden für 35 Minuten bei RT im Dunkeln mit den

Zellen inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PhosFlow Waschpuffer wurden die


Zellen in 350μl Fixierlösung aufgenommen, in FACS-Röhrchen überführt und am

FACSCanto II analysiert.

2.2.12 Zellviabilitäts-Bestimmung

Für die Untersuchung der Zellviabilität der CD4+ und DN T-Zellen wurde der

Suppressionstest wie beschrieben angesetzt und für 1 bis 3 Tage inkubiert. Um

apoptotische Zellen zu identifizieren, erfolgten zum einen Messungen der Aktivität

von Caspasen, welche den programmierten Zelltod induzieren. Dafür wurde der Cell

Meter Generic Fluorometric Caspase Activity Assay Kit verwendet. Das darin

enthaltene Färbereagenz TF2-VAD-FMK (Tide fluor 2- Valyl-Alanyl-Aspartyl-[O-

Methyl]- Fluoromethylketon) ist Zell-permeabel und bindet irreversibel an die

katalytische Domäne der aktivierten Caspasen-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 und -9. Durch

die Extinktion des gekoppelten Farbstoffs bei 488nm und dessen Emission bei

520nm können apoptotische Zellen im Durchflusszytometer analysiert werden. Zur

Anfärbung der Zellen wurde der Indikator TF2-VAD-FMK wie im Protokoll des

Herstellers AAT Bioquest angegeben, für eine Stunde mit den Zellen in der MLR

inkubiert, weggewaschen und die Zellen durchflusszytometrisch untersucht.

Zur Bestimmung der Zellviabilität wurden die Zellen zum anderen mit AnnexinV und

7-AAD (7-Aminoactinomycin) angefärbt. AnnexinV bindet an Phosphatidylserin,

welches an der Oberfläche von apoptotischen Zellen gefunden werden kann. 7-AAD

interkaliert in doppelsträngige DNA und markiert somit spät-apoptotische und

nekrotische Zellen. Für die Messung wurden die Zellen der MLR geernet und im

Anschluss an eine Oberflächenfärbung in 150μl Annexin-Puffer aufgenommen und

mit 5μl AnnexinV-FITC für 10 Minuten bei Dunkelheit gefärbt. Nach der Zugabe von

5μl 7-AAD wurden die Zellen für weitere 5 Minuten inkubiert und unverzüglich im

FACS analysiert.


2.2.13 RNA-Isolation

Gesamt-RNA wurde aus Zellen mit Hilfe des RNeasy Micro Kit nach dem Protokoll

des Herstellers Qiagen isoliert. Die Konzentration der RNA wurde am Nanodrop

2000c Spektrometer (Thermo Scientific) vermessen.

2.2.14 RNA-Sequenzierung

Für die Transkriptomanalyse wurden DN T-Zellen von 4 verschiedenen Spendern

zunächst in An- oder Abwesenheit von IL-7 in eine MLR mit CD4+ T-Zellen und

αCD3/28 Beads eingesetzt. Nach 12 Stunden wurden die Zellen geerntet und die

αCD3/28 Beads dabei über einen Magneten entfernt. Im Anschluss wurden die DN

T-Zellen mit Hilfe der FACS-basierten Zellsortierung mit einer Reinheit von > 99,6%

von den CD4+ T-Zellen abgetrennt. Diese Aufreinigung erfolgte am MoFlow

Zellsortierer (Beckman Coulter) in der Core Unit Cell Sorting Erlangen. Die

erhaltenen DN T-Zellen wurden lysiert und aus den Zelllysaten Gesamt-RNA isoliert.

Die weiteren Schritte wurden in Kooperation mit dem Institut für Humangenetik in

Erlangen durchgeführt. Die Qualität der RNA wurde zunächst anhand des 2100

Bioanalyzer Systems (Agilent Technologies) verifiziert. Aus 100ng Gesamt-RNA

wurden mit Hilfe des ovation human FFPE RNA-Seq systems (Nugen) barkodierte

RNA Sequenz Bibliotheken nach dem Protokoll des Herstellers für geringe RNA-

Mengen erstellt. Zur selektiven Depletion von ribosomaler RNA wurde dabei die

InDA-C (Insert Dependent Adapter Cleavage) Methode von Nugen vor der cDNA

Synthese angewandt. Um auftretende Varianzen während der Proben- und

Datenverarbeitung zuordnen zu können, wurden RNA spike-in Kontrollen von

Ambion eingesetzt, welche von dem external RNA control consortium (ERCC)

entwickelt wurden.

Die anschließende paired-end Sequenzierung (2 x 101bp) der generierten

Bibliotheken erfolgte an der HighSeq-2500 Plattform von Illumina. Die rohen

Sequenzdaten wurden mittels des STAR aligner Version 2.3.0 [173] mit dem

humanen Referenzgenom hg19 abgeglichen. 85% der Daten konnten im Durch-


schnitt eindeutig zugeordnet werden. Absolute read counts pro Gen wurden mit dem

Subread’s featureCounts Programm [174] berechnet und das gtf Annotationsfile mit

Ensembl erstellt. Alle weiteren Analysen wurden mit R Version 3.1.2 durchgeführt

[175]. Die differenzielle Expression wurde dabei mit Hilfe des DESeq2 package,

dessen statistische Testung auf einer negativen binomialen Verteilung beruht,

ermittelt [176]. Signifikant differenziell exprimierte Gene wurde mit der IPA

Datenbank abgeglichen und kanonischen Signalwegen sowie funktionellen Gruppen

zugeordnet.

2.2.15 Reverse Transkription

Für die Synthese von Einzelstrang-cDNA wurden 100ng der isolierten Gesamt-RNA

verwendet. Die reverse Transkription erfolgte in Ansätzen von 20μl Gesamtvolumen

in einem MasterCycler (Eppendorf). In den Tabellen sind der Reaktionsansatz und

der Programmverlauf am Cycler aufgelistet. Nur Mix 1 wurde auf 65°C erhitzt und im

Anschluss Mix 2 zugegeben. Die cDNA wurde direkt zur Amplifizierung eingesetzt

oder auf -20°C gelagert.

Reaktionsansatz: Cylcer-Programm:

Reagenz Volumen Temperatur Zeit

Mix 1: Random Decamers 1 μl 65°C 5 Min

dNTPs 10mM 1 μl 4°C bis Zugabe

USB Wasser 12 – x μl Mix 2

RNA-Probe x = 100ng 25°C 10 Min

42°C 50 Min

Mix 2: First Strand Buffer (5x) 4 μl 70°C 15 Min

Dithiothreitol 100mM 2 μl 4°C bis Ende

RNase Out 1 μl

Reverse Transkriptase 1 μl


2.2.16 Quantitative Polymerase Kettenreaktion

Die quantitative Polymerase Kettenreaktion wurde mit dem RotorGene SYBR Green

PCR Mastermix in dem StepOnePlus Cycler (Applied Biosystems) durchgeführt.

Sämtliche Primer wurden von Qiagen bezogen, nach den Angaben des Herstellers in

TE-Puffer gelöst und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Die cDNA-Proben

wurden vor dem ersten Einsatz 1:1 in H2O verdünnt und in einem Reaktionsvolumen

von 10μl, bestehend aus 1μl cDNA, 5μl SYBR Green, 1μl Primer und 3μl H2O in

Duplikaten vermessen. Als Standard wurde pro Primer eine 1:10 und 1:100

verdünnte cDNA-Probe und als Kontrolle ein well mit H2O statt cDNA mit angesetzt.

Die Tabelle zeigt das Protokoll der Amplifikation und der anschließenden Messung

des Schmelzverhaltens. Die Fluoreszenzmessung erfolgte nach jedem Amplifikati-

onszyklus und kontinuierlich während der Schmelzphase.

Phase Temperatur Zeit

Aktivierung 95°C 5 Min

30-40 Amplifikationszyklen:

Denaturierung 95°C 5 Sek

Annealing und Elongation 60°C 10 Sek

Schmelzkurve 60°C bis 90°C 0,1°C/ Sek

Mit Hilfe der StepOne Software wurde der Ct-Wert, der angibt, bei welchem Zyklus

die Fluoreszenz erstmals exponentielle wächst, jeder Probe berechnet und der

Mittelwert von den gemessenen Duplikaten gebildet. Die Expression des Zielgens

wurde relativ zu dem konstant exprimierten β-2-Mikrogobulin-Referenzgen bestimmt

[177].

47 3 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Messmethoden zur Bestimmung der suppressiven Aktivität humaner

DN T-Zellen

Ein Charakteristikum von humanen DN T-Zellen ist ihre immunregulatorische

Aktivität. Um diese Funktion nachweisen zu können, wurde folgendes Modellsystem

angewandt und weiterentwickelt: zunächst wurden humane DN T-Zellen von

Spender A isoliert und durch Stimulation mit allogenen DZ eines Spenders B für zwei

bis fünf Wochen expandiert. Für anschließende Experimente wurden stets DN T-

Zellen verwendet, deren letzte Restimulation mindestens fünf Tage zurück und deren

Reinheit über 95% lag. Am Tag des Versuchsansatzes wurden CD4+ T-Zellen des

Spenders A isoliert und mit CFSE gefärbt. Die CD4+ T-Lymphozyten wurden

schließlich in einer sogenannten „Mixed lymphocyte reaction“ (MLR) mit allogenen

DZ des Spenders B und den kultivierten DN T-Zellen im Verhältnis 2 : 1 : 2 inkubiert.

Nach fünf Tagen wurde die Proliferation der CD4+ T-Zellen bestimmt, indem deren

CFSE-Abnahme durchflusszytometrisch analysiert wurde. Wie in Abbildung 3-1

dargestellt, zeigen unstimulierte CD4+ T-Zellen keine Abnahme von CFSE. Dagegen

proliferieren die alloreaktiven CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit allogenen DZ sehr

stark. Durch Zugabe der DN T-Zellen konnte diese Proliferation fast vollständig

supprimiert werden. Die Reduktion der Proliferation von 74% auf 11,7% mit DN T-

Zellen entspricht einer Suppression von 84,2%. Diese Berechnung ergibt sich aus

folgender Formel:

48 3 Ergebnisse

Abbildung 3-1: Messung von CFSE in CD4+ T-Zellen an Tag 5 der MLR zur Bestim-

mung der suppressiven Aktivität von DN T-Zellen. Frisch isolierte CD4+ T-Zellen wurden

mit dem Farbstoff CFSE gefärbt und zusammen mit vorkultivierten DN T-Zellen desselben

Spenders sowie APZ eines allogenen Spenders inkubiert. Nach 5 Tagen wurde die CFSE

Abnahme durchflusszytometrisch analysiert. Es wurde auf vitale Lymphozyten, Singuletts

und CD4+ Zellen gegated. Dargestellt sind repräsentative Histogramme einer MLR.

In Abbildung 3-2 sind 14 unabhängige Experimente zusammengefasst. Nach der

fünftägigen Kokultur mit allogenen DZ liegt die durchschnittliche Proliferationsrate

der Effektor T-Zellen bei 60%. Durch Zugabe der DN T-Zellen konnte diese auf 24%

reduziert werden. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die DN T-Zell-

vermittelte Suppression unabhängig davon ist, ob die TZR-Stimulation der Zellen in

der MLR über allogene DZ oder durch artifizielle anti-CD3/CD28 gekoppelte Beads

49 3 Ergebnisse

(αCD3/28) erfolgt [81]. Um einen potentiellen Einfluss der DZ-Population auf die DN

T-Zell-Suppression auszuschließen, wurden in nachfolgenden Experimenten

teilweise αCD3/28 Beads eingesetzt. Das bisher verwendete Verhältnis von αCD3/28

Beads zu T-Zellen lag bei 1:2 und resultierte in einer Proliferationsrate um 90% ohne

DN T-Zellen [81]. Da diese Stimulation außerordentlich stark war, wurde in der

folgenden Arbeit ein Verhältnis von 1:50 angewandt. Aus Abbildung 3-2 lässt sich

erkennen, dass mit dieser schwächeren αCD3/28 –Stimulation durchschnittlich 70%

der CD4+ T-Zellen proliferierten. Außerdem waren die DN T-Zellen ähnlich wie mit

DZ-Stimulation in der Lage, diese Proliferation effektiv zu unterdrücken.

+DN +DN

0

20

40

60

80** ***

DZ

aCD3/28

% P

rolife

rati

on

Abbildung 3-2: Vergleich der Proliferation von konventionellen CD4+ T-Zellen nach

Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads. CD4+ T-Zellen wurden für 5 Tage mit

allogenen DZ (weiß) oder mit αCD3/28 (schwarz) in An- oder Abwesenheit von DN T-Zellen

kultiviert. Die % Proliferation der CD4+ T-Zellen wurde anhand der CFSE-Messung

bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte von 14 unabhängigen Experimenten.

Die Bestimmung der Proliferation mittels CFSE kann erst nach einer fünftägigen

Kokultivierung durchgeführt werden. Das Readout der MLR sollte daher weiterentwi-

ckelt und eine frühzeitigere Bestimmung der suppressiven Funktion ermöglicht

werden.

50 3 Ergebnisse

Damit Zellen in den Zellzyklus eintreten können, werden von der Zelle zeitlich

befristet eine Reihe spezifischer Proteine produziert. Eine Schlüsselrolle kommt

dabei den Cyclinen zu, deren Expression im Laufe des Zellzyklus streng reguliert

wird [178]. Wie in Abbildung 3-3A skizziert, wird Cyclin E für den Übergang in die S-

Phase hochreguliert, wohingegen Cyclin A zur Einleitung der G2-Phase benötigt

wird. Das Protein Ki-67 wird während aller Phasen des Zellzyklus exprimiert

(modifiziert nach [179-181]). Um die Proliferation der CD4+ T-Zellen in der MLR zu

ermitteln, wurde die Expression von Cyclin E, Cyclin A und Ki-67 nach 2 Tagen

bestimmt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass diese Zellzyklusproteine

nach Stimulation in den Effektor T-Zellen hochreguliert werden (Abbildung 3-3B).

Durch Zugabe von DN T-Zellen konnte diese Expression unterdrückt werden. Die

Bestimmung der Proliferation mit Hilfe der Ki-67-Färbung zeigte die größten

Unterschiede zwischen den stimulierten und unstimulierten beziehungsweise

supprimierten CD4+ T-Zellen. Im Gegensatz hierzu fielen die messbaren Unterschie-

de unter Verwendung von Cyclin E wesentlich geringer aus. Die Analyse der Cyclin A

Expression ergab ein ähnliches Bild, wobei die Schwankungen zwischen verschie-

denen Ansätzen deutlich höher ausfielen. Im Weiteren wurde daher die Proliferati-

onsmessung mit Hilfe von Ki-67 durchgeführt, sofern eine frühe Bestimmung der

suppressiven Aktivität notwendig war.

51 3 Ergebnisse

Abbildung 3-3: Messung von Zellzyklusmarkern in CD4+ T-Zellen an Tag 2 der MLR

(A) Schematisches Modell zur Expression von Zellzyklusproteinen im Verlauf des Zellzyklus.

(B) Die Expression von Cyclin E, Cyclin A und Ki-67 wurde in CD4+ T-Zellen an Tag 2 der

MLR durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4.

52 3 Ergebnisse

3.2 Untersuchung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression

durch IL-7

3.2.1 Expression und Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors

Der IL-7R setzt sich aus einer α-Kette (CD127) und einer γ-Kette (CD132) zu einem

Heterodimer zusammen und wird von CD4+ und CD8

+ T-Zellen exprimiert [182].

Nachdem bislang unbekannt war, inwieweit DN T-Zellen einen funktionellen IL-7

Rezeptor exprimieren, wurde dessen Expression auf DN T-Zellen im Vergleich zu

anderen T-Zellpopulationen durchflusszytometrisch analysiert. Während Treg-Zellen

durch eine geringe Expression der α-Kette charakterisiert sind, konnte beobachtet

werden, dass humane DN T-Zellen beide Rezeptor-Untereinheiten auf vergleichba-

rem Niveau zu CD4+

und CD8+ T-Zellen exprimieren (Abbildung 3-4).

CD4 Treg CD8 DN

0

500

1000

1500

MF

I C

D127

CD4 Treg CD8 DN

0

1000

2000

3000

4000

5000

MF

I C

D132

Abbildung 3-4: Expression

des IL-7 Rezeptors auf

humanen T-Zellpopulationen.

PBMC wurden mit CD127 und

CD132 angefärbt und

durchflusszytometrisch

analysiert. Es wurde auf vitale

CD3+ TZRαβ

+ T-Lymphozyten

gegated und die angezeigten T-

Zell-populationen mittels CD4+

FoxP3- (CD4), CD4

+ FoxP3

+

CD25+ (Treg), CD8

+ (CD8) oder

CD4- CD8

- (DN) unterschieden.

Dargestellt ist der Mittelwert der

mittleren Fluoreszenzintensität

(MFI) von 4 analysierten

Spendern.

53 3 Ergebnisse

Um die Funktionalität des IL-7R zu überprüfen, wurde die Phosphorylierung von

STAT5 mittels PhosFlow-Färbungen durchflusszytometrisch bestimmt. Abbil-

dung 3-5A zeigt den durch IL-7 vermittelten Anstieg von phosphorylierten STAT5 auf

frisch isolierten CD4+ T-Zellen. Da bekannt ist, dass die Transduktion des IL-7

Signales über einen negativen Feedback-Mechanismus die Herrunterregulation von

CD127 induziert, wurde des Weiteren die Expression von CD127 in der MLR

untersucht. Dabei konnte eine verminderte Expression von CD127 nach Zugabe von

IL-7 festgestellt werden, welche durch die DN T-Zellen nicht beeinflusst wurde

(Abbildung 3-5B).

54 3 Ergebnisse

Abbildung 3-5: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in CD4+ T-Zellen. (A) Frisch

isolierte CD4+ T-Zellen wurden 20 Min. mit IL-7 inkubiert. Phosphoryliertes STAT5 wurde

mittels PhosFlow-Färbungen nachgewiesen. Dargestellt ist ein repräsentatives Histogramm

sowie der MFI von 3 unabhängigen Experimenten. (B) CD4+ T-Zellen wurden in MLRs in An-

oder Abwesenheit von DN T-Zellen und/oder IL-7 eingesetzt und ihre jeweilige Expression

von CD127 nach 24 Std. durchflusszytometrisch analysiert. Die relative Expression bezieht

sich auf unstimulierte CD4+ T-Zellen.

Für sämtliche funktionellen Assays der DN T-Zell-vermittelten Suppression wurden

DN T-Zellen verwendet, die zuvor (wie in Kapitel 2.2.7 beschrieben) kultiviert und

somit voraktiviert waren. Aus diesem Grund wurde die Expression und Funktionalität

des IL-7R auf vorkultivierten DN T-Zellen bestimmt. Die durchflusszytometrischen

Messungen ergaben, dass die kultivierten DN T-Zellen ebenfalls den IL-7R

55 3 Ergebnisse

exprimieren (Abbildung 3-6A). Die Funktionalität des IL-7R auf den kultivierten DN T-

Zellen zeigte sich durch die Induktion der STAT5-Phosphorylierung

(Abbildung 3-6B). Zudem konnte in der MLR eine Herunterregulation von CD127 auf

den DN T-Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 3-6C).

Abbildung 3-6: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in DN T-Zellen. (A) CD127 und

CD132 wurde auf vorkultivierten DN T-Zellen vor ihrem Einsatz in Suppressionsassays

angefärbt. Ein repräsentatives Experiment ist dargestellt. (B) Vorkultivierte DN T-Zellen

wurden 20 Min. mit IL-7 inkubiert und der Phosphorylierungsstatus von STAT5 durchflusszy-

tometrisch untersucht. Dargestellt ist ein repräsentatives Histogramm sowie der MFI von 5

unabhängigen Experimenten. (C) Die Expression von CD127 wurde auf DN T-Zellen in der

MLR ± IL-7 nach 24 Std. durchflusszytometrisch analysiert und relativ zur unbehandelten

Kontrollgruppe dargestellt. n=5.

56 3 Ergebnisse

3.2.2 Charakterisierung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppres-

sion durch IL-7

Nachdem sowohl CD4+ als auch DN T-Zellen als sensitiv gegenüber IL-7 charakteri-

siert wurden, sollte ermittelt werden, ob IL-7 die immunregulatorische Funktion der

DN T-Zellen beeinflussen kann. Zu diesem Zweck wurde IL-7 direkt in die MLR

gegeben. Abbildung 3-7A zeigt anhand eines repräsentativen Experimentes die

Wirkung von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression. CD4+ T-Zellen wurden

durch die Stimulation mit allogenen DZ zu einer starken Proliferation angeregt,

welche durch DN T-Zellen effektiv inhibiert werden konnte. Die Zugabe von IL-7

beeinflusste die proliferative Antwort der stimulierten CD4+ T-Zellen nicht. Allerdings

schwächte IL-7 die DN T-Zell-vermittelte Suppression deutlich ab. Wie in

Abbildung 3-7B zusammengefasst, wurde durch Zugabe von IL-7 die Suppression

der DN T-Zellen auf durchschnittlich nur noch 25% vermindert. Eine signifikante

Beeinträchtigung der DN T-Zell-vermittelten Suppression konnte unabhängig von der

Art der Stimulation nachgewiesen werden.

57 3 Ergebnisse

Abbildung 3-7: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der

Proliferation von konventionellen CD4+ T-Zellen. CFSE gefärbte CD4

+ T-Zellen wurden

mit DZ oder αCD3/28 stimuliert und in An- oder Abwesenheit von DN T-Zellen und/oder IL-7

für 5 Tage kokultiviert. In (A) ist die CFSE-Messung der CD4+ T-Zellen von einem

repräsentativen Spender abgebildet. In (B) ist die prozentuale Suppression von ≥10

unabhängigen Ansätzen zusammengefasst.

Eine Titration der in der MLR eingesetzten IL-7 Konzentration ergab, dass die

suppressive Kapazität der DN T-Zellen bereits bei einer Konzentration von 2 ng/ml

vermindert wird und dieser Effekt mit 20 ng/ml IL-7 tendenziell verstärkt werden kann

(Abbildung 3-8). Außerdem zeigten PhosFlow-Messungen, bei denen unterschiedli-

che Konzentrationen von IL-7 zugegeben wurden, ein maximales p-STAT5-Signal

bei 20 ng/ml. Übereinstimmend ließen die Daten der p-STAT5 und Suppressions-

58 3 Ergebnisse

messung erkennen, dass mit einer weiteren Konzentrationserhöhung von IL-7 auf

200 ng/ml keine entscheidende Signalverstärkung und kein Einfluss auf die

Suppression erzielt werden kann. Aus diesen Gründen wurde eine IL-7 Konzentrati-

on von 20 ng/ml für alle weiteren Versuche verwendet.

Abbildung 3-8: Titration der modulatorischen Aktivität von IL-7 auf DN T-Zellen. (A)

CD4+ T-Zellen, DZ und DN T-Zellen wurden mit unterschiedlichen IL-7 Konzentrationen

kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die proliferative Antwort der CD4+ T-Zellen mittels CFSE-

Messung bestimmt. Die % Suppression bezieht sich jeweils auf Kontrollansätze, bei denen

die CD4+ T-Zellen mit der angegebenen IL-7 Konzentration ohne DN T-Zellen kultiviert

wurden. (B) DN T-Zellen wurden für 20 Min. mit unterschiedlichen IL-7 Konzentrationen

inkubiert und die STAT5 Phosphorylierung analysiert. Die Histogramme sind repräsentativ

für 3 durchgeführte Experimente.

Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass DN T-Zellen nicht nur die Proliferation

sondern auch die Aktivierung und Effektorfunktion von CD4+ T-Zellen inhibieren [81].

Daher wurde untersucht, ob IL-7 diese suppressive Aktivität von DN T-Zellen

ebenfalls beeinflusst. Wie in Abbildung 3-9 dargestellt, wurde die Expression der

Aktivierungsmarker CD25 und CD154 auf CD4+ T-Zellen durch DN T-Zellen deutlich

unterdrückt. Nach Zugabe von IL-7 wurde dieser inhibitorische Effekt signifikant

59 3 Ergebnisse

vermindert, so dass die mit IL-7 kultivierten CD4+ T-Zellen trotz Anwesenheit von DN

T-Zellen eine starke Expression der Aktivierungsmarker aufwiesen.

3/

28

3/

28+D

N

3/28

+IL7

3/

28+D

N+I

L7

0

5

10

15

20

25

ns

*

ns*

% C

D154+

CD

4+

T-Z

ellen

3/

28

3/

28+D

N

3/28

+IL7

3/

28+D

N+I

L7

0

5000

10000

15000

20000

25000

**ns

** ns

CD

25

MF

I

Abbildung 3-9: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der

Aktivierung von CD4+ T-Zellen. CD4

+ T-Zellen wurden mit αCD3/28 Beads, DN T-Zellen

und/oder IL-7 kokultiviert und nach 2 Tagen die Expression von CD154 und CD25 auf ihrer

Oberfläche durchflusszytometrisch bestimmt. n=7.

60 3 Ergebnisse

3.2.3 Einfluss von IL-7 auf die Zell-Viabilität

In der Literatur wurde IL-7 als Überlebensfaktor für T-Zellen beschrieben, welcher

die starke Expression von anti-apoptotischen Molekülen induziert [183]. Aus diesem

Grund stellte sich die Frage, ob eine verbesserte Viabilität der CD4+ T-Zellen die

Ursache für die IL-7-vermittelte Inhibition der suppressiven Funktion der DN T-Zellen

darstellt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Frequenz apoptotischer CD4+

T-Zellen (Annexin-V+

(AxV+) /7-AAD

+) in der MLR bestimmt. Wie in Abbildung 3-10

dargestellt, zeigten die CD4+

T-Zellen in der MLR eine stabile Überlebensfähigkeit.

Unabhängig von der Stimulation und der Anwesenheit von DN T-Zellen waren in

sämtlichen Ansätzen etwa 10% AxV+ 7-AAD

+ CD4

+ T-Zellen zu verzeichnen. Zur

Bestätigung dieser Ergebnisse wurde die Zellviabilität mittels Caspase-Aktivitäts-

Messungen überprüft. Dazu wurden die Zellen mit einem Substrat, welches von

aktiven Caspasen gespalten wird, gefärbt. Die anschließenden durchflusszytometri-

schen Messungen ergaben, dass IL-7 wiederum keinen Einfluss auf die Viabilität von

CD4+ T-Zellen in der MLR ausübte.

61 3 Ergebnisse

Abbildung 3-10: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von CD4+ T-Zellen in der MLR. Die

Abbildungen zeigen durchflusszytometrische Messungen von MLR-Ansätzen in An- oder

Abwesenheit von IL-7, bei denen auf CD4+ T-Zellen gegated wurde. n≥4. (A) AxV

+ und 7-

AAD+ CD4

+ T-Zellen wurden in der MLR nach 20 Std. bestimmt. (B-C) Die Caspase-Aktivität

der CD4+ T-Zellen wurde mittels TF2-VAD-FMK-Färbung nach 2-tägiger MLR analysiert.

62 3 Ergebnisse

Damit ein negativer Einfluss auf das Überleben der DN T-Zellen durch IL-7

ausgeschlossen werden kann, wurden in den AnnexinV/7-AAD und den Caspase-

Aktivitäts-Messungen ebenso die DN T-Zellen analysiert. Wie in Abbildung 3-11

dargestellt, konnte IL-7 in den DN T-Zellen eine geringfügige Verbesserung ihres

Überlebens induzieren. Letztlich lässt sich festhalten, dass die Beeinträchtigung der

Suppression weder durch eine Änderung der Viabilität von CD4+ T-Zellen noch durch

einen Zytokin-induzierten Zelltod der DN T-Zellen zu erklären war.

Abbildung 3-11: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von DN T-Zellen in der MLR. Der

Prozentsatz an AxV+ 7-AAD

+ und Caspase-aktiven DN T-Zellen wurde in MLRs ± IL-7

durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4.

3.2.4 Untersuchung der IL-7 Signaltransduktion in DN T-Zellen

Um den zugrundeliegenden Mechanismus der durch IL-7 induzierten Modulation der

DN T-Zell-vermittelten Suppression weiter aufzuklären, wurde im Folgenden die

zelluläre Signalübertragung von IL-7 untersucht. Zunächst stellte sich die Frage, ob

IL-7 einen direkten Effekt auf die DN T-Zellen ausübt und dabei deren suppressive

Funktion blockiert oder ob IL-7 über einen indirekten Mechanismus die CD4+ T-

Zellen resistent gegenüber der DN T-Zell-vermittelten Suppression macht. Zur

Überprüfung der ersten Hypothese eines direkten IL-7 Effektes auf DN T-Zellen

wurde die Signalübertragung von IL-7 in DN T-Zellen durch Verwendung eines pan-

63 3 Ergebnisse

JAK-Inhibitors blockiert. Wie im Kapitel 2.2.10 beschrieben, wurden die DN T-Zellen

hierfür mit dem Inhibitor vorinkubiert und nach 2-maligem Waschen als Suppressor-

Zellen in der MLR in An- oder Abwesenheit von IL-7 eingesetzt. Wie in

Abbildung 3-12 gezeigt, konnte in den DN T-Zellen nach Blockade der JAK-Kinasen

keine Verminderung der Suppression festgestellt werden. Die Blockade des IL-7

Signales in DN T-Zellen schien den IL-7 Effekt vollständig zu revidieren.

- + - +

0

20

40

60

IL-7

DN(JAK)DN()

% S

up

pre

ssio

n

Abbildung 3-12: Blockade der JAK-abhängigen Signaltransduktion in DN T-Zellen. DN

T-Zellen wurden mit einem pan-JAK-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in

MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 5 Tagen mittels

CFSE-Messung ermittelt. n=4.

Da die Daten der JAK-Inhibition darauf hinwiesen, dass IL-7 einen direkten Einfluss

auf die Funktion der DN T-Zellen hat, konzentrierten sich weitere Versuche auf die

Charakterisierung des IL-7 Signales in den DN T-Zellen. Zunächst wurde der

Einfluss des STAT5 Signalweges untersucht. Die STAT5-Inhibition führte allerdings

zu keiner Aufhebung des IL-7-vermittelten Effektes auf die Suppression

(Abbildung 3-13). Die Suppression wurde hierbei sowohl an Tag 5 mittels CFSE als

auch mittels Ki-67 an Tag 2 bestimmt. In Abbildung 3-13 und den nachfolgenden

Experimenten sind die Ergebnisse des früheren Messzeitpunktes dargestellt, da die

64 3 Ergebnisse

DN T-Zellen mit dem Inhibitor nur vorbehandelt werden und daher eine Revision der

Signalinhibition im Laufe mehrerer Tage nicht ausgeschlossen werden kann.

- + - +

0

20

40

60

80

100** **

IL-7

DN(STAT5)DN( )

% S

up

pre

ssio

n

Abbildung 3-13: Blockade der STAT5 Signaltransduktion in DN T-Zellen. DN T-Zellen

wurden mit einem STAT5-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7

eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67

Messungen ermittelt. n=6.

3.2.5 Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges durch IL-7

Wie in der Einleitung beschrieben, können die IL-7 Rezeptor-assoziierten JAK nicht

nur STAT5, sondern auch PI3K phosphorylieren. PI3K katalysiert wiederum die

Phosphorylierung von Akt, wodurch GSK-3β sowie mTOR und S6 phosphoryliert

werden. Letztlich führt diese Signaltransduktion zur Aktivierung gewisser Transkripti-

onsfaktoren und einem veränderten Genexpressionsmuster.

Nachdem die bisherigen Ergebnisse auf eine Rolle der JAK Signalübertragung bei

der Modulation der DN T-Zell-Suppression hindeuteten, die Inhibition von STAT5

jedoch keine Wirkung erzielte, stellten wir die Hypothese auf, dass diese Modulation

über den Akt/mTOR Signalweg erfolgen könnte. Es wurde untersucht, inwieweit IL-7

diesen Signalweg in den DN T-Zellen aktiviert. Diese Analysen erfolgten mit Hilfe von

PhosFlow-Färbungen der nachgeschalteten Signalmoleküle GSK-3β und S6. Es

65 3 Ergebnisse

zeigte sich dabei, dass eine Stimulation der DN T-Zellen mit DZ sowohl die

Phosphorylierung von GSK-3β als auch der beiden Phosphorylierungsstellen von S6

am Serin 235/236 und 240 induziert (Abbildung 3-14). Insbesondere wurde diese

Phosphorylierung durch Zugabe von IL-7 verstärkt. In unstimulierten Kontrollansät-

zen konnte durch IL-7 alleine keine Phosphorylierung der Akt/mTOR Kinasen

nachgewiesen werden. Demnach steigerte IL-7 die TZR-induzierte Aktivierung der

Akt/mTOR Signalkaskade in DN T-Zellen.

Abbildung 3-14: Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen durch IL-7. DN

T-Zellen wurden VPD gefärbt, über Nacht ohne IL-2 kultiviert und schließlich für 40 Min. mit

DZ oder mit DZ und IL-7 stimuliert. Unstimulierte DN T-Zellen dienten als Kontrolle. Der

Phosphorylierungsstatus von GSK3β und S6 (an S235/236 und S240) in den VPD+ DN T-

Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt. In (A) sind Histogramme eines repräsentati-

ven Experiments abgebildet. (B) zeigt die MFI der phosphorylierten Signalmoleküle von ≥ 6

unabhängigen Experimenten.

66 3 Ergebnisse

Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die Amplifikation der Akt/mTOR Signal-

kaskade mittels IL-7 bis auf die Transkriptionsebene der DN T-Zellen auswirkt. Wie

in Abbildung 3-15 dargestellt, wurden in den DN T-Zellen wichtige Transkriptionsfak-

toren, die von Akt/mTOR reguliert werden, in Anwesenheit von IL-7 vermehrt

exprimiert.

T-bet

HIF

1IR

F4

KLF4

0.5

1.0

1.5

*** ** *

x-f

ach

e E

xp

ressio

n

du

rch

IL

-7

Abbildung 3-15: Hochregulation von Akt-kontrollierten Transkriptionsfaktoren in DN

T-Zellen durch IL-7. DN T-Zellen wurden in An- oder Abwesenheit von IL-7 mit CD4+ T-

Zellen und αCD3/28 Beads kokultiviert. Nach 2 Tagen wurde die intrazelluläre Expression

von T-bet, HIF-1α, IRF4 und KLF4 in den DN T-Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die

x-fache Expression durch IL-7 wurde in Bezug auf die DN T-Zellen aus den MLR-Ansätzen

ohne IL-7 ermittelt. n≥4.

3.2.6 Die Rolle des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation der DN T-Zell-

vermittelten Suppression

Als nächstes stellte sich für uns die Frage, inwieweit der Akt/mTOR Signalweg eine

relevante Rolle bei der Modulation der Funktionalität von DN T-Zellen spielt. Hierfür

wurde jener Signalweg in den DN T-Zellen blockiert und anschließend ihr

suppressives Potential bestimmt. Zum Einsatz kamen dabei drei Inhibitoren mit

unterschiedlichen Angriffspunkten an den Kinasen PI3K, Akt und mTOR.

Abbildung 3-16 zeigt die suppressive Kapazität der DN T-Zellen in An- oder

67 3 Ergebnisse

Abwesenheit von IL-7. Die blockierten DN T-Zellen wiesen trotz IL-7 eine suppressi-

ve Aktivität auf, die vergleichbar stark wie die der DN T-Zellen im Kontrollansatz war.

Somit konnte mit dem Einsatz der PI3K/Akt/mTOR Inhibitoren die IL-7 vermittelte

Modulation der DN T-Zell-Suppression vollständig aufgehoben werden.

- + - + - + - +

0

20

40

60

80

100 *** ns ns

DN( ) DN(Akt) DN(mTOR)

IL-7

DN(PI3K)

ns

% S

up

pre

ssio

n

Abbildung 3-16: Blockade des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen. DN T-

Zellen wurden mit einem PI3K-, Akt- oder mTOR-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-

Zellen in MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen

mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n≥6.

3.2.7 Die Rolle weiterer IL-7 induzierter Signalwege bei der Modulation der

Suppression

Neben STAT5 und Akt/mTOR können auch Mitogen-aktivierte Proteinkinasen

(MAPK) durch IL-7 aktiviert werden [184]. Inwieweit den MAPK p38, Erk und Jnk bei

der Modulation der DN T-Zell-Funktion eine Bedeutung zukommt, wurde mit Hilfe

weiterer Blockierungsexperimente untersucht. Im Gegensatz zu den PI3K-, Akt-,

mTOR-Blockaden konnte die Inhibition von p38, Erk und Jnk in DN T-Zellen den IL-7

Effekt nicht aufheben (Abbildung 3-17). Bei sämtlichen getesteten MAPK Inhibitionen

wurde bei den Ansätzen mit IL-7 eine signifikante Reduktion der suppressiven DN T-

Zell-Aktivität gemessen.

68 3 Ergebnisse

- + - + - + - +

0

20

40

60

80

100****

DN( ) DN(JNK) DN(Erk)

*

IL-7

DN(p38)

**

% S

up

pre

ssio

n

Abbildung 3-17: Blockade der MAPK Signalwege in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden

mit einem JNK-, Erk- oder p38-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ±

IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67

Messungen ermittelt. n≥6.

Die Signalkaskade der MAPK ist in der Lage, weitere zentrale Signalmoleküle wie

das NF-κB zu aktivieren [185]. Da der NF-κB Signalweg einen wichtigen Regulator

kritischer T-Zell-Funktionen darstellt, wurde auch dessen Rolle bei der Modulation

der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen untersucht. Die Blockade des NF-κB

Signalweges hatte allerdings weder einen Einfluss auf die Suppression der DN T-

Zellen noch einen Einfluss auf deren IL-7-vermittelte Modulation (Abbildung 3-18).

69 3 Ergebnisse

- + - +

0

20

40

60

80

100

IL-7

DN(NFB)DN( )

** *

% S

up

pre

ssio

n

Abbildung 3-18: Blockade des NF-κB Signalweges in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden

mit einem NF-κB-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7

eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67

Messungen ermittelt. n=7.

3.2.8 Transkriptom-Analyse zur Charakterisierung des molekularen

Wirkmechanismus von IL-7/Akt/mTOR in DN T-Zellen

Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, dass IL-7 die TZR-induzierte Aktivierung

des Akt/mTOR Signalweges amplifiziert und dadurch die Funktionalität der DN T-

Zellen beeinträchtigt. Akt/mTOR kann eine Reihe von nachgeschalteten Proteinen

und zelluläre Prozesse beeinflussen [186-188]. Um den zugrundeliegenden

Mechanismus der Modulation der Suppression noch weiter zu charakterisieren,

wurde das gesamte Transkriptom von IL-7 behandelten DN T-Zellen analysiert und

mit unbehandelten DN T-Zellen verglichen. Abbildung 3-19 stellt das Vorgehen der

Transkriptom-Analyse schematisch dar. Es wurde eine MLR bestehend aus CD4+ T-

Zellen, αCD3/28 Beads und DN T-Zellen mit oder ohne IL-7 angesetzt. Nach zwölf

Stunden wurden die DN T-Zellen mittels eines Zell-Sorters isoliert und lysiert. Die

suppressive Funktion der DN T-Zellen sowie deren Modulation durch IL-7 wurde in

einem parallelen MLR-Kontrollansatz durchflusszytometrisch überprüft. Aus den DN

70 3 Ergebnisse

T-Zellen 4 unterschiedlicher Spender wurde RNA isoliert und deren Qualität

überprüft. Anschließend wurde die RNA in Kooperation mit Prof. Arif Ekici

sequenziert und analysiert.

Abbildung 3-19: Schema der RNA Sequenzierung von DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden

in MLR-Ansätzen in An- oder Abwesenheit von IL-7 eingesetzt. Nach 12 Std. wurden die DN

T-Zellen mittels durchflusszytometrischer Zellsortierung abgetrennt. Aus den DN T-Zellen

wurde Gesamt-RNA isoliert und diese sequenziert. Differentiell exprimierte Gene wurden

mittels DESeq2 ermittelt und mit Hilfe der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software

funktionell annotiert.

71 3 Ergebnisse

Die Auswertung der Daten ergab, dass über alle Spender gemittelt und bezogen auf

die Kontroll-Zellen in den IL-7 behandelten DN T-Zellen 1301 Gene unterschiedlich

exprimiert wurden (p-Wert <0,05). Wie im Genexpressionsprofil (Abbildung 3-20) rot

illustriert, wurden 485 Gene in den DN T-Zellen durch IL-7 verstärkt und 816 Gene

vermindert exprimiert. Die starke Herrunterregulation der IL-7R α-Kette (log2-fache

Veränderung = -0,86) belegt ein funktionelles IL-7 Signal auf die DN T-Zellen im

Experiment.

Abbildung 3-20: Differentielle Expression von IL-7 behandelten gegenüber

unbehandelten DN T-Zellen. Der dargestellte MA Plot zeigt die log2-fache Veränderung der

Expression in den IL-7 behandelten DN T-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Gene, die mit

p<0,05 differentiell exprimiert wurden, sind rot gekennzeichnet. Das am stärksten regulierte

Gen CD127 wurde markiert.

Die differentiell exprimierten Gene wurden mit Hilfe der IPA Software weiter

analysiert und kanonischen Signalwegen zugeordnet. Die Aufstellung in

Abbildung 3-21 zeigt, welche Signalwege durch IL-7 in den DN T-Zellen am stärksten

beeinflusst wurden. Darunter befanden sich sowohl JAK/STAT Zytokin-Signalwege,

als auch die PI3K/Akt, p70S6K und mTOR Signalwege. Außerdem wurde die

Herunterregulation von PTEN, eines zentralen Inhibitors des Akt/mTOR Signalwe-

ges, beobachtet. Im Gegensatz zu Akt/mTOR wurden unter den meist-veränderten

Signalwegen weder MAPK oder NF-κB Signalwege annotiert.

72 3 Ergebnisse

Abbildung 3-21:

Zuordnung der differentiell

exprimierten Gene zu

kanonischen Signalwegen

mit IPA Software. Die aus

der RNA Sequenzierung

ermittelten differentiell expri-

mierten Gene zwischen IL-7

behandelten und unbehande-

ten DN T-Zellen wurden mit

der „IPA Pathway Analysis“

Funktion analysiert. Die

differenziell exprimierten Gene

wurden dabei mit der IPA

Datenbank abgeglichen und

kanonischen Signalwegen

zugeordnet. Abgebildet sind

die 15 Signalwege, die durch

IL-7 in den DN T-Zellen am

Signifikantesten verändert

wurden. Die markierte „Ratio“

gibt das Verhältnis der Anzahl

der Gene unseres Daten-

satzes geteilt durch die Anzahl

aller annotierter Gene zu

einem Signalweg an.

73 3 Ergebnisse

Ein Abgleich der differentiell exprimierten Gene mit der IPA Datenbank ergab zudem,

dass eine Vielzahl an Genen, die laut Annotation von Akt kontrolliert werden, in den

DN T-Zellen verändert exprimiert werden und der Akt Signalweg daher als „Top

upstream regulator network“ vorhergesagt wird (p=5,27E-06). Eine Auflistung der

Gene, welche durch Akt hoch- beziehungsweise runterreguliert werden, befindet sich

in Abbildung 3-22.

Differently-expressed genes

annotated to Akt regulation log2 fold

change AR 0,31263

ATP5A1 -0,17832 BCL2 0,21395

BCL2A1 -0,28861 BMF -0,3296

CDKN1A 0,23649 CDKN1B -0,34280 COX4I1 -0,16922 CXCR4 0,19557 E2F2 0,21030 EGR2 -0,21491 EPAS1 0,22374

FAS -0,18201 FBXO32 -0,25099

FN1 0,22882 IER3 -0,26835 IL13 0,24408 IL1B 0,20133 IL22 0,23538 IL7R -0,86067 LEF1 -0,30648 MCL1 -0,19540 MUC1 0,37288

PTGER4 -0,17861 SLC8A1 0,42967 SOCS3 0,24417

Abbildung 3-22: Annotation des Akt Signalweges als „Top upstream regulator

network“. Die Tabelle basiert auf der IPA-Auswertung und zeigt Gene an, welche durch Akt

reguliert werden und deren Expression in den DN T-Zellen durch IL-7 signifikant hoch- oder

herunterreguliert wurden.

74 3 Ergebnisse

Im Folgenden wurde analysiert, welche molekularen und zellulären Funktionen in

den DN T-Zellen durch IL-7 beeinflusst werden. Das Clustering der differentiell

exprimierten Gene zu funktionellen Gruppen ergab, dass 350 Gene der Funktion

„Zellwachstum/-proliferation“ zugeordnet werden (Abbildung 3-23 oben). Um das

Clustering für DN T-Zellen zu präzisieren, wurde im nächsten Schritt nach

Funktionen gefiltert, die spezifisch für T-Zellen annotiert sind. Wie in Abbildung 3-23

unten zu sehen, wirkte IL-7 auf Funktionen wie T-Zell-Homöostase, Proliferation,

Differenzierung und Aktivierung am signifikantesten ein.

Most affected molecular and

cellular functions p-value #

Molecules Cell growth and proliferation 5,81E-21 – 5,53E-05 350 Cell death and survival 1,77E-19 – 5,38E-05 337 Cellular function and maintenance 7,63E-19 – 5,76E-05 284

Functional T-cell annotations p-value #

Molecules T cell homeostasis 2,42E-18 86 Quantity of T lymphocytes 5,19E-18 89 T cell development 5,93E-18 84 Proliferation of T lymphocytes 9,23E-17 92 Differentiation of T lymphocytes 1,42E-16 66 Function of T lymphocytes 8,51E-15 51 Cell movement of T lymphocytes 2,12E-14 45 Apoptosis of T lymphocytes 1,86E-13 51 Cell death of T lymphocytes 2,17E-13 55 Activation of T lymphocytes 7,92E-13 58

Abbildung 3-23: Einordnung der differentiell exprimierten Gene zu funktionellen

Gruppen. Die durch IL-7 in den DN T-Zellen differentiell exprimierten Gene wurden mit Hilfe

der IPA Software zu funktionellen Gruppen geclustert. Oben dargestellt sind die 3

funktionellen Gruppen mit höchster Signifikanz. Unten wurden diese Cluster durch einen

Filter spezifiziert, so dass nur die Annotationen, die T-Zell-Funktionen betreffen, angezeigt

werden.

75 3 Ergebnisse

In Abbildung 3-24 werden ausgewählte differentiell exprimierte Gene aufgezeigt, die

mit der Aktivierung, Proliferation und Homöostase von T-Lymphozyten assoziiert

wurden. Interessanterweise ergab sich bei der Aufstellung und dem Abgleich mit der

Literatur [189-192], dass diverse Anergie-assoziierten Gene in den DN T-Zellen

infolge von IL-7 herunterreguliert wurden. Faktoren, die für die Aufrechterhaltung

eines anergen Zustandes wichtig sind und in den DN T-Zellen vermindert exprimiert

wurden, sind zum Beispiel FoxO, NFAT, p27kip1

, NDFIP, EGR2, EGR3, SMAD3,

TSC1 und CBL.

Abbildung 3-24: Differentielle Expression signifikanter Gene, die mit Aktivierung,

Proliferation, Homöostase, Anergie und suppressiver Funktion assoziiert sind.

Dargestellt ist die differenzielle Expression von einer Auswahl an Genen, die mit der

Aktivierung, Proliferation, Homöostase und Anergie assoziiert worden waren und in den DN

T-Zellen durch IL-7 signifikante Expressionsänderungen zeigten.

Zur Verifizierung der Transkriptomanalyse wurde die Auswirkung von IL-7 auf die

Expression ausgewählter Gene mittels qPCR untersucht. Dazu wurden DN T-Zellen

anderer Spender mit αCD3/28 Beads in An- oder Abwesenheit von IL-7 über Nacht

kokultiviert. Nach erfolgter RNA-Isolation und Transkription in cDNA wurde die

Expression bestimmter Anergie-assoziierter Gene relativ zu einem Housekeeping-

76 3 Ergebnisse

Gen quantifiziert. Abbildung 3-25 zeigt die relative Genexpression in IL-7 behandel-

ten DN T-Zellen normiert auf die ohne IL-7 stimulierten DN T-Zellen. Die erhaltenen

Ergebnisse bestätigten, dass FoxO4, NFAT, EGR2, EGR3 und CBL durch IL-7 in

den DN T-Zellen vermindert exprimiert wurden.

Abbildung 3-25: Verifizierung der Expression Anergie-assoziierter Gene in DN T-

Zellen. DN T-Zellen, die aus anderen Spendern als die der Transkriptomanalyse stammten,

wurden in An- oder Abwesenheit von IL-7 stimuliert. Nach 16 Std. wurden aus den DN T-

Zellen RNA isoliert und qPCRs durchgeführt. Die Expression von FoxO4, NFAT, EGR2,

EGR3 und CBL wurde anhand der δδct-Werte quantifiziert. Die % relative Expression, die

sich auf die jeweilige Genexpression der IL-7 unbehandelten Kontroll-DN T-Zellen bezieht,

ist von 4 unabhängigen Versuchsansätzen dargestellt.

77 3 Ergebnisse

3.2.9 Korrelation des Aktivierungs- und Proliferationszustandes von DN T-

Zellen mit der suppressiven Funktion

Die Daten der RNA Sequenzierung deuteten darauf hin, dass IL-7 insbesondere die

Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen verstärkt und die Expression von

Anergie-assoziierten Genen aufhebt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die

Expression von Aktivierungs- und Proliferationsmarkern auf den DN T-Zellen nach

IL-7 Stimulation durchflusszytometrisch analysiert. Abbildung 3-26A zeigt den

Aktivierungszustand der DN T-Zellen anhand der CD25 und CD154 Expression, die

durch IL-7 sichtlich verstärkt wurde im Vergleich zu einer Stimulation mit DZ alleine.

In Abbildung 3-26B ist die Messung der Zellzyklusmarker Ki-67 und Cyclin A

dargestellt. Wie auch bei der Aktivierung zeigte sich, dass IL-7 die Proliferation der

stimulierten DN T-Zellen signifikant steigert.

78 3 Ergebnisse

Abbildung 3-26: Verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen durch IL-7.

DN T-Zellen wurden in MLRs mit oder ohne IL-7 eingesetzt und ihr Aktivierungs- und

Proliferationszustand nach 2 Tagen durchflusszytometrisch analysiert. (A) zeigt die relative

Expression von CD25 und CD154 auf IL-7 behandelten DN T-Zellen im Vergleich zu DN T-

Zellen aus MLR-Ansätzen ohne IL-7. (B) zeigt die intrazelluläre Expression von Ki-67 und

CyclinA in DN T-Zellen. Die Histogramme zeigen eine repräsentative Messung. Die Daten

aus ≥7 unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst und die relative Expression

von Ki-67 oder CyclinA in den mit IL-7 kultivierten DN T-Zellen dargestellt. Als Referenz

dienten DN T-Zellen, die ohne IL-7 stimuliert worden waren.

79 3 Ergebnisse

Im Weiteren wurde untersucht, ob die verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN

T-Zellen ihre suppressive Funktion beeinflusst. Hierfür wurden die Datensätze von

unabhängigen Experimenten gegeneinander aufgetragen (Abbildung 3-27).

Interessanterweise zeigte sich, dass DN T-Zellen umso stärker supprimieren je

weniger aktiviert sie sind. Eine ähnliche negative Korrelation zeigte sich auch in der

stärkeren Suppression der DN T-Zellen bei geringerer Proliferation. Die durch IL-7

gesteigerte Aktivierung und Proliferation ging mit einer geringeren suppressiven

Aktivität einher und korrelierte signifikant.

80 3 Ergebnisse

Abbildung 3-27: Korrelation von Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen mit

deren suppressiven Funktion. In der MLR ± IL-7 wurde nach 2 Tagen die DN T-Zell-

vermittelte Suppression der CD4+

T-Zell-Proliferation ermittelt. Zudem wurde die Expression

von CD25 und Ki-67 in den DN T-Zellen ermittelt und die gewonnen Werte gegen die %

Suppression aufgetragen. Die negativen Korrelationen wurden mittels der Spearman-

Analyse berechnet.

81 3 Ergebnisse

3.2.10 Modell: Mechanismus zur Modulation der suppressiven Fähigkeit von

humanen DN T-Zellen

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Promotionsarbeit wurde ein Modell zum

Mechanismus der Modulation des suppressiven Potentials von DN T-Zellen

aufgestellt (Abbildung 3-28).

Abbildung 3-28: Schematisches Modell der IL-7 vermittelten Modulation der

suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen

Die Stimulation des TZR induziert in den DN T-Zellen eine Phosphorylierung von Akt,

welche durch IL-7 verstärkt wird. Das amplifizierte Akt Signal setzt eine zelluläre

Signalkaskade in Gang, die in einem gesteigerten mTOR Signal resultiert. Dadurch

82 3 Ergebnisse

werden zentrale Regulatoren wie die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) sowie der

Transkriptionsfaktor FoxO gehemmt.

Die durch IL-7 veränderten Signalwege führen zu einer gesteigerten Aktivierung der

DN T-Zellen. Anergie-assoziierte Gene werden herunterreguliert, wodurch DN T-

Zellen vermehrt in den Zellzyklus eintreten können und proliferieren. Der Zugewinn

an Aktivierung und Zellwachstum korreliert allerdings mit einem Verlust an

immunregulatorischer Funktion der DN T-Zellen. Somit kann IL-7 über eine kritische

Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges die Funktionalität der DN T-Zellen

beeinträchtigen.

3.3 Charakterisierung weiterer Modulatoren der Suppression

3.3.1 Akt/mTOR als Angriffspunkt zur Modulation der Suppression

Die bisher beschriebenen Ergebnisse ergaben, dass IL-7 die suppressive Funktion

der DN T-Zellen beeinträchtigt, indem der Akt/mTOR Signalweg amplifiziert wird. In

der Literatur wurde beschrieben, dass bei einer Hyperaktivierung von Akt oder

mTOR in Treg Zellen deren immunregulatorischen Funktion verloren gehen kann

[193, 194]. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob sich eine Hyperaktivierung von

Akt/mTOR in DN T-Zellen in ähnlicher Weise auf deren immunregulatorische

Aktivität auswirkt. Zur Aktivierung von Akt wurde das neuartige „small molecule“

SC79 eingesetzt, welches spezifisch an Akt binden und dabei dessen Konformation

so ändern kann, dass die Phosphorylierung von Akt durch vorgeschaltete Kinasen

erleichtert wird [195]. DN T-Zellen wurden mit SC79 vorbehandelt und als

Suppressor-Zellen in eine MLR eingesetzt. Durch die Überaktivierung von Akt konnte

eine signifikante Verminderung der Suppression beobachtet werden

(Abbildung 3-29). Da IGF-1 (von engl. insulin-like growth factor 1) als starker

natürlicher Akt–Aktivator gilt, wurde weiterhin dieses Hormon zur Überprüfung

verwendet [196]. Die mit IGF-1 behandelten DN T-Zellen erwiesen sich ebenso als

schlechte Suppressor-Zellen.

http://de.wikipedia.org/wiki/Proteinkinase

83 3 Ergebnisse

Abbildung 3-29: Akt-Hyperaktivierung in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit den Akt-

Aktivatoren SC-79 oder IGF-1 vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs eingesetzt.

Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt.

n≥6.

3.3.2 Modulation der Suppression durch proinflammatorische Zytokine

Der Akt/mTOR Signalweg stellt ein zentrales und komplex vernetztes Element in der

T-Zell-Signaltransduktion dar und kann durch eine Reihe von Zytokinen angesteuert

werden. Daher wurden abschließend Untersuchungen dazu angestellt, inwieweit

Zytokine, die mit GvHD und inflammatorischen Bedingungen assoziiert sind, ebenso

einen Einfluss auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber Effektor T-Zellen

ausüben können. Dabei wurden die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12,

IFN-γ und TNF in einer Konzentration von 20 ng/ml in die MLR zugegeben. Die in

Abbildung 3-30 dargestellten Messergebnisse zeigen, dass diese Zytokine die

suppressive Funktion der DN T-Zellen nicht beeinflussten.

84 3 Ergebnisse

Abbildung 3-30: Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die DN T-Zell-vermittelte

Suppression. CFSE gefärbte CD4+ T-Zellen wurden mit DZ und/oder DN T-Zellen und den

Zytokinen IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ oder TNF kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die

Proliferation der CD4+ T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. n=3.

3.3.3 Modulation der Suppression durch γ-Ketten-Zytokine

Darüber hinaus wurden Zytokine, welche für ihre Signaltransduktion die common γ-

Kette (CD132) nutzen, auf ihren Einfluss auf die suppressive Kapazität der DN T-

Zellen getestet. Die Experimente ergaben, dass IL-9 und IL-21 keinen Einfluss auf

die Funktionalität der DN T-Zellen aufweisen (Abbildung 3-31). Das homöostatische

Zytokin IL-15 zeigte im Gegensatz zum verwandten IL-7 ebenso keinen Effekt.

Allerdings konnte durch Anwesenheit von IL-4 eine Beeinträchtigung der DN T-Zell-

vermittelten Suppression beobachtet werden.

85 3 Ergebnisse

Abbildung 3-31: Einfluss von y-Ketten-Zytokinen auf die DN T-Zell-vermittelte

Suppression. CFSE gefärbte CD4+ T-Zellen wurden mit DZ und/oder DN T-Zellen und den

Zytokinen IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 oder IL-21 kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die Proliferation

der CD4+ T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4.

86 4 Diskussion

4 Diskussion

4.1 Modulation der humanen DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7

Humane DN T-Zellen weisen eine starke suppressive Funktion gegenüber T-

Zellantworten auf und sind damit an der Regulation des Gleichgewichtes zwischen

Immunreaktivität und Immuntoleranz beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte

aufgeklärt werden, ob die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber

alloreaktiven T-Zell-Antworten moduliert werden kann. Im Fokus der Untersuchung

stand dabei das Zytokin IL-7, welches einen bedeutenden Überlebens- und

Proliferationsfaktor für T-Zellen darstellt und in zahlreichen Studien mit dem

Auftreten einer GvHD assoziiert worden war.

4.1.1 Einfluss von IL-7 auf die suppressive Aktivität humaner DN T-Zellen

Um den Einfluss von IL-7 auf humane immunregulatorische DN T-Zellen zu

charakterisieren, wurde zunächst die Expression des IL-7R untersucht. Dabei konnte

gezeigt werden, dass die humanen DN T-Zellen beide Rezeptoruntereinheiten -

CD127 und CD132 - auf einem vergleichbaren Niveau wie CD4+ und CD8

+ T-Zellen

exprimieren. Im Gegensatz dazu exprimieren natürliche Treg-Zellen CD127 nur

gering [102, 103]. DN T-Zellen sind im Vergleich zu Treg-Zellen somit vermutlich

sensitiver gegenüber geringeren IL-7 Konzentrationen.

Da in unseren Versuchsansätzen expandierte DN T-Zellen eingesetzt wurden und

die Untereinheit CD127 in Folge einer TZR-Stimulation herunterreguliert werden

kann [197], wurde die Expression des IL-7R auf den kultivierten DN T-Zellen

überprüft. Die wöchentliche Stimulation der DN T-Zellen unter Kulturbedingen führte

jedoch zu keinem anhaltenden Mangel der CD127 Expression. Die vorkultivierten DN

T-Zellen, die fünf bis sieben Tage nach der letzten Restimulation in die Proliferation-

sassays eingesetzt wurden, zeigten vor Versuchsansatz ebenso eine stabile CD127

Expression. Die Funktionalität des IL-7R konnte durch die nachgewiesene

Phosphorylierung von STAT5 nach Stimulation mit IL-7 belegt werden.

87 4 Diskussion

Zur Bestimmung der suppressiven Aktivität von humanen DN T-Zellen wurde in der

vorliegenden Arbeit die proliferative Antwort von in der MLR stimulierten CD4+ T-

Zellen analysiert. Um die Frage zu beantworten, ob IL-7 einen Einfluss auf die DN T-

Zell-vermittelte Suppression von T-Zell-Antworten hat, wurde exogenes IL-7 zu der

MLR zugegeben. Interessanterweise konnte in den vorliegenden Untersuchungen

dokumentiert werden, dass die suppressive Funktion der DN T-Zellen durch IL-7

deutlich eingeschränkt wird. So wurde die Proliferation der Effektor T-Zellen durch

die DN T-Zellen bei Anwesenheit von IL-7 nicht mehr effektiv unterdrückt und

darüber hinaus die DN T-Zell-vermittelte Suppression der T-Zell-Aktivierung

signifikant beeinträchtigt.

Da IL-7 über einen negativen Feedback-Mechanismus CD127 herunterreguliert und

nach Zugabe von IL-7 in die MLR eine verminderte Expression von CD127 sowohl

auf den DN als auch auf den CD4+ T-Zellen beobachtet wurde, konnte hiermit

nachgewiesen werden, dass sowohl die Suppressor- als auch die Responder-Zellen

in der MLR ein IL-7 Signal erhalten. Aus diesem Grund stellte sich die Frage, durch

welche T-Zellpopulationen die beeinträchtige DN T-Zell-vermittelte Suppression

vermittelt wird. Ein Effekt von IL-7 auf DZ konnte ausgeschlossen werden, da unter

Verwendung von αCD3/28 Beads in der MLR vergleichbare Resultate erzielt wurden.

Weiterhin könnte IL-7 direkt auf die CD4+ T-Zellen wirken und damit eine Resistenz

gegenüber der Suppression induzieren. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten

zeigen, dass eine Hyperaktivierung des Akt Signalweges in Effektor T-Zellen deren

Sensitivität gegenüber der Suppression von Treg-Zellen mindert [198, 199]. Ferner

wurde beschrieben, dass γc-Zytokine eine Resistenz gegen die immunregulatorische

Aktivität von Treg-Zellen auslösen können. So war IL-15 in der Lage, in CD4+

und

CD8+ T-Zellen Resistenz gegenüber der Suppression von Treg-Zellen zu induzieren

[200]. Außerdem konnte IL-21 der regulatorischen Aktivität von Treg-Zellen

entgegenwirken, indem die Proliferation der Effektor T-Zellen gesteigert wurde [201].

Da IL-7 das Überleben und die Proliferation von CD4+ T-Zellen beeinflussen kann

[202], wäre eine direkte Beeinflussung der CD4+ T-Zellen in unseren Versuchsansät-

zen möglich gewesen. Die Kontrollansätze ohne DN T-Zellen zeigten jedoch, dass

IL-7 die Aktivierung oder Proliferation der CD4+ T-Zellen nicht signifikant steigert. Der

ausbleibende Effekt von IL-7 auf die CD4+ T-Zellen liegt vermutlich in der relativ

88 4 Diskussion

starken Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads begründet. Die

Quantifizierung der apoptotischen Zellen mittels AxV/7AAD- oder Caspase-Färbung

zeigte ferner keinen Überlebensvorteil der CD4+ T-Zellen durch IL-7. Diese

Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-7 keine Resistenz der CD4+ T-Zellen

gegenüber der DN T-Zell-vermittelten Suppression induziert.

Aus den Zytotoxizitätsmessungen lassen sich zudem weitere Schlussfolgerungen

ziehen: zum einen zeigte sich bei den Ansätzen mit DN T-Zellen kein Anstieg an

toten CD4+ T-Zellen, sondern tendenziell eher ein Rückgang. Da DN T-Zellen die

Aktivierung der CD4+ T-Zellen unterdrücken, mindern sie vermutlich eher den

Aktivierungs-induzierten Zelltod von Effektor T-Zellen [11]. Zum anderen bestätigten

die Daten vorangegangene Arbeiten, dass humane DN T-Zellen, im Gegensatz zu

ihrer murinen Entsprechung, die Suppression gegenüber T-Zellen nicht durch die

Induktion von Zelltod vermitteln [55, 81].

Die einzige Studie, die sich bislang mit einer Modulation der DN T-Zell-Funktion

beschäftigt hat, stellte im Mausmodell fest, dass IL-10 die DN T-Zellen anfällig

gegenüber Apoptose werden lässt und somit die suppressive Aktivität mindert [92].

Unsere Daten zeigten, dass IL-7 das Überleben der DN T-Zellen in der Kokultur

geringfügig verbessert. Folglich liegt der Beeinträchtigung der DN T-Zell-vermittelten

Suppression keine Abnahme der DN T-Zellzahl durch IL-7 zu Grunde. Die später

diskutierten Untersuchungen ergaben vielmehr, dass IL-7 einen direkten Einfluss auf

die Funktionalität der DN T-Zellen ausübt.

Der Befund, dass IL-7 die immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen signifikant

minderte, zeigt einen neuen und vielversprechenden Angriffspunkt zur Modulation

der peripheren Immuntoleranz auf. Diese Modulation könnte insbesondere nach

allogener HSZT im Spannungsfeld zwischen einerseits der Rekonstitution des

Immunsystems und andererseits der Vermeidung einer GvHD eine entscheidende

Rolle spielen. Wie unterschiedliche Studien darlegten, kommt den DN T-Zellen

aufgrund ihrer Fähigkeit, alloreaktive Effektor T-Zellen zu unterdrücken, ein

interessantes therapeutisches Potential zu. So wurde für murine DN T-Zellen

nachgewiesen, dass sie in der Lage sind, die Schwere einer GvHD zu mindern oder

89 4 Diskussion

deren Entwicklung ganz zu verhindern und dabei trotzdem den notwendigen GvL-

Effekt zur Tumorbekämpfung aufrecht zu erhalten [55, 77, 84, 85]. Klinische Studien

bei Patienten nach allogener HSZT wiesen auf einen ähnlichen therapeutischen

Nutzen der DN T-Zellen hin, nachdem das Auftreten und die Schwere der GvHD

nach HSZT mit der Frequenz an DN T-Zellen invers korreliert [82, 83]. Hinsichtlich

des therapeutischen Ziels, eine GvHD mittels DN T-Zellen zu verhindern, ist die

Charakterisierung von Einflussfaktoren auf die suppressive Aktivität von DN T-Zellen

von großem Interesse. In dieser Arbeit konnte in IL-7 erstmals ein Modulator der

Funktionalität von humanen DN T-Zellen identifiziert werden, der den Erfolg einer

HSZT beeinflussen könnte. IL-7 spielt eine entscheidende Rolle nach HSZT, indem

es die T-Zell-Entwicklung und die Expansion von peripheren T-Zellen fördert [122].

Ein erhöhter IL-7 Spiegel, wie er unter lymphopenischen Bedingungen nach HSZT

zu finden ist, kann daher auf der einen Seite die Immunrekonstitution fördern [137,

159]. Auf der anderen Seite zeigten diverse Untersuchungen auf, dass IL-7 an der

Entwicklung einer GvHD beteiligt ist und dass eine hohe IL-7 Konzentration nach

HSZT somit einen prädiktiven Biomarker der GvHD darstellt [160, 161, 165, 166].

Warum IL-7 die Inflammation und Gewebeschäden nach HSZT begünstigt, ist

bislang unklar. In der Literatur wurde diskutiert, ob IL-7 die Aktivierung und

Proliferation von alloreaktiven T-Zellen und daher die GvHD fördert [162]. Die hier

vorliegenden Daten konnten diese Hypothese zumindest für CD4+ T-Zellen nicht

bestätigen. Inwieweit die Immunreaktion von alloreaktiven CD8+ T-Zellen möglicher-

weise durch IL-7 beeinflusst wird, bleibt aufzuklären. Unsere Ergebnisse deuten an,

dass IL-7 unter anderem die suppressive Funktion der DN T-Zellen beeinträchtigt,

und dadurch die GvHD-auslösenden Effektor T-Zellen von den DN T-Zellen nicht

mehr unter Kontrolle gebracht werden können. Insofern setzt IL-7 durch den Einfluss

auf die DN T-Zellen zelluläre immunregulatorische Mechanismen außer Kraft. Damit

übereinstimmend wäre denkbar, dass eine IL-7R Blockade die DN T-Zell-Funktion

wiederherstellt. Im murinen Modell konnte das Auftreten einer GvHD mit Hilfe einer

Blockade der IL-7R α-Kette vermieden werden [163]. Unsere Daten stellen diese

Beobachtungen in einen neuen Zusammenhang, da die Auswirkungen von IL-7

bisher nur auf Effektor T-Zellen analysiert wurden, die Effekte auf DN T-Zellen bisher

jedoch unberücksichtigt blieben. Wie wir zeigen konnten, exprimieren DN T-Zellen

90 4 Diskussion

beide IL-7R-Ketten. Eine Blockade des IL-7R hat somit vermutlich einen beachtens-

werten Einfluss auf die DN T-Zellen und ihre Funktion. Obwohl Treg-Zellen eine

geringe Expression der IL-7R α-Kette aufweisen, zeigten Studien, dass hohe IL-7

Konzentrationen ihre suppressive Aktivität beeinflussen können [156-158]. Der Effekt

von IL-7 auf die Funktion von Treg-Zellen und weitere immunregulatorische Zellen

nach HSZT wurde bislang nicht untersucht. Möglicherweise werden nicht nur die DN

T-Zellen sondern auch andere immunregulatorische T-Zellen in ihrer Funktion

beeinträchtigt, was letztlich im Zusammenspiel die Immuntoleranz bricht und die

Entwicklung einer schweren GvHD begünstigt.

In verschiedenen präklinischen und klinischen Studien wurde versucht, mit Hilfe von

rekombinantem humanem IL-7 (CYT107) die Rekonstitution des T-Zell-

Kompartiments zu verbessern [96, 142]. Während rekombinantes IL-7 in der Lage

ist, CD4+ und CD8

+ T-Zellen zu expandieren, scheint IL-7 die Expansion von Treg-

Zellen nur in einem geringeren Ausmaß zu fördern [141, 142]. Es wäre interessant

aufzuklären, inwieweit IL-7 die Rekonstitution von DN T-Zellen nach HSZT

beeinflusst. Der Einsatz von rekombinantem IL-7 wird sehr kontrovers diskutiert und

viele Studien mahnen zum vorsichtigen Gebrauch, da sie das Risiko einer GvHD-

Entstehung oder Exazerbation sehen [126, 135, 203]. Unsere Ergebnisse

unterstützen diese Bedenken, da die IL-7-vermittelte Einschränkung der DN T-Zell-

Suppression in einer Zunahme an alloreaktiven T-Zell-Antworten resultieren könnte.

Wie in der Einleitung erläutert, gibt es viele Hinweise darauf, dass IL-7 ebenso bei

bestimmten Autoimmunerkrankungen eine entscheidende Rolle als Modulator des

Gleichgewichts zwischen T-Zell-Reaktivität und Immuntoleranz spielt. Bei Patienten

mit juveniler idiopathischer Arthritis zeigte sich zum Beispiel, dass IL-7 die

suppressive Funktion von Treg-Zellen aufhebt [154, 155]. Unsere Ergebnisse zeigen

auf, dass diese Beeinträchtigung der Immuntoleranz durch IL-7 möglicherweise noch

schwerer ausfällt, da IL-7 zusätzlich auch noch die suppressive Aktivität der DN T-

Zellen brechen kann. Dieses Resultat mag auch im Kontext von Diabetes Typ I

relevant sein. Untersuchungen an Diabetes mellitus ergaben, dass der Lymphope-

nie-assoziierte Anstieg der IL-7 Spiegel zur Expansion von selbstreaktiven T-Zellen

91 4 Diskussion

führt [147]. Wie Blockaden des IL-7 Signalweges eindrücklich zeigten, ist IL-7 durch

seine Wirkung auf T-Zellen an dem Auftreten der Stoffwechselkrankheit beteiligt

[148, 149]. Andere Studien stellten fest, dass DN T-Zellen die Fähigkeit besitzen, die

autoreaktiven T-Zellen, die die Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas

angreifen, effektiv zu unterdrücken und dadurch die Ausbildung der Autoimmun-

krankheit zu verhindern [64-67]. Aus diesen Befunden kann geschlussfolgert werden,

dass der Funktion von DN T-Zellen eine kritische Bedeutung zum Schutz vor

Diabetes mellitus zukommt. Unsere Daten lassen vermuten, dass die Expansion der

selbstreaktiven T-Zellen bei höheren IL-7 Spiegeln unter Anderem in einem Verlust

der DN T-Zell-Funktionalität begründet sein könnten. In einem autologen Proliferati-

onsassay könnte überprüft werden, inwieweit IL-7 die DN T-Zell-Suppression

gegenüber selbstreaktiven T-Zellen beeinflusst. Für zukünftige therapeutische

Ansätze, die die Immuntoleranz bei Autoimmunerkrankungen erhöhen sollen, könnte

nicht nur der Einsatz von DN T-Zellen, sondern auch eine Inhibition des IL-7

Signales Potential tragen.

4.1.2 Signaltransduktion in den DN T-Zellen

Nachdem unsere Ergebnisse aufzeigten, dass IL-7 die DN T-Zell-vermittelte

Suppression moduliert, wurde durch Blockade bestimmter IL-7 Signaltransduktions-

wege analysiert, inwieweit IL-7 einen direkten Effekt auf die DN T-Zellen ausübt.

Damit die Inhibition des IL-7 Signales spezifisch in den DN T-Zellen und nicht in den

CD4+ T-Zellen erfolgt, wurden die DN T-Zellen mit dem Inhibitor vorbehandelt. Als

erster Versuch erfolgte eine Blockade der IL-7R α-Kette auf DN T-Zellen mit einem

inhibierenden anti-CD127 Antikörper nach der Beschreibung von Heninger et al.

[157]. Dieser Ansatz erwies sich jedoch als problematisch und brachte keine

konsistenten Messdaten hervor. Methodisch könnte dies darin begründet sein, dass

die Bindung des Antikörpers unspezifisch oder nicht langanhaltend stabil an CD127

erfolgt. Zudem konnte nicht ausgeschlossen werden, dass der Antikörper

ausschließlich eine blockierende Wirkung und keine aktivierende oder zytotoxische

Wirkung auf die T-Zellen hat. Weiterhin konnte eine mögliche Interaktion des

92 4 Diskussion

Antikörpers mit den Serumkomponenten im Kulturmedium nicht ausgeschlossen

werden.

Die in dieser Arbeit etablierte Ki-67-Messung ermöglichte eine frühe Bestimmung der

Suppression nach nur zweitätiger Kokultur, wodurch die Problematik einer Abnahme

der Blockade im Laufe der Zeit weitgehend umgangen werden konnte. Die Methode

wurde außerdem dahingehend optimiert, dass statt eine Blockade über Antikörper

chemische Substanzen zur Inhibition verwendet wurden. Diese ausgewählten

Inhibitoren sind durch eine hohe Spezifität sowie definierte Blockadeeigenschaften

charakterisiert, die in diversen Studien bereits erfolgreich nachgewiesen wurden

(siehe Material und Methoden für konkrete Literaturangaben). Mittels einer pan-JAK-

Inhibition konnte dadurch ein aussagekräftiges Ergebnis erzielt werden. Hierbei

führte die Blockade der IL-7 Signaltransduktion in den DN T-Zellen zu einer

vollständigen Aufhebung der IL-7-vermittelten Beeinträchtigung der Suppression. Da

die Literatur darlegt, dass IL-7 über JAK den STAT5 Signalweg aktivieren kann,

wurde zunächst erwartet, dass die STAT5-Inhibition zu einem ähnlichen Ergebnis

wie eine pan-JAK-Inhibition führt. Das STAT5 Signal erwies sich jedoch für den IL-7

Effekt als irrelevant. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass andere Signalmole-

küle, die von JAK aktiviert werden, für die Modulation der Suppression verantwortlich

sind. STAT5 wird zwar durch IL-7 in den DN T-Zellen phosphoryliert, spielt aber

keine Rolle bei der Suppression. Als potentielles Signalmolekül, welches durch JAK

ebenso aktiviert werden kann, kommt PI3K in Frage. Die Kinase PI3K setzt sich aus

unterschiedlichen Untereinheiten zusammen. Die Untereinheit p85 beinhaltet SH2-

Domänen und kann an phosphoryliertes Tyrosin-449 im zytoplasmatischen Teil der

IL-7R α-Kette binden [204, 205]. Dadurch kann IL-7 über JAK die PI3K aktivieren

und weiterhin den Akt Signalweg in T-Zellen anschalten [206]. Wie die Ergebnisse

unserer PhosFlow-Analysen ergaben, wird der Akt Signalweg - vermutlich über

Jak/PI3K - in den DN T-Zellen durch IL-7 amplifiziert. Obwohl in der Literatur auf den

Zusammenhang von JAK/PI3K/Akt im Gegensatz zu JAK/STAT seltener eingegan-

gen wird, zeigte sich in dieser Arbeit, dass dem JAK/PI3K/Akt Signalweg bei der IL-7

Signaltransduktion in die DN T-Zellen eine entscheidendere Bedeutung zukommt.

Wie die Ergebnisse zeigten, konnte die Beeinträchtigung der suppressiven Funktion

93 4 Diskussion

durch die Blockade der PI3K vollständig revidiert werden. In der Literatur wurde

beschrieben, dass IL-7 über STAT5 und PI3K unterschiedliche Funktionen

beeinflussen kann [207]. Während STAT5 beispielsweise für die T-Zell-

Differenzierung notwendig zu sein scheint, zeigte sich für die PI3K eine essentielle

Rolle für das Überleben und die Proliferation von T-Lymphozyten [208]. In CD8+ T-

Zellen zeigte sich, dass STAT5 und PI3K abhängig vom Differenzierungsstatus die

Expression von unterschiedlichen Genen induzieren beziehungsweise kontrollieren

[209]. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Beobachtungen überein. So konnte

ausschließlich PI3K und nicht STAT5 die suppressive Funktion der DN T-Zellen

modulieren.

Neben STAT5 und PI3K/Akt gibt es noch einen weiteren Signalweg über MAPK, der

im Diskurs steht, durch IL-7 aktiviert werden zu können. Verschiedene Studien

zeigten, dass IL-7 die zentralen MAPK p38, Erk und JNK aktivieren und dadurch

unter anderem das T-Zell-Wachstum fördern kann [184, 210, 211]. Weitere

Untersuchungen legten jedoch kontrovers dar, dass IL-7 die Aktivität der MAPK nicht

beeinflusst [207, 212]. Möglicherweise sind nur bestimmte MAPK für spezifische

durch IL-7-modulierbare T-Zell-Funktionen relevant.

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob MAPK an der IL-7-induzierten

Modulation der DN T-Zell-Suppression beteiligt sind. Bei den Blockadeexperimenten

konnte keine Relevanz der MAPK auf die IL-7-vermittelte Modulation der DN T-Zell-

Funktionalität nachgewiesen werden. Zusätzlich zeigte sich, dass weder eine

Blockade von p38, noch von JNK oder Erk eine Auswirkung auf die Funktion von

unbehandelten DN T-Zellen hat. Diese Beobachtung lässt Rückschlüsse auf den

Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression zu, bei dem die MAPK keine

bedeutsame Rolle zu spielen scheinen. Im Gegensatz zu den hier untersuchten DN

T-Zellen wurden bei anderen regulatorischen T-Zellenpopulationen eine Verknüp-

fung des p38 Signalweges mit der suppressiven Funktion beschrieben [213, 214].

Allerdings ist der p38 Signalweg bei diesen regulatorischen T-Zellen vermutlich mit

einem anderen Mechanismus zur Vermittlung der Suppression assoziiert als im Falle

der DN T-Zellen.

94 4 Diskussion

NF-kB ist ein zentraler Transkriptionsfaktor in Lymphozyten und kann durch eine

Reihe von Signalwegen, unter anderem auch von IL-7 sowie von MAPK und PI3K,

angesteuert werden [185, 215]. Unsere Daten weisen darauf hin, dass dieser

Transkriptionsfaktor jedoch an der suppressiven Funktion der DN T-Zellen und deren

Modulation nicht beteiligt ist.

Bei der Analyse des zugrundeliegenden Mechanismus, wie IL-7 die Funktionalität

der DN T-Zellen mindert, konnte in dieser Arbeit ein spezifischer Signalweg

identifiziert werden, der für die Modulation verantwortlich ist. Der Akt/mTOR

Signalweg spielt bei der Regulation von Überleben, Proliferation, Differenzierung und

dem Metabolismus von T-Zellen eine zentrale Rolle [125, 216]. Die Aktivierung des

Signalweges kann in CD4+ und CD8

+ T-Zellen über den TZR und kostimulatorische

Rezeptoren erfolgen [217, 218]. Darüber hinaus können Wachstumsfaktoren wie IL-

7 oder IGF-1 den Signalweg ebenso induzieren [196, 206, 219]. Inwieweit die

Signaltransduktion in den DN T-Zellen ihre Funktionalität steuert, wurde vor dieser

Arbeit weder im murinen noch humanen System untersucht. Unsere Ergebnisse

zeigten, dass die Stimulation des TZR mittels allogenen DZ oder αCD3/28 Beads zu

einer Induktion des Akt/mTOR Signalweges führt und dieses Signal durch IL-7

deutlich amplifiziert wird. Die durchflusszytometrischen Messungen ergaben, dass

IL-7 nicht nur zentrale Signalproteine in den DN T-Zellen verstärkt aktiviert, sondern

auch die Genexpression von Akt/mTOR-regulierten Transkriptionsfaktoren signifikant

ändert. Die Daten der Transkriptomanalyse bestätigten, dass durch IL-7 in den DN

T-Zellen insbesondere der JAK und PI3K/Akt/mTOR Signalweg amplifiziert wird und

andere Signalwege wie die der MAPK nicht oder nur sehr geringfügig beeinflusst

werden. Der starke Einfluss von IL-7 auf den EIF2 (von engl. Eukaryotic Initiation

Factor 2) Signalweg, welcher für die Translationsinitiation verantwortlich ist, lässt auf

Änderungen in der ribosomalen Proteinsynthese schließen.

Der Befund der vollständigen Aufhebung des IL-7 vermittelten Effektes mittels der

Akt/mTOR Blockade unterstützt die These, dass ein Einfluss von IL-7 auf die CD4+

T-Zellen oder auf andere Signalwege in den DN T-Zellen vernachlässigbar ist.

Außerdem lässt sich daraus auf eine kritische Funktion des Akt/mTOR Signalweges

95 4 Diskussion

in DN T-Zellen schließen. Die Daten der Hyperaktivierung des Signalweges mit

Substanzen wie SC-79 anstatt von IL-7, welche ebenso eine Beeinträchtigung der

DN T-Zell-Suppression auslöste, bekräftigen diese Schlussfolgerung.

Die Bedeutsamkeit von Akt/mTOR bei Treg-Zellen wurde bereits in verschiedenen

Studien untersucht. So führte die Hyperaktivierung von Akt zu einem Verlust der

suppressiven Funktion von Treg-Zellen [193, 220]. Eine Deletion des Proteins PTEN,

welches den Akt/mTOR Signalweg spezifisch inhibiert, schränkte die Treg-vermittelte

Suppression gegenüber T-Zellen ebenso stark ein [194]. Das Aktivierungslevel von

Akt/mTOR scheint demnach für die immunregulatorische Funktion von Treg-Zellen

entscheidend zu sein. Nachdem die Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges auch

für die Funktionalität von DN T-Zellen bedeutend ist, könnte vermutet werden, dass

Akt/mTOR grundsätzlich eine wichtige Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des

immunregulatorischen Potentials von T-Zellen hat. Ob der Verlust der immunregula-

torischen Funktion von Treg-Zellen, der durch IL-7 in den bereits erwähnten Studien

beobachtet wurde, wie bei DN T-Zellen mit einer spezifischen Amplifikation des

Akt/mTOR Signalweges zusammenhängt, wäre für folgende Untersuchungen

interessant.

Wie vorangegangene Arbeiten unserer Gruppe zeigten, brauchen DN T-Zellen ein

TZR-Signal, um ihre suppressive Aktivität zu erlangen [81]. Aufgrund von

Beobachtungen an Treg-Zellen liegt die Hypothese nahe, dass das TZR-induzierte

Akt/mTOR Signal in DN T-Zellen fein gesteuert wird. Die Intensität des Akt Signales

hat dabei ausschlaggebenden Einfluss darauf, ob T-Zellen eine regulatorische

Funktion oder vielmehr einen Effektor-Phänotyp bekommen [221, 222]. Verschiede-

ne Studien zeigten, dass eine gemäßigte Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges für

die suppressive Funktion von Treg-Zellen eine Notwendigkeit darstellt [223, 224].

Diese kann dadurch erzielt werden, dass Treg-Zellen spezifische Phosphatasen wie

PTEN und PHLPP1 (von engl. PH domain and Leucine rich repeat Protein

Phosphatase) konstitutiv hoch exprimieren [221, 225]. PTEN gilt als dominierender

negativer Regulator von Akt, dem daher eine zentrale Bedeutung bei der Aufrechter-

haltung der immunologischen Toleranz zukommt [226]. Unsere RNA-

Sequenzierungsdaten zeigten eine durch IL-7 vermittelte Herunterregulation von

96 4 Diskussion

PTEN in DN T-Zellen sowie eine verminderte Expression zahlreicher Zielproteine,

die zufolge der IPA Datenbank durch PTEN reguliert werden. Inwieweit sich die

PTEN-Expression in DN T-Zellen von anderen T-Zellen unterscheidet und dadurch

möglicherweise einen Einfluss auf die Funktionalität der DN T-Zellen ausübt, muss in

zukünftigen Experimenten untersucht werden.

Der Akt/mTOR Signalweg kann in CD4+ T-Zellen die Expression von FoxP3

regulieren [224]. Durch die Aktivierung des Akt Signales wurde eine Schwächung der

transkriptionellen „Signatur“ von Treg-Zellen (nach [227]) beobachtet, die teilweise

auf FoxP3 und teilweise auf unbekannte Faktoren zurückzuführen war [223]. Da sich

DN T-Zellen durch eine fehlende Expression von FoxP3 auszeichnen, müssen

andere Faktoren unterhalb des Akt Signales die Reduktion ihrer suppressiven

Funktion verursachen.

Die zahlreichen Studien, die eine entscheidende Bedeutung des Akt/mTOR

Signalweges bei Treg-Zellen aufzeigten, unterstützen das aus unseren Daten

generierte Modell, dass der Aktivierungszustand des Akt/mTOR Signalweges eine

große Relevanz bei der immunologischen Toleranz haben kann. In der vorliegenden

Arbeit beeinträchtigte die Hyperaktivierung von Akt/mTOR mittels IL-7 und zudem

mittels IGF-1, SC-79 und möglicherweise auch IL-4 die immunregulatorische

Funktion von DN T-Zellen. Das Aktivierungslevel von Akt/mTOR scheint demnach

das suppressive Potential der DN T-Zellen und die Immuntoleranz kritisch zu

beeinflussen. Dieser Befund ist hinsichtlich der therapeutischen Modulation der

Immuntoleranz interessant. Da der Akt/mTOR Signalweg ein zentraler Regulator von

einer Vielzahl an Funktionen von T-Zellen und mit diversen Krankheitsbildern

assoziiert ist, konzentrieren sich unterschiedliche Forschungsarbeiten darauf, wie auf

den Signalweg bestmöglich Einfluss genommen werden kann. Eine Reihe von

spezifischen Inhibitoren dieses Signalweges findet bereits in der Klinik Verwendung.

mTOR-Inhibitoren wie Rapamycin (oder Sirolimus), Everolimus oder Temsirolimus

werden standardmäßig in der Transplantationsmedizin als Immunsuppressiva oder

bei Autoimmunerscheinungen zur Minderung der Inflammation eingesetzt [228]. Zur

Vorbeugung der GvHD kommen diese Inhibitoren auch bei der Konditionierung vor

HSZT zum Einsatz. Bereits über 1000 klinische Studien wurden zur Evaluation

97 4 Diskussion

vielfältiger Therapieoptionen, die allesamt im mTOR Signalweg eingreifen,

durchgeführt [229, 230]. Analog zu mTOR-Inhibitoren werden Akt-Inhibitoren wie

Perifosin, MK-2206 oder GSK-2141795 aufgrund ihrer anti-proliferativen Wirkung im

Besonderen zur Tumortherapie verwendet [231, 232]. Eine Reihe an PI3K-

Inhibitoren finden sich im klinischen Zulassungsprozess, während das bereits

zugelassene Idelalisib zur Behandlung der chronisch lymphatischen Leukämie und

bei B-Zell-Lymphomen eingesetzt wird [233, 234]. Wie Ahmad et al. kürzlich zeigten,

kann eine PI3K Blockade unterschiedliche Auswirkungen auf Effektor T-Zellen und

Treg-Zellen haben, je nachdem welche PI3K Isoform selektiv inhibiert wird [235]. Auf

die Treg-Zellen hatte dabei nur die pharmakologische Inhibition der PI3Kδ, weder

aber der α- oder β-Isoform einen Effekt. Der in der vorliegenden Arbeit ausgewählte

Inhibitor sämtlicher PI3K-Isoformen zeigte, ebenso wie der Akt- oder mTOR-Inhibitor,

einen Effekt auf die DN T-Zellen, indem er die IL-7-vermittelte Beeinträchtigung der

Suppression revidierte. Dieser Befund lässt vermuten, dass die therapeutisch häufig

verwendete pharmakologische Inhibition des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in die

immunregulatorischen Funktion der DN T-Zellen eingreift und dabei möglicherweise

eine beeinträchtige Immuntoleranz verbessern oder wiederherstellen kann. Eine

Hyperaktivierung des Akt/mTOR Signalweges, wie mit dem small molecule SC-79,

hat hingegen das Potential die Immunregulation einzuschränken und somit

proinflammatorische Immunantworten zu fördern. Letztlich verstärken die erhaltenen

Ergebnisse die enorme Relevanz des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation

der Immuntoleranz und zeigen eine neue und selektive Bedeutung dieses

Signalweges für die Funktionalität der DN T-Zellen auf. Je nachdem, ob eine

Stärkung der Immuntoleranz oder der Immunreaktivität durch DN T-Zellen erwünscht

ist, konnten in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Intervention am Akt/mTOR Signalweg

dargelegt werden.

4.1.3 Molekularer Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR

Um den molekularen Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR auf die Funktion der

DN T-Zellen zu charakterisieren, wurde eine Transkriptom-Analyse durchgeführt.

Hierbei konnten 1301 Gene identifiziert werden, die gemittelt über alle Spender

98 4 Diskussion

signifikant differentiell exprimiert wurden. Der Abgleich mit der IPA Datenbank zeigte

einige Proteine auf, die von Akt gesteuert werden und in den IL-7 behandelten DN T-

Zellen signifikant hoch- oder herunterreguliert wurden. Zudem wurden Hinweise dazu

gewonnen, welche Funktionen in den DN T-Zellen aufgrund der Änderungen im

Genexpressionsprofil entscheidend betroffen wurden. Unter Anderem wurden 92

Gene, die mit der Proliferation von T-Lymphozyten assoziiert sind – darunter zum

Beispiel Cyclin E oder p27kip1

– in den IL-7 behandelten DN T-Zellen differenziell

exprimiert. Ebenso wurde die Expression von einer Reihe von Genen, die mit dem

Überleben von T-Zellen zusammenhängen, verändert. Übereinstimmend mit der

Literatur zeigte sich in den DN T-Zellen zum Beispiel die Hochregulation von Bcl-2,

dessen Expression laut anderen Arbeitsgruppen durch IL-7 Signale über den Akt

Signalweg gesteigert wird [98, 202]. Neben dem Einfluss von IL-7 auf die

Homöostase der DN T-Zellen wurden weitere Funktionen wie die Differenzierung, die

Migration oder die Aktivierung moduliert. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit

publizierten Studien zur zellbiologischen Funktion von IL-7 (siehe Kapitel 1.3.1).

In der Literatur wird der Akt/mTOR Signalweg mit einem anergen Phänotyp von T-

Zellen in Verbindung gebracht [236-239]. Der anerge Phänotyp zeichnet sich durch

eine Hyporesponsivität gegenüber stimulatorischen Signalen aus und kann durch die

Inhibition von mTOR induziert werden. Für die Aufrechterhaltung eines anergen

Zustandes bedarf es der Expression von Anergie-induzierenden Faktoren [189, 190,

192]. Die Expression dieser Faktoren kann durch mTOR unterbunden werden [237].

Bei der genaueren Betrachtung der Gene, die durch IL-7 in den DN T-Zellen

differentiell exprimiert wurden, fiel auf, dass eine Reihe von Anergie-assoziierten

Genen herunterreguliert wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Reduktion eines

Anergie-ähnlichen Zustandes der DN T-Zellen hin, der durch IL-7 und Akt/mTOR

Signale möglicherweise aufgeboben werden kann.

Inwieweit DN T-Zellen einen anergen Phänotyp für ihre immunregulatorische

Funktion benötigen, ist bislang unbekannt. In älteren Publikationen konnten Hinweise

auf einen anergen Zustand der DN T-Zellen gefunden werden [240, 241]. Da für

andere regulatorische T-Zell-Populationen eine funktionelle Relevanz von anergen

Eigenschaften aufgezeigt wurde, wäre dies auch für DN T-Zellen denkbar. So stellt

99 4 Diskussion

ein anerger Phänotyp ein Charakteristikum von sowohl Treg-Zellen als auch von Tr1-

Zellen und eine Notwendigkeit für ihre suppressive Aktivität dar [189, 242, 243]. Im

Rahmen weiterer Studien wurde beobachtet, dass anerge Treg-Zellen einen höheren

Schwellenwert zur Aktivierung benötigen und sich durch eine verminderte

Proliferation in Folge von Stimulation auszeichnen [244]. Bestimmte Transkriptions-

faktoren der FoxO-Familie wurden als Anergie-induzierende Faktoren beschrieben,

die für die Funktion von Treg-Zellen relevant sind [245]. FoxO kann den Zellzyklus

aktiv inhibieren und den Metabolismus verändern [246]. Interessanterweise wird

FoxO von Akt/mTOR gehemmt und kann die immunregulatorische Funktion von

Treg-Zellen modulieren [247]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass FoxO in den DN T-

Zellen aufgrund von IL-7 herunterreguliert wird. Eine molekulare Begründung, wie IL-

7 zur Beeinträchtigung der DN T-Zell-Suppression beiträgt, könnte daher in der über

IL-7/Akt/mTOR Signale vermittelte Blockade von FoxO liegen. Diese Schwächung

eines Anergie-ähnlichen Zustandes führt möglicherweise zum Verlust des

suppressiven Potentials der DN T-Zellen.

Ein weiterer zentraler Anergie-induzierender Faktor, der in DN T-Zellen durch IL-7

vermindert exprimiert wurde, ist NFAT. NFAT reguliert diverse Gene, darunter auch

CBL-b, EGR2 und EGR3 [10, 190]. Wie sowohl die Transkriptomanalyse ergab und

die qPCR-Daten bestätigten, wird diese Anergie-assoziierte Signalkaskade in DN T-

Zellen durch IL-7 herunterreguliert. Sowohl CBL-b als auch EGR2 und EGR3 sind

laut anderen Studien in der Lage, bestimmte Immuntoleranz-Mechanismen in T-

Zellen zu modulieren [244, 248]. Die Vermutung, dass diese Faktoren in DN T-Zellen

eine ähnliche Wirkung haben, ist daher naheliegend.

Unser Modell eines Verlustes der suppressiven Funktion von DN T-Zellen aufgrund

eines Bruchs in einem Anergie-ähnlichen Phänotyp wird durch einen interessanten

Befund einer anderen Arbeitsgruppe im Weiteren unterstützt. Dabei zeigte sich, dass

IL-7 den anergen Phänotyp von Treg-Zellen aufheben kann [201]. Die damit

einhergehende Proliferation war bei den Treg-Zellen ebenso mit einer Beeinträchti-

gung ihrer Funktion assoziiert.

Da das IL-7/Akt/mTOR Signal Anergie-induzierende Gene in DN T-Zellen

herunterreguliert, ist zu erwarten, dass die DN T-Zellen eine gesteigerte Aktivierung

100 4 Diskussion

und Proliferation nach Stimulation aufweisen. Die RNA-Sequenzierung zeigte, dass

Gene, welche mit der Zellaktivierung und -teilung assoziiert sind, verstärkt reguliert

wurden. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Messungen konnte auch auf

Proteinebene bestätigt werden, dass Proliferations- und Aktivierungsmarker auf den

DN T-Zellen durch IL-7 signifikant hochreguliert wurden. Die Korrelationen mit dem

suppressiven Potential zeigten darüber hinaus, dass die gesteigerte Aktivierung und

Proliferation einen signifikanten Einfluss auf die Funktion der DN T-Zellen hat. Je

aktivierter die DN T-Zellen waren und umso mehr sie proliferierten, desto geringer

fiel ihre suppressive Aktivität gegenüber den CD4+ Effektor T-Zellen aus. Die

negative Korrelation zwischen der Aktivierung und der Suppression konnte sowohl in

der Kultur mit IL-7 als auch in der Kontroll-MLR beobachtet werden. Dieser Befund

könnte auch für die in vitro-Kulturbedingungen der DN T-Zellen relevant sein.

Nachdem das Aktivierungslevel des Akt/mTOR Signalweges sowie der Aktivierungs-

und Proliferationszustand der DN T-Zellen mit der suppressiven Funktion eng

verknüpft zu sein scheint, sind die Kulturbedingungen sorgfältig zu wählen.

Bedingungen, die zu einer extremen Expansion der DN T-Zellen führen und für

therapeutische Einsätze eventuell angestrebt werden, sollten aufgrund möglicher

Funktionsbeeinträchtigungen achtsam behandelt werden. In vivo ist ebenso zu

beachten, dass das vorliegende Zytokinmilieu einen potentiellen Einfluss auf den

Aktivierungs- und Proliferationszustand und somit auf das immunregulatorische

Potential der DN T-Zellen haben könnte.

In der Literatur weisen viele Untersuchungen darauf hin, dass die Entscheidung

zwischen einem hyporesponsiven anergen oder einem aktivierten und proliferieren-

den Phänotyp von T-Zellen eng mit deren zellulärem Metabolismus verknüpft ist

[249]. Der Glukose-Stoffwechsel von T-Zellen wird von dem Akt/mTOR Signalweg

gesteuert und hat einen beträchtlichen Einfluss auf die Funktionalität von

unterschiedlich differenzierten T-Zellen [250, 251]. Neuere Studien zeigten, dass

mTOR durch die definierte Modulation des Metabolismus insbesondere die Funktion

von Treg-Zellen steuert [252-254]. Im Gegensatz zu Effektor T-Zellen beruht die

Energiegewinnung der Treg-Zellen nicht auf der aeroben Glykolyse sondern auf der

AMPK-vermittelten Fettsäureoxidation [255]. mTOR reguliert zentrale Faktoren im

101 4 Diskussion

Stoffwechsel wie HIF-1α und ist dadurch von großer Bedeutung für die immunregula-

torische Funktion von Treg-Zellen [256-258]. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten,

dass IL-7/Akt/mTOR den wichtigen Transkriptionsfaktor HIF-1α in den DN T-Zellen

hochreguliert und die Proliferation steigert. Es kann daher spekuliert werden, dass

der Glukose-Stoffwechsel in DN T-Zellen durch das IL-7/Akt/mTOR Signal verändert

wird und diese metabolischen Veränderungen die suppressive Funktion modulieren.

Die Untersuchung von metabolischen Vorgängen in DN T-Zellen könnte daher für

die Zukunft von großem Interesse sein.

4.2 Charakterisierung weiterer Modulatoren der DN T-Zell-Suppression

Bei der Entwicklung der GvHD nach allogener HSZT können verschiedene Zytokine

eine wichtige Rolle spielen. Die Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ oder TNF, die auf

das Immunsystem proinflammatorisch wirken, können nach HSZT erhöhte

Serumspiegel aufweisen und Gewebeschäden auslösen, welche die Pathogenese

der GvHD entscheidend fördern [45, 259-261]. Die genannten proinflammatorischen

Zytokine finden daher als spezifische Biomarker der GvHD sowie als therapeutische

Angriffspunkte Verwendung [262-265]. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die

proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ und TNF einen Einfluss auf

die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-Zell-Antworten

ausüben. Dabei zeigte sich keine Modulation der suppressiven Aktivität durch jene

Zytokine. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass DN T-Zellen unter diesen

proinflammatorischen Bedingungen ihre immunregulatorische Funktion beibehalten.

Ob DN T-Zellen die jeweiligen Zytokinrezeptoren exprimieren oder das Signal dieser

Zytokine keine Bedeutung auf die Funktionalität der DN T-Zellen hat, wurde nicht

weiter analysiert. Eine robuste suppressive Funktion der DN T-Zellen trotz

proinflammatorischen Milieus könnte für einen therapeutischen Einsatz der DN T-

Zellen von Vorteil sein.

Abschließend wurde in dieser Arbeit untersucht, inwieweit neben IL-7 andere γc-

Zytokine die DN T-Zell-Suppression modulieren können. Die Familie der γc-Zytokine

ist bekannt dafür, als Überlebens- und Wachstumsfaktor für T-Zellen zu

102 4 Diskussion

fungieren [266]. Wie eine kürzlich veröffentlichte Studie zeigte, spielt diese

Zytokinfamilie daher nach HSZT eine wichtige Rolle [267]. Eine Blockade der IL-7R

γc-Kette konnte dabei die GvHD mildern. Es besteht die Möglichkeit, dass diese

GvHD-Minderung vor allem auf der Inhibition der IL-7 Effekte beruht. Des Weiteren

könnte die CD132-Blockade auch das Signaling von IL-2, IL-15 und/oder IL-21

unterbinden. Ähnlich zu IL-7 wurde auch für diese drei Zytokine beschrieben, dass

deren Serumspiegel mit dem Auftreten einer GvHD assoziiert sein kann [165, 268-

271]. Da sich alle γc-Zytokine ähnliche Signaltransduktionswege teilen, hätte erwartet

werden können, dass auch diese Zytokine zu einer Beeinträchtigung der DN T-Zell-

vermittelten Suppression führen. Interessanterweise ergaben unsere Versuche

jedoch, dass weder IL-9 noch IL-15 oder IL-21 die Suppression vermindert. IL-2

wurde nicht untersucht, nachdem unsere Arbeitsgruppe 2011 bereits zeigte, dass die

Anwesenheit von IL-2 die Funktionalität der DN T-Zellen nicht beeinflusst [81]. Der

Befund, dass die Suppression der DN T-Zellen nur spezifisch durch IL-7 und nicht

durch alle anderen γc-Zytokine moduliert werden kann, ist aus mehrerlei Gesichts-

punkten interessant. Zunächst weisen die Ergebnisse darauf hin, dass IL-7 und den

anderen γc-Zytokinen unterschiedliche Funktionen bei der Regulation von

Immuntoleranz zukommen. Dass γc-Zytokine trotz ihrer teils überschneidenden

Funktion auch jeweils einzigartige biologische Effekte vermitteln können, konnten

andere Studien ebenso aufzeigen (zusammengefasst in [272, 273]). So können IL-2,

IL-7 und IL-15 durch opponierende Wirkung auf verschiedene Lymphozyten-

Populationen Immunantworten unterschiedlich regulieren. Während beispielsweise

ausschließlich IL-2 für die Homöostase von Treg-Zellen benötigt wird, spielt IL-15

eine einzigartige Rolle bei der Gedächtnisausbildung von T-Zellen [272]. Obwohl

sämtliche γc-Zytokinrezeptoren die Induktion des Signales über JAK1 und JAK3 zu

initiieren scheinen, müssen gewisse Unterschiede in der jeweiligen Signalkaskade

demnach für eine Regulation der verschiedenen biologischen Effekte verantwortlich

sein. Eine Möglichkeit, wie die Signaltransduktion feingesteuert werden kann, liegt in

der spezifischen Zusammensetzung aus unterschiedlichen Untereinheiten eines

jeden Rezeptors. Die spezifischen γc-Zytokinrezeptor-Untereinheiten werden

womöglich auf den T-Zellen differentiell exprimiert. Dadurch können letztendlich

entscheidende Unterschiede in der Dichte der jeweiligen Rezeptorexpression auf der

103 4 Diskussion

Zelloberfläche resultieren. Differenzen in der Signalweiterleitung können sich auch

aus verschiedenen Signalstärken ergeben, die je nach Bindungsaffinität eines γc-

Zytokins mit seinem Rezeptor oder der Rezeptorkomponenten untereinander und

zudem je nach Bindungsdauer und -kinetik abweichen [274]. Diese Bindungseigen-

schaften können damit über die Aktivierung von Signalmolekülen entscheiden [275-

277]. Nur der IL-7R weist die α-Kette CD127 auf. Es wurde gezeigt, dass die PI3K

direkt an CD127 binden kann [204]. Möglicherweise kann IL-7 auch dadurch den

Akt/mTOR Signalweg in besonderer Weise in den DN T-Zellen aktivieren. Aus

unseren Daten kann geschlossen werden, dass IL-7 den Akt Signalweg in den DN T-

Zellen funktionell entscheidend modifiziert. IL-2, IL-9, IL-15 und IL-21 aktivieren den

Akt Signalweg in den DN T-Zellen möglicherweise ebenso, jedoch entweder nicht

über ein gewisses kritisches Aktivierungslevel oder unter Beteiligung anderer

Faktoren, die letztlich im Zusammenspiel für die suppressive Funktion der DN T-

Zellen nicht relevant sind.

Im Gegensatz zu IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 scheint IL-4 eine untergeordnete Rolle

nach HSZT zu spielen. Eine Assoziation von IL-4 Spiegeln und einer GvHD-

Entwicklung ist nicht beschrieben worden. Vereinzelte Studien geben einen Hinweis

darauf, dass eine Verschiebung eines T-Helfer-Zellen Typ 1 Phänotyps zu einem T-

Helfer-Zelltyp 2, welche unter anderem die Zytokine IL-4 und IL-10 sezernieren, von

Vorteil sein könnte [260, 268, 278]. Studien an spezifischen Autoimmunerkrankun-

gen konnten zeigen, dass IL-4 sowohl antientzündliche (im Beispiel von Psoriasis)

als aber auch proinflammatorische Effekte (im Beispiel von Diabetes) ausüben kann

[279-281]. IL-4 kann von aktivierten CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 2 sowie von einigen

Zellen des angeboren Immunsystems, zum Beispiel von Mastzellen, produziert

werden [282]. Unsere Ergebnisse ergaben, dass IL-4 die DN T-Zell-vermittelte

Suppression gegenüber allogenen T-Zell-Antworten beeinträchtigt. Eine Aufklärung

des zugrunde liegenden Mechanismus steht noch aus. Es wäre möglich, dass der

Verlust der Suppression eine andere Ursache als der IL-7-vermittelte Signalweg hat.

Pace et al. zeigten, dass IL-4 in CD4+ T-Zellen Resistenz gegenüber der Suppressi-

on von Treg-Zellen induzieren können [283]. Die in dieser Arbeit durchgeführten

Versuche mit IL-7 sollten daher wiederholt werden, um aufzuklären, ob IL-4 eine

104 4 Diskussion

entscheidende Wirkung auf die CD4+ T-Zellen hat. Im Gegensatz zu IL-7 transdu-

ziert IL-4 Signale über STAT6 in die Zelle, wodurch IL-4 ein verändertes Genexpres-

sionsmuster als IL-7 in den CD4+ und DN T-Zellen hervorrufen dürfte. Falls IL-4 eine

direkte Modulation der suppressiven Funktion der DN T-Zellen bewirkt, wäre

interessant, inwieweit diese über ähnliche Signalwege und Transkriptionsregulatoren

verläuft. Da IL-4 den Akt/mTOR Signalweg aktivieren und beispielsweise die

Proliferation von Treg-Zellen steigern kann, könnte auch vermutet werden, dass IL-4

und IL-7 die Funktionalität der DN T-Zellen durch einen ähnlichen molekularen

Mechanismus vermindern [284, 285]. Falls der Akt/mTOR Signalweg sich wiederum

als spezifischer kritischer Signalweg herausstellen sollte, wäre zu untersuchen,

welche zentrale Regulatoren, wie zum Beispiel Anergie-assoziierte Proteine sowohl

durch IL-7 als auch durch IL-4 in DN T-Zellen entscheidend verändert werden und

für die suppressive Funktion der DN T-Zellen große Relevanz haben.

4.3 Zusammenfassung und Ausblick

Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass murine und humane DN T-Zellen

Immunantworten effektiv supprimieren können und dadurch eine wichtige Rolle bei

der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz spielen. So wurde beschrieben, dass DN

T-Zellen allogene CD4+ und CD8

+ T-Zell-Antworten spezifisch unterdrücken und

dadurch die Entwicklung einer GvHD nach allogener HSZT verhindern können. Ziel

dieser Arbeit war es aufzuklären, ob die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression

gegenüber allogenen T-Zell-Antworten moduliert werden kann. Als Modulatoren

wurden Zytokine untersucht, die nach HSZT hohe Serumspiegel zeigen und/oder mit

der Pathogenese der GvHD assoziiert sind. Insbesondere IL-7 war aufgrund

beschriebener Korrelationen mit der GvHD und der Bedeutung auf andere

immunregulatorische T-Zellen von Interesse. In dieser Arbeit konnte IL-7 als potenter

Modulator der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen identifiziert werden. IL-7

induzierte sowohl in die CD4+ als auch in die DN T-Zellen ein Signal, welches die

Viabilität der Zellen allerdings nicht bedeutsam beeinflusste. Wie Blockadeexperi-

mente von zentralen Signalwegen ergaben, führt IL-7 zu einem direkten Verlust der

Funktionalität in DN T-Zellen, indem spezifisch der Akt/mTOR Signalweg amplifiziert

105 4 Diskussion

wird. In weiteren Analysen konnte nachgewiesen werden, dass IL-7 die Proliferation

und Aktivierung der DN T-Zellen steigert und dieser Phänotyp negativ mit der

suppressiven Aktivität der DN T-Zellen korreliert. Die gesteigerte Proliferation und

Aktivierung der DN T-Zellen scheint mit einem Verlust der Expression Anergie-

assoziierter Gene einherzugehen. Für nachfolgende Studien wäre die Beantwortung

der Frage interessant, ob und inwieweit in DN T-Zellen ein Anergie-ähnlicher

Zustand für die Vermittlung der suppressiven Funktion benötigt wird. Potentielle

Kandidaten, die diesen Phänotyp beeinflussen können, wurden in dieser Arbeit

aufgezeigt und könnten in zukünftigen Experimenten noch detaillierter auf ihre

jeweilige Bedeutung hin charakterisiert werden. Möglicherweise ließen sich innerhalb

der durch IL-7/Akt/mTOR veränderten Genexpression auch weitere Proteine finden,

die an der Suppression beteiligt sind. Regulatoren des Stoffwechsels könnten dabei

insbesondere von Relevanz sein, nachdem zahlreiche neue Studien beschrieben,

dass metabolische Vorgänge maßgeblich über T-Zell-Funktionen entscheiden

können.

Aus dieser Arbeit kann festgehalten werden, dass der IL-7 und der Akt/mTOR

Signalweg die immunregulatorische Funktion der humanen DN T-Zellen gegenüber

allogenen CD4+ T-Zell-Antworten wesentlich beeinflusst. Eine Übertragung dieses

Befundes auf autologe sowie auf CD8+

T-Zell-Antworten wäre denkbar und sollte in

Zukunft noch untersucht werden. Ob humane DN T-Zellen wie murine DN T-Zellen

auch andere Zellen wie NK- und B-Zellen supprimieren und ob IL-7 und der

Akt/mTOR Signalweg darauf Einfluss nehmen, bleibt ebenso aufzuklären. Die

Bedeutung des Akt/mTOR Signalweges zeigte sich nicht nur durch dessen

Blockade, mit der eine vollständige Revision des IL-7 Effektes erzielt wurde, sondern

auch durch die pharmakologische Hyperaktivierung, welche das suppressive

Potential der DN T-Zellen einschränkte. Eine therapeutische Modulation des IL-7

oder des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen könnte daher für eine Regulation

der Immuntoleranz von zentraler Bedeutung sein. Wenn der Mechanismus der

Beeinträchtigung der Suppression durch IL-4 aufgeklärt ist, kann zukünftig eventuell

auch im IL-4 Signalweg eine weitere Möglichkeit nachgewiesen werden, wie die

Funktionalität der DN T-Zellen reguliert werden kann.

106 4 Diskussion

Das suppressive Potential der DN T-Zellen zeigte sich dagegen als unempfindsam

gegenüber einer Reihe von proinflammatorischen Zytokinen. Die suppressive

Aktivität scheint nur durch ganz spezifische Signalwege überkommen zu werden.

Eine weitere Charakterisierung der Rolle dieser Signalwege für DN T-Zellen in in vivo

Modellen und klinischen Untersuchungen würde die Relevanz der hier gewonnenen

Erkenntnisse noch erweitern. Eine Reduktion des IL-7 oder Akt/mTOR Signales bei

Patienten nach HSZT kann womöglich die erwünschte suppressive Aktivität der DN

T-Zellen zur Vermeidung der GvHD verbessern. Ebenso mag die Immuntoleranz bei

anderen autoimmunen oder malignen Erkrankungen dadurch therapeutisch

gesteigert oder vermindert werden. Weitere Charakterisierungen der Modulation und

des Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression unterstützen das

langfristige Ziel, DN T-Zellen als neuartige Zelltherapie gegen Immunerkrankungen

wie der GvHD einzusetzen.

107 5 Verzeichnisse

5 Verzeichnisse

5.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Pathophysiologie der akuten GvHD. ............................................ 13

Abbildung 1-2: Mechanismus der murinen DN T-Zell-vermittelten Suppression ................................................................................. 20

Abbildung 1-3: IL-7 Signaltransduktion für die T-Zell-Homöostase ...................... 24

Abbildung 3-1: Messung von CFSE in CD4+ T-Zellen an Tag 5 der MLR zur

Bestimmung der suppressiven Aktivität von DN T-Zellen.. .......... 48

Abbildung 3-2: Vergleich der Proliferation von konventionellen CD4+ T-

Zellen nach Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads ........................................................................................... 49

Abbildung 3-3: Messung von Zellzyklusmarkern in CD4+ T-Zellen an Tag 2

der MLR ....................................................................................... 51

Abbildung 3-4: Expression des IL-7 Rezeptors auf humanen T-Zellpopulationen ........................................................................... 52

Abbildung 3-5: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in CD4+ T-Zellen. ............ 54

Abbildung 3-6: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in DN T-Zellen ................ 55

Abbildung 3-7: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Proliferation von konventionellen CD4

+ T-Zellen ................... 57

Abbildung 3-8: Titration der modulatorischen Aktivität von IL-7 auf DN T-Zellen ........................................................................................... 58

Abbildung 3-9: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Aktivierung von CD4

+ T-Zellen ............................................... 59

Abbildung 3-10: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von CD4+ T-Zellen in der

MLR ............................................................................................. 61

Abbildung 3-11: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von DN T-Zellen in der MLR. ............................................................................................ 62

Abbildung 3-12: Blockade der JAK-abhängigen Signaltransduktion in DN T-Zellen ........................................................................................... 63

Abbildung 3-13: Blockade der STAT5 Signaltransduktion in DN T-Zellen ............. 64

108 5 Verzeichnisse

Abbildung 3-14: Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen durch IL-7 ..................................................................................... 65

Abbildung 3-15: Hochregulation von Akt-kontrollierten Transkriptionsfaktoren in DN T-Zellen durch IL-7 ............................................................. 66

Abbildung 3-16: Blockade des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen........ 67

Abbildung 3-17: Blockade der MAPK Signalwege in DN T-Zellen. ........................ 68

Abbildung 3-18: Blockade des NF-κB Signalweges in DN T-Zellen ....................... 69

Abbildung 3-19: Schema der RNA Sequenzierung von DN T-Zellen ..................... 70

Abbildung 3-20: Differentielle Expression von IL-7 behandelten gegenüber unbehandelten DN T-Zellen ......................................................... 71

Abbildung 3-21: Zuordnung der differentiell exprimierten Gene zu kanonischen Signalwegen mit IPA Software………………. ......... 72

Abbildung 3-22: Annotation des Akt Signalweges als „Top upstream regulator network“. ...................................................................................... 73

Abbildung 3-23: Einordnung der differentiell exprimierten Gene zu funktionellen Gruppen. ................................................................. 74

Abbildung 3-24: Differentielle Expression signifikanter Gene, die mit Aktivierung, Proliferation, Homöostase, Anergie und suppressiver Funktion assoziiert sind .......................................... 75

Abbildung 3-25: Verifizierung der Expression Anergie-assoziierter Gene in DN T-Zellen. ................................................................................. 76

Abbildung 3-26: Verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen durch IL-7 ..................................................................................... 78

Abbildung 3-27: Korrelation von Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen mit deren suppressiven Funktion ................................................. 80

Abbildung 3-28: Schematisches Modell der IL-7 vermittelten Modulation der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen ............................... 81

Abbildung 3-29: Akt-Hyperaktivierung in DN T-Zellen ............................................ 83

Abbildung 3-30: Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression ............................................................... 84

Abbildung 3-31: Einfluss von y-Ketten-Zytokinen auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression ................................................................................. 85

109 5 Verzeichnisse

5.2 Literaturverzeichnis

1. Murphy, K., P. Travers, and M. Walport, Janeway's Immunobiology. 2008.

2. Abbas, A.K., A.H. Lichtman, and S. Pillai, Cellular and molecular immunology. 2010. 6th edition.

3. Appay, V., et al., Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: consensus and issues. Cytometry A, 2008. 73(11): p. 975-83.

4. Deborah, A.L., C.G. Marielle, and M.L. David, Views of immunology: effector T cells. Immunological Reviews, 2011. 240(1): p. 25-39.

5. Neefjes, J., et al., Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation. Nat Rev Immunol, 2011. 11(12): p. 823-36.

6. Medawar, P.B., Immunity to homologous grafted skin; the suppression of cell division in grafts transplanted to immunized animals. Br J Exp Pathol, 1946. 27: p. 9-14.

7. Burnet, F.M., The clonal selection theory of acquired immunity. Cambridge University Press, 1959.

8. Hogquist, K.A., T.A. Baldwin, and S.C. Jameson, Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat Rev Immunol, 2005. 5(10): p. 772-82.

9. Xing, Y. and K.A. Hogquist, T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012. 4(6).

10. Nurieva, R.I., X. Liu, and C. Dong, Molecular mechanisms of T-cell tolerance. Immunological Reviews, 2011. 241(1): p. 133-144.

11. Green, D.R., N. Droin, and M. Pinkoski, Activation-induced cell death in T cells. Immunol Rev, 2003. 193: p. 70-81.

12. Takahashi, T., et al., Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells: induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state. Int Immunol, 1998. 10(12): p. 1969-80.

13. Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi, Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science, 2003. 299(5609): p. 1057-61.

14. Sakaguchi, S., Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol, 2005. 6(4): p. 345-52.

110 5 Verzeichnisse

15. Baecher-Allan, C., et al., CD4+CD25high Regulatory Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology, 2001. 167(3): p. 1245-1253.

16. Sakaguchi, S., Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol, 2004. 22: p. 531-62.

17. Sakaguchi, S., et al., Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol Rev, 2006. 212: p. 8-27.

18. Sakaguchi, S., et al., Immunologic tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance. Immunol Rev, 2001. 182: p. 18-32.

19. Wing, K. and S. Sakaguchi, Regulatory T cells exert checks and balances on self tolerance and autoimmunity. Nat Immunol, 2010. 11(1): p. 7-13.

20. Shevach, E.M., Regulatory T cells in autoimmmunity*. Annu Rev Immunol, 2000. 18: p. 423-49.

21. Wildin, R.S., et al., X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy. Nat Genet, 2001. 27(1): p. 18-20.

22. Bennett, C.L., et al., The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet, 2001. 27(1): p. 20-1.

23. Baecher-Allan, C. and D.A. Hafler, Suppressor T cells in human diseases. J Exp Med, 2004. 200(3): p. 273-6.

24. Baecher-Allan, C. and D.E. Anderson, Regulatory cells and human cancer. Semin Cancer Biol, 2006. 16(2): p. 98-105.

25. Wood, K.J. and S. Sakaguchi, Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat Rev Immunol, 2003. 3(3): p. 199-210.

26. Pellerin, L., et al., Regulatory T cells and their roles in immune dysregulation and allergy. Immunol Res, 2014. 58(2-3): p. 358-68.

27. Roncarolo, M.G., et al., Type 1 T regulatory cells. Immunol Rev, 2001. 182: p. 68-79.

28. Levings, M.K. and M.G. Roncarolo, T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD4 T cells with immunoregulatory properties. J Allergy Clin Immunol, 2000. 106(1 Pt 2): p. S109-12.

111 5 Verzeichnisse

29. Fantini, M.C., et al., Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5149-53.

30. Weiner, H.L., Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-beta-secreting regulatory cells. Microbes Infect, 2001. 3(11): p. 947-54.

31. Ciubotariu, R., et al., Specific suppression of human CD4+ Th cell responses to pig MHC antigens by CD8+CD28- regulatory T cells. J Immunol, 1998. 161(10): p. 5193-202.

32. Jiang, H., The Qa-1 dependent CD8+ T cell mediated regulatory pathway. Cell Mol Immunol, 2005. 2(3): p. 161-7.

33. Liu, Y., et al., Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol, 2014. 6(1): p. 81-92.

34. Peter, H.-H., W.J. Pichler, and U. Müller-Ladner, Klinische Immunologie. Elsevier, 2012. 3. Auflage.

35. Kolb, H.-J., Graft-versus-leukemia effects of transplantation and donor lymphocytes. Vol. 112. 2008. 4371-4383.

36. Porter, D.L. and J.H. Antin, The graft-versus-leukemia effects of allogeneic cell therapy. Annu Rev Med, 1999. 50: p. 369-86.

37. Suchin, E.J., et al., Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol, 2001. 166(2): p. 973-81.

38. Sherman, L.A. and S. Chattopadhyay, The molecular basis of allorecognition. Annu Rev Immunol, 1993. 11: p. 385-402.

39. Gould, D.S. and H. Auchincloss, Jr., Direct and indirect recognition: the role of MHC antigens in graft rejection. Immunol Today, 1999. 20(2): p. 77-82.

40. Barth, R., et al., Strong and weak histocompatibility gene differences in mice and their role in the rejection of homografts of tumors and skin. Ann Surg, 1956. 144(2): p. 198-204.

41. Goulmy, E., et al., Mismatches of minor histocompatibility antigens between HLA-identical donors and recipients and the development of graft-versus-host disease after bone marrow transplantation. N Engl J Med, 1996. 334(5): p. 281-5.

42. Kekre, N. and J.H. Antin, Hematopoietic stem cell transplantation donor sources in the 21st century: choosing the ideal donor when a perfect match does not exist. Blood, 2014. 124(3): p. 334-43.

112 5 Verzeichnisse

43. Hill, G.R. and J.L. Ferrara, The primacy of the gastrointestinal tract as a target organ of acute graft-versus-host disease: rationale for the use of cytokine shields in allogeneic bone marrow transplantation. Blood, 2000. 95(9): p. 2754-9.

44. Böld, T., Immunregulation durch adoptiven Transfer humaner CD4+CD25+ regulatorischer T-Zelln im xenogenen GvHD-Modell. UK Regensburg, 2009.

45. Ferrara, J.L., et al., Graft-versus-host disease. Lancet, 2009. 373(9674): p. 1550-61.

46. Markey, K.A., K.P. MacDonald, and G.R. Hill, The biology of graft-versus-host disease: experimental systems instructing clinical practice. Blood, 2014. 124(3): p. 354-62.

47. Pasquini, M., et al., 2013 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clin Transpl, 2013: p. 187-97.

48. Gooley, T.A., et al., Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine, 2010. 363(22): p. 2091-2101.

49. Rhen, T. and J.A. Cidlowski, Antiinflammatory Action of Glucocorticoids — New Mechanisms for Old Drugs. New England Journal of Medicine, 2005. 353(16): p. 1711-1723.

50. Garnett, C., J.F. Apperley, and J. Pavlu, Treatment and management of graft-versus-host disease: improving response and survival. Ther Adv Hematol, 2013. 4(6): p. 366-78.

51. Blazar, B.R., W.J. Murphy, and M. Abedi, Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nat Rev Immunol, 2012. 12(6): p. 443-58.

52. Hoffmann, P. and M. Edinger, CD4+CD25+ regulatory T cells and graft-versus-host disease. Semin Hematol, 2006. 43(1): p. 62-9.

53. Waldmann, H., et al., Harnessing FOXP3+ regulatory T cells for transplantation tolerance. J Clin Invest, 2014. 124(4): p. 1439-45.

54. Reimann, J., Double-negative (CD4-CD8-), TCR alpha beta-expressing, peripheral T cells. Scand J Immunol, 1991. 34(6): p. 679-88.

55. Zhang, Z.X., et al., Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med, 2000. 6(7): p. 782-9.

113 5 Verzeichnisse

56. Fischer, K., et al., Isolation and characterization of human antigen-specific TCR alpha beta+ CD4(-)CD8- double-negative regulatory T cells. Blood, 2005. 105(7): p. 2828-35.

57. Renauer, P.A., P. Coit, and A.H. Sawalha, The DNA methylation signature of human TCRalphabeta+CD4-CD8- double negative T cells reveals CG demethylation and a unique epigenetic architecture permissive to a broad stimulatory immune response. Clin Immunol, 2015. 156(1): p. 19-27.

58. Sallusto, F., et al., Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature, 1999. 401(6754): p. 708-712.

59. Lee, B.P., et al., Expression profiling of murine double-negative regulatory T cells suggest mechanisms for prolonged cardiac allograft survival. J Immunol, 2005. 174(8): p. 4535-44.

60. Crispin, J.C., et al., Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol, 2008. 181(12): p. 8761-6.

61. Cowley, S.C., et al., Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. J Immunol, 2010. 184(10): p. 5791-801.

62. Riol-Blanco, L., et al., IL-23 receptor regulates unconventional IL-17-producing T cells that control bacterial infections. J Immunol, 2010. 184(4): p. 1710-20.

63. Strober, S., et al., Cloned natural suppressor cell lines express the CD3+CD4-CD8- surface phenotype and the alpha, beta heterodimer of the T cell antigen receptor. J Immunol, 1989. 143(4): p. 1118-22.

64. Ford, M.S., et al., Peptide-activated double-negative T cells can prevent autoimmune type-1 diabetes development. Eur J Immunol, 2007. 37(8): p. 2234-41.

65. Duncan, B., et al., Double negative (CD3+ 4- 8-) TCR alphabeta splenic cells from young NOD mice provide long-lasting protection against type 1 diabetes. PLoS One, 2010. 5(7): p. e11427.

66. Collin, R., et al., The mouse idd2 locus is linked to the proportion of immunoregulatory double-negative T cells, a trait associated with autoimmune diabetes resistance. J Immunol, 2014. 193(7): p. 3503-12.

67. Zhang, D., et al., Adoptive cell therapy using antigen-specific CD4(-)CD8(-)T regulatory cells to prevent autoimmune diabetes and promote islet allograft survival in NOD mice. Diabetologia, 2011. 54(8): p. 2082-92.

114 5 Verzeichnisse

68. Theofilopoulos, A.N., et al., Molecular genetics of murine lupus models. Adv Immunol, 1989. 46: p. 61-109.

69. Sneller, M.C., et al., A novel lymphoproliferative/autoimmune syndrome resembling murine lpr/gld disease. J Clin Invest, 1992. 90(2): p. 334-41.

70. Ford, M.S., et al., The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med, 2002. 196(2): p. 261-7.

71. Juvet, S.C., et al., FcRgamma controls the fas-dependent regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells. PLoS One, 2013. 8(6): p. e65253.

72. Anand, A., et al., Characterization of CD3+ CD4- CD8- (double negative) T cells in patients with systemic lupus erythematosus: activation markers. Lupus, 2002. 11(8): p. 493-500.

73. Le Deist, F., et al., Clinical, immunological, and pathological consequences of Fas-deficient conditions. Lancet, 1996. 348(9029): p. 719-23.

74. Rieux-Laucat, F., et al., Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science, 1995. 268(5215): p. 1347-9.

75. Chen, W., et al., Role of double-negative regulatory T cells in long-term cardiac xenograft survival. J Immunol, 2003. 170(4): p. 1846-53.

76. Chen, W., et al., Donor lymphocyte infusion induces long-term donor-specific cardiac xenograft survival through activation of recipient double-negative regulatory T cells. J Immunol, 2005. 175(5): p. 3409-16.

77. Young, K.J., et al., Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol, 2003. 171(1): p. 134-41.

78. He, K.M., et al., Donor double-negative Treg promote allogeneic mixed chimerism and tolerance. Eur J Immunol, 2007. 37(12): p. 3455-66.

79. Su, Y., et al., Double negative Treg cells promote nonmyeloablative bone marrow chimerism by inducing T-cell clonal deletion and suppressing NK cell function. Eur J Immunol, 2012. 42(5): p. 1216-25.

80. Miyagawa, F., et al., Identification of CD3+CD4-CD8- T cells as potential regulatory cells in an experimental murine model of graft-versus-host skin disease (GVHD). J Invest Dermatol, 2013. 133(11): p. 2538-45.

81. Voelkl, S., R. Gary, and A. Mackensen, Characterization of the immunoregulatory function of human TCR-alphabeta+ CD4- CD8- double-negative T cells. Eur J Immunol, 2011. 41(3): p. 739-48.

115 5 Verzeichnisse

82. McIver, Z., et al., Double-negative regulatory T cells induce allotolerance when expanded after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. Br J Haematol, 2008. 141(2): p. 170-8.

83. Ye, H., et al., Characterization of CD3+CD4-CD8- (double negative) T cells reconstitution in patients following hematopoietic stem-cell transplantation. Transpl Immunol, 2011. 25(4): p. 180-6.

84. Young, K.J., et al., CD4(-)CD8(-) regulatory T cells implicated in preventing graft-versus-host and promoting graft-versus-leukemia responses. Transplant Proc, 2001. 33(1-2): p. 1762-3.

85. Young, K.J., et al., Antitumor activity mediated by double-negative T cells. Cancer Res, 2003. 63(22): p. 8014-21.

86. Merims, S., et al., Anti-leukemia effect of ex vivo expanded DNT cells from AML patients: a potential novel autologous T-cell adoptive immunotherapy. Leukemia, 2011. 25(9): p. 1415-22.

87. Voelkl, S., et al., Characterization of MHC class-I restricted TCRalphabeta+ CD4- CD8- double negative T cells recognizing the gp100 antigen from a melanoma patient after gp100 vaccination. Cancer Immunol Immunother, 2009. 58(5): p. 709-18.

88. Nakayama, M., Antigen Presentation by MHC-Dressed Cells. Front Immunol, 2014. 5: p. 672.

89. Ford McIntyre, M.S., et al., Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol, 2008. 181(4): p. 2271-5.

90. Zhang, Z.X., et al., Double-negative T cells, activated by xenoantigen, lyse autologous B and T cells using a perforin/granzyme-dependent, Fas-Fas ligand-independent pathway. J Immunol, 2006. 177(10): p. 6920-9.

91. Zhang, Z.X., W.L. Stanford, and L. Zhang, Ly-6A is critical for the function of double negative regulatory T cells. Eur J Immunol, 2002. 32(6): p. 1584-92.

92. Marra, L.E., et al., IL-10 induces regulatory T cell apoptosis by up-regulation of the membrane form of TNF-alpha. J Immunol, 2004. 172(2): p. 1028-35.

93. Gao, J.F., et al., Regulation of antigen-expressing dendritic cells by double negative regulatory T cells. Eur J Immunol, 2011. 41(9): p. 2699-708.

94. Hillhouse, E.E. and S. Lesage, A comprehensive review of the phenotype and function of antigen-specific immunoregulatory double negative T cells. J Autoimmun, 2013. 40: p. 58-65.

116 5 Verzeichnisse

95. Goodwin, R.G., et al., Human interleukin 7: molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(1): p. 302-6.

96. Capitini, C.M., A.A. Chisti, and C.L. Mackall, Modulating T-cell homeostasis with IL-7: preclinical and clinical studies. J Intern Med, 2009. 266(2): p. 141-53.

97. Guimond, M., et al., Interleukin 7 signaling in dendritic cells regulates the homeostatic proliferation and niche size of CD4+ T cells. Nat Immunol, 2009. 10(2): p. 149-57.

98. Rochman, Y., R. Spolski, and W.J. Leonard, New insights into the regulation of T cells by gamma(c) family cytokines. Nat Rev Immunol, 2009. 9(7): p. 480-90.

99. Goodwin, R.G., et al., Cloning of the human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell, 1990. 60(6): p. 941-51.

100. Mazzucchelli, R. and S.K. Durum, Interleukin-7 receptor expression: intelligent design. Nat Rev Immunol, 2007. 7(2): p. 144-54.

101. Fry, T.J. and C.L. Mackall, Interleukin-7: from bench to clinic. Blood, 2002. 99(11): p. 3892-904.

102. Seddiki, N., et al., Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med, 2006. 203(7): p. 1693-700.

103. Liu, W., et al., CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med, 2006. 203(7): p. 1701-11.

104. Puel, A., et al., Defective IL7R expression in T(-)B(+)NK(+) severe combined immunodeficiency. Nat Genet, 1998. 20(4): p. 394-7.

105. Cunningham-Rundles, C. and P.P. Ponda, Molecular defects in T- and B-cell primary immunodeficiency diseases. Nat Rev Immunol, 2005. 5(11): p. 880-92.

106. Bertolino, E., et al., Regulation of interleukin 7-dependent immunoglobulin heavy-chain variable gene rearrangements by transcription factor STAT5. Nat Immunol, 2005. 6(8): p. 836-43.

107. Kikuchi, K., et al., IL-7 receptor signaling is necessary for stage transition in adult B cell development through up-regulation of EBF. J Exp Med, 2005. 201(8): p. 1197-203.

117 5 Verzeichnisse

108. Corcoran, A.E., et al., Impaired immunoglobulin gene rearrangement in mice lacking the IL-7 receptor. Nature, 1998. 391(6670): p. 904-7.

109. Johnson, K., et al., Regulation of immunoglobulin light-chain recombination by the transcription factor IRF-4 and the attenuation of interleukin-7 signaling. Immunity, 2008. 28(3): p. 335-45.

110. Akashi, K., et al., Bcl-2 rescues T lymphopoiesis in interleukin-7 receptor-deficient mice. Cell, 1997. 89(7): p. 1033-41.

111. Trigueros, C., et al., Pre-TCR signaling regulates IL-7 receptor alpha expression promoting thymocyte survival at the transition from the double-negative to double-positive stage. Eur J Immunol, 2003. 33(7): p. 1968-77.

112. Muegge, K., M.P. Vila, and S.K. Durum, Interleukin-7: a cofactor for V(D)J rearrangement of the T cell receptor beta gene. Science, 1993. 261(5117): p. 93-5.

113. Schlissel, M.S., S.D. Durum, and K. Muegge, The interleukin 7 receptor is required for T cell receptor gamma locus accessibility to the V(D)J recombinase. J Exp Med, 2000. 191(6): p. 1045-50.

114. Tan, J.T., et al., IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(15): p. 8732-7.

115. Vivien, L., C. Benoist, and D. Mathis, T lymphocytes need IL-7 but not IL-4 or IL-6 to survive in vivo. Int Immunol, 2001. 13(6): p. 763-8.

116. Schluns, K.S., et al., Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol, 2000. 1(5): p. 426-32.

117. Xue, H.H., et al., IL-2 negatively regulates IL-7 receptor alpha chain expression in activated T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(21): p. 13759-64.

118. Li, J., G. Huston, and S.L. Swain, IL-7 promotes the transition of CD4 effectors to persistent memory cells. J Exp Med, 2003. 198(12): p. 1807-15.

119. Hu, H., et al., CD4(+) T cell effectors can become memory cells with high efficiency and without further division. Nat Immunol, 2001. 2(8): p. 705-10.

120. Kondrack, R.M., et al., Interleukin 7 regulates the survival and generation of memory CD4 cells. J Exp Med, 2003. 198(12): p. 1797-806.

121. Bradley, L.M., L. Haynes, and S.L. Swain, IL-7: maintaining T-cell memory and achieving homeostasis. Trends Immunol, 2005. 26(3): p. 172-6.

122. Fry, T.J. and C.L. Mackall, The many faces of IL-7: from lymphopoiesis to peripheral T cell maintenance. J Immunol, 2005. 174(11): p. 6571-6.

118 5 Verzeichnisse

123. Prlic, M., L. Lefrancois, and S.C. Jameson, Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. J Exp Med, 2002. 195(12): p. F49-52.

124. Leonard, W.J., et al., Signaling via the IL-2 and IL-7 receptors from the membrane to the nucleus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1999. 64: p. 417-24.

125. Cobbold, S.P., The mTOR pathway and integrating immune regulation. Immunology, 2013. 140(4): p. 391-8.

126. Mackall, C.L., T.J. Fry, and R.E. Gress, Harnessing the biology of IL-7 for therapeutic application. Nat Rev Immunol, 2011. 11(5): p. 330-42.

127. Takada, K. and S.C. Jameson, Naive T cell homeostasis: from awareness of space to a sense of place. Nat Rev Immunol, 2009. 9(12): p. 823-32.

128. Kittipatarin, C. and A.R. Khaled, Interlinking interleukin-7. Cytokine, 2007. 39(1): p. 75-83.

129. Ponchel, F., R.J. Cuthbert, and V. Goeb, IL-7 and lymphopenia. Clin Chim Acta, 2011. 412(1-2): p. 7-16.

130. Napolitano, L.A., et al., Increased production of IL-7 accompanies HIV-1-mediated T-cell depletion: implications for T-cell homeostasis. Nat Med, 2001. 7(1): p. 73-9.

131. Malaspina, A., et al., Idiopathic CD4+ T lymphocytopenia is associated with increases in immature/transitional B cells and serum levels of IL-7. Blood, 2007. 109(5): p. 2086-8.

132. Cox, A.L., et al., Lymphocyte homeostasis following therapeutic lymphocyte depletion in multiple sclerosis. Eur J Immunol, 2005. 35(11): p. 3332-42.

133. Fry, T.J., et al., A potential role for interleukin-7 in T-cell homeostasis. Blood, 2001. 97(10): p. 2983-90.

134. Bolotin, E., et al., Serum levels of IL-7 in bone marrow transplant recipients: relationship to clinical characteristics and lymphocyte count. Bone Marrow Transplant, 1999. 23(8): p. 783-8.

135. Dean, R.M., et al., Association of serum interleukin-7 levels with the development of acute graft-versus-host disease. J Clin Oncol, 2008. 26(35): p. 5735-41.

136. Goldrath, A.W. and M.J. Bevan, Low-affinity ligands for the TCR drive proliferation of mature CD8+ T cells in lymphopenic hosts. Immunity, 1999. 11(2): p. 183-90.

119 5 Verzeichnisse

137. Alpdogan, O., et al., IL-7 enhances peripheral T cell reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest, 2003. 112(7): p. 1095-107.

138. Mackall, C.L., et al., IL-7 increases both thymic-dependent and thymic-independent T-cell regeneration after bone marrow transplantation. Blood, 2001. 97(5): p. 1491-7.

139. Morrissey, P.J., et al., Administration of IL-7 to mice with cyclophosphamide-induced lymphopenia accelerates lymphocyte repopulation. J Immunol, 1991. 146(5): p. 1547-52.

140. Komschlies, K.L., K.J. Grzegorzewski, and R.H. Wiltrout, Diverse immunological and hematological effects of interleukin 7: implications for clinical application. J Leukoc Biol, 1995. 58(6): p. 623-33.

141. Rosenberg, S.A., et al., IL-7 administration to humans leads to expansion of CD8+ and CD4+ cells but a relative decrease of CD4+ T-regulatory cells. J Immunother, 2006. 29(3): p. 313-9.

142. Perales, M.A., et al., Recombinant human interleukin-7 (CYT107) promotes T-cell recovery after allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2012. 120(24): p. 4882-91.

143. Lundstrom, W., N.M. Fewkes, and C.L. Mackall, IL-7 in human health and disease. Semin Immunol, 2012. 24(3): p. 218-24.

144. Sportes, C., R.E. Gress, and C.L. Mackall, Perspective on potential clinical applications of recombinant human interleukin-7. Ann N Y Acad Sci, 2009. 1182: p. 28-38.

145. Sportes, C., et al., Administration of rhIL-7 in humans increases in vivo TCR repertoire diversity by preferential expansion of naive T cell subsets. J Exp Med, 2008. 205(7): p. 1701-14.

146. Sereti, I., et al., IL-7 administration drives T cell-cycle entry and expansion in HIV-1 infection. Blood, 2009. 113(25): p. 6304-14.

147. Calzascia, T., et al., CD4 T cells, lymphopenia, and IL-7 in a multistep pathway to autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(8): p. 2999-3004.

148. Penaranda, C., et al., IL-7 receptor blockade reverses autoimmune diabetes by promoting inhibition of effector/memory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(31): p. 12668-73.

149. Lee, L.F., et al., Anti-IL-7 receptor-alpha reverses established type 1 diabetes in nonobese diabetic mice by modulating effector T-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(31): p. 12674-9.

120 5 Verzeichnisse

150. De Benedetti, F., et al., Elevated circulating interleukin-7 levels in patients with systemic juvenile rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 1995. 22(8): p. 1581-5.

151. Churchman, S.M. and F. Ponchel, Interleukin-7 in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford), 2008. 47(6): p. 753-9.

152. Hartgring, S.A., et al., Interleukin-7 induced immunopathology in arthritis. Ann Rheum Dis, 2006. 65 Suppl 3: p. iii69-74.

153. Hartgring, S.A., et al., Interleukin-7-aggravated joint inflammation and tissue destruction in collagen-induced arthritis is associated with T-cell and B-cell activation. Arthritis Res Ther, 2012. 14(3): p. R137.

154. Ruprecht, C.R., et al., Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T cells in inflamed synovia. J Exp Med, 2005. 201(11): p. 1793-803.

155. van Amelsfort, J.M., et al., Proinflammatory mediator-induced reversal of CD4+,CD25+ regulatory T cell-mediated suppression in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2007. 56(3): p. 732-42.

156. Vercoulen, Y., et al., Human regulatory T cell suppressive function is independent of apoptosis induction in activated effector T cells. PLoS One, 2009. 4(9): p. e7183.

157. Heninger, A.K., et al., IL-7 abrogates suppressive activity of human CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells and allows expansion of alloreactive and autoreactive T cells. J Immunol, 2012. 189(12): p. 5649-58.

158. Younas, M., et al., IL-7 modulates in vitro and in vivo human memory T regulatory cell functions through the CD39/ATP axis. J Immunol, 2013. 191(6): p. 3161-8.

159. Matsuoka, K., et al., Altered regulatory T cell homeostasis in patients with CD4+ lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest, 2010. 120(5): p. 1479-93.

160. Sinha, M.L., et al., Interleukin 7 worsens graft-versus-host disease. Blood, 2002. 100(7): p. 2642-9.

161. Gendelman, M., et al., Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. J Immunol, 2004. 172(5): p. 3328-36.

162. Chung, B., et al., Importance of interleukin-7 in the development of experimental graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 2008. 14(1): p. 16-27.

121 5 Verzeichnisse

163. Chung, B., et al., Prevention of graft-versus-host disease by anti IL-7Ralpha antibody. Blood, 2007. 110(8): p. 2803-10.

164. Thiant, S., et al., Plasma levels of IL-7 and IL-15 after reduced intensity conditioned allo-SCT and relationship to acute GVHD. Bone Marrow Transplant, 2011. 46(10): p. 1374-81.

165. Thiant, S., et al., Plasma levels of IL-7 and IL-15 in the first month after myeloablative BMT are predictive biomarkers of both acute GVHD and relapse. Bone Marrow Transplant, 2010. 45(10): p. 1546-52.

166. Kielsen, K., et al., T cell reconstitution in allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: prognostic significance of plasma interleukin-7. Scand J Immunol, 2015. 81(1): p. 72-80.

167. Poiret, T., et al., Reduced plasma levels of soluble interleukin-7 receptor during graft-versus-host disease (GVHD) in children and adults. BMC Immunol, 2014. 15: p. 25.

168. Shamim, Z., et al., Genetic polymorphisms in the genes encoding human interleukin-7 receptor-alpha: prognostic significance in allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant, 2006. 37(5): p. 485-91.

169. Shamim, Z., et al., Prognostic significance of interleukin-7 receptor-alpha gene polymorphisms in allogeneic stem-cell transplantation: a confirmatory study. Transplantation, 2011. 91(7): p. 731-6.

170. Shamim, Z., et al., Polymorphism in the interleukin-7 receptor-alpha and outcome after allogeneic hematopoietic cell transplantation with matched unrelated donor. Scand J Immunol, 2013. 78(2): p. 214-20.

171. Broux, B., et al., The influence of interleukin-7 receptor alpha-chain haplotypes on outcome after allogeneic hematopoietic cell transplantation. Int J Immunogenet, 2014. 41(6): p. 521-7.

172. Jonuleit, H., et al., Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol, 1997. 27(12): p. 3135-42.

173. Dobin, A., et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics, 2013. 29(1): p. 15-21.

174. Liao, Y., G.K. Smyth, and W. Shi, featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics, 2014. 30(7): p. 923-30.

175. RCoreTeam, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2014.

122 5 Verzeichnisse

176. Love, M.I., W. Huber, and S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol, 2014. 15(12): p. 550.

177. Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8.

178. Murray, A.W., Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell, 2004. 116(2): p. 221-34.

179. Galderisi, U., F.P. Jori, and A. Giordano, Cell cycle regulation and neural differentiation. Oncogene, 2003. 22(33): p. 5208-19.

180. Scholzen, T. and J. Gerdes, The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol, 2000. 182(3): p. 311-22.

181. http://de.wikipedia.org/wiki/Cyclin, Cycline. 02/2015.

182. Surh, C.D. and J. Sprent, Homeostasis of naive and memory T cells. Immunity, 2008. 29(6): p. 848-62.

183. Jiang, Q., et al., Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev, 2005. 16(4-5): p. 513-33.

184. Crawley, J.B., et al., T cell proliferation in response to interleukins 2 and 7 requires p38MAP kinase activation. J Biol Chem, 1997. 272(23): p. 15023-7.

185. Oeckinghaus, A., M.S. Hayden, and S. Ghosh, Crosstalk in NF-[kappa]B signaling pathways. Nat Immunol, 2011. 12(8): p. 695-708.

186. Benczik, M. and S.L. Gaffen, The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol Invest, 2004. 33(2): p. 109-42.

187. Pollizzi, K.N. and J.D. Powell, Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol, 2014. 14(7): p. 435-46.

188. Fayard, E., et al., Protein kinase B/Akt at a glance. J Cell Sci, 2005. 118(Pt 24): p. 5675-8.

189. Schwartz, R.H., T cell anergy. Annu Rev Immunol, 2003. 21: p. 305-34.

190. Fathman, C.G. and N.B. Lineberry, Molecular mechanisms of CD4+ T-cell anergy. Nat Rev Immunol, 2007. 7(8): p. 599-609.

191. Powell, J.D., The induction and maintenance of T cell anergy. Clin Immunol, 2006. 120(3): p. 239-46.

123 5 Verzeichnisse

192. Wells, A.D., New insights into the molecular basis of T cell anergy: anergy factors, avoidance sensors, and epigenetic imprinting. J Immunol, 2009. 182(12): p. 7331-41.

193. Crellin, N.K., R.V. Garcia, and M.K. Levings, Altered activation of AKT is required for the suppressive function of human CD4+CD25+ T regulatory cells. Blood, 2007. 109(5): p. 2014-22.

194. Shrestha, S., et al., T cells require the phosphatase PTEN to restrain T1 and T cell responses. Nat Immunol, 2015.

195. Jo, H., et al., Small molecule-induced cytosolic activation of protein kinase Akt rescues ischemia-elicited neuronal death. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(26): p. 10581-6.

196. Zheng, W.H., et al., Insulin-like growth factor-1 (IGF-1): a neuroprotective trophic factor acting via the Akt kinase pathway. J Neural Transm Suppl, 2000(60): p. 261-72.

197. Alves, N.L., et al., Differential regulation of human IL-7 receptor alpha expression by IL-7 and TCR signaling. J Immunol, 2008. 180(8): p. 5201-10.

198. Wohlfert, E.A. and R.B. Clark, 'Vive la Resistance!'--the PI3K-Akt pathway can determine target sensitivity to regulatory T cell suppression. Trends Immunol, 2007. 28(4): p. 154-60.

199. Sun, J., et al., T cells expressing constitutively active Akt resist multiple tumor-associated inhibitory mechanisms. Mol Ther, 2010. 18(11): p. 2006-17.

200. Ben Ahmed, M., et al., IL-15 renders conventional lymphocytes resistant to suppressive functions of regulatory T cells through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J Immunol, 2009. 182(11): p. 6763-70.

201. Peluso, I., et al., IL-21 counteracts the regulatory T cell-mediated suppression of human CD4+ T lymphocytes. J Immunol, 2007. 178(2): p. 732-9.

202. Chetoui, N., et al., Interleukin-7 promotes the survival of human CD4+ effector/memory T cells by up-regulating Bcl-2 proteins and activating the JAK/STAT signalling pathway. Immunology, 2010. 130(3): p. 418-26.

203. Snyder, K.M., C.L. Mackall, and T.J. Fry, IL-7 in allogeneic transplant: clinical promise and potential pitfalls. Leuk Lymphoma, 2006. 47(7): p. 1222-8.

204. Venkitaraman, A.R. and R.J. Cowling, Interleukin-7 induces the association of phosphatidylinositol 3-kinase with the alpha chain of the interleukin-7 receptor. Eur J Immunol, 1994. 24(9): p. 2168-74.

124 5 Verzeichnisse

205. Dadi, H., S. Ke, and C.M. Roifman, Activation of phosphatidylinositol-3 kinase by ligation of the interleukin-7 receptor is dependent on protein tyrosine kinase activity. Blood, 1994. 84(5): p. 1579-86.

206. Johnson, S.E., et al., IL-7 activates the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in normal human thymocytes but not normal human B cell precursors. J Immunol, 2008. 180(12): p. 8109-17.

207. Crawley, A.M., et al., Jak/STAT and PI3K signaling pathways have both common and distinct roles in IL-7-mediated activities in human CD8+ T cells. J Leukoc Biol, 2014. 95(1): p. 117-27.

208. Pallard, C., et al., Distinct roles of the phosphatidylinositol 3-kinase and STAT5 pathways in IL-7-mediated development of human thymocyte precursors. Immunity, 1999. 10(5): p. 525-35.

209. Hand, T.W., et al., Differential effects of STAT5 and PI3K/AKT signaling on effector and memory CD8 T-cell survival. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(38): p. 16601-6.

210. Barata, J.T., et al., IL-7-dependent human leukemia T-cell line as a valuable tool for drug discovery in T-ALL. Blood, 2004. 103(5): p. 1891-900.

211. Ruppert, S.M., et al., JunD/AP-1-mediated gene expression promotes lymphocyte growth dependent on interleukin-7 signal transduction. PLoS One, 2012. 7(2): p. e32262.

212. Crawley, J.B., J. Willcocks, and B.M. Foxwell, Interleukin-7 induces T cell proliferation in the absence of Erk/MAP kinase activity. Eur J Immunol, 1996. 26(11): p. 2717-23.

213. Ellis, S.D., et al., Induced CD8+FoxP3+ Treg cells in rheumatoid arthritis are modulated by p38 phosphorylation and monocytes expressing membrane tumor necrosis factor alpha and CD86. Arthritis Rheumatol, 2014. 66(10): p. 2694-705.

214. Ohkusu-Tsukada, K., et al., Targeted inhibition of IL-10-secreting CD25- Treg via p38 MAPK suppression in cancer immunotherapy. Eur J Immunol, 2010. 40(4): p. 1011-21.

215. Lamberti, A., et al., Activation of NF-kappaB/Rel transcription factors in human primary peripheral blood mononuclear cells by interleukin 7. Biol Chem, 2004. 385(5): p. 415-7.

216. Manning, B.D. and L.C. Cantley, AKT/PKB signaling: navigating downstream. Cell, 2007. 129(7): p. 1261-74.

217. Smith-Garvin, J.E., G.A. Koretzky, and M.S. Jordan, T cell activation. Annu Rev Immunol, 2009. 27: p. 591-619.

125 5 Verzeichnisse

218. Kannan, A., et al., Signal transduction via the T cell antigen receptor in naive and effector/memory T cells. Int J Biochem Cell Biol, 2012. 44(12): p. 2129-34.

219. Patel, E.S. and L.J. Chang, Synergistic effects of interleukin-7 and pre-T cell receptor signaling in human T cell development. J Biol Chem, 2012. 287(40): p. 33826-35.

220. Han, J.M., et al., Insulin inhibits IL-10-mediated regulatory T cell function: implications for obesity. J Immunol, 2014. 192(2): p. 623-9.

221. Etemire, E., et al., Transiently reduced PI3K/Akt activity drives the development of regulatory function in antigen-stimulated Naive T-cells. PLoS One, 2013. 8(7): p. e68378.

222. Liu, Y., et al., AKT hyperactivation confers a Th1 phenotype in thymic Treg cells deficient in TGF-beta receptor II signaling. Eur J Immunol, 2014. 44(2): p. 521-32.

223. Haxhinasto, S., D. Mathis, and C. Benoist, The AKT-mTOR axis regulates de novo differentiation of CD4+Foxp3+ cells. J Exp Med, 2008. 205(3): p. 565-74.

224. Sauer, S., et al., T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(22): p. 7797-802.

225. Bensinger, S.J., et al., Distinct IL-2 receptor signaling pattern in CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5287-96.

226. Huynh, A. and L.A. Turka, Control of T cell tolerance by phosphatase and tensin homolog. Ann N Y Acad Sci, 2013. 1280: p. 27-9.

227. Hill, J.A., et al., Foxp3 transcription-factor-dependent and -independent regulation of the regulatory T cell transcriptional signature. Immunity, 2007. 27(5): p. 786-800.

228. Bruno, L. and M. Merkenschlager, Directing T cell differentiation and function with small molecule inhibitors. Cell Cycle, 2008. 7(15): p. 2296-8.

229. Santulli, G. and H. Totary-Jain, Tailoring mTOR-based therapy: molecular evidence and clinical challenges. Pharmacogenomics, 2013. 14(12): p. 1517-26.

230. www.clinicaltrials.gov.

231. Keane, N.A., et al., AKT as a therapeutic target in multiple myeloma. Expert Opin Ther Targets, 2014. 18(8): p. 897-915.

126 5 Verzeichnisse

232. Alexander, W., Inhibiting the akt pathway in cancer treatment: three leading candidates. P T, 2011. 36(4): p. 225-7.

233. Kurtz, J.E. and I. Ray-Coquard, PI3 kinase inhibitors in the clinic: an update. Anticancer Res, 2012. 32(7): p. 2463-70.

234.http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm406387.htm, FDA approves Zydelig for three types of blood cancers. FDA, Juli 2014.

235. Ahmad, S., et al., Functional redundancy of PI3K isoforms in conventional T cells provides a selective Treg-targeting strategy through inhibition of PI3K-delta isoform. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2014. 2(Suppl 3): p. O4.

236. Zheng, Y., et al., A role for mammalian target of rapamycin in regulating T cell activation versus anergy. J Immunol, 2007. 178(4): p. 2163-70.

237. Dure, M. and F. Macian, IL-2 signaling prevents T cell anergy by inhibiting the expression of anergy-inducing genes. Mol Immunol, 2009. 46(5): p. 999-1006.

238. Marcais, A., et al., microRNA-mediated regulation of mTOR complex components facilitates discrimination between activation and anergy in CD4 T cells. J Exp Med, 2014. 211(11): p. 2281-95.

239. Huynh, A., R. Zhang, and L.A. Turka, Signales and pathways controlling regulatory T cells. Immunol Rev, 2014. 258(1): p. 117-31.

240. Utting, O., S.-J. Teh, and H.-S. Teh, A Population of In Vivo Anergized T Cells with a Lower Activation Threshold for the Induction of CD25 Exhibit Differential Requirements in Mobilization of Intracellular Calcium and Mitogen-Activated Protein Kinase Activation. The Journal of Immunology, 2000. 164(6): p. 2881-2889.

241. Priatel, J.J., O. Utting, and H.S. Teh, TCR/self-antigen interactions drive double-negative T cell peripheral expansion and differentiation into suppressor cells. J Immunol, 2001. 167(11): p. 6188-94.

242. Lombardi, G., et al., Anergic T cells as suppressor cells in vitro. Science, 1994. 264(5165): p. 1587-9.

243. Lechler, R., et al., The contributions of T-cell anergy to peripheral T-cell tolerance. Immunology, 2001. 103(3): p. 262-9.

244. Qiao, G., et al., T cell activation threshold regulated by E3 ubiquitin ligase Cbl-b determines fate of inducible regulatory T cells. J Immunol, 2013. 191(2): p. 632-9.

127 5 Verzeichnisse

245. Ouyang, W. and M.O. Li, Foxo: in command of T lymphocyte homeostasis and tolerance. Trends Immunol, 2011. 32(1): p. 26-33.

246. Hedrick, S.M., et al., FOXO transcription factors throughout T cell biology. Nat Rev Immunol, 2012. 12(9): p. 649-61.

247. Kerdiles, Y.M., et al., Foxo transcription factors control regulatory T cell development and function. Immunity, 2010. 33(6): p. 890-904.

248. Safford, M., et al., Egr-2 and Egr-3 are negative regulators of T cell activation. Nat Immunol, 2005. 6(5): p. 472-80.

249. Palmer, C.S., et al., Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Front Immunol, 2015. 6: p. 1.

250. Finlay, D.K., Regulation of glucose metabolism in T cells: new insight into the role of Phosphoinositide 3-kinases. Front Immunol, 2012. 3: p. 247.

251. Pearce, E.L., et al., Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science, 2013. 342(6155): p. 1242454.

252. Procaccini, C., et al., An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity, 2010. 33(6): p. 929-41.

253. Zeng, H. and H. Chi, The interplay between regulatory T cells and metabolism in immune regulation. Oncoimmunology, 2013. 2(11): p. e26586.

254. Zeng, H., et al., mTORC1 couples immune Signales and metabolic programming to establish T(reg)-cell function. Nature, 2013. 499(7459): p. 485-90.

255. Michalek, R.D., et al., Cutting edge: distinct glycolytic and lipid oxidative metabolic programs are essential for effector and regulatory CD4+ T cell subsets. J Immunol, 2011. 186(6): p. 3299-303.

256. Dang, E.V., et al., Control of T(H)17/T(reg) balance by hypoxia-inducible factor 1. Cell, 2011. 146(5): p. 772-84.

257. Shi, L.Z., et al., HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells. J Exp Med, 2011. 208(7): p. 1367-76.

258. Oestreich, K.J., et al., Bcl-6 directly represses the gene program of the glycolysis pathway. Nat Immunol, 2014. 15(10): p. 957-64.

259. Toubai, T., et al., Role of cytokines in the pathophysiology of acute graft-versus-host disease (GVHD): are serum/plasma cytokines potential biomarkers for diagnosis of acute GVHD following allogeneic hematopoietic

128 5 Verzeichnisse

cell transplantation (Allo-HCT)? Curr Stem Cell Res Ther, 2012. 7(3): p. 229-39.

260. Fujii, N., et al., Serum cytokine concentrations and acute graft-versus-host disease after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation: concurrent measurement of ten cytokines and their respective ratios using cytometric bead array. Int J Mol Med, 2006. 17(5): p. 881-5.

261. Hill, G.R., W. Krenger, and J.L. Ferrara, The role of cytokines in acute graft-versus-host disease. Cytokines Cell Mol Ther, 1997. 3(4): p. 257-66.

262. Paczesny, S., et al., A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood, 2009. 113(2): p. 273-8.

263. Tawara, I., et al., Interleukin-6 modulates graft-versus-host responses after experimental allogeneic bone marrow transplantation. Clin Cancer Res, 2011. 17(1): p. 77-88.

264. Couriel, D.R., et al., A phase III study of infliximab and corticosteroids for the initial treatment of acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 2009. 15(12): p. 1555-62.

265. Korngold, R., et al., Role of tumor necrosis factor-alpha in graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia responses. Biol Blood Marrow Transplant, 2003. 9(5): p. 292-303.

266. Kovanen, P.E. and W.J. Leonard, Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the gamma(c)-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15, and 21, and their signaling pathways. Immunol Rev, 2004. 202: p. 67-83.

267. Hechinger, A.K., et al., Therapeutic activity of multiple common gamma-chain cytokine inhibition in acute and chronic GVHD. Blood, 2015. 125(3): p. 570-80.

268. Tanaka, J., et al., The important balance between cytokines derived from type 1 and type 2 helper T cells in the control of graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant, 1997. 19(6): p. 571-6.

269. Blaser, B.W., et al., Donor-derived IL-15 is critical for acute allogeneic graft-versus-host disease. Blood, 2005. 105(2): p. 894-901.

270. Bucher, C., et al., IL-21 blockade reduces graft-versus-host disease mortality by supporting inducible T regulatory cell generation. Blood, 2009. 114(26): p. 5375-84.

271. Hippen, K.L., et al., Blocking IL-21 signaling ameliorates xenogeneic GVHD induced by human lymphocytes. Blood, 2012. 119(2): p. 619-28.

129 5 Verzeichnisse

272. Katzman, S.D., et al., Opposing functions of IL-2 and IL-7 in the regulation of immune responses. Cytokine, 2011. 56(1): p. 116-21.

273. Sim, G.C. and L. Radvanyi, The IL-2 cytokine family in cancer immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev, 2014. 25(4): p. 377-90.

274. Arneja, A., et al., Qualitatively Different T Cell Phenotypic Responses to IL-2 versus IL-15 Are Unified by Identical Dependences on Receptor Signal Strength and Duration. The Journal of Immunology, 2014. 192(1): p. 123-135.

275. Ring, A.M., et al., Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15. Nat Immunol, 2012. 13(12): p. 1187-95.

276. Ikemizu, S., M. Chirifu, and S.J. Davis, IL-2 and IL-15 signaling complexes: different but the same. Nat Immunol, 2012. 13(12): p. 1141-2.

277. Palmer, M.J., et al., Interleukin-7 receptor signaling network: an integrated systems perspective. Cell Mol Immunol, 2008. 5(2): p. 79-89.

278. Foley, J.E., et al., Th2 cell therapy of established acute graft-versus-host disease requires IL-4 and IL-10 and is abrogated by IL-2 or host-type antigen-presenting cells. Biol Blood Marrow Transplant, 2008. 14(9): p. 959-72.

279. Falcone, M., et al., IL-4 triggers autoimmune diabetes by increasing self-antigen presentation within the pancreatic Islets. Clin Immunol, 2001. 98(2): p. 190-9.

280. Ghoreschi, K., U. Mrowietz, and M. Rocken, A molecule solves psoriasis? Systemic therapies for psoriasis inducing interleukin 4 and Th2 responses. J Mol Med (Berl), 2003. 81(8): p. 471-80.

281. Weigert, C., M. Rocken, and K. Ghoreschi, Interleukin 4 as a potential drug candidate for psoriasis. Expert Opin Drug Discov, 2008. 3(3): p. 357-68.

282. Nelms, K., et al., The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol, 1999. 17: p. 701-38.

283. Pace, L., et al., Cutting edge: IL-4-induced protection of CD4+CD25- Th cells from CD4+CD25+ regulatory T cell-mediated suppression. J Immunol, 2006. 176(7): p. 3900-4.

284. Pace, L., C. Pioli, and G. Doria, IL-4 modulation of CD4+CD25+ T regulatory cell-mediated suppression. J Immunol, 2005. 174(12): p. 7645-53.

285. Chatila, T.A., Interleukin-4 receptor signaling pathways in asthma pathogenesis. Trends Mol Med, 2004. 10(10): p. 493-9.

130 6 Anhang

6 Anhang

6.1 Veröffentlichungen

Völkl, S., Rensing-Ehl, A., Allgäuer, A., Kremer, A., Speckmann, C., Ehl, S.,

Mackensen, A., et al. (2015) Hyperactive mTOR pathway promotes lymphoprolifera-

tion and abnormal differentiation in autoimmune lymphoproliferative syndrome, in

preparation

Allgäuer, A., Schreiner, E., Ferrazi, F., Ekici, A., Mackensen, A., Völkl, S. (2015)

Interleukin-7 abrogates the immunosuppressive function of human double-negative T

cells by activating Akt/mTOR signaling, J Immunol. 2015 Oct 1;195(7):3139-48.

Rensing-Ehl, A., Volkl, S., Speckmann, C., Lorenz, M. R., Ritter, J., Janda, A.,

Abinun, M., Pircher, H., Bengsch, B., Thimme, R., Fuchs, I., Ammann, S., Allgäuer,

A., Kentouche, K., Cant, A., Hambleton, S., Bettoni da Cunha, C., Huetker, S.,

Kuhnle, I., Pekrun, A., Seidel, M. G., Hummel, M., Mackensen, A., Schwarz, K., and

Ehl, S. (2014) Abnormally differentiated CD4+ or CD8+ T cells with phenotypic and

genetic features of double negative T cells in human Fas deficiency, Blood 124, 851-

860.

Kulzer, L., Rubner, Y., Deloch, L., Allgäuer, A., Frey, B., Fietkau, R., Dorrie, J.,

Schaft, N., and Gaipl, U. S. (2014) Norm- and hypo-fractionated radiotherapy is

capable of activating human dendritic cells, J Immunotoxicol., 11(4):328-36

Filipovic, M. R., Miljkovic, J., Allgäuer, A., Chaurio, R., Shubina, T., Herrmann, M.,

and Ivanovic-Burmazovic, I. (2012) Biochemical insight into physiological effects of

H(2)S: reaction with peroxynitrite and formation of a new nitric oxide donor, sulfinyl

nitrite, Biochem J 441, 609-621.

131 6 Anhang

6.2 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen bedanken, die mir bei der

Anfertigung dieser Doktorarbeit mit Rat und Tat zur Seite standen.

Mein besonderer Dank gebührt Prof. Andreas Mackensen für sein in mich gesetztes

Vertrauen, die Aufnahme in die Med5-Familie und die Betreuung dieser Arbeit. Sein

stetiges Interesse am Fortschritt dieser Arbeit und vielseitigen Anregungen waren

eine großartige Unterstützung.

Ebenso möchte ich mich bei Dr. Simon Völkl für seine kompetente und ausdauernde

Beratung bei diversen fachlichen und Labor-praktischen Fragestellungen danken, die

wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Aus unserem Austausch

habe ich viel Wissen und vor allem immer wieder aufs Neue große Motivation für

unsere Forschung gezogen. Herzlichen Dank Sam!

Ferner danke ich dir, liebste Thea, für die konstruktive Zusammenarbeit und

Hilfsbereitschaft sowie insbesondere für deine unvergesslich herzliche Freundschaft

und ansteckenden Frohsinn.

Danke ebenso an Mike, Kerstin, Flo, Steff, Fred, Elisabeth, Caro der AG Mackensen

sowie den Ehemaligen Regina und Luise für viele anregende Diskussionen und die

super Zusammenarbeit. Ein herzliches Dankeschön gilt auch Anita, Anna, Armin,

Barbara, Betty, Co, Heidi, Heiko, Johanna, Judith, Margarete, Martina, Regina,

Sascha, Steffi und allen weiteren beteiligten Forschern und Ärzte der Med5.

Prof. Falk Nimmerjahn möchte ich ein herzliches Dankeschön für die Betreuung

dieser Arbeit und die fachliche Unterstützung in meiner jährlichen Betreuungskom-

mission aussprechen. Ebenso möchte ich Dr. Stefan Wirtz für sein Engagement in

meiner Betreuungskommission und für die Einweisung und der Lizenzbenutzung der

IPA Software danken. Prof. Lars Nitschke gilt mein Dank für die Begutachtung

meiner Arbeit und Prof. Dr. Andreas Burkovski für die Abnahme der mündlichen

Prüfung.

Für die Hilfe bei der RNA-Sequenzierung und dessen Auswertung danke ich Prof.

Arif Ekici und Dr. Fulvia Ferrazzi aus der Humangenetik, Erlangen sowie Uwe Appelt

von der FACS Core Unit, Erlangen für die vorrausgegangenen Zellsortierungen.

132 6 Anhang

Prof. Hans-Martin Jäck danke ich für die Aufnahme in das Fast-Track-PhD-

Programm und sein enormes Engagement für das Graduiertenkolleg GK1660,

welches unzählige wertvolle Erfahrungen ermöglichte – sei es durch die Teilnahme

an diversen Kongressen, Seminaren und Öffentlichkeitsveranstaltungen. Vielen

Dank ebenso an Anja Glanz und allen beteiligten Projektleitern für den vielseitigen

fruchtbaren Austausch und allen Kollegiaten beziehungsweise Freunden für die

einmalige Zeit.

Zu guter Letzt möchte ich von ganzem Herzen meiner Familie und meinem Freund

danken, die mich allzeit wesentlich unterstützt und liebevoll begleitet haben. Ich bin

äußerst glücklich, dass es euch gibt und ich immer auf Euch zählen kann!

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