Prof. Maria Nicola GADALETAProf. Maria Nicola GADALETA

E-mail: m.n.gadaleta@biologia.uniba.it

Facoltà di Scienze Biotecnologiche

Corso di Laurea in

Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche

Biochimica e Biotecnologie Biochimiche

DISPENSA N. 4DISPENSA N. 4

AMMINOACIDIAMMINOACIDI

α-AMMINOACIDI PROTEICI O STANDARD

Gli aminoacidi (AA) presenti nella cellula possono essere il prodotto di idrolisi delle proteine (αAA proteici o standard; αAA rari o non standard) o metaboliti liberi (AA non proteici).

Gli α-amminoacidi hanno proprietà strutturali comuni

M.N. Gadaleta

*

AMMINOACIDO SIMBOLI GRUPPO

## (Glicina) (P.M. 75) Gly G Alanina Ala A Valina Val V

Leucina Leu L Isoleucina Ile I ° Prolina Pro P Gruppo imminico Metionina Met M

Fenilalanina Phe F Gruppo fenile Triptofano (P.M. 204) Trp W Indolo

R non polare (o idrofobico) (8-9 AA)

Sono i meno solubili in acqua; il meno idrofobico è l’alalnina.

CLASSIFICAZIONE BIOCHIMICA DEI 20 AMMINOACIDI STANDARD

* per Tyr vedi AA con R polare non carico ## la Glicina avendo come R solo H è in alcuni casi inserito fra gli AA con R non polare (idrofobico), in altri fra gli amminoacidi con R polare non carico (idrofilico). ° L’anello piridinico comprende sia Cα che NH2. M.N. Gadaleta

R polare non carico a pH neutro (idrofilico) (6-7 AA)

Sono più solubili dei precedenti; R può formare legami H con H2O.

I più polari (Cys e Tyr*) a pH 7 sono debolmente ionizzati.

AMMINOACIDO

## (Glicina) Gly G Serina Ser S

Treonina Thr T Cisteina Cys C Tirosina* Tyr Y

Asparagina Asn N Glutamina Gln Q

* R aromatiico: vedi pagina precedente M.N. Gadaleta

R polare carico a pH 7 (idrofilici) (5 AA)

Tutti con R completamente ionizzato a pH 6-7, negativi o positivi, tranne His che ha pKR ~ 6.

AMMINOACIDO CARICA

Aspartato Asp D - Glutammato Glu E -

Lisina Lys K + Arginina Arg R + Istidina His H +

M.N. Gadaleta

Altre classificazioni di amminoacidi

AA acidi : glutammato e aspartato: AA monoamminodicarbossilici

AA basici : arginina e lisina: AA diamminomonocarbossilici

istidina ( anello imidazolico )

AA solforati : cisteina e metionina

AA aromatici : fenilalanina, triptofano e tirosina

M.N. Gadaleta

GLUTAMMATO MONOSODICO (MSG) *

Idrolizzati proteici vegetali (dadi) > 40% di MSG

Esempio di amminoacido utile all’organismodannoso in quantità eccessiva

Amminoacidi proteine

GLUTAMMATO

Neurotrasmettitore (versatilità delle biomolecole, principio di economia)

casa

* aumenta il sapore dei cibi dadi

ristorante

Sindrome da ristorante cinese dai capogiri al mal di testa all’affaticamento(eccessivo uso di MGS)

2% popolazione umana estremamente sensibile evitare : questo condimentofunghipisellialtri vegetali ricchi in MSG

M.N. Gadaleta

AMMINOACIDI RARI O NON-STANDARD (prodotti dalla modificazione post-traduzionale)

proteine fibrose = collageno non idrossilazione = scorbuto

Protrombina non carbossilazione = emorragia

Si ottiene dalla sostituzione dell’ OH ossidrilico Ser con Selenio. E’ presente nella glutatione perossidasi e in poche altre proteine.

Si ottiene dalla ossidazione del gruppo sulfidrilico di due cisteine con formazione di un ponte disolfuro

4-idrossiprolina γγγγ - carbossiglutammato

Selenocisteina (derivato della serina)

Cistina

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AMMINOACIDI NON-PROTEICI – circa 300 nella cellula

ββββ - alanina ornitina citrullina

(acido pantotenico)

(ciclo dell’urea)

(ciclo dell’urea)

αβγδ

αβγδ

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AMMINOACIDI ESSENZIALI

Amminoacidi che l’organismo non può sintetizzare o sintetizza in quantità insufficiente. Per

l’uomo sono 10 di cui

8 per tutta la vita

2 solo per il bambino

solo per i fenilchetonurici

nell’infanzia (rapida crescita)

durante la gravidanza

Arg e His

Tyr

Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val

M.N. Gadaleta

per tutta la vita

STEREOCHIMICA DEGLI αAMMINOACIDI

Tutti gli α-amminoacidi, tranne la glicina che non ha C chiralico, ruotano il piano della luce polarizzata Centro chiralico = Carbonio con 4 sostituenti diversi = otticamente attivo

Poichè la disposizione degli orbitali di legame intorno al Cα è tetraedrico i 4 gr

sostituenti possono disporsi nello spazio in 2 modi diversi e quindi gli AA

presentano 2 possibili stereoisomeri.

Questi stereoisomeri sono immagini speculari non sovrapponibili = eniantiomeri

M.N. Gadaleta

Il Cα è il C asimmetrico = centro chirale = tutti i sostituenti del C sono diversi.

D – configurazione assoluta L –

M.N. Gadaletada: Nelson & Cox

Convenzione di Fisher

CONFIGURAZIONE ASSOLUTA DEGLI AA : D, L

La configurazione assoluta non fa riferimento alle proprietà ottiche delle molecole ma solo alla configurazione secondo la convenzione di Fisher dei quattro sostituenti attorno a 1 C chiralico.

AMMINOACIDI [α] D

25

L-alanina +1.8 L-arginina +12.5 L-leucina -11.0 L-isoleucina +12.4 L-fenilalanina +34.5 L-ac. Glutammico +12.0

CONFIGURAZIONE RELATIVA

ROTAZIONE SPECIFICA [α] D

25 = rotazione oss. (deg x 100) lungh. camm. ott. (dm) x conc. (gr/100ml) D = linea del Na 589.3 nm

M.N. Gadaleta

configurazione relativa:

Destrogiri+ d)

Levogiri - l)

Rotazione specifica di alcuni amminoacidi isolati da proteine, in soluzione acquosa. Dipende dalla natura di R,

non dipende dalla configurazione assoluta del C asimmetrico sono tutti L stereoisomeri . Il grado e il segno di

rotazione specifica dipendono dal pH.

M.N. Gadaleta

Stereoisomeri : Enantiomeri proprietà fisiche e chimiche identiche ad

eccezione:

1. rotazione del piano della luce

polarizzata in misura uguale ma

direzione opposta

2. reagiscono in modo diverso con

reagenti a loro volta asimmetrici

(ENZIMI)

� se prodotti da una reazione

organica gli amminoacidi sono

ottenuti sotto forma di racemo

L-D

� Se sintetizzati con reazioni

enzimatiche si ottengono solo

gli isomeri L, perché gli enzimi sonoanch’essi asimmetrici.

Stereoisomeri possibili 2n n = n 0 di C asimmetrici

Glicina n = 0

Treonina e isoleucina n = 2 (4 possibili

stereoisomeri)

M.N. Gadaleta

SPETTRI DI ASSORBIMENTO DEGLI AMMINOACIDI

Gli amminoacidi non assorbono nel visibile

Tutti gli amminoacidi assorbono nell’estremo U.V. < 220 nm a causa del doppio legame del gruppo COOH

Tre amminoacidi assorbono nell’ U.V. intorno a 280 nm; Trp BANDA DEL TRIPTOFANO

Tyr

Phe

Queste caratteristiche si riflettono nelle proteine che possono essere dosate attraverso lettura

spettrofotometrica a 280 nm.

M.N. Gadaleta

LEGGE DI LAMBERT BEER

Legge valida solo ad A = Aλmax

A λmax= ε c l l = percorso ottico

ε = coefficiente di

estinzione molare

c = concentrazione

sostanza in esame

A = log I0/ It I0 = intensità luce

incidente

I = intensità luce

trasmessa

t

(A)

(Aλmax)

nell’U.V.

M.N. Gadaletada: Nelson & Cox

PROPRIETA’ ACIDO-BASICHE DEGLI AMMINOACIDI

Gli amminoacidi cristallini hanno : 1. punto di ebollizione >> 200 0C

2. alta solubilità in acqua

Queste proprietà sono tipiche dei reticoli cristallini di molecole dotate di carica le cui forze

attrattive sono di tipo elettrostatico; viceversa sarebbero stati stabilizzati da forze di Van

der Waals, più deboli, e quindi avrebbero avuto punti di fusione più bassi.

Gli amminoacidi cristallizzano come ioni dipolari o zwitterioni e si trovano in questa forma

anche in soluzioni acquose neutre. Gli amminoacidi hanno infatti:

1. alte costanti dielettriche D

2. grandi momenti dipolari

un riflesso di cariche sia positive che negative sulla stessa molecola.

M.N. Gadaleta

STATI DI IONIZZAZIONE DI UN AMMINOACIDO IN FUNZIONE DEL pH

Gli amminoacidi disciolti in acqua possono comportarsi:

come ACIDI (donatori di protoni)

come BASI (accettori di protoni)

sono chiamati ELETTROLITI ANFOTERI o ANFOLITI

M.N. Gadaleta

La CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA presenta due distinti stadi, corrispondenti

ciascuno alla rimozione di un protone.

Un semplice amminoacido mono amino-monocarbossilico, come la GLICINA, è di fatto un acido diprotico quando è

completamente protonato, in questa forma ha, cioè, due gruppi che possono ionizzarsi per dare protoni.

M.N. Gadaleta da: Nelson & Cox

� all’inizio della titolazione la Glicina è nella forma completamente protonata

� al punto di flesso della Ia sigmoide sono presenti quantità equimolecolari di COO- e

COOH; questo pH è il pK del gruppo che viene titolato. (pK1 = 2.34)

� a pH = 5.97 è completa la titolazione del primo gruppo e si inizia a rimuovere il

secondo protone. La forma prevalente è NH3-CHR-COO-

� al punto di flesso della IIa parte si avrà quantità equimolecolare di –NH3+ e –NH2.

Questo pH è il pK del gruppo –NH3+ (pK2 = 9.60)

� la titolazione è completa quando la forma predominante diventerà NH2-CHR-COO-

(completamente deprotonata)

M.N. Gadaleta

A pH = 5.97 la forma prevalente è lo ZWITTERIONE (cioè senza carica netta). Questo pH è detto PUNTO ISOELETTRICO (pI) ed è dato dalla media aritmetica dei due valori di pK (nel caso di amminoacidi privi di gruppi R dissociabili). Es. Glicina ⇒ pI = 2.34 + 9.60 / 2 = 5.97 pI = pK1 + pK2 2

� a pH = pI di un amminoacido 1. carica netta = 0 2. non si muove in un campo elettrico 3. presenta la minima solubilità

� a pH > pI la carica netta della Glicina sarà -, pertanto si muoverà verso il polo +

� a pH < pI la carica netta della Glicina sarà +, pertanto si muoverà verso il polo –

� a pH = 1 la Glicina sarà completamente protonata con carica netta + = 1

� a pH = 2.34 dove [NH3+-CHR-COOH] = [NH3

+-CHR-COO-], la Glicina avrà carica netta + = 0.5

� così per tutti i valori di pH si può calcolare la frazione di carica netta posseduta dall’amminoacido. Importante per la separazione elettroforetica.

La curva di titolazione predice la carica elettrica degli AA

M.N. Gadaleta

Gli amminoacidi con gruppi R ionizzabili hanno curve di titolazione più complesse con tre

stadi corrispondenti alle tre tappe di ionizzazione, con tre valori di pK.

Se i valori di pK sono molto simili le curve si fondono.

La curva di titolazione dell’istidina. Il pH isoelettrico (pI) è il valore al quale ci sonoun ugual numero di cariche positive e negative.

La molecola non ha carica netta.

pI = 7.6 = pK2 + pKR

2M.N. Gadaleta

VALORI DI pKA DI ALCUNI AMMINOACIDI E LORO pI

AMMINOACIDI PK1

-COOH

PK2 -NH3

PKR

PI

Glicina 2.34 9.6 5.97 Alanina 2.34 9.69 6.02 Leucina 2.36 9.6 5.98 Serina 2.21 9.15 5.68

Treonina 2.11 9.62 5.87 Glutamina 2.17 9.13 5.65

a. aspartico 1.88 9.60 3.65 2.77 a. glutammico 2.19 9.67 4.25 3.22

Istidina 1.82 9.2 6.0 7.6 Cisteina 1.96 8.18 8.28 5.07 Tirosina 2.20 9.11 10.07 5.66 Lisina 2.18 8.95 10.53 9.74

Arginina 2.17 9.04 12.48 10.76

� nessun amminoacido mono amino mono carbossilico ha capacità tamponante nelle

zone di pH fisiologico (7.4) da 6.0 a 8.0 tranne l ‘ISTIDINA il cui pKR è = 6. E’ un

amminoacido raro ma molto importante (per es. in Hb e nel sito attivo degli enzimi)

� il pI degli amminoacidi acidi è uguale a pK1 + pKR

2

� il pI degli amminoacidi basici è uguale a pK2 + pKR

2 M.N. Gadaleta

In pratica, a pH fisiologico l’istidina può associare e dissociare il protone con la stessa facilità. Può pertanto comportarsi da acido o da base: dipende dall’ambiente circostante. Importante in Hb e nella catalisi acido-basica.

M.N. Gadaleta

GENERALITA’ sulle proprietà acido-basiche degli AA

� il pI degli amminoacidi neutri non è esattamente 7 (come ci si aspetterebbe se –COOH e –NH2 avessero la

stessa forza), ma –COOH come acido è un pò più forte di –NH2 come base

� il gruppo α – COOH è un acido più forte di altri gruppi carbossilici (es. acido acetico ha il pK = 4.76). Ciò è

dovuto alla repulsione che si instaura tra i protoni che vengono liberati e la carica positiva del gruppo α –

aminico (con le sue cariche + stabilizza la carica – del –COO- dissociato)

� il pKa del gruppo aminico della Glicina viene modificato verso il basso rispetto ai valori medi di un gruppo

aminico primario: ciò è dovuto alla forza di attrazione degli atomi elettronegativi dell’ossigeno del -COOH,

aumentando contemporaneamente la tendenza del gruppo NH3 a cedere un H+

� tutti gli amminoacidi mono amino mono carbossilici con gruppi R privi di carica hanno valori di pK1 quasi

uguali (1.8 - 2.4) così per i valori di pK2 (8.8 - 11). Le curve di titolazione sono simili a quelle della Glicina

� il gruppo β - carbossilico dall’ a. aspartico e il γ - carbossilico dell’ a. glutammico sebbene completamente

ionizzati a pH 7 hanno valori di pK molto più alti dei gruppi α–COOH, cioè molto più simili a quelli degli

acidi carbossilici semplici come a. acetico

� il gruppo –SH delle cisteine e il gruppo –OH della tirosina sono debolissimi acidi. A pH 7 –SH è ionizzato

all’8%, mentre l’-OH è ionizzato all’0.01%

Queste considerazioni sono importanti per spiegare, per esempio, il meccanismo di catalisi nel sito attivo

degli enzimi.

M.N. Gadaleta

Metodi per l’analisi qualitativa e quantitativa deg li AA

1. SEPARAZIONE e ANALISI QUALITATIVA degli AA

Tecniche basate sulle proprietà di adsorbimento e miscibilità (o ripartizione)

1. cromatografia su carta2. “ su strato sottile (TLC)3. “ liquida ad alta pressione (HPLC )

Principi in base ai quali operano le suddette tecni che:

1. principio di ripartizione2. “ di ripartizione o di adsorbimento3. “ di ripartizione o di adsorbimento (sc. i onico)

Tecniche basate sulle proprietà di carica

1. elettroforesi su carta2. cromatografia a scambio ionico

2. ANALISI QUANTITATIVAAnalisi spettrofotometrica per tirosina, triptofano f enilalanina1. “ colorimetrica (ninidrina fino a 1 µµµµmole)2. “ fluorimetrica (fluorescamina fino a 1 pmoli)

(cloruro di dansile fino a 1 pmoli)M.N. Gadaleta

Cromatografia su colonna

M.N. Gadaleta

Analisi degli amminoacidi

Reazione con la ninidrina per l’analisi quantitativa colorimetrica degli amminoac idi

La reazione con la ninidrina distrugge la molecola d egli amminoacidi.

Il composto colorato si sviluppa dopo esposizione d egli amminoacidi a 100°C.

La prolina, che è un imminoacido dà un composto gia llo ( λλλλmax = 440 nm).

Sensibilità : micromole (10 -6moli ); µµµµg

M.N. Gadaleta

M.N. Gadaletada: Nelson & Cox