Práct 1 material de laboratorio

Instituto Politécnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Bioconversiones

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DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA, PH, TEMPERATURA Y

FUERZA IÓNICA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (α-AMILASA).

PROFESORES:

Dra. María del Carmen Oliver S. Dr. Luis Fernández Linares IBT. Jocelyn Sánchez Arellano

GRUPO: 5BM1

EQUIPO: 6

ALUMNOS:

Betancourt Acosta Jazmín

Hernández Borja Karen Susana

Loreto Reza Marco Eli

Montoya Díaz José Antonio

Salinas Martínez Carla Karen

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGÍALABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

2 de Octubre del 2014



ÍNDICE

Contenido1.1. Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio..................4

1.1.1 Introducción.................................................................................................4

1.1.2 Objetivos......................................................................................................4

1.1.3 Metodología.................................................................................................4

1.1.4 Resultados...................................................................................................7

1.1.5. Discusión....................................................................................................7

1.1.6. Conclusiones..............................................................................................8

1.1.7 Referencias..................................................................................................8

1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas.........................9

1.2.1 Introducción.................................................................................................9

1.2.2 Objetivos....................................................................................................11

1.2.3 Metodología...............................................................................................11

1.2.4 Resultados.................................................................................................14

1.2.5 Discusión...................................................................................................15

1.2.6 Conclusiones.............................................................................................15

1.2.7 Bibliografía.................................................................................................15

1.3 Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de Bioconversiones.16

1.3.1 Introducción...............................................................................................16

1.3.2 Objetivos....................................................................................................16

1.3.3Metodología................................................................................................17

1.3.4Discusión....................................................................................................19

1.3.5 Conclusiones.............................................................................................19

1.3.6Bibliografía..................................................................................................19

1.4 Determinación de crecimiento celular por turbidimetría o Densidad óptica (D.O), peso seco y cuenta directa en cámara de Neubauer..................................20

1.4.1 Introducción...............................................................................................20

1.4.2. Objetivos...................................................................................................21

1.4.3Materiales y reactivos.................................................................................21

1.4.4. Metodología..............................................................................................22

1.4.5. Resultados................................................................................................22

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1.4.6 Discusión...................................................................................................24

1.4.7 Conclusiones.............................................................................................24

1.5 Determinacion de azucares reductores...........................................................22

1.5.1Introducción................................................................................................22

1.5.2 Objetivos....................................................................................................23

1.5.3 Metodología...............................................................................................23

1.5.4 Resultados.................................................................................................24

1.5.5 Discusión...................................................................................................25

1.5.6 Conclusiones.............................................................................................27

1.5.7 Referencias................................................................................................27

1.6. Determinación de la concentración de proteína de las enzimas elegidas.......28

1.6.1 Introducción...............................................................................................28

1.6.2 Objetivos....................................................................................................29

1.6.3 Metodología...............................................................................................29

1.6.4 Resultados.................................................................................................30

1.6.5 Discusión...................................................................................................32

1.6.6 Conclusiones.............................................................................................33

1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas: amilasas................................34

1.7.1 Introducción...............................................................................................34

1.7.1Materiales y método...................................................................................34

1.7.2 Objetivos....................................................................................................35

1.7.3 Metodología...............................................................................................35

1.7.4 Resultados.................................................................................................35

1.7.5 Discusión...................................................................................................36

1.7.6Conclusiones..............................................................................................37

1.8 Efecto de la Concentración de la enzima en la actividad enzimática de una Amilasa...................................................................................................................39

1.8.1 Introducción...............................................................................................39

1.8.2 Objetivos....................................................................................................39

1.8.3 Desarrollo Experimental.............................................................................40

1.8.4 Resultados.................................................................................................41

1.8.5 Discusión...................................................................................................44

1.8.6 Conclusiones.............................................................................................45

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1.8.7 Memoria de cálculo....................................................................................45

1.8.8 Bibliografía.................................................................................................45

1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática................................46

1.9.1 Introducción...............................................................................................46

1.9.2 Metodología...............................................................................................47

1.9.3 Resultados :...............................................................................................48

1.9.4 Discusión...................................................................................................50

1.9.5 Conclusiones.............................................................................................51

1.9.6 Bibliografía.................................................................................................52

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1.1. Capacitación para el uso de micropipetas y equipo de laborato-rio

1.1.1 Introducción

Las micropipetas se utilizan en varios campos de la ciencia como el área de la salud, química, biología, farmacéutica y genética, para realizar medidas volumétricas con precisión y exactitud . Para ello los laboratorios deben asegurar la obtención de buenos resultados utilizando instrumentos de maneara adecuada demás se calibrados (Batista et. al, 2006).

Los rangos de microlitros que utilizan las micropipetas se utilizan con frecuencia en la mayoría de los campos de la química analítica y genética, especialmente cuando se trata de pruebas altamente sensibles donde un error pequeño puede conllevar a unos resultados erróneos.Paras tener una buena determinación se requiere calibrar las micropipetas en las condiciones en las que se va a trabajar en el laboratorio para de esta manera estar seguros de los resultados obtenidos, uno de los métodos más sencillos para calibrar consiste en comparar el volumen entregado por el instrumento es comparado con el peso del líquido (frecuentemente agua)a este método se llama método gravimétrico.Es indispensable para realizar este método conocer el manejo adecuado de las micropipetas así como su modo de dispensación del líquido Una punta desechable, por lo general de polipropileno, se adjunta a la pipeta del émbolo, posteriormente con el pistón en el primer límite de aspiración la punta se sumerge en el líquido, después se libera el embolo para la aspiración del líquido. Para expulsar el líquido del pistón, se desliza completamente el pistón, hasta llegar al segundo limite. El peso del volumen entregado es determinado utilizando una balanza analítica.

Hemos de mencionar que existe una norma para la calibración y manejo de micropipetas, esta norma es la ISO 8655 para aparatos volumétricos operados por pistón. Los premisas principales de dicha norma se centran en 3 puntos fundamentales: las condiciones ambientales, utilizar una balanza adecuada y minimizar el efecto de la evaporación en volúmenes inferiores

1.1.2 Objetivos Conocer el protocolo para el manejo de micropipetas en el laboratorio. Conocer los tipos y los rangos de volumen de micropipetas. Entender el manejo de micropipetas para el uso de líquidos volátiles y viscosos.

1.1.3 Metodología

Materiales y reactivos.

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Micropipeta 1µL - 10µL Micropipeta 2µL - 20µL Micropipeta 20µL - 200µL Micropipeta 100µL - 1000µL Puntas para micropipetas Balanza analítica Tubos eppendorf Agua destilada Glicerol Diclorometano

Manejo y uso de micropipetas.Se emplearon micropipetas de 4 distintos rangos de volumen. Se identificaron las puntas adecuadas para cada tipo de micropipeta Con una de las micropipetas se siguió el siguiente protocolo para la operación del instrumento, utilizando agua destilada como liquido de experimentación.

1. Se ajustó el pistón al volumen deseado.2. Se oprimió el pistón en el primer límite.3. Se sumergió la punta en el líquido, con el pistón oprimido.4. Después se liberó el embolo para la aspiración del líquido. 5. Para expulsar el líquido del pistón, se deslizo completamente el pistón, hasta llegar al

segundo limite. Manejo y uso de micropipetas para líquidos viscosos.Durante el manejo y uso de micropipetas para líquidos viscosos se utilizó como liquido de experimentación glicerol (densidad = 1.26 g/ cm3), se siguió el mismo protocolo de manejo, pero modificando el paso 4, para este etapa el embolo debe de ser liberado lentamente para permitir

que el líquido entre y no se formen burbujas o se introduzca aire dentro de la punta.

Manejo y uso de micropipetas para volátiles.Durante el manejo y uso de micropipetas para líquidos volátiles se utilizó como liquido de experimentación Diclorometano, se siguió el mismo protocolo de manejo, pero modificando nuevamente, en este caso se repitió el paso 2, 3 y 4 para saturar la punta de la micropipeta este procedimiento se llevó a cabo en una campana de extracción para evitar aspirar los vapores producidos por el.

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Ilustración 1 Procedimiento correcto para calibrar una micropipeta



Calibración de micropipetas

Se ajustó una micropipeta de 100µL - 1000µL a un el volumen de 600µL ,se tomaron 5 alícuotas de agua destilada como se muestra en la ilustración 1 y se pesaron en balanza analítica, utilizando un tubo eppendorf como contenedor

Calculo del error sistemático y aleatorio de micropipetas. Con los obtenidos se calculó el error sistemático que proporciona la Exactitud (proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio, que nos expresará la Precisión (grado de reproducibilidad de las medidas) de la pipeta.

Para el cálculo del error sistemático, se consideró previamente el factor de corrección del agua, considerando la presión atmosférica de la ciudad de México de 80kPa y una temperatura de 23.5 °C. Los factores de corrección se muestran en la Tabla 1.

Valor medio del volumen dosificado

x=∑ valoresmedidos

nnúmerode valoresmedidos∗Z…(1)

El error de medición sistemático porcentual se calcula con la siguiente ecuación

es=100∗¿x−xnominalxnominal

∨… (2 )

Donde Xnominal indica el volumen aparente dosificado, es decir el volumen que se desea tomar por la micropipeta.

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Tabla 1Factor Z (µg/µL) EN ISO 8655 para agua destilada en función de la temperatura y presión atmosféricas



El error aleatorio (desviación estándar) se calcula de la siguiente forma.

σ=±√∑i=1

N

¿¿¿¿… (3)

Es necesario calcular la desviación estándar como un valor porcentual (coeficiente de variación).

S% = σX

*100 … (4)

1.1.4 Resultados

Las Tablas 2 muestran los resultados de las mediciones de la masa de los volúmenes tomados con la micropipeta

Tabla 2. Pesos de volúmenes micropipeta 100µL -1000µLVolumen500µL

0.4890g 0.4858g 0.5141g 0.5066g 0.4870g

La tabla 3. Resume el error en los volúmenes medidos en cada una de las micropipetas.

Tabla 3. Error sistemático porcentual de las mediciones con micropipetas

Rango de pipeta

Volumen medido

(µL)

X corregid

o con factor Z

(mL)

es (%) S (%)

100µL -1000µL

600 0.4946 1.08 2.3756

1.1.5. Discusión

La norma EN ISO 8655 establece los límites permisibles de error en las micropipetas, la Tabla 4 muestra tales datos. Al realizar la comparación entre el error obtenido con las micropipeta del laboratorio de bioconversiones y los establecidos en la norma, se observan diferencias significativas, esto hace suponer que el equipo está mal calibrado.

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Tabla4 Límites de error permisibles en micropipetas

El valor de S(%) o coeficiente de desviación se puede deber a que el error aleatorio era significativo esto debido a que experimentalmente los valores obtenidos fueron tomados por diferentes personas del equipo lo que conlleva a un error mayor en cuanto a la toma de datos.Lo cual pudo influir en el valor de error sistemático es de igual manera , sin embargo aun considerando estos errores experimentales los resultados obtenido se encuentran sumamente fuera del rango esperado por la norma.

1.1.6. Conclusiones

Para el manejo de soluciones densas como el glicerol o para líquidos volátiles, es necesario seguir el protocolo de operación para asegurar tomar el volumen adecuado.El uso adecuado y la calibración de una micropipeta es un punto clave para asegurar la exactitud y precisión durante la toma de la muestra.

1.1.7 Referencias

E. Batista., L. Pinto,, E. Filipe,, &, (2006). Calibration of micropipettes: Test methods and un-certainty analysis. In Measurement (Vol. 40, pp. 338-342). doi:www.elsevier.com/locate/measurement

Eppendorf AG, SOP. (2013). Instrucciones del trabajo estándar para micropipetas. Retrie-ved from www.eppendorf.com/myeppendorf

Sica, A. , Constantino, P., Heijo, G., Fabretti, J. A G.antino, P., & Santo, C. G.antino, P, (2009). Evaluación del error debido a la evaporación en el método gravimétrico de calibración de micro pipetas. Revista del laboratorio tecnológico del Uruguay , 4, 15-18.

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1.2. Capacitación para el uso de espectrofotómetros y centrífugas.

1.2.1 Introducción

Espectrofotómetros

Espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una mues-tra, en función de la longitud de onda.

Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz característico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra vs soluciones es-tándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (solución incógnita).

Las ventajas de la espectrofotometría sobre otros métodos analíticos de laboratorio son varias: es rápida, precisa, versátil, fácil de usar y eficiente en costo.

La espectrofotometría se usa para diversas aplicaciones, como: análisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas, estandarización de colores de diversos materiales, detección de nive-les de contaminación en aire y agua, y determinación de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos.

Un espectrofotómetro típico posee cuatro componentes básicos: una fuente de radiación que tie-ne intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lámpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dis-persa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radia-ción que pasa por la muestra.

En general, los espectrofotómetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). El porcien-to de transmitancia se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. Una solución límpida, no absorbente (0 de absorbancia), mostrara una lectura de 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado.

Las determinaciones analíticas, basadas en el uso de un espectrofotómetro tienen como fundamento la ley de Lanbert-Beer. La ley también se conoce como ley de Beer-Lambert-Bouguer y fue descubierta de formas diferentes e independientes. Se puede decir que esta ley se trata de un medio o método matemático, el cual es utilizado para expresar de qué modo la materia absorbe la luz.

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Esta ley se puede expresar en términos de potencia de luz o de intensidad de luz, asumiendo luz monocromática, como:

It / I0 = 10 -ε bc

Donde It es la intensidad de luz transmitida por la muestra, I0 la intensidad de luz que incide sobre la muestra y que proviene de la fuente, ε el coeficiente de absortividad molar en unidades de M-

1cm-1, b es la longitud de la trayectoria del haz de luz a través de la muestra o el espesor de la celda en centímetros o lo que se conoce como paso óptico.

La relación It / I0 se conoce como transmitancia, T,

Porcentaje de transmitancia: % T = 100.It / I0

La luz absorbida sería I0 - It es decir la diferencia entre la intensidad de la luz incidente y la intensi -dad transmitida después de pasar a través de la muestra. A veces se expresa en forma porcentual en función de la transmitancia medida como :

Porcentaje de absorción = (Tblanco - Tmuestra. ) x 100 o absortancia.

Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relación It / I0 , entonces:

-log It / I0 = - log T o igual que log I0 /It = log I0 – log It

relación que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra.

La relación -log It / I0 = - log T recibe el nombre de Absorbancia y se designa por A.

Centrífugas

La centrifugación es un proceso de separación que utiliza la acción de la fuerza centrífuga para promover la aceleración de partículas en una mezcla de sólido-líquido. Dos fases claramente dis-tintas se forman en el recipiente durante la centrifugación:

El sedimento; generalmente no tiene una estructura uniforme.

El centrifugado o el concentrado que es el líquido flotante; a menudo claro, algunas veces nubla-do, debido a la presencia de las partículas coloidales muy finas que no se depositan fácilmente. Sin embargo puede también contener varias fases si el líquido intersticial de las mezclas contiene el elemento con diversas densidades, tales como aceites por ejemplo.

En un recipiente cilíndrico que rota a una velocidad angular w (rad/s) o N (rpm) y contiene un ani-llo de liquido de un radio significativo R (m), la aceleración centrifuga F c (m/s) a la que están some-tidas las partículas son:

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http://www.lenntech.es/centrifugacion.htm

http://www.lenntech.es/particulas-coloidales.htm



Fc = w2R = 0.011 N2R

La fuerza aplicable a cada partícula por unidad de peso viene expresada como:

Fc = 0.011 N2R (rs – rL) x 1/g = G (rs – rl),

con G = w2R / g = 0.11 N2R / 9.81 = 11.2 x 10-4 N2R

Donde rs : densidad de la partícularl : densidad del liquido intersticial

Los centrifugadores, o centrífugas, se encargan de la separación de las partículas mediante fuerza de aceleración gravitacional que se logra gracias a una rotación rápida. Este proceso puede provo-car la sedimentación o suspensión de las partículas o puede conseguir la fuerza necesaria para la filtración a través de algún tipo de filtro.

El método de separación es similar a la separación por gravedad. La fuerza motriz es mayor al ser resultado de la rotación del liquido: en el caso de la sedimentación, donde la fuerza motriz es el resultado entre las diferencias en densidad de las partículas sólidas y liquidas, la separación se logra con una fuerza del orden de 1000 a 20000 veces mayor que la gravedad.

Los centrifugadores de sedimentos fueron inventados para la separación entre líquidos y sólidas y para los sólidos no manejables. Pronto se llego a la conclusión de que este tipo de sistemas tiene una gran cantidad de aplicaciones adicionales desde la separación de sólidos e impurezas, hasta la separación de sólidos en líquidos.

1.2.2 Objetivos

Capacitar al alumno para el uso de equipos de laboratorio como lo son espectrofotómetros y

centrífugas.

Medir absorbancia de diferentes concentraciones de muestra para realizar una curva de cali -

bración.

1.2.3 MetodologíaMateriales, reactivos y equipos.

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Micropipetas (varios volúmenes) Puntas para micropipetas. Tubos eppendorf Celdas para espectrofotómetro Espectrofotómetro de luz visible y UV Centrífuga Colorante azul de tripano Agua destilada Tubos falcon de 50 mL Gradilla para celdas

Espectrofotómetros

Se mostró de forma teórica el protocolo de operación del espectrofotómetro. Se indicó la fuente de luz utilizada para los rangos de luz visible y ultravioleta.

Pasos:

1. Prender el espectrofotómetro y esperar a que se caliente entre 10 y 15 minutos.2. Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una CELDA

(o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia y a cero de absorbancia. 3. Posteriormente, se introdujo una celda con la muestra y se leyó la absorbancia a λ = 597 nm

La lámpara de deuterio es usada para medidas con longitud de onda dentro del rango visible, por otro lado las lámparas de tungsteno son usadas para mediciones en el rango de UV.

Consideraciones que hay que tener en el manejo:

Se debe llevar el equipo a cero después de cada muestra o si se cambia la longitud de onda. Dar al espectrofotómetro tiempo suficiente para que se caliente. Limpiar las celdas con papel liso y asegurarse de que las celdas no posean partículas, manchas

o huellas dactilares. Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo.

Centrífugas: Diagrama de flujo de los pasos (Centrífuga BECKMAN J2-MC)

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Consideraciones que hay que tener en el manejo y limpieza:

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta de control del equipo. Asegúrese de equilibrar los tubos de centrífuga (en peso) con la muestra u otra sustancia en

una balanza. Se tiene que limpiar las paredes internas de la centrífuga después de su uso para evitar conta -

minaciones. Se deben limpiar los rotores después de su uso para evitar que exista desequilibrio al momen-

to de usar la centrífuga nuevamente.

Diagrama de flujo de los pasos (Centrífuga HERMLE 2300)

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Para abrir mueva el interruptor a la posición ON y accione la palanca de apertura.

Para programar prima ROTOR e introduzca el número del tipo de rotor a usar.

Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm), verificando las velocidades máximas para cada rotor.

Oprima TIME y teclee el tiempo (h:min).

Oprima TEMP y teclee la temperatura (°C).

Al terminar la selección, oprima ENTER.

Para operar coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias (encontradas).

Coloque la tapa del rotor y cierre la centrífuga.

Permita que el equipo enfríe a la temperatura indicada antes de comenzar el programa.

Oprima el botón START para iniciar el programa (se puede abortar oprimiendo el botón STOP).



Consideraciones que hay que tener en el manejo y limpieza:

Antes de usar, siempre regístrese en la libreta u hoja de control del equipo. Para cambiar rotor utilice la llave del equipo. En caso de que, por alguna falla en el suministro eléctrico, la pantalla se muestre intermitente,

desconecte el equipo, espere unos segundos y conéctelo nuevamente. Proceda con la progra-mación.

Precaución al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla lentamente. Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que

los tubos encontrados tengan el mismo peso. Se tiene que limpiar las paredes internas de la centrífuga después de su uso para evitar conta -

minaciones. Se deben limpiar los rotores después de su uso para evitar que exista desequilibrio al momen-

to de usar la centrífuga nuevamente.

1.2.4 Resultados

Se midió la absorbancia de soluciones con diferentes concentraciones del colorante azul de

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Oprima el botón de apertura.

Para programar hay que mantener oprimido el botón preset.

Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla.

Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla.

Para operar coloque cada par de tubos equilibrados en peso en posiciones encontrada.

Coloque la tapa del rotor (si éste posee una) y cierre la centrífuga.

Oprima el botón start para iniciar el programa (puede parar oprimiendo el botón stop).



tripano, los resultados se muestran en la tabla x.

Tabla x. Absorbancias a 597nm las diluciones del colorante azul de tripano

Dilución Abs (597 nm)1:10 0.3861:20 0.2521:30 0.170

Gráfica x. Absorbancias a 597nm de las diluciones del colorante azul de tripano

1.2.5 DiscusiónEn el análisis espectrofotométrico ordinario se lee la absorbancia, pues ésta es directamente proporcional a la concentración, si se cumple la ley de Lambert-Beer (Walton et. al, 1983).

En la Tabla 1 se observa una disminución en la medida de la absorbancia de las diluciones realizadas, conforme disminuye la concentración del colorante azul de tripano. Lo anterior concuerda con la ley de Lambert-Beer.

1.2.6 ConclusionesLa disminución de las lecturas de absorbancia es directamente proporcional a la concentración del colorante azul de tripano.

1.2.7 Bibliografía Duymovich, C., Acheme, R., Sesini, S., & Mazziotta, D. (2005). Espectrofotómetros y fotoco-

lorímetros guía práctica de actualización. Acta bioquím. clín. latinoam. v.39 n.4

Walton, H. F., & Reyes. (1983). Análisis químico e instrumental moderno. España: Reverte.

Díaz N, Bárcela J. A., Fernández E., et al.(2008). Cap. 8. Espectrofometría: Espectros de ab-sorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. España: Campus Universitario de Rabanales: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Recuperado de http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf

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1.3 Preparación de reactivos requeridos en el laboratorio de Bioconversiones

1.3.1 Introducción.

Todos los reactivos y soluciones que se usan en el análisis biotecnologo para realizar las pruebas descriptas en las practicas, tanto de principios activos como de productos formulados deben ser preparados a partir de material de calidad o grado analitico.

Los reactivos son sustancias empleadas como tales o como elementos constitutivos de soluciones y se emplean para la realización de las pruebas y valoraciones, los reactivos especiales son los que se utilizan en una prueba en particular y su preparación se encuentra descripta junto con dicha prueba.

Por otro lado los Indicadores son reactivos empleados para determinar el punto final de una reacciónn quimica, para medir la concentración n de ion hidrogeno (pH) o para indicar un cambio de pH. Se enumeran junto con los indicadores.

Las soluciones reguladoras son soluciones reguladoras de pH, soluciones Colorimétricas- Son soluciones empleadas en la preparación de estándares colorimétricos para comparación, se abrevian (SC).

Las Soluciones de Reactivos son soluciones de reactivos en solventes y concentraciones definidos, apropiados para los fines especificados, se abrevian (SR).

Las soluciones volumétricas son soluciones de reactivos de concentración conocida, empleadas principalmente en determinaciones volumétricas. Las concentraciones se expresan generalmente en función de la normalidad, se abrevian (SV).

1.3.2 Objetivos.

Conocer la importancia del reactivo a preparar, identificando el tipo de reacción que genera cuando se homogeniza con otras sustancias, así como sus aplicaciones a nivel laboratorio.

fomentar las condiciones de operación para cada reactivo, tomando en cuenta, las técnicas básicas teóricas hasta la última referencia escrita sobre él.

Saber realizar los cálculos de preparación, y conocer las técnicas adecuadas de preparación y almacenamiento de los reactivos.

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1.3.3Metodología

Reactivo de Bradford

Se disolvieron 100 mg de azúl brillante de Coomasie G-250 en 50mL de etanol al 95%. A esta solución se le añadieron 100mL de ácido fosfórico al 85%(w/v). La solución resultante se diluyó a un volumen final de 1L. Una vez terminado el reactivo se verifico que su color fuera café. Las concentraciones finales en el reactivo fueron 0.01%(w/v) de azúl brillante de Coomasie G-250, 4.7% de etanol y 8.5%(w/v) de ácido fosfórico.

Reactivo DNS

Se disolvieron 30g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada has obtener un volumen final de 50mL. Se agregaron 1.6g de NaOH previamente disueltos en 10mL de agua destilda, a continuación se añadió 1g de DNS previamente disuelto en 20mL de agua destilada. Se aforó la solución a 100mL y se guardó en obscuridad en frasco ámbar.

Solución de almidón 1%(p/v)

Se suspendió 1g de almidón en 100mL de regulador de fosfatos 0.1M con pH 7.0, posteriormente se desnaturalizó calentando en baño de agua a 60 C durante 15 min.

Solución de acetatos 0.05M

Se disolvieron 5.103g de acetato de sodio en 750mL de agua destilada y 1.5mL de ácido acético en 500 mL de agua destilada. Se añadió cuanto fue necesario hasta alcanzar un pH 5 de la solución de ácido acético a la solución de acetato de sodio.

Solución de fosfatos 0.01M

Se disolvieron 20.106g de fosfato dibásico de sodio en 750mL de agua destilada y 6.9g de bifosfato de sodio en 500 mL de agua destilada. Se añadió cuanto fue necesario hasta alcanzar un pH 7 de la solución de bifosfato de sodio a la solución de fosfato dibásico de sodio.

Descripción del reactivo.

Reactivo de Bradford.

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias

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interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

Reactivo del ácido 3,5-Dinitrosalicílico (DNS)

Químicamente se trata de un anillo bencénico tetrasubstituido por dos grupos nitro, un hidroxilo y un carboxilo, Se utiliza en laboratorios de análisis clínicos como reactivo de identificación de azúcares reductores.

Solución de almidón.

El almidón se utiliza a menudo en la química como un indicador para valoraciones redox triyoduro donde está presente. El almidón forma un complejo azul-negro muy oscuro con triyoduro que puede hacerse por el yodo con yoduro de mezcla.

Solución de alfa-amilasa.

La alfa-amilasa degrada el almidón en una mezcla de disacáridos: maltosa, maltotriosa trisacárido (la cual contiene dos α (1-4)-residuos de glucosa) y oligosacáridos conocidos como dextrinas, que contienen la α (1-6)- ramas de glucosa.

Solución de antrona.

Es una solución reguladora, con aplicaciones variadas, ya sea actuando sola o con múltiples componentes en homogenización, así como los reactivos mencionados.

Memoria de cálculo.

Para la realización de solución de antrona.

Disolver 0.2 antrona en 5mL de etanol y aforar a 100mL con H2SO4 al 75%

Cálculos de acetatos. Preparación de reactivos.

136.08gr--------1M—1L 60.05mL------1L---1M

6.804gr--------0.05M—750mL 30.025mL-----1L---0.5M

X=5.103gr de acetato de sodio en 750mL X1=1.5mL de acido acético en 500mL

Se prepara tanto el acetato como el ácido acético luego se llevó el acetato a PH 7, utilizando el ácido ac.

18

http://es.wikipedia.org/wiki/Oligosac%25C3%25A1ridos

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Maltotriosa_trisac%25C3%25A1rido&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Maltotriosa_trisac%25C3%25A1rido&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Maltosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Disac%25C3%25A1ridos

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Alfa-amilasa&action=edit&redlink=1



1.3.4DiscusiónUn método rápido y exacto para la estimación de la concentración de proteínas es esencial en muchos campos de estudios como la caracterización y purificación de proteínas y enzimas, estudio de la expresión de una proteína y diagnóstico clínico.Bradford se ha vuelto el método preferido en los laboratorios debido a su mayor rapidez y sensibilidad, la buena técnica en la preparación de reactivos, mostró resultados viables en las siguientes prácticas.

Según el método Miller, los azúcares reductores pueden reducir el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que entran en contacto, con él se desarrolla un cambio de color parecido al café. El cambio de coloración puede entonces determinarse por lecturas de densidad óptica, leídas por espectrofotometría a una determinada longitud de onda que se realizaron en las prácticas siguientes.

1.3.5 Conclusiones Se realizarón los cálculos correspondientes para la elaboración de los reactivos descriptos.En el laboratorio de bioconversiones se usa el reactivo de Bradford para la cuantificación de proteínas.En el laboratorio de bioconversiones se usa el reactivo DNS para la cuantificación de azúcares reductores.

1.3.6BibliografíaBailey (1998) “Applied Microbiology and Biotechnology” Volumen 29 VTT, Biotechnical Laboratory, Tietotie 2, SF-02150, Espoo, FinlandKruger (1994) “Basic Protein and Peptide Protocols Methods in Molecular Biology” Volumen 32, University of Hertfordshire.

19



1.4 Determinación de crecimiento celular por turbidimetría o Densi-dad óptica (D.O), peso seco y cuenta directa en cámara de Neubauer.

1.4.1 IntroducciónExisten diversas técnicas para medir la cantidad de células de un cultivo, cada una de las cuales presenta una serie de ventajas y desventajas con respecto a los demás, pero por lo general todas reportan datos que se aproximan a la realidad (con mayor o menor ex-actitud.

La biomasa es un parámetro crítico y difícil de medir en distintos procesos. Es importante debido a que es una variable clave para optimizar un proceso específico, o para llegar a una eficiencia máxima para obtener un cierto producto (un antibiótico). Hay diversos métodos para la cuantificación de biomasa. Estos métodos deben ser rápidos, y si es posible, en tiempo real

Métodos directos de determinación de biomasaEl peso seco es el método más ampliamente aplicado para la estimación de biomasa. También se utiliza como un método de referencia. La densidad celular se puede cuantificar en gramos de peso seco, o como número de células viables / células muertas por mL. Las células en una muestra pueden ser separadas del caldo bien por centrifugación o bien por filtración y pesadas mientras estén completamente secas.La medición de peso seco por lo general da un resultado muy consistente. El método es simple pero laborioso y tardado. A pesar de ser un método ampliamente usado puede ser erróneo si el caldo contiene otro material insoluble como se encuentra comúnmente en un fermentador. Además, estos métodos no pueden distinguir de las células viables de las células muertas.El Peso húmedo Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intracelular y contribuye al peso total de la masa.

Cuenta directa en cámara.El recuento se realiza en una cuadrícula central de la cámara que se multiplica por la profundidad, obteniéndose un número de microorganismos por unidad de volumen. La cámara de Neubauer es una cámara adaptada al microscopio, se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro en donde se encuentra grabada una retícula cuadrada.

La retícula mide 3mm x 3mm de lado, subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de lado cada uno.

El recuento en cámara no es completamente exacto por las irregularidades en la distribución de la muestra. Por otra parte, pueden confundirse las células con otras formas

20

Ilustración 2Detalle de una rejilla de una cámara de Neubauer.



contenidas en el medio; además no permite distinguir entre células vivas de células muertasMétodos indirectos de determinación de biomasa

Dispersión de la luzCuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida.Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.

Densidad óptica.La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. La densidad óptica o turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos unicelulares puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz. Las muestras a determinar son generalmente traslúcidas cuando no presentan crecimiento microbiano

1.4.2. Objetivos

Conocer y diferenciar las técnicas más utilizadas para la cuantificación de biomasa microbiana.

Determinar el contenido de biomasa presente en una muestra de levadura por métodos directos e indirectos

Determinar la biomasa en peso seco y mediante técnica de turbidimetría correlacionando los datos

1.4.3Materiales y reactivos. Micropipeta 2µL - 20µL Micropipeta 20µL - 200µL Micropipeta 100µL - 1000µL Centrífuga Balanza analítica Espectrofotómetro Microscópico Cámara de Neubauer Puntas para micropipetas Charolas de aluminio Tubos eppendorf Agua destilada

21



1

.4.4. MetodologíaDensidad óptica (D.O.)Se empleó una muestra de levadura de panadería, a partir de la cual se realizaron diluciones para obtener un intervalo de lectura de densidad óptica menor a 1.

6. Se realizaron diluciones: 1:100, 1:200, 1:400 1:500 con muestra cultivo de levadura.7. Se preparó el espectrofotómetro para leer muestras a 600 nm.8. Se utilizó como blanco una muestra de aproximadamente 1 mL. de medio sin inoculo.9. Después se obtuvo la densidad óptica de cada muestra (1mL de cada dilución) a 600 nm.10. Para realizar la curva de calibración (D.O. vs dilución) se tomaron muestras con lecturas de absorbancia menores a

1.

Camara de NeubauerPara la cuenta directa en cámara de Neubauer, se tomó un volumen de muestra celular, posteriormente se realizó una dilución, se colocó 0.1 mL de la muestra de ultima dilución entre la cámara y el cubreobjetos, que por efecto de capilaridad, toda la cámara se cubrió de muestra. Se observó la cámara con muestra al microscopio, el cual, para localizar las divisiones de ésta, fue necesario utilizar el objetivo de 10x y posteriormente, para observar el número de células, se cambió el objetivo a 40x; donde seguidamente se procedió a realzar un conteo de células individuales vistas por cuadrante. Se realizó el cálculo necesario y se reportó el resultado en Cel. /mL.

Peso seco.1. Se etiquetaron las charolas de aluminio y se pesaron en la balanza analítica.2. Se colocó sobre las charolas el volumen a diluir de levadura directo correspondiente a las diluciones: 1, 1:2, 1:4,

1:8, 1:16, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250.3. Se dejaron en una estufa a 1000C, lo que quemo la pastilla, se enfrió en el desecador, y se peso.4. El peso seco se obtuvo de la diferencia entre el peso inicial y final de cada charola.

1.4.5. ResultadosDensidad óptica (D.O.)

D.O. A 600nm

1:100 1.114

1:200 0.529

1:400 0.232

1:500 0.185

Peso seco.

22

Figura 1 . “Densidad óptica vs dilución” se eliminaron los datos donde la ab-sorbancia resulto >1.

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 A 600nm

A 600nm

Dilución

Abso

rban

cia

F

Dilución Charola (g)

Peso inicial (g)

Peso final (g)

1:02 13.424 14.84 0,17451:04 13.240 14.285 0,10411.8 13.195 13.675 0,04995

1:16 13.284 13.382 0,017951:50 13.595 13.690 0,0089

1:100 13.202 13.243 0,003751:150 13.252 13.274 0,0021:200 13.252 13.265 0,001151:250 13.277 13.288 0,00075



Tabla 3. Cálculo de peso seco

Dilución Peso seco mg/mL

1:2 17,451:4 10,411.8 4,995

1:16 1,7951:50 0,89

1:100 0,3751.150 0,21:200 0,1151:250 0,075

En soluciones diluidas es posible hacer una correlación entre un método directo y uno indirecto (peso seco y densidad óptica) graficando D.O a 600 nm vs peso seco.

Camara de Neubauer El resultado de la cámara de neubauer es de 1 x108 Cel. /mL.

23

Se realizó el cálculo de pesos seco considerando que se realizaron diluciones para un volumen final de 10 ml. La Tabla 3 muestra los resultados:

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

2

4

6

8

10

12

f(x) = NaN x + NaNR² = 0 D.O vs Peso Seco

D.O vs Peso SecoLinear (D.O vs Peso Seco)

Peso seco

Dens

idad

Opti

ca

Figura 2 . “Correlación entre un método directo y un meto indirecto”.



1.4.6 Discusión• Se obtuvieron estimaciones que no pueden ser del todo correctas, ya que se cometieron errores en el procedi-

miento, al dejar a temperaturas de 1000C las charolas con muestra, (siendo lo recomendable 650C-48 h ó 800C-24h), provocando que las muestras se algunas muestras se quemaran, razón que puede causar variación en los resultados. Tabla 4.

• El peso seco obtenido a partir de una muestra (mg/mL), es una técnica útil para volúmenes grandes de muestra ya que diferencias en orden de miligramos representan un gran número de células.

• Esta relación directa entre absorbancia y peso seco sólo aplica para soluciones diluidas que no pueden tener una absorbancia mayor a 1, ya que valores mayores producen desviaciones y comportamientos no lineales que no se podrían evaluar de esta manera.

• Por otro lado el usar diluciones muy pequeñas puede involucrar más errores, debido a problemas de manejo de equipo como en el pipeteo, y menor sensibilidad en el espectrofotómetro por el bajo nivel de absorción.

• Los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado

• La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado

1.4.7 Conclusiones• La técnica de peso seco es un método simple, pero si se realiza de manera correcta consume bastante tiempo y

es poco reproducible.

• La principal desventaja “peso seco” es que durante su determinación no solo se incluyen microorganismos acti-vos, sino también, células muertas, material inerte y materia orgánica absorbida esto genera que la determina-ción de masa microbiana no sea exacta.

• Componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir degradación.

• La turbidimetría (Densidad Óptica) no es un método útil para medir la biomasa de suspensiones para un número relativamente pequeño de bacterias y o levaduras, esto por que según Rodríguez, et al (2005), señala que para que sean visibles trazas de turbidez es necesario más de un millón de células por mililitro para ser medida por un espectrofotómetro.

• La relación directa entre absorbancia y peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas con una absorbancia<1.

1.4.7 Referencias

Arnàiz C., I. (2003). Determinación de biomasa en procesos biológicos. Escuela su-perior de agricultura de Barcelona.

24



Barer, M. R., and Harwood, C. R. 1999. Bacterial viability and culturability. Adv. Mi-crob. Physiol.(Vol 41, pp 93–137).

Bratbak, G. 1985. Bacterial biovolume and biomass estimations. Appl.Environ. Mi-crobiol. (Vol 49, pp 1488–1493).

C. l., Felice. (2005). Microbial biomass estimation. Critical Reviews in Biotechnol-ogy,(Vol 112,pp 25-95).

Rodrìguez, E. (2005). Principios y prácticas de laboratorio.Bacteriología General, doi: Universisdad de Costa Rica.

Sica, A. , Constantino, P., Heijo, G., Fabretti, J. A G.antino, P., & Santo, C. G.antino, P, (2009). Evaluación del error debido a la evaporación en el método. Revista del laboratorio tecnológico del Uruguay , 4, 15-18.

25

1.5 Determinacion de azucares reductores

1.5.1Introducción

Los azucares con aldehídos libres o un grupo cetónico como glucosa, fructosa y lactosa los cuales presentan un carbono libre en una estructura y pueden reducir en determinadas condiciones a las sales cúpricas a esos azúcares se les conoce como azucares reductor (Martínez, 2000). Los azucares reductores se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)6

3- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Gracias a esto este tipo de azucares se pueden determinar cuantitativa o cualitativamente . (Ting, 1956)El método DNS, también llamado técnica de Miller es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrolisis de polisacáridos presentes en una muestra, básicamente lo que sucede es que el ácido 3,5 dinitrosalicílico es reducido a acido 3 amino 5 nitrosalicílico mientras que los grupos aldehído aparecen para oxidar los grupos carboxilo (Miller, 1959)El reactivo ácido dinitrosalicílico descubierto por Summer y colaboradores para la determinación de azúcares reductores está compuesto por ácido dinitrosalicílico, sal de Rochelle (tartrato sódico potásico), fenol, bisulfato de sodio e hidróxido de sodio. De acuerdo a los autores, la sal de Rochelle es adicionada para evitar la disolución de oxígeno en el reactivo, el fenol incrementa la cantidad de color producido y el bisulfato estabiliza la calidad del color obtenido, así mismo, se requiere el álcali para la acción reductora de la glucosa en el ácido dinitrosalicílico. El mayor defecto de la prueba DNS recae en la perdida de una parte del azúcar reductor analizado. (Miller, 1959)Es importante recalcar que, para poder disolver el ácido dinitrosalicílico, el hidróxido de sodio deberá estar completamente disuelto. Una vez preparado el reactivo deberá almacenarse en un recipiente color ámbar, a temperatura ambiente. Dura aproximadamente un mes. (Martínez, 2000)Por otro lado, es importante mencionar que si se utiliza un método espectrofotométrico para cuantificar la concentración de analito presente en una muestra problema, es necesario relacionar la concentración de dicho analito con la cantidad de luz que absorbe el haz que le incide. Sabiendo que ésta es una relación aproximadamente lineal, lo más recomendable es preparar una solución estándar, con una concentración conocida de analito y hacer diversas diluciones de la misma, para poder obtener dicha relación y expresarla matemáticamente con la ayuda de la ecuación de la recta y=mx +b. En este caso, m, será la pendiente de esta recta, “b” la ordenada al origen, “x” la concentración de analito y “y” la absorbancia observada para cada concentración. La técnica de DNS cuantifica, como máximo una concentración de azúcar de un mg/ml. Por lo tanto, la solución estándar deberá tener esa concentración. (Martínez, 2000)Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática (Martínez, 2000).

22



1.5.2 Objetivos

Conocer la metodología para realizar el método de Miller (DNS) para cuantificar azucares reductores.

Verificar la sensibilidad del método para cuantificación de azúcares reductores. Realizar una curva de calibración de absorbancia vs concentración de azúcares reductores.

1.5.3 Metodología

Materiales y reactivos

Agua destilada Reactivo DNS Solución de maltosa de 2g/L Micropipeta de 20 - 200 µL Micopipeta de 200-1000 µL Espectrofotómetro Parrilla Recipiente para calentar agua Flotador Tubos Eppendorf Agua corriente Hielo Un contenedor

Determinación de azúcares reductores a 540nm

1. Se realizó por triplicado una curva patrón de maltosa de 0 a 1.8 g/L tal como de muestra en la tabla 1

2. Por cada muestra se adicionó 0.1mL de reactivo DNS a tubos Eppendorf por triplicado.3. Se agregó 0.1 mL de muestra problema a cada tubo por duplicado.4. Se cerraron los tubos Eppendorf y se sometieron a baño maría por 5 minutos.5. Los tubos fueron colocados en un baño de hielo hasta enfriar.6. Fue sumado 1mL de agua destilada a cada tubo.7. Se homogenizaron las muestras.8. Con el blanco (agua destilada +DNS) el espectrofotómetro se ajustó a 540nm y se procedió a leer

las muestras a ésta longitud de onda.

23



Tabla 2 Diluciones para la curva patrón de maltosa

Se realizó una curva patrón en la que se observó el comportamiento de la absorbancia en función de la concentración. Obteniéndose una ecuación que describiera el comportamiento lineal de dicha gráfica

1.5.4 ResultadosAjustando la longitud de onda a 540nm cada una de las muestras para realizar la curva tipo fue leída, obteniéndose los resultados que se

muestran en la tabla 2.

No de muestra

Concentración de maltosa

[g/L]

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

Promedio

1 0 -0.08 -0.022 -0.002 -0.0352 0.2 0.027 0.031 0.013 0.0243 0.4 0.092 0.09 0.096 0.0934 0.6 0.228 0.192 0.198 0.2065 0.8 0.148 0.162 0.101 0.1376 1 0.273 0.294 0.278 0.2827 1.2 0.398 0.394 0.334 0.3758 1.4 0.483 0.355 0.407 0.4159 1.6 0.491 0.457 0.574 0.507

10 1.8 0.477 0.529 0.572 0.526

Haciendo uso de la absorbancia y siendo conocidas las concentraciones de cada muestra se realizó una gráfica para verificar el comportamiento de la absorbancia en función de la concertación, para obtener

24

Tubo

Concentración de

maltosa en la muestra

(g/L)

Vol. de la

solución de

maltosade 2g/L

(mL)

Volumen de agua

destilada (mL)

1 (blanco

)0.0 0.00 1.00

2 0.2 0.1 0.93 0.4 0.2 0.84 0.6 0.3 0.75 0.8 0.4 0.66 1.0 0.5 0.57 1.2 0.6 0.48 1.4 0.7 0.39 1.6 0.8 0.2

10 1.8 0.9 0.1



una mejor tendencia no se tomaron en cuenta las muestras 3 y 5 pues se comportaban de la manera esperada y poder así realizar una curva patrón adecuada que será necesaria para la cuantificación de azucares reductores para prácticas futuras.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.319568725653868 x − 0.0240378408458542R² = 0.989026384936073

Curva de calibración DNS

Concentración de maltosa(g/L)

Abso

rban

cia a

540

nm

Figura 1 Curva de calibración de DNS, en ésta gráfica se muestra el comportamiento de la absorbancia en función de la concentración de la muestra.

De acuerdo con la ecuación que se obtuvo al realizar la regresión lineal de los datos obtenidos experimentalmente de absorbancia vs las concentraciones propuestas para la determinación de azúcares reductores se tiene:

|¿|0.3196 x−0.024Dónde Abs= Absorbancia x= concentración de maltosa en la muestraEntonces, con el promedio de las absorbancias obtenido gracias a las lecturas realizadas por duplicado de cada muestra, se puede conocer la concentración de azucares reductores en cada muestra realizando un simple despeje de la ecuación anterior

x=|+0.024|0.3196

1.5.5 Discusión

La Espectrofotometría es una de las técnicas analíticas más utilizadas ya que se puede determinar la cantidad de azucares en una muestra de estudio ,comparándola después con la radiación absorbida por un blanco .En este caso, es de gran utilidad para poder determinar la cantidad de azucares reductores disueltos en una muestra, midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma.

25



La base en la determinación de azucares reductoras por este método es la reacción de esos carbohidratos con reactivos como el DNS que forman un complejo coloreado que puede ser detectado y cuantificado en un espectrofotómetro. La formación de ácido 3-amino-5-nitrosalicílico resulta en un cambio en la cantidad de luz absorbida, a longitud de onda 540 nm. La absorbancia medida es entonces, directamente proporcional a la cantidad de azúcar reductor, lo cual se puede observar en la figura 2. Según la bibliografía consultada la técnica DNS cuantifica como máximo una concentración de 1mg/mL de azúcares reductores sin embargo, en nuestro caso las lecturas de absorbancia fueron menores a uno hasta la concentración de maltosa correspondiente a 2g/L, por lo que no fue necesario hacer diluciones, ya que esto no concuerda con los datos bibliográficos se cree que el problema de las lecturas fue debido al espectrofotómetro que se empleó durante la práctica. Para la realización de la gráfica mostrada en la figura 2 se graficó la absorbancia I vs la concentración de cada muestra problema, debido a que como se muestra en la tabla 2 los puntos 3 y 5 varían significativamente al comportamiento de los demás datos obtenidos se optó por retirarlos de la gráfica para de esta manera obtener una mejor R2; Esta variación en las muestras 3 y 5 la atribuimos a un error de tipo sistemático ,ya que el triplicado no fue realizado por la misma persona, además de que la homogenización de la muestra pudo no ser la adecuada y por tanto dar fallas en las mediciones Es conveniente mencionar que ésta gráfica fue elegida debido a que se realizaron regresiones lineales de las gráficas en que fue graficado el promedio de absorbancias vs concentración y tres más con las absorbancias vs la concentración, sin embargo estas gráficas fueron descartadas debido ya que aún eliminando los puntos 3 y 5 no se pudo alcanzar un coeficiente de correlación mejor al que se presenta en la gráfica de la figura el cual fue de 0.989.

Según Vinagre en cualquier método analítico si la pendiente es empinada en una curva patrón, el método posee alta sensibilidad y si la pendiente es poco empinada, el método posee una baja sensibilidad, comparando la pendiente obtenida (figura 2) con la figura 3 se puede observar la alta sensibilidad del método para determinar azúcares reductores mediante DNS debido a que la pendiente que se obtuvo es empinada. (Vinagre, 2002).

26



Figura 2 Respuesta en función de la concentración del analito: Atributos de los métodos (Vinagre, 2002)

1.5.6 Conclusiones

El método de determinación de azucares reductores usando DNS es una técnica sencilla y rápida, que permite la cuantificación de éstos compuestos con facilidad.La realización de un triplicado en cualquier método analítico es de suma importancia, pues esto ayuda a verificar la reproducibilidad del ensayo, sin embargo, cuando los resultados que se obtienen no son los esperados, es importante identificar las posibles causas del error, así como tomar decisiones en base a los resultados que se obtienen.La importancia de una curva de calibración recae en el hecho de que al conocer alguna de las variables implicadas en dicha curva, se puede determinar con suma facilidad la variable que se desconoce.El uso adecuado del equipo, así como el correcto funcionamiento del mismo determina en gran medida los resultados que se obtienen al desarrollar un experimento.

1.5.7 Referencias

Martínez, A. (2000). DNS: Una técnica de cuantificación de azúcares reductores. TECNOCULTU-RA, 7-9. México [En línea] disponible en: http://es.scribd.com/doc/14424586/DNS-una-tecnica-para-la-cuantificacion-de-azucares-reductores

Miller, G. L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Redicing Sugar. Analitich Chemistry , 426-428. USA [En línea] disponible en: http://46.38.63.192/mail/lg.php?doi=10.1021/ac60147a030&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMy8xMC4xMDIxL2FjNjAxNDdhMDMwLnBkZg%3D%3D

27



Ting, S. (1956). Rapid Colorimetric Methods for Simultaneus Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices . USA: Food Chem.

Vinagre, J. (2002). Calidad de Métodos Analíticos. FAO, 137-145. [En línea] disponible en: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ah833s/AH833S07.pdf

1.6. Determinación de la concentración de proteína de las enzimas elegi-das.

1.6.1 Introducción

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

El método que se empleó durante estas prácticas se basa en un principio diferente: se emplea un colo -rante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contami-nantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm.

28



Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovino (BSA).

La determinación de las cantidades de microgramos de proteína en el ensayo de azul brillante de Coomassie Blue G-250 Bradford se lleva a cabo por medición de la absorbancia a 595 nm. Este ensayo es sensible (1-15 μg), permite la cuantificación de proteínas rápida y sencilla en los lisados celulares, fracciones celulares, o muestras de proteínas recombinantes, con el propósito de la normalización de las mediciones bioquímicas. Sin embargo, una no linealidad intrínseca compromete la sensibilidad y la precisión de este método (Bradford MM, 1976).

1.6.2 Objetivos

Determinar la concentración de proteína de una solución enzimática a través del método colorimétrico de Bradford.

Estandarizar el método de Bradford a partir de la elaboración de una curva estándar de Albúmina de suero bovino (BSA).

1.6.3 Metodología

Materiales, reactivos y equipos

Micropipeta 1µL - 10µL Micropipeta 2µL - 20µL Micropipeta 20µL - 200µL Micropipeta 100µL - 1000µL Espectrofotómetro Puntas para micropipetas Tubos Eppendorf con rosca Agua destilada BSA Solución de Bradford Celdas para espectrofotómetro Gradilla para celdas Tubo falcon de 15 mL forrado con papel aluminio

Método de Bradford

1. Se prepararon diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 µg/ml como se muestra en la tabla X.

Tabla X. Concentraciones de BSA para lecturas a 595 nm

(BSA) 200 μg/mL (mL) 0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225

0.25

29



Agua destilada (mL) 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025

0.0

Concentración de BSA (μg/mL)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2. Se adicionó a cada tubo eppendorf los volúmenes estandarizados en la Tabla X, obteniendo un volumen final de 0.25 mL en cada tubo. Cada dilución se realizó por triplicado.

3. Se adicionó 0.75 mL del reactivo Bradford a cada tubo para obtener un volumen final de 1 mL en cada tubo.

4. Posteriormente se dejó reposar la solución por 5 minutos .

5. Se leyó la absorbancia a 595 nm.

1.6.4 Resultados

Método de Bradford

Se realizaron lecturas por triplicado a distintas muestras de concentración conocida, tomando como blanco para calibrar la curva estándar: 0.25 mL de agua destilada y 0.75 mL de reactivo de Bradford. Se obtuvieron los datos de la Tabla X, los cuales se usaron para elaborar la curva estándar que sirve para determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford.

Tabla X. Lecturas de absorbancia a 595 nm

Concentración de BSA (µg/mL)

Absorbancia (A)Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Promedio

0 0 0 0 020 0.260 0.182 0.190 0.21040 0.428 0.340 0.550 0.43960 0.674 0.632 0.666 0.65780 0.738 0.759 0.760 0.752

100 0.773 0.810 0.972 0.851120 0.810 0.888 0.835 0.844140 0.838 0.886 0.777 0.833160 0.817 0.899 0.834 0.850

30



180 0.849 0.827 0.910 0.862200 0.839 0.856 0.846 0.847

Obteniendo la ecuación de la regresión lineal:

0 50 100 150 200 2500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1f(x) = 0.00387136363636364 x + 0.262712121212121R² = 0.727593634381541

Concentración de BSA (µg/mL)

Abso

rban

cia (A

)

Se eliminaron algunos datos debido a que en la grafica de la regresión lineal original se percibe que las ultimas concentraciones tienen una absorbancia muy similar. Quedando de la siguiente manera:

0 20 40 60 80 100 1200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9f(x) = 0.00871619047619048 x + 0.0494126984126985R² = 0.970127610517859

Concentarción de BSA (µg/mL)

Abso

rban

cia (A

)

Figura X. Curva estándar de BSA para determinación de proteínas por el método de Bradford.

31



y = 0.008x + 0.049Donde: y= absorbancia, x= concentración de BSA

1.6.5 Discusión

El rango de sensibilidad de U.V. con respecto al método de Bradford para determinar la concentración de proteína se usaron concentraciones de 0 – 200 μg/mL para la curva estándar del ensayo.

Sin embargo, una no linealidad intrínseca compromete la sensibilidad y la precisión del método de Bradford, es decir, hay un grado de curvatura en un amplio intervalo de concentraciones de proteína en la curva estándar de BSA a una λ=595. Por lo tanto, solo es posible utilizar una estrecha gama de concentraciones relativamente altas de proteína (2-10 mg/mL de BSA); a estas concentraciones se garantiza un ajuste de regresión lineal mejor (Ernst O., 2010).

La no linealidad representa un inconveniente cuando las cantidades de microgramos de proteína no están disponibles en la curva estándar, y que a menudo requiere múltiples diluciones de las muestras desconocidas.

La fuente de la no linealidad está en el propio reactivo, ya que hay un solapamiento en el espectro de las dos formas diferentes de la coloración del colorante (Bradford, 1976).

Existen tres formas del azul brillante de Coomassie que está en equilibrio ácido-base con el pH ácido habitual del ensayo. Las formas de color rojo, azul, y verde tienen máximos de absorbancia a 470, 590, y 650 nm, respectivamente. El azul es la forma que se une la proteína, formando un complejo que absorbe intensamente la luz a 595 nm.

El método de Bradford de cuantificación de proteínas está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína (Bradford, 1976).

32



Estructura química del azul de Comassie.

Algunas ventajas y/o desventajas del método de Bradford son: La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos. El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es imprescindible

para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas. La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo permanece estable

durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el ensayo.

Se pueden utilizar un gran número de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automati -zación.

Las interferencias o no existen o son mínimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohi -dratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes fuerte-mente alcalinos (fácilmente solucionable con la utilización de buffers).

1.6.6 Conclusiones

El método colorimétrico de Bradford, es un ensayo sencillo y de relativa sensibilidad debido al inconveniente de la presencia de detergentes o sales que interfieren con la interacción del complejo proteína-colorante.Existe una curvatura grande en la gráfica original de la regresión lineal, por lo tanto se eliminaron estos últimos datos que la ocasionan. La segunda gráfica, que fue una modificación de la primera, se muestra con una ecuación mucho mejor.

Referencias

Bradford MM (1976). Un método rápido y sensible para la cuantificación de cantidades de microgra-mos de proteína utilizando el principio de la proteína de unión de colorante. Anal Biochem. 72, 248-254.

Ernst, O., Zor, T (2010). Linealización del ensayo de proteínas Bradford. J. Vis. Exp. (38), e1918.

Zor T, Selinger Z (1996). Linealización del ensayo de proteínas de Bradford aumenta su sensibilidad: estudios teóricos y experimentales. Anal Biochem. 236, 302-308.

33

http://4.bp.blogspot.com/-hWYjZQDY5_E/Tvp0fbz1QUI/AAAAAAAAAQs/mu3YgQrxfH0/s1600/Nueva+imagen+(2).png



1.7.1 IntroducciónLas amilasas (E.C. 3.2.1.1) se encuentran entre las enzimas más importantes y de gran significado para la industria biotecnológica, constituyendo toda una clase de enzimas industriales teniendo entre el 20-30% del mercado mundial de enzimas (Azad et al. 2009; Rajagopalan & Krishnan 2008). El término amilasa fue usado originalmente para designar a una enzima extracelular capaz de hidrolizar enlaces -1,4-glucosidicos en polisacáridos contenedores de 3 o más unidades de glucosa 1,4- ligadas como se describe en la ilustración 1. La enzima actúa en almidón, glicógeno y polisacáridos de manera aleatoria liberando grupos reductores.

La enzima actúa en almidón, glicógeno y polisacáridos de manera aleatoria liberando grupos reductores. Estas enzimas se encuentran tanto en organismos eucariontes como procariontes. Son de gran valor en distintas aplicaciones biotecnológicas desde alimentos, fermentaciones, textiles e industria papelera (Deb,Talukdar, Mohsina, Sarker, & Sayem, 2013)

1.7.1Materiales y método Micropipeta 1µL - 10µL Micropipeta 20µL - 200µL Micropipeta 200µL - 1000µL Puntas para micropipetas Balanza analítica Tubos eppendorf Espectrofotómetro Celdas para espectrofotómetro (uv y visible) Solución de almidón 1% p/v Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS α-amilasa Reactivo de Bradford

34

1.7 Medición de la actividad catalítica de enzimas: amilasas

• Ilustración 1. Reacción catalizada por alfa-amilasa.



1.7.2 Objetivos Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa

Calcular las unidades de actividad enzimática.

1.7.3 Metodología

• En un tubo epperndorf de 1.5 mL se agregaron 950 L de solución de almidón al 1% p/v a temperatura ambiente (23°C) posteriormente se adicionaron 500 L de solución de amilasa exceptuando al testigo.

• Se agregó solución de almidón al 1% p/v inmediatamente se tomaron 100 L de la mezcla de reacción para colocarse en otro tubo eppendorf con 100 L de reactivo DNS para detener la reacción

• Este procedimiento se realizó por triplicado en intervalos de 30 segundos entre tubos de reacción y en intervalos de 3 y 6 minutos entre tubos con DNS para detener reacción.

• Todos los tubos se pusieron en baño María a ebullición durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo se sacaron para colocarse en una cuba con hielo, se homogenizó la solución en cada tubo, agregando 1 mL de agua destilada para su posterior lectura en espectrofotómetro UV-2100 a 540 nm.

• Para determinar la cantidad de proteína en la solución de α-amilasa se colocó dicha solución en

una celda UV con su respectivo Buffer de fosfatos pH 7 como blanco y se midió en espectrofotómetro a 280 nm.

• Se colocó en una celda de plástico 250 L de enzima y 750 L de solución de Bradford y después de 5 minutos se leyó a 595 nm utilizando buffer de fosfatos pH 7 en el blanco en lugar de enzima

1.7.4 Resultados El grupo realizo el método de Bradford para determinar de manera directa la cantidad de proteínas presentes en la muestra los cuales se encuentran en la tabla que se muestra a continuaciónTabla 1 Absorbancias obtenidas en el metdo de Bradford de el grupo

Equipo 01:10 01:201 0.345 0.364 0.194 0.1912 0.17 0.163 0.098 0.1733 0.126 0.472 0.241 0.3494 0 0.275 0.15 05 0.527 0.542 0.464 0.8436 0.146 0.165 0.063 0.1057 0.817 0.871 0.389 0.421

35



Así mismo se realizaron pruebas de DNS de las muestra a diferentes tiempos para observar de esta manera la actividad de la amilasa al medirTabla 2Resultados de absorbancia para medir actividad enzimática a 0,3,6 min

Absorbancia DNS (540nm)

0min 3min 6min0.215 0.119

0.256 0.2120.235 0.168

promedio 0.256 0.221 0.143x=( y+0.0093)/0.4047

1.7.5 Discusión.Utilizando el promedio de las mediciones de absorbancia se calculó la actividad enzimática correspondiente a los tiempos de 6 y 3 minutos utilizando las siguientes ecuaciones:

U=[Producto ] t 1−[Producto ] t 0

t

U esp=[Producto ] t 1− [Producto ] t 0

t [Proteína ]

Los resultados de U se muestran en la siguiente tabla Tabla 3 Resultados de actividad enzimática con respecto a la glucosa liberada vs tiempo

Gráfica 1. Concentración de maltosa liberada con respecto al tiempo, la pendiente representa la activi-dad enzimática U.

Dichos resultados se expresan en función de la concentración de maltosa puesto que la curva de calibración por el método de DNS está en función de maltosa.

En tabla 3 se muestran los resultados de actividad enzimática calculados en los minutos 3 y 6 del experimento. Se observa que la actividad enzimática es menor a los 6 minutos, tanto la actividad específica como no específica y que la pendiente de la gráfica 1 corresponde al resultado de actividad enzimática (U) al minuto 6 Sin embargo este comportamiento se repite en la actividad enzimática específica.

36

tiempo Act enz µmol/ml

3 0.22066667

6 0.1435



Tabla4. Resultados de actividad enzimática con respecto a los moles de maltosa liberados.

tiempo Act enz Act esp3 0.22066667 0.07336 0.1435 0.0239

1.7.6Conclusiones Tanto en la tabla 3 como en la 4 se puede observar que el resultado de actividad enzimática es

menor a los 6 minutos, dicho resultado es el esperado, puesto que la velocidad enzimática es ma-yor cuando existe mayor disponibilidad de sustrato, es decir al inicio de la reacción

Factores como la temperatura o condiciones del ensayo pudieron haber afectado este resultado. Pero estos no fueron considerables,

1.7.7 ReferenciasDeb, P., Talukdar, S. A., Mohsina, K., Sarker, P. K., & Sayem, S. A. (2013). Production

and partial characterization of extracellular amylase enzyme from Bacillus amyloliquefaciens P-001. SpringerPlus, 2.

Azad MA, Bae JH, Kim JS, Lim JK, Song KS, Shin BS, Kim HR. Isolation and characterization of a novel thermostable alpha-amylase from Korean pine seeds. N Biotechnol. 2009; 26:143–149. doi: 10.1016/j.nbt.2009.09.006. [PubMed] [Cross Ref]

Rajagopalan G, Krishnan C. Alpha-amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresour Technol. 2008; 99(8):3044–3050. doi: 10.1016/j.biortech.2007.06.001. [PubMed] [Cross Ref]

37



1.8 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA EN LA ACTIVIDAD EN-ZIMÁTICA DE UNA AMILASA.

1.8.1 IntroducciónLa actividad enzimática se refiere a la capacidad de catálisis en condiciones óptimas, es decir, cuando una enzima actúa en su velocidad máxima, lo que se consigue estandarizando las condiciones del medio y utilizando concentración saturada del sustrato; en estas condiciones la velocidad de catálisis es máxima.Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzimas no pueden medirse directamente. Por consiguiente la actividad de una enzima se mide generalmente siguiendo la desaparición de sustrato, aparición de un producto o la modificación de cofactores de una reacción. Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:

Influencia de temperatura pH Concentración de la enzima Concentración del sustrato efecto de los inhibidores y activadores.

La α-amilasa (1,4, α-glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza los enlaces α 1-4 glicósidicos de polisacáridos, tales como el almidón, glicógeno o productos de degradación de los mismos (1). Tiene una actividad enzimática que oscila entre 53-129 U/L, su peso molecular va de los 40 000 a 50 000 Da, su actividad requiere de la presencia de iones cloruro (2). Esta enzima tiene importancia en la industria alimentaria como en cervecería, dulcería, cereales y panadería, y específicamente en la sacarificación maltogénica (1), sin embargo, su producción es limitada y es un producto de exportación. La α-amilasa que es producida de manera natural por Aspergillus oryzae tiene un peso molecular de 52 x

38



310 (2). Las enzimas de origen microbiano presentan ventajas técnico-económicas: poseen tiempos de generación menores, tienen requerimientos de espacio menor por unidad de enzima producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la disponibilidad de nuevas enzimas (3). Los preparados industriales de enzimas, se caracterizan por la actividad particular de la enzima deseada, por el efecto del pH, temperatura, tiempo de reacción, concentraciones de la enzima y del sustrato, así como el efecto de los inhibidores o activadores, que pueden presentarse en las aplicaciones industriales. La producción de una enzima, incluye dos etapas principales: la fermentación, en la que se multiplica el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación y purificación en la que se aísla la enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. En la industria se utilizan más los preparados enzimáticos, pues la purificación de la enzima podría representar costos adicionales en la producción de alimentos. La calidad de la enzima está en función de la fermentación, pues esta influye directamente en la coloración, olor y estabilidad de la enzima.

1.8.2 Objetivos Determinar el efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática Determinar la concentración de la enzima mediante la técnica de Bradford

1.8.3 Desarrollo Experimental Solución de almidón al 1%

Determinación de la concentración de proteína en la solución enzimática por Bradford

39

Pesar 1g de almidón

Suspender en 100 ml de regulador de

fosfatos 0.1M pH 7.0

Desnaturalizar en agua a 60 °C por 15

min.



Efecto de la concentración de enzima en la velocidad de reacción enzimática

TABLA 8.1. Soluciones para determinar el efecto de la concentración de la enzima en la actividad enzimática.

TUBO Testigo 3P1 3P2 3P3 3P4 3P540

Preparar un blanco con 0.25 ml del

regulador de fosfatos y 0.75ml de

Bradford

Tomar 0.25 ml de cada concentración y adicionar 0.75 ml

de Bradford

Realizar por duplicado para cada

concentración de amilasa

Esperar 5 min.

Leer absorbancia a 595nm

Determinar la concentración

Prepara tubos eppendorf como lo

indica la tabla

Adicionar por triplicado 0.95ml de

la solución a diferentes

concentraciones

Adicionar 0.05ml de solucion de amilasa,

excepto al testigo

Utilizar un intervalo entre cada tubo, de

30s.

Incubar por 5 min en un baño a 25°C

Tomar 0.1ml de la reaccion y

adicionarlo a un tubo con 0.1ml de DNS

Tratar por técnica DNS visto en la

sección 1.5 y 1.7



Sol. De amilasa(mg/ml)

-- 1 2 3 4 5

Vol. De la solución de

Sustrato(ml)

0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95

Vol. De la solución de

Enzima en PO4(ml)

0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

1.8.4 Resultados

Efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática de una amilasa

Tabla 8.2 Lecturas de absorbancias a 540 nm a distintas concentraciones de enzima.Tubos a distintas concentraciones de enzima

P14mg/mL

P23mg/mL

P32mg/mL

P41mg/mL

P50.5mg/mL

Promedio de absorbancias (nm) 0.293 0.337 0.262 0.262 0.166

41



0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.319568725653867 x − 0.0240378408458541R² = 0.989026384936073

Curva de calibración DNS

Concentración de maltosa(g/L)

Abso

rban

cia a

540

nm

fig. 1 Curva de calibración de DNS, en ésta gráfica se muestra el comportamiento de la absorbancia en función

de la concentración de la muestra

Para determinar la concentración, despejamos x de la ecuación de la recta de la gráfica

x= y+0.0240.3196

Tabla 8.3 Concentraciones de producto para diferentes concentraciones de amilasaConcentración de amilasa 4mg/mL 3 mg/mL 2mg/mL 1mg/mL 0.5mg/

mLAbsorbancias (nm) 0.293 0.337 0.262 0.262 0.166Concentración de azúcares reductores 0.9918 g/L 1.1295 g/L 0.8948 g/L 0.8948 g/L 0.5944

g/L

42



0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

concentracion de α- amilasa (mg/mL)

conc

entr

acio

n az

ucar

es re

duct

ores

(g/L

)

Fig. 2 Relación entre la conc. de enzima y de azúcar reductor

Tabla 8.4 valores de actividad enzimática con respecto a su concentración.

Fig 3 comportamiento de la actividad enzimática de la amilasa vs conc. enzima

1.8.5 Discusión

En la tabla 8.2 observamos la absorbancia a diferentes concentraciones de enzima en mg/ml, mediante la gráfica 8.2 se determina la concentración de enzima como lo vemos en la tabla 8.3, dichos resultados no son satisfactorios, debido a que desde la lectura de la absorbancia se presentó irregularidad a lo esperado bibliográficamente, sin embargo se observa que la concentración va aumentando desde [0.5] a [3] manteniendo una relación ascendente.Por otro lado se observa que la actividad enzimática respecto a la concentración de enzima, no

43

Concentración de amilasa (mg/ml)

actividad enzimática(g/L *min)

0.5 0.09901 0.05002 03 0.03914 -0.0229



concuerda con la actividad normal con respecto a la concentración, ya que entre más concentración de enzima, mayor actividad debería de mostar.Sin embargo se observa que la mayor actividad enzimática se encuentra a una concentración de 0.5 mg/ml (ya que como valor de producto 0, se toma al cero como tal.) y un pH de 7 (pH óptimo de la amilasa) y a 24°C de temperatura. Y la menor actividad, se encuentra entre concentraciones de 4mg/ml, causando completa controversia al encontrar la menor actividad en la mayor concentración de enzima.En la tabla 8.4 se puede observar los resultados de la actividad enzimática, los cuales muestran un comportamiento no esperado bibliográficamente, debido al mal manejo que se llevó a la hora de preparar las muestras provocando una lectura errónea en el espectrofotómetro.Con respecto a la velocidad, para sacar los valores de la velocidad se debe linealizar la gráfica, y la pendiente es equivalente a la velocidad.Por otro lado, analizando las posibles causas de los errores, se puede decir que la técnica de DNS necesita concentración y un buen manejo de los espacios y el material, ya que puede existir error al momento de agregar la soluciones o incluso en el tiempo en el que actúa el DNS e incluso en la temperatura optima a la que se debe trabajar.La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de la actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones

1.8.6 ConclusionesCon el fin de obtener respuesta a la actividad enzimática en función de la concentración, se realizó la metodología mostrada anteriormente, mediante la técnica de DNS se determinó dicha actividad enzimática.La cuantificación de la actividad enzimática siempre está en función de ciertas condiciones que si se modifican afectan el ensayo enzimático. Dichas condiciones las comenzamos a ver con la variación de concentración de enzima.

1.8.7 Memoria de cálculoSe determinó la concentración a partir de la curva tipo de maltosa

y=0.3196 X - 0.024Despejando a X

X= y+0.0240.3196

Se sustituye cada absorbancia en el valor de “y” y se obtiene la concentración.

X (0.5 )=0.166+0.0240.3196

=0.5944

X (1 )=0.262+0.0240.3196

=0.8948 g/L

X (2 )=0.262+0.0240.3196

=0.8948 g/L

X (3 )=0.337+0.0240.3196

=0.1295g /L

X ( 4 )=0.293+0.0240.3196

=0.9918 g/L

44



Posteriormente se determina la actividad enzimática, Al sustituir en (1) las concentraciones en gL

del

producto.

U 0.5=[ 0.5944 ]t1−[ 0 ]t 0

6=0.0990g /Lmin

U 1=[ 0.8948 ]t1− [0.5944 ] t0

6=0.0500 g/Lmin

U 1=[ 0.8948 ]t1− [0.8948 ]t 0

6=0g /Lmin

U 1=[ 0.9918 ]t1− [0.8948 ]t 0

6=−0.0229g /Lmin

1.8.8 Bibliografía Guadarrama, A.(2002, Mayo). Obtención de α-amilasa a partir de Aspergillus oryzae [en línea].

Disponible en: http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-24.pdf [08/09/2013]

1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimática

1.9.1 Introducción En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalí-tica debida a la desnaturali-zación tér- mica, y la activi-dad enzi- mática decrece rápida- mente hasta anularse

45



Figura 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas late-rales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus car-gas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarro-llado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fi-siológicos.

DISOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Mantener el pH constante es vital para el correcto desa-rrollo de las reacciones químicas y bioquímicas que tie-nen lugar tanto en los seres vivos como, a nivel experi-mental, en el laboratorio. Los amortiguadores (también llamados disoluciones amortiguadoras, sistemas tampón o buffers) son aquellas disoluciones cuya concentración de protones apenas varía al añadir ácidos o bases fuer-tes

Los amortiguadores más sencillos están formados por mezclas binarias:

46



un ácido débil y una sal del mismo ácido con una base fuerte (por ejemplo, ácido acético y aceta-to sódico)

una base débil y la sal de esta base con un ácido fuerte (por ejemplo, amoníaco y cloruro amóni-co)

1.9.2 MetodologíaMetodología para la preparación de buffer de fosfatos a pH 7

Para realizar la preparación de la solución de buffer a pH 7, se pesaron 4.3544 g de fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) equivalentes a 0.1 M para 250 mL de buffer. Se transfirieron estos a un matraz aforado de 250 mL y se aforó con agua destilada. Después, se llevó a pH 7 con una solución de fosfato monobási-co de potasio (KH2PO4) 0.1 M.

Metodología para la preparación de solución de almidón a pH 7

Para preparar solución de almidón a pH 7, se mezclaron 0.1 gramos de almidón por cada 10 mL de buffer a pH 7, y se agitó hasta que se disolvió completamente el almidón. Posteriormente se llevó a un horno para que el almidón se disolviera completamente y el volumen de muestra evaporado fue compensado al adicionarle agua destilada.

Efecto del pH en la actividad enzimática alfa- amilasa

En el desarrollo de la práctica se prepararon soluciones buffer de pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0, para determi-nar la actividad enzimática a estos valores. Con la ayuda de esto se llevó a preparar seis muestra madre en la cual se agregó 0.95 mL de solución de almidón al 1% y 0.05 mL de enzima alfa- amilasa, con interva-los de 30 segundos. Esto se realizó por duplicado en tiempos de 3 y 6 minutos.

Primeramente se colocó a cada tubo de reacción 0.95 mL de solución de almidón al 1% y a los tubos para análisis de actividad enzimática 0.1 mL re reactivo DNS. Una vez teniendo todo esto listo se prosiguió a iniciar la experimentación. En tiempo cero se agregó al primer tubo 0.05 mL de mezcla de reacción, se dejó pasar 30 segundos para poder agregar al otro tubo 0.05 mL de mezcla de reacción y así sucesiva-mente hasta llegar a los 6 diferentes tipos de buffer. Exactamente en el minuto 3 se agregó 0.1 mL de la nueva mezcla al tubo que se le había colocado previamente 0.1 mL de DNS. Y de nuevo se prosiguió suce-sivamente de esta manera hasta los 8.3 min, colocando cada muestra madre con sus respectivos tubos como se muestra en la siguiente tabla. Todo esto se realizó por duplicado de cada regulador de pH.

Una vez que se tuvieron todos los tubos preparados se llevaron a baño maría durante 5 minutos, transcu-rrido este tiempo se pasaron inmediatamente a baño de agua fría. Ya que se tuvieron fríos los tubos se colocó 1 mL de agua destilada y se llevaron a leer en el espectrofotómetro a 540 nm.

Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima alfa- amilasa

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Para la determinación del efecto de la temperatura se utilizó una muestra de la enzima a un pH=7. Las temperaturas a determinar fueron 24, 35, 45, 55 y 65°C.

Se prepararon 4 tubos de reacción con 0.95mL de solución de almidón a pH= 7en una gradilla para tubos de 1.5 mL. En la misma gradilla para cada tubo de reacción se prepararon 4 tubos con 0.1mL de reactivo DNS y un tubo sin enzima como blanco.

Al inicio del proceso los tubos de reacción con 0.95mL de solución de almidón y el blanco correspondien-te se colocaron previamente dentro de un baño por 5 minutos para que alcanzaran la temperatura de de-terminación.

Se comenzó en un tiempo cero adicionando 0.05mL de solución de enzima al cada tubo de reacción en las temperaturas antes mencionadas.

Pasados 3 minutos, se adicionó 0.1mL de la mezcla de reacción del tubo a los tubos con DNS.

Pasados 6 minutos desde el tiempo cero, se adicionó 0.1mL de la mezcla de reacción de los tubos a los que contienen DNS.

Se vaciaron los tubos de reacción con DNS en celdas espectrofotométricas y se procedió a leer la absor-bancia a 540nm como lo indica el método de determinación con DNS.

1.9.3 Resultados : Se analizó la actividad enzimática de la enzima α-amilasa a diferentes temperaturas y distintos pH para conocer su comportamiento de acuerdo a las condiciones fisicoquímicas presentes, obteniendo una dife-rencia de actividad notable y velocidades variables (Tabla 1 y 2), observando que las condiciones si afec-tan la función de la enzima.

Tabla 1. Determinación de actividad enzimática de α-amilasa a diferente pH.

Ph

Velocidad Promedio

(g de Glucosa/L * min)

U

Concentración

Proteica Muestra (mg)

U/mg de

proteína

5 0.2544 1.4133 0.1000 14.1330

6 0.2636 1.4647 0.1000 14.6469

7 0.1675 0.9304 0.1000 9.3042

8 0.0000 0.0000 0.1000 0.0000

9 0.0000 0.0000 0.1000 0.0000

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5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.00

2

4

6

8

10

12

14

16

pH

U/m

g de

pro

tein

a (µ

mol

/min

*mg)

Figura 2. Comparación de actividad enzimática especifica de α-amilasa a diferente pH a 24.1 °C.

Tabla 2. Determinación de actividad enzimática de α-amilasa a distintas temperaturas.

Temperatura °C

Velocidad Promedio

(g de Glucosa/L * min)

U Concentración

Proteica Muestra (mg)

U/mg de

proteína

24.1 0.1675 0.9304 0.1000 9.3042

35 0.0728 0.4047 0.1000 4.0472

55 0.2193 1.2184 0.1000 12.1844

65 0.1417 0.7870 0.1000 7.8695

49



20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 700

2

4

6

8

10

12

14

Temperatura (°C)

U/m

g de

pro

tein

a (µ

mol

/min

*mg)

Figura 3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática específica. pH de 7 a una concentración en-zimática de 2 mg/Ml

1.9.4 DiscusiónTodas las enzimas tienen un pH óptimo en donde tienen mayor actividad, y a medida que se alejan de ese pH (ya sea alcalino o ácido) disminuye su actividad. Esto se debe a que unos restos aminoacídicos de las enzimas tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la proteína como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio puede modificar las cargas de estos aminoácidos y de este modo desnaturalizar a la enzima.

En la figura 2 puede verse que el pH óptimo donde la enzima alfa- amilasa alcanza una actividad enzimá-tica óptima y por ende una velocidad catalítica alta es en un pH cercano a 6. Si el medio es ácido, la activi-dad enzimática no tiene una repercusión tan fuerte en comparación con medios alcalinos.

Por tanto, se puede decir que a pH extremos, la alfa- amilasa deja de funcionar o al menos disminuye no-tablemente su actividad enzimática.

En la figura 3, existe cierta incongruencia en los datos, ya que según la gráfica la temperatura óptima de la enzima alfa- amilasa es de 55°C. Pero el comportamiento de la gráfica es sigmoidal, indicando en un principio que a una temperatura baja (en comparación a su óptima) hay buena actividad enzimática, qui-zá no la mejor, pero si funciona bien en la conversión de sustrato producto, luego la temperatura aumen-te y la actividad enzimática vuelve a verse afectada.

El pH óptimo y la temperatura óptima son de 5-6 y de 60°C respectivamente. Ambos casos se pudieron comprobar en la práctica, pero el comportamiento de las demás temperaturas no es claro.

Aun que si se compara la gráfica obtenida con la bilbiografía, se aprecia que el comportamiento es similar

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}

Figura 4. Efecto de la temperatura en la hidrólisis de almidón por la enzima alfa- amilasa

1.9.5 ConclusionesAl término de la práctica, se concluye que:

El pH óptimo de la alfa- ailasa fúngica es cercano a 6.

La temperatura óptima para la hidrólisis de almidón por alfa- amilasa es de 55°C, pero no quiere decir que sólo a temperaturas elevadas realiza una buena función, sino también en temperaturas bajas puede tener un funcionamiento bueno.

En medios ácidos, la actividad enzimática de alfa- amilasa es mejor que en medio alcalinos.

1.9.6 Bibliografía Worthington Corporation, Enzyme concentration, recuperado de http://www.worthington-

biochem.com/introbiochem/enzymeconc.html, el día 8 de Septiembre del 2013.

Bioquímica experimental. Actividad enzimática. Disponible en http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/seccic3b3n3-curvas-temporales.pdf. Revisado el 08 de septiembre de 2013.

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Manuel Tena Aldave y Jesús Jorrín Novo. Estudio cinético de la actividad de invertasa de levadura de pa-nadería. Departamente de Bioquímica y Biología molecular.

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Práct 1 material de laboratorio

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