structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului...

Functiile

proteinelor

structurale

mecanice

Control

pH

canale

pompe

transport

3/4 din capacitatea

totala de

tamponare a

organismului

http://static.fastbleep.com/

http://static.memrise.com/

TipuriStructura cuaternara – 4 subunități

Hemoglobina

Deoxihemoglobina A

PDB 1HBB

HbA 2β2

96% Hb adult

25 % nou-născut

HbA1c 2β2 glicozilată

(subunitatea β NH2-Val)

5% Hb adult sănătos

↑ 5% Hb diabetici

HbA2 2δ2

2-3% Hb adult sănătos

↑ 3% β-talasemia

HbF 22

1% Hb adult

75 % nou-născut

HbF~O2 > HbA~O2

Anemia falciformă (siclemia)

Hemoglobina

http://www.medicalstudent.ro/contravizita/

anemia-falciforma.html

www.chem.wisc.edu

HbS 2β2

β GLU6VAL

acces restrâns al O2 la HbS

Oboseala

https://www.intechopen.com/

Proteine – masa moleculară

https://www.researchgate.net/

http://onlinembr.info

Tehnici de separare si caracterizare

a proteinelor

Studiul proteinelor -obiective

1. Purificarea proteinei

prepararea extractului

precipitarea

centrifugarea

separarea cromatografica

verificarea puritatii

dializa

ultrafiltrarea


1.1. Prepararea

extractuluimicroorganisme

plante

Alegerea sursei

Procariote

(archea, eubacterii)

Eucariote

Drojdii

Fungi

muscată

tutun

Spanac

Arabidopsis thalianaorigine

animală

Ficat, pancreas, creier

http://anatomyofthefoot.com/

1. Purificarea

proteinei

1.1. Prepararea

extractului ultrasonicare

utilizarea presei franceze

cicli inghetare-dezghetare

Ruperea

membranelor

celulare

enzimatic

folosirea detergenților

http://www.mdpi.com/

1.1. Prepararea extractului

ultrasonicare presa franceza


celulele bacteriene P = 20.000 psi (1360 atm)

Vmin= 40mL samples• scumpă

• zgomotoasă

• timp îndelungat funcționare/curățire

celulele procariote

eucariote

țesuturi animale• zgomotoasă

• reproductibilitatea (denaturare)

cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare

1.1. Prepararea extractului

joy-of-bioprocess.blogspot.com

- Utilizarea lizozimului

- Utilizarea detergentilor

www.plospathogens.org


celulele bacteriene

animale

+ ieftină•reproductibilitatea (denaturare)

1.2. Precipitarea proteinelor

A. Precipitarea la pH = pI

Papaina (papaia) pI = 8,85

Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1

B. Precipitarea cu (NH4)2SO4

precipitat

Precipitarea fractiunilor care contin HSA

a) Inainte de adaugarea sarii;

b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu;

c) Precipitat proteic rezultat in urma centrifugarii (60 min la 5000 rpm).


1.2. Precipitarea proteinelor

C. Precipitarea cu PEG

D. Precipitarea cu solventi organici

Acetona EtOH

1.3. Dializa

Amestec

supus

dializei

Sac de

dializa

A B

Solutie

tampon

Proteina

Molecule mici

difuzie


1.3. Dializa – îndepărtarea sărurilor/solvenților organici


http://www.spectrumlabs.com/

https://www.thermofisher.com/

Saci de dializa

(esteri celuloza)

http://static.coleparmer.com/

https://www.thermofisher.com/

1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei)


N2 (presiune)

Sticla

sinterizata

Ultrafiltrat

Membrana

Magnet pentru

agitareSolutia de proteina

supusa concentrarii

Agitator magnetic

Membrane semipermeabile

- Acetat de celuloza

- Nylon

- polivinilidena

Mai rapida decat dializa

Concentrarea probei

http://www.sigmaaldrich.com/

1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei)

Membrane semipermeabile

-presiune-

www.ebay.tv

http://www.emdmillipore.com/

Membrane

semipermeabile/centrifugare

www.fishersci.com


1.5. Centrifugarea


rPrecede alte operatii

sonicare

precipitare

Separarea

M

forma

densitate

natura

solventului

Viteze mici < 6000 rpm

Particule mai mari

nucleu celule

rosii

1.5. Ultracentrifugarea


Viteze mari > 20000 rpm

Organite celulare

mitocondrii reticulul

endoplasmatic

1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s

Hemoglobina 4,5 S

Mioglobina 1,8 SProcariote Eucariote

http://1.bp.blogspot.com

1.5. Centrifugare vs ultracentrifugarea


http://namrataheda.blogspot.ro

1.5. Ultracentrifugarea


http://image.slidesharecdn.com/

http://www.visionlearning.com/

http://www.biologydiscussion.com/

1.6. Separarea cromatografica


1.6.1. Cromatografie de excludere

Coloana

cromatografica

Amestec

supus

separarii

GelA B

http://www.waters.com/


1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

Tipul gelulului Intervalul de

separare

(M, KDa)

Sephadex G-10 < 0.7

Sephadex G-25 1-5

Bio-Gel P-60 3-60

Sephadex G-75 3-70

Sephadex G-100 4-100

Bio-Gel P-100 5-100

Sephadex G-200 30-200

Sephacryl S-300 10-1.500

Sepharose 2B 70-40.000

10

100

1000

0 20 40 60 80 100 120

Volume/ml

MW

/kD

a

Estimarea masei

moleculare relative Mr


1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri

http://www.ap-lab.com/images/LS_setup.gif

Sistem de purificare cromatografică

http://wolfson.huji.ac.il/purification/

Superdex 200 Increase 10/300 GL

http://www.gelifesciences.com/


1.6.1. Cromatografie de permeabilitate

in geluri

Avantaje

Timp scurt de analiză;

Separare bine-definită;

Benzi înguste și sensibilitate bună;

Nu există pierderi ale compusilor separați;

Volum mic de fază mobilă ;

Rată de eluție controlabilă.

Separare cromatografica

HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200HEPES 50 mM pH 7.4 +50 mM NaCl)

Zaharia, M. & Gradinaru, R.,

J. Appl. Spectrosc.,

82 (2), 285-292 (2015)

Etapă finală la purificarea proteinelor


1. Purificarea enzimei

1.6.3. Cromatografie prin interactii hidrofobe

www.pall.com

http://www.jncamericany.com/

Cromatografie mixtă – hidrofobă + ionică

http://www.genengnews.com/



1.6.2. Cromatografie de schimb ionic

– –– –––

–Proteina

Schimbator

anionicIoni din

tampon

–

–––

––

–

A B




https://www.chromacademy.com/

ww.bio-rad.com/webroot

Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Dietil-amino-etil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+( CH2CH3)2 slaba

Cuaternara aminoetil

(QAE)

-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3 puternica

Cuaternara amoniu (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 puternica

Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria

schimbatorului

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO- slaba

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3- puternica

Sulfonat de metil -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3- puternica

Grupări functionale ale schimbatorilor de ioni






1.6.4. Cromatografie de afinitate

https://www.creative-biostructure.com/



1.6.4. Cromatografie de afinitate

ADN cu secventa suplimentara

Insertie in

bacterii (E coli)

Distrugerea

membranelor

proteina cu

secventa

adiacenta

alte

proteine

legare

Ma

trice d

e a

finita

te

Spalare

Elutie

Indepatare

secventa

suplimentara

= ligand



1.6.4. Cromatografie de afinitate –aplicații

Purificarea acizilor nucleici

Purificarea proteinelor membranare

Purificarea enzimelor

Purificarea anticorpilor

Purificarea receptorilor (pentru hormoni)

Purificarea proteine neurotransmiţătoare

10

100

1000

0 10 20 30

distance/mm

MW

/kD

a

97 kDa

45 kDa

30 kDa

20 kDa

66 kDa

14 kDa

1.6. Verificarea puritatii - electroforeza


1.6. Verificarea puritatii – SDS electroforeza

1. Purificarea proteinelor

Avantajele SDS electroforezei

SDS (detergent) solubilizeaza aproape

toate proteinele;

Izoproteinele nu apar sub forma unor benzi

diferite;

Micelele de SDS-proteina, fiind puternic incarcate

negativ, poseda o mobilitate electroforetica;

Lanturile polipeptidice sunt despachetate

separarea = f(dimensiune a porilor, M);

www.pnas.org

Dezavantaje

Proteinele separate prin SDS-electroforeza -

leaga bine colorantul.

Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)

• 16.5% 2-25 kDa

Sisteme de electroforeza folosite (cu detergent)



Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)

• 7.5% 40-400 kDa

• 12.5% 20-100 kDa

• 20% 3-25 kDa

Sisteme de electroforeza nativa

- fara SDS

- agenti reducatori (DTT)

Sisteme de electroforeza folosite



Mecanism de polimerizare

1.6. Verificarea puritatii – SDS - electroforeza


Acril-

amida

(%)

Intervalul

de separare

(KDa)

15 15-45

12,5 15-60

10 18-75

7,5 30-120

5 60-210



Mecanism de polimerizare

http://www.gelifesciences.com/

Reducerea puntilor disulfidice



http://www.crc.dk/yeast/

Reducerea puntilor disulfidice

1.6. Diagnoză - electroforeza


https://www.researchgate.net/topic/Sickle-Cell-Disease

1.6. Verificarea puritatii – electroforeza bidimensională


http://www.bio-rad.com

1.6. Separarea proteinei - HPLC verificarea puritatii


elte.prompt.hu

dionex.com

1.6. Spectrometria de masa – determinarea masei moleuclare

1. Puritatea proteinei / complecsi

1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (MALDI-TOF)

1. Puritatea proteinei / complecsi

www.atdbio.com

http://www.kcl.ac.uk/

1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (ESI-MS)

1. Puritatea proteinei


1. Purificarea peptidelor/proteinelor

Proba

Sursă de

ionizareMS1 Fragmentare

(cameră de

coliziune)

MS2

Spectru

de masă 1

Spectru

de masă 2

EI, ESI

MALDI

Detector

1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa in tandem

1. Analiza proteinei

1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa in tandem


AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da)

Ala, A 71.0 Gln, Q 128.1 Leu, L 113.1 Ser, S 87.0

Arg, R 156.1 Glu, E 129.0 Lys, K 128.1 Thr, T 101.0

Asn, N 114.0 Gly, G 57.0 Met, M 131.0 Trp, W 186.1

Asp, D 115.0 His, H 137.1 Phe, F 147.1 Tyr, Y 163.1

Cys, C 103.0 Ile, I 113.1 Pro, P 97.1 Val, V 99.1

Aplicatiile MS

Identificarea proteinelor

(2D gel)

Caracterizarea proteinelor

recombinate

Modificarile postranslationale

ale proteinelor



Expert Protein Analysis

System ExPASy

1- si -globine ( 12 KDa); 2- -actine ( 12 KDa)

3- acetil colin esteraza; 4- spectrine cu lant -actine

Proba din ficatul uman

Determinarea masei moleculare

structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului...

Documents

Transcript of structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului...