ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/...
Transcript of ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/...
![Page 1: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/1.jpg)
ΟΟ ΚυτταρικόςΚυτταρικός ΚύκλοςΚύκλος
The Cell CycleThe Cell Cycle
![Page 2: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/2.jpg)
HH ζωήζωή τουτου κυττάρουκυττάρου
Αντιγραφή τουDNA και
Κυτταρική αύξηση
ΚυτταρικόςΚύκλος
Θυγατρικά Κύτταρα
Κυτταρική∆ιαίρεση
Γήρανση(Senescence)
Κυτταρικός θάνατος
![Page 3: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/3.jpg)
ΟιΟι φάσειςφάσεις τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
G1S
MG2
∆ιαχωρισμόςχρωμοσωμάτων
Κυτταροπλασματική∆ιαίρεση
(Κυτταροκίνηση)
![Page 4: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/4.jpg)
G0
Z Ζ Ζ Ζ Quiescence
S
G2
M
G1
Η φάση G0
• Είναι περίοδος στην οποία το κύτταρο ευρίσκεται«έξω» από τον κυτταρικό κύκλο, σε κατάστασηληθάργου (quiescent), δηλαδή δεν διπλασιάζει το DNA και δεν διαιρείται, επιτελεί όμως άλλες λειτουργίες(μεταβολισμός, επικοινωνία, κίνηση, κ.α.)
• Σε συνθήκες κυτταροκαλιέργειας, τα κύτταραπηγαίνουν από τη G1 στη G0 όταν οι θρεπτικές ουσίεςδεν επαρκούν, έως ότου υπάρξουν πάλι προϋποθέσειςνα πολλαπλασιαστούν οπότε επιστρέφουν στην G1 καισυνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο
• Στον οργανισμό, τα διαφοροποιημένα κύτταρα (ποιαείναι?) είναι μόνιμα σε φάση G0
![Page 5: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/5.jpg)
ΡύθμισηΡύθμιση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2 και M)πρέπει να διαδραματίζονται:
• Με τη σωστή σειρά
• Στον κατάλληλο χρόνο
• Μόνο μία φορά σε κάθε κύκλο
![Page 6: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/6.jpg)
Cyclin-dependent kinase (Cdk)
cyclin
TaTa σύμπλοκσύμπλοκaa κινκινaaσώνσών Cdk/CyclinCdk/Cyclin είναιείναιυπεύθυναυπεύθυνα γιαγια τοτο συντονισμόσυντονισμό τωντωνγεγονότωνγεγονότων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
![Page 7: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/7.jpg)
S Cdk/Cyclin
ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση/ / απενεργοποίησηαπενεργοποίηση συμπλόκωνσυμπλόκων Cdk/CyclinCdk/Cyclinρυθμίζειρυθμίζει τηντην πρόοδοπρόοδο τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
G1S
MG2
G1 Cdk/Cyclin
G1/S Cdk/Cyclin
M Cdk/Cyclin
G2 Cdk/Cyclin
Anaphase onset
Growth factors Mitogens
No Cdkactivity
![Page 8: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/8.jpg)
Ποιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν τηνενεργότητα των Cdks?
![Page 9: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/9.jpg)
Cdk
INACTIVE
ATP
Cyclin
active site
Cyclin
T-loop
ATP
Cdk-activating kinase (CAK)
activating phosphorylation T161
ACTIVE
ATP
P
1. 1. ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τωντων CdksCdks μέσωμέσω πρόσδεσηςπρόσδεσηςκυκλινώνκυκλινών καικαι φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης
![Page 10: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/10.jpg)
Cdc25 phosphatases
Activating phosphorylation T161
Cdk
cyclin
ACTIVE
P
Wee1 kinase
Inhibitory phosphorylationsT14 & Y15
INACTIVE
P
P
2. 2. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks μέσωμέσω φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης
![Page 11: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/11.jpg)
3. 3. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks απόαπό CdkCdk inhibitor proteins inhibitor proteins
(CKI)(CKI)
INACTIVE
CKI
ACTIVE
Cdk
cyclin
P P
All Cdksp21cip/waf1
p27kip1
p57Cip/ Kip
G1 Cdksp15INK4B
p16INK4A
P19 INK4D
INK4
TargetsMembersCKI family
![Page 12: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/12.jpg)
Cyclin
CdkT-Y- -T p
ACTIVE
CDC25
Cyclin
CdkT-Y- -T p
Wee1
p
CdkT-Y- -T p
Cyclin
CKI
CdkT-Y- -T p
CKI
Cyclin
CdkT-Y- -T
PP
CAK (Cdk7/CycH)
ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτηςενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks
![Page 13: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/13.jpg)
4. 4. ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks μέσωμέσω πρωτεόλυσηςπρωτεόλυσης
εξαρτώμενηςεξαρτώμενης απόαπό τοτοΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα
![Page 14: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/14.jpg)
ToTo ΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα ((ProteasomeProteasome))• Είναι μια ενδοκυτταρική πρωτεάση και η δράση της απαιτείυδρόλυση ATP
• Ρόλος του πρωτεασώματος είναι η αποικοδόμηση πρωτεϊνώνλόγω βλαβών, λαθών κατά τη σύνθεσή τους ή αναγκών τουκυτταρικού κύκλου
• Αποτελείται από ένα κεντρικό «κούφιο» κυλινδρικό τμήμα
• και από δύο υπομονάδες (caps) στα άκρα του κυλίνδρου
caps
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Edition
![Page 15: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/15.jpg)
ΓιαΓια νανα δράσειδράσει τοτο πρωτεάσωμαπρωτεάσωμα πρέπειπρέπει ηηπρωτεΐνηπρωτεΐνη--στόχοςστόχος νανα ««σημανθείσημανθεί»» μεμε αλυσίδααλυσίδα
μορίωνμορίων ubiquitinubiquitin
• Ubiquitin: μικρή πρωτεΐνη 76 αα. Προσδένεται σε πλευρικές αλυσίδες Lysineτων πρωτεϊνών-στόχων από ubiquitinationένζυμα και σχηματίζει αλυσίδες poly-ubiquitin
Ubiquitin
HOOC
NH2
Πρόσδεσησε Lysine
Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed
![Page 16: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/16.jpg)
ΛειτουργίαΛειτουργία τουτου ΠρωτεασώματοςΠρωτεασώματος
normal proteinmisfolded protein
poly-ubiquitin chain
proteasome
ATP
poly-ubiquitin chain
misfolded protein
![Page 17: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/17.jpg)
UbiquitinationUbiquitination ΈνζυμαΈνζυμα
• Για το σχηματισμό αλυσίδων poly-ubiquitinχρειάζονται ubiquitination ένζυμα
• Κατηγορίες Ubiquitination ενζύμων :
E1: ubiquitin activating enzyme
E2: ubiquitin conjugating enzyme
E3: ubiquitin ligase
• Υπάρχουν περισσότερα από 300 σύμπλοκα Ε2-Ε3 τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικά σήματααποικοδόμησης πρωτεϊνών-στόχων (ειδικέςαμινοξικές αλληλουχίες, φωσφορυλιώσεις, κ.ά.)
Ubiquitin
HOOC
NH2
Πρόσδεσησε Lysine
Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed
![Page 18: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/18.jpg)
ΟυμπικιτινίωσηΟυμπικιτινίωση πρωτεϊνώνπρωτεϊνών ((protein protein ubiquitinationubiquitination))
E2
E3
Phosphorylationtargets protein
for ubiquitination
prot
einkinase
p
prot
ein
Misfoldedprotein to be
degraded
E2
E3
prot
ein
p
E1 SH COO-
Ub
ATPE1 SC=O
E2
E3
E1
prot
ein
Poly-Ub protein is targeted for degradation by the proteasome
E2
E3
prot
ein
p
![Page 19: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/19.jpg)
∆ύο∆ύο κατηγορίεςκατηγορίες συμπλόκωνσυμπλόκων μεμεενεργότηταενεργότητα E3 E3 ubiquitinubiquitin ligaseligase
ρυθμίζουνρυθμίζουν τηντην ενεργότηταενεργότητα τωντων CdksCdks
SCF
(Τέλος G1, S, G2)
APC/C
(M και αρχή G1)
![Page 20: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/20.jpg)
•• ΕίναιΕίναι σύμπλοκοσύμπλοκο πρωτεϊνώνπρωτεϊνών (Skp1/CUL1/F(Skp1/CUL1/F--Box protein) Box protein) μεμεενεργότηταενεργότητα ΕΕ3 3 ubiquitinubiquitin ligaseligase
•• ΑναγνωρίζειΑναγνωρίζει φωσφορυλιωμένεςφωσφορυλιωμένες πρωτεΐνεςπρωτεΐνες--στόχουςστόχους, , τιςτιςουμπικιτινιώνειουμπικιτινιώνει καικαι τιςτις σημαίνεισημαίνει γιαγια πρωτεόλυσηπρωτεόλυση απόαπό τοτοπρωτεάσωμαπρωτεάσωμα
•• ΣυμμετέχειΣυμμετέχει στηστη ρύθμισηρύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks κατάκατά τιςτιςG1, S G1, S καικαι G2 G2 μέσωμέσω αναγνώρισηςαναγνώρισης καικαι ουμπικιτινίωσηςουμπικιτινίωσης CKICKI καικαιΚυκλινώνΚυκλινών
ΤοΤο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF
![Page 21: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/21.jpg)
ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdksαπόαπό τοτο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF
Cdk inhibitor protein (CKI)
INACTIVE
Pkinase
P
Pactive SCF
ubiquitin, E1 + E2
enzymes
poly-ubiquitinchain
P
P
ACTIVE
Cdk
cyclin
P
kinaseP
P
active SCF
ubiquitin, E1 + E2
enzymes
P
P
active Cdk
Pproteasome
P
inactive Cdk
proteasome
![Page 22: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/22.jpg)
ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks
• Πρόσδεση Κυκλινών και φωσφορυλίωση ενεργοποίησης στηνThr161
• Φωσφορυλιώσεις απενεργοποίησης στις Thr14 & Tyr15
• Πρόσδεση πρωτεϊνών CDK-inhibitors (CKI)
• Αποικοδόμηση Κυκλινών από το πρωτεάσωμα
• Αποικοδόμηση CKI από το πρωτεάσωμα
![Page 23: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/23.jpg)
ΤαΤα κυριότερακυριότερα σύμπλοκασύμπλοκα Cdk/CyclinCdk/Cyclinσεσε κύτταρακύτταρα σπονδυλοζώωνσπονδυλοζώων
Cyclin BCdk1 (Cdc2)M
Cyclin ACdk1 (Cdc2)G2
Cyclin ACdk2S
Cyclin ECdk2G1/S
Cyclin DCdk4, Cdk6G1
CyclinCdkCdk/Cyclin
![Page 24: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/24.jpg)
Cdk4,6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Cdk2/Cyclin Α
Cdk1/Cyclin Α
Cdk1/Cyclin Β
ΜεταβολέςΜεταβολές στηνστην ενεργότηταενεργότητα συμπλόκωνσυμπλόκωνCdk/CyclinCdk/Cyclin ρυθμίζουνρυθμίζουν τοντον κυτταρικόκυτταρικό κύκλοκύκλο
Anaphase onset
Growth factors Mitogens
No Cdkactivity
![Page 25: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/25.jpg)
Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Growth factors Mitogens
ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdkactivity
![Page 26: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/26.jpg)
ΗΗ πρωτεΐνηπρωτεΐνη τουτου ΡετινοβλαστώματοςΡετινοβλαστώματος((Retinoblastoma proteinRetinoblastoma protein,, RbRb))
• Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Απενεργοποίηση και τωνδύο αλληλομόρφων του γονιδίου προκαλεί καρκίνο τουρετινοβλαστώματος στον άνθρωπο
• Εκφράζεται σταθερά αλλά μεταβάλλονται τα επίπεδαφωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης κατά τον κυτταρικό κύκλο
• Φωσφορυλιώνεται στη G1 από τις CDK4, CDK6 και CDK2. Ημη φωσφορυλιωμένη μορφή της Rb προσδένει και απενεργοποιείτο μεταγραφικό παράγοντα E2F
• O ενεργός E2F προσδένεται σε αλληλουχίες υποκινητών καιεπάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων του E2F
![Page 27: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/27.jpg)
Growth factor-activated signaling pathways (mitogens)
Cdk4,Cdk6/ Cyclin D
Rb partially inactive Rb
PP
Rb
E2FInactive E2F No expression of E2F target
genes
E2FLow E2F activity Low expression of E2F target
genes
E2FHigh E2F activity High expression of E2F target
genes
active Rb
Cdk2/ Cyclin E
Rb inactive RbP P
P P
Cdk4,Cdk6/ Cyclin D
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdk activity
![Page 28: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/28.jpg)
ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F• Προσδένει τη μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη Rb
• Απουσία προσδεδεμένης Rb εντοπίζεται σε ειδικές αλληλουχίες στονυποκινητή και επάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων
• Προσελκύει ένζυμα που προκαλούν «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνηςώστε αυτή να είναι μεταγραφικά ενεργή
Closed chromatin
Transcriptional inactive
Ε2FHAT
Open chromatin
Gene expression
RbE2
FRb
P P
P P
CDKs
![Page 29: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/29.jpg)
ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F
• Οι μεταγραφικοί του στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια:
Κυτταρικού κύκλου (Cdk2, Cyclin Ε, Cyclin A, E2F)
Αντιγραφής DNA (PCNA, MCM2-7, RPA, H2A, DNA polα, δ)
Επιδιόρθωσης DNA (BRCA1,2, FANC, RAD51)
Απόπτωσης (APAF1, CASPases 3,7,8)
![Page 30: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/30.jpg)
Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Growth factors Mitogens
ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdkactivity
![Page 31: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/31.jpg)
G1 S
+
+
active Rb
inactive E2F
Cdk2/ CycEactive
Cdk4, 6/ CycD p27
G1/S restriction
point
ΕνεργότηταΕνεργότητα τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1καικαι αρχήαρχή τηςτης SS
P
Ubiquitination by SCF & degradation
by proteasomeGrowth factors
Mitogens
Active Cdk4,6/ Cyclin D
Cdk2/ Cyclin E
G1/S restriction point
Gene expression Cdk2, CycE
Cdk2/ CycEactive
active E2F
inactive RbP PPP
No Cdk activity
![Page 32: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/32.jpg)
ΡύθμισηΡύθμιση τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1-- αρχήαρχή τηςτης SS
• Στην αρχή της G1 η συνολική ενεργότητα Cdk είναι χαμηλή
• Η Rb προσδένει και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγονταE2F
• Μιτογόνες ουσίες ενεργοποιούν τις Cdk4,6/ Cyclin D καιCdk2/ Cyclin Ε
• Φωσφορυλίωση του Rb οδηγεί σε ενεργοποίηση του E2F καιμεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται σε περεταίρω ενεργοποίησηCDK συμπλόκων και έναρξη της αντιγραφής του DNA
![Page 33: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/33.jpg)
G1S
MG2
Cdk1/Cyclin Β
Anaphase onset
ΈναρξηΈναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
Ενεργοποίηση τουσυμπλόκου Cdk1/ Cyclin B
![Page 34: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/34.jpg)
ΕνεργότηταΕνεργότητα τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B είναιείναιαναγκαίααναγκαία γιαγια τηντην έναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής
διαίρεσηςδιαίρεσης
Cdk1/ Cyclin B
∆ιάλυσηπυρηνικούφακέλου
Σχηματισμόςμιτωτικήςατρακτου
∆ιάταξηχρωμοσωμάτων
![Page 35: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/35.jpg)
ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B καικαιέναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
G2 M
Cdk1
Cyclin B
+
Cdk-inhibitory kinase
Wee1
PP
activating phosphorylation
inhibitory phosphorylation
P
Cdc25 Cdk-activating phosphatase
Cdk1/ Cyclin B
Mitotic entry
active Cdk1
![Page 36: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/36.jpg)
• Για να μπούμε στη φάση της μιτωτικής διαίρεσης απαιτείταιενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk1/CyclinΒ
• Η φωσφατάση Cdc25 αποφωσφορυλιώνει τις Υ14 και Τ15 της Cdk1 και την ενεργοποιεί
• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB ενισχύει την ενεργότητα της Cdc25
• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB φωσφορυλιώνει και απενεργοποιείτην κινάση Wee1
΄Εναρξη΄Εναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικήςδιαίρεσηςδιαίρεσης
![Page 37: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/37.jpg)
ΠώςΠώς μπορούμεμπορούμε νανα διακρίνουμεδιακρίνουμε σεσεποιαποια φάσηφάση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
βρίσκεταιβρίσκεται τοτο κύτταροκύτταρο;;
![Page 38: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/38.jpg)
• Ανοσοφθορισμός (immunofluorescence)
• Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)
∆ιάκριση∆ιάκριση τωντων φάσεωνφάσεων τουτουκυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
![Page 39: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/39.jpg)
• Μονιμοποίηση των κυττάρων και χρώση με ουσίες οι οποίες φθορίζουν μετάτην πρόσδεσή τους στο DNA (DAPI, Propidium Iodide)
• Ανίχνευση επιτόπων ειδικών για τη συγκεκριμένη φάση του κυτταρικούκύκλου (markers), με χρήση αντισωμάτων συνδεδεμένων σε φθορίζων μόριο
• Μικροσκοπία φθορισμού
S-phase G1-phase
ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικούκύκλουκύκλου μεμε ανοσοφθορισμόανοσοφθορισμό
Φθορίζων μόριο
Ab
S-ειδικήπρωτεΐνηξέπλυμα
Φθορισμός
![Page 40: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/40.jpg)
ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάσηδιπλασιασμούδιπλασιασμού τουτου DNADNA
Παράδειγμα S- phase marker: PCNA
phase contrastPCNA
![Page 41: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/41.jpg)
ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάση τηςτηςμιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
Παράδειγμα Μ- phase marker: φωσφορυλιωμένη Ιστόνη Η3 στηΣερίνη 10 (pH3)
pH3 PI pH3 PI
![Page 42: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/42.jpg)
ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου μεμεκυτταρομετρίακυτταρομετρία ροήςροής (flow (flow cytometrycytometry))
• Μέθοδος ανάλυσης πληθυσμού κυττάρων η οποία δείχνει το ποσοστόκυττάρων που έχουν συγκεκριμένη ποσότητα DNA
• Μονιμοποίηση κυττάρων
• Χρώση με Propidium Iodide (PI). Η χρωστική PI φθορίζει (στο κόκκινο) όταν προσδεθεί στο DNA και η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη τηςποσότητας του DNA κάθε κυττάρου
• Η ποσότητα του DNA (2N, 4N ή ενδιάμεση) είναι χαρακτηριστική τηςφάσης του κυτταρικού κύκλου (G1, G2 ή S)
• Ανάλυση φθορισμού των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής μας δείχνει τοποσοστό αυτών στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου
flow
FACS: fluorescence-activated cell sorter
Analysehistogram
![Page 43: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/43.jpg)
ΚυτταρομετρίαΚυτταρομετρία ροήςροής-- PI profilesPI profiles
Even
ts (n
umbe
r of c
ells
)
Flow cytometer
DNA (PI fluorescence)
G1 G2+M
SSub-G1 (dead) polyploid
2N 4N
4.4polyploid21.3G2+M32.4S40.1G11.8Sub-G1
Percentage (%)Fraction
PI
Μικροσκόπιο φθορισμού
![Page 44: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/44.jpg)
Κυτταρική σειρά 1 Κυτταρική σειρά 2
∆είχνονται καλλιέργειες δύο κυτταρικών σειρών σε τυπικόθρεπτικό μέσο
Ποιες διαφορές εντοπίζετε στα PI profiles των δύο σειρών? ∆ώστε πιθανή εξήγηση
PI profiles: Quiz 1 PI profiles: Quiz 1
![Page 45: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/45.jpg)
PI profiles: Quiz 2 PI profiles: Quiz 2
A B C D
1. Τυπική καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο
2. παρουσία αναστολέα της μιτωτικής διαίρεσης (nocodazole)για 12 hrs
3. Καλλιέργεια κυττάρων παρουσία αναστολέα της αντιγραφήςτου DNA (hydroxyurea) για 12 hrs
4. Καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (FBS)για 24 hrs
Κάντε τις αντιστοιχίες
![Page 46: ΟΚυτταρικόςΚύκλοςGrowth factor-activated signaling pathways (mitogens) Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Rb partially inactive Rb P P Rb Inactive E2F No E2Fexpression of E2F target](https://reader036.fdocument.org/reader036/viewer/2022081402/5f0af4c27e708231d42e2aab/html5/thumbnails/46.jpg)
Molecular Biology of The Cell,
Alberts et al, 4th Ed,
Chapter 17